JP2023502474A - Ighmbp2遺伝子に関連する障害の治療のための材料および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)関連障害の治療のために設計された、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを提供する。一態様では、(a)1つ以上の調節制御要素と、(b)免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)のcDNA配列とを含む、ポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、調節制御要素は、配列番号3に記載されるヌクレオチド配列を含むCBAプロモーター、または配列番号4に記載されるヌクレオチド配列を含むP546プロモーター、もしくは調節制御またはプロモーター活性を保持するその断片である。
Description
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる、2019年11月22日に出願された米国仮出願第62/939,270号の優先権を主張する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、サイズ:73,110バイト、作成日:2019年11月23日の54445_Seqlisting.txtとして識別される、コンピュータ可読形態の配列表を含有する。
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、サイズ:73,110バイト、作成日:2019年11月23日の54445_Seqlisting.txtとして識別される、コンピュータ可読形態の配列表を含有する。
発明の分野
本開示は、免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)遺伝子の変異に関連する障害の治療のために設計された、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを提供する。開示されたrAAVは、野生型タンパク質の発現をもたらす野生型IGHMBP2 cDNAを、それを必要とする対象に提供する。
本開示は、免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)遺伝子の変異に関連する障害の治療のために設計された、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを提供する。開示されたrAAVは、野生型タンパク質の発現をもたらす野生型IGHMBP2 cDNAを、それを必要とする対象に提供する。
免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)遺伝子は、ヘリカーゼスーパーファミリー1(SF1)内のUpf1様群の構成要素をコードする。このタンパク質は、ヘリカーゼドメイン、R3Hドメイン、ジンクフィンガードメイン、および核局在化シグナル配列を有することが公知である。IGHMBP2は、遍在的に発現され、110kDaの遺伝子産物に対応する993個のアミノ酸をコードする、15個のエクソンを含む。疾患の発症におけるIGHMBP2タンパク質の正確な役割は不明である。正常なIGHMBP2は、リボソームRNAの成熟および翻訳、免疫グロブリンクラススイッチ、mRNA前駆体の成熟、およびDNA結合活性またはTATA結合タンパク質との相互作用のいずれかによる転写調節において役割を果たすことが公知である。IGHMPB2タンパク質は、ヘリカーゼドメイン、R3Hドメイン、ジンクフィンガードメイン、および核局在化シグナル配列からなるヘリカーゼスーパーファミリー1(SF1)内のUpf1様群の構成要素として分類されている。IGHMPB2遺伝子の常染色体劣性変異は、呼吸困難1型(SMARD1)およびシャルコー・マリー・トゥース2S型(CMT2S)を伴う脊髄性筋萎縮症を引き起こすことが公知である。IGHMPB2遺伝子における患者変異の大部分は、ヘリカーゼドメイン内でクラスター化し、ミスセンス変異である。
SMARD1は、近位筋力低下および呼吸不全に続く早期遠位下肢筋萎縮によって特徴付けられる、常染色体劣性運動ニューロン疾患である。SMARD1患者は、6週齢~13カ月齢に横隔膜の麻痺を示す。患者は通常、13カ月齢の前に換気を必要とする。IGHMBP2遺伝子の機能喪失変異は、SMARD1を引き起こすことが公知である。
シャルコー・マリー・トゥース(CMT)神経障害は、最もよく見られる遺伝性神経障害である。CMT2は、遠位筋力低下および萎縮、軽度の感覚喪失、および正常またはほぼ正常な神経伝導速度によって特徴付けられる、軸索(非脱髄性)末梢神経障害である。CMT2は、臨床的にCMT1に類似するが、典型的には、あまり重症ではない。患者は、上肢および下肢の筋萎縮を伴う、ゆっくり進行する遠位筋力低下を有する。CMT2のサブタイプは、臨床的に類似し、分子遺伝学的所見によってのみ区別される。CMT2のほとんどのサブタイプは、常染色体優性様式で遺伝性であるが、いくつかは、常染色体劣性様式で遺伝性である。IGHMBP2遺伝子の劣性機能喪失変異は、現在はCMT2Sとして細分類されている、CMT2を引き起こすことが公知である。
CMT2Sのための現在の治療法はなく、管理は、症状を治療することを伴う。したがって、SMARD1およびCMT2Sを治療するための遺伝子置換療法を開発する必要がある。
一態様では、(a)1つ以上の調節制御要素と、(b)免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)のcDNA配列とを含む、ポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、調節制御要素は、配列番号3に記載されるヌクレオチド配列を含むCBAプロモーター、または配列番号4に記載されるヌクレオチド配列を含むP546プロモーター、もしくは調節制御またはプロモーター活性を保持するその断片である。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号5のヌクレオチド配列を有するSV40イントロン、およびSV40イントロンの断片を含む。いくつかの実施形態では、IGHMBP2 cDNAは、配列番号1に記載されるポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、本開示は、機能的IGHMBP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、rAAVを提供し、ヌクレオチドは、配列番号1に対して、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、または89%、より典型的には、少なくとも90%、91%、92%、93%、または94%、さらにより典型的には、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有し、タンパク質は、IGHMBP2活性を保持する。例えば、機能的IGHMBP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、IGHMBP2の機能に影響を及ぼす、1つ以上の塩基対置換、欠失、または挿入を含み得る。さらに、機能的IGHMBP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、IGHMBP2タンパク質の発現を増加または減少させ得る、1つ以上の塩基対置換、欠失、または挿入を含み得、発現パターンのこの変化は、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害の治療のために所望され得る。
例えば、本開示は、機能的IGHMBP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、rAAVを提供し、タンパク質は、配列番号2に対して、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、または89%、より典型的には、少なくとも90%、91%、92%、93%、または94%、さらにより典型的には、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質は、IGHMBP2活性を保持する。例えば、機能的IGHMBP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、IGHMBP2タンパク質の機能に影響を及ぼす、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。
核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性の割合」、または「同一の割合」という用語は、最大限対応するように整合されたときに同じである、2つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、または少なくとも約500~5000個のヌクレオチドの断片が所望される。しかしながら、少なくとも約9個のヌクレオチド、通常は少なくとも約20~24個のヌクレオチド、少なくとも約28~32個のヌクレオチド、少なくとも約36個以上のヌクレオチドなど、より小さい断片間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性の割合は、当技術分野で公知である技術によって決定されることができる。例えば、相同性は、配列情報を整合させ、ALIGN、ClustalW2、およびBLASTなどの容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することにより、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定されることができる。一実施形態では、BLASTが整合ツールとして使用されるとき、以下のデフォルトパラメータ、すなわち、遺伝暗号=標準、フィルター=なし、鎖=両方、カットオフ=60、予測=10、マトリクッス=BLOSUM62、説明=50個の配列、並べ替え=高得点、データベース=非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+Swissタンパク質+Spupdate+PIRである。
別の態様では、本開示は、配列番号7のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるrAAV構築物を提供する。例えば、ssAAV9.CB.IGHMBP2ベクターは、配列番号7のITR内にあり、かつそれを含み、図13に示されるヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’ITR、CMVエンハンサー、CBプロモーター、修飾SV40イントロン配列、ヒトIGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’ITRを含む。一実施形態では、ベクターは、配列番号7のヌクレオチド1~4397を含む。ITR内のヌクレオチドは、順方向または逆方向にあり得る。例えば、CMVエンハンサー配列、CBプロモーター配列、SV40配列、ヒトIGHMBP2遺伝子配列、およびbGHポリA配列は、順方向または逆方向にあり得る。別の実施形態では、ベクターは、配列番号7の1~4397のヌクレオチドに対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。配列番号7に記載されるプラスミドは、カナマイシン耐性およびpUC複製起点をさらに含む。
例示的実施形態では、本開示は、配列番号18のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるrAAV構築物を提供する。例えば、ssAAV9.CB.IGHMBP2-clinicalベクターは、配列番号18のITR内にあり、かつそれを含み、図18に示されるヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、配列番号19に記載される5’ITRを含む。加えて、rAAVベクターは、それぞれ逆方向に、CMVエンハンサー、CBプロモーター、修飾SV40イントロン配列、ヒトIGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および配列番号12に記載される3’ITRを含む。一実施形態では、ベクターは、配列番号18のヌクレオチド1~4386を含む。ITR内のヌクレオチドは、順方向または逆方向にあり得る。別の実施形態では、ベクターは、配列番号18の1~4386のヌクレオチドに対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。配列番号18に記載されるプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子およびpUC複製起点をさらに含む。カナマイシン耐性遺伝子は、順方向または逆方向にあり得る。
さらなる態様では、本開示は、配列番号8のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるrAAV構築物を提供する。例えば、ssAAV9.P546.IGHMBP2ベクターは、配列番号8のITR内にあり、かつそれを含み、図14に示されるヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’ITR、P546プロモーター、修飾SV40イントロン配列、ヒトIGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’ITRを含む。一実施形態では、ベクターは、配列番号8のヌクレオチド1~4375を含む。ITR内のヌクレオチドは、順方向または逆方向にあり得る。例えば、P546プロモーター配列、SV40配列、ヒトIGHMBP2遺伝子、およびbGHポリA配列は、順方向または逆方向にあり得る。別の実施形態では、ベクターは、配列番号8の1~4397のヌクレオチドに対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。配列番号8に記載されるプラスミドは、カナマイシン耐性およびpUC複製起点をさらに含む。
例示的実施形態では、本開示は、配列番号17のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるrAAV構築物を提供する。例えば、ssAAV9.P546.IGHMBP2-clinicalベクターは、配列番号17のITR内にあり、かつそれを含み、図16に示されるヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、配列番号19に記載される5’ITRを含む。加えて、rAAVベクターは、それぞれ逆方向に、P546プロモーター配列、修飾SV40イントロン配列、ヒトIGHMBP2遺伝子のためのコード配列、およびbGHポリA、ならびに配列番号12に記載される3’ITRを含む。一実施形態では、ベクターは、配列番号17のヌクレオチド1~4364を含む。ITR内のヌクレオチドは、順方向または逆方向にあり得る。別の実施形態では、ベクターは、配列番号17の1~4364のヌクレオチドに対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。配列番号17に記載されるプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子およびpUC複製起点をさらに含む。カナマイシン耐性遺伝子は、順方向または逆方向にあり得る。
別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、rAAVは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、またはAnc80、AAV7m8、およびそれらの誘導体のものである。いくつかの実施形態では、rAAVのゲノムは、プロモーター断片と、IGHMBP2 cDNAとを含む。
いくつかの実施形態では、rAAVのゲノムは、CBAプロモーターと、IGHMBP2 cDNAとを含む。例示的なゲノムは、CBAプロモーターと、ssAAV9.CB.IGHMBP2、配列番号7のヌクレオチド1~4397として記載されるrAAV、または配列番号18のヌクレオチド1~4386として記載されるrAAVなどのIGHMBP2 cDNAとを含む。
いくつかの実施形態では、rAAVのゲノムは、P546プロモーターと、IGHMBP2 cDNAとを含む。例示的なゲノムは、P546プロモーターと、ssAAV9.P546.IGHMBP2などのIGHMBP2 cDNAと、配列番号8のヌクレオチド1~4375として記載されるrAAV、または配列番号17のヌクレオチド1~4364として記載されるrAAVとを含む。
いくつかの実施形態では、rAAVのゲノムは、CBAプロモーターの断片またはP546プロモーターの断片と、IGHMBP2 cDNAとを含み、プロモーターの断片は、プロモーター活性を保持する。
別の態様では、本明細書に記載のrAAVを含むrAAV粒子が、本明細書に記載される。
本明細書に記載のrAAVのうちのいずれかまたは本明細書に記載のウイルス粒子のうちのいずれかを含む、組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の粘度および/または密度を増加させる薬剤をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、その薬剤は、造影剤である。造影剤は、約20~40%の非イオン性低浸透圧化合物もしくは造影剤、またはイオヘキソールなどの約25%~約35%の非イオン性低浸透圧化合物であり得る。開示された組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達などの任意の送達手段のために配合され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の粘度を約0.05%、または約1%、または1.5%、または約2%、または約2.5%、または約3%または約4%、または約5%、または約6%、または約7%、または約8%、または約9%、または約10%増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、組成物の粘度を約1%~約5%、または約2%~12%、または約5%~約10%、または約1%~約20%、または約10%~約20%、または約10%~約30%、または約20%~約40%、または約20%~約50%、または約10%~約50%、または約1%~約50%増加させる。
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の密度を約0.05%、または約1%、または1.5%、または約2%、または約2.5%、または約3%、または約4%、または約5%、または約6%、または約7%、または約8%、または約9%、または約10%増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、組成物の密度を約1%~約5%、または約2%~12%、または約5%~約10%、または約1%~約20%または約10%~約20%、または約10%~約30%、または約20%~約40%または約20%~約50%、または約10%~約50%、または約1%~約50%増加させる。
例えば、開示された組成物は、髄腔内送達のために配合され、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含む。
加えて、開示された組成物は、静脈内送達のために配合され、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含む。
本明細書に記載のrAAVまたはrAAV粒子を投与することを含む、IGHMBP2関連障害の治療を必要とする対象においてIGHMBP2関連障害を治療する方法が、特に企図される。いくつかの実施形態では、方法は、rAAVまたはrAAV粒子の前、後、またはそれと同時に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。IGHMPB2関連障害には、IGHMPB2タンパク質の機能の喪失をもたらすか、またはIGHMPB2タンパク質の発現の低減を引き起こす、変異によって引き起こされる障害または疾患が含まれる。IGHMPB2関連障害は、発現または活性の低減の原因にもかかわらず、IGHMPB2タンパク質の発現または活性の低減に関連する任意の疾患または障害であり得る。本開示は、IGHMPB2遺伝子の変異についてのホモ接合体またはIGHMPB2遺伝子の変異についてのヘテロ接合体である、対象におけるIGHMPB2関連障害を企図する。例えば、IGHMBP2関連障害は、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2遺伝子における変異の存在に関連する神経学的障害である。IGHMBP2関連障害には、神経学的障害の重症度がSMARD1およびCMT2Sに罹患している患者で観察される重症度の間であるような、患者が混合表現型を有する障害も含まれる。
方法のうちのいずれかでは、対象は、IGHMBP2遺伝子に変異を有する。これらの変異には、本明細書の表1もしくは2に示されるものなどの現在公知であるもの、または神経学的障害に関連する将来同定されるIGHMBP2遺伝子の変異が含まれる。
本明細書で使用される場合の「対象」は、任意の動物であり得、また、患者とも称され得る。好ましくは、対象は、脊椎動物であり、より好ましくは、対象は、農場家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ)またはペット(例えば、イヌ、ネコ)などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、年齢が1~10歳に及ぶ対象などの小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、4~15歳である。対象は、一実施形態では、例えば、年齢が10~19歳の範囲に及ぶ対象などの青年対象である。他の実施形態では、対象は、成人(18歳以上)である。開示された方法のうちのいずれかでは、rAAVまたはウイルス粒子は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達によって送達される。例えば、方法のうちのいずれかでは、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量が、髄腔内送達によって対象に投与される。加えて、開示された方法のうちのいずれかでは、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量が、静脈内送達によって対象に投与される。
別の態様では、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害の治療のための薬剤の調製における本明細書に記載のrAAVまたはrAAV粒子の使用が、本明細書に記載される。例えば、開示された薬剤のうちのいずれかは、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達のために配合される。例えば、薬剤は、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、髄腔内送達によって対象に投与される。加えて、薬剤は、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、静脈内送達によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、免疫抑制剤の投与の前または後に、同時に投与される。
別の態様では、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害の治療のための本明細書に記載のrAAVまたはrAAV粒子を含む組成物が、本明細書に記載される。例えば、開示された組成物のうちのいずれかは、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達のために配合される。例えば、組成物は、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、髄腔内送達によって対象に投与される。加えて、組成物は、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、静脈内送達によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫抑制剤の投与の前または後に、同時に投与される。別の実施形態では、組成物は、免疫抑制剤をさらに含む。
免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)遺伝子は、ヘリカーゼドメイン、R3Hドメイン、ジンクフィンガードメイン、および核局在化シグナル配列からなるヘリカーゼスーパーファミリー1(SF1)内のUpf1様群の構成要素である、タンパク質をコードする。IGHMPB2遺伝子の変異は、呼吸困難1型(SMARD1)およびシャルコー・マリー・トゥース病2S型(CMT2S)を伴う脊髄性筋萎縮症を引き起こすことが公知である。IGHMPB2遺伝子における患者変異の大部分は、ヘリカーゼドメイン内でクラスター化し、ミスセンス変異である。
IGHMPB2変異
IGHMPB2の野生型cDNA配列は、配列番号1(Genbank NM_002180.2)に記載され、DNA結合タンパク質SMUB-2としても知られるIGHMPB2タンパク質は、配列番号2(Genbank NP_002171.2)に記載される。野生型遺伝子産物は、7つの推定ヘリカーゼモチーフおよびRNAヘリカーゼに典型的なDEADボックス様モチーフを有する、993アミノ酸タンパク質である。変異は、ヘリカーゼ活性の機能不全につながり得る。IGHMPB2遺伝子は、15個のエクソンを有することが公知である。IGHMPB2遺伝子の変異は、SMARD1およびCMT2Sに関連することが見出された。
SMARD1を引き起こす約26個の既知のIGHMPB2変異がある。変異には、劣性ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト、フレーム内欠失、フレームシフト挿入、およびスプライスドナー部位変異が含まれ、IGHMPB2遺伝子の15個のエクソンに及ぶ(Luan et al.,Brain & Dev.28:685-689,2016、参照により本明細書に組み込まれる)。SMARD1を引き起こすことが公知である例示的な変異が、表1で以下に要約される。開示された遺伝子療法ベクターおよび治療方法は、SMARD1を引き起こすIGHMPB2の他の変異が将来識別され得るため、表1に提供される変異によって引き起こされる障害または出願時に公知であるものに限定されない。表1
IGHMPB2の野生型cDNA配列は、配列番号1(Genbank NM_002180.2)に記載され、DNA結合タンパク質SMUB-2としても知られるIGHMPB2タンパク質は、配列番号2(Genbank NP_002171.2)に記載される。野生型遺伝子産物は、7つの推定ヘリカーゼモチーフおよびRNAヘリカーゼに典型的なDEADボックス様モチーフを有する、993アミノ酸タンパク質である。変異は、ヘリカーゼ活性の機能不全につながり得る。IGHMPB2遺伝子は、15個のエクソンを有することが公知である。IGHMPB2遺伝子の変異は、SMARD1およびCMT2Sに関連することが見出された。
SMARD1を引き起こす約26個の既知のIGHMPB2変異がある。変異には、劣性ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト、フレーム内欠失、フレームシフト挿入、およびスプライスドナー部位変異が含まれ、IGHMPB2遺伝子の15個のエクソンに及ぶ(Luan et al.,Brain & Dev.28:685-689,2016、参照により本明細書に組み込まれる)。SMARD1を引き起こすことが公知である例示的な変異が、表1で以下に要約される。開示された遺伝子療法ベクターおよび治療方法は、SMARD1を引き起こすIGHMPB2の他の変異が将来識別され得るため、表1に提供される変異によって引き起こされる障害または出願時に公知であるものに限定されない。表1
CMT2Sを引き起こす既知のIGHMPB2変異は、軸索神経障害を引き起こす常染色体劣性変異である(Cottenie et al.,Am J Hum Genet.2014;95:590-601、Schottmann et al.,Neurology.2015;84:523-31、両方とも参照により本明細書に組み込まれる)。CMT2Sを引き起こすことが公知である例示的な変異が、表2で以下に要約される。開示された遺伝子療法ベクターおよび治療方法は、CMT2Sを引き起こすIGHMPB2の他の変異が将来識別され得るため、表2に提供される変異によって引き起こされる障害または出願時に公知であるものに限定されない。
SMARD1の診断および進行
SMARD1はまた、常染色体劣性遠位脊髄性筋萎縮症1遠位遺伝性運動神経障害VI型(dHMN6もしくはHMN6)または遠位筋ジストロフィー1型(DSMA-1)としても公知である。この障害は、乳児SMAの変異体である。SMARD1の最も顕著な症状は、胸部X線上に示される内臓脱出症を伴う横隔膜麻痺に起因する重度の呼吸困難、3%を下回る低出生体重、離乳不能、および上肢における進行性筋力低下であり、遠位筋もまた、影響を受ける。追加の症状には、低い運動神経伝導速度、および腓腹神経生検での有髄線維のサイズの縮小が含まれる。感覚神経および自律神経もまた、一部の患者では、疼痛知覚の減少、過剰発汗、便秘、および膀胱失禁によって実証されるように影響を受けた。臨床的特徴には、子宮内胎児発育遅延、未熟児、弱い泣き声、および足の奇形が含まれる。症状は通常、1カ月齢~6カ月齢で現れる。
SMARD1はまた、常染色体劣性遠位脊髄性筋萎縮症1遠位遺伝性運動神経障害VI型(dHMN6もしくはHMN6)または遠位筋ジストロフィー1型(DSMA-1)としても公知である。この障害は、乳児SMAの変異体である。SMARD1の最も顕著な症状は、胸部X線上に示される内臓脱出症を伴う横隔膜麻痺に起因する重度の呼吸困難、3%を下回る低出生体重、離乳不能、および上肢における進行性筋力低下であり、遠位筋もまた、影響を受ける。追加の症状には、低い運動神経伝導速度、および腓腹神経生検での有髄線維のサイズの縮小が含まれる。感覚神経および自律神経もまた、一部の患者では、疼痛知覚の減少、過剰発汗、便秘、および膀胱失禁によって実証されるように影響を受けた。臨床的特徴には、子宮内胎児発育遅延、未熟児、弱い泣き声、および足の奇形が含まれる。症状は通常、1カ月齢~6カ月齢で現れる。
シャルコー・マリー・トゥース遺伝性神経障害2(CMT2)の診断および進行
CMT2は、進行性末梢運動および感覚神経障害であり、一般に、i)正常範囲(>40~50m/秒)を伴うが、時として軽度に異常な範囲(>30~40m/秒)内である神経伝導速度(NCV)、ii)正の波、多相性電位、または細動、ならびに誘発された運動および感覚反応の振幅の低減などの所見を伴う軸索神経障害の証拠を示すEMG検査、iii)複合運動活動電位(CMAP)の大幅な低減および/または(必ずではないが)典型的には劣性様式と一致する家族歴のうちの1つ以上を測定して診断される。
CMT2は、進行性末梢運動および感覚神経障害であり、一般に、i)正常範囲(>40~50m/秒)を伴うが、時として軽度に異常な範囲(>30~40m/秒)内である神経伝導速度(NCV)、ii)正の波、多相性電位、または細動、ならびに誘発された運動および感覚反応の振幅の低減などの所見を伴う軸索神経障害の証拠を示すEMG検査、iii)複合運動活動電位(CMAP)の大幅な低減および/または(必ずではないが)典型的には劣性様式と一致する家族歴のうちの1つ以上を測定して診断される。
神経生検は、診断のために要求されないが、進行を監視するか、または診断を確認する方法として使用され得る。神経生検は、再生の兆候を伴う有髄線維の喪失、軸索発芽、およびニューロフィラメントを伴う萎縮性軸索、ならびに対照よりも大きな節の間隙および短い節間の長さを示し、節間形成の発達異常を示唆している。
CMT2Sは、感覚系ではなく運動系の神経をより顕著に関与させるが、両方が関与する。罹患した個人は、典型的には、通常、腱反射の減弱および軽度の感覚喪失または感覚喪失なしに関連する足および/または手の遠位筋のゆっくりと進行する衰弱および萎縮を有する。罹患した個人は、通常、5歳~25歳の間に症候性になるが、発症は、歩行の遅れを伴う乳児期から30年後までに及ぶ。典型的な主症状は、足および足首の衰弱である。最初の身体所見は、足首における足背屈の衰弱を伴う腱反射の減弱または欠如である。
CMT2Sがある成人患者は、典型的には、両側性下垂足、膝下の筋肉の対称性萎縮(コウノトリ脚外観)、および下肢の腱反射の欠如を有する。活発な腱反射および伸筋足底反応、ならびに非対称性筋萎縮もまた、罹患した個人の最大15%で報告されている。発声または呼吸の困難をもたらす声帯または横隔神経の関与が観察されている。加えて、むずむず脚症候群および睡眠時無呼吸も観察されている。
AAV遺伝子療法
本開示は、IGHMPB2 cDNAを発現する遺伝子療法ベクター、例えば、rAAVベクター、およびIGHMPB2関連障害を治療する方法を提供する。IGHMPB2関連障害には、IGHMPB2タンパク質の機能の喪失を引き起こすか、またはIGHMPB2タンパク質の発現の低減を引き起こす、変異によって引き起こされる障害が含まれる。さらに、発現または活性の低減の原因にもかかわらず、IGHMPB2タンパク質の発現または活性の低減に関連する任意の疾患または障害である。
本開示は、IGHMPB2 cDNAを発現する遺伝子療法ベクター、例えば、rAAVベクター、およびIGHMPB2関連障害を治療する方法を提供する。IGHMPB2関連障害には、IGHMPB2タンパク質の機能の喪失を引き起こすか、またはIGHMPB2タンパク質の発現の低減を引き起こす、変異によって引き起こされる障害が含まれる。さらに、発現または活性の低減の原因にもかかわらず、IGHMPB2タンパク質の発現または活性の低減に関連する任意の疾患または障害である。
本明細書で使用される場合、「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖DNAパルボウイルスである。現在、AAVの13個の血清型が存在し、それらは、例えば、Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,Vol.1,pp.169-228、およびBerns,1990,Virology,pp.1743-1764,Raven Press,(New York)で見出され得る、AAVの一般的な情報および概説で特性評価されている。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的および機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が追加のAAV血清型に適用可能であることが十分に予想される。(例えば、Blacklowe,1988,pp.165-174 of Parvoviruses and Human Disease,J.R.Pattison,ed.、およびRose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974)を参照されたい)。例えば、すべてのAAV血清型は、相同rep遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらはすべて、AAV2で発現されるもの等の3つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、および「逆位末端反復配列」(ITR)に対応する末端における類似自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が類似調節制御下にあることも示唆する。
本明細書で使用される場合の「AAVベクター」とは、AAV末端反復配列(ITR)に隣接している1つ以上の目的とするポリヌクレオチド(または導入遺伝子)を指す。かかるAAVベクターは、repおよびcap遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製およびパッケージングされ得る。
「AAVビリオン」または「AAVウイルス粒子」または「AAVベクター粒子」とは、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドAAVベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含む場合、それは、典型的には、「AAVベクター粒子」または単に「AAVベクター」と称される。したがって、かかるベクターがAAVベクター粒子内に含有されるため、AAVベクター粒子の産生には、必然的にAAVベクターの産生が含まれる。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖DNAゲノムは、逆位末端配列(ITR)を含む約4.7kb長である。例示的なITR配列は、配列番号11、12、および19に記載されるITR配列などの、長さが130個の塩基対または長さが141個の塩基対であり得る。AAVの複数の血清型がある。AAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、AAV血清型2(AAV2)ゲノムのヌクレオチド配列は、Ruffing et al.,J Gen Virol,75:3385-3392(1994)によって修正されたSrivastava et al.,J Virol,45:555-564(1983)に提示されている。他の例として、AAV-1の完全ゲノムは、GenBank受理番号NC_002077で提供されており、AAV-3の完全ゲノムは、GenBank受理番号NC_1829で提供されており、AAV-4の完全ゲノムは、GenBank受理番号NC_001829で提供されており、AAV-5ゲノムは、GenBank受理番号AF085716で提供されており、AAV-6の完全ゲノムは、GenBank受理番号NC_001862で提供されており、AAV-7およびAAV-8のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、GenBank受理番号AX753246およびAX753249で提供されており(AAV-8に関する米国特許第7,282,199および同第7,790,449もまた参照)、AAV-9ゲノムは、Gao et al.,J.Virol.,78:6381-6388(2004)で提供されており、AAV-10ゲノムは、Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)に提示されており、AAV-11ゲノムは、Virology,330(2):375-383(2004)で提供されている。AAVrh.74血清型のクローニングは、Rodino-Klapac.,et al.Journal of translational medicine 5,45(2007)に記載されている。ウイルスDNA複製(rep)、カプシド形成/パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するCis作用配列は、ITR内に含有される。3つのAAVプロモーター(それらの相対マップ位置に対してp5、p19、およびp40と名付けられる)は、repおよびcap遺伝子をコードする2つのAAV内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のAAVイントロンの差異的スプライシング(例えば、AAV2のヌクレオチド2107および2227における)と相まって、2つのrepプロモーター(p5およびp19)は、rep遺伝子から4つのrepタンパク質(rep78、rep68、rep52、およびrep40)の産生をもたらす。Repタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。cap遺伝子は、p40プロモーターから発現され、3つのカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、3つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、AAVゲノムのマップ位置95に位置する。AAVのライフサイクルおよび遺伝学は、Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)に概説されている。
AAVは、例えば、遺伝子療法において、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のAAV感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントおよび無症候性である。さらに、AAVは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。さらに、AAVは、ゆっくりと分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム(染色体外要素)としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化DNAとして感染性である。さらに、AAV複製、ゲノムカプシド形成および組み込みを指示するシグナルがAAVゲノムのITR内に含有されるため、ゲノムの内部約4.3kb(複製および構造カプシドタンパク質、rep-capをコードする)のいくつかまたはすべては、プロモーター、目的のDNA、およびポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットなどの外来DNAと置換され得る。repおよびcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件(56℃~65℃で数時間)に容易に耐え、AAVの低温保存の重要性を低くする。AAVは、凍結乾燥され得る。最後に、AAV感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
複数の研究により、筋肉における長期(1.5年を超える)の組換えAAV媒介タンパク質発現が実証されている。Clark et al.,Hum Gene Ther,8:659-669(1997)、Kessler et al.,Proc Nat.Acad Sc.USA,93:14082-14087(1996)、およびXiao et al.,J Virol,70:8098-8108(1996)を参照されたい。また、Chao et al.,Mol Ther,2:619-623(2000)、およびChao et al.,Mol Ther,4:217-222(2001)も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管化されているため、Herzog et al.,Proc Natl Acad Sci USA,94:5804-5809(1997)、およびMurphy et al.,Proc Natl Acad Sci USA,94:13921-13926(1997)に記載されているように、組換えAAV形質導入が、筋肉内注射に続いて体循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。さらに、Lewis et al.,J Virol,76:8769-8775(2002)は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、および分泌のための必要な細胞因子を保有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬の安定した発現が可能であることを示した。
本開示の組換えAAVゲノムは、本開示の核酸分子および核酸分子に隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。rAAVゲノム中のAAV DNAは、AAV血清型(例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、またはAnc80、AAV7m8、およびそれらの誘導体)を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のAAV血清型に由来し得る。偽型rAAVの産生は、例えば、WO01/83692に開示されている。他のタイプのrAAV変異体、例えば、カプシド変異を有するrAAVも企図される。例えば、Marsic et al.,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
提供される組換えAAV(すなわち、感染性カプシド化rAAV粒子)は、rAAVゲノムを含む。「rAAVゲノム」という用語は、修飾されている天然のAAVゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、rAAVゲノムは、天然のcapおよびrep遺伝子を除去するために修飾されている。いくつかの実施形態では、rAAVゲノムは、内因性5’および3’逆位末端反復(ITR)を含む。いくつかの実施形態では、rAAVゲノムは、AAVゲノムが由来したAAV血清型とは異なるAAV血清型からのITRを含む。いくつかの実施形態では、rAAVゲノムは、逆位末端反復(ITR)によって5’末端および3’末端上に隣接した目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、rAAVのゲノムは、「遺伝子カセット」を含む。例示的実施形態では、両方のrAAVのゲノムは、AAV repおよびcap DNAを欠き、すなわち、ゲノムのITRの間にAAV repまたはcap DNAが存在しない。
本明細書に提供されるrAAVゲノムは、いくつかの実施形態では、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、遺伝子カセットを形成するために標的細胞内で機能的である転写制御要素(プロモーター、エンハンサー、および/またはポリアデニル化シグナル配列を含むが、これらに限定されない)に作動可能に連結されている。プロモーターの例は、pIRFプロモーター、配列番号3に記載されるポリヌクレオチド配列を含むニワトリβアクチンプロモーター(CBA)、および配列番号4に記載されるポリヌクレオチド配列を含むP546プロモーターである。シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子-1aプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない追加のプロモーターが、本明細書で企図される。
加えて、本明細書では、CBプロモーター配列、P546プロモーター配列、および転写促進活性を示すCBA(配列番号3)またはP546(配列番号4)配列のヌクレオチド配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるプロモーター配列が提供される。
転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、ニューロン内で特異的に、または星状細胞内での特異的に発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターもまた、企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞中で発現されたときに導入遺伝子RNA転写物のプロセシングを容易にするためのイントロン配列を含んでもよい。このようなイントロンの一例は、SV40イントロンである。
本明細書で提供されるrAAVゲノムは、IGHMPB2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号1)を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるrAAVゲノムは、IGHMPB2 cDNA(配列番号1)によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む。
本明細書で提供されるrAAVゲノムは、配列番号7のヌクレオチド1~4397または配列番号8のヌクレオチド1~4375を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるrAAVゲノムは、配列番号7のヌクレオチド1~4397または配列番号7配列番号7もしくは8のヌクレオチド1~4375に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリヌクレオチドを含む。
本明細書で提供されるrAAVゲノム、いくつかの実施形態では、IGHMPB2タンパク質をコードし、厳しい条件下で配列番号1に記載されるポリヌクレオチド配列またはその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
本開示のDNAプラスミドは、本開示のrAAVゲノムを含む。DNAプラスミドは、rAAVゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、AAVのヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス、E1欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス)の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるAAVゲノム、repおよびcap遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、rAAV粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。rAAVの産生は、以下の成分、rAAVゲノム、rAAVゲノムから分離した(すなわち、その中に存在しない)AAV repおよびcap遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞(本明細書でパッケージング細胞と表される)内に存在することを必要とする。AAV repおよびcap遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のAAV血清型に由来し得、AAV血清型AAV-9、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-10、AAV-11、AAV-12、およびAAV-13を含むが、これらに限定されない、rAAVゲノムITRとは異なるAAV血清型に由来し得る。偽型rAAVの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO01/83692に開示される。
パッケージング細胞を生成する方法は、AAV粒子の産生のための必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、AAV repおよびcap遺伝子を欠くrAAVゲノム、rAAVゲノムから分離したAAV repおよびcap遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含む、プラスミド(または複数のプラスミド)が、細胞のゲノムに組み込まれる。AAVゲノムは、GCテーリング(Samulski et al.,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlin et al.,1983,Gene,23:65-73)、または直接平滑末端ライゲーション(Senapathy & Carter,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、rAAVの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、rAAVゲノムおよび/またはrep遺伝子ならびにcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを採用する。
rAAV生産の一般原則は、例えば、Carter,1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539、およびMuzyczka,1992,Curr.Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129)に概説されている。様々なアプローチは、Ratschin et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)、Hermonat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)、Tratschin et al.,Mo1.Cell.Biol.5:3251(1985)、McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963(1988)、およびLebkowski et al.,Mol.Cell.Biol.,7:349(1988).Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)、米国特許第5,173,414号、WO95/13365、ならびに対応する米国特許第5,658.776号、WO95/13392、WO96/17947、PCT/US98/18600、WO97/09441(PCT/US96/14423)、WO97/08298(PCT/US96/13872)、WO97/21825(PCT/US96/20777)、WO 97/06243(PCT/FR96/01064)、WO99/11764、Perrin et al.Vaccine 13:1244-1250(1995)、Paul et al.Human Gene Therapy 4:609-615(1993)、Clark et al.Gene Therapy 3:1124-1132(1996)、米国特許第5,786,211号、米国特許第5,871,982号、および米国特許第6,258,595号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、rAAV産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性rAAVを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、HeLa細胞、293細胞、およびPerC.6細胞(同種293株)などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、低継代293細胞(アデノウイルスのE1で形質転換されたヒト胎児腎細胞)、MRC-5細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、WI-38細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、ベロ細胞(サル腎細胞)、およびFRhL-2細胞(アカゲザル胎児肺細胞)などの形質転換されたがん細胞ではない細胞である。
rAAVは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によってなど、当該技術分野で標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからrAAVベクターを精製するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Clark et al.,Hum.Gene Ther.,10(6):1031-1039(1999)、Schenpp and Clark,Methods Mol.Med.,69 427-443(2002)、米国特許第6,566,118号、およびWO98/09657に開示される方法を含む。
本明細書で提供される組成物は、rAAVと、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、採用される投与量および濃度で不活性であり、リン酸塩[例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)]、クエン酸塩、もしくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および/またはTween(登録商標)、ポロキサマー188などのコポリマー、Pluronics(例えば、Pluronic F68)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、またはイオキシランなどの非イオン性低浸透圧化合物を含有する、薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性、約180mgI/mL、約322mOsm/kg水の蒸気圧浸透圧法によるオスモル濃度、約273mOsm/Lのオスモル濃度、20℃で約2.3cpおよび37℃で約1.5cpの絶対粘度、ならびに37℃で約1.164の比重のうちの1つ以上を有することができる。
例示的な組成物は、組成物の粘度および/または密度を増加させるための薬剤を含む。例えば、組成物は、組成物の粘度および/または密度を増加させるための造影剤を含む。例示的な組成物は、約20~40%の非イオン性低浸透圧化合物もしくは造影剤、または約25%~約35%の非イオン性低浸透圧化合物を含む。例示的な組成物は、20mMのTris(pH8.0)、1mMのMgCl2、200mMのNaCl、0.001%のポロキサマー188、および約25%~約35%の非イオン性低浸透圧化合物中に配合されたscAAVまたはrAAVウイルス粒子を含む。別の例示的な組成物は、1×PBSおよび0.001%プルロニック(登録商標)F68中に配合されたscAAVを含む。
本開示の方法で投与されるrAAVの投与量は、例えば、特定のrAAV、投与モード、投与の時間、治療目標、個体、および標的とされる細胞型によって変動し、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。投与量は、ウイルスゲノムの単位(vg)で表され得る。本明細書で企図される投与量は、1×107、1×108、1×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、1×1011、約1×1012、約1×1013、約1.1×1013、約1.2×1013、約1.3×1013、約1.5×1013、約2×1013、約2.5×1013、約3×1013、約3.5×1013、約4×1013、約4.5×1013、約5×1013、約6×1013、約1×1014、約2×1014、約3×1014、約4×1014、約5×1014、約1×1015、約1×1016まで、またはそれ以上の総ウイルスゲノムを含む。
約1×109~約1×1010、約5×109~約5×1010、約1×1010~約1×1011、約1×1011~約1×1015vg、約1×1012~約1×1015vg、約1×1012~約1×1014vg、約1×1013~約6×1014vg、約1×1013~約1×1015vg、および約6×1013~約1.0×1014vgの投与量も企図される。本明細書で例示される1つの用量は、髄腔内送達を介して投与される1x1013vgである。本明細書で例示される別の用量は、1.5×1013vgである。
投与量はまた、vg/kgの単位で表され得る。本明細書で企図される投与量は、約1×107vg/kg、1×108vg/kg、1×109vg/kg、5×109vg/kg、6×109vg/kg、7×109vg/kg、8×109vg/kg、9×109vg/kg、1×1010vg/kg、2x1010vg/kg10、3×1010vg/kg、4×1010vg/kg、5×1010vg/kg、1×1011vg/kg、約1×1012vg/kg、約1×1013vg/kg、約1.1×1013vg/kg、約1.2×1013vg/kg、約1.3×1013vg/kg、約1.5×1013vg/kg、約2×1013vg/kg、約2.5×1013vg/kg、約3×1013vg/kg、約3.5×1013vg/kg、約4×1013vg/kg、約4.5×1013vg/kg、約5×1013vg/kg、約6×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、約2×1014vg/kg、約3×1014vg/kg、約4×1014vg/kg、約5×1014vg/kg、約1×1015vg/kg、約1×1016vg/kgまでを含む。
約1×109vg/kg~約1×1010vg/kg、約45×109vg/kg~約5×1010vg/kg、約1×1010vg/kg~約1×1011vg/kg、約1×1011vg/kg~約1×1015vg/kg、約1×1012vg/kg~約1×1015vg/kg、約1×1012vg/kg~約1×1014vg/kg、約1×1013vg/kg~約2×1014vg/kg、約1×1013vg/kg~約1×1015vg/kg、および約6×1013vg/kg~約1.0×1014vg/kgの投与量も企図される。本明細書で例示される1つの用量は、静脈内送達を介して投与される1x1013vg/gである。本明細書で例示される別の用量は、静脈内送達を介して投与される2.5×1014vg/kgである。
インビボまたはインビトロで、rAAVで標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量または有効複数回用量の本開示のrAAVを含む組成物を、それを必要とする動物(ヒトを含む)に投与するステップを含む。用量が、障害/疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害/疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される障害/疾患状態に関連する少なくとも1つの症状を緩和(排除または低減)し、障害/疾患状態への進行を遅延もしくは予防し、障害/疾患状態の進行を遅延もしくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解(部分もしくは完全)をもたらし、および/または生存を延長する用量である。本開示の方法による予防または治療が企図される疾患の例は、SMARD1およびCMT2Sである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時処置および逐次的処置の両方を含む。新規療法との組み合わせであるとして、本開示の方法と標準的な医療との組み合わせが特に企図される。いくつかの実施形態では、併用療法は、本明細書に開示される遺伝子療法と組み合わせて免疫抑制剤を投与することを含む。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のrAAVのAAV成分(特に、AAV ITRおよびカプシドタンパク質)の投与経路および血清型は、治療される感染および/または疾患状態、ならびに野生型IGHMPB2タンパク質を発現する標的細胞/組織を考慮して、当業者によって選択および/または適合され得る。
本開示は、有効用量の本開示のrAAVおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を通した吸収などの経腸投与、および注射、注入、または移植を通した非経口投与が含まれる。
本開示のrAAVによる細胞の形質導入は、IGHMPB2タンパク質の持続的発現をもたらす。本開示は、したがって、IGHMPB2タンパク質を発現するrAAVを動物、好ましくは、ヒトに投与/送達する方法を提供する。これらの方法は、本開示の1つ以上のrAAVで細胞を形質導入することを含む。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるIGHMPB2の発現をもたらす、本開示の複製欠損rAAVを介した、インビボまたはインビトロのいずれかのレシピエント細胞へのIGHMPB2のコード領域の投与/送達を指すために使用される。
免疫抑制剤
免疫抑制剤は、遺伝子療法の投与後の対象におけるrAAVに対する免疫応答の開始の前または後に投与され得る。加えて、免疫抑制剤は、遺伝子療法またはタンパク質補充療法と同時に投与され得る。対象における免疫応答には、対象へのrAAVの投与に続くか、またはそれによって引き起こされる、有害な免疫応答または炎症反応が含まれる。免疫応答は、投与されたrAAVに応答した対象における抗体の産生であり得る。
免疫抑制剤は、遺伝子療法の投与後の対象におけるrAAVに対する免疫応答の開始の前または後に投与され得る。加えて、免疫抑制剤は、遺伝子療法またはタンパク質補充療法と同時に投与され得る。対象における免疫応答には、対象へのrAAVの投与に続くか、またはそれによって引き起こされる、有害な免疫応答または炎症反応が含まれる。免疫応答は、投与されたrAAVに応答した対象における抗体の産生であり得る。
例示的な免疫抑制剤には、グルココルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、mTOR阻害剤、プリン類似体、メトトレキサート、およびシクロホスファミドなどの細胞静止剤、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMDH)阻害剤、モノクローナル抗体または融合タンパク質およびポリペプチドなどの生物製剤、ならびにボルテゾミブなどのジペプチドボロン酸分子が含まれる。
免疫抑制剤は、炎症を減少させ、対象の免疫系を抑制または変調するステロイドである、抗炎症ステロイドであり得る。例示的な抗炎症ステロイドは、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ブデソニド、またはプレドニゾンなどのグルココルチコイドである。
ヤヌスキナーゼ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素のうちの1つ以上を標的とすることによる、JAK/STATシグナル伝達経路の阻害剤である。例示的なヤヌスキナーゼ阻害剤には、トファシチニブ、バリシチニブ、ウパダシチニブ、ペフィシチニブ、およびオクラシチニブが含まれる。
カルシニューリン阻害剤は、シクロフィリンに結合し、カルシニューリンの活性を阻害する。例示的なカルシニューリン阻害剤には、シクロスポリン、タクロリムス、およびピセクロリムスが含まれる。
mTOR阻害剤は、セリン/スレオニン特異的タンパク質キナーゼmTORを低減または阻害する。例示的なmTOR阻害剤には、シロリムス、エベロリムス、およびテムシロリムスが含まれる。
免疫抑制剤には、免疫抑制マクロライドが含まれる。「免疫抑制マクロライド」という用語は、対象の免疫系を抑制または変調するマクロライド剤を指す。マクロライドは、クラジノースまたはデソアミンなどの1つ以上のデオキシ糖が付着した大きな大環状ラクトン環を含む薬剤のクラスである。ラクトン環は通常、14、15、または16員である。マクロライドは、ポリケチドクラスの薬剤に属し、天然産物であり得る。免疫抑制マクロライドの例には、タクロリムス、ピメクロリムス、およびシロリムスが含まれる。
プリン類似体は、ヌクレオチド合成を阻止し、IMDH阻害剤を含む。例示的なプリン類似体には、アザチオプリン、ミコフェノール酸、およびレフノミドが含まれる。
例示的な免疫抑制生物製剤には、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキネヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ベラタセプト、およびダクリズマブが含まれる。
特に、免疫抑制剤は、抗CD20抗体である。抗CD20特異的抗体という用語は、CD20に特異的に結合するか、またはCD20の発現もしくは活性を阻害もしくは低減する抗体を指す。例示的な抗CD20抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ、またはオファツムマブが含まれる。
免疫抑制抗体の追加の例には、バシリキシマブおよびダクリズマブなどの抗CD25抗体(または抗IL2抗体もしくは抗TAC抗体)、ならびにムロモナブ-CD3、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビシリズマブなどの抗CD3抗体、アレムツズマブなどの抗CD52抗体が含まれる。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。記載された数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、記述される整数の最小および最大が含まれる。
実施例1-IGHMBP2をコードする遺伝子療法構築物
IGHMBP2をコードするAAVゲノム構築物は、遍在プロモーターの制御下にあるIGHMBP2 cDNAの完全長転写産物を用いたAAV9ベクター設計を描写する、図1に記載されるように生成された。これらの構築物に含むために企図されるプロモーターは、i)cmv-エンハンサーニワトリベータアクチンプロモーター(CBA、配列番号3)、またはP546(配列番号4)もしくは546と称される合成短縮メチルCpG結合タンパク質2(MeCp2)プロモーターのいずれかである。
IGHMBP2をコードするAAVゲノム構築物は、遍在プロモーターの制御下にあるIGHMBP2 cDNAの完全長転写産物を用いたAAV9ベクター設計を描写する、図1に記載されるように生成された。これらの構築物に含むために企図されるプロモーターは、i)cmv-エンハンサーニワトリベータアクチンプロモーター(CBA、配列番号3)、またはP546(配列番号4)もしくは546と称される合成短縮メチルCpG結合タンパク質2(MeCp2)プロモーターのいずれかである。
ヒトGFP cDNAクローンが、Origene,Rockville,MDから入手された。IGHMBP2 cDNAのみが、i)P546プロモーターまたはv)ハイブリッドニワトリβ-アクチンプロモーター(CB)のいずれかのうちの1つ以上の制御下で、自己相補的AAV9ゲノムにさらにサブクローン化された。プラスミド構築物はまた、シミアンウイルス40(SV40)キメライントロンなどのイントロン、およびウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル(BGHポリA)も含んだ。構築物は、いずれかのAAV9ゲノムにパッケージ化された。
プラスミドssAAV.CB.IGHMBP2.Kan.-Fw(カナマイシン耐性遺伝子が順方向にある)のためのマップが、図2に記載され、プラスミド全体の配列が、配列番号7で提供される。ssAAV.CB.IGHMBP2ベクターは、配列番号7のITR内にあり、かつそれを含み、図13に示されるようなヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’AAV2 ITR、CMVエンハンサー、CBAプロモーター、修飾SV40イントロン配列、IGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’AAV2 ITRを含む。配列番号7に記載されるプラスミドは、pUC複製起点とともにカナマイシン耐性をさらに含む。プラスミドssAAV.CB.IGHMBP2.Kan.-Rv(カナマイシン耐性遺伝子が逆方向にある)は、配列番号9として提供される。
表2は、プラスミドssAAV.CB.IGHMBP2.Kan.-Fw(配列番号7)の分子的特徴を示し、その範囲は、配列番号7におけるヌクレオチドを指し、
は、カナマイシン遺伝子が順方向にあることを示す。
プラスミドssAAV.P546.IGHMBP2.Kan.-Fw(カナマイシン耐性遺伝子が順方向にある)のためのマップが、図3に記載され、プラスミド全体の配列が、配列番号8で提供される。ssAAV.P546.IGHMBP2ベクターは、配列番号8のITR内にあり、かつそれを含み、図14に示されるようなヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’AAV2 ITR、P546プロモーター(本明細書ではMeCp2プロモーターまたはP546プロモーターとしても表される)、修飾SV40イントロン配列、IGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’AAV2 ITRを含む。配列番号8に記載されるプラスミドは、pUC複製起点とともにカナマイシン耐性をさらに含む。プラスミドssAAV.P546.IGHMBP2.Kan.-Rv(カナマイシン遺伝子が逆方向にある)は、配列番号10として提供される。
表3は、プラスミドssAAV.P546.IGHMBP2.Kan.-Fw(配列番号8)の分子的特徴を示し、その範囲は、配列番号8におけるヌクレオチドを指し、
は、カナマイシン耐性遺伝子が順方向にあることを示す。
プラスミドssAAV.P546.IGHMBP2.Kan-clinical(P546プロモーター配列、IGHMBP2 cDNA配列、SV40イントロン、およびbGHポリアデニル化配列が逆方向である)のためのマップが、図15に記載され、プラスミド全体の配列が、配列番号17で提供される。ssAAV.P546.IGHMBP2-clinicalベクターは、ITR内にあり、かつそれを含み、図16に示されるようなヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’AAV2 ITR(配列番号19)、P546プロモーター、修飾SV40イントロン配列、IGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’AAV2 ITR(配列番号12)を含む。配列番号17に記載されるプラスミドは、pUC複製起点とともにカナマイシン耐性をさらに含む。カナマイシン耐性遺伝子は、図15では順方向にあるが、逆方向にカナマイシン耐性遺伝子を伴うプラスミドも企図される。
表4は、プラスミドssAAV.P546.IGHMBP2.Kan-clinical(配列番号17)の分子的特徴を示し、その範囲は、配列番号17におけるヌクレオチドを指し、
は、要素が順方向にあることを示し、
は、要素が逆方向にあることを示す。
プラスミドssAAV.CB.IGHMBP2.Kan-clinical(CMVエンハンサー配列、CBプロモーター配列、IGHMBP2 cDNA配列、SV40イントロン、およびbGHポリアデニル化配列が逆方向にある)のためのマップが、図17に記載され、プラスミド全体の配列が、配列番号18で提供される。ssAAV.CB.IGHMBP2-clinicalベクターは、ITR内にあり、かつそれを含み、図18に示されるようなヌクレオチド配列を含む。rAAVベクターは、5’AAV2 ITR(配列番号19)、CMVエンハンサー、CBプロモーター、修飾SV40イントロン配列、IGHMBP2遺伝子のためのコード配列、bGHポリA、および3’AAV2 ITR(配列番号12)を含む。配列番号18に記載されるプラスミドは、pUC複製起点とともにカナマイシン耐性をさらに含む。カナマイシン耐性遺伝子は、図17では順方向にあるが、逆方向にカナマイシン耐性遺伝子を伴うプラスミドも企図される。
表5は、プラスミドssAAV.CB.IGHMBP2.Kan-clinical(配列番号18)の分子的特徴を示し、その範囲は、配列番号18におけるヌクレオチドを指し、
は、要素が順方向にあることを示し、
は、要素が逆方向にあることを示す。
実施例2-マウスにおけるIGHMBP2遺伝子療法ベクターのCSF送達
SMARD1およびCMT2Sのマウスモデルが、IGHMBP2を発現するAAVのCSF送達の効果を比較するために使用された。以下の表4は、IGHMBP2遺伝子療法ベクターの有効性を調査するために使用され得る、異なるマウスモデルを提供する。この研究では、疾患スペクトルの非常に重症の末端(em3)および中程度疾患形態(nmd-2J)を表す2つの異なるマウスモデルが、この研究に使用された。
SMARD1およびCMT2Sのマウスモデルが、IGHMBP2を発現するAAVのCSF送達の効果を比較するために使用された。以下の表4は、IGHMBP2遺伝子療法ベクターの有効性を調査するために使用され得る、異なるマウスモデルを提供する。この研究では、疾患スペクトルの非常に重症の末端(em3)および中程度疾患形態(nmd-2J)を表す2つの異なるマウスモデルが、この研究に使用された。
Em3マウスモデル
最初の研究のために、nmdem3/em3ホモ接合体マウスは、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介してIGHMBP2遺伝子療法ベクターまたは対照を投与された。「nmd」マウス変異は、脊髄運動ニューロンの進行性変性および筋萎縮を引き起こす(Cox et al.,euron 21:1327-1337,1998)。nmd変異は、Smbp2またはCatf1として以前に説明された推定転写活性化因子およびATPase/DNAヘリカーゼとして同定された。nmd表現型は、マウス染色体13上の主要な遺伝子座によって半優性様式で減衰される。
最初の研究のために、nmdem3/em3ホモ接合体マウスは、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介してIGHMBP2遺伝子療法ベクターまたは対照を投与された。「nmd」マウス変異は、脊髄運動ニューロンの進行性変性および筋萎縮を引き起こす(Cox et al.,euron 21:1327-1337,1998)。nmd変異は、Smbp2またはCatf1として以前に説明された推定転写活性化因子およびATPase/DNAヘリカーゼとして同定された。nmd表現型は、マウス染色体13上の主要な遺伝子座によって半優性様式で減衰される。
Nmdem3/em3ホモ接合体マウスマウスは、1×PBSおよび0.001%Pluronic F68(PBS/F68として表される)中に配合されたssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)もしくは空のウイルス粒子(ウイルスB)のいずれかの動物当たり5e10ウイルスゲノム(vg)のいずれかの1回の脳室内注射を受けた。強度試験が、投与後3週間から開始して実施され、生存率も監視された。図3は、ウイルスAおよびウイルスCを用いた処置が麻痺を回復させるように思われたが、これらのマウスが対照よりも小さいままであったことを実証する。
図4は、AAVの投与後2~3週間における対照マウスの隣にnmdem3/em3ホモ接合体マウスの代表的な画像を提供する。ウイルスAまたはウイルスCで処置されたマウスは、クラスプの改善を示した。加えて、ウイルスB(空のウイルス粒子)で処置されたマウスは、ウイルスAおよびCで処置されたマウスと比較して、その後肢を広げることができなかった。
図5は、nmdem3/em3マウスの生存分析を提供する。ウイルスAまたはウイルスCを用いた処置は、マウスの生存期間を回復した(それぞれ1匹が早期に死亡した)。しかしながら、ウイルスB(空のウイルス粒子)は、回復するように思われない。未処置およびウイルスB処置では時折生存者がいたが、これらのマウスは、非常に小さく、弱かった。図6に示されるように、ウイルスAまたはウイルスCを用いた処置は、nmdem3/em3ホモ接合体マウスの体重を改善したが、処置から8週間後に測定されると体重を完全には回復しなかった。
強度試験のために、処置されたマウスは、ワイヤーケージの蓋の上で最大60秒間反転され、それらが落下したとき、または60秒の終点に達したときの時間が留意された。3回の試行の最長時間が記録された。マウスが60秒間持続する最初の試行に失敗した場合、最初の失敗した試行が、A)故意に参加したくないこと、B)滑ったこと、またはC)60秒のワイヤー吊り下げを完了することができなかったことに起因したかどうかを確認するために、再度試験された。2回目に失敗した場合、約3~5分の休憩が与えられ、再度試験された。図7のデータ/グラフ内の数字は、最長の試行を反映する。図7は、マウスがワイヤーから吊り下げられるときに落下するまでの待ち時間と対比した処置後の時間を提供する。ウイルスAを用いた処置は、最初の改善を示し、その後に強度の低下が続き、後に、注射後8週間で野生型レベルに戻って回復した。ウイルスCを用いた処置は、ホモ接合体マウスが正常マウス(nmd+/+)と同様であるように強度を改善した。
加えて、処置されたnmdem3/em3ホモ接合体マウスの神経が、抽出および評価された。左右両方の横隔神経、大腿運動神経、および大腿感覚神経が、抽出され、電子顕微鏡(EM)固定で一晩固定された。神経は、次いで、1×PBS緩衝液で3回洗浄され、我々の組織学中核部に送られるまで4℃で保存された。軸索数が、ImageJの半自動化「WEKA訓練可能プログラム」プラグインを使用して決定された。処置されたnmdem3/em3ホモ接合体マウスの大腿神経の断面が、図8Aに示され、軸索領域が、図8Bに提供される。すべての群は、コルモゴロフ-スミルノフ検定で相互と有意に異なった。ウイルスAまたはウイルスCを用いた処置は、軸索の面積を有意に増加させた。
処置から8週間後の処置されたnmdem3/em3ホモ接合体マウスの肋間筋の筋肉面積も調査された。処置されたマウスでは、300本の筋線維が、各動物の個別の組織のヘマトキシリンおよびエオシン断面からImageJにおいて手動でトレースされた。測定値は、ピクセル単位で提供され、図8Dのグラフは、筋線維領域の範囲を示す累積度数を表す。
後肢の筋肉の断面が、図8Cに示される。後肢からの断面画像については、2つの切開が、膝および足首における脚の長さを定義するために膝蓋骨および踵骨に加えられた。第3の切開が、膝蓋骨および踵骨から等距離の点に加えられた。骨および筋肉の形態が、すべての動物の間で同じ領域から画像を選ぶために調べられた。ウイルスAまたはウイルスCで処置されたマウスは、筋肉面積の増加を示し、ウイルスCが最高のパフォーマンスを示した。
加えて、ウイルスAまたはウイルスBを用いた処置は、nmdem3/em3ホモ接合体マウスの後肢における神経筋接合部を部分的に回復した。図9Aおよび9Bは、rAAVを用いた処置から8週間後に後肢から取得されたMGおよびSol筋肉の免疫細胞化学を示す代表的な写真である。MGとSol筋肉は、重量を量られ、筋肉は、4%PFAで固定された。筋肉は、シナプス前神経のためのマーカーとしてのニューロフィラメント(緑)およびシナプス後Ach受容体のためのマーカーとしてブンガロトキシン(赤)を検出する抗体で染色された。神経筋接合部(NMJ)が、SP8 Leica共焦点顕微鏡を介して撮影された。各タイプのNMJ占有の例が、図9Aに提供されている。占有は、完全に神経支配されている(赤色のBTXアセチルコリンチャネルおよび緑色のニューロフィラメントチャネルが完全に重複する)、部分的に神経支配されている(赤色および緑色のチャネルが部分的に重複する)、または完全に除神経されている(1つのチャネルが完全に欠如している)のいずれかとして手動で決定された。未処置nmdem3/em3ホモ接合体マウスの後肢には神経筋接合部の神経支配がほとんどなかった。ウイルスAおよびC処置nmdem3/em3ホモ接合体マウスでは、完全に神経支配された、断片化された、および神経支配されていないNMJの混合物が見出された。グラフは、内側腓腹筋およびヒラメ筋上のNMJの計数を提供し、ウイルスAおよびウイルスCの両方で完全に神経支配されたNMJの増加を示し、ウイルスCがより高い割合の完全に神経支配されたNMJを示した。
Nmd-2Jマウスモデル
加えて、nmd-2Jマウスは、IGHMBP2遺伝子療法ベクターを投与されたか、または対照が、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介して投与された。nmd-2Jマウスは、中程度SMARD1様麻痺を有し、約60~100日で死亡する傾向がある。これらのマウスは、1×PBSおよび0.001%Pluronic F68(PBS/F68として表される)中に配合されたssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)もしくは空のウイルス粒子(ウイルスB)のいずれかの動物当たり5e10ウイルスゲノム(vg)のいずれかの1回の脳室内注射を受けた。上記に記載されるように、図10は、ウイルスAおよびCがnmd-2Jマウスの生存を改善したことを実証する、生存プロットを提供する。
加えて、nmd-2Jマウスは、IGHMBP2遺伝子療法ベクターを投与されたか、または対照が、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介して投与された。nmd-2Jマウスは、中程度SMARD1様麻痺を有し、約60~100日で死亡する傾向がある。これらのマウスは、1×PBSおよび0.001%Pluronic F68(PBS/F68として表される)中に配合されたssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)もしくは空のウイルス粒子(ウイルスB)のいずれかの動物当たり5e10ウイルスゲノム(vg)のいずれかの1回の脳室内注射を受けた。上記に記載されるように、図10は、ウイルスAおよびCがnmd-2Jマウスの生存を改善したことを実証する、生存プロットを提供する。
筋電図検査(EMG)は、有効性についての潜在的な臨床バイオマーカーである。電気生理学的結果は、Arnold et al,Annals of clinical and translational neurology,1(1),34-44,2014に記載されるように坐骨神経刺激に続いて後肢筋から記録される、複合筋活動電位(CMAP)、単一運動単位電位(SMUP)、および運動単位数推定(MUNE)が含まれる。CMAPは、神経支配の強度を測定し、MUNEは、筋肉を神経支配するニューロンの数の推定値を提供する。
簡潔には、2つの細いリング電極が、電気生理学的結果を記録するために麻酔されたマウス上に配置された。活性(E1)リング電極は、膝関節において後肢の腓腹筋の近位部分上で皮膚上に配置され、参照(E2)リング電極は、足の中足骨中央部分の領域上に配置された。リング電極の下にある皮膚は、インピーダンスを低減させるためにゲルでコーティングされた。坐骨CMAP応答が、坐骨神経の最大上刺激(最大約120%)(0.1ミリ秒の持続時間および強度1~10mAの方形波パルス)を用いて取得された。平均単一運動単位電位(SMUP)サイズおよびMUNEは、最小限の悉無律型応答を取得するために強度を0.026mAステップで増加させながら、1Hzの周波数において0.1ミリ秒の持続時間の最大下刺激を送達することによって、増分応答を記録することにより計算された。10の増分が、平均単一運動単位電位SMUP振幅を提供するために平均された。MUNEは、以下のように計算された:MUNE=CMAP/平均SMUP。CMAPおよびSMUPの振幅については、ピーク間測定が使用された。図11A-Dに示されるように、ウイルスAまたはウイルスCで処置されたマウスではCMAPおよびMUNE上に有意な増加があったが、CMAPは、ウイルスAで処置されたマウスおよびウイルスCで処置されたマウスで異ならなかった。図11A-Dは、未処置マウスと比較して、IGHMBP2遺伝子療法ベクターで処置されたマウス間の明確な差異を実証する。
Em5マウスモデル
em5マウスモデルはまた、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介して投与されたIGHMBP2遺伝子療法ベクターの効果を調査するために使用された。em5マウスは、感覚および運動神経障害の表現型であるCMT2Sを有し、約10カ月の生存期間を有する。これらのマウスは、1×PBSおよび0.001%Pluronic F68(PBS/F68として表される)中に配合されたssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)もしくは空のウイルス粒子(ウイルスB)のいずれかの動物当たり5e10ウイルスゲノム(vg)のいずれかの1回の脳室内注射を受けた。
em5マウスモデルはまた、脳脊髄液(CSF)への脳室内注射(ICV)を介して投与されたIGHMBP2遺伝子療法ベクターの効果を調査するために使用された。em5マウスは、感覚および運動神経障害の表現型であるCMT2Sを有し、約10カ月の生存期間を有する。これらのマウスは、1×PBSおよび0.001%Pluronic F68(PBS/F68として表される)中に配合されたssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)もしくは空のウイルス粒子(ウイルスB)のいずれかの動物当たり5e10ウイルスゲノム(vg)のいずれかの1回の脳室内注射を受けた。
図12Aは、健康なマウスならびにウイルスAおよびウイルスCで処置されたEm5マウスでの吊り下げワイヤー試験の結果を提供する。健康なマウスならびにウイルスAおよびウイルスCで処置されたマウスは、未処置em5マウスと比較して有意に優れた握力を示した。健康なマウスとウイルスAまたはウイルスCで処置されたマウスとの間に有意差はなかった。図12Bは、処置されたマウスおよび未処置マウスにおける内側腓腹筋(MG)の重量を示す。図12Bは、未処置em5マウスと比較して、健康なマウスならびにウイルスAおよびウイルスCで処置されたEm5マウスにおける全体重に関連してMGの筋肉量の増加を示す。処置された動物と健康な動物との間に差異はなかった。
実施例3-ヒトにおける臨床試験
ssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)は、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害に罹患しているヒト患者に髄腔内に投与される。臨床試験用のscAAVは、cGMP条件下でHEK293細胞の三重トランスフェクション方法を利用して産生される。
ssAAV9.CB.IGHMBP2(ウイルスA)またはssAAV9.P546.IGHMBP2(ウイルスC)は、SMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害に罹患しているヒト患者に髄腔内に投与される。臨床試験用のscAAVは、cGMP条件下でHEK293細胞の三重トランスフェクション方法を利用して産生される。
参加のために選択される患者は、遺伝子型によって決定されるようなSMARD1またはCMT2SなどのIGHMBP2関連障害と診断された1~20歳であろう。患者は、患者当たりssAAVの1回限りの遺伝子導入用量を受ける。ssAAVは、20mMの1mM MgCl2、200mMのNaCl、0.001%ポロキサマー188 Tris(pH8.0)中で配合され、髄腔内注射を通して一度だけ送達されるであろう。安全性は、臨床的根拠に基づき、かつ安全性ラベルの検討により評価される。遺伝子導入後30日目の安全性データの精査を可能にするために、各対象の登録の間に最低3~4週間がある。疾患の進行が測定され、生活の質および長期生存の可能性に対する処置の影響が評価される。
Claims (33)
- ポリヌクレオチドであって、
(a)1つ以上の調節制御要素と、
(b)免疫グロブリン-μ結合タンパク質2(IGHMBP2)のcDNA配列とを含む、ポリヌクレオチド。 - 前記調節制御要素が、CBAプロモーターまたはP546プロモーター、もしくはその断片である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記IGHMBP2 cDNAが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列、または配列番号1に記載されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号3または4のヌクレオチド配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)。
- 前記ゲノムが、P546プロモーターと、IGHMBP2 cDNAとを含む、請求項5に記載のrAAV。
- 前記ゲノムが、CBAプロモーターと、IGHMBP2 cDNAとを含む、請求項5に記載のrAAV。
- 前記rAAVが、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13またはAnc80、AAV7m8、およびそれらの誘導体のものである、請求項5~7のいずれか一項に記載のrAAV。
- 請求項5~8のいずれか一項に記載のrAAVを含む、rAAV粒子。
- 請求項5~8のいずれか一項に記載のrAAVまたは請求項9に記載のウイルス粒子を含む、組成物。
- 前記組成物の粘度または密度を増加させる薬剤をさらに含む、請求項10に記載の組成物。
- 前記薬剤が、造影剤である、請求項10に記載の組成物。
- 前記組成物が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達のために配合される、請求項9~12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、髄腔内送達のために配合され、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含む、請求項10~13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、静脈内送達のために配合され、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含む、請求項10~13のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項5~8のいずれか一項に記載のrAAV、請求項9に記載のrAAV粒子、または請求項10~15のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、IGHMBP2関連障害の治療を必要とする対象においてIGHMBP2関連障害を治療する方法。
- 前記障害が、SMARD1またはCMT2Sである、請求項16に記載の方法。
- 前記対象が、IGHMBP2遺伝子に変異を有する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記rAAVまたは前記rAAV粒子が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達によって投与される、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。
- 患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量が、髄腔内送達によって前記対象に投与される、請求項16~19のいずれか一項に記載の方法。
- 約1e13vg/kg~約2e14vg/kgの用量のrAAVまたはrAAV粒子の用量が、静脈内送達によって前記対象に投与される、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項16~21のいずれか一項に記載の方法。
- IGHMBP2関連障害の治療のための薬剤の調製における、請求項5~8のいずれか一項に記載のrAAV、請求項9に記載のrAAV粒子、または請求項10~15のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 前記障害が、SMARD1またはCMT2Sである、請求項23に記載の使用。
- 前記薬剤が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、または静脈内送達のために配合される、請求項23または24に記載の使用。
- 前記薬剤が、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、前記薬剤が、前記対象への髄腔内送達のために配合される、請求項23~25のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤が、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、前記薬剤が、前記対象への静脈内送達のために配合される、請求項23~25のいずれか一項に記載の使用。
- IGHMBP2関連障害の治療のための請求項5~8のいずれか一項に記載のrAAV、請求項9に記載のrAAV粒子、または請求項10~15のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 前記障害が、SMARD1またはCMT2Sである、請求項28に記載の組成物。
- 前記組成物が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達または静脈内送達のために配合される、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記組成物が、患者当たり約1e13vg~患者当たり約1e15vgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、前記組成物が、髄腔内送達のために配合される、請求項28~30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約1e13vg/kg~約2e14vg/kgのrAAVまたはrAAV粒子の用量を含み、前記組成物が、静脈内送達のために配合される、請求項28~30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、免疫抑制剤をさらに含む、請求項28~32のいずれか一項に記載の組成物。
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