ES2575990T3 - Vectores con codón de iniciación modificado para la traducción de aav-rep78 para la producción de aav en las células de insectos - Google Patents
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Abstract
Secuencia de nucleótidos que comprende un marco de lectura abierto único que codifica proteínas Rep78 y Rep52 parvovirales, donde el codón iniciador para la traducción de la proteína Rep78 parvoviral es un codón iniciador subóptimo en comparación con el codón ATG normal, donde la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de control de expresión que comprende una secuencia de nueve nucleótidos de SEC. ID Nº: 7 hacia arriba del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rep78 parvoviral.
Description
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Vectores con codon de iniciacion modificado para la traduccion de aav-rep78 para la produccion de aav en las celulas de insectos
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a la produccion de virus adeno-asociados en las celulas de insecto y a virus adeno-asociado con mejoras en la expresion y estabilidad del protefnas vfricas rep que aumentan la productividad de vectores vfricos adeno-asociados en las celulas de insecto.
Antecedentes de la invencion
[0002] Virus adeno-asociados (AAV) se pueden considerar como uno de los vectores vfricos mas prometedores para la terapia genetica humana.
AAV tiene la capacidad de infectar eficazmente celulas humanas que se dividen asf como las que no se dividen, el genoma vfrico AAV se integra en un sitio cromosomico unico en el genoma de la celula huesped, y lo mas importante, aunque AAV esta presente en muchos seres humanos nunca ha sido asociado a ninguna enfermedad. Ante estas ventajas, virus adeno-asociado recombinante (rAAV) esta siendo evaluado en los ensayos clfnicos de terapia genetica para hemofilia B, melanoma maligno, fibrosis cfstica, y otras enfermedades.
[0003] Celulas huesped que soportan replicacion AAV in vitro son todas derivadas de tipos de celula de mamffero. Por lo tanto, rAAV para usar en la terapia genetica ha sido hasta aquf principalmente producido en lfneas celulares mamfferas tales como por ejemplo 293 celulas, celulas COS, celulas HeLa, KB celulas, y otras lfneas celulares mamfferas (ver por ejemplo US 6,156,303, US 5,387,484, US 5,741,683, US 5,691,176, US 5,688,676, US 20020081721, WO 00/47757, WO 00/24916, y WO 96/17947). Vectores rAAV son tfpicamente producidos en tales sistemas de cultivo celular mamffero proporcionando plasmidos de ADN que contienen el gen terapeutico flanqueado por el origen de replicacion AAV (repetidores terminales invertidos o ITR), genes para protefnas de replicacion Aav Rep78; Rep68; Rep52, y Rep40, y genes para virion o protefnas estructurales VP1, VP2, y VP3. Ademas, un plasmido con genes tempranos de adenovirus (E2A, E4ORF6, VARNA) sirve mejorar la expresion de los genes AAV y mejorar el rendimiento de vector (ver por ejemplo Grimm et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 27452760).
Sin embargo, en la mayor parte de estos sistemas de cultivo celular mamffero, el numero de partfculas AAV generado por celula esta sobre el orden de 104 partfculas (revisado en Clark, 2002, Kidney Int. 61(Suppl. 1): 9-15). Para un estudio clfnico, mas del 1015 partfculas de rAAV pueden ser requeridas.
Para producir este numero de partfculas rAAV, transfeccion y cultivo con aproximadamente 1011 celulas humanas cultivadas 293, el equivalente de 5.000 175-cm2 matraces de celulas, serfan requeridas, lo que supone la transfeccion de hasta 1011 293 celulas.
Por lo tanto, produccion a gran escala de rAAV que usa sistemas de cultivo celular mamffero para obtener material para ensayos clfnicos ya ha probado ser problematica, la produccion a escala comercial puede incluso no ser realizable.
Ademas existe siempre el riesgo, que un vector para uso clfnico que se produce en un cultivo celular mamffero sera contaminado con material indeseable, quizas patogeno presente en la celula huesped mamffera.
[0004] Para superar estos problemas de sistemas de producciones de mamffero, recientemente, un sistema de produccion AAV ha sido desarrollada usando celulas de insecto (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 19351943; US 20030148506 and US 20040197895).
Para la produccion de AAV en celulas de insecto algunas modificaciones fueron necesarias para conseguir la estequiometrfa correcta de las tres protefnas capsidas AAV (VP1, VP2 y VP3), que se basa en una combinacion de uso alterno de dos sitios de aceptor de empalme y la utilizacion suboptima de un codon iniciador ACG para VP2 que no es reproducido con precision por celulas de insecto.
Para imitar la estequiometrfa correcta de las protefnas capsidas en las celulas de insecto Urabe et al. (2002; supra) usan una construccion que es transcrita en un mensajero policistronico unico que es capaz de expresar la tres protefnas VP sin requerir empalme y donde el codon de iniciador mas arriba se sustituye por el codon de iniciador suboptimo ACG.
En aplicacion divisionaria (PCT/NL2005/050018) los presentes inventores han ademas mejorado la infectividad de la produccion a base de vectores rAAV producidos por baculovirus por otra optimizacion de la estequiometrfa de protefnas capsidas AAV en las celulas de insecto.
[0005] Para la expresion del protefnas AAV Rep en el sistema de expresion de celula de insecto AAV como inicialmente desarrollado por Urabe et al. (2002; supra), se usa una construccion de baculovirus recombinante que alberga dos independiente unidades Rep de expresion (un para Rep78 y un para Rep52), cada bajo el control de un promotor de celula de insecto separado, los promotores AIE1 y PolH, respectivamente.
En este sistema, el promotor AIE1, un promotor mucho mas debil que el promotor PolH, fue elegido para la transmision de expresion Rep78 al ser conocida que en celulas mamfferas, una expresion menos abundante de
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Rep78 en comparacion con Rep52 favorece produccion de vector alto (Li et al., 1997, J Virol. 71: 5236-43; Grimm et al., 1998, supra).
[0006] Mas recientemente sin embargo, Kohlbrenner et al. (2005, Mol. Ter. 12: 1217-25) proporcionado que la construccion de baculovirus para la expresion de las dos protefnas Rep, como usado por Urabe et al., padece de una inestabilidad inherente.
Separando la orientacion palfndroma de los dos genes Rep en el vector original Urabe y disenando dos vectores de baculovirus separados para la expresion Rep52 y Rep78, Kohlbrenner et al. (2005; supra) aumentaron la estabilidad de pasaje del vector.
Sin embargo, a pesar de la expresion consistente en Rep78 y Rep52 de las dos construcciones de baculovirus-Rep independientes en las celulas de insecto por al menos 5 pasajes, el rendimiento de vector rAAV es 5 a 10 veces mas bajo en comparacion con la construccion de baculovirus-Rep original disenada por Urabe et al. (2002, supra).
[0007] Hay asf todavfa una necesidad para superar las limitaciones serias anteriores de produccion (comercial) a gran escala de vectores AAV en las celulas de insecto.
Asf es un objeto de la presente invencion proveer medios y metodos que permiten una produccion de rendimiento elevado y estable (a gran escala) de vectores AAV en las celulas de insecto.
Descripcion de la invencion
Definiciones
[0008] Como se utiliza en este caso, el termino "enlazado operativamente" se refiere a una conexion de elementos polinucleotidos (o polipeptidos) en una relacion funcional.
Un acido nucleico esta "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos.
Por ejemplo, una secuencia reguladora de transcripcion esta operativamente enlazada a una secuencia codificante si esta afecta a la transcripcion de la secuencia codificante.
Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son tfpicamente contiguas y, donde sea necesario para unir dos regiones de codificacion de protefna, contiguas y en el marco de lectura.
[0009] "Secuencia de control de expresion" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que regula la expresion de una secuencia de nucleotidos a la que esta operativamente enlazada.
Una secuencia de control de expresion esta "enlazada operativamente" a una secuencia de nucleotidos cuando la secuencia de control de expresion controla y regula la transcripcion y/o la traduccion de la secuencia de nucleotidos. Asf, una secuencia de control de expresion puede incluir promotores, potenciadores, sitios de introduccion de ribosoma interno (IRES), terminadores de transcripcion, un codon de inicio delante de un gen de codificacion de protefna, senal de empalme para intrones, y codones de parada.
El termino "secuencia de control de expresion" pretende incluir, como mfnimo, una secuencia cuya presencia se disena por expresion de influencia, y tambien pueden incluir componentes ventajosos adicionales.
Por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de pareja de fusion son secuencias de control de expresion.
El termino puede tambien incluir el diseno de la secuencia de acidos nucleicos de manera que codones de iniciacion indeseables potenciales dentro y fuera de marco, son quitados de la secuencia.
Esto puede tambien incluir el diseno de la secuencia de acidos nucleicos de manera que sitios de empalme potenciales indeseables son quitados.
Incluye secuencias o secuencias de poliadenilacion (pA) que dirigen la adicion de una cola poliA, es decir, una cadena de residuos de adenina en el extremo de 3' de secuencias ARNm referidas como secuencias poliA.
Tambien se puede disenar para mejorar estabilidad de ARNm.
Secuencias de control de expresion que afectan a la transcripcion y estabilidad de la traduccion, por ejemplo, promotores, al igual que secuencias que efectuan la traduccion, por ejemplo, secuencias Kozak, se conocen en las celulas de insecto.
Secuencias de control de expresion pueden ser de tal naturaleza que modulan la secuencia de nucleotidos a los que son operativamente enlazadas de manera que son conseguidos niveles de expresion mas bajos o niveles de expresion mas altos.
[0010] Como se utiliza en este caso, el termino "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripcion" se refiere a un fragmento de acido nucleico que funciona para controlar la transcripcion de una o varias secuencias codificantes, y esta localizado arriba con respecto a la direccion de transcripcion del sitio de iniciacion de transcripcion de la secuencia codificante, y es estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de union para ARN-polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciacion de transcripcion y cualquiera de las otras secuencias de ADN, incluyendo, pero no limitado a sitios de union de factor de transcripcion, represor y sitios de union a protefnas activadoras, y cualquiera de las otras secuencias de nucleotidos conocidas por uno de habilidad en la tecnica para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripcion del promotor.
Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en mas tejidos con muchas condiciones fisiologicas y desarrollables.
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Un promotor "inducible" es un promotor que es fisiologicamente o desarrolladamente regulado, por ejemplo por la aplicacion de un inductor qufmico.
Un promotor "especffico de tejido" solo esta activo en tipos especfficos de tejidos o celulas.
[0011] Los terminos "sustancialmente identico", "identidad sustancial" o "esencialmente similar" o "similitud esencial" significan que dos peptido o dos secuencias de nucleotidos, cuando optimamente alineados, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan parametros por defecto, comparten al menos un porcentaje determinado de identidad de secuencia tal y como se define en otra parte aquf.
GAP usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias a lo largo de su longitud entera, maximizando el numero de coincidencias y minimizando el numero de espacios.
Generalmente, se usan los parametros por defecto de GAP, con una penalizacion por creacion de espacio = 50 (nucleotidos) / 8 (protefnas) y penalizacion por extension de espacio = 3 (nucleotidos) / 2 (protefnas).
Para los nucleotidos, la matriz de puntuacion por defecto usada es nwsgapdna y para las protefnas la matriz de puntuacion por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89,915-919).
Esta claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, timina (T) en la secuencia de ADN es considerada igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.
Alineamientos de secuencia y puntuaciones para identidad de secuencia de porcentaje se pueden determinar utilizando programas informaticos, tales como el GCG Wisconsin Package, version 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA o el software libre EMBOSS para Windows (version actual 2.7.1-07).
Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad se puede determinar por la busqueda en las bases de datos tales como FASTA, BLAST, etc.
[0012] Secuencias de nucleotidos que codifican protefnas Rep parvovirales de la invencion tambien se puede definir por su capacidad para hibridar con la secuencia de nucleotidos de SEC ID NO.10, respectivamente, bajo condiciones de hibridacion moderadas o preferiblemente severas.
Condiciones de hibridacion severas son aquf definidas como condiciones que permiten a una secuencia de acidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 50 nucleotidos, 75 o 100 y de la forma mas preferible de aproximadamente 200 o mas nucleotidos, hibridar a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable, y que se lava a 65°C en una solucion que comprende aproximadamente 0,1 M sal, o menos, preferiblemente 0,2 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable.
Preferiblemente, la hibridacion se realiza durante toda la noche, es decir al menos durante 10 horas y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solucion de lavado. Estas condiciones normalmente permitiran la hibridacion especffica de secuencias con aproximadamente 90% o mas en identidad de secuencia.
[0013] Condiciones moderadas son aquf definidas como condiciones que permiten a una secuencia de acidos nucleicos de al menos 50 nucleotidos, preferiblemente de aproximadamente 200 o mas nucleotidos, hibridar a una temperatura de aproximadamente 45°C en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable, y que es lavada a temperatura ambiente en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquiera otra solucion con una fuerza ionica comparable.
Preferiblemente, la hibridacion se realiza durante toda la noche, es decir al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solucion de lavado. Estas condiciones normalmente permitiran la hibridacion especffica de secuencias con hasta 50% en identidad de secuencia.
El experto en la tecnica sera capaz de modificar estas condiciones de hibridacion para especfficamente secuencias de identificado variando en la identidad entre 50% y 90%.
Descripcion detallada de la invencion
[0014] La presente invencion se refiere el uso de parvovirus de animal, en particular dependovirus tal escomo AAV humano infeccioso o sfmico, y sus componentes (por ejemplo, un genoma de parvovirus animal) para uso como vectores para introduccion y/o expresion de acidos nucleicos en celulas mamfferas.
En particular, la invencion se refiere a mejoras en la productividad de tales vectores parvovirales cuando se producen en las celulas de insecto.
[0015] Virus de la familia Parvoviridae son virus pequeno de ADN animal.
La familia Parvoviridae se puede dividir entre dos subfamilias: los Parvovirinae, que infectan a vertebrados, y los Densovirinae, que infectan a insectos.
Miembros de la subfamilia Parvovirinae son aquf referidos como los parvovirus e incluyen el genero Dependovirus. Como se puede deducir del nombre de su genero, los miembros del Dependovirus son unicos en que normalmente requieren coinfeccion con un virus auxiliar tal como adenovirus o virus de herpes para infeccion productiva en el cultivo celular.
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El genero Dependovirus incluye AAV, que infecta normalmente a seres humanos (por ejemplo, serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4), y virus relacionados que infectan a otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adeno-asociados bovinos, caninos, equinos y ovinos).
Mas informacion sobre parvovirus y otros miembros del Parvoviridae es descrita en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996).
Por comodidad la presente invencion es posteriormente ejemplificada y descrita aquf por referencia a AAV.
Es sin embargo entendido que la invencion no esta limitada a AAV sino que puede igualmente aplicarse a otros parvovirus.
[0016] La organizacion genomica de todos los serotipos AAV conocidos es muy similar.
El genoma de AAV es una molecula lineal de ADN monocatenario que tiene menos de aproximadamente 5,000 nucleotidos (nt) de longitud.
Las secuencias repetidoras terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleotidos de codificacion unicas para las protefnas (Rep) de replicacion no estructurales y las protefnas estructurales (VP).
Las protefnas VP (VP1; -2 y -3) forman la capsida.
El terminal 145 nt es autocomplementario y es programado de modo que un duplex intramolecular energeticamente estable que forma una horquilla en forma de T puede formarse.
Estas estructuras de horquilla funcionan como un origen para replicacion de ADN vfrico, sirviendo como cebadores para el complejo de polimerasa de ADN celular.
Despues de la infeccion wtAAV en celulas mamfferas, los genes Rep (es decir Rep78 y Rep52) son expresados del P5 promotor y el P19 promotor, respectivamente, y ambas protefnas Rep tienen una funcion en la replicacion del genoma vfrico.
Un evento de empalme en el ORF Rep produce la expresion de en realidad cuatro protefnas Rep (es decir Rep78; Rep68; Rep52 y Rep40).
Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no empalmado, que codifica protefnas Rep78 y Rep52, en celulas mamfferas es suficiente para produccion de vector AAV.
Tambien en las celulas de insecto las protefnas Rep78 y Rep52 bastan para produccion de vector AAV.
[0017] Un "vector recombinant parvoviral o AAV" (o "vector rAAV" ) aquf se refiere a un vector que comprende una o varias secuencias polinucleotidas de interes, genes de interes o "transgenes" que son flanqueados por secuencias de repeticion de terminal parvoviral o AAV invertido (ITR).
Tales vectores rAAV se pueden replicar y empaquetar en partfculas vfricas infecciosas en caso de existir en una celula huesped de insecto que expresa productos geneticos rep AAV y cap (es decir protefnas Rep AAV y cap). Cuando un vector rAAV se incorpora en una construccion de acidos nucleicos mayor (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plasmido o baculovirus usado para la clonacion o transfeccion), luego el vector rAAV es tfpicamente referido como un "pro-vector" que puede ser "salvado" por replicacion y encapsidacion en presencia de funciones de embalaje AAV y funciones de auxiliar necesarias.
[0018] En un primer aspecto la invencion se refiere a una secuencia de nucleotidos que incluye unas protefnas Rep de parvovirus de animal que codifican secuencias de nucleotidos que comprenden un marco de lectura abierto, donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna Rep78 parvoviral es un codon iniciador suboptimo.
El codon iniciador suboptimo es preferiblemente un codon iniciador que hace salto de exon parcial.
El salto de exon parcial se entiende aquf como que al menos parte de los ribosomas no inician traduccion en el codon iniciador suboptimo de la protefna Rep78 pero a un codon iniciador mas abajo, por lo cual preferiblemente el codon iniciador de mas abajo es el codon iniciador de la protefna Rep52.
El codon iniciador suboptimo preferiblemente realiza salto de exon parcial en la expresion de la secuencia de nucleotidos en una celula de insecto.
Preferiblemente, el codon iniciador suboptimo realiza salto de exon parcial en una celula de insecto para producir en la celula de insecto una proporcion molar de Rep78 a Rep52 en el rango de 1:10 a 10:1,1:5 a 5:1, o 1:3 a 3:1, preferiblemente a alrededor de 20 - 40 horas tras la infeccion, mas preferiblemente a alrededor de 30 - 40 horas tras la infeccion, usando una expresion de baculovirus.
La racion molar de Rep78 y Rep52 se puede determinar mediante transferencia de Western como se describe en el ejemplo 1.1.3, preferiblemente utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce un epftopo comun tanto de Rep78 como de Rep52, o utilizando el anticuerpo descrito en el ejemplo 1.1.3.
[0019] El termino "codon de iniciacion suboptimo" aquf no solo se refiere al codon de iniciacion de trinucleotido mismo sino tambien a su contexto.
Asf, un codon iniciador suboptimo puede consistir en un codon ATG "optimo" en un contexto suboptimo, por ejemplo un contexto no Kozak.
Sin embargo, mas preferidos son codones de iniciacion suboptima donde el codon de iniciacion de trinucleotido mismo es suboptimo, es decir no es ATG.
Suboptimo es aquf entendido como que el codon es menos eficaz en la iniciacion de la traduccion en un contexto de otro modo identico en comparacion con el codon ATG normal.
Preferiblemente, la eficiencia del codon suboptimo es inferior a 90, 80, 60,40 o 20% de la eficiencia del codon ATG normal en un contexto de otro modo identico.
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Metodos para la comparacion de la eficiencia relativa de iniciacion de traduccion son conocidos de por si a la persona experta.
Codones de iniciacion suboptimos preferidos se pueden seleccionar de ACG, TTG, CTG, y GTG.
Mas preferido es ACG.
[0020] Una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas Rep de parvovirus de animal es aquf entendida como una secuencia de nucleotidos que codifica las protefnas Rep no estructurales que se requieren y son suficiente para producir el vector parvoviral en las celulas de insecto como las protefnas Rep78 y Rep52.
La secuencia de nucleotidos de parvovirus animal es preferiblemente de un dependovirus, mas preferiblemente de un virus humano o sfmico adeno-asociado (AAV) y de la forma mas preferible de un AAV que infecta normalmente a seres humanos (por ejemplo, serotipos 1,2, 3A, 3B, 4, 5, y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4).
Un ejemplo de una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas Rep de parvovirus de animal se da en SEC ID n° 10, que representa una parte del genoma de secuencia AAV serotipo-2 que codifica las protefnas Rep.
La secuencia codificante Rep78 comprende nucleotidos 11 - 1876 y la secuencia Rep52 codificante comprende nucleotidos 683 - 1876.
Se entiende que los pesos moleculares exactos de las protefnas Rep78 y Rep52, al igual que las posiciones exactas de los codones de iniciacion de traduccion pueden diferir entre parvovirus diferentes.
Sin embargo, la persona experta sabra identificar la posicion correspondiente en la secuencia de nucleotidos de otros parvovirus que AAV-2.
Una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas Rep de parvovirus de animal puede asf tambien ser definidas como una secuencia de nucleotidos:
a) que codifica un polipeptido que incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98, o 99% en identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID No: 11;
b) que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98, o 99% en identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de posiciones 11 - 1876 de la SEC ID No: 10;
c) la cadena complementaria de esta hibrida a una secuencia de molecula de acido nucleico de (a) o (b);
d) secuencias de nucleotidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molecula de acido nucleico de (c) debido a la degeneracion del codigo genetico.
Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos codifica protefnas Rep de parvovirus animales que se requieren y son suficientes para la produccion de vector parvoviral en las celulas de insecto.
[0021] Una otra secuencia de nucleotidos preferida de la invencion comprende una secuencia de control de expresion que comprende un secuencia de nueve nucleotidos de SEC.ID N°: 7 o una secuencia de nucleotidos sustancialmente homologos para SEC. ID N°: 7, arriba del codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep78 parvoviral.
Una secuencia con identidad sustancial a la secuencia de nucleotidos de SEC. ID N°: 7 y que ayudara a aumentar la expresion de la protefna Rep78 parvoviral es por ejemplo una secuencia que tiene al menos 60%, 70%, 80% o 90% en identidad a la secuencia de nueve nucleotidos de sEc ID n.°: 7.
[0022] Eliminacion de posibles sitios falsos de iniciacion de traduccion en las secuencias codificantes de protefna Rep, diferentes de los sitios de iniciacion de traduccion Rep78 y Rep52, de otro parvovirus sera bien entendido por un artesano de habilidad en la tecnica, como sera la eliminacion de sitios de empalme putativo que se pueden reconocer en las celulas de insecto.
Las varias modificaciones de las secuencias parvovirales tipo salvaje para expresion apropiada en las celulas de insecto se consigue por aplicacion de tecnicas de ingenierfa genetica bien conocidas tales como descrito por ejemplo en Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Varias otras modificaciones de zonas de codificacion de protefnas Rep son conocidas por el experto en la materia que podrfan aumentar la produccion de protefna Rep. Estas modificaciones estan dentro del campo de la presente invencion.
[0023] En otro aspecto la invencion se refiere a una construccion de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas Rep parvovirales tal como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, en la construccion, la secuencia de nucleotidos que codifica las protefnas Rep parvovirales esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
Estas secuencias de control de expresion al menos incluiran un promotor que esta activo en las celulas de insecto. Tecnicas conocidas por un experto en la tecnica para la expresion de genes extranjeros en las celulas huesped de insecto pueden utilizarse para practicar la invencion.
Metodologfa para ingenierfa molecular y expresion de polipeptidos en las celulas de insecto es descrita, por ejemplo, en Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W. H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4,745,051; US2003148506; and WO 03/074714.
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Un promotor especialmente adecuado para la transcripcion de la secuencia de nucleotidos de la invencion que codifica las protemas Rep parvovirales es por ejemplo el promotor poliedro.
Sin embargo, se conocen en la tecnica otros promotores que son activos en las celulas de insecto, por ejemplo los promotores p10; p35, IE-1 o AIE-1 y otros promotores descritos en las referencias anteriores.
[0024] Preferiblemente la construccion de acidos nucleicos para la expresion de las protemas Rep parvoviral en las celulas de insecto es un vector compatible con celula de insecto.
Un "vector compatible con celula insecto" o "vector" se entiende a una molecula de acido nucleico capaz de transformacion o transfeccion productiva de un insecto o celula de insecto.
Vectores biologicos ejemplares incluyen plasmidos, moleculas lineales de acido nucleico, y virus recombinantes. Cualquier vector se puede emplear siempre y cuando sea compatible con celula insecto.
El vector puede se integrar en el genoma de celulas de insecto pero la presencia del vector en el insecto celular no necesita ser permanente y los vectores episomicos transitorios son tambien incluidos.
Los vectores se pueden introducir por cualquier medio conocido, por ejemplo por tratamiento qmmico de las celulas, electroporacion, o infeccion.
En una forma de realizacion preferida, el vector es un baculovirus, un vector vmco, o un plasmido.
En una forma de realizacion mas preferida, el vector es un baculovirus, es decir la construccion es un vector baculoviral.
Vectores baculovirales y metodos para su uso son descritos anteriormente en referencias citadas sobre ingeniena molecular de celulas de insecto.
[0025] En otro aspecto la invencion se refiere a una celula de insecto que comprende no mas de un tipo de secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica una protema Rep parvoviral.
Preferiblemente el marco de lectura abierto unico codifica una o varias de las protemas Rep parvovirales, mas preferiblemente el marco de lectura abierto codifica todas las protemas Rep parvovirales, de la forma mas preferible el marco de lectura abierto codifica la protema Rep 78 en toda su longitud donde preferiblemente al menos tanto las protemas Rep 52 como Rep 78 se pueden expresar en la celula de insecto.
Se entiende aqrn que la celula de insecto puede comprender mas de una copia del tipo unico de secuencia de nucleotidos, por ejemplo en un vector episomico multicopia, pero que estos son copias multiples de esencialmente una y la misma molecula de acido nucleico, o al menos moleculas de acido nucleico que codifican una y la misma secuencia de aminoacidos Rep, por ejemplo moleculas de acido nucleico que solo difieren de una a la otra debido a la degeneracion del codigo genetico.
La presencia de solo un tipo unico de molecula de acido nucleico que codifica las protemas Rep parvovirales evita la recombinacion entre secuencias homologas como puede estar presente en diferentes tipos de vectores que comprenden secuencias Rep, lo que puede dar lugar a construcciones de expresion Rep defectuosas que afectan a (la estabilidad de) los niveles de produccion parvoviral en las celulas de insecto.
Preferiblemente, en la celula de insecto, la secuencia de nucleotidos que comprende el marco de lectura abierto unico que codifica una o varias protemas Rep parvovirales es parte de una construccion de acidos nucleicos donde la secuencia de nucleotidos es operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
Otra celula de insecto preferida comprende como una "primera" secuencia de nucleotidos una secuencia de nucleotidos que tal como se ha definido anteriormente codifica protemas Rep parvovirales, preferiblemente una secuencia codificante con un codon iniciador suboptimo tal como se ha definido anteriormente, o una construccion de acidos nucleicos tal como se ha definido anteriormente o la celula de insecto que comprende como una "primera" construccion de acidos nucleicos una construccion de acidos nucleicos que tal como se ha definido anteriormente comprende tales secuencias de nucleotidos.
[0026] Cualquier celula de insecto que permite la replicacion de un vector (rAAV) parvoviral recombinante y que se pueden mantener en el cultivo se pueden usar conforme a la presente invencion.
Por ejemplo, la lmea celular usada puede ser de Spodoptera frugiperda, lmeas celulares de drosophila, o lmeas celulares de mosquitero, por ejemplo, lmeas celulares derivadas de Aedes albopictus.
Celulas de insecto o lmeas celulares preferidas son celulas de las especies de insecto que son susceptibles de infeccion de baculovirus, incluyendo por ejemplo Se301; SeIZD2109, SeUCR1, Sf9; Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1; Tn368, HzAm1; Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, EE.UU) y expresSF+® (US 6,103,526; Protein Sciences Corp., CT, USA).
[0027] Una celula de insecto preferida segun la invencion, ademas de la descrita anteriormente "primera" secuencia de nucleotidos o una construccion de acidos nucleicos, comprende ademas:
a) una segunda secuencia de nucleotidos que comprende al menos una secuencia de nucleotidos (ITR) de repeticion de terminal invertido parvoviral; y,
b) una tercera secuencia de nucleotidos que comprende secuencias codificantes de protema Cap parvoviral operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
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[0028] En el contexto de la invencion "al menos una secuencia de nucleotidos ITR parvovirales" se entiende como una secuencia palmdroma, que comprende en su mayona secuencias simetricamente complementarias dispuestas tambien referidas como regiones "A", " B", and " C".
El ITR funciona como un origen de replicacion, un sitio con un papel "cis" en la replicacion, es decir, siendo un sitio de reconocimiento protemas de replicacion para que actuan como trans tales como por ejemplo Rep 78 (o Rep68) que reconocen el palmdromo y las secuencias espedficas internas al palmdromo.
Una excepcion a la simetna de la secuencia ITR es la region "D" del ITR.
Es unico (sin tener un complemento dentro de un ITR).
Mellar ADN monocatenario ocurre en la juntura entre las regiones A y D.
Es la region donde la nueva smtesis de ADN se inicia.
La region D esta normalmente a un lado del palmdromo y proporciona direccionalidad al paso de replicacion de acido nucleico.
Un parvovirus que se replica en una celula de mairnfero tfpicamente tiene dos secuencias ITR.
Es, sin embargo, posible disenar un ITR de modo que haya sitios de union en ambos hilos de las regiones A y regiones D esten situadas simetricamente, una a cada lado del palmdromo.
En un molde de ADN circular bicatenario (por ejemplo, un plasmido), la replicacion asistida por Rep78 o Rep68 de acido nucleico luego procede en ambas direcciones y un ITR unico basta para replicar parvoviralmente un vector circular.
Asf, una secuencia de nucleotidos ITR se puede usar en el contexto de la presente invencion.
Preferiblemente, sin embargo, dos u otro numero par de ITR regulares se usan.
De la forma mas preferible, dos secuencias ITR se usan.
Un ITR parvoviral preferido es un ITR AAV.
Por razones de seguridad puede ser deseable la construccion de un vector (rAAV) parvoviral recombinante que sea incapaz de diseminarse adicionalmente despues de la introduccion inicial en una celula.
Tal mecanismo de seguridad para limitar la propagacion de vector indeseable en un receptor se puede proporcionar usando rAAV con un ITR quimerico como se describe en US2003148506.
[0029] El numero de construcciones de acidos nucleicos empleado en la celula de insecto para la produccion del vector (rAAV) parvoviral recombinante no es limitante en la invencion.
Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o mas construcciones separadas se pueden emplear para producir rAAV en las celulas de insecto conforme a los metodos de la presente invencion.
Si cinco construcciones son empleadas, una construccion codifica VP AAV 1, otra construccion codifica AAV VP2, otra construccion codifica AAV VP3, otra construccion mas codifica la protema Rep tal como se ha definido anteriormente y una construccion final comprende al menos un ITR AAV.
Si se usan menos de cinco construcciones, las construcciones pueden comprender varias combinaciones de al menos un ITR AAV y VP1, VP2, VP3, y las secuencias codificantes de protema Rep.
Preferiblemente, dos construcciones o tres construcciones se usan, con dos construcciones que son mas preferidas como se ha descrito anteriormente.
Si se usan dos construcciones, preferiblemente la celula de insecto comprende: (a) una primera construccion de acido nucleico para la expresion de las protemas Rep tal como se ha definido anteriormente, esta construccion comprende ademas las secuencias de nucleotidos terceras tal y como se define en (b) arriba (que comprende secuencias codificantes de protema Cap parvoviral operativamente enlazada por lo menos a una secuencia de control de expresion para la expresion en una celula de insecto; ver tambien mas abajo); y (c) una segunda construccion de acidos nucleicos que comprende la segunda secuencia de nucleotidos tal y como se define en (a) arriba (que comprende al menos una secuencia de nucleotido ITR parvoviral/AAV).
Si se usan tres construcciones, preferiblemente la misma configuracion usada para dos construcciones se usa, excepto que construcciones separadas se usan para la expresion de las protemas capsidas y para la expresion de las protemas Rep.
Las secuencias en cada construccion pueden estar en cualquier orden la una respecto a la otra.
Por ejemplo, si una construccion comprende ITR y un ORF que comprende secuencias de nucleotidos que codifican protemas capsidas de VP, el ORF VP se puede situar en la construccion de manera que, en la replicacion del ADN entre secuencias ITR, el ORF VP es replicado o no replicado.
Para otro ejemplo, las secuencias que codifican Rep y/o el ORF que comprende secuencias de nucleotidos que codifican protemas capsidas de VP pueden estar en cualquier orden en una construccion.
Se entiende que tambien la segunda, tercera y demas construccion(s) de acido nucleico preferiblemente son unos vectores compatibles con celulas de insecto, preferiblemente unos vectores baculovirales como se ha descrito anteriormente.
Alternativamente, en la celula de insecto de la invencion, una o varias de la primera secuencia de nucleotidos, segunda secuencia de nucleotidos, tercera secuencia de nucleotidos y cuarta secuencia de nucleotidos y opcionalmente otras secuencias de nucleotidos pueden estar integradas de forma estable en el genoma de la celula de insecto.
Un tecnico en la materia sabe como introducir de forma estable una secuencia de nucleotidos en el genoma de insecto y como identificar una celula con tal secuencia de nucleotidos en el genoma.
La incorporacion en el genoma se puede ayudar, por ejemplo, usando un vector que comprende unas secuencias de nucleotidos altamente homologas a regiones del genoma de insecto.
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El uso de secuencias especfficas, tales como transposones, es otra forma para introducir una secuencia de nucleotidos en un genoma.
[0030] En la invencion, la tercera la secuencia de nucleotidos que comprende secuencias codificantes de protefna capsida (Cap) parvoviral es aquf entendida como que comprende secuencias que codifican cada una de loas tres protefnas capsidas parvovirales, VP1; -2 y -3.
La tercera secuencia de nucleotidos que comprende las secuencias codificantes de protefna capsida puede estar presente en varias formas.
Por ejemplo, secuencias codificantes separadas para cada uno de las protefnas capsidas VP1; -2 y -3 pueden usarse, por lo cual cada secuencia codificante es operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
Mas preferiblemente, sin embargo, la tercera secuencia de nucleotidos comprende un marco de lectura abierto unico que codifica las tres protefnas capsidas VP1, VP2, y VP3 (AAV) parvovirales animales, donde el codon iniciador para traduccion de la protefna capsida VP1 es un codon iniciador suboptimo que no es ATG como por ejemplo descrito por Urabe et al. (2002, supra).
Un codon iniciador suboptimo para la protefna capsida VP1 puede ser tal como se ha definido anteriormente para la protefna Rep78.
Codones de iniciacion suboptima mas preferidos para la protefna capsida VP1 se pueden seleccionar de ACG, TTG, CTG y GTG, de los cuales CTG y GTG son mas preferidos.
Una tercera secuencia de nucleotidos preferida para la expresion de las protefnas capsidas comprende ademas una secuencia de control de expresion que comprende una secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 o una secuencia de nucleotidos sustancialmente homologa a SEC. ID N°: 7, arriba del codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida VP1.
Una secuencia con identidad sustancial a la secuencia de nucleotidos de SEC. ID N°: 7 y que ayudara a aumentar la expresion de VP1 es por ejemplo una secuencia que tiene al menos 60%, 70%, 80% o 90% en identidad al secuencia de nueve nucleotidos de SEC ID n.°: 7.
Otra tercera secuencia de nucleotidos preferida para la expresion de las protefnas capsidas mas preferiblemente comprende al menos una modificacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida VP1 seleccionada de entre un C en la posicion de nucleotidos 12, un A a posicion de nucleotidos 21, y un C en posicion de nucleotidos 24 (con referencia a posicion 1 como el primer nucleotido del codon iniciador de traduccion; ven SEC ID NO.1).
Eliminacion de posibles codones de iniciacion falsos para la traduccion de VP1 de otros serotipos sera bien entendido por un artesano de habilidad en la tecnica, como sera la eliminacion de sitios de empalme putativo que se pueden reconocer en las celulas de insecto.
Varias otras modificaciones de regiones de codificacion de VP se conocen por el experto en la materia que podrfan bien aumentar el rendimiento de VP y virion o tener otros efectos deseados, tales como tropismo alterado o reduccion de antigenicidad del virion.
Estas modificaciones estan dentro del campo de la presente invencion.
Preferiblemente la secuencia de nucleotidos de la invencion que codifica las protefnas capsidas parvovirales es operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto, que al menos incluiran un promotor que esta activo en las celulas de insecto.
Tales secuencias de control y demas tecnicas y materiales (por ejemplo vectores) para las protefnas capsidas parvovirales de expresion en las celulas huesped de insecto son ya anteriormente descritos para las protefnas Rep.
[0031] En una forma de realizacion preferida de la invencion, la segunda secuencia de nucleotidos presente en las celulas de insecto de la invencion, es decir la secuencia que comprende al menos un ITR parvoviral (AAV), comprende ademas al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes, por lo cual preferiblemente al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes se incorpora en el genoma de un vector (rAAV) parvoviral recombinante producido en la celula de insecto.
Preferiblemente, al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes es una secuencia para la expresion en una celula mamffera.
Preferiblemente, la segunda secuencia de nucleotidos comprende dos secuencias de nucleotidos de ITR parvoviral (AAV) y donde al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes esta localizado entre las dos secuencias de nucleotidos ITR parvoviral (AAV).
Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes (para la expresion en la celula mamffera) sera incorporada en el vector (rAAV) parvoviral recombinante producido en la celula de insecto si esta situada entre dos ITR regulares, o se localiza en cada lado de un ITR disenado con dos D regiones.
[0032] La segunda secuencia de nucleotidos definida aquf arriba puede asf comprender una secuencia de nucleotidos que codifica al menos un "producto genico de interes" para la expresion en una celula mamffera, situada de manera que sera incorporada en un vector (rAAV) parvoviral recombinante replicado en la celula de insecto. Cualquier secuencia de nucleotidos se puede incorporar para mas tarde expresarse en una celula mamffera modificada con el vector (rAAV) parvoviral recombinante producido conforme a la presente invencion.
La secuencia de nucleotidos puede por ejemplo codificar una protefna que puede expresar un agente ARNi, es decir una molecula de ARN que es capaz de interferencia de ARN tal como por ejemplo un ARNhc (hairpinARN corto) o un siARN (interferencia corta ARN). "siARN" significa un ARN pequeno de interferencia que es un ARN bicatenario
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de longitud corta que no es toxico en celulas mamfferas (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47).
En una forma de realizacion preferida, la segunda secuencia de nucleotidos puede comprender dos secuencias de nucleotidos y cada una codifica un producto genico de interes para la expresion en una celula mamffera.
Cada una de los dos secuencias de nucleotidos que codifican un producto de interes esta localizada de manera que sera incorporada en un vector parvoviral (rAAV) recombinante replicado en la celula de insecto.
[0033] El producto de interes para la expresion en una celula mamffera puede ser un producto genico terapeutico.
Un producto genico terapeutico puede ser un polipeptido, o una molecula de ARN (siARN), u otro producto genico que, cuando expresado en una celula objetivo, proporciona un efecto terapeutico deseado tal como por ejemplo la ablacion de una actividad no deseada, por ejemplo la ablacion de una celula infectada, o la complementacion de un defecto genetico, por ejemplo causando una deficiencia en una actividad enzimatica.
Ejemplos de productos geneticos de polipeptidos terapeuticos incluyen CFTR, Factor IX, lipoprotefna-lipasa (LPL, preferiblemente LPL S447X; ver WO 01/00220), apolipoprotefna A1, glucuronosiltransferasa de difosfato de uridina (UGT), protefna de interaccion de regulador de Retinitis Pigmentosa GTPase (RP-GRIP), y citocinas o interleukinas como por ejemplo IL-10.
[0034] Alternativamente, o ademas como un segundo producto genico, la segunda secuencia de nucleotidos definida aquf arriba puede comprender un polipeptido que codifica una secuencia de nucleotidos que sirven como protefnas marcadoras para valorar transformacion celular y expresion.
Protefnas marcadoras adecuadas para este proposito son por ejemplo la protefna GFP fluorescente, y la timidina quinasa HSV de genes marcadores seleccionables (para seleccion en el medio HAT), higromicina bacteriana B fosfotransferasa (para seleccion en la higromicina B), Tn5 fosfotransferasa de aminoglicosido (para seleccion en G418), y dihidrofolato reductasa (DHFR) (para seleccion en el metotrexato), CD20, el gen de factor de crecimiento de nervio de baja afinidad.
Fuentes para obtener estos genes marcadores y metodos para su uso se proporcionan en Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Ademas, la segunda secuencia de nucleotidos definida aquf arriba puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que puede servir como un mecanismo de fallo de seguridad que permite polimerizar un sujeto de celulas transducidas con el vector (rAAV) parvoviral recombinante de la invencion, si se cree necesario. Tal secuencia de nucleotidos, frecuentemente referida como un gen suicida, codifica una protefna que es capaz de convertir un profarmaco en una sustancia toxica que es capaz de matar las celulas transgenicas donde la protefna es expresada. Ejemplos adecuados de tales genes suicidas incluyen por ejemplo el gen de E.coli de deaminasa de citosina o un de los genes de timidina quinasa de virus herpes simplex, citomegalovirus y virus Varicella-Zoster, en cuyo caso ganciclovir puede ser utilizado como profarmaco para matar las celulas transgenicas en el sujeto (ver por ejemplo Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849).
[0035] En otra forma de realizacion uno de los productos geneticos de interes puede ser una protefna AAV.
En particular, una protefna Rep, tal como Rep78 o Rep68, o un fragmento funcional de la misma.
Una secuencia de nucleotidos que codifica un Rep78 y/o un Rep68, si esta presente en el genoma de un vector (rAAV) parvoviral recombinante de la invencion y expresada en una celula mamffera transducida con el vector, permite la integracion del vector (rAAV) parvoviral recombinante en el genoma de la celula de mamffero transducido. La expresion de Rep78 y/o Rep68 en una celula transducida rAAV o infectada mamffera puede proporcionar una ventaja para ciertos usos del vector (rAAV) parvoviral recombinante, porque permite expresion a largo plazo o permanente de cualquier otro producto genico de interes introducido en la celula por el vector.
[0036] En los vectores (rAAV) parvovirales recombinantes de la invencion, el al menos una secuencia(s) de nucleotido que codifica un producto genico de interes para la expresion en una celula mamffera, preferiblemente esta operativamente enlazado por lo menos una secuencia de control de expresion compatible con celula mamffera, por ejemplo, un promotor.
Muchos de estos promotores se conocen en la tecnica (ver Sambrook y Russel, 2001, supra).
Promotores constitutivos que son aproximadamente expresados en muchos tipos de celula, tales como el promotor CMV, pueden ser utilizados.
Sin embargo, seran mas preferidos promotores que son inducibles, especfficos de tejido, especificos de tipo de celula, o especfficos de ciclo celular.
Por ejemplo, para la expresion especffica de hfgado, se puede seleccionar un promotor de un promotor a1-anti- tripsina, un promotor de globulina de union de hormona de tiroides, un promotor de albumina, un promotor LPS (union de globulina tiroxina), un promotor HCR-ApoCII hfbrido, un promotor HCR-hAAT hfbrido y un promotor de apolipoprotefna E.
Otros ejemplos incluyen el promotor E2F para selectivos de tumor, y, en particular, expresion selectiva de tumor de celula neurologica (Parr et al., 1997, Nat. Med. 3:1145-9) o el promotor IL-2 para su uso en celulas de sangre mononucleares (Hagenbaugh et al., 1997, J Exp Med; 185: 2101-10).
[0037] AAV es capaz de infectar un numero de celulas mamfferas.
Ver, por ejemplo, Tratschin et al. (1985, Mol. Cell Biol. 5:3251-3260) and Grimm et al. (1999, Hum. Gene Ther. 10:2445-2450).
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Sin embargo, la transduccion AAV de fibroblastos sinoviales de humano es significativamente mas eficaz que en celulas murinas similares, JJennings et al., Arthritis Res, 3:1 (2001), y la troficidad celular de AAV difiere entre serotipos. Ver, por ejemplo, Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3428-3432), que discuten diferencias entre AAV2, aAV4, y AAV5 respecto al tropismo de celula CNS mamffero y eficiencia de transduccion.
[0038] Secuencias AAV que se pueden utilizar en la presente invencion para la produccion de vectores de AAV recombinante en las celulas de insecto se pueden derivar del genoma de cualquier serotipo AAV.
Generalmente, los serotipos AAV tienen secuencias genomicas de homologfa significativa en el aminoacido y los niveles de acido nucleico, proporcionan un conjunto identico de funciones geneticas, producen viriones que son esencialmente ffsicamente y funcionalmente equivalentes, y replican y ensamblan por mecanismos practicamente identicos.
Para la secuencia genomica de los varios serotipos AAV y una vision de conjunto de las similitudes genomicas ven por ejemplo GenBank Numero de registro U89790; GenBank Numero de registro J01901; GenBank Numero de registro AF043303; GenBank Numero de registro AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); y Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47).
Serotipos AAV 1,2, 3, 4 y 5 son fuentes preferidas de secuencias de nucleotidos de AAV para usar en el contexto de la presente invencion.
Preferiblemente las secuencias ITR AAV para su uso en el contexto de la presente invencion son derivadas de AAV1, AAV2, y/o AAV4.
Asimismo, las secuencias Rep (Rep78 y Rep52) codificantes son preferiblemente derivadas de AAV1, AAV2, y/o AAV4.
Las secuencias codificante para las protefnas capsidas VP1, VP2, y VP3 para su uso en el contexto de la presente invencion pueden sin embargo ser tomadas de cualquiera de 42 serotipos conocidos, mas preferiblemente de partfculas AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AaV7, AAV8 o AAV9 o tipo AAV desarrolladas recien obtenidas por ejemplo por tecnicas de redistribucion de capsida y bibliotecas de capsida AAV.
[0039] Secuencias Rep AAV e ITR estan particularmente conservadas entre mas serotipos.
Las protefnas Rep78 de varios serotipos AAV son por ejemplo mas del 89% identicas y la identidad de secuencia de nucleotidos total en el nivel de genoma entre AAV2; AAV3A, AAV3B, y AAV6 es de alrededor de 82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947).
Ademas, las secuencias Rep e ITR de muchos serotipos AAV se conocen por eficazmente complementar de forma cruzada (es decir, sustituir funcionalmente) secuencias correspondientes de otros serotipos en la produccion de partfculas de AAV en celulas mamfferas.
US2003148506 informa que secuencias Rep AAV e ITR tambien complementan eficazmente de forma cruzada otras secuencias Rep AAV e ITR en las celulas de insecto.
[0040] Las protefnas de VP AAV se conocen por decidir la tropicidad celular del virion AAV.
Las secuencias de codificacion de protefna de VP estan significativamente menos conservadas que protefnas y genes Rep entre serotipos de AAV diferentes.
La capacidad de secuencias Rep e ITR para complementar de forma cruzada secuencias correspondientes de otros serotipos permite la produccion de partfculas rAAV pseudotipadas que comprenden las protefnas capsidas de un serotipo (por ejemplo; AAV3) y las secuencias Rep y/o ITR de otro serotipo AAV (por ejemplo, AAV2).
Tales partfculas rAAV pseudotipadas son una parte de la presente invencion.
[0041] Secuencias modificadas "AAV" tambien se pueden usar en el contexto de la presente invencion, por ejemplo para la produccion de vectores rAAV en las celulas de insecto.
Tales secuencias modificadas por ejemplo incluyen secuencias con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o mas identidad de secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos (por ejemplo, una secuencia con aproximadamente 75-99% en identidad de secuencia de nucleotidos) a un AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, iTR Rep, o VP se puede usar en lugar de secuencias AAV de tipo salvaje, iTR Rep, o VP.
[0042] Aunque similar a los otros serotipos AAV en muchos aspectos, AAV5 difiere de otro serotipos AAV humanos y sfmicos mas que otros serotipos conocidos humano y sfmicos.
En la vista de esto, la produccion de AAV5 puede diferir de la produccion de otros serotipos en las celulas de insecto.
Cuando metodos de la invencion se emplean por producir AAV5, se prefiere que una o varias construcciones comprendan, colectivamente en el caso superior a una construccion, una secuencia de nucleotidos que incluye un AAV5 ITR, una secuencia de nucleotidos comprende una secuencia codificante AAV5 Rep (es decir una secuencia de nucleotidos comprende un AAV5 Rep78).
Tales secuencias iTr y Rep se pueden modificar como se desee para obtener produccion eficaz de vectores AAV5 o pseudotipados AAV en las celulas de insecto.
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Por ejemplo, el codon de inicio de las secuencias Rep puede ser modificado, los sitios de empalme VP se pueden modificar o eliminar, y/o el codon de inicio VP1 y nucleotidos cercanos se pueden modificar para mejorar la produccion de vectores AAV5 en la celula de insecto.
[0043] En otro aspecto la invencion se refiere asf a un metodo para la produccion de un virion (rAAV) parvoviral recombinante (que comprende un vector (rAAV) parvoviral recombinante tal como se ha definido anteriormente) en una celula de insecto.
Preferiblemente, el metodo comprende los pasos de: (a) cultivo de una celula de insecto como definido aquf arriba bajo condiciones de manera que vector (rAAV) parvoviral recombinante es producido; y, (b) recuperacion del vector (rAAV) parvoviral recombinante.
Es entendido aquf que el vector (rAAV) parvoviral recombinante producido con el metodo es preferiblemente un virion parvoviral infeccioso o AAV que comprenden los acidos nucleicos de vector (rAAV) parvoviral recombinante. Las condiciones de crecimiento para celulas de insecto en el cultivo, y la produccion de productos heterologos en las celulas de insecto en el cultivo son bien conocidas en la tecnica y descritas por ejemplo en las referencias citadas anteriores en la ingenierfa molecular de celulas de insectos.
[0044] Preferiblemente el metodo comprende ademas la etapa de purificacion de afinidad de (los viriones comprendiendo) el vector (rAAV) parvoviral recombinante que utiliza un anticuerpo anti-AAV, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado.
El anticuerpo anti-AAV es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
Un anticuerpo especialmente adecuado es un anticuerpo de camelido monocatenario o un fragmento del mismo como por ejemplo obtenible de camellos o llamas (ver por ejemplo Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302).
El anticuerpo para purificacion de afinidad de rAAV preferiblemente es un anticuerpo que especfficamente se enlaza un epftopo en una protefna capsida AAV, por la cual preferiblemente el epftopo es un epftopo que esta presente en protefna capsida superior a un serotipo AAV.
Por ejemplo el anticuerpo se puede elevar o seleccionar basandose en enlace especffico a capsida AAV2 pero al mismo tiempo tambien puede tambien enlazar especfficamente con capsidas AAV1, AAV3 y AAV5.
[0045] En otro aspecto la invencion se refiere a un virion rAAV producido en los metodos descritos anteriormente de la invencion, usando las construcciones de acidos nucleicos y celulas tal como se ha definido anteriormente. Preferiblemente el virion rAAV comprende en su genoma al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes, por lo cual al menos una secuencia de nucleotidos no es una secuencia de nucleotidos de AAV nativa, y por lo cual en la estequiometrfa de las protefnas capsidas AAV VP1, VP2, y VP3 la cantidad de VP1: (a) es al menos 100, 105, 110, 120, 150, 200 o 400% de la cantidad de VP2 o (b) es al menos 8, 10, 10,5, 11, 12, 15, 20 o 40% de la cantidad de VP3 o (c) es al menos tal y como se define en tanto (a) y (b).
Preferiblemente, la cantidad de VP1, VP2 y VP3 se determina usando un anticuerpo que reconoce un epftopo que es comun a cada uno de VP1, VP2 y VP3.
Varios inmunoensayos estan disponibles en la tecnica que permitiran cuantificar las cantidades relativas de VP1, VP2 y/o VP3 (ver por ejemplo Using Antibodies, E. Harlow and D. Lane, 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Un anticuerpo adecuado que reconoce un epftopo que es comun a cada una de la tres protefnas capsidas es por ejemplo el anticuerpo anti-Cap de raton B1 (como esta comercialmente disponible de Progen, Alemania).
Un virion rAAV preferido segun la invencion es un virion que comprende en su genoma al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes, por lo cual al menos una secuencia de nucleotidos no es una secuencia de nucleotidos de AAV nativa, y por lo cual el virion AAV comprende una protefna capsida VP1 que comprende una leucina o una valina en posicion de aminoacido 1.
Un virion de AAV mas preferido segun la invencion tiene la proporcion de protefnas capsidas tal como se ha definido anteriormente y comprende una protefna capsida VP1 que comprende una leucina o una valina en posicion de aminoacido 1.
[0046] En otros aspectos la invencion pertenece a las siguientes formas de realizacion numeradas:
1. Una secuencia de nucleotidos que incluye un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleotidos que codifican protefnas Rep parvovirales, donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna Rep78 parvoviral es un codon iniciador que realiza salto de exon parcial ante expresion en las celulas de insecto.
2. Una secuencia de nucleotidos segun forma de realizacion 1, donde el codon iniciador es seleccionado de ACG, TTG, CTG, y GTG.
3. Una secuencia de nucleotidos segun formas de realizacion 1 o 2, donde la secuencia de nucleotidos comprende una secuencia de control de expresion que comprende un secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 o una secuencia de nucleotidos sustancialmente homologa a SEC. ID N°: 7, arriba del codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep78 AAV.
4. Una secuencia de nucleotidos segun cualquiera de las formas de realizacion de la 1 a la 3, donde las protefnas Rep parvovirales son protefnas Rep (AAV) de virus adeno-asociado.
5. Una construccion de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos segun cualquiera de las formas de realizacion de la 1 a la 4, donde la secuencia de nucleotidos esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
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6. Una construccion de acidos nucleicos segun la forma de realizacion 5, donde la secuencia de nucleotidos esta operativamente enlazada a un promotor de poliedro.
7. Una construccion de acidos nucleicos segun las formas de realizacion 5 o 6, donde la construccion es un vector compatible con celula de insecto, preferiblemente un vector baculoviral.
8. Una celula de insecto que comprende no mas de un tipo de secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica una o varias protefnas Rep parvovirales.
9. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 8, donde el marco de lectura abierto unico codifica la protefna Rep en toda su longitud 78 .
10. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 8 o 9, donde la secuencia de nucleotidos que comprende el marco de lectura abierto unico que codifica una o varias protefnas Rep parvovirales es parte de una construccion de acidos nucleicos donde la secuencia de nucleotidos esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
11. Una celula de insecto segun cualquier forma de realizacion de la 8 a la 10, donde la celula de insecto comprende una primera secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica una o varias protefnas Rep parvovirales tal y como se define en cualquier forma de realizacion 1 - 4, o una primera construccion de acidos nucleicos donde la secuencia de nucleotidos esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto tal y como se define en cualquiera de las formas de realizacion 5 - 7.
12. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 11, donde la celula de insecto comprende ademas:
a) una segunda secuencia de nucleotidos que comprende al menos una secuencia de nucleotidos (ITR) de repeticion invertida de terminal parvoviral; y,
b) una tercera secuencia de nucleotidos que comprende secuencias que codifican protefna capsida parvoviral operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
13. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 12, donde la celula de insecto comprende:
a) una primera construccion de acidos nucleicos segun cualquier forma de realizacion de la 5 a la 7, donde la primera construccion de acidos nucleicos comprende ademas una tercera secuencia de nucleotidos tal y como se define en (b) de la forma de realizacion 9; y,
b) una segunda construccion de acidos nucleicos que comprende la segunda secuencia de nucleotidos tal y como se define en (a) de la forma de realizacion 9.
14. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 13, donde la segunda construccion de acidos nucleicos es un vector compatible con celula de insecto, preferiblemente un vector baculoviral.
15. Una celula de insecto segun cualquier forma de realizacion de la 12 a la 14, donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende ademas al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes y por la cual al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes se incorpora en el genoma de un vector parvoviral producido en la celula de insecto.
16. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 15, donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende dos secuencias de nucleotidos ITR parvovirales y donde al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes esta localizada entre las dos secuencias de nucleotidos ITR parvovirales.
17. Una celula de insecto segun cualquier forma de realizacion de la 12 a la 16, donde la tercera secuencia de nucleotidos que incluye un marco de lectura abierto comprende secuencias de nucleotidos que codifican protefnas capsidas VP1, VP2, y VP3 parvovirales donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna capsida VP1 parvoviral es seleccionado de ACG, TTG, CTG, y GTG.
18. Una celula de insecto segun la forma de realizacion 17, donde la tercera secuencia de nucleotidos comprende una secuencia de control de expresion que comprende un secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 o una secuencia de nucleotidos sustancialmente homologa a SEC. ID N°: 7, arriba del codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida de VP1 parvoviral.
19. Una celula de insecto segun las formas de realizacion 17 o 18, donde la tercera secuencia de nucleotidos comprende ademas al menos una modificacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida de VP1 parvoviral seleccionada de entre un C en la posicion de nucleotido 12, un A en la posicion de nucleotido 21, y un C en la posicion de nucleotido 24.
20. Una celula de insecto segun cualquiera de las formas de realizacion de la 12 a la 19, donde al menos una de la primera secuencia de nucleotidos, segunda secuencia de nucleotidos, y tercera secuencia de nucleotidos esta de forma estable integrada en el genoma de la celula de insecto.
21. Una celula de insecto segun cualquiera de las formas de realizacion de la 8 a la 20, donde el parvovirus es AAV.
22. Un metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante en una celula de insecto, donde el virion comprende una segunda secuencia de nucleotidos tal y como se define en cualquiera de las formas de realizacion 12, 15 y 16, donde el metodo incluye las etapas de:
a) cultivo de una celula de insecto tal y como se define en cualquiera de las formas de realizacion de la 12 a la 21 bajo condiciones de manera que virion parvoviral recombinante es producido; y,
b) recuperacion del virion parvoviral recombinante.
23. Un metodo segun la forma de realizacion 22, que comprende ademas la etapa de purificacion de afinidad del virion que utiliza un anticuerpo anti-parvoviral, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado.
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24. Un metodo segun la forma de realizacion 23, donde el anticuerpo anti-parvoviral es un anticuerpo camelido monocatenario o un fragmento del mismo.
25. Un metodo segun cualquier forma de realizacion de la 22 a la 24, donde el virion parvoviral recombinante es un virion de AAV recombinante.
[0047] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que suceden a la palabra estan incluidos, pero los elementos no especfficamente mencionados no estan excluidos.
Ademas, la referencia a un elemento por el artfculo indefinido "a" o "un" no excluye la posibilidad que mas de uno del elemento este presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos.
El artfculo indefinido "a" o "un" por lo tanto normalmente significa "al menos uno".
Descripcion de las figuras
[0048]
Figura 1:
A) La organizacion de expresion Rep en el genoma de AAV de tipo salvaje.
Los genes Rep78 y Rep 52 son expresados respectivamente de promotores P5 y P19.
Expresion de Rep68 y Rep40 (que son las variantes empalmadas de resp. Rep78 Y Rep52) no es mostrada.
Ambas unidades de expresion contienen un sitio de iniciacion ATG.
B) La construccion de la invencion tiene el ORF Rep bajo el control de un promotor unico (por ejemplo el promotor (PolH) poliedro).
Este promotor conduce la expresion tanto de Rep78 como de Rep52 debido a que el codon iniciador Rep78 ATG se convierte en el codon iniciador alterno ACG y es parcialmente saltado por el ribosoma.
C) La construccion original por Urabe et al. (2002; supra) conduce Rep78 y Rep52 independientemente de dos promotores diferentes (resp. AIE1 y polH).
Figura 2: Analisis de electrotransferencia de protefnas Rep expresadas de baculovirus recombinante que fue pasajeado 5 veces en las celulas de insecto.
El baculovirus original disenado por Urabe et al., 2002 (original REP/Bac-to-Bac) produce una reduccion lenta de expresion de Rep78/52 durante 5 pasajes.
La unidad de expresion para Rep78 y 52 disenada por Urabe et al., 2002 insertado en el esqueleto de baculovirus PSC (REP original / PSC) tambien resulta en una reduccion de expresion de Rep78/52 tras el pasaje en las celulas de insecto.
Sin embargo, el baculovirus con la unidad de expresion REP con el codon iniciador ACG en el PSC esqueleto (REP-ACG / PSC) produce expresion estable de Rep78/52 por al menos 5 pasajes.
El analisis de electrotransferencia fue realizado como se describe en el ejemplo 1.1.3.
Figura 3: Resultados de la tabla 1 fijados en un grafico.
Figura 4: Comparacion de las estabilidades de varias construcciones rAAV en las celulas de insecto. La produccion rAAV en celulas SF+ fue realizada como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1.
Para todas las producciones el ITR que contiene baculovirus y el gen de capsida que contiene baculovirus fueron identicos, el numero de pasaje fue el mismo que el gen Rep que contiene baculovirus. 4 genes Rep diferentes que contienen baculovirus fueron usados: 1) el REP-ACG / PSC, 2) SLR: la construccion original por Urabe et al. (2002; supra), 3) Rep52 + Rep78(B2B): dos Bac-to-Bac baculovirus separados, uno con el gen Rep 78 y el otro con el gen Rep 52. 4) Rep52 + Rep78(PSC): dos baculovirus de ciencias de protefna separada, uno conteniendo el gen Rep 78 y el otro con el genRep 52.
Figura 5: Estabilidad de las construcciones REP-ACG / PSC de baculovirus hasta el pasaje 8. Producciones rAAV en celulas SF+ fueron realizadas como se describe en el ejemplo 1.
Figura 6: Comparacion del efecto del efecto de pasaje en la expresion de protefna rep de la construccion original de Urabe et al. (2002; supra) con una construccion REP-ACG / PSC conforme a la invencion.
Los pasajes de baculovirus y la transferencia Western fueron hechos como se describe en el ejemplo 1. Durante un pasaje normal de los baculovirus rep, se tomaron muestras a 40 horas despues de la adicion de los baculovirus a las celulas SF y la transferencia Western fue realizada.
Ejemplos
Ejemplo 1: construcciones Rep
1.1. Materiales y metodos
1.1.1 Construccion de plasmido de Baculovirus
[0049] Para expresar Rep78 y Rep52 de un unico mensajero bicistronico ARN, el codon iniciador ATG de Rep78 situado en el vector de expresion pFastBacDualSLR (Urabe et al., 2002, supra) fue convertido en ACG.
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El cebador hacia arriba usado fue:
BamHI
5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3' (SEC ID NO.8)
SECUENCIA DE CEBADOR hacia adelante
[0050] El cebador 3' que fue usado en la reaccion por PCR flanqueab el gen REP78 y contiene un sitio de Xbal (TCTAGA):
XbaI
5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'
(SEC ID NO.9)
SECUENCIA DE CEBADOR inverso
[0051] La secuencia entre el conjunto de cebador mencionado arriba fue amplificada por PCR (volumen de reaccion 50 pl; 1x Pfx Amp. Bufer, 0,3mM del dNTP, 1mM MgSO4,150mM cebador forw., 150mM cebador giran., 2x solucion intensificadora, modelo 50ng (pFastBacDualSLR), 1 U platino Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, US) utilizando el protocolo siguiente: 1 ciclo de 95°C, 5 min; 35 ciclos de 95°C, 15 seg; 55°C, 30 seg; 72°C, 2 min; 1 ciclo de 72°C, 10 min; 4°C, para siempre).
El producto PCR fue clonado en PCR-blunt II-TOPO usando el equipo de clonacion de PCR Zero Blunt TOPO PCR. El Rep78 fue subclonado en pFastBacDual (Invitrogen) que utiliza los sitios de restriccion SpeI y XbaI.
El casete de expresion Rep mutado fue finalmente clonado (usando enzimas de restriccion BstZ17I y AvrII) en la construccion de expresion de baculovirus (cortado con EcoRV y XbaI) pPSC10 (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT, USA).
El analisis de secuencias de la construccion fue verificado por Baseclear, Leiden, Pafses Bajos.
1.1.2 Produccion de baculovirus recombinante
[0052] Baculovirus recombinantes derivados del virus nuclear Autographa californica (AcNPV) fueron producidos utilizando el GeneXpress BaculoKIT (Protein Sciences Corporation).
Transfeccion fue realizada de la siguiente manera: en un tubo de fondo redondo de 14ml se mezclaron 200 pl medio GRACE con 6 pl de cellfectina (Invitrogen), y en un tubo de Eppendorf 200 pl medio GRACE fueron mezclados con 50 pl ADN vfrico (ciencias de protefna) y 2 pg de plasmido de transferencia (Rep).
El contenido del tubo de Eppendorf fue adicionado al tubo y mezclado cuidadosamente.
Despues un periodo de incubacion de 30 minutos a RT 1,300 pl GRACE se anadio a la mezcla de transfeccion. Celulas de insecto en un matraz T25 fueron lavados con medio GRACE y la mezcla de transfeccion fue anadida gota a gota a la capa celular.
Tras una incubacion de 6 horas a 28°C suero SF900II suplementado con 10% FBS fue anadido cuidadosamente y el matraz T25 fue metido en un hornillo a 28°C durante 5 dfas despues de los cuales el baculovirus recombinante fue cosechado.
1.1.3 Analisis de electrotransferencia
[0053] Celulas de insecto (SF+) fueron infectadas con baculovirus-REP.
A16, 40, y 64 horas tras la infeccion, una muestra fue tomada de las celulas y las celulas fueron lisadas anadiendo 0,1V 10 x TRIS bufer de lisis (1,5M NaCl, 0,5M TRIS, 0,01M MgCl, 1% Triton X-100, pH8.5, filtro esterilizado) e incubado a 28°C durante 30 minutos en una coctelera (Innova 44, New Brunswick).
ADN desnudo y ARN fueron degradados por incubacion con benzonasa a 37°C durante 30 minutos.
Lisado celular fue centrifugado (1,900 x g; 15 min; 4°C).
NuPage LDS bufer de muestra (4x; Invitrogen) fue adicionado a una muestra del sobrenadante y fue cargado sobre un gel 4-12% Bis-Tris (120V).
Las protefnas fueron transferidas a una membrana PVDF (BioRad) durante 30 minutos, 10V (transferencia Semidry). Inmunoqufmica Western fue realizada por el bloqueo de la membrana con bufer de bloqueo Superblock-PBS (PIERCE) y se realizo incubacion subsequente con raton anti-Rep (303.9, Progen, Alemania; dilucion 1:50) y HRP anti-raton conejo (DAKO, dilucion 1:500).
Las protefnas Rep fueron visualizadas por coloracion quimioluminiscente con lumi-luz mas sustrato de transferencia Western (Roche).
1.2 Resultados
[0054] El rendimiento de la recien disenada construccion Rep de la invencion (REP-ACG / PSC) fue comparado con las construcciones Rep originales en tanto 1) esqueleto de baculovirus PSC como en 2) esqueleto de baculovirus Bac-to-Bac (Urabe et al..2002).
Las tres construcciones fueron pasajeados en serie hasta pasaje 5.
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Experimentos de produccion de AAV1-LPL fueron realizados utilizando las construcciones Rep de pasajes 2, 3, 4 y 5 en combinacion con un AAV-LPL y un baculoviru recombinante de AAV-Cap de respectivamente pasajes 2, 3, 4 y 5 (los AAV-LPL y Baculovirus recombinante de AAV-Cap usados aquf son descritos abajo en el ejemplo 2). Rendimiento de produccion de AAV1-LPL fue determinado por qPCR y se muestra en la tabla 1.
El baculovirus original disenado por Urabe et al., 2002 (original REP/Bac-to-Bac) produce una reduccion rapida de produccion de AAV por 5 pasajes.
La unidad de expresion para disenado Rep por Urabe et al., 2002 insertada en el esqueleto de baculovirus PSC (REP original / PSC) tambien resulta en una reduccion de produccion de AAV tras el pasaje en las celulas de insecto.
Sin embargo, el baculovirus con la unidad de expresion REP con el codon iniciador esqueleto ACG en el PSC (REP- ACG / PSC) produce produccion de AAV estable por al menos 5 pasajes.
Por lo tanto, la produccion reproducible de rendimientos de AAV-LPL a lo largo de diferentes pasajes (por ejemplo 2 a 5) fue solo obtenida usando baculovirus con la construccion REP-ACG.
Tabla 1: Produccion de viriones rAAV usando las construcciones de baculovirus de diferentes pasajes: celulas Sf9 fueron infectadas con tres baculovirus recombinantes que codifican una unidad de LPL-vector de pasaje 2, 3, 4 o 5, unidad de pasaje 2, 3, 4 o 5 de una expresion Rep y una unidad de pasaje expresion de Cap 2, 3, 4 o 5.
Tras tres dfas, las celulas fueron cosechadas y rendimientos AAV (genomas de vector por ml; vg/ml) fueron
determinados por qPCR.
- Pasaje
- REP original / PSC vg/ml REP-ACG / PSC vg/ml REP original / Bac-to-Bac vg/ml
- 2
- 5,38E+09 3,04E+09 3,62E+10
- 3
- 9,57E+09 4,77E+09 7,28E+09
- 4
- 1,66E+09 7,81 E+09 7,59E+08
- 5
- 7,35E+08 9,90E+09 2,03E+08
Tabla 2: Q-PCR realizado en el varias construcciones Bac-Rep tras pasaje en las celulas de insecto (pasaje 2-5).
- Graduacion (g c's/ml)
- ORF
- Rep78 Rep52 proporcion ORF/Rep78 proporcion ORF/Rep52
- REP/Bac-to-Bac Original P2
- 1,4E+09 2,2E+08 2,4E+08 6,42 5,82
- REP/Bac-to-Bac Original P3
- 6,4E+08 5,6E+07 5,0E+07 11,43 12,93
- REP/Bac-to-Bac Original P4
- 2,1E+09 7,1E+07 6,5E+07 29,47 32,02
- REP/Bac-to-Bac Original P5
- 1,7E+09 3,2E+07 2,5E+07 53,68 69,67
- REP-ACG / PSC (C4) P2
- 3,0E+09 2,7E+09 2,9E+09 1,11 1,04
- REP-ACG / PSC (C4) P3
- 2,3E+09 2,0E+09 2,2E+09 1,11 1,05
- REP-ACG / PSC (C4) P4
- 2,5E+09 2,2E+09 2,3E+09 1,13 1,08
- REP-ACG / PSC (C4) P5
- 2,7E+09 2,1E+09 2,5E+09 1,26 1,07
- REP-ACG / PSC (A3) P2
- 2,5E+09 2,2E+09 2,5E+09 1,18 1,00
- REP-ACG / PSC (A3) P3
- 4,2E+09 3,9E+09 4,0E+09 1,08 1,04
- REP-ACG / PSC (A3) P4
- 2,7E+09 2,4E+09 2,5E+09 1,10 1,05
- REP-ACG / PSC (A3) P5
- 1,5E+09 1,5E+09 1,5E+09 1,03 0,98
- REP/Bac-to-Bac P2 Original
- 1,0E+09 1,1E+09 1,1E+09 0,95 0,87
- REP/Bac-to-Bac P3 Original
- 7,1E+08 6,7E+08 8,1E+08 1,07 0,88
- REP/Bac-to-Bac P4 Original
- 1,3E+08 1,1E+08 1,3E+08 1,18 1,03
- REP/Bac-to-Bac P5 Original
- 1,3E+08 5,3E+07 6,9E+07 2,34 1,82
[0055] La tabla 2 muestra los resultados de un ensayo (q-PCR) de PCR cuantitativo que fue disenado para la unidad de expresion Rep en los baculovirus recombinantes y para un ORF de baculovirus flanqueante (copias de gen por ml; gc's/ml).
La proporcion entre los valores Q-PCR determina la presencia de deleciones en el Rep-baculovirus.
Una proporcion de 1 teoricamente significa que todos los baculovirus en el lote contienen una secuencia 52 o Rep78 recombinante
El baculovirus original disenado por Urabe et al., 2002 (original REP/Bac-to-Bac) muestra cantidades significativas del baculovirus recombinante en pasaje 5 tiene deleciones en las secuencias Rep.
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La unidad de expresion para Rep78 y 52 disenada por Urabe et al., 2002 insertada en el esqueleto de baculovirus PSC (REP original / PSC) muestra una perdida muy temprana y espectacular de baculovirus recombinante.
Sin embargo, el baculovirus con la unidad de expresion REP con el codon iniciador ACG en el esqueleto PSC (REP- ACG / PSC) (clon C4 y A3) muestra baculovirus recombinantes estables lo largo de al menos 5 pasajes.
Ejemplo 2: construcciones Cap
2.1.1 Construccion plasmida de Baculovirus
[0056] Para expresar VP1,2,3 de un ARN mensajero policistronico unico, la construccion de baculovirus-AAV-Cap fue disenada como se describe en Urabe et al., 2002, supra.
Brevemente, el codon iniciador ATG de VP1 muto a ACG.
Un codon iniciador ATG potencial en la posicion 11 ha sido cambiado a ACG.
El sitio aceptor de empalme hacia abajo del codon iniciador VP1 fue destruido (mutacion en las posiciones 21 y 24). El casete de expresion Cap mutado fue clonado en una construccion de expresion de baculovirus; pFastBacDual (pFBDAAV1VPm11) con sitios de restriccion BamH1/Stul.
Este plamfdico (pFBDAAV1VPm11) fue la materia prima para la introduccion de codones de iniciacion alterna para VP1.
El cebador directo usado por Urabe et al. (2002; supra) para introducir las mutaciones mencionadas fue:
BamHI 1 11 21 24
5'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(SEC ID NO. 1)
[0057] Los siguientes cebadores hacia adelante fueron usados para hacer las construcciones de expresion usando pFBDAAV1VPm11 (Urabe et al., 2002, supra) como materia prima:
5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3 (SEC ID NO.2)
5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3 (SEC ID NO.3)
5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3 (SEC ID n° 4)
5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3 (SEC ID n° 5)
[0058] El cebador inverso que fue usado en las reacciones PCR con los cebadores anteriores hacia adelante fue dirigido a la posicion ~ 230 pares de cebadores hacia abajo del codon iniciador VP1 y contiene un unico sitio Stu I (AGGCCT).
5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3 (SEC ID n° 6)
[0059] Fragmentos fueron amplificados con los conjuntos mencionados arriba de pares de cebador hacia adelante y atras por PCR.
Tras la digestion de productos PCR con BamHI y Stu I los productos PCR fueron subclonados en los sitios BamHI / Stu I de pFBDAAV1vpm11 dando como resultado las varias construcciones de baculovirus-AAV-Cap que deben evaluarse.
Construcciones de ADN fueron verificados por analisis de secuencias en Baseclear, Leiden, Pafses Bajos.
2.1.2 Produccion de baculovirus recombinante
[0060] Baculovirus recombinantes derivados del virus de polihidrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) fueron producidos utilizando el sistema de expresion de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen). rBac-Cap fue amplificado por la infeccion de 2x106 Sf9 celulas por ml a una moi de 0,1.
Tres dfas despues de la infeccion de las celulas fueron centrifugadas y el sobrenadante con el virus fue recuperado.
2.1.3 Produccion de AAV recombinante
[0061] Lotes rAAV fueron producidos utilizando tres baculovirus recombinantes segun Urabe et al., 2002.
Sin embargo, para este estudio un baculoviru albergo una construccion de expresion para el transgen LPLS447X.
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El agente terapeuticamente activo expresado del transgen es una variante de origen natural de lipoprotefna-lipasa de humano, un polipeptido monocatenario de 448 aminoacidos.
La variante LPLS447X tiene una delecion de dos aminoacidos en el C-termino de la protefna.
El segundo baculovirus albergo una construccion de expresion para los genes de replicacion AAV, Rep 78 y Rep 52. El tercer baculovirus albergo la secuencia capsida AAV1 con bien un ACG o un codon iniciador TTG, CTG, GTG para VP1.
[0062] Lotes de rAAV de mamffero producidos con el sistema de transfeccion de plasmido fueron producidos segun Grimm et al., 1998 (Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 1998 Dec 10;9(18):2745-60).
2.1.3 Analisis de electrotransferencia Western
[0063] Celulas de insecto fueron infectadas con baculovirus-Cap.
Tres dfas tras la infeccion, las celulas fueron centrifugadas (3.000 g; 15 min).
El sobrenadante fue filtrado a traves de un filtro Millex 0,22um.
El bufer de muestra NuPage LDS (Invitrogen) se anadio a una muestra del sobrenadante y fue cargado sobre un gel 4-12% Bis-Tris.
El gel fue ejecutado a 100V.
Las protefnas fueron transferidas a unamembrana de nitrocelulosa (BioRad) durante 1 hora, 100V, 350mA. Inmunoqufmica Western fue realizada por el bloqueo de la membrana con 1% de leche desnatada seca Marvel y posteriormente se realizo incubacion con anti-Cap de raton (B1 de Progen, Alemania; dilucion 1:50) y HRP anti-raton de conejo (DAKO, dilucion 1:100).
VP1, 2 y 3 fueron visualizadas por coloracion quimioluminiscente con lumi-luz mas sustrato de transferencia Western (Roche).
2.1.4 Mediciones bioqufmicas
[0064] Actividad de humano LPLS447X fue ensayada tal y como se describe anteriormente usando un sustrato de emulsion de trioleoilglicerol radiactivo (Nilsson-Ehle y Scholtz, 1976).
Masa inmunoreactiva de Humano lplS447X fue probada utilizando un sandwich ELISA con IgY de pollo y anticuerpos anti-hLPL de raton 5D2 (Liu et al., 2000).
Niveles de triglicerido de plasma fueron medidos usando equipos comerciales despues de los protocolos del fabricante (Boehringer Mannheim, #450032).
2.2 Resultados
2.2.1 Construccion de baculovirus recombinante
[0065] Para introducir codones de iniciacion alternos diferentes para la expresion VP1 en el plasmido de baculovirus disenado por Urabe et al. (2002; supra) una serie de cebadores hacia arriba fueron disenadas con un sitio de restriccion de BamHI y bien un codon TTG, ATT, GTG o CTG en lugar del codon iniciador ACG de VP1.
PCR que usa estos cebadores en combinacion con un cebador hacia abajo con un sitio StuI resulto en fragmentos amplificados que fueron subclonados en el sitio BamHI/StuIde pFBDVPm11 (Bac-Cap).
Los plasmidos de baculovirus resultantes fueron usados para la preparacion de baculovirus recombinantes que utilizan el sistema de expresion de baculovirus Bac-to-Bac.
Los baculovirus recombinantes preparados fueron infectados en las celulas de insecto para producir capsidas AAV. Tres dfas despues de la infeccion, la expresion viral de protefna de los lotes de baculovirus diferentes fue determinada en tecnicas de electrotransferencia Western.
De las tecnicas de electrotransferencia Western esta claro que la construccion de baculovirus con el codon iniciador TTG para VP1 expreso esta protefna a un nivel mas alto en comparacion con el codon iniciador ACG previamente usado.
La proporcion entre VP1 y VP2 que utiliza el codon TTG resulto ser 1:1 que es similar a la que se proporciona para el AAV salvaje tipo (no mostrado).
2.2.2 Infeccion de lotes rAAV en celulas en el cultivo
[0066] Para investigar la infectividad de las capsidas AAV derivada de baculovirus recombinantes con el TTG, codon iniciador rAAV fue generado.
Tambien un lote rAAV fue generado por transfeccion plamfdica en celulas de mamffero HEK293.
Una graduacion de genoma de vector de ambos lotes rAAV fue determinada por qPCR.
Esta graduacion fue usada para infectar celulas HEK 293 en una placa de microtitulacion a una moi en aumento.
Dos dfas tras la infeccion, fue realizado un ensayo cuantitativo (ensayo masa LPLS447X) para el producto de transgen (LPLS447X) en el medio de las celulas infectadas.
El ensayo mostro que la cantidad de LPLS447X producido por rAAV producido por baculovirus fue similar al LPL producido por el rAAV producido por plasmido (no mostrado).
Claims (23)
- 51015202530354045505560651. Secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica protefnas Rep78 y Rep52 parvovirales, donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna Rep78 parvoviral es un codon iniciador suboptimo en comparacion con el codon ATG normal, donde la secuencia de nucleotidos comprende una secuencia de control de expresion que comprende una secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 hacia arriba del codon de iniciacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep78 parvoviral.
- 2. Secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 1, donde el codon iniciador suboptimo es tal que al menos parte de los ribosomas no inician la traduccion en el codon suboptimo de la protefna Rep78 sino en un codon iniciador mas abajo.
- 3. Secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 1 o 2, donde el codon iniciador es seleccionado de ACG, TTG, CTG, y GTG.
- 4. Secuencia de nucleotidos segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, donde las protefnas Rep parvovirales son protefnas Rep de virus adeno-asociado (AAV).
- 5. Construccion de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, donde la secuencia de nucleotidos esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto, preferiblemente a un promotor de poliedro, y donde la construccion de acidos nucleicos es preferiblemente un vector compatible con la celula de insecto, mas preferiblemente un vector baculoviral.
- 6. Celula de insecto que comprende una secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica protefnas Rep78 y Rep52 parvovirales, donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna Rep78 parvoviral es un codon iniciador suboptimo en comparacion con el codon ATG normal.
- 7. Celula de insecto segun la reivindicacion 6, donde la secuencia de nucleotidos codifica la protefna Rep78 de longitud total.
- 8. Celula de insecto segun la reivindicacion 6 o 7, donde el codon iniciador suboptimo es tal que al menos parte de los ribosomas no inician la traduccion en el codon suboptimo de la protefna Rep78 sino en un codon iniciador mas abajo.
- 9. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 8, donde el codon iniciador es seleccionado de ACG, TTG, CTG, y GTG.
- 10. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 9, donde la secuencia de nucleotidos comprende una secuencia de control de expresion que comprende un secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 hacia arriba del codon de iniciacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep78 AAV.
- 11. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 10, donde las protefnas Rep parvovirales son protefnas Rep de virus adeno-asociado (AAV).
- 12. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 11, donde la secuencia de nucleotidos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 es parte de una construccion de acido nucleico y esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
- 13. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 12, donde la celula de insecto comprende ademas:a) una segunda secuencia de nucleotidos que comprende al menos una secuencia de nucleotidos (ITR) de repeticion invertida de terminal parvoviral; y,b) una tercera secuencia de nucleotidos que comprende secuencias codificantes de protefna capsida parvoviral operativamente enlazadas a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
- 14. Celula de insecto segun la reivindicacion 13, donde la celula de insecto comprende:a) una primera construccion de nucleotidos, donde la secuencia de nucleotidos es parte de una construccion de acidos nucleicos y esta operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto;b) una segunda construccion de acidos nucleicos que comprende al menos una secuencia de nucleotidos (ITR) de repeticion de terminal invertida parvoviral; yc) una tercera construccion de acido nucleotido que comprende secuencias codificantes de protefna capsida parvoviral operativamente enlazada a secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto,510152025303540455055donde la primera, segunda y tercera construcciones de acidos nucleicos preferiblemente son vectores compatibles con la celula de insecto, preferiblemente vectores baculovirales.
- 15. Celula de insecto segun la reivindicacion 13 o 14, donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende ademas al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes y por la cual al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes se incorpora en el genoma de un vector parvoviral producido en la celula de insecto, y preferiblemente donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende dos secuencias de nucleotidos ITR parvovirales y donde al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes esta localizada entre las dos secuencias de nucleotidos ITR parvovirales.
- 16. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15, donde la tercera secuencia de nucleotidos comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleotidos que codifican protefnas capsidas VP1, VP2, y VP3 parvovirales, donde el codon iniciador para la traduccion de la protefna capsida de VP1 parvoviral es seleccionado de ACG, TTG, CTG, y GTG y donde la tercera secuencia de nucleotidos opcionalmente comprende una secuencia de control de expresion que comprende una secuencia de nueve nucleotidos de SEC. ID N°: 7 hacia arriba del codon de iniciacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida de VP1 parvoviral.
- 17. Celula de insecto segun la reivindicacion 16, donde la tercera secuencia de nucleotidos comprende ademas al menos una modificacion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna capsida de VP1 parvoviral seleccionada de entre un C en la posicion de nucleotido 12, un A en la posicion de nucleotido 21, y un C en la posicion de nucleotido 24.
- 18. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 17, donde al menos una de la primera secuencia de nucleotidos, segunda secuencia de nucleotidos, y tercera secuencia de nucleotidos esta de forma estable integrada en el genoma de la celula de insecto.
- 19. Celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 18, donde el parvovirus es AAV.
- 20. Metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante, preferiblemente un virion AAV, en una celula de insecto, donde el virion comprende una segunda secuencia de nucleotidos que comprende al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion (ITR) de terminal invertido parvoviral, donde el metodo incluye las etapas de:a) cultivo de una celula de insecto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 19 bajo condiciones tales que el virion parvoviral recombinante es producido; y,b) recuperacion del virion parvoviral recombinante;y que opcionalmente comprende ademas la etapa de:c) purificacion de afinidad del virion usando un anticuerpo anti-parvoviral, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado, donde el anticuerpo anti-parvoviral es preferiblemente un anticuerpo de camelido monocatenario o un fragmento del mismo.
- 21. Metodo segun la reivindicacion 20, donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende ademas al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes y por el cual al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes se incorpora en el genoma de un vector parvoviral producido en la celula de insecto, y preferiblemente donde la segunda secuencia de nucleotidos comprende dos secuencias de nucleotidos ITR parvoviral y donde al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes esta localizada entre las dos secuencias de nucleotidos ITR parvoviral.
- 22. Secuencia de nucleotidos segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 4, una construccion de acidos nucleicos segun 5, o una celula de insecto segun cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 19, donde uno o varios posibles sitios de iniciacion falsos de traduccion en las secuencias codificantes de protefna Rep, diferentes a los sitios de iniciacion de traduccion Rep78 y Rep52, son eliminados.
- 23. Metodo segun la reivindicacion 20 o 21, donde uno o varios posibles sitios de iniciacion falsos de traduccion en las secuencias codificantes de protefna Rep, diferentes a los sitios de iniciacion de traduccion Rep78 y Rep52, son eliminados.
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