CN114144197A - 完全人类翻译后修饰的抗体治疗剂 - Google Patents
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Abstract
提供了用于递送完全人类翻译后修饰的治疗性单克隆抗体及其抗原结合片段的方法和组合物。所述完全人类翻译后修饰的治疗性单克隆抗体可通过基因治疗方法，例如以重组腺相关病毒(rAAV)载体形式递送至适当组织。还提供了制造所述AAV载体的方法、药物组合物和治疗方法。另外，提供了产生作为完全人类翻译后修饰的“生物改良剂”的治疗性抗体的方法。这些完全人类翻译后修饰的治疗性抗体可施用于需要用所述治疗性抗体进行治疗的受试者。
Description
0.序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式通过电子方式提交并特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年4月24日，命名为38013_0001Pl_SL.txt并且大小为690,185字节。
1.引言
描述了组合物和方法，其用于将完全人类翻译后修饰(HuPTM)的治疗性单克隆抗体(“mAb”)或治疗性mAb的HuPTM抗原结合片段(例如所述治疗性mAb的完全人类糖基化(HuGly)Fab)递送至被诊断患有需要用所述治疗性mAb治疗的疾病或疾患的人类受试者。
2.发明背景
已显示治疗性mAb有效治疗多种疾病和疾患。然而，由于这些药剂仅在短时段内有效，因此通常需要重复注射较长持续时间，由此对患者产生相当大的治疗负担。
3.发明内容
描述了组合物和方法，其用于将HuPTM mAb或治疗性mAb的HuPTM抗原结合片段(例如，治疗性mAb的完全人类糖基化Fab(HuGlyFab))递送至被诊断患有需要用所述治疗性mAb治疗的疾病或疾患的患者(人类受试者)。治疗性mAb的此类抗原结合片段包括Fab、F(ab')2或scFv(单链可变片段)(在本文中统称为“抗原结合片段”)。如本文所用的“HuPTM Fab”可包括mAb的其他抗原结合片段。在一个替代性实施方案中，可使用全长mAb。递送可有利地经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有需要用治疗性mAb治疗的疾患的患者(人类受试者)施用编码治疗性mAb或其抗原结合片段(或任一者的高糖基化衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以在所述患者的组织或器官中形成持久储集物，从而向目标组织持续供应HuPTM mAb或治疗性mAb的抗原结合片段，例如人类糖基化转基因产物，所述mAb或其抗原结合片段在所述目标组织处发挥其治疗作用。
由转基因编码的HuPTM mAb或HuPTM抗原结合片段可包括(但不限于)全长治疗性抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合于：
·神经系统目标，包括：来源于淀粉样前体蛋白(APP)的淀粉样蛋白β(Aβ或Abeta)肽，包括(但不限于)索拉珠单抗(solanezumab)、GSK933776和仑卡奈单抗(lecanemab)(参见图2A至图2C)，其指示用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)；分选蛋白(sortilin)，包括(但不限于)AL-001(参见图3)，其用于治疗额颞叶痴呆(FTD)；与包括阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、FTD、慢性创伤性脑病变、皮克综合征(Pick's Complex)和原发性年龄相关性Tau蛋白病的Tau蛋白病相关的Tau蛋白，包括(但不限于)ABBV-8E12、UCB-0107和NI-105(BIIB076)(参见图4A至图4C)，其用于治疗Tau蛋白病；SEMA4D，包括(但不限于)VX15/2503(参见图5)，其用于治疗亨廷顿病(Huntington's disease)和青少年亨廷顿病；α-突触核蛋白，包括(但不限于)普拉森单抗(prasinezumab)、NI-202(BIIB054)和MED-1341(参见图6A至图6C)，其用于治疗帕金森病(Parkinson's disease)和突触核蛋白病(synucleinopathy)；超氧化物歧化酶-1(SOD-1)，包括(但不限于)NI-204(参见图7A和图7B)，其用于治疗ALS和阿尔茨海默病；和CGRP受体，包括(但不限于)伊普汀单抗(eptinezumab)、福瑞满单抗(fremanezumab)或伽奈珠单抗(galcanezumab)(参见图8A至图8C)，其用于治疗偏头痛和丛集性头痛；
·眼部抗血管生成目标，包括(但不限于)：VEGF(血管内皮生长因子)，包括(但不限于)赛伐珠单抗(sevacizumab)(参见图9A)，其用于治疗视网膜病症，包括糖尿病性视网膜病变(DR)、近视脉络膜新生血管(mCNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)和黄斑水肿；红细胞生成素受体，包括(但不限于)LKA-651(参见图9B和图9C)，其指示用于治疗视网膜疾病，例如视网膜静脉栓塞(RVO)、湿性AMD和黄斑水肿；来源于淀粉样前体蛋白(APP)的淀粉样蛋白β(Aβ或Abeta)肽，包括(但不限于)索拉珠单抗、GSK933776和仑卡奈单抗(参见图2A至图2C)，其用于治疗干性AMD；激活素受体样激酶1(ALK1)，包括(但不限于)阿伐苏单抗(ascrinvacumab)(参见图10A)，其指示用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性；补体组分5(C5)，包括(但不限于)特度鲁单抗(tesidolumab)和拉瓦利单抗(ravulizumab)(参见图10B和图10D)，其指示用于治疗干性AMD和非感染性葡萄膜炎；内皮糖蛋白(END或CD105)，包括(但不限于)卡妥昔单抗(carotuximab)(参见图10C)，其指示用于治疗湿性AMD和由增加的血管形成引起的其他视网膜病症；补体组分1Q(C1Q)，包括(但不限于)ANX-007(参见图11)，其指示用于治疗青光眼；和血浆蛋白目标，例如人类补体蛋白，包括(但不限于)血浆激肽释放酶(pKal)，包括(但不限于)拉那鲁单抗(lanadelumab)(参见图19)，其用于治疗糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿；
·补体组分5，包括(但不限于)拉瓦利单抗，其指示用于治疗重症肌无力(参见图10D)；
·TNF-α，包括(但不限于)阿达木单抗(adalimumab)
英利昔单抗(infliximab)
和戈利木单抗(golimumab)，其指示用于治疗非感染性葡萄膜炎(参见图12A至图12C)；
·排斥性导向分子A，包括(但不限于)艾利扎单抗(elezanumab)(参见图13)，其用于治疗多发性硬化症；
·转甲状腺素蛋白(Transthyretin；TTR)，包括(但不限于)NI-301和PRX-004(参见图14A和图14B)，其指示用于治疗淀粉样变性；
·结缔组织生长因子(CTGF)，包括(但不限于)帕姆单抗(pamrevlumab)(参见图15)，其指示用于治疗纤维化疾病(例如糖尿病性肾病变、肝纤维化、特发性肺纤维化)；
·视神经脊髓炎(NMO)/非感染性葡萄膜炎目标，包括以上TNF-α靶向抗体和白细胞介素6(IL6)和白细胞介素6受体(IL6R)靶向抗体，包括(但不限于)赛他利单抗(satralizumab)、赛瑞单抗(sarilumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、思鲁库单抗(sirukumab)、奥洛奇单抗(olokizumab)、吉瑞利单抗(gerilimzumab)和托珠单抗(tocilizumab)(参见图16A至图16H)，其指示用于治疗NMO、DR、DME和非感染性葡萄膜炎；和CD19，包括(但不限于)英比利珠单抗(inebilizumab)(参见图16I)，其指示用于治疗NMO；
·免疫反应目标，包括白细胞介素6(IL6)和白细胞介素6受体(IL6R)靶向抗体，包括(但不限于)赛他利单抗、赛瑞单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗和托珠单抗(参见图16A至图16H)，其指示用于治疗例如与细菌或病毒感染相关并且有待与免疫效应剂(例如CAR-T和其他基于细胞的疗法)和免疫肿瘤学药剂一起施用以抵抗、减少或改善与此类疗法相关的有害免疫反应的不良免疫反应，例如细胞因子释放综合征；
·整合素β7，包括(但不限于)艾托珠单抗(etrolizumab)(参见图17)，其指示用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn's disease)；
·骨硬化蛋白，包括(但不限于)若莫珠单抗(romosozumab)
(参见图18)，其指示用于治疗骨质疏松和异常骨质流失或无力；
·血浆蛋白目标，例如人类补体蛋白，包括(但不限于)血浆激肽释放酶，包括(但不限于)拉那鲁单抗(参见图19)，其用于治疗遗传性血管性水肿和眼部适应症，包括糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿；和
·抗IL和IL受体和用于自身免疫、呼吸道和过敏性疾病的其他目标，例如白细胞介素5(IL5)，包括(但不限于)贝纳利珠单抗(benralizumab)(参见图29A)；白细胞介素5受体(IL5R)，包括(但不限于)瑞利珠单抗(reslizumab)(参见图29B)；白细胞介素13(IL13)，包括(但不限于)塔罗金单抗(tralokinumab)(参见图29C)；白细胞介素31受体α(IL-31RA)，包括(但不限于)奈莫利珠单抗(nemolizumab)(参见图29D)；免疫球蛋白E(IgE)，包括(但不限于)奥马珠单抗(omalizumab)(参见图29E)；和胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromal lymphopoietin；TSLP)，包括(但不限于)特泽派单抗(tezepelumab)(参见图29F)或抗原结合片段。
用于递送转基因的重组载体包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)。然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体；痘疮病毒载体，或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。转基因的表达可由组成型或组织特异性表达控制元件控制。
基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链都得以表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。在某些实施方案中，编码序列编码Fab或F(ab')2或scFv。在某些实施方案中，表达抗体的全长重链和轻链。在其他实施方案中，构建体表达scFv，其中重链和轻链可变结构域经由柔性不可切割接头连接。在某些实施方案中，构建体从N末端起表达NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
通过基因疗法递送的治疗性抗体具有优于注射或输注的治疗性抗体的若干优势，所述注射或输注的治疗性抗体随时间推移而耗散，从而产生峰值水平和谷值水平。与反复注射抗体相反，转基因产物抗体的持续表达使作用部位处存在的抗体水平更一致，风险更低并且对于患者而言更方便，因为需要进行的注射次数更少。此外，由于在翻译期间和之后存在不同微环境，从转基因表达的抗体是以不同于直接注射的抗体的方式进行翻译后修饰。在不受任何特定理论束缚的情况下，这导致抗体具有不同的扩散、生物活性、分布、亲和力、药物动力学和免疫原性特性，使得与直接注射的抗体相比，递送至作用部位的抗体是“生物改良剂(biobetter)”。
另外，从转基因体内表达的抗体不太可能含有与由重组技术产生的抗体相关的降解产物，例如蛋白质聚集和蛋白质氧化。由于蛋白质浓度高、与制造设备和容器的表面相互作用以及利用某些缓冲液系统的纯化，聚集是与蛋白质产生和储存相关的问题。在基因疗法的转基因表达中不存在这些促进聚集的条件。氧化，例如甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸氧化，也与蛋白质产生和储存相关，并且由应激的细胞培养条件、金属和空气接触以及缓冲剂和赋形剂中的杂质引起。从转基因体内表达的蛋白质也可在应激条件下氧化。然而，人类和许多其他生物体均配备有抗氧化防御系统，其不仅降低氧化应激，而且有时也修复和/或逆转氧化。因此，体内产生的蛋白质不太可能呈氧化形式。聚集和氧化均可能影响效力、药物动力学(清除率)和免疫原性。
适合于向人类受试者施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂的制剂缓冲液中的悬浮液。
本发明部分基于以下原理：
(i)当前市面上的mAb治疗剂具有免疫球蛋白G(IgG)同种型，例如IgG1、IgG2和IgG4，其一般具有药物动力学(PK)特性，例如缓慢清除、长半衰期和有限组织分布。在静脉内施用后，典型的mAb血清PK特征曲线是两阶段的，具有迅速分布阶段和较慢消除阶段；因此，需要重复施用以维持治疗慢性疾患所需的剂量。此外，mAb的分布一般归因于其较大大小和亲水性而受限于血管和间质空间。mAb从循环分配至大部分组织的程度一般在约5-15％范围内，但在脑中低得多。(参见例如Kamath,2016,Drug Discovery Today:Technologies 21-22:75-83，其通过引用整体并入本文)。原位持续产生HuPTMmAb或HuPTMFab避免重复施用并允许使用否则实现功效的全身半衰期将过短的Fab；并且所描述的施用方法直接接近目标组织，例如脑，其中可实现较高剂量至此类组织的递送。
(ii)多种治疗性mAb的Fab区具有糖基化位点。例如，参见图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F，其鉴定共有和非共有天冬酰胺(“N”)糖基化位点以及某些治疗性mAb的Fab区中作为糖基化位点的谷氨酰胺(“Q”)残基。(参见例如Valliere-Douglass等人,2009,J.Biol.Chem.284:32493-32506和Valliere-Douglass等人,2010,J.Biol.Chem.285:16012-16022，其各自关于抗体中N-连接的糖基化位点的鉴定通过引用整体并入本文)。另外，O-糖基化包括通过酶将N-乙酰基-半乳糖胺添加至丝氨酸或苏氨酸残基。已证明存在于抗体铰链区中的氨基酸残基可经O-糖基化。相较于例如大肠杆菌中产生的抗原结合片段，O-糖基化的可能性赋予本文所提供的治疗性抗体另一个优势，同样因为大肠杆菌天然不含有与人类O-糖基化中使用的机制相当的机制。(实际上，仅当细菌被修饰以含有特定O-糖基化机制时证明大肠杆菌中的O-糖基化。参见例如Farid-Moayer等人,2007,J.Bacteriol.189:8088-8098)。此外，Fab氨基酸序列可被修饰以对高糖基化变体进行工程化(例如参见图20A和图20B中所示的可对治疗性抗体的高糖基化Fab区进行工程化的氨基酸取代；以及Courtois等人,2016,mAbs8:99-112，其关于在全长抗体的Fab结构域上被高糖基化的抗体衍生物的描述通过引用整体并入本文)。
(iii)除糖基化位点以外，Fab区可在CDR中或附近含有酪氨酸(“Y”)硫酸化位点；参见图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F，其鉴定某些治疗性mAb的Fab区中的酪氨酸-O-硫酸化位点。(参见例如Yang等人,2015,Molecules 20:2138-2164(特别是第2154页)，其关于进行蛋白质酪氨酸硫酸化的酪氨酸残基周围的氨基酸的分析通过引用整体并入)。“规则”可概述如下：Y残基，E或D在Y的+5至-5位置内，并且其中Y的-1位置是中性或酸性带电荷氨基酸，而非消除硫酸化的碱性氨基酸，例如R、K或H。
(iv)通过人类细胞对例如图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F中所示的那些的Fab区和Fc区(参见图22和表7)的糖基化将导致添加可改进转基因产物的稳定性、半衰期并降低其不合需要的聚集和/或免疫原性的聚糖。(关于Fab糖基化的新出现的重要性的综述，参见例如Bovenkamp等人,2016,J.Immunol.196:1435-1441；并且参见鉴定可连接至HuGlyFab的聚糖的图22(根据Bondt等人,2014,Mol&Cell Proteomics 13.1:3029-2029)改编)。已显示抗体的Fab和Fc部分具有不同糖基化型态，其中相对于Fc聚糖，Fab聚糖在半乳糖基化、唾液酸化和等分(例如通过等分GlcNAc)中较高，但在岩藻糖基化中较低。(例如参见Bondt等人,2014,Mol.&Cell.Proteomics 13.11:3029-3039，其关于Fab相关N-聚糖的公开内容通过引用整体并入本文)。
(v)显然，添加至本发明的HuPTM mAb和HuGlyFab的聚糖是含有2,6-唾液酸的经高度加工的复合型N-聚糖。此类聚糖不存在于以下各者中：(a)在大肠杆菌中产生的治疗性mAb(其完全未被糖基化)；(b)在CHO细胞中产生的治疗性抗体，所述CHO细胞不具有在糖基化期间添加2,6-唾液酸所需的2,6-唾液酸基转移酶；或(c)于CHO或鼠类细胞系中产生的治疗性抗体，所述CHO或鼠类细胞系添加非人类天然(并且潜在地具免疫原性)的N-乙醇酰神经氨酸(“Neu5Gc”或“NeuGc”)，而非主要人类唾液酸N-乙酰基神经氨酸(“Neu5Ac”)。参见例如Dumont等人,2015,Crit.Rev.Biotechnol.36(6):1110-1122；Huang等人,2006,Anal.Biochem.349:197-207(NeuGc是例如SP2/0和NS0的鼠类细胞系中的主要唾液酸)；以及Song等人,2014,Anal.Chem.86:5661-5666，其中的每一者通过引用整体并入本文。
(vi)本发明的HuPTM mAb和HuGlyFab的人类糖基化型态应降低转基因产物的免疫原性并改进功效。重要的是，当根据本文所描述的方法使用的全长抗体和抗原结合片段表达于人类目标细胞中时，对在原核宿主细胞(例如，大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如CHO细胞或鼠类NS0或SP2/0细胞)中体外生产的需求被规避。相反，由于本文所描述的方法(例如使用人类目标细胞表达抗原结合片段)，全长抗体和抗原结合片段的N-糖基化位点有利地被与人类治疗有关和有益治疗的聚糖装饰。当将CHO细胞、鼠类细胞或大肠杆菌用于抗体/抗原结合片段产生时，这种优势由于以下原因而难以实现：例如(a)CHO细胞缺乏添加某些聚糖所需的组分(例如2,6唾液酸和等分GlcNAc)；(b)CHO细胞和鼠类细胞(NS0和SP2/0细胞)添加Neu5Gc而非Neu5Ac作为对于人类并非典型的唾液酸；(c)CHO细胞还可产生免疫原性聚糖α-Gal抗原，其与大部分个体中存在的抗α-Gal抗体反应，其在高浓度下可引发全身性过敏反应(参见例如Bosques,2010,Nat Biotech 28:1153-1156)；以及(d)大肠杆菌天然地不含有N-糖基化所需的组分。
(vii)例如图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F中所示的那些的Fab区的酪氨酸硫酸化(许多人类细胞中的稳固翻译后过程)将导致转基因产物对其分子目标的亲合力增加。实际上，已显示抗体的Fab的酪氨酸硫酸化显著增加对抗原的亲合力和活性。(参见例如Loos等人,2015,PNAS112:12675-12680；以及Choe等人,2003,Cell 114:161-170)。此类翻译后修饰不存在于大肠杆菌(不具有酪氨酸硫酸化所需的酶的宿主)中产生的治疗性抗体上，并且充其量在CHO细胞中产生的治疗性mAb中有不足的表示。CHO细胞并非分泌细胞，并且翻译后酪氨酸硫酸化的能力有限。(参见例如Mikkelsen和Ezban,1991,Biochemistry 30:1533-1537，尤其第1537页的论述)。
出于前述原因，产生HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的疾病治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码全长HuPTM mAb或治疗性mAb的HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体施用至被诊断患有需要用所述mAb治疗的疾病的患者(人类受试者)，以在受试者中形成持久储集物，从而持续供应通过受试者的经转导细胞产生的人类糖基化、硫酸化转基因产物。用于HuPTMmAb或HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导人类细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生全长HuTPM mAb或HuPTM Fab，并且可向患者施用糖蛋白。
本文所提供的方法涵盖涉及伴随施用其他可用治疗而将全长HuPTM mAb或HuPTMFab递送至患者的组合疗法。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。此类额外治疗可包括(但不限于)使用治疗性mAb的辅助疗法。
还提供了制造病毒载体，特别是基于AAV的病毒载体的方法。在特定实施方案中，提供了产生重组AAV的方法，所述方法包括培养含有人工基因组的宿主细胞，所述人工基因组包含：由AAV ITR侧接的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码治疗性抗体的转基因，所述转基因可操作地连接至将控制转基因在人类细胞中的表达的表达控制元件；缺乏AAV ITR的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码AAV rep和衣壳蛋白，所述AAV rep和衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述AAV rep和衣壳蛋白在培养物中的所述宿主细胞中的表达并且反式供应rep和cap蛋白的表达控制元件；足以准许通过AAV衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组的腺病毒辅助功能；以及从所述细胞培养物回收包裹所述人工基因组的重组AAV。
本发明人还已经发现全长抗体可从基于AAV的载体表达(参见实施例36和37)。编码全长抗体的重链和轻链的核苷酸序列可针对于人类细胞中的表达进行密码子优化，并且可在序列中具有数目减少的CpG二聚体。因此，提供了包含AAV载体的组合物，所述AAV载体表达编码治疗性抗体的全长重链(包括Fc结构域)和轻链的转基因。还提供了施用和制造方法。
3.1说明性实施方案
物质的组合物
1.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FD)、Tau蛋白病、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病变、皮克综合征和原发性年龄相关性Tau蛋白病、亨廷顿病、青少年亨廷顿病、帕金森病、突触核蛋白病、ALS、偏头痛或丛集性头痛，所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体具有：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗淀粉样蛋白β(抗Aβ)、抗分选蛋白、抗Tau蛋白(抗Tau)、抗信号蛋白4D(抗SEMA4D)、抗α突触核蛋白(抗SNCA)、抗超氧化物歧化酶-1(抗SOD1)或抗抑钙素基因相关肽受体(抗CGRPR)单克隆抗体(mAb)的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞、人类肝脏细胞和/或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是鞘内、静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
2.如段落1的药物组合物，其中所述抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；所述抗分选蛋白mAb是AL-001；所述抗Tau mAb是ABBV-8E12、UCB-0107或NI-105(BIIB076)；所述抗SEMA4D mAb是VX15/2503；所述抗SNCA mAb是普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341；所述抗SOD1 mAb是NI-2041.10D12或NI-204.12G7；并且所述抗CGRPR mAb是伊普汀单抗、福瑞满单抗或伽奈珠单抗。
3.如段落1或2的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或单链可变结构域(scFv)。
4.如段落1至3中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:1和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:290的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:291的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:360和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:392的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:361的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQID NO:6的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:7和任选地IgG4同种型(例如氨基酸序列SEQID NO:285)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:9和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:292的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:11和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和任选地IgG4同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:285)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:15和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:293的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:17和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ IDNO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:19和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:294的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:21和任选地具有氨基酸序列SEQID NO:295的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:23和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:25和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:296的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:27和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:297的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:29和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:298的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的轻链。
5.如段落4的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:71和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:72；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:73和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:74；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:376和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:377；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:75和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:76；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:77的重链和具有核苷酸序列SEQ IDNO:78的轻链；具有核苷酸序列SEQ ID NO:79的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:80的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:81的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:82的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:83的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:84的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:85的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:86的轻链；或具有核苷酸序列SEQID NO:87的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:88的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:89的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:90的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:91的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:92的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:93的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:94的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:95重链和具有核苷酸序列SEQID NO:96的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:97的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:98的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:99的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:100的轻链。
6.如段落1至4中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
7.如段落1至6中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类CNS细胞、肌肉细胞或肝脏细胞中的分泌和翻译后修饰。
8.如段落7的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表2的信号序列。
9.如段落1至8中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8或AAV9。
10.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的视网膜病症，包括糖尿病性视网膜病变、近视脉络膜新生血管(mCNV)、黄斑变性(例如新生血管性(湿性)或干性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、黄斑水肿(例如视网膜静脉栓塞(RVO)后的黄斑水肿或糖尿病性黄斑水肿(DME))、视网膜静脉栓塞、糖尿病性视网膜病变(DR)、非感染性葡萄膜炎或青光眼、或视网膜异常血管形成，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV2.7m8衣壳(SEQ ID NO:142)、AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)、抗红细胞生成素受体(抗EPOR)、抗Aβ、抗激活素受体样激酶1(抗ALK1)、抗补体组分5(抗C5)、抗内皮糖蛋白(抗ENG)、抗补体组分1Q(抗CC1Q)或抗pKal mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内或脉络膜上施用。
11.如段落10的药物组合物，其中所述抗VEGF mAb是赛伐珠单抗；抗EPOR mAb是LKA-651(NSV2)或LKA-651(NSV3)；抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；抗ALK1mAb是阿伐苏单抗；抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；抗ENG mAb是卡妥昔单抗；所述抗CC1Q mAb是ANX-007；并且所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
12.如段落10或11的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
13.如段落10至12中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:290的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:360和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:392的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:361的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:31和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:299的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:33和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:34的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:35和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:291的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:37和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:300的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:39和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:301的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:40的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:41和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:302的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:43和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:44的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:69和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:314的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:70的轻链。
14.如段落13的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:71和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:72；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:376和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:377；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:101和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:102；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:103和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:104；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:105和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:106；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:73和编码轻链的核苷酸序列SEQID NO:74；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:107和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:108；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:109和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:110；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:111和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:112；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:113和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:114；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:139和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:140；或核苷酸序列SEQ ID NO 141、286、287或435至443。
15.如段落10至13中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
16.如段落10至15中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类视网膜细胞中的分泌和翻译后修饰。
17.如段落16的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表2、表3或表4的信号序列。
18.如段落10至17中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
19.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)、AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗补体组分5(C5)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗白细胞介素-6(IL-6)mAb或其抗原结合片段、或基本上全长或全长抗白细胞介素-6受体(IL-6R)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内或脉络膜上施用。
20.如段落19的药物组合物，其中所述抗TNFαmAb是阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗；所述抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；所述抗IL-6mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗；或者所述抗IL-6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗。
21.如段落19或20的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
22.如段落19至21中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:45和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:303的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:451、452或453的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:47和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:304的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:48的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:49和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:305的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:50的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:39和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:301的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:40的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:334的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:336的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:338的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:339的重链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ IDNO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；和具有氨基酸序列SEQID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链。
23.如段落22的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:115和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:116；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:117和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:118；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:119和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:120；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:109和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:110；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:344；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ IDNO:346；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:350；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:352；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:341和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:342。
24.如段落19至22中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
25.如段落19至24中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类视网膜细胞中的分泌和翻译后修饰。
26.如段落25的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表2、表3或表4的信号序列。
27.如段落19至26中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
28.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的多发性硬化症，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗排斥性导向分子A(抗RGMa)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞、人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是鞘内、静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
29.如段落28的药物组合物，其中所述抗RGMa mAb是艾利扎单抗。
30.如段落28或29的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
31.如段落28至30中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:51和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:306的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:52的轻链。
32.如段落31的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:121和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:122。
33.如段落28至31中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
34.如段落28至33中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类CNS细胞中的分泌和翻译后修饰。
35.如段落34的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表2、表3或表4的信号序列。
36.如段落28至35中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV9。
37.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的淀粉样变性(ATTR)、家族性淀粉样蛋白心肌病(FAC)或家族性淀粉样蛋白多发性神经病变(FAP)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗转甲状腺素蛋白(抗TTR)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者皮下、肌肉内或静脉内施用。
38.如段落37的药物组合物，其中所述抗TTR mAb是NI-301或PRX-004。
39.如段落37或38的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
40.如段落37至39中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:53和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:55和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:307的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:56的轻链。
41.如段落40的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:123和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:124；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:125和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:126。
42.如段落37至41中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
43.如段落37至42中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
44.如段落43的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表3或表4的信号序列。
45.如段落37至44中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
46.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的纤维化病症、肺纤维化、囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、心房纤维化、心内膜纤维化、陈旧性心肌梗塞、关节纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、纵隔纤维化、骨髓纤维化(MF)、肾源性系统性纤维化(NSF)、进行性大块纤维化(PMF)和腹膜后纤维化(RPF)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗结缔组织生长因子(抗CTGF)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者皮下、肌肉内或静脉内施用。
47.如段落46的药物组合物，其中所述抗CTGF mAb是帕姆单抗。
48.如段落46或47的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
49.如段落46至48中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:57和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:308的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:58的轻链。
50.如段落49的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:127和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:128。
51.如段落44至50中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
52.如段落44至51中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
53.如段落52的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表3或表4的信号序列。
54.如段落44至53中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
55.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎、视神经脊髓炎(NMO)、糖尿病性视网膜病变(DR)或糖尿病性黄斑水肿(DME)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV2.7m8衣壳(SEQ ID NO:142)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)、抗白细胞介素-6(IL6)或抗分化簇19(抗CD19)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内或脉络膜上施用。
56.如段落55的药物组合物，其中所述抗IL6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗，或者所述抗CD19mAb是英比利珠单抗。
57.如段落55或56的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
58.如段落55至57中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:334的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:336的轻链；或具有氨基酸序列SEQ IDNO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQID NO:338的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:339和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:283的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:63和任选地具有氨基酸序列SEQ IDNO:311的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:64的轻链。
59.如段落58的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:344；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:346；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:350；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQ IDNO:352；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:353和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:354；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:133和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:134。
60.如段落55至59中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
61.如段落55至60中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类视网膜细胞中的分泌和翻译后修饰。
62.如段落61的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表2、表3或表4的信号序列。
63.如段落55至62中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
64.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的炎性肠病(IBD)，包括UC和CD，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗整合素β7亚基(抗ITGB7)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者皮下、肌肉内或静脉内施用。
65.如段落64的药物组合物，其中所述抗ITGB7 mAb是艾托珠单抗。
66.如段落64或65的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
67.如段落64至66中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:65和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:312的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:66的轻链。
68.如段落67的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:135和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:136。
69.如段落64至68中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
70.如段落64至69中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
71.如段落70的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表3或表4的信号序列。
72.如段落64至71中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
73.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的骨质疏松或异常骨质流失或无力(例如治疗骨巨细胞瘤、治疗由治疗诱发的骨质流失、减缓乳腺癌和前列腺癌患者的骨质流失(或增加其骨质)、预防骨转移所致的骨骼相关事件或减少骨骼再吸收和转换)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗骨硬化蛋白(抗SOST)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者静脉内、肌肉内或皮下施用。
74.如段落73的药物组合物，其中所述抗SOST mAb是若莫珠单抗。
75.如段落73或74的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
76.如段落73至75中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:67和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:313的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链。
77.如段落76的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:137和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:138。
78.如段落73至77中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
79.如段落73至78中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
80.如段落79的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表3或表4的信号序列。
81.如段落73至80中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
82.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的血管性水肿，包括遗传性血管性水肿，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗激肽释放酶(抗pKal)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者静脉内、肌肉内或皮下施用。
83.如段落82的药物组合物，其中所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
84.如段落82或83的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
85.如段落82至84中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:69和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:314的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:70的轻链。
86.如段落85的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ IDNO:139和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:140；或核苷酸序列SEQ ID NO 141、286、287或435至443。
87.如段落82至85中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
88.如段落82至87中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类视网膜细胞中的分泌和翻译后修饰。
89.如段落88的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)或来自表3或表4的信号序列。
90.如段落82至89中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
治疗方法
91.一种治疗有需要的人类受试者的阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FD)、Tau蛋白病、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病变、皮克综合征和原发性年龄相关性Tau蛋白病、亨廷顿病、青少年亨廷顿病、帕金森病、突触核蛋白病、ALS、偏头痛或丛集性头痛的方法，所述方法包括向所述人类受试者的脑脊髓液(CSF)递送治疗有效量的抗淀粉样蛋白β(抗Aβ)、抗分选蛋白、抗Tau蛋白(抗Tau)、抗信号蛋白4D(抗SEMA4D)、抗α突触核蛋白(抗SNCA)、抗超氧化物歧化酶-1(抗SOD1)或抗抑钙素基因相关肽受体(抗CGRPR)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类CNS细胞产生。
92.一种治疗有需要的人类受试者的阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FD)、Tau蛋白病、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病变、皮克综合征和原发性年龄相关性Tau蛋白病、亨廷顿病、青少年亨廷顿病、帕金森病、突触核蛋白病、ALS、偏头痛或丛集性头痛的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗淀粉样蛋白β(抗Aβ)、抗分选蛋白、抗Tau蛋白(抗Tau)、抗信号蛋白4D(抗SEMA4D)、抗α突触核蛋白(抗SNCA)、抗超氧化物歧化酶-1(抗SOD1)或抗抑钙素基因相关肽受体(抗CGRPR)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的人类翻译后修饰(HuPTM)形式的储集物。
93.如段落91或92的方法，其中所述抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；所述抗分选蛋白mAb是AL-001；所述抗Tau mAb是ABBV-8E12、UCB-0107或NI-105(BIIB076)；所述抗SEMA4D mAb是VX15/2503；所述抗SNCAmAb是普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341；所述抗SOD1 mAb是NI-2041.10D12或NI-204.12G7；并且所述抗CGRPR mAb是伊普汀单抗、福瑞满单抗或伽奈珠单抗。
94.如段落91至93中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
95.如段落91至94中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:290的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:292的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:360和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:392的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:361的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:7和任选地IgG4同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:285)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的轻链；或具有氨基酸序列SEQ IDNO:9和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:292的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQID NO:10的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:11和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和任选地IgG4同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:285)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:15和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:293的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:17和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:19和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:294的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:21和任选地具有氨基酸序列SEQ IDNO:295的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:23和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:25和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:296的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:27和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:297的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:29和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:298的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的轻链。
96.如段落95的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:71和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:72；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:73和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:74；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:376和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:377；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:75和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:76；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:77的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:78的轻链；具有核苷酸序列SEQ ID NO:79的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:80的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:81的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:82的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:83的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:84的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:85的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:86的轻链；或具有核苷酸序列SEQ IDNO:87的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:88的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:89的重链和具有SEQ ID NO:90的核苷酸序列的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:91的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:92的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:93的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:94的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:95的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:96的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:97的重链和具有核苷酸序列SEQ IDNO:98的轻链；或具有核苷酸序列SEQ ID NO:99的重链和具有核苷酸序列SEQ ID NO:100的轻链。
97.如段落91至95中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
98.如段落91至97中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
99.如段落91至98中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc和/或α-Gal。
100.如段落91至99中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
101.如段落92至100中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV9。
102.如段落92至101中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类CNS细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
103.一种治疗有需要的人类受试者的糖尿病性视网膜病变、近视脉络膜新生血管(mCNV)、黄斑变性(例如新生血管性(湿性)或干性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、黄斑水肿(例如视网膜静脉栓塞(RVO)后的黄斑水肿或糖尿病性黄斑水肿(DME))、RVO、糖尿病性视网膜病变(DR)、非感染性葡萄膜炎、青光眼或视网膜异常血管形成的方法，所述方法包括向所述人类受试者的视网膜递送治疗有效量的抗血管内皮生长因子(抗VEGF)、抗红细胞生成素受体(抗EPOR)、抗Aβ、抗激活素受体样激酶1(抗ALK1)、抗补体组分5(抗C5)、抗内皮糖蛋白(抗ENG)、抗补体组分1Q(抗CC1Q))或抗pKal mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类视网膜细胞产生。
104.一种治疗有需要的人类受试者的糖尿病性视网膜病变、近视脉络膜新生血管(mCNV)、黄斑变性(例如新生血管性(湿性)或干性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、黄斑水肿(例如视网膜静脉栓塞(RVO)后的黄斑水肿或糖尿病性黄斑水肿(DME))、RVO、糖尿病性视网膜病变(DR)、非感染性葡萄膜炎、青光眼或视网膜异常血管形成的方法，所述方法包括：
向所述受试者的视网膜施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)、抗红细胞生成素受体(抗EPOR)、抗Aβ、抗激活素受体样激酶1(抗ALK1)、抗补体组分5(抗C5)、抗内皮糖蛋白(抗ENG)、抗补体组分1Q(抗CC1Q)或抗pKal mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
105.如段落103或104的方法，其中所述抗VEGF mAb是赛伐珠单抗；抗EPOR mAb是LKA-651(NSV2)或LKA-651(NSV3)；抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；抗ALK1mAb是阿伐苏单抗；抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；抗ENG mAb是卡妥昔单抗；所述抗CC1Q mAb是ANX-007；并且所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
106.如段落103至105中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
107.如段落103至106中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:1和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:290的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:360和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:392的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:361的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:31和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:299的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:33和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQID NO:34的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:35和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:291的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:37和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:300的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:39和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:301的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:40的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:41和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:302的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:43和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:69和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:314的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:70的轻链。
108.如段落107的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:71和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:72；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:376和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:377；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:101和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:102；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:103和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:104；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:105和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:106；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:73和编码轻链的核苷酸序列SEQ IDNO:74；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:107和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:108；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:109和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:110；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:111和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:112；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:113和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:114；或核苷酸序列SEQ IDNO141、286、287或435至443。
109.如段落103至105中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
110.如段落103至109中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
111.如段落103至110中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
112.如段落103至111中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
113.如段落104至112中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV2.7m8、AAV8或AAV9。
114.如段落104至113中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类视网膜细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
115.一种治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括向所述人类受试者的视网膜递送治疗有效量的基本上全长或全长抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类视网膜细胞产生。
116.一种治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的视网膜施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗补体组分5(C5)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗白细胞介素-6(IL-6)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗白细胞介素-6受体(IL-6R)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
117.如段落115或116的方法，其中所述抗TNFαmAb是阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗；所述抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；所述抗IL-6mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗；或者所述抗IL-6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗。
118.如段落115至117中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
119.如段落115至118中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:45和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:303的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:46的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:47和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:304的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:48的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:49和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:305的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:50的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:39和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:301的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:40的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:334的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:336的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:338的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:339的重链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；和具有氨基酸序列SEQ ID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链。
120.如段落119的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:115和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:116；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:117和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:118；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:119和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:120；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:109和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:110；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ IDNO:344；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:346；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:350；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:352；编码重链的核苷酸序列SEQID NO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:341和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:342。
121.如段落115至118中任一段落的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
122.如段落115至121中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
123.如段落115至122中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
124.如段落115至123中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
125.如段落116至124中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV2.7m8、AAV8或AAV9。
126.如段落116至125中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类视网膜细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
127.一种治疗有需要的人类受试者的多发性硬化症的方法，所述方法包括向所述人类受试者的脑脊髓液(CSF)递送治疗有效量的基本上全长或全长抗排斥性导向分子A(抗RGMa)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类CNS细胞产生。
128.一种治疗有需要的人类受试者的多发性硬化症的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的所述CNS施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗排斥性导向分子A(抗RGMa)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
129.如段落127或128的方法，其中所述抗RGMa mAb是艾利扎单抗。
130.如段落127至129中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
131.如段落127至130中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:51和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:306的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:52的轻链。
132.如段落131的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:121和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:122。
133.如段落127至131中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
134.如段落127至133中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
135.如段落127至134中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
136.如段落127至135中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
137.如段落128至136中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV9。
138.如段落128至136中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类CNS细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
139.一种治疗有需要的人类受试者的淀粉样变性(ATTR)、家族性淀粉样蛋白心肌病(FAC)或家族性淀粉样蛋白多发性神经病变(FAP)的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的基本上全长或全长抗转甲状腺素蛋白(抗TTR)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
140.一种治疗有需要的人类受试者的哮喘的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗转甲状腺素蛋白(抗TTR)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
141.如段落139或140的方法，其中所述抗TTR mAb是NI-301或PRX-004。
142.如段落139至141中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
143.如段落139至142中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:53和任选地IgG1同种型(例如氨基酸序列SEQ ID NO:283)的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:55和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:307的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:56的轻链。
144.如段落143的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:123和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:124；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:125和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:126。
145.如段落139至143中任一段落的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
146.如段落139至145中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
147.如段落139至146中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
148.如段落139至147中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
149.如段落140至148中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
150.如段落140至149中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或人类肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
151.一种治疗有需要的人类受试者的纤维化病症包括肺纤维化、囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、心房纤维化、心内膜纤维化、陈旧性心肌梗塞、关节纤维化、克罗恩病、纵隔纤维化、骨髓纤维化(MF)、肾源性系统性纤维化(NSF)、进行性大块纤维化(PMF)和腹膜后纤维化(RPF)的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的基本上全长或全长抗结缔组织生长因子(抗CTGF)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
152.一种治疗有需要的人类受试者的纤维化病症包括肺纤维化、囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、心房纤维化、心内膜纤维化、陈旧性心肌梗塞、关节纤维化、克罗恩病、纵隔纤维化、骨髓纤维化(MF)、肾源性系统性纤维化(NSF)、进行性大块纤维化(PMF)和腹膜后纤维化(RPF)的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗结缔组织生长因子(抗CTGF)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
153.如段落151或152的方法，其中所述抗CTGF mAb是帕姆单抗。
154.如段落151至153中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
155.如段落151至154中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:57和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:308的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:58的轻链。
156.如段落155的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:127和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:128。
157.如段落151至155中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
158.如段落151至157中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
159.如段落151至158中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
160.如段落151至159中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
161.如段落152至160中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
162.如段落152至161中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或人类肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
163.一种治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎、视神经脊髓炎(NMO)、糖尿病性视网膜病变(DR)或糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法，所述方法包括向所述人类受试者的视网膜递送治疗有效量的抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)mAb、抗白细胞介素-6(IL6)mAb或抗分化簇19(抗CD19)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类视网膜细胞产生。
164.一种治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎、视神经脊髓炎(NMO)、糖尿病性视网膜病变(DR)或糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的视网膜施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)mAb、抗白细胞介素-6(IL6)mAb或抗分化簇19(抗CD19)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
165.如段落163或164的方法，其中所述抗IL6R是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗，或者所述抗CD19mAb是英比利珠单抗。
166.如段落163至165中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
167.如段落163至166中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:334的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:336的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:338的轻链；或具有氨基酸序列SEQ IDNO:339和任选地具有IgG1氨基酸序列SEQ ID NO:283的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:63和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:311的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:64的轻链。
168.如段落167的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:344；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:346；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQID NO:350；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:352；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:353和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:354；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:133和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:134。
169.如段落163至167中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
170.如段落163至168中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
171.如段落163至169中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
172.如段落163至170中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
173.如段落164至171中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8、AAV2.7m8或AAV9。
174.如段落164至172中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类视网膜细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
175.一种治疗有需要的人类受试者的炎性肠病(IBD)包括UC和CD的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的基本上全长或全长抗整合素β7亚基(抗ITGB7)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
176.一种治疗有需要的人类受试者的炎性肠病(IBD)包括UC和CD的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗整合素β7亚基(抗ITGB7)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
177.如段落175或176的方法，其中所述抗ITGB7 mAb是艾托珠单抗。
178.如段落175至177中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
179.如段落175至178中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:65和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:312的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:66的轻链。
180.如段落179的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:135和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:136。
181.如段落175至179中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
182.如段落175至181中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
183.如段落175至182中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
184.如段落175至183中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
185.如段落176至184中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
186.如段落176至185中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或人类肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
187.一种治疗有需要的人类受试者的全身性骨质疏松或异常骨质流失或无力(例如治疗骨巨细胞瘤、治疗由治疗诱发的骨质流失、减缓乳腺癌和前列腺癌患者的骨质流失(或增加其骨质)、预防骨转移所致的骨骼相关事件或减少骨骼再吸收和转换)的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的基本上全长或全长抗骨硬化蛋白(抗SOST)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
188.一种治疗有需要的人类受试者的骨质疏松或异常骨质流失或无力(例如治疗骨巨细胞瘤、治疗由治疗诱发的骨质流失、减缓乳腺癌和前列腺癌患者的骨质流失(或增加其骨质)、预防骨转移所致的骨骼相关事件或减少骨骼再吸收和转换)的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗骨硬化蛋白(抗SOST)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
189.如段落187或188的方法，其中所述抗SOST mAb是若莫珠单抗。
190.如段落187至189中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
191.如段落187至190中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:67和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:313的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链。
192.如段落191的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:137和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:138。
193.如段落187至191中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
194.如段落187至193中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
195.如段落187至194中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
196.如段落187至195中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
197.如段落188至196中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
198.如段落188至196中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或人类肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
199.一种治疗有需要的人类受试者的血管性水肿的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的基本上全长或全长抗激肽释放酶(抗pKal)mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肌肉细胞或人类肝脏细胞产生。
200.一种治疗有需要的人类受试者的血管性水肿，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码基本上全长或全长抗激肽释放酶(抗pKal)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肌肉细胞或人类肝脏细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
201.如段落199或200的方法，其中所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
202.如段落199至201中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
203.如段落199至202中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:69和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:314的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:70的轻链。
204.如段落203的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:139和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:140。
205.如段落199至203中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
206.如段落199至205中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
207.如段落199至206中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
208.如段落199至207中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
209.如段落200至208中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
210.如段落200至209中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或人类肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
制造方法
211.一种产生重组AAV的方法，所述方法包括：
(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞含有：
(i)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码治疗性抗体的转基因，所述转基因可操作地连接至将控制所述转基因在人类细胞中的表达的表达控制元件；
(ii)缺乏AAV ITR的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码AAV rep和AAV衣壳蛋白，所述AAV rep和AAV衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述AAV rep和所述AAV衣壳蛋白在培养物中的宿主细胞中的表达并且反式供应AAV rep和AAV衣壳蛋白的表达控制元件；
(iii)足以准许通过AAV衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组的腺病毒辅助功能；以及
(b)从所述细胞培养物回收包裹所述人工基因组的重组AAV。
212.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包含索拉珠单抗、仑卡奈单抗、GSK933776、AL-001、ABBV-8E12、UCB-0107、NI-105(BIIB076)、VX15/2503、普拉森单抗、NI-202(BIIB054)、MED-1341、NI-2041.10D12、NI-204.12G7、伊普汀单抗、福瑞满单抗、伽奈珠单抗或艾利扎单抗的重链和轻链可变结构域。
213.如段落212的方法，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳蛋白。
214.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包含赛伐珠单抗、LKA-651(NSV2)、LKA-651(NSV3)、GSK933776、索拉珠单抗、仑卡奈单抗、阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、卡妥昔单抗、ANX-007、拉那鲁单抗、阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗、赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗的重链和轻链可变结构域。
215.如段落214的方法，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV2.7m8、AAV8或AAV9衣壳蛋白。
216.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包含NI-301、PRX-004、帕姆单抗、艾托珠单抗、若莫珠单抗或拉那鲁单抗的重链和轻链可变结构域。
217.如段落216的方法，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳蛋白。
218.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb。
自身免疫、呼吸道和过敏性疾病
物质的组合物
219.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的特应性皮炎，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL13 mAb或抗IL31RA或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
220.如段落219的药物组合物，其中所述抗IL13或所述IL31RA是塔罗金单抗或奈莫利珠单抗。
221.如段落219或220的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
222.如段落219至221中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:368和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:396的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:369的轻链；或者所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:370和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:397的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:371的轻链。
223.如段落222的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQID NO:384和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:385；或者所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:386和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:387。
224.如段落219至221中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
225.如段落219至224中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
226.如段落225的药物组合物，其中所述信号序列选自表2或表3中的信号序列。
227.如段落219至226中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
228.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL5R mAb或抗IgE mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
229.如段落228的药物组合物，其中所述抗IL5R或抗IgE mAb是瑞利珠单抗或奥马珠单抗。
230.如段落228或229中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
231.如段落228至230中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:364和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:394的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:365的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:372和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:398的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链。
232.如段落231的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQID NO:380和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:381；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389。
233.如段落228至231中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
234.如段落228至233中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
235.如段落234的药物组合物，其中所述信号序列选自表2或表3中的信号序列。
236.如段落228至235中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
237.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL5、抗IL-5R、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
238.如段落237的药物组合物，其中所述抗IL-5、抗IL5R、抗IgE或抗TSLP mAb是贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗。
239.如段落237或238的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
240.如段落237至239中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:364和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:394的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:365的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:366和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:395的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:367的轻链；具有氨基酸序列SEQ ID NO:372的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:374和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:284的IgG2 Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:375的轻链。
241.如段落240的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQID NO:380和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:381；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:382和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:383；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:390和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:391。
242.如段落237至240中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
243.如段落237至242中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
244.如段落243的药物组合物，其中所述信号序列选自表2或表3中的信号序列。
245.如段落237至244中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
246.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的慢性特发性荨麻疹，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IgEmAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
247.如段落246的药物组合物，其中所述抗IgE mAb是奥马珠单抗。
248.如段落246或247中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
249.如段落246至248中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:372和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:398的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链。
250.如段落249的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389。
251.如段落246至249中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
252.如段落246至251中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
253.如段落252的药物组合物，其中所述信号序列选自表2或表3中的信号序列。
如段落246至253中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
治疗方法
254.一种治疗有需要的人类受试者的特应性皮炎的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的抗IL13或抗IL31RA mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
255.一种治疗有需要的人类受试者的特应性皮炎的方法，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗IL13或抗IL31RA mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
256.如段落254或255的方法，其中所述抗IL13或所述IL31RA mAb是塔罗金单抗或奈莫利珠单抗。
257.如段落254至256中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
258.如段落254至257中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:368和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:396的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:369的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:370和任选地氨基酸序列SEQID NO:397的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:371的轻链。
259.如段落258的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:384和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:385；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:386和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:387。
260.如段落254至258中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
261.如段落254至260中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
262.如段落254至261中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
263.如段落254至262中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
264.如段落254至263中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
265.如段落254至264中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
266.一种治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的抗IL5R或抗IgE mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
267.一种治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘的方法，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗IL5R或抗IgE mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
268.如段落266或267的方法，其中所述抗IL5R或抗IgE mAb是瑞利珠单抗或奥马珠单抗。
269.如段落266至268中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
270.如段落266至269中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:366和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:395的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:367的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:372和任选地氨基酸序列SEQID NO:398的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链。
271.如段落270的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:382和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:383；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389。
272.如段落266至270中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
273.如段落266至272中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
274.如段落266至273中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
275.如段落266至274中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
276.如段落266至275中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
277.如段落266至276中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
278.一种治疗有需要的人类受试者的哮喘或COPD的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的抗IL5、抗IL5R、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
279.一种治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘的方法，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗IL5R、抗IL5、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
280.如段落278或279的方法，其中所述抗IL5R、抗IL5、抗IgE或抗TSLP mAb是贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗。
281.如段落278至280中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
282.如段落278至281中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:364和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:394的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:365的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:366和任选地氨基酸序列SEQID NO:395的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:367的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:372和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:398的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:374和任选地氨基酸序列SEQ IDNO:284的IgG2 Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:375的轻链。
283.如段落282的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:380和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:381；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:383和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:383；编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:390和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:391。
284.如段落278至283中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
285.如段落278至284中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
286.如段落278至285中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
287.如段落278至286中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
288.如段落278至287中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
289.如段落278至288中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
290.一种治疗有需要的人类受试者的慢性特发性荨麻疹的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的抗IgE mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
291.一种治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘的方法，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗IgE mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
292.如段落290或291的方法，其中所述抗IgE mAb是奥马珠单抗。
293.如段落290至292中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
294.如段落290至293中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:372和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:398的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:373的轻链。
295.如段落294的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:388和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:389。
296.如段落290至295中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
297.如段落290至296中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
298.如段落290至297中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
299.如段落290至298中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
300.如段落290至299中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
301.如段落290至300中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
制造方法
302.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包含贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗的重链和轻链可变结构域。
303.如段落302的方法，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳蛋白。
重症肌无力
物质的组合物
304.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的重症肌无力，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗C5mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
305.如段落304的药物组合物，其中所述抗C5是拉瓦利单抗。
306.如段落304或305的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab)2或scFv。
307.如段落304至306中任一段落的药物组合物，其中所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链。
308.如段落307的药物组合物，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379。
309.如段落304至308中任一段落的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
310.如段落304至310中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
311.如段落310的药物组合物，其中所述信号序列选自表2或表3中的信号序列。
312.如段落304至311中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
治疗方法
313.一种治疗有需要的人类受试者的重症肌无力的方法，所述方法包括向所述人类受试者的循环递送治疗有效量的抗C5 mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是由人类肝脏细胞或人类肌肉细胞产生。
314.一种治疗有需要的人类受试者的重症肌无力的方法，所述方法包括：
向所述受试者的肝脏或肌肉施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗C5 mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
315.如段落313或314的方法，其中所述抗C5是拉瓦利单抗。
316.如段落313至315中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
317.如段落313至316中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:362和任选地氨基酸序列SEQ ID NO:393的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:363的轻链。
318.如段落260的方法，其中所述转基因包含编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:378和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:379。
319.如段落313至318中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体。
320.如段落313至319中的任一者的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
321.如段落313至320中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
322.如段落313至321中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
323.如段落313至322中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
324.如段落313至323中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
制造方法
325.如段落211的方法，其中所述转基因编码基本上全长或全长mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包含拉瓦利单抗的重链和轻链可变结构域。
326.如段落304的方法，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳蛋白。
用于抑制免疫反应的组合物和方法
327.一种药物组合物，所述药物组合物用于减少、抑制或改善有需要的人类受试者的有害免疫反应，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)或抗白细胞介素-6(IL6)的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者皮下、肌肉内、静脉内或经肺施用。
328.如段落327的药物组合物，其中所述抗IL6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗。
329.如段落327或328的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
330.如段落327至329中任一段落的药物组合物，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:334的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:336的轻链；或具有氨基酸序列SEQ IDNO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQID NO:338的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:339和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:283的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；或具有氨基酸序列SEQID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链。
331.如段落330的药物组合物，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQID NO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:344；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:346；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:350；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQID NO:352；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:353和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:354。
332.如段落327至331中任一段落的药物组合物，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
333.如段落327至331中任一段落的药物组合物，其中所述转基因编码所述抗原结合片段的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的分泌和翻译后修饰。
334.如段落333的药物组合物，其中所述信号序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)或来自表3或表4的信号序列。
335.如段落327至334中任一段落的药物组合物，其中所述AAV衣壳是AAV8。
336.一种减少、抑制或改善有需要的人类受试者的有害免疫反应的方法，所述方法包括向所述人类受试者的作为免疫反应目标的循环或组织递送治疗有效量的抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)mAb、抗白细胞介素-6(IL6)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段，所述mAb或其抗原结合片段是从转基因表达并由人类肌肉细胞或肝脏细胞产生。
337.一种减少、抑制或改善有需要的人类受试者的有害免疫反应的方法，所述方法包括：
向所述人类受试者的肌肉或肝脏施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)mAb、抗白细胞介素-6(IL6)mAb的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肌肉细胞或肝脏细胞中的表达的调控序列，所述施用使得形成释放所述mAb或其抗原结合片段的HuPTM形式的储集物。
338.如段落336或337的方法，其中所述抗IL6R是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗。
339.如段落336至338中任一段落的方法，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab')2或scFv。
340.如段落336至339中任一段落的方法，其中所述全长mAb或所述抗原结合片段包含：具有氨基酸序列SEQ ID NO:59和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:309的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:61和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:310的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:331和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:355的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:332的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:333和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:356的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:334的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:335和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:357的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ IDNO:336的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:337和任选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:358的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:338的轻链；或具有氨基酸序列SEQ IDNO:339和任选地具有IgG1氨基酸序列SEQ ID NO:283的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的轻链；或具有氨基酸序列SEQ ID NO:341和任选地具有氨基酸序列SEQID NO:359的Fc多肽的重链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:342的轻链。
341.如段落340的方法，其中所述转基因包含：编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:129和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:130；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:131和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:132；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:343和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:344；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:345和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:346；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:347和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:348；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:349和编码轻链的核苷酸序列SEQID NO:350；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:351和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:352；或编码重链的核苷酸序列SEQ ID NO:353和编码轻链的核苷酸序列SEQ ID NO:354。
342.如段落336至339中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段是高糖基化突变体，或者其中所述mAb的所述Fc多肽是被糖基化或非糖基化的。
343.如段落336至342中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有α2,6-唾液酸化聚糖。
344.如段落336至343中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段被糖基化，但不含可检测的NeuGc或α-Gal。
345.如段落336至344中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段含有酪氨酸硫酸化。
346.如段落336至345中任一段落的方法，其中所述重组表达载体是AAV8或AAV9。
347.如段落336至346中任一段落的方法，其中所述mAb或其抗原结合片段的所述HuPTM形式的产生是通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养物中的人类肝脏细胞或肌肉细胞并表达所述mAb或其抗原结合片段来确认的。
编码全长mAb的AAV组合物实施方案
348.一种组合物，所述组合物包含腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV具有：
a.病毒AAV衣壳，其任选地与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
b.人工基因组，其包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长mAb的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类细胞中的表达的调控序列。
c.其中所述转基因编码所述mAb的重链和轻链的N末端处的信号序列，所述信号序列导引所述mAb的分泌和翻译后修饰。
349.如段落348的组合物，其中所述mAb包含具有Fc多肽的重链和具有段落4、13、22、31、40、49、58、67、76、85、95、107、119、131、143、155、167、179、191、203、222、231、240、249、258、270、282、294、307和317中指定的序列组合中的任一者的轻链。
350.如段落348-349的组合物，其中所述mAb是全长拉那鲁单抗。
351.如段落350的组合物，其中所述转基因包含编码所述mAb的重链和轻链的核苷酸序列之间的弗林蛋白酶(Furin)/T2A接头。
352.如段落350至351的组合物，其中所述调控序列包括来自表1的调控序列。
353.如段落352的组合物，其中所述调控序列是LMTP6启动子、ApoE.hAAT调控序列、CAG启动子、CK8调控序列或TBG启动子。
354.如段落350至353的组合物，其中所述转基因包含核苷酸序列SEQ ID NO.141、286、287或435至444。
355.如段落350至354的组合物，其中所述病毒衣壳是AAV8病毒衣壳。
356.一种药物组合物，所述药物组合物用于将拉那鲁单抗递送至血流以治疗有需要的人类受试者的遗传性血管性水肿，所述组合物包含重组AAV，所述重组AAV包含编码拉那鲁单抗的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在肌肉细胞和/或肝脏细胞中的表达的调控序列，其中所述重组AAV是以一定剂量向所述人类受试者施用，所述剂量足以引起拉那鲁单抗从所述转基因的表达和拉那鲁单抗分泌至所述人类受试者的所述血流中，以便在所述受试者中产生至少5μg/ml至至少35μg/ml拉那鲁单抗的拉那鲁单抗血浆水平。
357.一种治疗有需要的人类受试者的遗传性血管性水肿的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的组合物，所述组合物包含重组AAV，所述重组AAV包含编码拉那鲁单抗的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在肌肉细胞和/或肝脏细胞中的表达的调控序列，所述量足以引起拉那鲁单抗从所述转基因的表达和拉那鲁单抗分泌至所述人类受试者的所述血流中，以便在所述受试者中产生至少5μg/ml至至少35μg/ml拉那鲁单抗的拉那鲁单抗血浆水平。
358.如段落356或357的方法或组合物，其中所述转基因包含核苷酸序列SEQ IDNO:141、286、287或435至444。
359.如段落356至358的方法或组合物，其中所述拉那鲁单抗血浆水平为20μg/ml至35μg/ml。
360.如段落356至359的方法或组合物，其中所述拉那鲁单抗血浆水平维持至少三个月。
361.如段落356至360的方法或组合物，其中分泌至所述血浆中的所述拉那鲁单抗抗体展现pKal活性的大于至少40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的降低，如通过动力学酶功能测定法所测量。
362.如段落361的方法或组合物，其中所述拉那鲁单抗抗体的所述活性是在所述施用之后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周测量。
363.一种测定样本中的人类抗pKal抗体活性的方法，所述方法包括：
a.将所述样本与活化人类pKal一起温育；
b.随后将已与所述活化人类pKal一起温育的所述样本与合成底物Pro-Phe-Arg-AMC一起温育；
c.测量AMC在三小时内相较于对照样本的释放。
额外实施方案
364.一种药物组合物，所述药物组合物用于将抗体或其抗原结合片段递送至有需要的人类受试者的血流，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)AAV病毒衣壳，其感染肝脏细胞和/或肌肉细胞；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长抗体或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至导引肌肉细胞和肝脏细胞中的表达的嵌合启动子；
其中所述AAV载体被配制以供肌肉内施用。
365.如段落364的药物组合物，其中所述嵌合启动子是LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ ID NO:326)。
366.如段落365的药物组合物，其中所述嵌合启动子是LMPT6(SEQ ID NO:320)。
367.如段落364至366中任一段落的药物组合物，其中所述AAV病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性。
368.如段落364至367中任一段落的药物组合物，其中所述抗体是赛伐珠单抗、LKA-651、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗、艾利扎单抗、NI-301、PRX-004、帕姆单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、英比利珠单抗、艾托珠单抗、若莫珠单抗、拉那鲁单抗、贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗。
369.如段落364至366中任一段落的药物组合物，其中所述转基因包含核苷酸序列SEQ ID NO:443。
4.附图说明
图1.rAAV载体基因组构建体的示意图，所述rAAV载体基因组构建体含有编码治疗性mAb的Fab区的重链和轻链、由表达元件控制、由AAV ITR侧接的表达盒。
图2A至图2C.用于如下治疗性抗淀粉样蛋白β肽抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：索拉珠单抗Fab(图2A)、GSK933776(图2B)和仑卡奈单抗(图2C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。重链铰链区以灰色突出显示。
图3.用于治疗性抗分选蛋白抗体AL-001的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列(图3)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。重链铰链区以灰色突出显示。
图4A至图4C.用于如下治疗性抗tau抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：ABBV-8E12(图4A)、UCB-0107(图4B)和NI-105(图4C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。重链铰链区以灰色突出显示。
图5.用于治疗性抗SEMA4D抗体VX15/2503的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列(图5)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图6A至图6C.用于如下治疗性抗α-突触核蛋白抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：普拉森单抗(图6A)、NI-202(图6B)和MEDI-1341(图6C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图7A和图7B.用于如下治疗性抗超氧化物歧化酶1(SOD1)抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：NI-205.10D12(图7A)；和NI-205.12G7(图7B)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图8A至图8C.用于如下针对CGRPR的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：伊普汀单抗(图8A)、福瑞满单抗(图8B)和伽奈珠单抗(图8C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图9A至图9C.用于如下针对生物因子的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：抗VEGF，赛伐珠单抗(图9A)；抗EpoR，LKA-651.NVS2(图9B)和LKA-651.NVS3(图9C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图10A至图10D.用于如下针对生物因子的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：抗ALK1，阿伐苏单抗(图10A)；抗C5，特度鲁单抗(图10B)和拉瓦利单抗(图10D)；和抗内皮糖蛋白，卡妥昔单抗(图10C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。重链铰链区以灰色突出显示。
图11.用于ANX-007(一种治疗性抗CC1Q抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。铰链区以灰色突出显示。
图12A至图12C.用于如下针对TNF-α的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：阿达木单抗(图12A)、英利昔单抗(图12B)和戈利木单抗(图12C)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。重链铰链区以灰色突出显示。
图13.用于艾利扎单抗(一种治疗性抗RGMa抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图14A和图14B.用于如下针对转甲状腺素蛋白(TTR)的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：NI-301(图14A)和PRX-004(图14B)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图15.用于帕姆单抗(一种治疗性抗CTGF抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图16A至图16I.用于如下针对生物因子的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：抗IL6R，赛他利单抗(图16A)、赛瑞单抗(图16B)、托珠单抗(图16H)；抗IL6，司妥昔单抗(图16C)、克拉扎珠单抗(图16D)、思鲁库单抗(图16E)、奥洛奇单抗(图16F)、吉瑞利单抗(图16G)；和抗CD19，英比利珠单抗(图16I)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图17.用于艾托珠单抗(一种治疗性抗ITGB7抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图18.用于若莫珠单抗(一种治疗性抗骨硬化蛋白抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图19.用于拉那鲁单抗(一种治疗性抗血浆激肽释放酶(pKal)抗体)的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图20A和图20B.本文公开的治疗性抗体的重链Fab部分(图20A)(按出现的次序分别为SEQ ID NO:1的残基1-220、SEQ ID NO:3的残基1-223、SEQ ID NO:5的残基1-237、SEQID NO:7的残基1-220、SEQ ID NO:9的残基1-223、SEQ ID NO:11的残基1-232、SEQ ID NO:13的残基1-228、SEQ ID NO:15的残基1-224、SEQ ID NO:17的残基1-232、SEQ ID NO:19的残基1-230、SEQ ID NO:21的残基1-234、SEQ ID NO:23的残基1-231、SEQ ID NO:25的残基1-219、SEQ ID NO:27的残基1-227、SEQ ID NO:29的残基1-224、SEQ ID NO:31的残基1-230、SEQ ID NO:33的残基1-225、SEQ ID NO:35的残基1-235、SEQ ID NO:37的残基1-223、SEQ ID NO:39的残基1-224、SEQ ID NO:41的残基1-226、SEQ ID NO:43的残基1-229、SEQID NO:45的残基1-229、SEQ ID NO:47的残基1-228、SEQ ID NO:49的残基1-237、SEQ IDNO:51的残基1-228、SEQ ID NO:53的残基1-228、SEQ ID NO:55的残基1-225、SEQ ID NO:57的残基1-224、SEQ ID NO:59的残基1-224、SEQ ID NO:61的残基1-224、SEQ ID NO:63的残基1-229、SEQ ID NO:65的残基1-225、SEQ ID NO:67的残基1-228、SEQ ID NO:69的残基1-230、SEQ ID NO:331的残基1-227、SEQ ID NO:333的残基1-228、SEQ ID NO:335的残基1-227、SEQ ID NO:337的残基1-224、SEQ ID NO:339的残基1-230、SEQ ID NO:341的残基1-228、SEQ ID NO:360的残基1-232、SEQ ID NO:362的残基1-227、SEQ ID NO:364的残基1-229、SEQ ID NO:366的残基1-221、SEQ ID NO:368的残基1-226、SEQ ID NO:370的残基1-226、SEQ ID NO:372的残基1-225和SEQ ID NO:374的残基1-227)和轻链Fab部分(图20B)(按出现的次序分别为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、332、334、336、338、340、342、361、363、365、367、369、371、373和375)的氨基酸序列的氨基酸序列比对。突出显示可被取代以产生Fab区的高糖基化变体的位置。在氨基酸残基位置上方标注应引起人类细胞发生Fab区的高糖基化的四个取代(一个在重链中并且三个在轻链中)。(对于对mAb或抗原结合片段进行工程化以在Fab结构域上含有额外糖基化位点，关于在全长抗体的Fab结构域上经高糖基化的抗体的衍生物的描述，参见例如Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112)。
图21.AAV衣壳1-9的Clustal多重序列比对。可通过从其他比对AAV衣壳的对应位置“募集”氨基酸残基来对AAV9和AAV8衣壳进行氨基酸取代(在底部行中以粗体显示)。以灰色显示的序列＝高变区。AAV衣壳的氨基酸序列是如下指定SEQ ID NO：AAV1是SEQ ID NO:274；AAV2是SEQ ID NO:275；AAV3-3是SEQ ID NO:276；AAV4-4是SEQ ID NO:277；AAV5是SEQID NO:278；AAV6是SEQ ID NO:279；AAV7是SEQ ID NO:280；AAV8是SEQ ID NO:143；AAV9是SEQ ID NO:144；AAVrh10是SEQ ID NO:145；hu31是SEQ ID NO:281；并且hu32是SEQ ID NO:282。
图22.可连接至全长mAb或抗原结合结构域的HuGlyFab区的聚糖。(从Bondt等人,2014,Mol&Cell Proteomics 13.1:3029-3039改编)。
图23.IgG1(SEQ ID NO:283)、IgG2(SEQ ID NO:284)和IgG4(SEQ ID NO:285)的恒定重链区(CH2和CH3)的Clustal多重序列比对。铰链区(从重链的残基219至残基230)以斜体字显示。氨基酸的编号呈EU格式。
图24A至图24D.A.显示AAV8和AAV9的基因组配置的示意图。表达盒利用CAG启动子(SEQ ID NO:411)驱动人类抗体的表达，所述人类抗体结合于例如血浆激肽释放酶(pKal)或TNFα并抑制pKal或TNFα。突变体IL2前导序列(mIL2，SEQ ID NO:146)靶向重链和轻链以进行分泌，并且弗林蛋白酶-F2A序列(SEQ ID NO:231)驱动聚合蛋白切割成重链和轻链组分。B.比较CAG.L01(SEQ ID NO:435；含有拉那鲁单抗序列L01(SEQ ID NO:141))和CAG.L02(SEQ ID NO:437；含有拉那鲁单抗序列L02(SEQ ID NO:286))前病毒质粒构造的转染滴定。顶部图展现转染不同质粒量(4μg至非转染)之后的报告转基因(eGFP)表达。左下图描绘细胞溶解产物中的拉那鲁单抗表达，而右下图检测分泌于细胞上清液中的质粒表达的拉那鲁单抗。C.比较CAG.L02和CAG.L03前病毒质粒构造的转染滴定。各图描绘分泌于细胞上清液中的从CAG.L02或CAG.L03构建体表达的拉那鲁单抗的不同曝光长度(30秒或60秒)。D.比较拉那鲁单抗Fab前病毒质粒构造的转染滴定。图描绘转染不同质粒量之后，拉那鲁单抗Fab的水平。L01构建体(CAG.L01：SEQ ID NO:435)由CB启动子驱动，而L02(CAG L02：SEQ IDNO:437)由CAG启动子(SEQ ID NO:411)驱动。
图25.经由静脉内(IV)或肌肉内(IM)途径向NGS小鼠施用所指示的AAV9和AAV8载体(n＝5只/组)。IV施用至尾静脉中，并且IM施用是双侧施用至腓肠肌中。包括用媒介物处理的小鼠作为对照。施用后七周，处死小鼠，并且通过ELISA测定血清人类抗体水平。
图26.显示AAV9施用后NGS小鼠中抗体表达(拉那鲁单抗血清水平)的时程(n＝5只/组)。IV或IM注射AAV9载体(2e11 gc)，并且通过ELISA在第7天(D7)、第21天(D21)、第35天(D35)和第49天(D49)测定血清抗体水平。
图27描绘在如下不同调控元件的控制下用表达单克隆抗体拉那鲁单抗(Mab1)的不同顺式质粒转导细胞之后，C2C12肌肉细胞中拉那鲁单抗的表达：CAG(SEQ ID NO:411)、LMTP6(SEQ ID NO:320)和ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)。为检测抗体蛋白质，在转导之后，用FITC缀合的抗Fc(IgG)抗体处理细胞。显示DAPI染色在所有所测试条件下确认细胞的汇合度和生存力。
图28A和图28B.用2.5×1012vg/kg编码拉那鲁单抗的通过不同肝脏特异性、肝脏串联和肝脏-肌肉调控元件调控的AAV8载体静脉内注射C/57BL6小鼠之后，拉那鲁单抗的血清表达水平(μg/ml)(参见表1)。CAG(SEQ ID NO:411)和TBG(SEQ ID NO:423)启动子用作对照。显示注射后1、3、5和7周抽取的血液的数据。LSPX1，肝脏特异性启动子1(SEQ ID NO:315)；LSXP2，肝脏特异性启动子2(SEQ ID NO:316)；LTP1，肝脏特异性串联启动子1(SEQ IDNO:317)；LMTP6，肝脏和肌肉双重特异性串联启动子6(SEQ ID NO:320)。通过ELISA从两周一次的血清收集物对蛋白质表达水平进行定量。N＝5只小鼠/载体。x轴上的数字表示载体施用后的周数。数据表示平均值+SEM。8B.肝脏中病毒基因组的定量。向C57BL/6小鼠静脉内施用同等剂量(2.5×1012vg/kg)的由不同肝脏特异性启动子驱动的AAV8载体。N＝5只小鼠/组。通过ddPCR分析在载体施用后49天收集的小鼠肝脏样本中的载体DNA。数据表示平均值+SEM。
图29A至图29F.用于如下针对生物因子的治疗性抗体的Fab区的转基因构建体的氨基酸序列：抗IL5，贝纳利珠单抗(A)；抗IL5R，瑞利珠单抗(B)；抗IL13，塔罗金单抗(C)；抗IL31R，奈莫利珠单抗(D)；抗IgE，奥马珠单抗(E)；和抗TSLP，特泽派单抗(F)。糖基化位点是粗体字。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(斜体字)如图例中所指示。互补决定区(CDR)加下划线。铰链区以灰色突出显示。
图30A和图30B.A.Wistar大鼠的施用途径和剂量选择。将编码载体化拉那鲁单抗的由CAG启动子驱动的AAV8载体以1×1013vg/kg(体重)肌肉内注射或以1×1013vg/kg和1×1014vg/kg静脉内注射至SD大鼠。通过ELISA从每三至七天收集的血清对蛋白质表达进行定量。N＝3只大鼠/载体。数据表示平均值+SEM。关于Welch t检验，*指示p<0.05，**指示p<0.01。B.将编码载体化拉那鲁单抗的由CAG(SEQ ID NO:411)或ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)启动子驱动的AAV8载体以5×1013vg/kg静脉内注射至Wistar和SD大鼠。通过ELISA从每周血清收集物对蛋白质表达进行定量。N＝3只大鼠/载体。数据表示平均值+SEM。P值：*，p<0.05；**，p<0.01。表格中呈现每个时间点每个组中的动物的血清抗体浓度(平均值和SEM)。
图31A至图31D.A.AAV8递送之后的血清抗激肽释放酶(pKal)(拉那鲁单抗)抗体浓度。动物接受5×1010vg/kg至GA肌肉中的双侧注射。每两周收集血清，并通过ELISA对载体化抗体浓度进行定量。B.通过微滴式数字PCR(ddPCR)对相关组织的载体基因组定量。C.来自肝脏的载体基因表达的比较。数据表示如通过ΔΔCT方法定量的相对倍数基因表达。D.使用微滴式数字PCR(ddPCR)的组织的AAV转基因表达的比较。将抗pKal抗体mRNA拷贝相对于跨组织的GAPDH mRNA拷贝进行归一化。数据表示为平均值±SEM。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)、接着是Tukey HSD事后检验来测定统计显著性。*P<0.05，**P<0.01。
图32：用AAV8处理的野生型小鼠的血清中的抗体浓度。使用不同于HEK系统的BV/Sf9产生系统产生拉那鲁单抗载体。用剂量为2.5×1012vg/kg的载体静脉内注射C57BL/6小鼠。
图33A至图33F.A和B显示所指示pKal浓度的pKal滴定曲线和信噪比。C.使用两个pKal浓度(6.25nM和12.5nM)测量抗体-剂量反应中拉那鲁单抗(相较于非特异性人类IgG对照抗体)的抑制范围。向C57BL/6小鼠(n＝5)静脉内施用每只小鼠5×1010个载体基因组(vg)(2.5×1012vg/kg)的ApoE.hAAT.L02.AAV8。D和E显示两个小鼠组的经汇集酶活性和pKal活性的降低百分比。使用酶渐进式活性曲线的斜率和AMC标准计算特定pKal酶活性，其中相较于第-7天，在第49天记录显著较小活性。F.将酶活性的降低百分比计算为第49天的活性除以第-7天的活性。含载体化抗pKal抗体的IgG显著降低pKal活性。所有结果都是2至5只小鼠/组的汇集。为确定差异显著性，使用Student t检验(配对，双尾)，其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图34A至图34L.小鼠脚爪体积和用测试物品处理的角叉菜胶诱发的脚爪水肿小鼠的脚爪肿胀的定量。条形图显示C57BL/6小鼠的在角叉菜胶注射之后2小时(A)、4小时(C)、6小时(E)、8小时(G)、24小时(I)和48小时(K)测量的脚爪体积(A、C、E、G、I和K)。通过计算在每个时间点和基线测量的脚爪体积的差异来评估脚爪肿胀差异(B、D、F、H、J和L)。N＝10只小鼠/组。通过单因素方差分析与用于多重比较的Dunnett事后检验来进行数据分析。数据表示平均值+S.DEM。P值：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图35A和图35B：用测试物品处理的角叉菜胶诱发的脚爪水肿小鼠中所测量的小鼠脚爪体积的时程。在0.7％(A)或1％(B)角叉菜胶注射之前(基线)和之后不同时间点测量小鼠脚爪体积。N＝10只小鼠/组。数据表示平均值±SEM。
图36A和图36B：载体化阿达木单抗IgG和Fab顺式质粒表达的表征。(A)描绘来源于用相应顺式质粒转染的293T细胞的细胞上清液的阿达木单抗IgG和Fab的表达的蛋白质印迹法(Western blot)。(B)来源于用顺式质粒转染的细胞的人类TNFα结合ELISA。将pAAV.CAG.拉那鲁单抗.IgG用作非特异性抗体(mAb)对照。数据表示为平均值±SEM。
图37A至图37C.AAV8表达的阿达木单抗IgG表达和活性的表征。(A)在293T.AAVR细胞的转导后，以两个感染倍率(MOI)对AAV8表达的阿达木单抗进行的定量。(B)描绘两个不同MOI下的阿达木单抗IgG重链和轻链组分的表达的蛋白质印迹法。(C)来源于细胞培养物上清液的阿达木单抗IgG的人类TNFα结合ELISA。数据表示为平均值±SEM。
图38.编码载体化阿达木单抗Fab的自互补AAV顺式质粒的比较。阴性对照包括来自非转染细胞的细胞上清液。数据表示为平均值±SEM。
图39.载体化阿达木单抗IgG和Fab跨模型物种(小鼠、大鼠和人类)的TNFα结合。阴性对照包括来自非转染细胞的上清液。将载体化拉那鲁单抗(pAAV.CAG.拉那鲁单抗.IgG)用作非特异性抗体对照。数据表示为平均值±SEM。
5.具体实施方式
描述了组合物和方法，其用于将完全人类翻译后修饰(HuPTM)的治疗性单克隆抗体(mAb)或治疗性mAb的HuPTM抗原结合片段(例如治疗性mAb的完全人类糖基化Fab(HuGlyFab))递送至被诊断患有需要用治疗性mAb治疗的疾病或疾患的患者(人类受试者)。递送可有利地经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有需要用治疗性mAb治疗的疾患的患者(人类受试者)施用编码治疗性mAb或其抗原结合片段(或任一者的高糖基化衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以在患者的组织或器官中形成持久储集物，从而向目标组织持续供应HuPTM mAb或治疗性mAb的抗原结合片段，例如人类糖基化转基因产物，所述mAb或其抗原结合片段在所述目标组织处发挥其治疗作用。
由转基因编码的HuPTM mAb或HuPTM抗原结合片段可包括(但不限于)全长治疗性抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段结合于：
·神经系统目标，包括淀粉样蛋白β(Aβ或Abeta)肽、分选蛋白、Tau蛋白、SEMA4D、α-突触核蛋白和CGRP受体，
·眼部目标，包括VEGF、EpoR、ALK1、内皮糖蛋白、补体组分5和补体组分1Q，
·排斥性导向分子A
·转甲状腺素蛋白
·结缔组织生长因子
·视神经脊髓炎(NMO)/非感染性葡萄膜炎目标和免疫反应目标，包括白细胞介素6受体、白细胞介素6和CD19
·整合素β7
·骨硬化蛋白
·TNF-α，和
·血浆蛋白目标，例如人类补体蛋白，包括血浆激肽释放酶，
·自身免疫、呼吸道和过敏性疾病目标，例如白细胞介素和白细胞介素受体，包括IL5、IL5R、IL13和IL31RA、免疫球蛋白E和胸腺基质淋巴细胞生成素
或经工程化以在Fab结构域上含有额外糖基化位点的此类mAb或抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其关于在全长抗体的Fab结构域上经高糖基化的抗体的衍生物的描述通过引用整体并入本文)。前述抗原结合片段的重链和轻链的氨基酸序列提供于下文表5中，并且这些抗原结合片段的编码重链和轻链的核苷酸序列(包括密码子优化型式)提供于表6中。
用于递送转基因的重组载体包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)。rAAV由于以下多种原因而成为尤其具有吸引力的载体：它们可转导非复制型细胞，并且因此可用于将转基因递送至以低水平进行细胞分裂的组织，例如CNS；它们可经修饰以优先靶向所选特定器官；并且存在可选的数百个衣壳血清型以获得所需组织特异性，和/或以避免预先存在的患者抗体中和一些AAV。此类rAAV包括(但不限于)基于AAV的载体，包含来自AAV1、AAV2、AAV2.m78、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10或AAVrh20中的一者或多者的衣壳组分。在某些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10或AAVrh20血清型中的一者或多者的衣壳。
然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体；痘疮病毒载体，或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。转基因的表达可由组成型或组织特异性表达控制元件控制。
基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链都得以表达。更具体来说，重链和轻链应以大约相等的量表达，换句话说，重链和轻链以重链与轻链约1:1的比率表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。在某些实施方案中，编码序列编码Fab或F(ab')2或scFv。
在某些实施方案中，本文公开的核酸(例如多核苷酸)和核酸序列可例如经由本领域技术人员已知的任何密码子优化技术而进行密码子优化(参见例如Quax等人,2015,MolCell 59:149-161的综述)并且还可被优化以减少CpG二聚体。可密码子优化的治疗性抗体的重链和轻链可变结构域的核苷酸序列公开于表6中。每个重链和轻链需要前导序列以确保适当翻译后加工和分泌(除非表达为scFv，其中仅N末端链需要前导序列)。本文公开了适用于治疗性抗体的重链和轻链在人类细胞中的表达的前导序列。示例性重组表达构建体显示于图1和图24A中。
产生HuPTM mAb或HuPTM Fab(包括HuPTM scFv)将产生用于经由基因疗法实现的疾病治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码全长HuPTM mAb或治疗性mAb的HuPTM Fab或其他抗原结合片段(例如scFv)的病毒载体或其他DNA表达构建体施用至被诊断患有需要用所述mAb治疗的疾病的患者(人类受试者)，以在受试者中形成持久储集物，从而持续供应通过受试者的转导细胞产生的人类糖基化、硫酸化转基因产物。用于HuPTMmAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv的cDNA构建体应包括确保通过经转导人类细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。
适合于向人类受试者施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂的制剂缓冲液中的悬浮液。此类制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生全长HuPTM mAb或HuPTM Fab或其其他抗原结合片段，并且可向患者施用糖蛋白。仅举几例，可用于此类重组糖蛋白产生的人类细胞系包括(但不限于)人胚肾293细胞(HEK293)、纤维肉瘤HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7和视网膜细胞系PER.C6或RPE(例如参见Dumont等人,2015,Crit.Rev.Biotechnol.36(6):1110-1122，其关于可用于重组产生HuPTMmAb、HuPTM Fab或HuPTM scFv产物，例如HuPTM Fab糖蛋白的人类细胞系的综述通过引用整体并入)。为确保完全糖基化，尤其唾液酸化和酪氨酸硫酸化，用于产生的细胞系可通过对宿主细胞进行工程化以共表达α-2,6-唾液酸转移酶(或α-2,3-唾液酸转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶两者)和/或负责人类细胞中的酪氨酸-O-硫酸化的TPST-1和TPST-2酶来增强。
在基因疗法或蛋白质疗法中产生的每个分子不必完全被糖基化和硫酸化。实际上，所产生的糖蛋白群体应具有足够的糖基化(包括2,6-唾液酸化)和硫酸化以证明功效。本发明的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制疾病的进展。
本发明的方法涵盖涉及伴随施用其他可用治疗而将全长HuPTM mAb或HuPTM Fab或其抗原结合片段递送至患者的组合疗法。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。此类额外治疗可包括(但不限于)使用治疗性mAb的辅助疗法。
还提供了制造病毒载体，特别是基于AAV的病毒载体的方法。在特定实施方案中，提供了产生重组AAV的方法，所述方法包括培养含有人工基因组的宿主细胞，所述人工基因组包含：由AAV ITR侧接的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码治疗性抗体的转基因，所述转基因可操作地连接至将控制转基因在人类细胞中的表达的表达控制元件；缺乏AAV ITR的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码AAV rep和衣壳蛋白，所述AAV rep和衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述AAV rep和衣壳蛋白在培养物中的所述宿主细胞中的表达并且反式供应rep和cap蛋白的表达控制元件；足以准许通过AAV衣壳蛋白复制和包装人工基因组的腺病毒辅助功能；以及从所述细胞培养物回收包裹所述人工基因组的重组AAV。
5.1构建体
本文提供了病毒载体或其他DNA表达构建体，其编码HuPTM mAb或其抗原结合片段，特别是HuGlyFab、或HuPTM mAb抗原结合片段的高糖基化衍生物。本文所提供的病毒载体和其他DNA表达构建体包括用于将转基因递送至目标细胞的任何适合方法。转基因的递送方式包括病毒载体、脂质体、其他含脂质复合物、其他大分子复合物、合成的经修饰mRNA、未修饰的mRNA、小分子、非生物活性分子(例如金粒子)、聚合分子(例如树枝状聚合物)、裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒或游离基因体。在一些实施方案中，载体是靶向载体，例如靶向视网膜色素上皮细胞、CNS细胞、肌肉细胞或肝脏细胞的载体。
在一些方面，本公开提供了一种供使用的核酸，其中所述核酸包含编码HuPTM mAb或HuGlyFab或其其他抗原结合片段的核苷酸序列，如本文所描述的转基因，其可操作地连接至经选择用于针对转基因表达的组织中的表达的启动子，例如(但不限于)CB7/CAG启动子(SEQ ID NO:411，图24A)和相关上游调控序列(参见图1)；巨细胞病毒(CMV)启动子；劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子；GFAP启动子(胶质纤维酸性蛋白)；MBP启动子(髓磷脂碱性蛋白)；MMT启动子；EF-1α启动子(SEQ ID NO:415)；mU1a(SEQ ID NO:414)；UB6启动子；鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子；肝脏特异性启动子，例如TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子(SEQ ID NO:423)、APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、ApoE.hAAT(SEQID NO:412)或mIR122启动子；或肌肉特异性启动子，例如人类肌间线蛋白(desmin)启动子、CK8启动子(SEQ ID NO:413)或Pitx3启动子；诱导型启动子，例如低氧诱导型启动子或雷帕霉素诱导型启动子。
在本文中的一些方面，转基因表达是由工程化核酸调控元件控制，所述调控元件具有超过一个调控元件(启动子或增强子)，包括以串联方式排列的调控元件(两个或三个拷贝)，其促进肝脏特异性表达，或肝脏特异性表达和肌肉特异性表达两者，或肝脏特异性表达和骨特异性表达两者。这些调控元件包括用于以下的调控元件：肝脏特异性表达，LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQ ID NO:316)、LTP1(SEQ ID NO:317)、LTP2(SEQ ID NO:318)或LTP3(SEQ ID NO:319)；肝脏和肌肉表达，LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ IDNO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQ ID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ ID NO:326)；或肝脏和骨表达，LBTP1(SEQ ID NO:327)或LBTP2(SEQ ID NO:328)，其序列提供于表1中。
在某些实施方案中，本文提供了包含一种或多种核酸(例如多核苷酸)的重组载体。核酸可包含DNA、RNA、或DNA和RNA的组合。在某些实施方案中，DNA包含选自由以下组成的组的序列中的一者或多者：启动子序列、目标基因(转基因，例如编码HuPTMmAb或HuGlyFab或其他抗原结合片段的重链和轻链的核苷酸序列)的序列、非翻译区和终止序列。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含可操作地连接至目标基因的启动子。
在某些实施方案中，本文所公开的核酸(例如多核苷酸)和核酸序列可例如经由本领域技术人员已知的任何密码子优化技术而进行密码子优化(参见例如Quax等人,2015,Mol Cell 59:149-161的综述)。本文针对HuGlyFab的重链和轻链在表6中提供用于人类细胞中的表达的核苷酸序列。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)一个或多个控制元件，b)鸡β-肌动蛋白内含子和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码mAb或Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/(F/T)2A接头(SEQ ID NO:231或429)分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。一个示例性构建体显示于图1中。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)一个或多个控制元件，b)鸡β-肌动蛋白内含子和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)使用编码重链的Fab部分(包括铰链区序列)加用于适当同种型的重链的Fc多肽以及轻链的序列来编码包含重链和轻链序列的全长抗体的核酸序列，其中重链和轻链核苷酸序列通过自切割弗林蛋白酶(F)/(F/T)2A接头(SEQ ID NO:231或429)分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。一个示例性构建体显示于图24A中。
5.1.1mRNA载体
在某些实施方案中，作为DNA载体的替代方案，本文所提供的载体是编码目标基因(例如转基因，例如HuPTMmAb或HuGlyFab或其其他抗原结合片段)的经修饰mRNA。用于将转基因递送至视网膜色素上皮细胞的经修饰和未经修饰mRNA的合成教导于例如Hansson等人,J.Biol.Chem.,2015,290(9):5661-5672中，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，本文提供了一种编码HuPTMmAb、HuPTM Fab或HuPTM scFv的经修饰mRNA。
5.1.2病毒载体
病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒(AAV，例如AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8)、慢病毒、辅助依赖型腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、日本血球凝集素病毒(HVJ)、甲病毒、痘疮病毒和逆转录病毒载体。逆转录病毒载体包括基于小鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体。甲病毒载体包括塞姆利基森林病毒(semliki forest virus；SFV)和辛得比斯病毒(sindbis virus；SIN)。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是重组病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体被改变以使其在人类中是复制缺陷型。在某些实施方案中，病毒载体是杂交载体，例如置于“无助”腺病毒载体中的AAV载体。在某些实施方案中，本文提供了病毒载体，其包含来自第一病毒的病毒衣壳和来自第二病毒的病毒包膜蛋白。在特定实施方案中，第二病毒是水泡性口炎病毒(VSV)。在更特定的实施方案中，包膜蛋白是VSV-G蛋白。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于HIV的病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的基于HIV的载体包含至少两个多核苷酸，其中gag和pol基因来自HIV基因组，并且env基因来自另一种病毒。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于单纯疱疹病毒的病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的基于单纯疱疹病毒的载体经修饰以使其不包含一种或多种即刻早期(IE)基因，从而使其无细胞毒性。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于MLV的病毒载体。在某些实施方案中，代替病毒基因，本文所提供的基于MLV的载体包含多达8kb的异源DNA。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于慢病毒的病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的慢病毒载体来源于人类慢病毒。在某些实施方案中，本文所提供的慢病毒载体来源于非人类慢病毒。在某些实施方案中，本文所提供的慢病毒载体包装于慢病毒衣壳中。在某些实施方案中，本文所提供的慢病毒载体包含以下元件中的一者或多者：长末端重复序列、引物结合位点、聚嘌呤区、att位点和衣壳化位点。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于甲病毒的病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的甲病毒载体是重组的复制缺陷型甲病毒。在某些实施方案中，本文所提供的甲病毒载体中的甲病毒复制子通过在其病毒粒子表面上呈现功能性异源配体而靶向特定细胞类型。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体是基于AAV的病毒载体。在某些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体不编码AAV rep基因(复制所需)和/或AAV cap基因(合成衣壳蛋白所需)(rep和cap蛋白可由包装细胞反式提供)。已鉴定多种AAV血清型。在某些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自一种或多种AAV血清型的组分。在某些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自以下中的一者或多者的衣壳组分：AAV1(SEQ ID NO:274)、AAV2(SEQ ID NO:275)、AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)、AAV3(SEQ ID NO:276)、AAV4(SEQ ID NO:277)、AAV5、AAV6(SEQ ID NO:279)、AAV7(SEQ ID NO:280)、AAV8(SEQ ID NO:143)、AAV9(SEQ ID NO:144)、AAV10、AAV11或AAVrh10(SEQ ID NO:145)。在某些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVrh10血清型中的一者或多者的衣壳。提供了病毒载体，其中衣壳蛋白是AAV8衣壳蛋白(SEQ IDNO:143)、AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳蛋白(SEQ ID NO:145)的变体，并且所述衣壳蛋白例如与AAV8衣壳蛋白(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳蛋白(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性，同时保留原生衣壳的生物功能。在某些实施方案中，经编码AAV衣壳具有SEQID NO:143、144或145的序列，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代并且保留AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳的生物功能。图21基于标记有SUBS的行中的比较提供了不同AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列与可在比对序列中特定位置处被取代的潜在氨基酸的比较性比对。因此，在特定实施方案中，AAV载体包含AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳变体，其具有在原生AAV衣壳序列中的所述位置处不存在的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，如在图21的SUBS行中所鉴定。AAV8、AAV9和AAVrh10衣壳的氨基酸序列提供于图21中。
在一些实施方案中，基于AAV的载体包含来自一个或多个AAV血清型的组分。在一些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自以下中的一者或多者的衣壳组分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其两者或更多者的组合。在一些实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自以下中的一者或多者的组分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其两种或更多种血清型的组合。在一些实施方案中，rAAV粒子包含与例如选自以下的AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具至少80％或更高的同一性(例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即至多100％同一性)的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16，或其衍生物、修饰或假型。
在特定实施方案中，用于本文中的组合物和方法中的重组AAV是Anc80或Anc80L65(参见例如Zinn等人,2015,Cell Rep.12(6):1056-1068，其通过引用整体并入)。在特定实施方案中，用于本文中的组合物和方法中的重组AAV是AAV.7m8(包括其变体)(参见例如US9,193,956、US 9,458,517、US 9,587,282、US 2016/0376323和WO 2018/075798，其中的每一者通过引用整体并入本文)。在特定实施方案中，用于本文中的组合物和方法中的AAV是US 9,585,971中所公开的任何AAV，例如AAV-PHP.B。在特定实施方案中，用于本文中的组合物和方法中的AAV是AAV2/Rec2或AAV2/Rec3载体，其具有来源于AAV8和血清型cy5、rh20或rh39的杂交衣壳序列(参见例如Issa等人,2013,PLoS One 8(4):e60361，其关于这些载体的内容通过引用并入本文)。在特定实施方案中，用于本文中的组合物和方法中的AAV是以下(其中的每一者通过引用整体并入本文)中的任一者中所公开的AAV：US 7,282,199；US7,906,111；US 8,524,446；US 8,999,678；US 8,628,966；US 8,927,514；US 8,734,809；US9,284,357；US 9,409,953；US 9,169,299；US 9,193,956；US 9,458,517；US 9,587,282；US 2015/0374803；US 2015/0126588；US 2017/0067908；US 2013/0224836；US 2016/0215024；US 2017/0051257；PCT/US2015/034799；和PCT/EP2015/053335。在一些实施方案中，rAAV粒子具有与以下专利和专利申请(其中的每一者通过引用整体并入本文)中的任一者中所公开的AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具至少80％或更高同一性(例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即至多100％同一性)的衣壳蛋白：美国专利第7,282,199号、第7,906,111号、第8,524,446号、第8,999,678号、第8,628,966号、第8,927,514号、第8,734,809号、第US 9,284,357号、第9,409,953号、第9,169,299号、第9,193,956号、第9,458,517号和第9,587,282号；美国专利申请公开第2015/0374803号、第2015/0126588号、第2017/0067908号、第2013/0224836号、第2016/0215024号、第2017/0051257号；和国际专利申请第PCT/US2015/034799号、第PCT/EP2015/053335号。
在一些实施方案中，rAAV粒子包含美国专利第9,840,719号和WO 2015/013313中所公开的任何AAV衣壳，例如AAV.Rh74和RHM4-1，其中的每一者通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV粒子包含WO 2014/172669中所公开的任何AAV衣壳，例如AAV rh.74，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV粒子包含如Georgiadis等人,2016,Gene Therapy 23:857-862和Georgiadis等人,2018,Gene Therapy 25:450中所描述的AAV2/5的衣壳，所述文献中的每一者通过引用整体并入。在一些实施方案中，rAAV粒子包含WO 2017/070491中所公开的任何AAV衣壳，例如AAV2tYF，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV粒子包含如Puzzo等人,2017,Sci.Transl.Med.29(9):418中所描述的AAVLK03或AAV3B的衣壳，所述文献通过引用整体并入。在一些实施方案中，rAAV粒子包含美国专利第8,628,966号、US 8,927,514、US 9,923,120和WO 2016/049230中所公开的任何AAV衣壳，例如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，其中的每一者通过引用整体并入。
在一些实施方案中，rAAV粒子具有以下中所公开的衣壳蛋白：国际申请公开第WO2003/052051号(参见例如'051公开的SEQ ID NO:2)、第WO 2005/033321号(参见例如'321公开的SEQ ID NO:123和88)、第WO 03/042397号(参见例如'397公开的SEQ ID NO:2、81、85和97)、第WO 2006/068888号(参见例如'888公开的SEQ ID NO:1和3-6)、第WO 2006/110689号(参见例如'689公开的SEQ ID NO:5-38)、第WO2009/104964号(参见例如'964公开的SEQID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、第WO 2010/127097号(参见例如'097公开的SEQ ID NO:5-38)和第WO 2015/191508号(参见例如'508公开的SEQ ID NO:80-294)；以及美国申请公开第20150023924号(参见例如'924公开的SEQ ID NO:1、5-10)，其中的每一者的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV粒子具有与以下中所公开的AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具至少80％或更高同一性(例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即至多100％同一性)的衣壳蛋白：国际申请公开第WO 2003/052051号(参见例如'051公开的SEQ ID NO:2)、第WO 2005/033321号(参见例如'321公开的SEQ ID NO:123和88)、第WO 03/042397号(参见例如'397公开的SEQ ID NO:2、81、85和97)、第WO 2006/068888号(参见例如'888公开的SEQ ID NO:1和3-6)、第WO 2006/110689号(参见例如'689公开的SEQ ID NO:5-38)、第WO2009/104964号(参见例如964公开的SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、第WO 2010/127097号(参见例如'097公开的SEQ ID NO:5-38)和第WO 2015/191508号(参见例如'508公开的SEQ ID NO:80-294)；以及美国申请公开第20150023924号(参见例如'924公开的SEQ ID NO:1、5-10)。
在额外的实施方案中，rAAV粒子包含假型AAV衣壳。在一些实施方案中，所述假型AAV衣壳是rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣壳。用于产生和使用假型rAAV粒子的方法是本领域中已知的(参见例如Duan等人,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等人,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等人,Methods 28:158-167(2002)；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001))。
基于AAV8、基于AAV9和基于AAVrh10的病毒载体用于本文所描述方法中的某些中。基于AAV的病毒载体的核苷酸序列和制造重组AAV和AAV衣壳的方法教导于例如美国专利第7,282,199B2号、美国专利第7,790,449B2号、美国专利第8,318,480B2号、美国专利第8,962,332B2号和国际专利申请第PCT/EP2014/076466号中，其中的每一者通过引用整体并入本文。在一个方面，本文提供了编码转基因(例如HuPTM Fab)的基于AAV(例如AAV8、AAV9或AAVrh10)的病毒载体。包括AAV8、AAV9和AAVrh10的AAV衣壳的氨基酸序列提供于图21中。
在某些实施方案中，上文可使用单链AAV(ssAAV)。在某些实施方案中，可使用自互补载体，例如scAAV(参见例如Wu,2007,Human Gene Therapy,18(2):171-82；McCarty等人,2001,Gene Therapy,第8卷,第16期,第1248-1254页；以及美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号，其中的每一者通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，用于本文中所描述的方法中的病毒载体是基于腺病毒的病毒载体。重组腺病毒载体可用于在编码HuPTMmAb或HuGlyFab或抗原结合片段的转基因中转移。重组腺病毒可为第一代载体，其具有E1缺失、具有或不具有E3缺失和具有插入任一缺失区中的表达盒。重组腺病毒可为第二代载体，其含有E2和E4区的全部或部分缺失。辅助依赖型腺病毒仅保留腺病毒反向末端重复序列和包装信号(phi)。转基因插入包装信号与3'ITR之间，具有或不具有用以使基因组保持接近大约36kb的野生型大小的填充序列。用于产生腺病毒载体的示例性方案可见于Alba等人,2005,“Gutless adenovirus:last generationadenovirus for gene therapy,”Gene Therapy 12:S18-S27中，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，用于本文中所描述的方法中的病毒载体是基于慢病毒的病毒载体。重组慢病毒载体可用于在编码HuPTM mAb抗原结合片段的转基因中转移。使用四种质粒来制造构建体：含有Gag/pol序列的质粒、含有Rev序列的质粒、含有包膜蛋白的质粒(例如VSV-G)和具有包装元件和抗VEGF抗原结合片段基因的顺式质粒。
为了产生慢病毒载体，将四种质粒共转染至细胞(例如基于HEK293的细胞)中，其中尤其聚乙烯亚胺或磷酸钙可用作转染剂。然后在上清液中收获慢病毒(慢病毒需要从细胞中萌芽以具有活性，因此不需要/不应该进行细胞收获)。过滤上清液(0.45μm)并且然后添加氯化镁和苯佐酶(benzonase)。进一步的下游过程可有很大不同，其中使用TFF和柱色谱法是最具GMP相容性的方法。其他方法使用具有/不具有柱色谱法的超速离心。用于产生慢病毒载体的示例性方案可见于Lesch等人,2011,“Production and purification oflentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviralvectors,”Gene Therapy 18:531-538；和Ausubel等人,2012,“Production of CGMP-GradeLentiviral Vectors,”Bioprocess Int.10(2):32-43中，其均通过引用整体并入本文。
在一个特定实施方案中，用于本文所描述的方法中的载体是编码HuPTM mAb抗原结合片段(例如HuGlyFab)的载体，使得在将载体引入相关细胞中之后，HuPTM mAb抗原结合片段或HuGlyFab的糖基化和/或酪氨酸硫酸化变体由所述细胞表达。
5.1.3基因表达的启动子和修饰子
在某些实施方案中，本文所提供的载体包含调节基因递送或基因表达的组分(例如“表达控制元件”)。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含调节基因表达的组分。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含影响对细胞的结合或靶向的组分。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含影响摄取后多核苷酸(例如转基因)在细胞内的定位的组分。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含可用作例如用以检测或选择已摄取多核苷酸的细胞的可检测或可选择标志物的组分。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个控制转基因的表达的启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。在某些实施方案中，启动子是CB7(也称为CAG启动子)(参见Dinculescu等人,2005,Hum Gene Ther 16:649-663，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，CAG或CB7启动子(SEQ ID NO:411)包括增强由载体驱动的转基因的表达的其他表达控制元件。在某些实施方案中，其他表达控制元件包括鸡β-肌动蛋白内含子和/或兔β-珠蛋白polyA信号。在某些实施方案中，启动子包含TATA盒。在某些实施方案中，启动子包含一个或多个元件。在某些实施方案中，一个或多个启动子元件可相对于彼此倒置或移动。在某些实施方案中，启动子的元件经定位以协同地起作用。在某些实施方案中，启动子的元件经定位以独立地起作用。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个选自由以下组成的组的启动子：人类CMV即刻早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒(RS)长末端重复序列和大鼠胰岛素启动子。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含一个或多个选自由以下组成的组的长末端重复序列(LTR)启动子：AAV、MLV、MMTV、SV40、RSV、HIV-1和HIV-2LTR。在某些实施方案中，本文所提供的载体包含一个或多个组织特异性启动子(例如视网膜色素上皮细胞特异性启动子、CNS特异性启动子、肝脏特异性启动子或肌肉特异性启动子)。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含RPE65启动子或视蛋白启动子(视网膜细胞/CNS特异性启动子)。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含肝脏细胞特异性启动子，例如TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子(SEQID NO:423)、APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、ApoE.hAAT启动子(SEQ ID NO:412)或MIR122启动子。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含肌肉特异性启动子，例如人类肌间线蛋白启动子(Jonuschies等人,2014,Curr.Gene Ther.14:276-288)、CK8启动子(SEQ ID NO:413；Himeda等人,2011Muscle Gene Therapy:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Dongsheng Duan(编),709:3-19；SEQ ID NO:413)或Pitx3启动子(Coulon等人,2007,JBC 282:33192)。在其他实施方案中，病毒载体包含VMD2启动子。在某些实施方案中，本文中的病毒载体包含合成和串联启动子，例如下表1中所列的启动子。
在某些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在某些实施方案中，启动子是低氧诱导型启动子。在某些实施方案中，启动子包含低氧诱导因子(HIF)结合位点。在某些实施方案中，启动子包含HIF-1α结合位点。在某些实施方案中，启动子包含HIF-2α结合位点。在某些实施方案中，HIF结合位点包含RCGTG基序。关于HIF结合位点的位置和序列的细节，参见例如
等人,Blood,2011,117(23):e207-e217，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，启动子包含除HIF转录因子以外的低氧诱导型转录因子的结合位点。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个在低氧时优先翻译的IRES位点。对于有关低氧诱导型基因表达和其中所涉及的因素的教导内容，参见例如Kenneth和Rocha,BiochemJ.,2008,414:19-29，其通过引用整体并入本文。在特定实施方案中，低氧诱导型启动子是人类N-WASP启动子，参见例如Salvi,2017,Biochemistry and Biophysics Reports 9:13-21(关于N-WASP启动子的教导内容通过引用并入)或者是人类Epo的低氧诱导型启动子，参见例如Tsuchiya等人,1993,J.Biochem.113:395-400(关于Epo低氧诱导型启动子的公开内容通过引用并入)。在其他实施方案中，启动子是药物诱导型启动子，例如由雷帕霉素或其类似物的施用诱导的启动子。参见例如以下PCT公开中的雷帕霉素诱导型启动子的公开内容：WO94/18317、WO 96/20951、WO 96/41865、WO 99/10508、WO 99/10510、WO 99/36553、和WO 99/41258，以及US 7,067,526，其关于药物诱导型启动子的公开内容通过引用整体并入本文。
本文提供了含有某些广泛启动子和组织特异性启动子的构建体。此类启动子包括合成和串联启动子。启动子的实例和核苷酸序列提供于下表1中。
表1.启动子和其他调控元件序列
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个除启动子以外的调控元件。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含增强子。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含抑制子。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含内含子(例如VH4内含子(SEQ ID NO:417)或嵌合内含子(SEQ ID NO:416))。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含多聚腺苷酸化序列。
提供了基因表达盒和包含基因表达盒的rAAV，其中转基因的表达是由工程化核酸调控元件控制，所述核酸调控元件具有超过一个调控元件(启动子或增强子)，包括以串联方式排列的调控元件(两个或三个拷贝)，其促进肝脏特异性表达，或肝脏特异性表达和肌肉特异性表达两者，或肝脏特异性表达和骨特异性表达两者。这些调控元件包括用于以下的调控元件：肝脏特异性表达，LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQ ID NO:316)、LTP1(SEQID NO:317)、LTP2(SEQ ID NO:318)或LTP3(SEQ ID NO:319)；肝脏和肌肉表达，LMTP6(SEQID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQ ID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ ID NO:326)；或肝脏和骨表达，LBTP1(SEQ ID NO:327)或LBTP2(SEQ ID NO:328)，其序列提供于表1中，见上文。
5.1.4信号肽
在某些实施方案中，本文所提供的载体包含调节蛋白质递送的组分。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个信号肽。信号肽在本文中也可称为“前导序列”或“前导肽”。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物在细胞中实现适当包装(例如糖基化)。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物在细胞中实现适当定位。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物实现从细胞的分泌。
存在在基因疗法情形下或在细胞培养物中选择用于蛋白质产生的信号序列的两个通用方法。一个方法是使用来自与所表达蛋白质同源的蛋白质的信号肽。例如，人类抗体信号肽可用于在CHO或其他细胞中表达IgG。另一个方法是鉴定针对用于表达的特定宿主细胞优化的信号肽。信号肽可在不同蛋白质之间或甚至不同生物体的蛋白质之间互换，但通常所述细胞类型的最丰富分泌蛋白的信号序列是用于蛋白质表达。例如，发现人类白蛋白(血浆中的最丰富蛋白质)的信号肽基本上增加CHO细胞中的蛋白质产物产量。然而，作为“靶向后功能”，某些信号肽可在从所表达蛋白质切割之后保持功能和发挥活性。因此，在特定实施方案中，信号肽是选自通过用于表达的细胞分泌的最丰富蛋白质的信号肽以避免后靶向功能。在某一实施方案中，信号序列与重链和轻链序列两者融合。一个示例性序列是MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)，其可由核苷酸序列SEQ ID NO:422(参见表2，图2至图19和图29A至图29F)编码。或者，适合于表达并且可引起HuPTM mAb或Fab或scFv在眼睛(包括CNS)、肌肉或肝脏中的选择性表达或定向表达的信号序列分别提供于下文表2、表3和表4中。
表2.用于眼睛/CNS组织中的表达的信号肽
表3.用于肌肉细胞中的表达的信号肽
表4.用于肝脏细胞中的表达的信号肽
5.1.5多顺反子信号-IRES和2A接头以及scFv构建体
内部核糖体进入位点.单一构建体可经工程化以编码重链和轻链两者，所述重链和轻链由可切割接头或IRES分开以使得分开的重链和轻链多肽由转导细胞表达。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体提供多顺反子(例如双顺反子)信息。例如，病毒构建体可编码由内部核糖体进入位点(IRES)元件分开的重链和轻链(例如使用IRES元件产生双顺反子载体，参见例如Gurtu等人,1996,Biochem.Biophys.Res.Comm.229(1):295-8，其通过引用整体并入本文)。IRES元件绕过核糖体扫描模型并且在内部位点开始翻译。IRES在AAV中的用途描述于例如Furling等人,2001,Gene Ther 8(11):854-73中，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，双顺反子信息包含在病毒载体内，所述病毒载体对其中多核苷酸的大小有限制。在某些实施方案中，双顺反子信息包含在基于AAV病毒的载体(例如基于AAV8、基于AAV9或基于AAVrh10的载体)内。
弗林蛋白酶-2A接头.在其他实施方案中，本文所提供的病毒载体编码重链和轻链，所述重链和轻链由具有或不具有上游弗林蛋白酶切割位点的可切割接头(例如自切割2A和2A样肽)分开，所述可切割接头例如弗林蛋白酶/2A接头，例如弗林蛋白酶/F2A(F/F2A)或弗林蛋白酶/T2A(F/T2A)接头(Fang等人,2005,Nature Biotechnology 23:584-590，Fang,2007,Mol Ther 15:1153-9，和Chang,J.等人,MAbs 2015,7(2):403-412，其中的每一者通过引用整体并入本文)。例如，弗林蛋白酶/2A接头可并入表达盒中以将重链和轻链编码序列分开，从而产生具有以下结构的构建体：
前导序列-重链-弗林蛋白酶位点-2A位点-前导序列-轻链-PolyA。
例如包含氨基酸序列RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDV ESNPGP(SEQ ID NO:231)的F2A位点或包含氨基酸序列RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:429)的T2A位点的2A位点或2A样位点是自加工的，从而导致最终G与P氨基酸残基之间的“切割”。可使用的具有或不具有上游柔性Gly-Ser-Gly(GSG)接头序列(SEQ ID NO:427)的若干接头包括(但不限于)：
T2A：(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:227)；
P2A：(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:228)；
E2A：(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:229)；
F2A：(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:230)
(也参见例如Szymczak等人,2004,Nature Biotechnol 22(5):589-594，和Donnelly等人,2001,J Gen Virol,82:1013-1025，其中的每一者通过引用并入本文)。编码柔性接头的不同部分的示例性核苷酸序列描述于表1-1中。
表1-1
在某些实施方案中，例如弗林蛋白酶切割位点的额外蛋白水解切割位点邻近于自加工切割位点(例如2A或2A样序列)并入表达构建体中，从而提供一种移除在由自加工切割序列切割之后仍保留的额外氨基酸的方式。不受任一理论束缚，当核糖体在开放阅读框中遇到2A序列时，跳过肽键，从而导致翻译终止或继续翻译下游序列(轻链)。这种自加工序列在重链的C末端产生一串额外氨基酸。然而，此类额外氨基酸然后在弗林蛋白酶切割位点由宿主细胞弗林蛋白酶切割，所述弗林蛋白酶切割位点例如紧接在2A位点之前和重链序列之后，并且由羧基肽酶进一步切割。取决于所用弗林蛋白酶接头的序列和体内切割接头的羧肽酶，所得重链可在C末端包括一个、两个、三个或更多个额外氨基酸，或者其可不具有此类额外氨基酸(参见例如Fang等人,2005年4月17日,Nature Biotechnol.Advance OnlinePublication；Fang等人,2007,Molecular Therapy 15(6):1153-1159；Luke,2012,Innovations in Biotechnology,Ch.8,161-186)。可使用的弗林蛋白酶接头包含一系列四个碱性氨基酸，例如RKRR(SEQ ID NO:222)、RRRR(SEQ ID NO:223)、RRKR(SEQ ID NO:224)或RKKR(SEQ ID NO:225)。一旦这种接头由羧肽酶切割，即可保留额外氨基酸，使得额外的零、一、二、三或四个氨基酸可保留在重链的C末端上，例如R、RR、RK、RKR、RRR、RRK、RKK、RKRR(SEQ ID NO:222)、RRRR(SEQ ID NO:223)、RRKR(SEQ ID NO:224)或RKKR(SEQ ID NO:225)。在某些实施方案中，一旦接头由羧肽酶切割，则不保留额外氨基酸。在某些实施方案中，由用于本文所描述的方法中的构建体产生的抗体(例如抗原结合片段)群体中的0.5％至1％、1％至2％、5％、10％、15％或20％在切割之后具有保留在重链的C末端上的一、二、三或四个氨基酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶接头具有序列R-X-K/R-R，使得重链的C末端上的额外氨基酸是R、RX、RXK、RXR、RXKR或RXRR，其中X是任何氨基酸，例如丙氨酸(A)。在某些实施方案中，无额外氨基酸可保留在重链的C末端上。
柔性肽接头.在一些实施方案中，单一构建体可经工程化以编码由柔性肽接头分开的重链和轻链(例如重链和轻链可变结构域)两者，例如编码scFv的那些构建体。柔性肽接头可由如甘氨酸和丝氨酸的柔性残基构成，使得相邻重链和轻链结构域相对于彼此自由移动。构建体可布置成使得重链可变结构域处于scFv的N末端，接着是接头和然后的轻链可变结构域。或者，构建体可布置成使得轻链可变结构域处于scFv的N末端，接着是接头和然后的重链可变结构域。也就是说，组分可排列为NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
在某些实施方案中，本文所描述的表达盒包含在病毒载体内，所述病毒载体对其中多核苷酸的大小有限制。在某些实施方案中，表达盒包含在基于AAV病毒的载体内。归因于某些载体的大小限制，载体可容纳或可不容纳治疗性抗体的完整重链和轻链的编码序列，但可容纳抗原结合片段的重链和轻链的编码序列，例如Fab或F(ab')2片段或scFv的重链和轻链。特别是，本文所描述的AAV载体可容纳大约4.7千碱基的转基因。对于构建体，例如图1中的含有CB7启动子、鸡β-肌动蛋白内含子、兔β-珠蛋白polyA信号和ITR的构建体，所编码的治疗性抗体可为大约752个氨基酸。较小表达元件的取代将准许表达较大蛋白质产物，例如全长治疗性抗体。
5.1.6非翻译区
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个非翻译区(UTR)，例如3'和/或5'UTR。在某些实施方案中，UTR针对所需蛋白质表达水平而被优化。在某些实施方案中，UTR针对转基因的mRNA半衰期而被优化。在某些实施方案中，UTR针对转基因的mRNA的稳定性而被优化。在某些实施方案中，UTR针对转基因的mRNA的二级结构而被优化。
5.1.7反向末端重复序列
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体包含一个或多个反向末端重复(ITR)序列。ITR序列可用于将重组基因表达盒包装至病毒载体的病毒粒子中。在某些实施方案中，ITR是来自AAV，例如AAV8或AAV2(参见例如Yan等人,2005,J.Virol.,79(1):364-379；美国专利第7,282,199B2号、美国专利第7,790,449B2号、美国专利第8,318,480B2号、美国专利第8,962,332B2号和国际专利申请第PCT/EP2014/076466号，其中的每一者通过引用整体并入本文)。在优选的实施方案中，编码ITR的核苷酸序列可例如包含核苷酸序列SEQ IDNO:418(5'-ITR)或420(3'-ITR)。在某些实施方案中，可使用用于产生自互补载体，例如scAAV的经修饰ITR(参见例如Wu,2007,Human Gene Therapy,18(2):171-82；McCarty等人,2001,Gene Therapy,第8卷,第16期,第1248-1254页；以及美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号，其中的每一者通过引用整体并入本文)。在优选的实施方案中，编码经修饰ITR的核苷酸序列可例如包含核苷酸序列SEQ ID NO:419(5'-ITR)或421(3'-ITR)。
5.1.8转基因
转基因编码HuPTM mAb，其呈基于本文所公开的治疗性抗体的全长抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段(HuGlyFab)或F(ab')2或scFv的形式。在特定实施方案中，HuPTMmAb或抗原结合片段(特别是HuGlyFab)经工程化以在Fab结构域上含有额外糖基化位点(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其关于Fab结构域上的高糖基化位点的描述通过引用整体并入本文)。图20提供了本文所公开的治疗性抗体的Fab重链和轻链的比对，并且以绿色突出显示可经天冬酰胺或在一些情况下经丝氨酸取代从而引起高糖基化的残基。另外，对于包含Fc结构域的HuPTM mAb，Fc结构域可经工程化以改变N297处的糖基化位点，以便阻止所述位点的糖基化(例如，在N297处取代为另一氨基酸和/或在T297处取代为并非T或S的残基以敲除糖基化位点)。此类Fc结构域是“非糖基化的”。
在某些实施方案中，转基因用重链和轻链的编码序列编码全长抗体或其抗原结合片段。编码全长抗体的此类转基因包含Fab部分和Fc区。Fc区进一步论述于章节5.1.9中。示例性序列提供于图23和表7中。
在一些实施方案中，宜使用抗原结合片段。图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F提供了治疗性抗体的Fab片段的重链和轻链的氨基酸序列(也参见表5，其提供治疗性抗体的Fab重链和轻链的氨基酸序列)。在一些实施方案中，用于表达全长抗体的转基因可包含使用编码重链的Fab部分(包括铰链区序列)加用于如本文中进一步描述的适当同种型的重链的Fc多肽以及轻链的核苷酸序列来编码重链和轻链序列的核苷酸序列。编码本文所公开的治疗性抗体的重链和轻链的Fab片段部分的核苷酸序列提供于表6中。某些这些核苷酸序列针对人类细胞中的表达进行密码子优化。用于编码拉那鲁单抗和阿达木单抗的转基因的序列分别提供于表8和表17中。转基因可使用编码以下图中所提供的序列但不包括重链上铰链区的形成链间二硫键的部分(例如含有序列CPPCPA(SEQ ID NO:232)的部分)的核苷酸序列来编码Fab片段：图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F。不含在C末端的铰链区的CPPCP(SEQ ID NO:233)序列的重链Fab结构域序列将不形成链内二硫键，并因此将形成具有对应轻链Fab结构域序列的Fab片段，而具有在C末端的铰链区的含有序列CPPCP(SEQ ID NO:233)的部分的那些重链Fab结构域序列将形成链内二硫键并且因此将形成Fab2片段。例如，在一些实施方案中，转基因可编码包含经其间的柔性接头连接的轻链可变结构域和重链可变结构域的scFv(其中重链可变结构域可在scFv的N末端或C末端)，并且任选地可进一步在重链的C末端包含Fc多肽(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。或者，在其他实施方案中，转基因可编码包含核苷酸序列的F(ab')2片段，所述核苷酸序列编码轻链和重链序列，所述重链序列至少包括铰链区的序列CPPCA(SEQ ID NO:430)，如图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F中所描绘，所述图描绘可在重链序列的C末端处包括的铰链区的各个区。预先存在的抗铰链抗体(AHA)可产生免疫原性并降低功效。因此，在某些实施方案中，对于IgG1同种型，具有D221的C末端或具有突变T225L或具有L242的末端可降低与AHA的结合。(参见例如Brezski,2008,J Immunol 181:3183-92和Kim,2016,8:1536-1547)。对于IgG2，AHA的风险较低，因为IgG2的铰链区不易受产生内源性AHA所需的酶促切割影响。(参见例如Brezski,2011,MAbs 3:558-567)。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体按以下次序包含以下元件：a)组成型或诱导型(例如低氧诱导型或利福霉素诱导型)启动子序列或组织特异性启动子/调控区，例如表1中所提供的调控区中的一者；和b)编码转基因(例如HuGlyFab)的序列。在某些实施方案中，编码转基因的序列包含由IRES元件分开的多个ORF。在某些实施方案中，ORF编码HuGlyFab的重链和轻链结构域。在某些实施方案中，编码转基因的序列在一个由F/F2A序列或F/T2A序列分开的ORF中包含多个亚基。在某些实施方案中，包含转基因的序列编码由F/F2A序列或F/T2A序列分开的HuGlyFab的重链和轻链结构域。在某些实施方案中，包含转基因的序列编码由柔性肽接头分开的HuGlyFab的重链和轻链可变结构域(如同scFv)。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体按以下次序包含以下元件：a)组成型或诱导型启动子序列或组织特异性启动子，例如表1中的启动子或调控区中的一者；和b)编码转基因(例如HuGlyFab)的序列，其中所述转基因包含编码由IRES元件分开的信号肽、轻链和重链Fab部分的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体按以下次序包含以下元件：a)表1中所列的组成型或低氧诱导型启动子序列或调控元件；和b)编码转基因的序列，所述转基因包含信号肽、由可切割F/F2A序列(SEQ ID NO:231)或F/T2A序列(SEQ ID NO:429)或柔性肽接头分开的轻链和重链序列。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体按以下次序包含以下元件：a)第一ITR序列；b)第一接头序列；c)组成型或诱导型启动子序列或组织特异性启动子或调控区；d)第二接头序列；e)内含子序列；f)第三接头序列；g)第一UTR序列；h)编码转基因(例如HuGlyFab)的序列；i)第二UTR序列；j)第四接头序列；k)poly A序列；l)第五接头序列；和m)第二ITR序列。
在某些实施方案中，本文所提供的病毒载体按以下次序包含以下元件：a)第一ITR序列；b)第一接头序列；c)组成型或诱导型启动子序列或组织特异性调控区；d)第二接头序列；e)内含子序列；f)第三接头序列；g)第一UTR序列；h)编码转基因(例如HuGlyFab)的序列；i)第二UTR序列；j)第四接头序列；k)poly A序列；l)第五接头序列；和m)第二ITR序列，其中所述转基因包含信号，并且其中所述转基因编码由可切割F/2A序列分开的轻链和重链序列。
5.1.9Fc区修饰
在某些实施方案中，所述转基因编码缔合形成全长或完整抗体的全长或基本上全长重链和轻链。(“基本上完整”或“基本上全长”是指mAb具有与全长重链mAb氨基酸序列具至少95％同一性的重链序列和与全长轻链mAb氨基酸序列具至少95％同一性的轻链序列)。因此，所述转基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码例如下图中的Fab片段的轻链和重链，并且编码Fc结构域肽：图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F，包括重链的铰链区和Fab片段的重链的C末端。表7提供了本文所描述的某些治疗性抗体的Fc多肽的氨基酸序列。或者，可利用其序列提供于图23中的IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域。如所详述，转基因可包含编码治疗性抗体的Fc多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列如表6中所提供在铰链区的C末端处连接至编码重链Fab片段(具有图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F以及表6中所提供的氨基酸序列)的核苷酸序列。
术语“Fc区”是指两个“Fc多肽”(或“Fc结构域”)的二聚体，每个“Fc多肽”包含抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的重链恒定区。在一些实施方案中，“Fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个Fc多肽。“Fc多肽”是指IgA、IgD和IgG的至少最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，或IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包括这些结构域的N末端的柔性铰链的部分或全部。对于IgG，例如，“Fc多肽”包含免疫球蛋白结构域Cgamma2(Cγ2，通常称为CH2结构域)和Cgamma3(Cγ3，也称为CH3结构域)，并且可包括Cgamma1(Cγ1，也称为CH1结构域)与CH2结构域之间的铰链结构域的下部部分。尽管Fc多肽的边界可变化，但人类IgG重链Fc多肽通常定义以包含在T223或C226或P230起始直至其羧基末端的残基，其中编号是根据Kabat等人(1991,NIH公开91-3242,国家技术信息服务中心(National Technical Information Services),Springfield,Va.)中的EU索引。对于IgA，例如，Fc多肽包含免疫球蛋白结构域Calpha2(Cα2)和Calpha3(Cα3)，并且可包括Calpha1(Cα1)与Cα2之间的铰链的下部部分。
在某些实施方案中，Fc多肽是治疗性抗体的Fc多肽(参见表7)或者是对应于治疗性抗体的同种型的Fc多肽(同种型指示于图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F中)。在其他实施方案中，Fc多肽是IgG Fc多肽。例如取决于治疗性抗体的所需效应活性，Fc多肽可来自IgG1、IgG2或IgG4同种型(关于IgG1、IgG2和IgG4 Fc结构域序列的比对参见图23，根据EU编号进行编号)，或者可为IgG3 Fc结构域。在一些实施方案中，包括Fc结构域的工程化重链恒定区(CH)是嵌合的。因而，嵌合CH区组合来源于超过一个免疫球蛋白同种型和/或亚型的CH结构域。例如，嵌合(或杂交)CH区包含来自IgG、IgA和/或IgM的Fc区的部分或全部。在其他实例中，嵌合CH区包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH2结构域的部分或所有与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH3结构域的部分或全部的组合。在其他实施方案中，嵌合CH区含有嵌合铰链区。
在一些实施方案中，重组载体编码包含工程化(突变)Fc区(例如IgG恒定区的工程化Fc区)的治疗性抗体。相较于具有野生型IgG恒定区或无所述修饰的IgG重链恒定区的对应抗体，对IgG抗体的抗体恒定区、Fc区或Fc片段的修饰可改变一个或多个效应功能，例如Fc受体结合或新生儿Fc受体(FcRn)结合，并因此改变半衰期、CDC活性、ADCC活性和/或ADPC活性。因此，在一些实施方案中，抗体可经工程化以提供展现改变的与一个或多个Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcγRIV或FcRn受体)的结合(相较于无所述修饰的参考或野生型恒定区)的IgG抗体的抗体恒定区、Fc区或Fc片段。在一些实施方案中，相较于具有野生型IgG恒定区或无所述修饰的IgG恒定区的对应抗体，IgG抗体的抗体恒定区、Fc区或Fc片段展现一个或多个改变的效应功能，例如CDC、ADCC或ADCP活性。
“效应功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括FcγR介导的效应功能，例如ADCC和ADCP；和补体介导的效应功能，例如CDC。
“效应细胞”是指表达一个或多个Fc受体并介导一个或多个效应功能的免疫系统的细胞。效应细胞包括(但不限于)单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴球、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)、自然杀手(NK)细胞和T细胞，并且可来自包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任何生物体。
“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性效应(免疫)细胞识别目标细胞上结合的抗体并且随后使得目标细胞溶解。
“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”是指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性效应子(免疫)细胞识别目标细胞上结合的抗体并且随后引起目标细胞的吞噬的细胞介导的反应。
“CDC”或“补体依赖性细胞毒性”是指其中一个或多个补体蛋白组分识别目标细胞上结合的抗体并且随后引起目标细胞的溶解的反应。
在一些实施方案中，Fc结构域的修饰包括(但不限于)参考IgG恒定区的EU编号(参见图23)的以下修饰及其组合：233、234、235、236、237、238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
在某些实施方案中，Fc区包含IgG的氨基酸残基251-256、285-290、308-314、385-389和428-436中的一者或多者的氨基酸添加、缺失或取代。在一些实施方案中，251-256、285-290、308-314、385-389和428-436(Kabat的EU编号；参见图23)被组氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。在一些实施方案中，非组氨酸残基被组氨酸残基取代。在一些实施方案中，组氨酸残基被非组氨酸残基取代。
相较于具有野生型Fc的抗体，具有工程化Fc的抗体增强FcRn结合使得亲和力增强的抗体与FcRn优先结合，因此导致FcRn亲和力增强的抗体的净增强再循环，从而得到进一步增加的抗体半衰期。增强的再循环方法允许高效地靶向和清除抗原，包括例如“高滴度”循环抗原，例如C5、细胞因子，或细菌或病毒抗原。
在某些实施方案中，提供了相较于野生型Fc区(无工程化修饰)对血清中的FcRn的结合增强的IgG抗体的经修饰的恒定区、Fc区或Fc片段。在一些情况下，抗体(例如IgG抗体)经工程化以在中性pH(例如处于或高于pH 7.4)结合于FcRn，以相较于野生型Fc区(无工程化修饰)增强与FcRn的结合的pH依赖性。在一些情况下，抗体(例如IgG抗体)经工程化以相对于在酸性pH下结合于FcRn的野生型IgG和/或参考抗体以及相较于与血清中的FcRn的结合(例如在中性pH，例如处于或高于pH 7.4下)展现与核内体中的FcRn的增强结合(例如在酸性pH，例如处于或低于pH 6.0下)(例如亲和力或KD增加)。提供了具有IgG抗体的工程化抗体恒定区、Fc区或Fc片段的抗体，其相较于具有野生型IgG恒定区或无所述修饰的IgG恒定区的对应抗体，展现改进的血清或滞留组织半衰期。
这些Fc修饰的非限制性实例包括例如位置250(例如E或Q)、250和428(例如L或F)、252(例如LN/Y/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、2591(例如V2591)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)(EU编号；参见图23)。
在一些实施方案中，Fc区可为突变形式，例如hIgG1 Fc，其包括展现增强的人类FcRn亲和力(Dall'Acqua等人,2002,J Immunol 169:5171-5180)的M252突变，例如M252Y和S254T和T256E(“YTE突变”)；和结合至hFcRn从而产生两个盐桥(Oganesyan等人,2014,JBC289(11):7812-7824)的这种突变抗体的后续晶体结构。具有YTE突变的抗体已向猴和人类施用，并且其具有显著改进的药物动力学特性(Haraya等人,2019,Drug Metabolism andPharmacokinetics,34(1):25-41)。
在一些实施方案中，对Fc区中的一个或多个氨基酸残基的修饰可降低在全身循环(血清)中的半衰期，但会通过禁止FcRn结合(例如H435A，Kabat的EU编号)而使在组织中(例如在眼睛中)的滞留有所改善(Ding等人,2017,MAbs 9:269-284；和Kim,1999,Eur JImmunol 29:2819)。
在一些实施方案中，Fc结构域可经工程化以激活正常Fc效应功能中的全部、一些或未激活，而不影响Fc多肽(例如抗体)的所需药物动力学特性。具有改变效应功能的Fc多肽可合乎需要，因为其可通过治疗性蛋白降低不合需要的副作用，例如效应细胞的活化。
改变或甚至消除效应功能的方法可包括对抗体的铰链区氨基酸残基的突变或修饰。例如，包含根据EU编号系统的234A、237A和238S取代的IgG Fc结构域突变体展现降低的补体依赖性溶解和/或细胞介导的破坏。在本领域中已显示，下部铰链中，例如铰链结构域内位置233-236(EU编号)缺失或被修饰为甘氨酸之处的缺失和/或取代显著降低ADCC和CDC活性。
在特定实施方案中，Fc结构域是在残基297或299处具有取代以改变297处的糖基化位点，从而使得Fc结构域不被糖基化的非糖基化Fc结构域。此类非糖基化Fc结构域可具有降低的ADCC或其他效应活性。
包含具有改变的效应功能的突变和/或嵌合CH区的蛋白质和对突变抗体进行工程化和测试的方法的非限制性实例在本领域中描述于例如K.L.Amour等人,Eur.J.Immunol.1999,29:2613-2624；Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006,103:4005；2007年6月14日公开的美国专利申请公开第20070135620A1号；2008年6月26日公开的美国专利申请公开第20080154025A1号；2010年9月16日公开的美国专利申请公开第20100234572A1号；2012年9月6日公开的美国专利申请公开第20120225058A1号；2015年11月26日公开的美国专利申请公开第20150337053A1号；2016年10月6日公开的国际公开第WO20/16161010A2号；2016年6月7日发布的U.S.9,359,437；和2018年8月21日发布的美国专利第10,053,517号中，所述文献都通过引用并入本文。
所有人类IgG子类的重链基因中保守的C末端赖氨酸(-K)一般不存在于在血清中循环的抗体中，C末端赖氨酸在循环中被切掉，产生异质循环IgG群体。(van den Bremer等人,2015,mAbs 7:672-680)。在全长mAb的载体化构建体中，编码C末端赖氨酸(-K)或Fc末端的甘氨酸-赖氨酸(-GK)的DNA可缺失以原位产生更均质的抗体产物。(参见Hu等人,2017Biotechnol.Prog.33:786-794，其通过引用整体并入本文)。
5.1.10载体的制造和测试
本文所提供的病毒载体可使用宿主细胞制造。本文所提供的病毒载体可使用哺乳动物宿主细胞制造，例如A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初级纤维母细胞、肝细胞和成肌细胞。本文所提供的病毒载体可使用来自人类、猴、小鼠、大鼠、兔或仓鼠的宿主细胞来制造。
宿主细胞通过编码转基因和相关元件(例如载体基因组)的序列和在宿主细胞中产生病毒的方式，例如复制和衣壳基因(例如AAV的rep和cap基因)稳定地转化。关于产生具有AAV8衣壳的重组AAV载体的方法，参见美国专利第7,282,199B2号的具体实施方式的章节IV，其通过引用整体并入本文。所述载体的基因组拷贝滴度可例如通过
分析来确定。病毒粒子可例如通过CsCl2沉降来回收。
或者，昆虫细胞中的杆状病毒表达系统可用于产生AAV载体。关于综述，参见Aponte-Ubillus等人,2018,Appl.Microbiol.Biotechnol.102:1045-1054，其关于制造技术的全文通过引用并入本文。
体外测定(例如细胞培养测定)可用于测量本文所描述的载体的转基因表达，因此指示例如载体的效力。例如，PER.
细胞系(Lonza)，一种来源于人类胚胎视网膜细胞或视网膜色素上皮细胞的细胞系，例如视网膜色素上皮细胞系hTERT RPE-1(可从
获得)，可用于评定转基因表达。一旦表达，即可确定所表达产物的特性，包括确定与HuGlyFab相关的糖基化和酪氨酸硫酸化型态。糖基化型态和确定其的方法论述于章节5.2.1中，而酪氨酸硫酸化型态和确定其的方法论述于章节5.2.2中。另外，可使用本领域中已知的测定法，例如章节5.2.1和5.2.2中所描述的方法来确定由细胞表达的HuGlyFab的糖基化/硫酸化产生的益处。
5.1.10组合物
适合于向人类受试者施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂的制剂缓冲液中的悬浮液。此类制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。在一些实施方案中，药物组合物包含rAAV与药学上可接受的载剂的组合，以供向受试者施用。在一个实施方案中，术语“药学上可接受”是指被联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出适用于动物，并且更特定地适用于人类。术语“载剂”是指与药剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，包括例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经静脉内施用时，水是常用载剂。还可使用生理盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液作为液体载剂，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。药学上可接受的载剂、赋形剂和稳定剂的额外实例包括(但不限于)缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或本领域中已知的非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。除以上成分以外，本发明的药物组合物还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放制剂等形式。
5.2N-糖基化、酪氨酸硫酸化和O-糖基化
本文所公开的HuGlyFab或HuPTM Fab、HuPTMmAb和HuPTM scFv的氨基酸序列(一级序列)各包含至少一个发生N-糖基化或酪氨酸硫酸化的位点(关于治疗性抗体的Fab片段的氨基酸序列内的糖基化和/或硫酸化位置，参见图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F)。翻译后修饰也发生于全长抗体的Fc结构域中，特别是残基N297处(根据EU编号，参见图23)。
或者，突变可引入至Fc结构域中以改变残基N297(EU编号，参见图23)处的糖基化位点，特别是用另一氨基酸取代297处的天冬酰胺或299处的苏氨酸以移除糖基化位点，从而产生非糖基化Fc结构域。
5.2.1N-糖基化
反向糖基化位点
典型的N-糖基化序列在本领域中已知是Asn-X-Ser(或Thr)，其中X可为除Pro之外的任何氨基酸。然而，最近已证明，人类抗体的天冬酰胺(Asn)残基可在反向共有基序Ser(或Thr)-X-Asn的情形下被糖基化，其中X可为除Pro之外的任何氨基酸。参见Valliere-Douglass等人,2009,J.Biol.Chem.284:32493-32506；和Valliere-Douglass等人,2010,J.Biol.Chem.285:16012-16022。如本文所公开，本文所公开的某些HuGlyFab和HuPTM scFv包含此类反向共有序列。
非共有糖基化位点
除反向N-糖基化位点之外，最近已证明，人类抗体的谷氨酰胺(Gln)残基可在非共有基序Gln-Gly-Thr的情形下被糖基化。参见Valliere-Douglass等人,2010,J.Biol.Chem.285:16012-16022。出人意料地，本文所公开的某些HuGlyFab片段包含此类非共有序列。另外，O-糖基化包含通过酶将N-乙酰基-半乳糖胺添加至丝氨酸或苏氨酸残基。已证明存在于抗体铰链区中的氨基酸残基可经O-糖基化。相较于例如大肠杆菌中产生的抗原结合片段，O-糖基化的可能性赋予本文所提供的治疗性抗体另一个优势，同样因为大肠杆菌天然不含与人类O-糖基化中使用的机制相当的机制。(实际上，仅当细菌被修饰以含有特定O-糖基化机制时证明大肠杆菌中的O-糖基化。参见例如Farid-Moayer等人,2007,J.Bacteriol.189:8088-8098)。
工程化的N-糖基化位点
在某些实施方案中，与通常会与HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv缔合的核酸相比(例如相对于在其未经修饰状态下与HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv相关的N-糖基化位点的数目)，编码HuPTM mAb、HuGlyFab或HuTPM scFv的核酸被修饰以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个N-糖基化位点(包括典型的N-糖基化共有序列、反向N-糖基化位点和非共有N-糖基化位点)。在特定实施方案中，糖基化位点的引入是通过在抗原结合片段的一级结构中的任何位置插入N-糖基化位点(包括典型的N-糖基化共有序列、反向N-糖基化位点和非共有N-糖基化位点)来实现，只要所述引入不影响抗体或抗原结合片段与其抗原的结合即可。糖基化位点的引入可通过例如添加新氨基酸至抗原结合片段或抗原结合片段所来源于的抗体的一级结构(例如全部或部分添加糖基化位点)，或者通过使抗原结合片段或抗原结合片段所来源于的抗体中的现有氨基酸突变，以便产生N-糖基化位点(例如不将氨基酸添加至抗原结合片段/抗体，而是使抗原结合片段/抗体的所选氨基酸突变以形成N-糖基化位点)来实现。本领域技术人员应认识到，蛋白质的氨基酸序列可使用本领域中已知的方法容易地修饰，例如包括修饰编码蛋白质的核酸序列的重组方法。
在一个特定实施方案中，HuGlyMab或抗原结合片段经修饰以使得当在哺乳动物细胞(例如视网膜、CNS、肝脏或肌肉细胞)中表达时，其可经高糖基化。参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文。
HuPTM mAb和HuPTM抗原结合片段的N-糖基化
与小分子药物不同，生物制剂通常包含许多具有不同修饰或形式的变体的混合物，所述变体可具有不同的效力、药物动力学和/或安全概况。在基因疗法或蛋白质疗法中产生的每个分子不必完全被糖基化和硫酸化。实际上，所产生的糖蛋白群体应具有足够的糖基化(包括2,6-唾液酸化)和硫酸化以证明功效。本文所提供的基因疗法治疗的目标可例如在于减缓或遏制疾病或异常疾患的进展或降低与疾病或异常疾患相关的一个或多个症状的严重程度。
当HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv表达于人类细胞中时，抗原结合片段的N-糖基化位点可经各种不同聚糖糖基化。抗原结合片段的N-聚糖和Fc结构域已在本领域中表征。例如，Bondt等人,2014,Mol.&Cell.Proteomics 13.11:3029-3039(其关于Fab相关的N-聚糖的公开内容通过引用整体并入本文；也参见图22)表征与Fab相关的聚糖，并且证明抗体的Fab和Fc部分包含截然不同的糖基化型态，其中相对于Fc聚糖，Fab聚糖在半乳糖基化、唾液酸化和等分(例如等分GlcNAc)中较高，但在岩藻糖基化中较低。如Bondt一样，Huang等人,2006,Anal.Biochem.349:197-207(其关于Fab相关的N-聚糖的公开内容通过引用整体并入本文)发现Fab的大多数聚糖经唾液酸化。然而，在由Huang检验的抗体的Fab(其在小鼠细胞背景中产生)中，经鉴定的唾液酸残基是N-乙醇酰神经氨酸(“Neu5Gc”或“NeuGc”)(其不是人类天然的)，而非N-乙酰基神经氨酸(“Neu5Ac”，主要的人类唾液酸)。另外，Song等人,2014,Anal.Chem.86:5661-5666(其关于Fab相关的N-聚糖的公开内容通过引用整体并入本文)描述与市售抗体相关的N-聚糖文库。
Fc结构域的糖基化已经表征，并且是在天冬酰胺297(EU编号；参见图23)处的单一N连接聚糖。聚糖起到整体结构和功能作用，从而影响抗体效应功能，例如与Fc受体的结合(关于Fc糖基化在抗体功能中的作用的论述，参见例如Jennewein和Alter,2017,Trends InImmunology 38:358)。Fc区聚糖的移除几乎完全消除效应功能(Jennewien和Alter，在362处)。已显示Fc聚糖的组成影响效应功能，例如已显示高糖基化和岩藻糖基化的减少增加ADCC活性，而唾液酸化与抗炎性作用相关(同上，在364处)。疾病状态、遗传学和甚至膳食都可影响体内Fc聚糖的组成。对于以重组方式表达的抗体，聚糖组成可因用于重组表达的宿主细胞的类型而显著不同，并且策略可用于控制和修改以重组方式表达在细胞培养物(例如CHO)中的治疗性抗体中的聚糖的组成，以改变效应功能(参见例如Hansen等人的US2014/0193404)。因此，与表达于非人类宿主细胞中的抗体相比，本文所提供的HuPTM mAb可适宜在N297处具有更类似于原生人类聚糖组成的聚糖。
重要的是，当HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv表达于人类细胞中时，规避了对原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如CHO细胞或NS0细胞)中的体外产生的需求。实际上，根据本文所描述的方法，HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv的N-糖基化位点有利地用与人类治疗相关并对其有益的聚糖装饰。这种优势在将CHO细胞、NS0细胞或大肠杆菌用于抗体/抗原结合片段产生中时难以实现，因为例如CHO细胞(1)不表达2,6唾液酸转移酶并且因此无法在N-糖基化期间添加2,6唾液酸；(2)可添加Neu5Gc而非Neu5Ac作为唾液酸；并且(3)还可产生免疫原性聚糖α-Gal抗原，其与大部分个体中存在的抗α-Gal抗体反应，其在高浓度下可引发全身性过敏反应；而且因为(4)大肠杆菌天然地不含N-糖基化所需的组分。
用于确定抗体(包括抗原结合片段)的糖基化型态的测定法是本领域中已知的。例如，肼解可用于分析聚糖。首先，多糖通过与肼一起温育而从其缔合蛋白释放(可使用Ludger Liberate Hydrazinolysis聚糖释放试剂盒,Oxfordshire,UK)。亲核肼攻击多糖与载体蛋白之间的糖苷键，并允许释放附接的聚糖。N-乙酰基在此处理过程中丢失，必须通过重新N-乙酰化来重建。也可使用酶释放聚糖，例如糖苷酶或内切糖苷酶，例如PNGase F和Endo H，其与肼相比切割得更干净，并且副反应更少。游离聚糖可在碳柱上纯化，并且随后在还原端用荧光团2-氨基苯甲酰胺标记。根据Royle等人,Anal Biochem 2002,304(1):70-90的HPLC方案，可在GlycoSep-N柱(GL Sciences)上分离经标记的多糖。所得荧光色谱图指示多糖长度和重复单元的数目。可通过收集个别峰并且随后进行MS/MS分析来搜集结构信息。由此可确认重复单元的单糖组成和序列，并且另外可鉴定多糖组成的均质性。低或高分子量的特定峰可通过MALDI-MS/MS来分析，并且结果用于确认聚糖序列。色谱图中的每个峰对应于由某一数目的重复单元及其片段(例如糖残基)组成的聚合物，例如聚糖。因此，色谱图允许测量聚合物(例如聚糖)长度分布。洗脱时间是聚合物长度的指示，而荧光强度与相应聚合物(例如聚糖)的摩尔丰度相关。评定与抗原结合片段相关的聚糖的其他方法包括Bondt等人,2014,Mol.&Cell.Proteomics 13.11:3029-3039；Huang等人,2006,Anal.Biochem.349:197-207；和/或Song等人,2014,Anal.Chem.86:5661-5666所描述的方法。
与抗体(包括抗原结合片段)相关的聚糖型态的均质性或异质性，由于与糖基化位点上存在的聚糖长度或大小和聚糖数目有关，可使用本领域中已知的方法来评定，例如测量聚糖长度或大小和流体动力半径的方法。HPLC(例如尺寸排阻、正相、逆相和阴离子交换HPLC)以及毛细管电泳允许测量流体动力半径。与具有较少糖基化位点的载体相比，蛋白质中较高的糖基化位点数目导致较大的流体动力半径变化。然而，当分析单一聚糖链时，其可能由于长度更受控制而更均质。可通过肼解、SDS PAGE和毛细管凝胶电泳来测量聚糖长度。另外，均质性也可表示某些糖基化位点使用型态变化至更宽/更窄的范围。这些因素可通过糖肽LC-MS/MS来测量。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或其抗原结合也不含可检测的NeuGc和/或α-Gal。“可检测的NeuGc”或“可检测α-Gal”或“不含或不具有NeuGc或α-Gal”在本文中”是指HuPTMmAb或抗原结合片段不含通过本领域中已知的标准测定方法可检测的NeuGc或α-Gal部分。例如，根据Hara等人,1989,“Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection”J.Chromatogr.,B:Biomed.377,111-119(其关于检测NeuGc的方法通过引用并入本文)，NeuGc可通过HPLC来检测。或者，NeuGc可通过质谱法来检测。α-Gal可使用ELISA检测，参见例如Galili等人,1998,“A sensitive assay for measuringα-Gal epitope expression on cells by amonoclonal anti-Gal antibody”Transplantation.65(8):1129-32，或通过质谱法检测，参见例如Ayoub等人,2013,“Correct primary structure assessment and extensiveglyco-profiling of cetuximab by a combination of intact,middle-up,middle-downand bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques”Landes Bioscience.5(5):699-710。也参见Platts-Mills等人,2015,“Anaphylaxis to the CarbohydrateSide-Chain Alpha-gal”Immunol Allergy Clin North Am.35(2):247-260中所引用的参考文献。
N-糖基化的益处
N-糖基化赋予本文所描述的HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv多种益处。通过在大肠杆菌中产生抗原结合片段无法获得此类益处，因为大肠杆菌天然地不具有N-糖基化所需的组分。此外，一些益处难以经由在例如CHO细胞(或鼠类细胞，例如NS0细胞)中的抗体产生实现，因为CHO细胞缺乏添加某些聚糖所需的组分(例如2,6唾液酸和等分GlcNAc)；而且因为CHO或鼠类细胞系添加并非人类天然(和潜在免疫原性)的N-N-乙醇酰神经氨酸(“Neu5Gc”或“NeuGc”)，而非主要人类唾液酸N-乙酰基神经氨酸(“Neu5Ac”)。参见例如Dumont等人,2015,Crit.Rev.Biotechnol.36(6):1110-1122；Huang等人,2006,Anal.Biochem.349:197-207(NeuGc是例如SP2/0和NS0的鼠类细胞系中的主要唾液酸)；以及Song等人,2014,Anal.Chem.86:5661-5666，其中的每一者通过引用整体并入本文。此外，CHO细胞也可产生免疫原性聚糖α-Gal抗原，其与大部分个体中存在的抗α-Gal抗体反应，其在高浓度下可引发全身性过敏反应。参见例如Bosques,2010,Nat.Biotech.28:1153-1156。本文所描述的HuPTM scFv的HuGlyFab的人类糖基化型态应降低转基因产物的免疫原性并改进功效。
尽管非典型糖基化位点通常导致抗体群体的糖基化水平低(例如约1-5％)，但功能益处可为显著的(参见例如van de Bovenkamp等人,2016,J.Immunol.196:1435-1441)。例如，Fab糖基化可影响抗体的稳定性、半衰期和结合特性。为了确定Fab糖基化对抗体与其目标的亲和力的效应，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或表面等离子体共振(SPR)。为了确定Fab糖基化对抗体的半衰期的效应，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如通过测量已施用放射性标记抗体的受试者的血液或器官中的放射性水平。为了确定Fab糖基化对抗体稳定性的效应(例如聚集水平或蛋白质去折叠水平)，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如差示扫描量热法(DSC)、例如尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)的高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳、质谱法或浊度测量。
用于本文中所描述的方法中的HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv上唾液酸的存在可影响HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv的清除率。因此，HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTMscFv的唾液酸型态可用于产生具有优化清除率的治疗剂。评定抗原结合片段清除率的方法是本领域中已知的。参见例如Huang等人,2006,Anal.Biochem.349:197-207。
在另一个特定实施方案中，由N-糖基化赋予的益处是聚集减少。占据的N-糖基化位点可掩蔽易于聚集的氨基酸残基，从而使得聚集减少。此类N-糖基化位点可为本文所用的抗原结合片段原生的或经工程化至本文所用的抗原结合片段中，从而产生在表达，例如表达于人类细胞中时较不易于聚集的HuGlyFab或HuPTM scFv。评定抗体聚集的方法是本领域中已知的。参见例如Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文。
在另一个特定实施方案中，由N-糖基化赋予的益处是免疫原性降低。此类N-糖基化位点可为本文所用的抗原结合片段原生的或经工程化至本文所用的抗原结合片段中，从而产生在表达，例如表达于人类视网膜细胞、人类CNS细胞、人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中时较不易于具有免疫原性的HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv。
在另一个特定实施方案中，由N-糖基化赋予的益处是蛋白质稳定性。众所周知，蛋白质的N-糖基化赋予其稳定性，并且评定由N-糖基化产生的蛋白质稳定性的方法是本领域中已知的。参见例如Sola和Griebenow,2009,J Pharm Sci.,98(4):1223-1245。
在另一个特定实施方案中，由N-糖基化赋予的益处是结合亲和力改变。本领域中已知，抗体可变结构域中N-糖基化位点的存在可增加抗体对其抗原的亲和力。参见例如Bovenkamp等人,2016,J.Immunol.196:1435-1441。用于测量抗体结合亲和力的测定法是本领域中已知的。参见例如Wright等人,1991,EMBO J.10:2717-2723；和Leibiger等人,1999,Biochem.J.338:529-538。
5.2.2酪氨酸硫酸化
酪氨酸硫酸化发生在酪氨酸(Y)残基处，谷氨酸酯(E)或天冬氨酸(D)在Y的+5至-5位置内，并且其中Y的位置-1是中性或酸性带电荷氨基酸，而非消除硫酸化的碱性氨基酸，例如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)。本文所描述的HuGlyFab和HuPTM scFv包含酪氨酸硫酸化位点(参见图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F)。
重要的是，酪氨酸硫酸化的抗原结合片段无法在大肠杆菌中产生，大肠杆菌天然不具有酪氨酸硫酸化所需的酶。另外，CHO细胞缺乏酪氨酸硫酸化—其并非分泌细胞并且翻译后酪氨酸硫酸化的能力有限。参见例如Mikkelsen和Ezban,1991,Biochemistry 30:1533-1537。有利地，本文所提供的方法需要在分泌性的并具有酪氨酸硫酸化能力的人类细胞中表达HuPTM Fab。
酪氨酸硫酸化由于若干原因是有利的。例如，已显示针对目标的治疗性抗体的抗原结合片段的酪氨酸硫酸化大大增加对抗原的亲合力和活性。参见例如Loos等人,2015,PNAS 112:12675-12680和Choe等人,2003,Cell 114:161-170。用于检测酪氨酸硫酸化的测定法是本领域中已知的。参见例如Yang等人,2015,Molecules 20:2138-2164。
5.2.3O-糖基化
O-糖基化包括通过酶将N-乙酰基-半乳糖胺添加至丝氨酸或苏氨酸残基。已证明存在于抗体铰链区中的氨基酸残基可经O-糖基化。在某些实施方案中，HuGlyFab包含其铰链区的全部或一部分，并因此能够在表达于人类细胞中时经O-糖基化。相较于例如大肠杆菌中产生的抗原结合片段，O-糖基化的可能性赋予本文所提供的HuGlyFab另一个优势，同样因为大肠杆菌天然不含有与人类O-糖基化中使用的机制相当的机制。(实际上，仅当细菌被修饰以含有特定O-糖基化机制时证明大肠杆菌中的O-糖基化。参见例如Farid-Moayer等人,2007,J.Bacteriol.189:8088-8098)。O-糖基化HuGlyFab凭借具有聚糖而与N-糖基化HuGlyFab(如上文所论述)共有有利特性。
5.3载体化治疗性抗体
5.3.1用于阿尔茨海默病的抗Aβ HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于来源于淀粉样前体蛋白的淀粉样蛋白β(Aβ或Abeta)肽并且可有益于治疗阿尔茨海默病(AD)等。在特定实施方案中，HuPTM mAb是索拉珠单抗、或GSK933776、或仑卡奈单抗、或前述中的一者的抗原结合片段。这些抗体的Fab片段的氨基酸序列分别提供于图2A至图2C中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有AD或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码Aβ结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于Aβ的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于Aβ的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗Aβ抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因包含编码索拉珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.1和2，参见表5和图2A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。所述核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:71(编码索拉珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:72(编码索拉珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除包括重链和轻链可变结构域序列以及CL和CH1序列的Fab片段以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Aβ抗原结合结构域具有SEQ ID NO:1的重链可变结构域和CH1结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Aβ抗原结合结构域含有如图2A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQID NO:71的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:71)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如表7的SEQIDNO:290、SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链的Aβ抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含重链的Aβ抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:1中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码高糖基化索拉珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:1和2的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L107N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个索拉珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图2A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Aβ抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因包含编码GSK933776的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.3和4，参见表5和图2B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:73(编码GSK933776重链Fab部分)和SEQ ID NO:74(编码GSK933776轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于表2中的信号序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Aβ抗原结合结构域具有SEQ ID NO:3的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Aβ抗原结合结构域含有如图2B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA(SEQ ID NO:202)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ IDNO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQ IDNO:204)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQ ID NO:205)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:3的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:73)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQID NO.291(表7)或替代地SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。在特定实施方案中，Fc结构域在位置235和237(EU编号)处具有丙氨酸取代。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链的Aβ抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:4中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含重链的Aβ抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:3中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:4中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:3中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:3，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码高糖基化GSK933776Fab，其包含分别为SEQ ID NO:3和4的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L110N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个GSK933776CDR的核苷酸序列，所述CDR在图2B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Aβ抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因包含编码仑卡奈单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.360和361，参见表5和图2C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:376(编码仑卡奈单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:377(编码仑卡奈单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除包括重链和轻链可变结构域以及CL和CH1结构域的Fab片段以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Aβ抗原结合结构域具有SEQ ID NO:360的重链可变结构域和CH1结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Aβ抗原结合结构域含有如图2C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO: 199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQID NO:376的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:376)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如表7的SEQ IDNO.392、SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链的Aβ抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:361中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含重链的Aβ抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:360中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:361中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:360中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:360，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:361，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码高糖基化仑卡奈单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:360和361的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T119N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个仑卡奈单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图2C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Aβ抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗Aβ抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的AD的方法。所述抗体可为索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在其他实施方案中，所述抗体是具有Fc区的全长或基本上全长抗体。在某些实施方案中，所述患者已诊断患有前驱性AD和/或具有与前驱性AD相关的症状，例如与早期AD或甚至前驱AD相关的轻度认知障碍。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗Aβ疗法有反应的受试者。在特定实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有AD或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗Aβ抗体的治疗有反应或被视为抗Aβ抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776进行治疗并且已发现对索拉珠单抗、仑卡奈单抗和/或GSK933776有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗Aβ抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗Aβ HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的AD治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗Aβ HuPTM Fab或HuPTM mAb的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有AD或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗Aβ HuPTMmAb或抗Aβ HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗Aβ HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有AD或认为AD的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图2A中所列的索拉珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置N56、Q104和/或N154，或轻链(SEQ ID NO:2)的Q105、N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有索拉珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:1)的Y94、Y95和/或Y101或轻链(SEQ ID NO:2)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗AβHuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，抗Aβ-HuPTM mAb是具有Fc区，例如SEQ IDNO 290或替代地SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:285的Fc结构域，或其突变体或变体的全长mAb。
在特定实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图2B中所列的GSK933776的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:3)的氨基酸位置N32、Q107和/或N157或轻链(SEQ ID NO:4)的N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有GSK933776的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:3)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:4)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，抗Aβ-HuPTM mAb是具有Fc区，例如SEQID NO:291或替代地SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:285的Fc结构域或其突变体或变体的全长mAb，并且例如在位置235和237(EU编号)处具有丙氨酸取代。
在特定实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图2C中所列的仑卡奈单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:360)的氨基酸位置Q116和/或N166或轻链(SEQID NO:361)的N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有仑卡奈单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:360)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:361)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，抗Aβ-HuPTM mAb是具有Fc区，例如SEQ ID NO 392或替代地SEQ ID NO:283的Fc结构域，或其突变体或变体的全长mAb。在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制AD(特别是认知障碍)的进展。可通过测量斑块形成的减少，和/或认知功能的改善，或认知功能减退的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于AD的治疗包括(但不限于)
(多奈哌齐(donepezil))、
(加兰他敏(galantamine))、
(雷斯替明(rivastigmine))和
(多奈哌齐和美金刚(memantine))，并且与包括(但不限于)索拉珠单抗、GSK933776或仑卡奈单抗的抗Aβ药剂或例如aTAU的抗Tau药剂一起施用。
5.3.2.用于额颞叶痴呆的抗分选蛋白HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于分选蛋白并且可有益于治疗额颞叶痴呆(FD)。在特定实施方案中，HuPTM mAb是AL-001或AL-001的抗原结合片段。这种抗体的Fab片段的重链和轻链的氨基酸序列提供于图3中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有FD或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码分选蛋白结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于分选蛋白的HuPTM mAb或HuPTMFab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于分选蛋白的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如AL-001或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗分选蛋白抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因包含编码AL-001的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.5和6，参见表5和图3)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:75(编码AL-001重链Fab部分)和SEQ ID NO:76(编码AL-001轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域序列以及CH1和CL结构域以外，转基因可在序列C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗分选蛋白抗原结合结构域具有SEQ ID NO:5的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗分选蛋白抗原结合结构域含有如图3中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:75的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQID NO:75)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因编码包含轻链的分选蛋白抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:6中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因编码包含重链的分选蛋白抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:5中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:6中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ IDNO:5中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，分选蛋白抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图3中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，分选蛋白抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:6，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图3中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因编码高糖基化AL-001Fab或mAb，其包含分别为SEQ ID NO:5和6的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T124N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗分选蛋白抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个AL-001CDR的核苷酸序列，所述CDR在图3的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗分选蛋白抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗分选蛋白抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的FD的方法。所述抗体可为AL-001，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在某些实施方案中，所述转基因编码全长或基本上全长Al-001mAb，包括Fc区。在某些实施方案中，所述患者已诊断患有FD和/或具有与FD或前驱性FD相关的症状，例如与早期FD或甚至前驱FD相关的轻度认知障碍。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗分选蛋白疗法有反应的受试者。在特定实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有FD或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗分选蛋白抗体的治疗有反应或被视为抗分选蛋白抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用AL-001进行治疗，并且已发现对AL-001有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗分选蛋白抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗分选蛋白HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的FD治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗分选蛋白HuPTM Fab或HuPTM mAb的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有FD或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗分选蛋白HuPTM mAb或抗分选蛋白HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗分选蛋白HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有FD或认为FD的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗分选蛋白HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图3中所列的AL-001的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:5)的氨基酸位置Q121和/或N171或轻链(SEQ IDNO:6)的N32、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有AL-001的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQID NO:5)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:6)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗分选蛋白HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，抗分选蛋白HuPTM mAb是具有Fc区，例如SEQ ID NO 283、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:285的Fc结构域，或其突变体或变体的全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制FD(特别是认知障碍)的进展。可通过测量认知功能的改善，和/或行为、性格和/或在表达或理解语言方面的困难劣化的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗分选蛋白HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可用于FD的治疗可与本文所提供的基因疗法组合。
5.3.3.用于Tau蛋白病如阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病变、进行性核上性麻痹或额颞叶痴呆的抗Tau HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于Tau蛋白(Tau)，例如单体Tau、寡聚Tau、非磷酸化Tau和磷酸化Tau并且可有益于治疗阿尔茨海默病(AD)、慢性创伤性脑病变(CTE)、皮克综合征、原发性年龄相关性Tau蛋白病、进行性核上性麻痹(PSP)、FD和其他Tau蛋白病。在特定实施方案中，HuPTM mAb是ABBV-8E12、UCB-0107和NI-105(BIIB076)，或前述中的一者的抗原结合片段。这些抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图4A至图4C中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有AD、CTE、PSP、FD或其他Tau蛋白病或具有所述疾病的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码Tau结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于Tau的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于Tau的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如ABBV-8E12、UCB-0107和NI-105(BIIB076)或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗Tau抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因包含编码ABBV-8E12的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.7和8，参见表5和图4A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:77(编码ABBV-8E12重链Fab部分)和SEQ ID NO:78(编码ABBV-8E12轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在CH1结构域的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Tau抗原结合结构域具有SEQ ID NO:7的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Tau抗原结合结构域含有如图4A中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ ID NO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQID NO:77的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:77)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或285，包括S241P取代(EU编号)或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链的Tau抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:8中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含重链的Tau抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:7中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:8中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:7中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:7，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:8，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码高糖基化ABBV-8E12 Fab，其包含分别为SEQ ID NO:7和8的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T110N(重链)、Q164N或Q164S(轻链)，和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个ABBV-8E12 CDR的核苷酸序列，所述CDR在图4A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Tau抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因包含编码UCB-0107的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.9和10，参见表5和图4B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:79(编码UCB-0107重链Fab部分)和SEQ ID NO:80(编码UCB-0107轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ IDNO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域、CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Tau抗原结合结构域具有SEQID NO:9的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Tau抗原结合结构域含有如图4B中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ ID NO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:79的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:79)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如SEQ ID NO.292(表7)，或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链的Tau抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:10中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含重链的Tau抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:9中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:10中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:9中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:9，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:10，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码高糖基化UCB-0107Fab，其包含分别为SEQ ID NO:9和10的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M113N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个UCB-0107CDR的核苷酸序列，所述CDR在图4B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Tau抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因包含编码NI-105的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.11和12，参见表5和图4C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:81(编码NI-105重链Fab部分)和SEQ ID NO:82(编码NI-105轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Tau抗原结合结构域具有SEQ ID NO:11的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Tau抗原结合结构域含有如图4C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA(SEQ ID NO:202)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ IDNO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQ IDNO:204)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQ ID NO:205)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:81的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:81)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链的Tau抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:12中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含重链的Tau抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:11中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:12中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:11中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:11，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Tau抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图4C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码高糖基化NI-105Fab，其包含分别为SEQ ID NO:11和12的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L119N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个NI-105CDR的核苷酸序列，所述CDR在图4C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Tau抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗Tau抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的AD、CTE、PSP、FD或其他Tau蛋白病的方法。所述抗体可为ABBV-8E12、UCB-0107或NI-105(BIIB076)，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。在某些实施方案中，所述患者已诊断患有前驱性AD和/或具有与前驱性AD相关的症状，例如与早期AD或甚至前驱AD相关的轻度认知障碍。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗Tau疗法有反应的受试者。在特定实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有AD、PSP或FD或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗Tau抗体的治疗有反应或被视为抗Tau抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用ABBV-8E12、UCB-0107和/或NI-105(BIIB076)进行治疗并且已发现对ABBV-8E12、UCB-0107和/或NI-105(BIIB076)有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗Tau抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗Tau HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的AD、PSP或FD的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗Tau HuPTM Fab或HuPTM mAb的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有AD、PSP或FD或具有所述疾病的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗Tau HuPTMmAb或抗Tau HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗Tau HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有AD、PSP或FD或认为AD、PSP或FD的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图4A中所列的ABBV-8E12的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:7)的氨基酸位置N57、Q107、N157和/或N199或轻链(SEQ ID NO:8)的N78、Q104、N162和/或N214中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有ABBV-8E12的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:7)的Y96、Y97和/或Y104，和/或轻链(SEQ ID NO:8)的Y90和/或Y91处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图4B中所列的UCB-0107的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:9)的氨基酸位置N32、N58、N76、Q110、N160和/或N202或轻链(SEQ ID NO:10)的N99、N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有UCB-0107的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:9)的Y93、Y94、Y101和/或Y102，和/或轻链(SEQ ID NO:10)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图4C中所列的NI-105的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:11)的氨基酸位置N77、N107、Q116和/或N166，和/或轻链(SEQ ID NO:12)的N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有NI-105的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:11)的Y93和/或Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:12)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制AD、PSP或FD(特别是认知障碍、大肌肉或小肌肉运动技能障碍或视觉障碍)的进展。可通过测量斑块形成的减少和/或认知功能、运动技能或视力的改善，或认知功能、运动技能或视力的减退的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗Tau HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于AD、PSP或FD的治疗包括(但不限于)
(多奈哌齐)、
(加兰他敏)、
(雷斯替明)和
(多奈哌齐和美金刚)，并与以下一起施用：抗Tau药剂，包括(但不限于)抗Tau，例如(但不限于)ABBV-8E12、UCB-0107或NI-105；和抗Aβ药剂，例如(但不限于)索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776。
5.3.4.用于亨廷顿病的抗SEMA4D HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于信号蛋白4D(SEMA4D)并且可有益于治疗亨廷顿病(HD)和青少年亨廷顿病(JHD)。在特定实施方案中，HuPTM mAb是VX15/2503或VX15/2503的抗原结合片段。这种抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图5中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有HD或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码SEMA4D结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于SEMA4D的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于SEMA4D的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如VX15/2503或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗SEMA4D抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因包含编码VX15/2503的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.13和14，参见表5和图5)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:83(编码VX15/2503重链Fab部分)和SEQ ID NO:84(编码VX15/2503轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SEMA4D抗原结合结构域具有SEQ ID NO:13的重链可变结构域和CH1结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SEMA4D抗原结合结构域含有如图5中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ IDNO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:83的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:83)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因编码包含轻链的SEMA4D抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:14中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因编码包含重链的SEMA4D抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:13中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:14中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:13中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SEMA4D抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:13，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图5中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SEMA4D抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:14，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图5中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因编码高糖基化VX15/2503Fab，其包含分别为SEQ ID NO:13和14的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T113N(重链)、Q156N或Q156S(轻链)，和/或E191N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SEMA4D抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个VX15/2503CDR的核苷酸序列，所述CDR在图5的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的HD或青少年HD的方法。所述抗体可为VX15/2503，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在某些实施方案中，所述转基因编码全长或基本上全长VX15/2503。在某些实施方案中，所述患者已被诊断患有HD和/或具有与其相关的症状，例如与早期HD或甚至前驱HD相关的轻度非自主运动、颤抖和/或肌张力障碍。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗SEMA4D疗法有反应的受试者。在特定实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有HD或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗SEMA4D抗体的治疗有反应或被视为抗SEMA4D抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用VX15/2503进行治疗，并且已发现对VX15/2503有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗SEMA4D抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗SEMA4D HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的HD治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗SEMA4D HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有HD或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗SEMA4D HuPTM mAb或抗SEMA4D HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗SEMA4D HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有HD或青少年HD或认为HD或青少年HD的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗SEMA4D HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图5中所列的VX15/2503的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:13)的氨基酸位置N61、Q110、N160和/或N207或轻链(SEQ ID NO:14)的N22、Q104、N154和/或N206中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有VX15/2503的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:13)的Y94、Y95、Y99、Y100和/或Y101或轻链(SEQ ID NO:14)的Y31、Y36、Y90和/或Y91处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SEMA4D HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制HD或青少年HD(特别是自主运动障碍)的进展。可通过测量运动、肌张力障碍的改善，和/或认知功能的改善，或舞蹈症控制和认知功能的减退的减少来监测功效。在青少年HD的情况下，可通过测量肌肉僵硬、肌张力障碍和/或舞蹈症的改善，或肌肉和认知功能的减退的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗SEMA4D HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于HD或青少年HD的治疗包括(但不限于)语言、物理和职业疗法、
(四苯那嗪(Tetrabenazine))、
(可那氮平(clonazepam))、
(氟哌啶醇(haloperidol))、
(氯氮平(clozapine))、
(氟西汀(fluoxetine))、
(舍曲林(sertraline))和
(去甲替林(nortriptyline))，并且与包括(但不限于)VX15/2503的抗SEMA4D药剂一起施用。
5.3.5.用于帕金森病和突触核蛋白病的抗α-突触核蛋白HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于α-突触核蛋白(SNCA)并且可有益于治疗帕金森病(PD)和其他突触核蛋白病，例如路易体痴呆(dementia with Lewy bodies；DLB)、单纯性自主神经衰竭(pure autonomic failure；PAF)和多发性系统萎缩症(multiple systematrophy；MSA)。在特定实施方案中，HuPTM mAb是普拉森单抗、NI-202(BIIB054)和MED-1341，或前述中的一者的抗原结合片段。这些抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图6A至图6C中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有PD、DLB、PAF、MSA或具有所述疾病的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码SNCA结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于SNCA的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于SNCA的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗SNCA抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因包含编码普拉森单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.15和16，参见表5和图6A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:85(编码普拉森单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:86(编码普拉森单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SNCA抗原结合结构域具有SEQ IDNO:15的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SNCA抗原结合结构域含有如图6A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:85的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQID NO:85)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:293(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链的SNCA抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:16中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含重链的SNCA抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:15中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:16中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:15中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:16，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:16，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Tau抗原结合片段转基因编码高糖基化普拉森单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:15和16的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L119N(重链)、Q166N或Q166S(轻链)，和/或E201N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个普拉森单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图6A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SNCA抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因包含编码NI-202的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.17和18，参见表5和图6B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:87(编码NI-202重链Fab部分)和SEQ ID NO:88(编码NI-202轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SNCA抗原结合结构域具有SEQ ID NO:17的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SNCA抗原结合结构域含有如图6B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:87的3'端处的核苷酸序列由表5中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:87)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链的SNCA抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:18中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含重链的SNCA抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:17中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:18中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:17中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:17，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:18，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码高糖基化NI-202Fab，其包含分别为SEQ ID NO:17和18的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L119N(重链)、Q166N或Q166S(轻链)，和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个NI-202CDR的核苷酸序列，所述CDR在图6B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SNCA抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因包含编码MED-1341的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.19和20，参见表5和图6C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:89(编码MEDI-1341重链Fab部分)和SEQ ID NO:90(编码MEDI-1341轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1或CL序列以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SNCA抗原结合结构域具有SEQ ID NO:19的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SNCA抗原结合结构域含有如图6C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGG(SEQ ID NO:206)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ IDNO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFL(SEQ IDNO:208)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEFEGGPSVFL(SEQ ID NO:209)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:89的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:89)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ IDNO:294(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链的SNCA抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:20中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含重链的SNCA抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:19中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:20中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:19中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:19，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SNCA抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:20，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图6C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码高糖基化MEDI-1341Fab，其包含分别为SEQ ID NO:19和20的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T117N(重链)和/或Q203N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SNCA抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个MEDI-1341CDR的核苷酸序列，所述CDR在图6C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SNCA抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗SNCA抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的PD、DLB、PAF、MSA或其他突触核蛋白病的方法。所述抗体可为普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在其他实施方案中，所述转基因编码具有Fc区的全长或基本上全长抗体。在某些实施方案中，所述患者已诊断患有PD或其他突触核蛋白病和/或具有与其相关的症状，例如与早期PD或甚至前驱PD相关的轻度认知和/或运动技能障碍。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗SNCA疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有PD、DLB、PAF或MSA或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗SNCA抗体的治疗有反应或被视为抗SNCA抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用普拉森单抗、NI-202(BIIB054)和/或MED-1341进行治疗并且已发现对普拉森单抗、NI-202(BIIB054)和/或MED-1341有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗SNCA抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗SNCA HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的PD、DLB、PAF或MSA的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗SNCA HuPTM Fab或HuPTMmAb的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有PD、DLB、PAF或MSA或具有所述疾病的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗SNCA HuPTMmAb或抗SNCA HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗SNCA HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有PD、DLB、PAF或MSA或认为PD、DLB、PAF或MSA的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图6A中所列的普拉森单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:15)的氨基酸位置Q108和/或N158或轻链(SEQ ID NO:16)的N34、N164和/或N216中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有普拉森单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:15)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:16)的Y92和/或Y93处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图6B中所列的NI-202的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:17)的氨基酸位置N71、Q116和/或N166或轻链(SEQ ID NO:18)的N34、N164和/或N216中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有NI-202的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:17)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:18)的Y92和/或Y93处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图6C中所列的MEDI-1341的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:19)的氨基酸位置N77、Q114和/或N164或轻链(SEQ ID NO:20)的N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有MED-1341的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQID NO:19)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:20)的Y94和/或Y95处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制PD、DLB、PFA或MSP(特别是认知障碍、大肌肉或小肌肉运动技能障碍或视觉障碍)的进展。可通过测量认知功能、运动技能(即，姿势、平衡、颤抖)和/或视力的改善，或认知功能、运动技能或视力的减退的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗SNCA HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于PD、DLB、PFA或MSP的治疗包括(但不限于)
或
(卡比多巴(carbidopa)/左旋多巴(levodopa))，并且与抗SNCA药剂一起施用，所述抗SNCA药剂包括(但不限于)抗SNCA，例如(但不限于)普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341。
5.3.6.用于阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化的抗SOD1HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于超氧化物歧化酶1(SOD1)并且可有益于治疗AD和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在特定实施方案中，HuPTM mAb是NI-204或NI-204的抗原结合片段。这种抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图7A和图7B中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有AD或ALS或具有所述疾病的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码SOD1结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于SOD1的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于SOD1的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如NI-204或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗SOD1抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因包含编码NI-204(10D12)的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.21和22，参见表5和图7A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:91(编码NI-202(10D12)重链Fab部分)和SEQ ID NO:92(编码NI-202(10D12)轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SOD1抗原结合结构域具有SEQ ID NO:21的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SOD1抗原结合结构域含有如图3中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ ID NO:210)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ IDNO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ IDNO:212)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ ID NO:213)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:91的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:91)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ IDNO:295或IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含轻链的SOD1抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:22中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含重链的SOD1抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:21中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:22中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:21中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SOD1抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:21，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图7A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SOD1抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图7A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码高糖基化NI-202(10D12)Fab，其包含分别为SEQ ID NO:21和22的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L121N(重链)、Q159N或Q159S(轻链)，和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个NI-202(10D12)CDR的核苷酸序列，所述CDR在图7A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SOD1抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因包含编码NI-204(12G7)的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.23和24，参见表5和图7B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:93(编码NI-202(12G7)重链Fab部分)和SEQ ID NO:94(编码NI-202(12G7)轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SOD1抗原结合结构域具有SEQ ID NO:23的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SOD1抗原结合结构域含有如图7B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ IDNO:210)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ ID NO:212)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQID NO:213)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:93的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:93)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含轻链的SOD1抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:24中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含重链的SOD1抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:23中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:24中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:23中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SOD1抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:23，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图7B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SOD1抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:24，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图7B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码高糖基化NI-202(12G7)Fab，其包含分别为SEQ ID NO:23和24的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L118N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SOD1抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个NI-202(12G7)CDR的核苷酸序列，所述CDR在图7B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SOD1抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗SOD1抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的AD或ALS的方法。所述抗体可为NI-202，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在某些实施方案中，所述患者已诊断患有前驱性AD(例如与早期AD或甚至前驱AD相关的轻度认知障碍)或ALS和/或具有与所述疾病相关的症状。
用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗SOD1疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有AD或ALS或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗SOD1抗体的治疗有反应或被视为抗SOD1抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用NI-202进行治疗，并且已发现对NI-202有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗SOD1抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗SOD1 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的AD或ALS的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗SOD1 HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有AD或ALS或具有所述疾病的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗SOD1 HuPTMmAb或抗SOD1 HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗SOD1 HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有AD或ALS或认为AD或ALS的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗SOD1 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图7A中所列的NI-202(10D12)的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:21)的氨基酸位置N110和/或N168或轻链(SEQ ID NO:22)的Q99、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有NI-204的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:21)的Y94或轻链(SEQ ID NO:22)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SOD1 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗SOD1 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图7B中所列的NI-202(12G7)的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:23)的氨基酸位置N110和/或N168或轻链(SEQ ID NO:24)的Q99、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有NI-204的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:23)的Y94或轻链(SEQ ID NO:24)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SOD1 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制AD或ALS的进展。在AD的情况下，可通过测量斑块形成的减少，和/或认知功能的改善，或认知功能减退的减少来监测功效。在ALS的情况下，可通过测量语言改善，和/或笨拙、异常肢体疲乏和/或肌肉痉挛和颤搐的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗SOD1 HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于AD的治疗包括(但不限于)
(多奈哌齐)、
(加兰他敏)、
(雷斯替明)和
(多奈哌齐和美金刚)，并且与包括(但不限于)NI-204的抗SOD1药剂一起施用。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于ALS的治疗包括(但不限于)
(利鲁唑(riluzole))、
(依达拉奉(edaravone))、
(利鲁唑)和
(右美沙芬HBr和硫酸奎尼丁)，并且与包括(但不限于)NI-204的抗SOD1药剂一起施用。
5.3.7.用于偏头痛和丛集性头痛的抗CGRPR HuPTM构建体和制剂.
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于抑钙素基因相关肽受体(CGRPR)并且可有益于治疗偏头痛和丛集性头痛(统称为头痛病)。在某些实施方案中，HuPTM mAb是伊普汀单抗、福瑞满单抗、伽奈珠单抗或前述中的一者的抗原结合片段。这些抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图8A至图8C中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有偏头痛和丛集性头痛或具有所述疾病的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码CGRPR结合HuPTMmAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于CGRPR的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于CGRPR的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如伊普汀单抗、福瑞满单抗、伽奈珠单抗或如本文中详述或根据本文中的细节的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗CGRPR抗原结合片段(例如参见Courtois等人,2016,mAbs 8:99-112，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因包含编码伊普汀单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.25和26，参见表5和图8A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:95(编码伊普汀单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:96(编码伊普汀单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CGRPR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:25的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CGRPR抗原结合结构域含有如图8A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:95的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:95)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:296(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链的CGRPR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:26中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含重链的CGRPR抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:25中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:26中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:25中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:26，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码高糖基化伊普汀单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:25和26的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L106N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个伊普汀单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图8A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CGRPR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因包含编码福瑞满单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.27和28，参见表5和图8B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:97(编码福瑞满单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:98(编码福瑞满单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CGRPR抗原结合结构域具有SEQID NO:27的重链Fab片段，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CGRPR抗原结合结构域含有如图8B中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:97的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:97)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:297(表7)或IgG2Fc结构域，例如SEQ ID No.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链的CGRPR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:28中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含重链的CGRPR抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:27中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:28中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:27中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:27，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:28，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码高糖基化福瑞满单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:27和28的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L117N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个福瑞满单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图8B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CGRPR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因包含编码伽奈珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.29和30，参见表5和图8C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:99(编码伽奈珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:100(编码伽奈珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CGRPR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:29的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CGRPR抗原结合结构域含有如图8C中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEAAGG(SEQ IDNO:431)或ESKYGPPCPSCPAPEAAGG(SEQ ID NO:432)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQID NO:99的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:99)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:298(表7)或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链的CGRPR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:30中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含重链的CGRPR抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:29中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:30中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:29中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CGRPR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:30，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图8C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码高糖基化伽奈珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:29和30的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T114N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CGRPR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个伽奈珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图8C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CGRPR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗CGRPR抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的偏头痛和丛集性头痛的方法。所述抗体可为伊普汀单抗、福瑞满单抗或伽奈珠单抗，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段，或者是具有Fc区的全长抗CGRPR抗体。在某些实施方案中，所述患者已被诊断患有间歇性偏头痛或慢性偏头痛和/或具有与所述疾病相关的症状。在某些实施方案中，所述患者已被诊断患有间歇性丛集性头痛或慢性丛集性头痛和/或具有与所述疾病相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1中并显示于图8A至图8C中。此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用重组载体。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗CGRPR疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有偏头痛或丛集性头痛或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗CGRPR抗体的治疗有反应或被视为抗CGRPR抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用伊普汀单抗、福瑞满单抗或伽奈珠单抗进行治疗，并且已发现对伊普汀单抗、福瑞满单抗和伽奈珠单抗中的一者或多者有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗CGRPR抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在人类细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗CGRPR HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的偏头痛或丛集性头痛的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗CGRPR HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体鞘内施用(特别是脑池内或腰椎施用)或静脉内施用至被诊断患有偏头痛或丛集性头痛或具有所述疾病的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在CNS中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗CGRPR HuPTM mAb或抗CGRPR HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导CNS细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗CGRPR HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有偏头痛或丛集性头痛或认为偏头痛或丛集性头痛的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图8A中所列的伊普汀单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:25)的氨基酸位置Q103和/或N153或轻链(SEQ ID NO:26)的N21、N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有伊普汀单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:25)的Y32、Y33和/或Y93，和/或轻链(SEQ ID NO:26)的Y87和/或Y88处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图8B中所列的福瑞满单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:27)的氨基酸位置Q114、N164、N197和/或N206或轻链(SEQ ID NO:28)的N93、Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有福瑞满单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:27)的Y96、Y97和/或Y203或轻链(SEQ ID NO:28)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图8C中所列的伽奈珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:29)的氨基酸位置Q111、N161和/或N203或轻链(SEQ ID NO:30)的N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有厄瑞奴单抗(erenumab)的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:29)的Y32和/或Y33和/或Y93，和/或轻链(SEQ ID NO:30)的Y86和/或Y87和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTMmAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被2,6唾液酸化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化2,6唾液酸化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于预防或减轻偏头痛、丛集性头痛或与其相关的症状中的一者或多者的强度或频率，所述症状包括恶心、光敏感、声音敏感、红眼、眼睑浮肿、前额和面部出汗、流眼泪(流泪)、瞳孔大小异常地小(瞳孔缩小)、鼻塞、流鼻涕(鼻漏)和眼睑下垂(上睑下垂)。可通过测量偏头痛或丛集性头痛的强度或频率的降低，或在限定时间段内使用急性偏头痛特异性药物的量的减少来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗CGRPR HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。仅举几例，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于丛集性头痛或偏头痛的治疗包括(但不限于)翠普登(triptans)、麦角胺衍生物和NSAID，并且与包括(但不限于)伊普汀单抗、福瑞满单抗和伽奈珠单抗的抗CGRPR药剂一起施用。
5.3.8.用于眼部病症的抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ和抗激肽释放酶HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段分别结合于血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素受体(EPOR)、来源于淀粉样前体蛋白的Aβ肽或激肽释放酶并且被指示用于治疗一种或多种视网膜病症，包括糖尿病性视网膜病变、近视脉络膜新生血管(mCNV)、黄斑变性(例如新生血管性(湿性)或干性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、黄斑水肿(例如视网膜静脉栓塞(RVO)后的黄斑水肿或糖尿病性黄斑水肿(DME))。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有赛伐珠单抗、LKA-651、GSK933776、仑卡奈单抗或拉那鲁单抗，或前述中的一者的抗原结合片段的氨基酸序列。赛伐珠单抗、LKA-651、索拉珠单抗、GSK933776、仑卡奈单抗和拉那鲁单抗的Fab片段的氨基酸序列分别提供于图9A至图9C、图2A至图2C和图19中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有视网膜病症(例如糖尿病性视网膜病变、mCNV、黄斑变性或黄斑水肿)或具有所述疾病的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码VEGF结合、EPOR结合、Aβ结合或激肽释放酶结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物，包括scFv)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于VEGF、EPOR、Aβ或激肽释放酶的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于VEGF、EPOR、Aβ或激肽释放酶的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如赛伐珠单抗、LKA-651、索拉珠单抗、仑卡奈单抗、GSK933776或拉那鲁单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ、抗激肽释放酶抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因包含编码赛伐珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.31和32，参见表5和图9A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:101(编码赛伐珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:102(编码赛伐珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗VEGF抗原结合结构域具有SEQ ID NO:31的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗VEGF抗原结合结构域含有如图9A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:101的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:101)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:299(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因编码包含轻链的VEGF抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:32中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因编码包含重链的VEGF抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:31中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:32中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:31中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，VEGF抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:31，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，VEGF抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因编码高糖基化赛伐珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:31和32的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L117N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗VEGF抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个赛伐珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图9A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗VEGF抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因包含编码LKA-651(NVS2)的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.33和34，参见表5和图9B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:103(编码LKA-651(NVS2)重链Fab部分)和SEQ ID NO:104(编码LKA-651(NVS2)轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗EPOR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:33的重链可变结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗EPOR抗原结合结构域含有如图9B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:103的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:103)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含轻链的EPOR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:34中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含重链的EPOR抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:33中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:34中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:33中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，EPOR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:33，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，EPOR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:34，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码高糖基化LKA-651(NVS2)Fab，其包含分别为SEQ ID NO:33和34的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L112N(重链)和/或Q195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个LKA-651(NVS3)CDR的核苷酸序列，所述CDR在图9C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗EPOR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因包含编码LKA-651(NVS3)的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.35和36，参见表5和图9C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:105(编码LKA-651(NVS3)重链Fab部分)和SEQ ID NO:106(编码LKA-651(NVS3)轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗EPOR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:35的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗EPOR抗原结合结构域含有如图9C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:105的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:105)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含轻链的EPOR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:36中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含重链的EPOR抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:35中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:36中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:35中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，EPOR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:35，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，EPOR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:36，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图9C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码高糖基化LKA-651(NVS3)Fab，其包含分别为SEQ ID NO:35和36的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L122N(重链)和/或Q195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗EPOR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个LKA-651(NVS3)CDR的核苷酸序列，所述CDR在图9C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗EPOR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因包含编码索拉珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.1和2，参见表5和图2A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:71(编码索拉珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:72(编码索拉珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除包括重链和轻链可变结构域以及CL CH1的Fab片段以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Aβ抗原结合结构域具有SEQ IDNO:1的重链可变结构域和CH1结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Aβ抗原结合结构域含有如图2A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:71的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:71)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如表7的SEQ ID NO:290、SEQ ID NO.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链的Aβ抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含重链的Aβ抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:1中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码高糖基化索拉珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:1和2的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L107N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个索拉珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图2A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Aβ抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因包含编码GSK933776的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.3和4，参见表5和图2B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:73(编码GSK933776重链Fab部分)和SEQ ID NO:74(编码GSK933776轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗Aβ抗原结合结构域具有SEQ ID NO:3的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗Aβ抗原结合结构域含有如图2B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA(SEQ ID NO:202)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQ ID NO:204)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELAGAPSVFL(SEQID NO:205)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:73的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:73)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:291(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链的Aβ抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:4中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含重链的Aβ抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:3中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:4中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:3中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:3，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，Aβ抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图2B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码高糖基化GSK933776Fab，其包含分别为SEQ ID NO:3和4的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L110N(重链)、Q165N或Q165S(轻链)，和/或E200N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗Aβ抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个GSK933776CDR的核苷酸序列，所述CDR在图2B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗Aβ抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
抗激肽释放酶构建体以及HuPTM mAb和HuPTM Fab详细描述于下文章节5.3.18中。提供了用于抗激肽释放酶抗体拉那鲁单抗的表达的转基因，其序列提供于表8中。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗VEGF抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的一种或多种视网膜病症(例如糖尿病性视网膜病变、mCNV、黄斑变性或黄斑水肿)的方法。所述抗体可为赛伐珠单抗，或其Fab片段或其任何抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有上文所列的各种视网膜病症中的一者或多者，和/或具有与其相关的症状。
还提供了通过施用含有编码抗EPOR抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的一种或多种视网膜病症(例如糖尿病性视网膜病变、mCNV、黄斑变性或黄斑水肿)的方法。所述抗体可为LKA-651，或其Fab片段或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有上文所列的各种视网膜病症中的一者或多者，和/或具有与其相关的症状。
进一步提供了通过施用含有编码抗Aβ抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的干性AMD变性的方法。抗体或其Fab片段可为索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776。在实施方案中，患者已被诊断患有干性AMD和/或具有与其相关的症状。
提供了通过施用含有编码抗激肽释放酶抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的糖尿病性视网膜病变或糖尿病性黄斑水肿的方法。所述抗体可为拉那鲁单抗或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有上文所列的各种视网膜病症中的一者或多者，和/或具有与其相关的症状。在特定实施方案中，转基因是表8中的编码拉那鲁单抗的转基因。
用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8衣壳的载体可用于眼部适应症。可以使得重组载体进入视网膜的任何方式，例如通过将重组载体引入至眼睛中来施用重组载体(例如图9A至图9C、图2A至图2C和图19中所示的重组载体)。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶抗体有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有一种或多种视网膜病症或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶抗体的治疗有反应或被视为抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用赛伐珠单抗、LKA-651、索拉珠单抗、仑卡奈单抗、GSK933776或拉那鲁单抗进行治疗并且已发现对赛伐珠单抗、LKA-651、索拉珠单抗、仑卡奈单抗、GSK933776或拉那鲁单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的一种或多种视网膜病症的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ、抗激肽释放酶HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用至被诊断患有一种或多种视网膜病症或具有所述病症的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导视网膜细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ或抗激肽释放酶HuPTM mAb或HuPTM Fab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有视网膜病症的认为视网膜病症的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗VEGF HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图9A中所列的赛伐珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:31)的氨基酸位置N32和/或N164或轻链(SEQID NO:32)的N22、N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有赛伐珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:31)的Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:32)的Y88和/或Y89处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗VEGF HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗EPOR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图9B中所列的LKA-651(NVS2)的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:33)的氨基酸位置Q109和/或N159或轻链(SEQ ID NO:34)的N68和/或N171中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有LKA-651(NVS2)的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:33)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:34)的Y85、Y86和/或Y96处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗EPOR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗EPOR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图9C中所列的LK-651(NVS3)的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:35)的氨基酸位置N32、N80和/或N169或轻链(SEQ ID NO:36)的N68和/或N171中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有LKA-651(NVS3)的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:35)的Y97和/或Y98，和/或轻链(SEQ ID NO:36)的Y30、Y31、Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗EPOR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图2A中所列的索拉珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置N56、Q104和/或N154或轻链(SEQ ID NO:2)的Q105、N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有索拉珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:1)的Y94、Y95和/或Y101或轻链(SEQ ID NO:2)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗AβHuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的NeuGc部分和/或不含任何可检测(例如通过本领域中已知的测定法，例如下文章节5.2中所描述的那些测定法检测)的α-Gal部分。在某些实施方案中，抗Aβ-HuPTM mAb是具有Fc区，例如SEQ IDNO:283、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:285的Fc结构域，或其突变体或变体的全长mAb。
在特定实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图2B中所列的GSK933776的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:3)的氨基酸位置N32、Q107和/或N157或轻链(SEQ ID NO:4)的N163和/或N215中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有GSK933776的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:3)的Y94和/或Y95或轻链(SEQ ID NO:4)的Y91和/或Y92处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制视网膜病症的进展，和/或抑制血管生成。在视网膜病症的情况下，可通过监测视觉锐度来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度相比于基线的变化来监测功效。(参见例如美国卫生和公共服务部、食品药品监督管理局药物评估与研究中心、生物技术评估与研究中心.关于行业的指南：批准癌症药物和生物制剂的临床试验终点(clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs andbiologics).https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm071590.pdf.于2007年5月发布.2017年10月13日获取；Oncology Endpoints in a ChangingLandscape.Manag.Care.2016；1(增刊):1-12)。
本文所提供的方法涵盖将抗VEGF、抗EPOR或抗Aβ HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至视网膜以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于糖尿病性视网膜病变、mCNV、黄斑变性或黄斑水肿的治疗包括(但不限于)激光光凝(laser photocoagulation)、使用维替泊芬(verteporfin)的光动力疗法、阿柏西普(aflibercept)和/或玻璃体内类固醇，并且与抗VEGF、抗EPOR、抗Aβ药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)赛伐珠单抗、LKA-651(NVS2)、LKA-651(NVS3)、索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776。
5.3.9.用于眼部病症的抗ALK1、抗C5和抗内皮糖蛋白HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段分别结合于激活素受体样激酶1(ALK1)、补体组分5(C5)或抗内皮糖蛋白(ENG)并且被指示用于治疗一种或多种眼部病症，包括由新生血管增加引起的视网膜疾病，例如nAMD(也称为“湿性”AMD)、干性AMD、视网膜静脉栓塞(RVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变(DR)或非感染性葡萄膜炎。在某些实施方案中，HuPTMmAb具有阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、卡妥昔单抗或前述中的一者的抗原结合片段的氨基酸序列。阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗和卡妥昔单抗的Fab片段的氨基酸序列分别提供于图10A至图10D。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有眼部病症(例如黄斑变性或黄斑部葡萄膜炎)或具有所述病症的一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码ALK1结合、C5结合或ENG结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物，包括scFv)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于ALK1、C5或ENG的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于ALK1、C5或ENG的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、卡妥昔单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗ALK1、抗C5或抗ENG抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因包含编码阿伐苏单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.37和38，参见表5和图10A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:107(编码阿伐苏单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:108(编码阿伐苏单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗ALK1抗原结合结构域具有SEQ ID NO:37的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗ALK1抗原结合结构域含有如图10A中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:107的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:107)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:300(表7)或IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID No.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因编码包含轻链的ALK1抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:38中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因编码包含重链的ALK1抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:37中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:38中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:37中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，ALK1抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:37，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，ALK1抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:38，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因编码高糖基化阿伐苏单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:37和38的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L113N(重链)、Q161N或Q161S(轻链)，和/或E196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗ALK1抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个阿伐苏单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗ALK1抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因包含编码特度鲁单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.39和40，参见表5和图10B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:109(编码特度鲁单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:110(编码特度鲁单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗C5抗原结合结构域具有SEQ ID NO:39的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗C5抗原结合结构域含有如10B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ ID NO:210)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ ID NO:212)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQID NO:213)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:109的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:109)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:301(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链的C5抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:40中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含重链的C5抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:39中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:40中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:39中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:39，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:40，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码高糖基化特度鲁单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:39和40的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L111N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个特度鲁单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗C5抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因包含编码卡妥昔单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.41和42，参见表5和图10C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:111(编码卡妥昔单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:112(编码卡妥昔单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗ENG抗原结合结构域具有SEQ ID NO:41的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗ENG抗原结合结构域含有如图10C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:111的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:111)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:302(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因编码包含轻链的ENG抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:42中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因编码包含重链的ENG抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:41中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:42中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:41中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，ENG抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:41，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，ENG抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:42，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因编码高糖基化卡妥昔单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:41和42的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T113N(重链)、Q159N或Q159S(轻链)，和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗ENG抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个卡妥昔单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗ENG抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因包含编码拉瓦利单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.362和363，参见表5和图10D)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:378(编码拉瓦利单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:379(编码拉瓦利单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类CNS细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列或见于上文表2中的序列的氨基酸序列。
除包括重链和轻链可变结构域以及CL CH1的Fab片段以外，转基因可在重链CH1序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗C5抗原结合结构域具有SEQ IDNO:362的重链可变结构域和CH1结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗C5抗原结合结构域含有如图10D中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ IDNO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ IDNO:378的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:378)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG2 Fc结构域，例如表7的SEQ ID NO:393、SEQ ID No.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链的C5抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:363中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含重链的C5抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:362中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:363中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:362中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:362，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:363，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码高糖基化拉瓦利单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:362和363的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L117N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个拉瓦利单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10D的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗C5抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗ENG、抗C5或抗ALK1抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的一种或多种眼部病症的方法。抗体或其Fab片段可为阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗或卡妥昔单抗。在实施方案中，患者已被诊断患有上文所列的各种眼部病症中的一者或多者，和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8或AAV9衣壳的载体可用于眼部适应症。重组载体(例如图10A至图10D中所示的重组载体)可以使得重组载体进入视网膜的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至眼睛中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗ALK1、抗C5或抗ENG有反应的受试者。在一些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有一种或多种视网膜病症或在抗C5抗体的情况下患有非感染性葡萄膜炎，或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗ALK1、抗C5或抗ENG抗体的治疗有反应或被视为抗ALK1、抗C5或抗ENG抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，患者先前已用阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗或卡妥昔单抗进行治疗并且已发现对阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗或卡妥昔单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗ALK1、抗C5或抗ENG或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗ALK1、抗C5或抗ENG HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的一种或多种视网膜病症的治疗或在来源于抗C5的那些抗体的情况下非感染性葡萄膜炎的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗ALK1、抗C5或抗ENG HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用至被诊断患有一种或多种视网膜病症或非感染性葡萄膜炎或具有所述病症的一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导视网膜细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗ALK1、抗C5或抗ENG HuPTMmAb或HuPTM Fab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有视网膜或眼部病症的认为视网膜或眼部病症的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗ALK1 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10A中所列的阿伐苏单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:37)的氨基酸位置N62、N78、Q110、N160、N193和/或N202，或轻链(SEQ ID NO:38)的Q101、N159和/或N211中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有阿伐苏单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTMmAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:37)的Y95、Y96和/或Y199，和/或轻链(SEQ IDNO:38)的Y87和/或Y88处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗ALK1 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10B中所列的特度鲁单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:39)的氨基酸位置N59、Q108和/或N158或轻链(SEQ ID NO:40)的N68、N95和/或N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有特度鲁单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:39)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:40)的Y30、Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10D中所列的拉瓦利单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:362)的氨基酸位置N63、N106、Q114、N164、N197和/或N206或轻链(SEQ ID NO:363)的N28、Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有拉瓦利单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:362)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQID NO:363)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗ENG HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10C中所列的卡妥昔单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:41)的氨基酸位置Q110和/或N160或轻链(SEQ ID NO:42)的N52、N93、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有卡妥昔单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:41)的Y95和/或Y96，和/或轻链(SEQ ID NO:42)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗ENG HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制眼部病症的进展。在视网膜病症的情况下，可通过监测视觉锐度来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度的变化来监测功效。在葡萄膜炎的情况下，可通过监测视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛相比于基线的变化来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗ALK1、抗C5或抗ENG HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至视网膜以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于黄斑变性的治疗包括(但不限于)激光光凝、使用维替泊芬的光动力疗法、阿柏西普、抗VEGF药剂和/或玻璃体内类固醇，并且与抗ALK1、抗C5或抗ENG药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗或卡妥昔单抗。在葡萄膜炎的情况下，可与本文所提供的基因疗法组合的可用于受试者的治疗包括(但不限于)硫唑嘌呤(azathioprine)、氨甲蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯、环孢素(cyclosporine)、环磷酰胺、皮质类固醇(局部和/或全身)和其他药物，并且与抗ALK1、抗C5或抗ENG药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗或卡妥昔单抗。
5.3.10.用于青光眼的抗CC1Q HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于补体组分1Q(CC1Q)并且被指示用于治疗青光眼。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有ANX-007或前述抗体的抗原结合片段的氨基酸序列。ANX-007的Fab片段的氨基酸序列提供于图11中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有青光眼或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码CC1Q结合HuPTMmAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物，包括scFv)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于CC1Q的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于CC1Q的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如ANX-007或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗CC1Q抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因包含编码ANX-007的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.43和44，参见表5和图11)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:113(编码ANX-007重链Fab部分)和SEQ ID NO:114(编码ANX-007轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CC1Q抗原结合结构域具有SEQ ID NO:43的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CC1Q抗原结合结构域含有如图11中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:113的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:113)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因编码包含轻链的CC1Q抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:44中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因编码包含重链的CC1Q抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:43中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:44中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:43中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CC1Q抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:43，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图11中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CC1Q抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:44，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图11中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因编码高糖基化ANX-007Fab，其包含分别为SEQ ID NO:43和44的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T116N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CC1Q抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个ANX-007CDR的核苷酸序列，所述CDR在图11的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CC1Q抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗CC1Q抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的青光眼的方法。抗体或其Fab片段可为ANX-007。在实施方案中，患者已被诊断患有上文所列的各种视网膜病症中的一者或多者，和/或具有与其相关的症状。
用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8或AAV9衣壳的载体可用于眼部适应症。重组载体(例如图11中所示的重组载体)可以使得重组载体进入视网膜的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至眼睛中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗CC1Q有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有青光眼或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗CC1Q抗体的治疗有反应或被视为抗CC1Q抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用ANX-007进行治疗，并且已发现对ANX-007有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗CC1Q或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗CC1Q HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的一种或多种视网膜病症的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗CC1Q HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用至被诊断患有青光眼或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导视网膜细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗CC1QHuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有青光眼或认为青光眼的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗CC1Q HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图11中所列的ANX-007的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:43)的氨基酸位置N59、Q113和/或N163，或轻链(SEQ ID NO:44)的N22、N30、Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有ANX-007的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:43)的Y60、Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:44)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CC1Q HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制青光眼的进展。在青光眼的情况下，可通过监测视觉锐度、眼痛或眼内压(IOP)来监测功效。例如，可通过评定IOP、视觉锐度和疼痛相比于基线的变化来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗CC1Q HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至视网膜以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于青光眼的治疗包括(但不限于)前列腺素(
和
)、α-肾上腺素能激动剂(
和
)、碳酸酐酶抑制剂(
和
)、拟副交感神经药(
)和/或β阻断剂(
)，并且与包括但不限于ANX-007的抗CC1Q药剂一起施用。
5.3.11.用于非感染性葡萄膜炎的抗TNFαHuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于肿瘤坏死因子-α(TNFα)(例如阿达木单抗(图12A)、英利昔单抗(图12B)或戈利木单抗(图12C))并且被指示用于治疗非感染性葡萄膜炎。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。所述抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图12A至图12C中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码TNFα结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于TNFα的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于TNFα的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗TNFα抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因包含编码阿达木单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.45和46，参见表5和图12A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:115(编码阿达木单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:116(编码阿达木单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TNFα抗原结合结构域具有SEQ ID NO:45的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗TNFα抗原结合结构域含有如图12A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:115的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:115)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:303(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链的TNFα抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:46中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含重链的TNFα抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:45中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:46中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:45中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:45，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:46，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码高糖基化阿达木单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:45和46的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L116N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个阿达木单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图12A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TNFα抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因包含编码英利昔单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.47和48，参见表5和图12B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:117(编码英利昔单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:118(编码英利昔单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TNFα抗原结合结构域具有SEQ ID NO:47的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗TNFα抗原结合结构域含有如图12B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:117的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:117)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:304(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链的TNFα抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:48中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含重链的TNFα抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:47中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:48中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:47中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:47，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码高糖基化英利昔单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:47和48的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T115N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图11A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个英利昔单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图12B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TNFα抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因包含编码戈利木单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.49和50，参见表5和图12C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:119(编码戈利木单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:120(编码戈利木单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TNFα抗原结合结构域具有SEQ ID NO:49的重链可变结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗TNFα抗原结合结构域含有如图12C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:119的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:119)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:305(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链的TNFα抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:50中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含重链的TNFα抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:49中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:50中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:49中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:49，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TNFα抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:50，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图12C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码高糖基化戈利木单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:49和50的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T124N(重链)、Q164N或Q164S(轻链)，和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TNFα抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个戈利木单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图12C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TNFα抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗TNFα抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的非感染性葡萄膜炎的方法。所述抗体可为阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有非感染性葡萄膜炎和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8或AAV9衣壳的载体可用于眼部适应症。重组载体(例如图12A至12C中所示的重组载体)可以使得重组载体进入视网膜的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至眼睛中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗TNFα疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗TNFα抗体的治疗有反应或被视为抗TNFα抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗进行治疗，并且已发现对阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗有反应。在其他实施方案中，患者先前已用抗TNFα抗体或融合蛋白(例如依那西普、赛妥珠单抗)或其他抗TNFα药剂进行治疗。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗TNFα抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗TNFαHuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的非感染性葡萄膜炎的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗TNFαHuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体静脉内施用至被诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
在特定实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图12A中所列的阿达木单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:45)的氨基酸位置N54、Q113和/或N163，或轻链(SEQ ID NO:46)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有阿达木单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:45)的Y32、Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:46)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图12B中所列的英利昔单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:47)的氨基酸位置N57、N101、Q112和/或N162，或轻链(SEQ ID NO:48)的N41、N76、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有英利昔单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:47)的Y96和/或Y97，和/或轻链(SEQ ID NO:48)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图12C中所列的戈利木单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:49)的氨基酸位置N80、Q121和/或N171，或轻链(SEQ ID NO:50)的N162和/或N214中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有戈利木单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:49)的Y112、Y113和/或Y114，和/或轻链(SEQ ID NO:50)的Y89和/或Y90处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制非感染性葡萄膜炎的进展或缓解其一个或多个症状，以便降低患者的疼痛、眼睛发红度、光敏感度和/或其他不适的程度。可通过测量疼痛、眼睛发红度和/或畏光的降低和/或视力改善来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于患有非感染性葡萄膜炎的受试者的治疗包括(但不限于)硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯、环孢素、环磷酰胺、皮质类固醇(局部和/或全身)和其他药剂，并且与抗TNFα药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗。
5.3.12.用于多发性硬化症的抗RGMa HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于排斥性导向分子A(RGMa)并且被指示用于治疗多发性硬化症(MS)。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有艾利扎单抗或前述抗体的抗原结合片段的氨基酸序列。艾利扎单抗的Fab片段的氨基酸序列提供于图13中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有MS或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码RGMa结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于RGMa的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于RGMa的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如艾利扎单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的RGMa整合素抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗RGMa抗原结合片段转基因包含编码艾利扎单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.51和52，参见表5和图13)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:121(编码艾利扎单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:122(编码艾利扎单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗整合素抗原结合结构域具有SEQID NO:51的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗整合素抗原结合结构域含有如图13中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ ID NO:210)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ ID NO:212)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQID NO:213)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:121的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:121)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:306(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗整合素抗原结合片段转基因编码包含轻链的RGMa抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:52中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗RGMa抗原结合片段转基因编码包含重链的整合素抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:51中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗RGMa抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:52中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:51中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，RGMa抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:51，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图13中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，整合素抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:52，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图13中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗RGMa抗原结合片段转基因编码高糖基化艾利扎单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:51和52的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L115N(重链)，和/或Q197N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗RGMa抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个艾利扎单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图13的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗RGMa抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，所述AAV载体包含病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:72)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:73)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗RGMa mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗RGMa抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的MS的方法。所述抗体可为艾利扎单抗(elenazumab)并且是例如全长抗体或其Fab片段或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有MS和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1和5.4.2中。在一些实施方案中，此类载体应对人类肝脏细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图13中所示的重组载体)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见5.5.2。在其他实施方案中，此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。重组载体(例如图13中所示)可以使得重组载体进入CNS的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗RGMa疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有MS或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗RGMa抗体的治疗有反应或被视为抗RGMa抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用艾利扎单抗进行治疗，并且已发现对艾利扎单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗RGMa抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗RGMa HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的MS的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗RGMa HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体皮下、肌肉内或静脉内施用至被诊断患有MS或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肝脏、肌肉或CNS组织中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞、肌肉细胞或CNS细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗RGMa HuPTMmAb或抗RGMa HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，在一些实施方案中，信号序列可具有选自表2、表3或表4中所列的对应于分别由CNS细胞、肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗RGMa HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有MS并且认为MS的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗RGMa HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图13中所列的艾利扎单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:51)的氨基酸位置N57、Q112和/或N162或轻链(SEQ ID NO:52)的N71和/或N173中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有艾利扎单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:51)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:52)的Y88和/或Y89处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗RGMa HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制MS的进展，特别是减少患者的疼痛和不适和/或改善行动能力。可通过对受侵袭组织的症状或病变程度进行评分来监测功效。例如，关于MS，可通过评定复发频率(例如按年计算的复发率)、身体残疾状况(例如对库茨科扩展残疾状况量表(Kurtzke Expanded Disability Status Scale；EDSS)进行评分)和生物标志物，包括使用MRI进行大脑扫描(例如经由磁共振成像评估T1-加权钆(Gd)增强病变和T2高强度病变)来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗RGMa HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至CNS、肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于MS的治疗包括(但不限于)干扰素β、干扰素β1a、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、环磷酰胺、皮质类固醇、免疫调节剂(例如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和/或氨甲蝶呤)和米托蒽醌(mitoxantrone)并且与包括(但不限于)艾利扎单抗的抗RGMa药剂一起施用。
5.3.13用于淀粉样变性的抗TTR HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于转甲状腺素蛋白(TTR)(特别是折叠异常或病原性TTR)并且被指示用于治疗家族性或野生型淀粉样蛋白转甲状腺素蛋白(ATTR)淀粉样变性、家族性淀粉样蛋白心肌病(FAC)和/或家族性淀粉样蛋白多发性神经病变(FAP)。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有NI-301或PRX-004或其抗原结合片段的氨基酸序列。NI-301和PRX-004的Fab片段的氨基酸序列分别提供于图14A和图14B中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有淀粉样变性、FAP和/或FAC或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码TTR结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于TTR的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于TTR的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如NI-301、PRX-004或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗TTR抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因包含编码NI-301的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.53和54，参见表5和图14A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:123(编码NI-301重链Fab部分)和SEQ ID NO:124(编码NI-301轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TTR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:53的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述TTR抗原结合结构域含有如图14A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:123的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:123)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含轻链的TTR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:54中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含重链的TTR抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:53中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:54中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:53中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TTR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:53，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图14A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TTR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:54，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图14A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码高糖基化NI-301Fab，其包含分别为SEQ ID NO:53和54的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M115N(重链)、Q159N或Q159S(轻链)，和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个NI-301CDR的核苷酸序列，所述CDR在图14A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TTR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因包含编码PRX-004的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.55和56，参见表5和图14B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:125(编码PRX-004重链Fab部分)和SEQ ID NO:126(编码PRX-004轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TTR抗原结合结构域具有SEQ ID NO:55的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗TTR抗原结合结构域含有如图14B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:125的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:125)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:307(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含轻链的TTR抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:56中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含重链的TTR抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:55中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:56中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:55中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TTR抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:55，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图14B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TTR抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:56，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图14B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码高糖基化PRX-004Fab，其包含分别为SEQ ID NO:55和56的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L112N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TTR抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个PRX-004CDR的核苷酸序列，所述CDR在图14B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TTR抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗TTR抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的ATTR、FAT或FAC的方法。所述抗体可为NI-301、PRX-004并且是例如全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有ATTR、FAC或FAT和/或具有与其相关的症状。
提供了通过施用含有编码抗TTR抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的ATTR、FAC和FAT的方法。所述抗体可为NI-301或PRX-004，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有ATTR、FAT或FAC和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.1和5.4.2中。在一些实施方案中，此类载体应对人类肝脏细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图14A和图14B中所示的重组载体)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见5.5.2。在其他实施方案中，此类载体应对人类CNS细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。重组载体(例如图14A和图14B所示)可以使得重组载体进入CNS的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.1。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗TTR疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有ATTR、FAP或FAC或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗TTR抗体的治疗有反应或被视为抗TTR抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用PRX-004或NI-301进行治疗，并且已发现对PRX-004或NI-301有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗TTR或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗TTR HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的ATTR、FAC或FAP的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗TTR HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体皮下、肌肉内或静脉内施用至被诊断患有ATTR、FAC或FAP或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肌肉或肝脏中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肌肉细胞或肝脏细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗TTR HuPTMmAb或抗TTR HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肌肉细胞或肝脏细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌肉细胞或肝脏细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗TTR HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有ATTR、FAP或FAC的认为适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗TTR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图14A中所列的NI-301的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:53)的氨基酸位置N58、N78、N83、Q112和/或N161或轻链(SEQ ID NO:54)的Q99、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有NI-301的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:53)的Y95和/或Y96，和/或轻链(SEQ ID NO:54)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TTR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗TTR HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图14B中所列的PRX-004的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:55)的氨基酸位置N76、Q109和/或N159或轻链(SEQ ID NO:56)的N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有PRX-004的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:55)的Y93和/或Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:56)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TTR HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制所治疗的疾病的进展或减轻其一个或多个症状。在ATTR的情况下，可通过评定一个或多个淀粉样变性终点，包括通过测量器官受损的进程、淀粉样蛋白原纤维组织沉积物的量和/或器官功能(即，肾脏和肝脏)的改善来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗TTR HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肌肉或肝脏以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于ATTR的治疗包括(但不限于)化学治疗剂(例如烷基化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和有丝分裂抑制剂)、来那度胺(lenalidomide)
泊利度胺(pomalidomide)
沙立度胺(thalidomide)
达雷木单抗(daraumumab)
埃罗妥珠单抗(elotuzumab)
硼替佐米(bortezomib)
依萨佐米(ixazomib)
和/或卡非佐米(carfilzomib)
并且与包括(但不限于)NI-301和PRX-004的抗TTR药剂一起施用。
5.3.14用于纤维化疾病的抗CTGF HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于结缔组织生长因子(CTGF)并且被指示用于治疗一种或多种纤维化病症，包括肺纤维化、囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、心房纤维化、心内膜纤维化、陈旧性心肌梗塞、关节纤维化、克罗恩病、纵隔纤维化、骨髓纤维化(MF)、肾源性系统性纤维化(NSF)、进行性大块纤维化(PMF)和腹膜后纤维化(RPF)。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有帕姆单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。帕姆单抗的Fab片段的氨基酸序列提供于图15中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有纤维化病症或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码CTGF结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于CTGF的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于CTGF的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如帕姆单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗CTGF抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因包含编码帕姆单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.57和58，参见表5和图15)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:127(编码帕姆单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:128(编码帕姆单抗轻链Fab部分)。在治疗纤维化疾病的情况下，重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CTGF抗原结合结构域具有SEQ ID NO:57的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CTGF抗原结合结构域含有如图15中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ IDNO:210)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQ ID NO:212)或EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL(SEQID NO:213)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:127的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:127)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:308(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因编码包含轻链的CTGF抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:58中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因编码包含重链的CTGF抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:57中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:58中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:57中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CTGF抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:57，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图15中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CTGF抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图15中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因编码高糖基化帕姆单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:57和58的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L111N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CTGF抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个帕姆单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图15的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CTGF抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗CTGF抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的一种或多种纤维化病症(例如IPF)的方法。所述抗体可为帕姆单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有一种或多种纤维化病症和/或具有与其相关的症状。
用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。为了递送至肝脏，用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肝脏细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图15中所示的重组载体)可以使得重组载体进入肝脏的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗CTGF疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有一种或多种纤维化病症或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗CTGF抗体的治疗有反应或被视为抗CTGF抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用帕姆单抗进行治疗，并且已发现对帕姆单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗CTGF或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗CTGF HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的一种或多种纤维化病症的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗CTGF HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体皮下、肌肉内或静脉内施用至被诊断患有一种或多种纤维化病症的人类受试者(患者)，以在肝脏或肌肉中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗CTGF HuPTMmAb或抗CTGF HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肌肉细胞或肝脏细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌肉细胞或肝脏细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗CTGF HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有纤维化病症的认为纤维化病症的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗CTGF HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图15中所列的帕姆单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:57)的氨基酸位置N59、Q108和/或N158或轻链(SEQ ID NO:58)的N68、N95和/或N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有帕姆单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:57)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:58)的Y30、Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CTGF HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制所治疗的疾病的进展或减轻其一个或多个症状。在CF的情况下，可通过评定第一秒最大吐气量(FEV1)、肺恶化频率降低、生活质量(QoL)改善和较年轻患者的生长改善来监测功效。(例如参见VanDevanter和Konstan,“Outcome measurement for clinical trials assessing treatment of cysticfibrosis lung disease”Clin.Investig.2(2):163-175(2012))。在肺纤维化的情况下，可通过评定肺活量(LVC)、运动性脱氧饱和(desaturation with exertion)和一氧化碳肺弥漫量(DLCO)来监测功效。在IPF的情况下，可通过评定6分钟行走测试期间的呼吸困难、FVC、DLCO、脱氧饱和的程度、高分辨率计算机断层摄影(HRCT)的蜂窝化程度或肺高压或肺气肿的存在来监测功效。在肝硬化的情况下，可通过评定肝静脉压力梯度(HVPG)和肝纤维化阶段来监测功效。在心房纤维化的情况下，可通过使用显影剂增强的延迟增强MRI(DE-MRI)定位心房中的结构重塑(SRM)和/或纤维化并对其程度进行量化来监测功效。在心内膜纤维化的情况下，可通过评定心室的内膜的纤维化病变来监测功效。在关节纤维化的情况下，可通过评定受侵袭关节中涉及纤维化的范围来监测功效(例如MRI)。在克罗恩病的情况下，可通过使用先进成像技术评定血清学标志物(例如纤维结合蛋白、CRP、bFGF、ASCA)的水平和/或纤维化病变程度来监测功效。在纵隔纤维化的情况下，可通过使用显影剂增强CT评定纤维化、多形性炎性浸润和静脉炎的存在和/或程度来监测功效。在骨髓纤维化的情况下，可通过评定血清中炎性细胞因子的水平、血球计数(PLT、WBC、RBC)、骨髓纤维化(网硬蛋白和胶原蛋白)程度、脾脏大小和/或全身症状相较于基线的变化来监测功效。在肾源性系统性纤维化的情况下，可通过评定肾小球滤过率(GFR)相比于基线的变化、纤维化的定量和/或皮肤变暗，和/或涉及区域中的灼痛、瘙痒和/或剧烈刺痛的减少来监测功效。在进行性大块纤维化的情况下，可通过肺功能改善和/或肺中致密纤维化聚结块的大小减小来监测功效。在腹膜后纤维化的情况下，可通过评定下背和/或腹部疼痛的减少、贫血、异常皮肤变色和/或生活质量的改善来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗CTGF HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肌肉或肝脏以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于CF的治疗包括(但不限于)抗生素、疫苗和咳嗽药(例如乙酰半胱氨酸和阿法脱氧核糖核酸酶(dornasa alfa))，并且与包括(但不限于)帕姆单抗的抗CTGF一起施用。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于IPF的治疗包括(但不限于)氧气疗法、肺部复健(pulmonary rehabilitation)、尼达尼布(Nintedanib)
吡非尼酮(Pirfenidone)
皮质类固醇(泼尼松(prednisone))、霉酚酸吗啉乙酯/霉酚酸
和硫唑嘌呤
并且与包括(但不限于)帕姆单抗的抗CTGF一起施用。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于肝硬化的治疗包括(但不限于)利尿剂(例如螺内酯、美托拉宗(metolazone)和呋塞米(frusemide))、氨还原剂、β阻断剂、合成激素(例如奥曲肽(octeotride))、抗生素和抗病毒药。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于心房纤维化的治疗包括(但不限于)物理消融、β阻断剂、抗凝血剂、钙离子通道阻断剂、皮质类固醇(例如泼尼松)、非类固醇消炎药和抗心律不整药(地高辛(digoxin))。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于心内膜纤维化的治疗包括(但不限于)手术、抗凝血剂、ACE抑制剂、皮质类固醇(例如泼尼松)、非类固醇消炎药、利尿剂(例如螺内酯、美托拉宗和呋塞米)或其他抗炎剂和抗心律不整药(地高辛)。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于陈旧性心肌梗塞的治疗包括(但不限于)β阻断剂、抗凝血剂、他汀类药物、硝酸甘油和ACE抑制剂。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于关节纤维化的治疗包括(但不限于)手术、物理疗法、皮质类固醇注射、非类固醇消炎药和低温疗法。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于克罗恩病的治疗包括(但不限于)维生素D、抗炎剂、非类固醇抗炎剂、皮质类固醇、免疫抑制剂(例如
阿达木单抗、氨甲蝶呤、巯基嘌呤或硫唑嘌呤)和抗生素。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于纵隔纤维化的治疗包括(但不限于)他莫昔芬(tamoxifen)、抗炎剂、非类固醇抗炎剂(例如吲哚美辛(indocin))、皮质类固醇、免疫抑制剂(例如
阿达木单抗、氨甲蝶呤、巯基嘌呤或硫唑嘌呤)。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于MF的治疗包括(但不限于)鲁索替尼(ruxolitinib)、沙立度胺、雄激素疗法、输血、化学治疗剂和脾脏放射治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于NSF的治疗包括(但不限于)氧气疗法和支气管扩张剂。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于RPF的治疗包括(但不限于)皮质类固醇、免疫抑制剂(例如霉酚酸吗啉乙酯、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤或环磷酰胺)和他莫昔芬。
5.3.15.用于NMO和非感染性葡萄膜炎和有害免疫反应的抗IL6R、抗IL6和抗CD19HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于白细胞介素-6受体(IL6R)、白细胞介素-6(IL6)或分化簇19(CD19)，来源于抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体，例如赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗(图16A至图16I)并且被指示用于治疗非感染性葡萄膜炎、视神经脊髓炎(NMO)、糖尿病性视网膜病变(DR)或糖尿病性黄斑水肿(DME)。还描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于白细胞介素-6受体(IL6R)或白细胞介素-6(IL6)，来源于抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体，例如赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗(图16A至图16H)并且被指示用于治疗、抑制或改善有害免疫反应，例如与病毒或细菌感染或施用免疫促进治疗剂(例如免疫肿瘤学抗体、基于蛋白质或细胞的疗法，例如CAR-T疗法)相关的炎症、细胞因子释放综合征等。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、英比利珠单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。所述抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图16A至图16I中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有非感染性葡萄膜炎、NMO、DR或DME或具有其一个或多个症状或替代地需要治疗、抑制或改善有害免疫反应的患者(人类受试者)施用编码IL6R结合、IL6结合或CD19结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于IL6R、IL6或CD19的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于IL6R、IL6或CD19的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、英比利珠单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗IL6R、IL6或抗CD19抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因包含编码赛他利单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.59和60，参见表5和图16A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:129(编码赛他利单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:130(编码赛他利单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6R抗原结合结构域具有SEQ ID NO:59的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述IL6R抗原结合结构域含有如图16A中所列的氨基酸序列ERKSCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:433)或ERKSCVECPPCPA(SEQ ID NO:434)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:129的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:129)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:309(表7)或IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID No.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6R抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:60中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6R抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:59中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:60中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:59中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:59，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码高糖基化赛他利单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:59和60的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L114N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个赛他利单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6R抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因包含编码赛瑞单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.61和62，参见表5和图16B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:131(编码赛瑞单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:132(编码赛瑞单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6R抗原结合结构域具有SEQ ID NO:61的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6R抗原结合结构域含有如图16B中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:131的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:131)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:310(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6R抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:62中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6R抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:61中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:62中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:61中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:61，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码高糖基化赛瑞单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:61和62的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M111N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个赛瑞单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6R抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因包含编码托珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.341和342，参见表5和图16H)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:353(编码托珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:354(编码托珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6R抗原结合结构域具有SEQ ID NO:341的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6R抗原结合结构域含有如图16H中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQID NO:353的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:353)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:359(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6R抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:342中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6R抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:341中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:342中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:341中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:341，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16H中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6R抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:342，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16H中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码高糖基化托珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:341和342的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L115N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6R抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个托珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16H的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6R抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因包含编码司妥昔单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.331和332，参见表5和图16C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:343(编码司妥昔单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:344(编码司妥昔单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6抗原结合结构域具有SEQ ID NO:331的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6抗原结合结构域含有如图16C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:343的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:343)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:355(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:332中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:331中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:332中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:331中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:331，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:332，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码高糖基化司妥昔单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:331和332的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：S114N(重链)、Q159N或Q159S(轻链)，和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个司妥昔单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因包含编码克拉扎珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.333和334，参见表5和图16D)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:345(编码克拉扎珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:346(编码克拉扎珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6抗原结合结构域具有SEQ ID NO:333的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6抗原结合结构域含有如图16D中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:345的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:345)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:356(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:334中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:333中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:334中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:333中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:333，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:334，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码高糖基化克拉扎珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:333和334的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L115N(重链)、Q163N或Q163S(轻链)，和/或E198N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个克拉扎珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16D的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因包含编码思鲁库单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.335和336，参见表5和图16E)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:347(编码思鲁库单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:348(编码思鲁库单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6抗原结合结构域具有SEQ ID NO:335的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6抗原结合结构域含有如图16E中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:347的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:347)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:357(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:336中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:335中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:336中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:335中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:335，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16E中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:336，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16E中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码高糖基化思鲁库单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:335和336的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T114N(重链)、Q159N或Q159S(轻链)，和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个思鲁库单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16E的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因包含编码奥洛奇单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.337和338，参见表5和图16F)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:349(编码奥洛奇单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:350(编码奥洛奇单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6抗原结合结构域具有SEQ ID NO:337的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6抗原结合结构域含有如图16F中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ IDNO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:349的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:349)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:358(表7)或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:338中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:337中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:338中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:337中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:337，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16F中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:338，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16F中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码高糖基化奥洛奇单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:337和338的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L115N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个奥洛奇单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16F的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因包含编码吉瑞利单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.339和340，参见表5和图16G)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:351(编码吉瑞利单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:352(编码吉瑞利单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL6抗原结合结构域具有SEQ ID NO:339的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL6抗原结合结构域含有如图16G中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:351的3'端处的核苷酸序列由表7中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:351)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有IgG1 Fc结构域，例如SEQ ID No.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL6抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:340中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含重链的IL6抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:339中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:340中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:339中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:339，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16G中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL6抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:340，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16G中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码高糖基化吉瑞利单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:339和340的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M117N(重链)和/或Q198N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL6抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个吉瑞利单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16G的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL6抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因包含编码英比利珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.63和64，参见表5和图16I)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:133(编码英比利珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:134(编码英比利珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗CD19抗原结合结构域具有SEQ ID NO:63的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗CD19抗原结合结构域含有如图16C中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:133的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:133)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:311(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因编码包含轻链的CD19抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:64中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因编码包含重链的CD19抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:63中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:64中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:63中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，CD19抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:63，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16I中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，CD19抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图16I中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因编码高糖基化英比利珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:63和64的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L116N(重链)、Q164N或Q164S(轻链)，和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗CD19抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个英比利珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图16I的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗CD19抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的NMO的方法。所述抗体可为赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗，并且是例如全长、基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。
还提供了通过施用含有编码抗IL6R抗体或抗IL6抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的非感染性葡萄膜炎、DR或DME的方法。所述抗体可为赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。
在实施方案中，患者已被诊断患有一种或多种眼部病症和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8或AAV9衣壳的载体可用于眼部适应症。重组载体(例如图16A至图16I中所示的重组载体)可以使得重组载体进入视网膜的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至眼睛中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
提供了通过施用含有编码抗IL6R或抗IL6抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗、抑制或改善人类受试者的有害免疫反应的方法。所述抗体可为赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗，并且是例如全长、基本上全长抗体或其Fab片段或其其他抗原结合片段。
在实施方案中，患者已经诊断具有有害免疫反应(例如与病毒或细菌感染相关的炎症或细胞因子风暴)和/或具有与其相关的症状，或者需要用以控制不良副作用(包括预防性地控制)的疗法，所述不良副作用例如可由细菌或病毒感染或免疫治疗剂(例如免疫肿瘤学治疗剂或基于免疫细胞的疗法，例如基于CAR-T细胞的疗法)引发的炎症和/或细胞因子释放综合征。病毒感染包括流感、例如SARS-CoV-2的冠状病毒或其他冠状病毒感染等。可引发可避免或改善的不良作用的免疫治疗剂包括BiTE单链抗体；CAR-T治疗剂，例如(但不限于)替沙津鲁(tisagenlecleucel)
或西卡思罗(axicabtageneciloleucel)
或其他免疫肿瘤学治疗剂，例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、CD28超激动剂TGN1412、利妥昔单抗(rituximab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)或派立珠单抗(pembrolizumab)、奥沙利铂或来那度胺。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肌肉细胞或肝脏细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图16A至图16H中所示的重组载体)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗IL6R、抗IL6或抗CD19疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已被诊断患有一种或多种眼部病症或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体的治疗有反应或被视为抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，患者先前已用赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、或英比利珠单抗进行治疗，并且已发现对赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗有反应。在其他实施方案中，患者先前已用抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体进行治疗。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗IL6R、抗IL6或抗CD19抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗IL6R、抗IL6或抗CD19 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的一种或多种眼部病症的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗IL6R、抗IL6或抗CD19HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用至被诊断患有非感染性葡萄膜炎、NMO、DR或DME或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导视网膜细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。或者，产生抗IL6R、抗IL6或抗CD19 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的有害免疫反应的治疗、抑制或改善的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗IL6R、抗IL6 HuPTMFab或HuPTM Mab的病毒载体或其他DNA表达构建体皮下、肌肉内或静脉内施用至经诊断具有有害免疫反应或具有其一个或多个症状或待控制免疫疗法的副作用的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞和/或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
在特定实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16A中所列的赛他利单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:59)的氨基酸位置N77、N161、N194和/或N203或轻链(SEQ ID NO:60)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有赛他利单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:59)的Y94、Y95和/或Y200，和/或轻链(SEQ ID NO:60)的Y49、Y50、Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16B中所列的赛瑞单抗重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:61)的氨基酸位置N54、Q108和/或N158或轻链(SEQ ID NO:62)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有赛瑞单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:61)的Y32、Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:62)的Y86、Y87和/或Y192处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16H中所列的托珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:341)的氨基酸位置N61、N77和/或N161或轻链(SEQ ID NO:342)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有赛他利单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:341)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:342)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6R HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16C中所列的司妥昔单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:331)的氨基酸位置Q111和/或N161或轻链(SEQ ID NO:332)的N60、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有司妥昔单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:331)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:332)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16D中所列的克拉扎珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:333)的氨基酸位置N76、Q112和/或N162或轻链(SEQ ID NO:334)的N30、N161和/或N213中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有克拉扎珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:333)的Y93和/或Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:334)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16E中所列的思鲁库单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:335)的氨基酸位置Q111和/或N161或轻链(SEQ ID NO:336)的N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有思鲁库单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:335)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:336)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16F中所列的奥洛奇单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:337)的氨基酸位置N79、Q112、N162和/或N204或轻链(SEQ ID NO:338)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有奥洛奇单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:337)的Y96和/或Y97，和/或轻链(SEQ ID NO:338)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16G中所列的吉瑞利单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:339)的氨基酸位置N78、Q114、N164或轻链(SEQ ID NO:340)的N71和/或N174中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有吉瑞利单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:339)的Y95和/或Y96，和/或轻链(SEQ ID NO:340)的Y88和/或Y89处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL6 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗CD19 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图16I中所列的英比利珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:63)的氨基酸位置N77、Q113和/或N163或轻链(SEQ ID NO:64)的N80、N162和/或N214中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有英比利珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:63)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:64)的Y90和/或Y91处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗CD19 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含任何可检测的NeuGc部分和/或不含任何可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制一种或多种眼部病症的进展或缓解其一个或多个症状。在非感染性葡萄膜炎的情况下，可通过测量疼痛、发红和/或畏光的减少和/或视力相对于基线的改善来监测功效。在NMO的情况下，可通过测量视力和感觉的改善，和/或腿部或手臂的无力或麻痹、疼痛痉挛和/或不可控制的呕吐和打嗝的减轻来监测功效。在非感染性葡萄膜炎的情况下，可通过监测视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛相比于基线的变化来监测功效。在DR和DME的情况下，可通过监测视觉锐度来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度相比于基线的变化来监测功效。
或者，基因疗法的目标在于减少、抑制或改善人类受试者的有害免疫反应，例如遭受病毒或细菌感染(包括SARS-coV-2或COVID19感染)或需要控制免疫疗法的副作用，例如经施用免疫肿瘤学药剂和/或基于细胞的免疫疗法(例如CAR-T细胞疗法)的受试者。有害免疫反应(包括细胞因子释放综合征)的症状包括高热、炎症、严重疲乏、恶心，并且可引起组织或器官受损，包括多重器官衰竭。
本文所提供的方法涵盖将抗IL6R、抗IL6或抗CD19 HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉和递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于患有非感染性葡萄膜炎的受试者的治疗包括(但不限于)硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯、环孢素、环磷酰胺、皮质类固醇(局部和/或全身)和其他药剂，并且与包括(但不限于)赛瑞单抗、赛他利单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗的抗IL6R或抗IL6一起施用。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于患有NMO的受试者的治疗包括(但不限于)硫唑嘌呤
氨甲蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯
利妥昔单抗
皮质类固醇(局部和/或全身)和其他药剂，并且与抗IL6R、抗IL6或抗CD19药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于DR或DME的治疗包括(但不限于)激光光凝、使用维替泊芬的光动力疗法、阿柏西普和/或玻璃体内类固醇、抗VEGF药剂和其他药剂，并且与抗IL6R药剂或抗CD19药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)赛瑞单抗、赛他利单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗或英比利珠单抗。
5.3.16用于克罗恩病和溃疡性结肠炎的抗整合素(β7亚基)HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于整合素β7亚基(ITGB7)并且被指示用于治疗炎性肠病(IBD)(例如UC和CD)。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有艾托珠单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。艾托珠单抗的Fab片段的氨基酸序列提供于图17中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有IBD(例如UC或CD)或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码ITGB7结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于ITGB7的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于ITGB7的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如艾托珠单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗ITGB7抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因包含编码艾托珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.65和66，参见表5和图17)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:135(编码艾托珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:136(编码艾托珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗ITGB7抗原结合结构域具有SEQ ID NO:65的重链可变结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗ITGB7抗原结合结构域含有如图17中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQID NO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:135的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:135)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:311(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因编码包含轻链的ITGB7抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:66中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因编码包含重链的ITGB7抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:65中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:66中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:65中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，ITGB7抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:65，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图17中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，ITGB7抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:66，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图17中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因编码高糖基化艾托珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:65和66的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L112N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗ITGB7抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个艾托珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图17的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗ITGB7抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗ITGB7抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的IBD的方法。所述抗体可为艾托珠单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有一种或多种IBD和/或具有与其相关的症状。
用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肝脏细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图17中所示的重组载体)可以使得重组载体进入肝脏的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗ITGB7疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有IBD或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗ITGB7抗体的治疗有反应或被视为抗ITGB7抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用艾托珠单抗进行治疗，并且已发现对艾托珠单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗ITGB7或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗ITGB7 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的IBD的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗ITGB7 HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体皮下、肌肉内或静脉内施用至被诊断患有IBD的人类受试者(患者)，以在肌肉或肝脏中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肌肉细胞或肝脏细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗ITGB7 HuPTMmAb或抗ITGB7 HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肌肉细胞或肝脏细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌肉细胞或肝脏细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗ITGB7HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有视网膜病症或癌症的认为IBD的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗ITGB7 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图17中所列的艾托珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:65)的氨基酸位置N60、N76、Q109和/或N159，或轻链(SEQ ID NO:66)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有艾托珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:65)的Y93和/或Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:66)的Y36、Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗ITGB7 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制所治疗的疾病的进展或减轻其一个或多个症状。关于CD，可通过评定治疗时程内的克罗恩病活动指数[CDAI]来监测功效(例如参见Best WR等人(1976)Gastroenterology,3月；70(3):439-44,“Development of a Crohn'sdisease activity index.National Cooperative Crohn's Disease Study”)。关于UC，可通过评定治疗时程内的梅欧评分(Mayo score)和内视镜分项评分来监测功效(例如参见Lobaton等人,“The Modified Mayo Endoscopic Score(MMES):A New Index for theAssessment of Extension and Severity of Endoscopic Activity in UlcerativeColitis Patients,”J.Crohns Colitis.2015年10月:9(10):846-52)。
本文所提供的方法涵盖将抗ITGB7 HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肌肉或肝脏以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于IBD的治疗包括(但不限于)非类固醇消炎药(例如美色拉嗪(mesalamine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine))、类固醇(例如氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松、布地奈德(budesonide))、免疫抑制剂(例如氨甲蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤)、维生素(例如铁、胆钙化醇)、抗生素(例如氨基水杨酸、甲硝哒唑)、其他抗体(例如英利昔单抗、阿达木单抗)，并且与包括(但不限于)艾托珠单抗的抗ITGB7一起施用。
5.3.17.用于骨质疏松的抗骨硬化蛋白HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于骨硬化蛋白(SOST)，来源于抗SOST抗体，例如若莫珠单抗(图18)并且被指示用于治疗骨质疏松或异常骨质流失或无力(例如治疗骨巨细胞瘤、治疗由治疗诱发的骨质流失、减缓乳腺癌和前列腺癌患者的骨质流失(或增加其骨质)、预防骨转移所致的骨骼相关事件或减少骨骼再吸收和转换)。在某些实施方案中，HuPTMmAb具有若莫珠单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。这种抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图18中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有骨质疏松或遭受骨质流失的患者(人类受试者)施用编码SOST结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于SOST的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于SOST的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如若莫珠单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗SOST抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因包含编码若莫珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.67和68，参见表5和图18)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:137(编码重链Fab部分)和SEQ ID NO:138(编码若莫珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗SOST抗原结合结构域具有SEQ ID NO:67的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗SOST抗原结合结构域含有如图18中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:137的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:137)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:313(表7)或IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID No.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因编码包含轻链的SOST抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:68中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因编码包含重链的SOST抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:67中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:68中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:67中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，SOST抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:67，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图18中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，SOST抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:68，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图18中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因编码高糖基化若莫珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:67和68的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：T118N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗SOST抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个若莫珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图18的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗SOST抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗SOST抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的骨质疏松或异常骨质流失(例如，乳腺癌或前列腺癌患者或骨转移所致的骨质疏松或异常骨质流失)的方法。所述抗体可为若莫珠单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有骨质疏松或异常骨质流失和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肝脏细胞或肌肉细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图18中所示)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗SOST疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已被诊断患有骨质疏松或异常骨质流失或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗SOST抗体的治疗有反应或被视为抗SOST抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用若莫珠单抗进行治疗，并且已发现对若莫珠单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗SOST抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗SOST HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的骨质疏松或骨质流失的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗SOST HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体静脉内施用至被诊断患有骨质疏松或骨质流失或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肝脏或肌肉组织中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗SOST HuPTM mAb或抗SOST HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，抗SOST HuPTM mAb或HuPTMFab可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生，并且向被诊断患有骨质疏松或骨质流失或认为骨质疏松或骨质流失的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗SOST HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图18中所列的若莫珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:67)的氨基酸位置Q115、N165、N198和/或N207，或轻链(SEQ ID NO:68)的N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有若莫珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:67)的Y94和/或Y204，和/或轻链(SEQ ID NO:68)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗SOST HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制骨质疏松或骨质流失的进展。可通过评估骨组织或骨骼事件或骨骼事件缺乏来监测功效。例如，关于骨质疏松，可通过骨矿物质含量评定、脊椎骨折射线照片或用于临床断裂确认的诊断性成像来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗SOST HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于骨质疏松或骨质流失的治疗包括(但不限于)双膦酸盐(例如唑来膦酸)、甲状旁腺激素(例如特立帕肽(teriparatide)[PTH 1-34]和/或全长PTH 1-84)、钙、维生素D、抗RANKL药剂以及用于诊断患有癌症的患者的化学疗法、低温疗法或放射线疗法，并且与包括(但不限于)若莫珠单抗的抗SOST药剂一起施用。
5.3.18.用于血管性水肿和糖尿病性视网膜病变的抗pKal HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于激肽释放酶(pKal)，来源于抗pKal抗体并且被指示用于治疗血管性水肿，例如遗传性血管性水肿。在其他实施方案中，提供了用于治疗糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的组合物和方法。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有拉那鲁单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。这种抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图19中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有血管性水肿或糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的患者(人类受试者)施用编码pKal结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于pKal的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于pKal的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如拉那鲁单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗pKal抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因包含编码拉那鲁单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.69和70，参见表5和图19)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:139(编码拉那鲁单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:140(编码拉那鲁单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。对于糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿适应症，信号序列可导引人类眼部细胞或视网膜细胞中的表达和分泌，例如表5中的信号序列中的一者。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗pKal抗原结合结构域具有SEQ ID NO:69的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗pKal抗原结合结构域含有如图19中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:139的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:139)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:314(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在特定实施方案中，提供了编码全长拉那鲁单抗的构建体，所述全长拉那鲁单抗包括Fc结构域，尤其如本文中实施例36和表8中所描述的核苷酸序列L01、L02或L03(分别为SEQ ID NO:141、286或287)，所述核苷酸序列经密码子优化并且在L02和L03的情况下耗乏CpG二聚体。转基因还可包含编码信号肽MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146；例如在重链和/或轻链的N末端处)的核苷酸序列，所述信号肽可由核苷酸序列SEQ ID NO:422编码。编码轻链和重链的核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A接头(SEQ ID NO:231)分开，以产生双顺反子载体。或者，轻链和重链的核苷酸序列是由弗林蛋白酶-T2A接头(例如SEQ ID NO:429并且如由SEQ ID NO:424编码)分开。拉那鲁单抗的表达可由组成型或组织特异性启动子导引。在某些实施方案中，转基因含有CAG启动子(SEQ ID NO:411)或TBG(SEQ ID NO:423)启动子。或者，启动子可为组织特异性启动子(或包括启动子和增强子元件的调控序列)，例如APOE.hAAT调控序列(SEQ ID NO:412)、LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX3、LTP1(SEQ ID NO:317)或LMTP6(SEQ ID NO:320)启动子或CK8(SEQ ID NO:413)启动子。关于显示基因组配置的示意图，参见图24A。转基因可含有表1中所提供的元件。编码全长拉那鲁单抗的示例性转基因提供于表8中，并且包括CAG.LAN.F2A(SEQ ID NO:436)、CAG.LAN.T2A(SEQ ID NO:437)、TBG.LAN.T2A(SEQ ID NO:438)、APOE.hAAT.LAN.T2A(SEQ ID NO:439)、LSPX1.LAN.T2A(SEQ ID NO:440)、LSPX2.LAN.T2A(SEQ ID NO:441)、LTP1.LAN.T2A(SEQ IDNO:442)和LMTP6.LAN.T2A(SEQ ID NO:443)。ITR序列添加至构建体的5'和3'端以产生基因组。转基因可包装至AAV、特别是AAV8中。
在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因编码包含轻链的pKal抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:70中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因编码包含重链的pKal抗原结合片段，所述重链包含与SEQID NO:69中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:70中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:69中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，pKal抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:69，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图19中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，pKal抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:70，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图19中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因编码高糖基化拉那鲁单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:69和70的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M117N(重链)和/或Q159N、Q159S和/或E194N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗pKal抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个拉那鲁单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图19的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗pKal抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗pKal抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的血管性水肿的方法。所述抗体可为拉那鲁单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有血管性水肿和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中，并且示例性转基因提供于上文。此类载体应对人类肝脏细胞或肌肉细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳、优选地AAV8的那些载体。重组载体(例如图19中所示)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中，例如通过静脉内或肌肉内施用。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
提供了通过施用含有编码抗pKal抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的糖尿病性视网膜病变或糖尿病性黄斑水肿的方法。还参见上文的章节5.3.8。抗体可为拉那鲁单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有糖尿病性视网膜病变或糖尿病性黄斑水肿和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中，并且示例性转基因提供于上文。此类载体应对人类视网膜细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图19中所示)可以使得重组载体进入视网膜组织的任何方式施用，例如如章节5.5.3中所公开。在特定实施方案中，转基因是AAV8载体中的CAG.LAN.F2A(SEQ ID NO:436)、CAG.LAN.T2A(SEQ ID NO:437)、TBG.LAN.T2A(SEQ ID NO:438)、APOE.hAAT.LAN.T2A(SEQ ID NO:439)、LSPX1.LAN.T2A(SEQ ID NO:440)、LSPX2.LAN.T2A(SEQ ID NO:441)、LTP1.LAN.T2A(SEQ ID NO:442)或LMTP6.LAN.T2A(SEQ ID NO:443)。
关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2和5.5.4。
本文中的实施例51、53、54和56提供了经施用编码全长拉那鲁单抗的AAV载体的小鼠和大鼠中拉那鲁单抗的血清水平的结果，以评定不同启动子和其他调控元件、接头、AAV类型、施用模式等。这些结果传达获得足以实现治疗功效的血清水平(特别是稳态血清水平)的编码拉那鲁单抗的重组AAV载体的剂量。充足治疗功效的稳态血清水平可经由临床研究确定，例如如关于拉那鲁单抗的处方信息所提供(参见
处方信息)。在特定实施方案中，以足以在患者血清中表达治疗有效水平的拉那鲁单抗的剂量(载体基因组)向有需要的患者(例如被诊断患有或罹患HAE的患者)施用AAV8拉那鲁单抗载体。在特定实施方案中，施用使得Cmax为9μg/ml至35μg/ml，包括12μg/ml至25μg/ml，或20μg/ml至35μg/ml；并且Cmin为4μg/ml至25μg/ml，或Cmin大于20μg/ml，但在某些实施方案中小于200μg/ml或500μg/ml。血清或血浆浓度优选地以稳态浓度形式实现，例如将血清或血浆水平维持在Cmax与Cmin内至少1个月、2个月、3个月或大于3个月，或1年。在特定实施方案中，施用AAV载体使得稳态拉那鲁单抗血浆浓度是5μg/ml至30μg/ml，或10μg/ml至20μg/ml；或15μg/ml至30μg/ml或大于20μg/ml，但在某些实施方案中小于200μg/ml或500μg/ml。在特定实施方案中，分泌至所述血浆中的拉那鲁单抗抗体展现pKal活性的大于至少40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的降低，如通过动力学酶功能测定法(例如实施例57中所描述的测定法)所测量。在某些实施方案中，拉那鲁单抗抗体的活性是在施用AAV载体之后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周测量的。本文提供的治疗方法降低血管性水肿发生或发作的发生率或严重程度。在特定的实施方案中，血管性水肿发生在皮肤、胃肠道或上呼吸道中。
施用这种基因疗法的受试者可为对抗pKal疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已诊断患有血管性水肿或糖尿病性视网膜病变或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗pKal抗体的治疗有反应或被视为抗pKal抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用拉那鲁单抗进行治疗，并且已发现对拉那鲁单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗pKal抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗pKal HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的血管性水肿的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗pKal HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体静脉内施用至被诊断患有血管性水肿或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肝脏或肌肉组织中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
在特定实施方案中，抗pKal HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图19中所列的拉那鲁单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:69)的氨基酸位置N77、Q114和/或N164或轻链(SEQ ID NO:70)的Q99、N157和/或N209中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有拉那鲁单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:69)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:70)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗pKal HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab(或任一者的高糖基化衍生物)是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制血管性水肿的进展、降低患者疼痛或不适的程度或降低自身反应性B细胞和免疫球蛋白产生浆细胞的水平。可通过对身体的受侵袭组织或部位(例如皮肤、关节、肾脏、肺、血细胞、心脏和大脑)中功能、症状或炎症程度进行评分来监测功效。例如，可通过评定侵袭严重程度或频率的变化来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗pKal HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。与本文所提供的基因疗法组合的可用于血管性水肿的治疗包括(但不限于)达那唑(danazol)、缓激肽受体拮抗剂(例如艾替班特(icatibant))、血浆激肽释放酶抑制剂(例如艾卡拉肽(ecallantide))、C1酯酶抑制剂、康纳斯特阿法(conestat alfa)、抗纤维蛋白溶解剂(例如氨甲环酸)、奥马珠单抗和新鲜冷冻血浆输注、抗组胺和皮质类固醇，并且与包括(但不限于)拉那鲁单抗的抗pKal药剂一起施用。
5.3.19.用于自身免疫、呼吸道和过敏性疾病的抗IL和IL受体以及其他目标HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于白细胞介素(IL)、白细胞介素受体(ILR)(例如IL31RA、IL13、IL5或IL-5)、免疫球蛋白E(IgE)或胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)，来源于抗IL、抗ILR、抗IgE或抗TSLP，并且被指示用于治疗一种或多种自身免疫相关病症、呼吸道疾病和过敏性疾病，例如特应性皮炎、慢性特发性荨麻疹、哮喘、嗜曙红细胞性哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)(在下文中统称为“受试者AI-Ds”)。在特定实施方案中，HuPTM mAb具有贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗或前述中的一者的抗原结合片段的氨基酸序列。这些抗体的Fab片段的氨基酸序列分别提供于图29A至图29F中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有特应性皮炎、慢性特发性荨麻疹、哮喘、嗜曙红细胞性哮喘或COPD或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码IL/ILR结合、IgE结合或TSLP结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于IL/ILR、IgE或TSLP的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于IL/ILR、IgE或TSLP的抗体的抗原结合片段，所述结合于IL/ILR的抗体例如贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗；所述结合于IgE的抗体例如奥马珠单抗；或所述结合于TSLP的抗体例如特泽派单抗；或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因包含编码贝纳利珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.364和365，参见表5和图29A)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:380(编码贝纳利珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:381(编码贝纳利珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL5抗原结合结构域具有SEQ ID NO:364的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL5抗原结合结构域含有如图29A中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:380的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:380)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:394(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNo.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL5抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:365中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因编码包含重链的IL5抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:364中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:365中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:364中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL5抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:364，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL5抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:365，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29A中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因编码高糖基化贝纳利珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:364和365的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L116N(重链)，和/或Q160N、Q160S和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL5抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个贝纳利珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29A的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL5抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因包含编码瑞利珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.366和367，参见表4和图29B)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:382(编码瑞利珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:383(编码瑞利珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL5R抗原结合结构域具有SEQ ID NO:366的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL5R抗原结合结构域含有如图29B中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ IDNO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:382的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:382)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:395(表7)或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID NO.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL5R抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:367中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因编码包含重链的IL5R抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:366中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:367中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:366中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL5R抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:366，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL5R抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:367，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29B中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因编码高糖基化瑞利珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:366和367的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L111N(重链)，和/或Q160N、Q160S和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL5R抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个瑞利珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29B的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL5R抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因包含编码塔罗金单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.368和369，参见表5和图29C)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:384(编码塔罗金单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:385(编码塔罗金单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL13抗原结合结构域具有SEQ ID NO:368的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IL13抗原结合结构域含有如图29C中所列的氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG(SEQ IDNO:214)和具体来说ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:216)、ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:217)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:218)或ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL(SEQ ID NO:219)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:384的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:384)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:396(表7)或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID NO.285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL13抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:369中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因编码包含重链的IL13抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:368中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:369中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:368中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL13抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:368，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL13抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:369，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29C中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因编码高糖基化塔罗金单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:368和369的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L117N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL13抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个塔罗金单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29C的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL13抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因包含编码奈莫利珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.370和371，参见表5和图29D)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:386(编码奈莫利珠单抗重链Fab部分)和SEQ IDNO:387(编码奈莫利珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IL31RA抗原结合结构域具有SEQ ID NO:370的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述IL31RA抗原结合结构域含有如图29D中所列的氨基酸序列ERKSCVECPPCPAPPVAG(SEQ IDNO:433)或ERKSCVECPPCPA(SEQ ID NO:434)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ IDNO:386的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:386)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:397(表7)或IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID NO.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因编码包含轻链的IL31RA抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:371中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因编码包含重链的IL31RA抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:370中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ IDNO:371中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:370中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL31RA抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:370，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IL31RA抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:371，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因编码高糖基化奈莫利珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:370和371的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L116N(重链)，和/或Q160N和/或Q160S和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IL31RA抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个奈莫利珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29D的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IL31RA抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因包含编码奥马珠单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.372和33，参见表5和图29E)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:388(编码奥马珠单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:389(编码奥马珠单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗IgE抗原结合结构域具有SEQ ID NO:372的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗IgE抗原结合结构域含有如图29E中所列的氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO:194)和具体来说EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:196)、EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:197)、EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:198)、EPKSCDKTHLCPPCPA(SEQ ID NO:199)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQ ID NO:200)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(SEQID NO:201)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:388的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:388)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:398(表7)或IgG1 Fc结构域，例如SEQ IDNO.283或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因编码包含轻链的IgE抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:373中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因编码包含重链的IgE抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:372中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:373中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:372中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，IgE抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:372，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29E中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，IgE抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:373，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29E中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因编码高糖基化奥马珠单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:372和373的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L116N(重链)，和/或Q164N和/或Q164S和/或E199N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗IgE抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个奥马珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29E的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗IgE抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因包含编码特泽派单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.374和375，参见表5和图29F)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:390(编码特泽派单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:391(编码特泽派单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗TSLP抗原结合结构域具有SEQ ID NO:374的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗TSLP抗原结合结构域含有如图29E中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ IDNO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ IDNO:390的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:390)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有IgG2 Fc结构域的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因编码包含轻链的TSLP抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:375中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因编码包含重链的TSLP抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:374中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:375中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:374中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，TSLP抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:374，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29F中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，TSLP抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:375，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图29F中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因编码高糖基化特泽派单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:374和375的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：M117N(重链)和/或Q196N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗TSLP抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个特泽派单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图29F的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗TSLP抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的血管性水肿的方法。所述抗体可为贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有AI-Ds和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肝脏细胞或肌肉细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。重组载体(例如图29A至图29F中所示)可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至血流中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已被诊断患有AI-Ds或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体的治疗有反应或被视为抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用度匹鲁单抗(dupilumab)、伊科奇单抗(ixekizumab)、塞库金单抗(secukinumab)、优特克单抗(ustekinumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗进行治疗，并且已发现对度匹鲁单抗、伊科奇单抗、塞库金单抗、优特克单抗、美泊利单抗、贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的血管性水肿的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体静脉内施用至被诊断患有血管性水肿或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肝脏或肌肉组织中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
在特定实施方案中，抗IL5 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29A中所列的贝纳利珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:364)的氨基酸位置Q113和/或N163或轻链(SEQ ID NO:365)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有贝纳利珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:364)的Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:365)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL5HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL5R HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29B中所列的瑞利珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:366)的氨基酸位置N35、Q108、N158和/或N200或轻链(SEQ ID NO:367)的Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有瑞利珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:366)的Y93和/或Y94，和/或轻链(SEQ ID NO:367)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL5R HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL13 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29C中所列的塔罗金单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:368)的氨基酸位置N54、N164和/或N206或轻链(SEQ ID NO:369)的N68和/或N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有塔罗金单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:368)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:369)的Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL13HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL31RA HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29D中所列的奈莫利珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:370)的氨基酸位置Q113、N163、N196和/或N205或轻链(SEQ ID NO:371)的N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有奈莫利珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:370)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:371)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL31RA HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IL31RA HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29D中所列的奈莫利珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:370)的氨基酸位置Q113、N163、N196和/或N205或轻链(SEQ ID NO:371)的N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有奈莫利珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:370)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:371)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IL31RA HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗IgE HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29E中所列的奥马珠单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:372)的氨基酸位置N36、N59、N77、Q113和/或N159或轻链(SEQ ID NO:373)的Q104、N162和/或N214中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有奥马珠单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:372)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:373)的Y90和/或Y91处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗IgE HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在特定实施方案中，抗TSLP HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图29F中所列的特泽派单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:374)的氨基酸位置N77、N80、Q114、N164、N197和/或N206或轻链(SEQ ID NO:375)的N68和/或N172中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有特泽派单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:374)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQ ID NO:375)的Y85和/或Y86处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗TSLP HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab(或任一者的高糖基化衍生物)是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制AI-Ds的进展、降低患者的疼痛或不适程度。
可通过对身体的受侵袭组织或部位(例如皮肤)中的症状或发炎程度进行评分来监测功效。关于特应性皮炎，可通过评定治疗时程内受侵袭皮肤或患者生活质量的变化来监测功效。一个或多个标准化评定可用于评定所述变化。(参见例如医师全面评定(Physician Global Assessment；PGA)、晶格系统(lattice system)、NPF牛皮癣评分(NPF-PS)、医学结果调查简表36(Outcome Survey Short Form 36；SF-36)、Euro QoL、皮肤病生活质量指数(Dermatology Life Quality Index；DLQI)和Skindex；Schram等人(2012)Allergy；67:99-106:“EASI,(objective)SCORAD and POEM for atopic eczema:responsiveness and minimal clinically important difference”，其描述包括湿疹面积和严重程度指数(Eczema Area and Severity Index；EASI)以及特应性皮炎严重程度评分指数(SCORAD)的标准化评定)。关于COPD和哮喘，可通过评定症状的变化或通过利用峰值呼气流量(PEV)或肺活测量量法(例如FEV1)测量气道功能来监测功效。关于嗜曙红细胞性哮喘，可通过评定哮喘恶化和肺功能(例如气道阻塞、用力肺活量和肺余容积)和哮喘控制的变化来监测功效。关于慢性特发性荨麻疹，可通过评定受侵袭皮肤的变化或嘴唇、眼睑或咽喉的肿胀程度的变化来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。与本文所提供的基因疗法组合的可用于受试者AI-Ds的治疗包括(但不限于)抗组胺、H2阻断剂、局部皮质类固醇或用于慢性特发性荨麻疹的抗抑郁剂、氨基水杨酸盐、免疫调节剂(例如硫唑嘌呤(AZA)、6-巯基嘌呤(6-MP)、氨甲蝶呤(MTX))、口服或局部皮质类固醇(例如泼尼松或布地奈德)、局部钙调神经磷酸酶抑制剂、用于哮喘或COPD吸入型皮质类固醇、白三烯修饰剂、高剂量吸入型皮质类固醇和口服皮质类固醇，和/或用于特应性皮炎的局部类固醇，并且与抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP药剂一起施用，所述药剂包括(但不限于)度匹鲁单抗、伊科奇单抗、塞库金单抗、优特克单抗、美泊利单抗、贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗。
5.3.20用于非感染性葡萄膜炎的HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于白细胞介素-6受体(IL6R)、白细胞介素-6(IL6)、TNFα或C5，来源于抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体，例如赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗(图10B和图10D、图12A至图12C和图16A至图16I)并且被指示用于治疗葡萄膜炎，优选地非感染性后葡萄膜炎(NIU)。
在某些实施方案中，提供了治疗全葡萄膜炎或中间葡萄膜炎(包括与NIU相关者)的方法。因此，还提供了治疗NIU和全葡萄膜炎和中间葡萄膜炎的方法。葡萄膜炎是眼部炎症，并且可能与全身性自身免疫病症相关，包括白塞病(Behcet's disease)、结节病、青少年慢性关节炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征、多发性硬化症和其他自身免疫适应症，特别是T细胞介导的自身免疫适应症。在其他实施方案中，NIU与眼部自身免疫病相关，例如鸟枪弹样视网膜脉络膜病、多灶性脉络膜炎和其他白点综合征。治疗方法包括抑制和减少视力丧失和眼部损伤进展如黄斑瘢痕形成或萎缩、层状黄斑裂孔形成和视神经萎缩的方法。特别是，治疗方法可提高视力(例如，由最佳矫正视力(BCVA)评分定义)或减缓视力丧失和或眼部损伤。NIU的其他表现包括玻璃体混浊、黄斑性视网膜炎和血管炎。因此，提供了通过施用HuPTM来治疗与NIU相关的玻璃体混浊、黄斑性视网膜炎和/或血管炎，降低其严重程度和减缓其进展的方法。
在某些实施方案中，HuPTM mAb具有赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至16I中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有其一个或多个症状的患者(人类受试者)施用编码IL6R结合、IL6结合、TNFα结合或C5结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于IL6R、IL6、TNFα或C5的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTM mAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于IL6R、IL6、TNFα或C5的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。转基因详细描述于上文章节5.3.9、5.3.11或5.3.15中。
在优选的实施方案中，结合于TNFα的抗体是阿达木单抗或如本文所描述的其变体。例如，全长或Fab阿达木单抗抗体可通过施用编码阿达木单抗mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的腺相关病毒(AAV)载体来递送，例如CAG.阿达木单抗.IgG(SEQ ID NO:451)或CAG.阿达木单抗.Fab(SEQ ID NO:453)。
编码抗C5、抗IL6R、抗IL6或TNF-α抗原结合片段转基因的序列可见于表5(氨基酸)或表6(核苷酸)或图10A、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，一个或多个形成视网膜的细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表2中所列的对应于由一个或多个形成视网膜的细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。或者，信号序列可适合于肌肉细胞或肝脏细胞中的表达，例如下文表3和表4中所列的那些序列。
抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合结构域可具有SEQ ID NO:39、362、45、47、49、331、333、335、337、339、341、59或61的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合结构域含有如图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中所列和如章节5.3.9、5.3.11或5.3.15中详细描述的氨基酸序列的全部或一部分。
在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ IDNO:301、303、304、305、309、310、355-359或394-398(表7)或IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域，例如SEQ ID No.283、284或285或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合结构域可具有SEQ ID NO:40、363、46、48、50、332、334、336、338、340、342、60或62的轻链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合结构域含有如图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中所列和如章节5.3.9、5.3.11或5.3.15中详细描述的氨基酸序列的全部或一部分。
在某些实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链的C5、IL6、IL6R或TNFα抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:40、363、46、48、50、332、334、336、338、340、342、60或62中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含重链的C5、IL6、IL6R或TNFα抗原结合片段，所述重链包含与SEQ ID NO:39、362、45、47、49、331、333、335、337、339、341、59或61中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:40、363、46、48、50、332、334、336、338、340、342、60或62中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:39、362、45、47、49、331、333、335、337、339、341、59或61中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:39、362、45、47、49、331、333、335、337、339、341、59或61，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:40、363、46、48、50、332、334、336、338、340、342、60或62，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段转基因编码高糖基化Fab，其包含分别为SEQ ID NO:39和40、362和363、45和46、47和48、49和50、331和332、333和334、335和336、337和338、339和340、341和342、59和60或61和62的重链和轻链，所述重链和轻链具有如图20A(重链)和图20B(轻链)中所指示的突变中的一者或多者。
在某些实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFα抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
还提供了通过施用含有编码抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的非感染性葡萄膜炎的方法。所述抗体可为赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗，并且是例如其Fab片段或其其他抗原结合片段。
在实施方案中，患者已被诊断患有非感染性葡萄膜炎和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.3中。此类载体应对人类视网膜类细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8衣壳的那些载体。或者，带有AAV2.7m8或AAV9衣壳的载体可用于眼部适应症。重组载体(例如图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中所示的重组载体)可以使得重组载体进入视网膜的任何方式施用，例如通过将重组载体引入至眼睛中。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.3。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已被诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体的治疗有反应或被视为抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗或英比利珠单抗进行治疗，并且已发现对赛他利单抗、赛瑞单抗、托珠单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗、阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗有反应。在其他实施方案中，患者先前已用抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体进行治疗。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的非感染性葡萄膜炎治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗IL6R、抗IL6、抗TNFα或抗C5 HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用至被诊断患有非感染性葡萄膜炎或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在视网膜中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导视网膜细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制非感染性葡萄膜炎的进展或缓解其一个或多个症状，以便降低患者的疼痛、眼睛发红度、光敏感度和/或其他不适的程度。可通过测量疼痛、眼睛发红度和/或畏光的降低和/或视力改善来监测功效。还可通过监测最佳矫正视力(BCVA)和/或进行压平眼压测量法、眼前段和眼后端裂隙灯检查、扩张间接检眼镜检查和光学同调断层扫描(OTC)并与基线值进行比较来评定功效。
在特定实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10B、图10D、图12A至图12C或图16A至图16I中所列的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在一个或多个氨基酸位置处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段具有重链和/或轻链的硫酸化基团。在其他实施方案中，抗C5、抗IL6、抗IL6R或抗TNFαHuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。关于Y-硫酸化位点和其他翻译后修饰的详细描述，参见章节5.3.9、5.3.11或5.3.15。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制非感染性葡萄膜炎的进展或缓解其一个或多个症状。可通过监测视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛来监测功效。例如，可通过评定视觉锐度、眼睛发红度、光敏感度和/或眼痛相比于基线的变化来监测功效。
本文所提供的方法涵盖将抗IL6、抗IL6R、抗TNFα或抗C5HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至视网膜以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于患有非感染性葡萄膜炎的受试者的治疗包括(但不限于)硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯、环孢素、环磷酰胺、皮质类固醇(局部和/或全身(口服和/或吸入型))和其他药剂，并且与包括(但不限于)阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗的抗TNFα、抗IL6、抗IL6R或抗C5药剂一起施用。
用于递送至视网膜细胞类型的构建体
章节5.3.9、5.3.11和5.3.15描述了重组载体，所述重组载体含有编码结合于C5、TNFα、IL6R和IL6的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。用于递送转基因的此类重组载体可对一种或多种人类视网膜细胞类型具有向性。此类载体可包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)，例如带有AAV8衣壳的那些载体。或者，可使用带有AAV2.7m8衣壳的AAV载体。然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体、痘疮病毒载体或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。
在优选的实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV2.7m8衣壳(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞(例如视网膜细胞或肝脏细胞类型)中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体。在某些实施方案中，经编码AAV8或AAV2.7m8衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:143或142，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在一些实施方案中，HuPTM mAb或其抗原结合片段(包括HuPTM Fab转基因)应由用于在人类视网膜或肝脏细胞类型中表达HuPTM Fab或HuPTM mAb的适当表达控制元件控制，所述表达控制元件例如CB7启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子/CAG，SEQ ID NO:411)或组织特异性启动子，并且所述HuPTM mAb或其抗原结合片段可包括增强由载体驱动的转基因的表达的其他表达控制元件。启动子序列和例如内含子的其他调控元件的序列提供于表1中。
用于抗体或Fab的基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链都得以表达。更具体来说，重链和轻链应以大约相等的量表达，换句话说，重链和轻链以重链与轻链约1:1的比率表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。重链和轻链中的每一者的前导序列是例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。上文章节5.1.5提供可用于本文所提供的方法和组合物的特异性IRES、2A和其他接头序列。在特定实施方案中，接头是弗林蛋白酶-2A接头，例如弗林蛋白酶-F2A接头RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:231)或弗林蛋白酶-T2A接头RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:429)。在特定实施方案中，转基因是编码以下的核苷酸序列：信号序列-重链Fab部分-弗林蛋白酶(F/T)2A接头-信号序列-轻链Fab部分。用于特度鲁单抗和拉瓦利单抗Fab表达的序列分别参见图10B和图10D；用于阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗Fab表达的序列分别参见图12A至图12C；并且用于赛他利单抗、赛瑞单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗和托珠单抗、英比利珠单抗Fab表达的序列分别参见图16A至图16I。在一个替代性实施方案中，构建体还包含用于表达全长mAb的编码治疗性抗体的Fc结构域(参见表7或图23)的核苷酸序列。阿达木单抗mAb和Fab单链构建体转基因的核苷酸序列描述于表17中。还提供了编码阿达木单抗(全长(SEQ ID NO:444和448)或Fab片段(由SEQ ID NO:445和446(重链)和498-450(轻链)编码的组分))的重链和轻链的组分序列的核酸序列。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子(SEQ ID NO:411)，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码C5结合、TNFα结合、IL6R结合和IL6结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/(F/T)2A接头(分别为SEQ ID NO:231或429)分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在一个优选的实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子(SEQ ID NO:411)，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码阿达木单抗(全长(SEQ ID NO:444和448)或Fab片段(由SEQ ID NO:445和446(重链)以及498-450(轻链)编码的组分))的重链和轻链的组分序列的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/T2A接头(SEQ ID NO:429)分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗C5、抗TNFα、抗IL6R和抗IL6 mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在一个或多个视网膜细胞类型(例如人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞(midgetcell)、阳伞细胞(parasol cell)、双层细胞(bistratified cell)、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞)中的表达的调控序列。
在一个优选的实施方案中，提供了AAV，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码阿达木单抗mAb(SEQ ID NO:451)或其抗原结合片段(SEQ ID NO:453)的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在一个或多个视网膜细胞类型(例如人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞)中的表达的调控序列。
用于递送至视网膜类细胞的施用
应以使得重组载体进入视网膜的任何方式，例如通过将重组载体直接引入至眼睛中来施用治疗有效量的上文所描述的重组载体。在特定实施方案中，例如通过微量注射或微插管来视网膜下施用(由训练有素的视网膜外科医师进行的涉及在局部麻醉下对受试者进行部分玻璃体切除术和将基因治疗剂注射至视网膜中的手术程序)、或玻璃体内施用、或脉络膜上施用载体。视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用应使得可溶转基因产物表达于以下视网膜细胞类型中的一者或多者中：人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞。经编码抗C5、抗TNFα、抗IL6R和抗IL6抗体的表达导致转基因产物在视网膜中的递送和维持。适合于施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液的制剂缓冲液中的悬浮液，所述重组载体包含编码抗C5、抗TNFα、抗IL6R和抗IL6抗体或其抗原结合片段的转基因。所述制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。
mAb在视网膜细胞类型中的全长表达
在一个特定实施方案中，为了在视网膜细胞类型中表达完整或基本上完整的mAb，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码以下的核酸序列：抗C5(例如特度鲁单抗、拉瓦利单抗)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)、抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)的重链Fab；与治疗性抗体相关的Fc多肽(表6和X)或呈治疗性抗体的原生形式的同一IgG同种型的Fc多肽，例如来自图23的IgG同种型氨基酸序列；和抗C5(例如特度鲁单抗和拉瓦利单抗)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)和抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)的轻链，其中重链(Fab和Fc多肽)以及轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/(T/F)2A或柔性接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码完整或基本上完整抗C5、抗TNFα、抗IL6R或抗IL6 mAb的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在一个或多个视网膜细胞类型(例如人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞)中的表达的调控序列。
5.3.21.用于重症肌无力的抗C5 HuPTM构建体和制剂
描述了用于递送HuPTM mAb及其抗原结合片段(例如HuPTM Fab)的组合物和方法，所述HuPTM mAb及其抗原结合片段结合于补体组分5(抗C5)，来源于抗C5抗体(例如拉瓦利单抗(图10D))并且被指示用于治疗重症肌无力。在某些实施方案中，HuPTM mAb具有若莫珠单抗或其抗原结合片段的氨基酸序列。这种抗体的Fab片段的氨基酸序列提供于图10D中。递送可经由基因疗法实现，例如通过向被诊断患有重症肌无力的患者(人类受试者)施用编码C5结合HuPTM mAb(或其抗原结合片段和/或高糖基化衍生物或其他衍生物)的病毒载体或其他DNA表达构建体，以形成持久储集物，从而持续供应人类PTM，例如人类糖基化转基因产物。
转基因
提供了重组载体，所述重组载体含有编码结合于C5的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因，所述重组载体可被施用以向患者递送HuPTMmAb或抗原结合片段。所述转基因是包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码结合于C5的抗体的抗原结合片段，所述抗体例如拉瓦利单抗或如本文中详述的其变体。所述转基因还可编码含有额外糖基化位点的抗C5抗原结合片段(例如参见Courtois等人)。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因包含编码拉瓦利单抗的Fab部分的重链和轻链(分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.362和363，参见表5和图10D)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可针对人类细胞中的表达而进行密码子优化。核苷酸序列可例如包含如表6中所列的核苷酸序列SEQ ID NO:378(编码拉瓦利单抗重链Fab部分)和SEQ ID NO:379(编码拉瓦利单抗轻链Fab部分)。重链和轻链序列都在N末端具有适合于人类细胞(特别是，人类肝脏细胞(例如肝细胞)或肌肉细胞)中的表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的氨基酸序列。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
除重链和轻链可变结构域以及CH1和CL结构域序列以外，转基因可在重链CH1结构域序列的C末端包含全部或一部分铰链区。在特定实施方案中，抗C5抗原结合结构域具有SEQ ID NO:362的重链Fab结构域，其中额外铰链区序列起始于C末端缬氨酸(V)之后，所述抗C5抗原结合结构域含有如图10D中所列的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:220)或ERKCCVECPPCPA(SEQ ID NO:221)的全部或一部分。这些铰链区可通过SEQ ID NO:378的3'端处的核苷酸序列由表6中所列的铰链区编码序列(SEQ ID NO:378)编码。在另一个实施方案中，转基因包含编码抗体的全长(或基本上全长)重链和轻链的氨基酸序列，所述重链和轻链包含重链的C末端的Fc结构域，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:393(表7)或IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID NO.284或如图23中所描绘，或其突变体或变体。Fc结构域可经工程化以改变与一个或多个Fc受体的结合和/或效应功能，如章节5.1.9所公开，见上文。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链的C5抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:363中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含重链的C5抗原结合片段，所述重链包含与SEQ IDNO:362中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码包含轻链和重链的抗原结合片段，所述轻链包含与SEQ ID NO:363中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO:362中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含重链，所述重链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:362，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的重链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20A中的比对所鉴定。在特定实施方案中，C5抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:363，并且所述取代、插入或缺失例如在框架区(例如CDR外的那些区，所述CDR在图10D中加下划线)中进行或者是被其他治疗性抗体中的一者或多者的轻链中处于所述位置的氨基酸取代，例如如通过图20B中的比对所鉴定。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码高糖基化拉瓦利单抗Fab，其包含分别为SEQ ID NO:363和362的重链和轻链，所述重链和轻链具有以下突变中的一者或多者：L117N(重链)、Q160N或Q160S(轻链)，和/或E195N(轻链)(参见图20A(重链)和图20B(轻链))。
在某些实施方案中，抗C5抗原结合片段转基因编码抗原结合片段并且包含编码六个若莫珠单抗CDR的核苷酸序列，所述CDR在图10D的重链和轻链可变结构域序列中加下划线，所述CDR在框架区(一般是人类框架区)之间间隔开并且取决于抗原结合分子的形式而与恒定结构域缔合，如本领域中已知以形成抗C5抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域。
基因治疗方法
提供了通过施用含有编码抗C5抗体或其抗原结合片段的转基因的病毒载体来治疗人类受试者的重症肌无力的方法。所述抗体可为拉瓦利单抗，并且是例如全长或基本上全长抗体或其Fab片段，或其其他抗原结合片段。在实施方案中，患者已被诊断患有重症肌无力和/或具有与其相关的症状。用于递送转基因的重组载体描述于章节5.4.2中。此类载体应对人类肝脏细胞或肌肉细胞具有向性并且可包括非复制型rAAV，特别是带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。可以使得重组载体进入肝脏或肌肉组织的任何方式，例如通过将重组载体引入至血流中来施用重组载体(例如图10D中所示)。关于治疗方法的细节，参见章节5.5.2。
施用此类基因疗法的受试者可为对抗C5疗法有反应的受试者。在某些实施方案中，所述方法涵盖治疗已被诊断患有重症肌无力或具有与其相关的一个或多个症状并且经鉴定对抗C5抗体的治疗有反应或被视为抗C5抗体疗法的良好候选者的患者。在特定实施方案中，所述患者先前已用拉瓦利单抗进行治疗，并且已发现对拉瓦利单抗有反应。为了确定反应性，可直接向受试者施用抗C5抗体或抗原结合片段转基因产物(例如在细胞培养物、生物反应器等中产生的产物)。
人类翻译后修饰的抗体
产生抗C5 HuPTM mAb或HuPTM Fab将产生用于经由基因疗法实现的重症肌无力的治疗的“生物改良”分子，所述基因疗法例如通过将编码抗C5 HuPTM Fab的病毒载体或其他DNA表达构建体静脉内施用至被诊断患有骨质疏松或骨质流失或具有其一个或多个症状的人类受试者(患者)，以在肝脏或肌肉组织中形成持久储集物，从而持续供应通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞产生的完全人类翻译后修饰，例如人类糖基化、硫酸化的转基因产物。
用于抗C5 HuPTMmAb或抗C5 HuPTM Fab的cDNA构建体应包括确保通过经转导肝脏细胞或肌肉细胞进行适当共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。例如，信号序列可为MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。或者，信号序列可具有选自表3或表4中所列的对应于分别由肌细胞或肝细胞分泌的蛋白质的信号序列中的任一者的氨基酸序列。
作为基因疗法的替代方案或除基因疗法以外的治疗，可通过重组DNA技术在人类细胞系中产生抗C5 HuPTM mAb或HuPTM Fab，并且向被诊断患有骨质疏松或骨质流失或认为骨质疏松或骨质流失的疗法对其适当的患者施用。
在特定实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段具有含有如图10D中所列的拉瓦利单抗的重链和轻链Fab部分的氨基酸序列的重链和轻链(其中谷氨酰胺(Q)糖基化位点、天冬酰胺(N)糖基化位点、非共有天冬酰胺(N)糖基化位点和酪氨酸-O-硫酸化位点(Y)如图例中所指示)，并且在重链(SEQ ID NO:362)的氨基酸位置N63、N106、Q114、N164、N197和/或N206或轻链(SEQ ID NO:363)的N28、Q100、N158和/或N210中的一者或多者处被糖基化，特别是2,6-唾液酸化。或者或另外，具有拉瓦利单抗的重链和轻链可变结构域序列的HuPTM mAb或其抗原结合片段在重链(SEQ ID NO:362)的Y94和/或Y95，和/或轻链(SEQID NO:363)的Y86和/或Y87处具有硫酸化基团。在其他实施方案中，抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段不含可检测的NeuGc部分和/或不含可检测的α-Gal部分。在某些实施方案中，HuPTM mAb是具有Fc区的全长或基本上全长mAb。
在某些实施方案中，HuPTM mAb或Fab是治疗上有效的，并且至少0.5％、1％或2％被糖基化和/或硫酸化，并且可至少5％、10％或甚至50％或100％被糖基化和/或硫酸化。本文提供的基因疗法治疗的目标在于减缓或遏制重症肌无力的进展。可通过例如通过使用重症肌无力定量评分(QMGS)、徒手肌力测试(MMT)和/或肌无力肌力评分(参见Barnett C等人,Neurol Clin.2018年5月；36(2):339-353)评估耐力或易疲乏性相比于基线的变化来监测功效。例如，QMSC评分评定上睑下垂、复视、眼轮匝肌无力、一杯水的吞咽、语言、预测的用力肺活量百分比、握力(2项)、手臂耐力(2项)、腿部耐力(2项)和屈颈耐力的变化。
本文所提供的方法涵盖将抗C5 HuPTM mAb或其抗原结合片段递送至肝脏或肌肉以及递送其他可用治疗的组合。可在基因疗法治疗之前、同时或之后施用额外治疗。可与本文所提供的基因疗法组合的可用于重症肌无力的治疗包括(但不限于)吡啶斯的明(pyridostigmine)、皮质类固醇或免疫抑制剂，并且与包括(但不限于)拉瓦利单抗的抗C5药剂一起施用。
表5.Fab片段氨基酸序列的表格
表6.Fab片段核酸序列的表格
表7.Fc结构域氨基酸序列的表格
5.4基因疗法构建体的递送
5.4.1用于递送至CNS的构建体
章节5.3.1、5.3.2、5.3.3、5.3.4、5.3.5、5.3.6和5.3.7描述了重组载体，其含有编码分别结合于Aβ、分选蛋白、Tau蛋白、SEMA4D、α-突触核蛋白、SOD1和CGRPR的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。用于递送转基因的此类重组载体应对人类CNS细胞(例如神经胶质和神经元细胞)具有向性。此类载体可包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)，特别是带有AAV9、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39或AAVcy5衣壳的那些载体。然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体、痘疮病毒载体或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体，尤其从CNS细胞表达。在某些实施方案中，经编码AAV9衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:144，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在其他特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体，特别是从CNS细胞表达。在某些实施方案中，经编码AAVrh10衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:145，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在一些实施方案中，HuPTM mAb或其抗原结合片段(包括HuPTM Fab转基因)应由以下控制：用于在人类CNS细胞中表达HuPTM mAb或HuPTM Fab的适当表达控制元件，例如CB7启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子)、RSV启动子、GFAP启动子(胶质纤维酸性蛋白)、MBP启动子(髓磷脂碱性蛋白)、MMT启动子、EF-1α、U86启动子、RPE65启动子或视蛋白启动子、诱导型启动子(例如低氧诱导型启动子或药物诱导型启动子，例如由雷帕霉素和相关药剂诱导的启动子)；以及增强由载体驱动的转基因的表达的其他表达控制元件(例如内含子，例如鸡β-肌动蛋白内含子、小鼠细小病毒(MVM)内含子、人类因子IX内含子(例如FIX截短内含子1)、β-珠蛋白剪接供体/免疫球蛋白重链剪接受体内含子、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体内含子、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)内含子和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体内含子；和polyA信号，例如兔β-珠蛋白polyA信号、人类生长激素(hGH)polyA信号、SV40晚期polyA信号、合成polyA(SPA)信号和牛生长激素(bGH)polyA信号)。参见例如Powell和Rivera-Soto,2015,Discov.Med.,19(102):49-57。
基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链都得以表达。更具体来说，重链和轻链应以大约相等的量表达，换句话说，重链和轻链以重链与轻链约1:1的比率表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。重链和轻链中的每一者的前导序列是例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)或表2中所提供的前导序列中的一者。上文章节5.1.5提供可用于本文所提供的方法和组合物的特异性IRES、2A和其他接头序列。在特定实施方案中，接头是弗林蛋白酶-2A接头，例如弗林蛋白酶-F2A接头RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:231)。在优选的实施方案中，接头是弗林蛋白酶-2A接头，例如弗林蛋白酶-T2A接头RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:429)。在特定实施方案中，转基因是编码以下的核苷酸序列：信号序列-重链Fab部分-弗林蛋白酶-2A接头-信号序列-轻链Fab部分。例如，用于索拉珠单抗、仑卡奈单抗和GSK933776Fab表达的序列分别参见图2A至图2C；用于AL-001Fab表达的序列参见图3；用于ABBV-8E12、UCB-0107和NI-105Fab表达的序列分别参见图4A至图4C；用于VX15/2503Fab表达的序列参见图5；用于普拉森单抗、NI-202和MED-1341Fab表达的序列分别参见图6A至图6C；用于NI-204Fab表达的序列参见图7A至图7B；并且用于伊普汀单抗、福瑞满单抗和伽奈珠单抗Fab表达的序列分别参见图8A至图8C。在一个替代性实施方案中，构建体还包含用于表达全长mAb的编码治疗性抗体的Fc结构域(参见表7或图23)的核苷酸序列。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码Aβ结合、分选蛋白结合、Tau蛋白结合、SEMA4D结合、α-突触核蛋白结合、SOD1结合或CGRPR结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/2A接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗Aβ、抗分选蛋白、抗Tau蛋白、抗SEMA4D、抗α-突触核蛋白、抗SOD1或抗CGRPRmAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类CNS细胞中的表达的调控序列。
5.4.2用于递送至肝脏细胞或肌肉细胞的构建体
章节5.3.8、5.3.9、5.3.10、5.3.11、5.3.12、5.3.13、5.3.14、5.3.15、5.3.16、5.3.17、5.3.18、5.3.19、5.3.20和5.3.21描述了重组载体，其含有编码结合VEGF、EpoR、ALK-1、C5、ENG、CC1Q、TNFα、RGMa、TTR、CTGF、IL6R、IL6、CD19、ITGF7、SOST、pKal、IL-6、IL-6R、IL/ILR、IgE或TSLP的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。用于递送转基因的此重组载体可对人类肝脏细胞或肌肉细胞具有向性。此类载体可包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)，例如带有AAV8或AAV9衣壳的那些载体。然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体、痘疮病毒载体或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞(例如人类肌肉细胞或肝脏细胞)中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体。在某些实施方案中，经编码AAV8衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:143，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞(例如人类肌肉细胞或肝脏细胞)中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体。在某些实施方案中，经编码AAV9衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:144，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在其他实施方案中，HuPTM mAb或其抗原结合片段(包括HuPTM Fab转基因)应由用于在人类肝脏细胞或肌肉细胞中表达HuPTM Fab的适当表达控制元件控制，所述表达控制元件例如CB7启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子，SEQ ID NO:411)；EF-1α启动子(SEQ ID NO:415)；mU1a(SEQ ID NO:414)；或肝脏特异性启动子，例如TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子(SEQ ID NO:423)、APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、ApoE.hAAT启动子(SEQ ID NO:412)或MIR122启动子；或肌肉特异性启动子，例如人类肌间线蛋白启动子、CK8启动子(SEQ ID NO:413)或人类Pitx3启动子；或诱导型启动子，例如低氧诱导型启动子或雷帕霉素诱导型启动子，并且所述HuPTM mAb或其抗原结合片段可包括增强由载体驱动的转基因的表达的其他表达控制元件(例如内含子如鸡β-肌动蛋白内含子、小鼠微小病毒(MVM)内含子、人类因子IX内含子(例如FIX截短内含子1)、β-珠蛋白剪接供体/免疫球蛋白重链剪接受体内含子、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体内含子、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)内含子和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体内含子；和polyA信号，例如兔β-珠蛋白polyA信号、人类生长激素(hGH)polyA信号、SV40晚期polyA信号、合成polyA(SPA)信号和牛生长激素(bGH)polyA信号)。参见例如Powell和Rivera-Soto,2015,Discov.Med.,19(102):49-57。
在一些实施方案中，转基因表达是由组织特异性启动子或促进组织特异性的调控元件控制，例如针对肝脏特异性表达的LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQ ID NO:316)、LTP1(SEQ ID NO:317)、LTP2(SEQ ID NO:318)或LTP3(SEQ ID NO:319)；针对肝脏和肌肉表达的LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQ ID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ IDNO:326)；或针对肝脏和骨表达的LBTP1(SEQ ID NO:327)或LBTP2(SEQ ID NO:328)，其序列提供于表1中。
基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链均得以表达。更具体来说，重链和轻链应以大约相等的量表达，换句话说，重链和轻链以重链与轻链约1:1的比率表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。重链和轻链中的每一者的前导序列是例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。上文章节5.1.5提供可用于本文所提供的方法和组合物的特异性IRES、2A和其他接头序列。在特定实施方案中，接头是弗林蛋白酶-2A接头，例如弗林蛋白酶-F2A接头RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:231)或弗林蛋白酶-T2A接头RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:429)。在特定实施方案中，转基因是编码以下的核苷酸序列：信号序列-重链Fab部分-弗林蛋白酶-2A接头-信号序列-轻链Fab部分。例如，用于GSK933776Fab表达的序列参见图2B；用于赛伐珠单抗和LKA-651Fab表达的序列分别参见图9A至图9C；用于阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗和卡妥昔单抗Fab表达的序列分别参见图10A至图10D；用于ANX-007Fab表达的序列参见图11；用于阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗Fab表达的序列参见图12A至图12C；用于艾利扎单抗Fab表达的序列参见图13；用于NI-301和PRX-004Fab表达的序列分别参见图14A和图14B；用于帕姆单抗Fab表达的序列参见图15；用于赛他利单抗、赛瑞单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗、托珠单抗和英比利珠单抗Fab表达的序列分别参见图16A至图16I；用于艾托珠单抗Fab表达的序列参见图17；用于若莫珠单抗Fab表达的序列参见图18；用于拉那鲁单抗Fab表达的序列参见图19；并且用于贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗、奈莫利珠单抗、奥马珠单抗和特泽派单抗Fab表达的序列分别参见图29A至图29F。在一个替代性实施方案中，构建体还包含用于表达全长mAb的编码治疗性抗体的Fc结构域(参见表7或图23)的核苷酸序列。在特定实施方案中，表达拉那鲁单抗的转基因序列提供于表8中。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)诱导型启动子，例如低氧诱导型启动子，或组织特异性启动子，例如ApoE.hAAT、LSPX1、LMTP6或CK8或表1中所公开的其他启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码VEGF结合、EpoR结合、ALK-1结合、C5结合、ENG结合、CC1Q结合、TNF-α结合、RGMa结合、TTR结合、CTGF结合、IL6R结合、IL6结合、CD19结合、ITGF7结合、SOST结合、pKal结合、IL-6或IL6R结合、IL/ILR结合、IgE结合或TSLP结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/2A接头或T2A接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子或组织特异性启动子(例如ApoE.hAAT或LSPX1)，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；和(3)编码VEGF结合、EpoR结合、ALK-1结合、C5结合、ENG结合、CC1Q结合、TNF-α结合、RGMa结合、TTR结合、CTGF结合、IL6R结合、IL6结合、CD19结合、ITGF7结合、SOST结合、pKal结合、IL-6或IL-6R、IL/ILR结合、IgE结合或TSLP结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/2A接头或T2A接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗VEGF、抗EpoR、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNF-α、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗IL6R、抗IL6、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal、IL-6或IL-6R、抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗VEGF、抗EpoR、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNF-α、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗IL6R、抗IL6、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal、IL-6或IL-6R、抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类肌肉细胞中的表达的调控序列。
在某些实施方案中，rAAV包含编码例如拉那鲁单抗的抗激肽释放酶抗体的转基因，并且构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)调控控制元件，a)启动子/增强子，例如如表1中的Sp7(SEQ ID NO:329)、minSP7(SEQ ID NO:329)、ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)、LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQ ID NO:316)、LTP1(SEQID NO:317)、LTP2(SEQ ID NO:318)、LTP3(SEQ ID NO:319)、LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)、LMTP20(SEQ ID NO:326)、LBTP1(SEQ ID NO:327)或LBTP2(SEQ ID NO:328)中的任一者，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码拉那鲁单抗的重链和轻链(L01(SEQ ID NO:141)、L02(SEQ ID NO:286)或L03(SEQ ID NO:287)，表8)的核酸序列，其中重链(Fab和Fc区)和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/F2A(SEQ IDNO:231)或弗林蛋白酶(F)/T2A(SEQ ID NO:429)或柔性接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。在特定实施方案中，表达拉那鲁单抗的转基因具有序列SEQ ID NO:435至443。
5.4.3用于递送至视网膜细胞类型的构建体
章节5.3.8、5.3.9、5.3.10、5.3.11、5.3.15、5.3.19和5.3.20描述了重组载体，其含有编码结合于VEGF、EpoR、Aβ肽、激肽释放酶、ALK-1、C5、ENG、CC1Q、TNFα、IL6R、IL6和CD19的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。用于递送转基因的此类重组载体可对一种或多种人类视网膜细胞类型具有向性。此类载体可包括非复制型重组腺相关病毒载体(“rAAV”)，例如带有AAV8衣壳的那些载体。或者，可使用带有AAV2.7m8衣壳的AAV载体。然而，可使用其他病毒载体，包括(但不限于)慢病毒载体、痘疮病毒载体或称为“裸DNA”构建体的非病毒表达载体。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞(例如视网膜细胞或肝脏细胞类型)中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体。在某些实施方案中，经编码AAV8衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:143，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用的基因疗法的构建体，其包含AAV载体，所述AAV载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV2.7m8衣壳(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和病毒或人工基因组，所述病毒或人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码治疗性抗体的重链和轻链的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类细胞(例如视网膜细胞或肝脏细胞类型)中的表达的调控序列，所述一个或多个调控序列以如本文所公开的治疗上适当的方式表达和递送治疗性抗体。在某些实施方案中，经编码AAV2.7m8衣壳具有含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，特别是由存在于其他AAV衣壳中的对应位置(例如图21的SUBS行中)的氨基酸残基进行的取代的序列SEQ ID NO:142，图21提供了各种AAV的衣壳序列的氨基酸序列的比较，突出显示了适合于衣壳序列内不同位置处的取代的氨基酸。
在一些实施方案中，HuPTM mAb或其抗原结合片段(包括HuPTM Fab转基因)应由用于在人类视网膜细胞或肝脏细胞类型中表达HuPTM Fab或HuPTM Mab的适当表达控制元件控制，所述表达控制元件例如CB7启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子，SEQ ID NO:411)；或组织特异性启动子，例如RPE特异性启动子(例如RPE65启动子)，或视锥特异性启动子(例如视蛋白启动子)，或肝脏特异性启动子，例如TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子(SEQID NO:423)、APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、ApoE.hAAT启动子(SEQ ID NO:412)或MIR122启动子；或诱导型启动子，例如低氧诱导型启动子或药物诱导型启动子(例如由雷帕霉素和相关药剂诱导的启动子)，并且所述HuPTM mAb或其抗原结合片段可包括增强由载体驱动的转基因的表达的其他表达控制元件(例如内含子如鸡β-肌动蛋白内含子、小鼠微小病毒(MVM)内含子、人类因子IX内含子(例如FIX截短内含子1)、β-珠蛋白剪接供体/免疫球蛋白重链剪接受体内含子、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体内含子、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)内含子和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体内含子；和polyA信号，例如兔β-珠蛋白polyA信号、人类生长激素(hGH)polyA信号、SV40晚期polyA信号、合成polyA(SPA)信号和牛生长激素(bGH)polyA信号)。参见例如Powell和Rivera-Soto,2015,Discov.Med.,19(102):49-57。在一些实施方案中，转基因表达是由组织特异性启动子或促进组织特异性的调控元件控制，例如针对肝脏特异性表达的LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQ ID NO:316)、LTP1(SEQ ID NO:317)、LTP2(SEQ ID NO:318)或LTP3(SEQ ID NO:319)；针对肝脏和肌肉表达的LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ IDNO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQ ID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ ID NO:326)；或针对肝脏和骨表达的LBTP1(SEQ ID NO:327)或LBTP2(SEQ IDNO:328)，其序列提供于表1中。
用于抗体或Fab的基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链都得以表达。更具体来说，重链和轻链应以大约相等的量表达，换句话说，重链和轻链以重链与轻链约1:1的比率表达。重链和轻链的编码序列可在单一构建体中被工程化，其中重链和轻链通过可切割接头或IRES分开，从而表达分开的重链和轻链多肽。重链和轻链中的每一者的前导序列是例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)。上文章节5.1.5提供可用于本文所提供的方法和组合物的特异性IRES、2A和其他接头序列。在特定实施方案中，接头是弗林蛋白酶-2A接头，例如弗林蛋白酶-F2A接头RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:231)或弗林蛋白酶-T2A接头RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:429)。在特定实施方案中，转基因是编码以下的核苷酸序列：信号序列-重链Fab部分-弗林蛋白酶(F/T)2A接头-信号序列-轻链Fab部分。用于索拉珠单抗、GSK933776和仑卡奈单抗Fab表达的序列分别参见图2A至图2C；用于赛伐珠单抗和LKA-651Fab表达的序列分别参见图9A至图9C；用于阿伐苏单抗、特度鲁单抗、拉瓦利单抗和卡妥昔单抗Fab表达的序列分别参见图10A至图10D；用于ANX-007Fab表达的序列参见图11；用于阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗Fab表达的序列分别参见图12A至图12C；用于赛他利单抗、赛瑞单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗、吉瑞利单抗和托珠单抗、英比利珠单抗Fab表达的序列分别参见图16A至图16I；并且用于拉那鲁单抗Fab表达的序列参见图19(并且编码拉那鲁单抗和拉那鲁单抗转基因的核苷酸序列也参见表8)。在一个替代性实施方案中，构建体还包含用于表达全长mAb的编码治疗性抗体的Fc结构域(参见表7或图23)的核苷酸序列(并且拉那鲁单抗的核苷酸序列参见表8)。
在一个特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；以及(3)编码VEGF结合、EpoR结合、抗Aβ、ALK-1结合、C5结合、ENG结合、CC1Q结合、TNFα结合、激肽释放酶结合、IL6R结合、IL6结合和CD19结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/2A接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在另一个实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；以及(3)编码VEGF结合、EpoR结合、Aβ结合、ALK-1结合、C5结合、ENG结合、CC1Q结合、TNFα结合、激肽释放酶结合、IL6R结合、IL6结合和CD19结合Fab的重链和轻链的核酸序列，所述重链和轻链通过柔性肽接头分开，从而确保适当折叠和溶解性。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗激肽释放酶、抗IL6R、抗IL6和抗CD19 mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在一个或多个视网膜细胞类型(例如人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞)中的表达的调控序列。
5.5剂量施用
5.5.1用于递送至CNS的施用.
章节5.3.1、5.3.2、5.3.3、5.3.4、5.3.5、5.3.6和5.3.7描述了重组载体，其含有编码分别结合于Aβ、分选蛋白、Tau蛋白、SEMA4D、α-突触核蛋白、SOD1和CGRPR的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。应以使得重组载体进入CNS的任何方式，例如通过将重组载体引入至大脑脊髓液(CSF)中来施用治疗有效量的任何此类重组载体。在特定实施方案中，鞘内施用，特别是脑池内施用(例如至小脑延髓池)或替代地腰椎递送施用载体。或者，重组载体可经静脉内施用。特别是，已显示重组AAV9载体跨越血脑屏障，并且因而可用于将抗Aβ、抗分选蛋白、抗Tau、抗SEMA4D、抗α-突触核蛋白、抗SOD1或抗CGRPR抗体转基因产物递送至CNS。具体来说，scAAV9可特别适用于静脉内施用。鞘内(包括脑池内或腰椎施用)或静脉内施用应导致可溶转基因产物在CNS细胞中的表达。转基因产物(例如经编码抗Aβ、抗分选蛋白、抗Tau、抗SEMA4D、抗α-突触核蛋白、抗SOD1或抗CGRPR抗体)的表达导致转基因产物在CNS中的递送和维持。因为转基因产物持续产生，所以维持较低浓度可为有效的。转基因产物的浓度可在CSF的患者样本中测量。
适合于鞘内、脑池内、腰椎或静脉内施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液的制剂缓冲液中的悬浮液，所述重组载体包含编码抗Aβ、抗分选蛋白、抗Tau、抗SEMA4D、抗α-突触核蛋白、抗SOD1或抗CGRPR抗体或其抗原结合片段的转基因。所述制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。
5.5.2用于递送至肝脏或肌肉组织的施用
章节5.3.8、5.3.9、5.3.10、5.3.11、5.3.12、5.3.13、5.3.14、5.3.15、5.3.16、5.3.17、5.3.18、5.3.19、5.3.20和5.3.21描述了重组载体，其含有编码结合VEGF、EpoR、Aβ、ALK-1、C5、ENG、CC1Q、TNFα、RGMa、TTR、CTGF、IL6R、IL6、CD19、ITGF7、SOST、pKal、IL/ILR、IgE或TSLP的HuPTM mAb或HuPTM Fab(或HuPTM mAb的其他抗原结合片段)的转基因。应以使得重组载体进入肝脏或肌肉(例如骨骼肌)的任何方式，例如通过将重组载体引入至血流中来施用治疗有效量的任何此类重组载体。或者，可经由肝血流，例如经由肝上静脉或经由肝动脉直接向肝脏施用载体。在特定实施方案中，皮下、肌肉内或静脉内施用载体。肌肉内、皮下、静脉内或肝施用应导致可溶转基因产物在肝脏细胞或肌肉细胞中的表达。或者，可经由肝血流，例如经由肝上静脉或经由肝动脉直接向肝脏施用载体。转基因产物(例如经编码抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗ALK1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗IL6R、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal、抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体)的表达导致转基因产物在肝脏或肌肉中的递送和维持。
在特定实施方案中，提供将抗TNFα抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少0.5μg/mL或至少1μg/mL的Cmin(例如1至10μg/ml、3至30μg/ml或5至15μg/mL或5至30μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少5μg/mL的Cmin(例如5至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)，优选地约8μg/mL至9μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供将英利昔单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少2μg/mL的Cmin(例如2至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)，优选地约5μg/mL至6μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗CD19转基因产物的血浆浓度维持在至少1μg/ml的Cmin(例如1至10μg/ml或10至100μg/ml或100至300μg/ml的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，需要将抗SOST抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少1μg/ml的Cmin(例如1至10μg/ml或10至100μg/ml或100至200μg/ml的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将赛瑞单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少5μg/ml的Cmin(例如5至20μg/ml或20至50μg/ml的Cmin)，优选地约15μg/mL至20μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供将托珠单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少1μg/ml的Cmin(例如1至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将司妥昔单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少20μg/ml的Cmin(例如20至100μg/ml或100至200μg/ml的Cmin)，优选地约80μg/mL至90μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗CTGF抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少100μg/ml的Cmin(例如100至200μg/ml或200至300μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗ENG抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少10μg/mL的Cmin的剂量，例如10至100μg/ml、或100至300μg/ml、或300至600μg/ml的Cmin。
在特定实施方案中，提供将抗C5抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少10μg/ml的Cmin(例如10至100μg/ml、或100至200μg/mL、或200至300μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将拉瓦利单抗抗体或其抗原结合片段在未接受过补体抑制剂的患者中的血浆浓度维持在至少200μg/mL的Cmin(例如200至300μg/ml、或300至400μg/mL、或400至600μg/mL的Cmin)，优选地约350至450μg/mL的Cmin，以及维持在约450至550μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗IL/ILR抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少0.1μg/mL的Cmin(例如0.1至10μg/ml、或10至20μg/mL、或20至100μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗IgE抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少100μg/mL的Cmin(例如100至200μg/ml、或200至300μg/mL、或300至400μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将抗TSLP抗体转基因产物的血浆浓度维持在至少70μg/ml的Cmin(例如70至150μg/ml、或100至200μg/mL、或200至350μg/mL的Cmin)的剂量。
在特定实施方案中，提供将拉那鲁单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少10μg/mL的Cmin(例如10至50μg/ml、或50至100μg/mL、或100至200μg/mL的Cmin)，优选地约20至30μg/mL的Cmin的剂量。
然而，在所有情况下，因为转基因产物持续产生，所以维持较低浓度可为有效的。然而，因为转基因产物持续产生，所以维持较低浓度可为有效的。转基因产物的浓度可在患者血清样本中测量。
适合于静脉内、肌肉内、皮下或肝施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液的制剂缓冲液中的悬浮液，所述重组载体包含编码抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗IL6R、抗IL6、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal、抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP抗体或其抗原结合片段的转基因。所述制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。
5.5.3用于递送至视网膜类细胞的施用
应以使得重组载体进入视网膜的任何方式，例如通过将重组载体直接引入至眼睛中来施用治疗有效量的重组载体。在特定实施方案中，例如通过微量注射或微插管来视网膜下施用(由训练有素的视网膜外科医师进行的涉及在局部麻醉下对受试者进行部分玻璃体切除术和将基因治疗剂注射至视网膜中的手术程序；参见例如Campochiaro等人,2016,Hum Gen Ther 9月26日电子版：doi:10.1089/hum.2016.117，其通过引用整体并入本文)、或玻璃体内施用、或脉络膜上施用载体。(参见例如Patel等人,2012,Invest Ophth&VisSci 53:4433-4441；Patel等人,2011,Pharm Res 28:166-176；Olsen,2006,Am J Ophth142:777-787，其中的每一者通过引用整体并入)。视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用应使得可溶转基因产物表达在以下视网膜细胞类型中的一者或多者中：人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞。
转基因产物(例如经编码抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗pKal、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗IL6R、抗IL6和抗CD19抗体)的表达导致转基因产物在视网膜中的递送和维持。适合于施用的药物组合物包含重组载体于包含生理学上相容的水性缓冲液的制剂缓冲液中的悬浮液，所述重组载体包含编码抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗pKal、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗IL6R、抗IL6和抗CD19抗体或其抗原结合片段的转基因。所述制剂缓冲液可包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一者或多者。
在特定实施方案中，提供了将阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少5μg/mL的Cmin(例如5至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)，优选地约8μg/mL至9μg/mL的Cmin的剂量。在特定实施方案中，包含编码阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的转基因的载体的剂量和施用途径应导致阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的表达，所述表达实现和维持与通过剂量1.5mg修美乐(Humira)的每月玻璃体内注射实现的玻璃体内浓度等效的水平的阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的玻璃体内浓度。
在特定实施方案中，提供了将英利昔单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少2μg/mL的Cmin(例如2至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)，优选地约5μg/mL至6μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供了将赛瑞单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少5μg/ml的Cmin(例如5至20μg/ml或20至50μg/ml的Cmin)，优选地约15μg/mL至20μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，包含编码赛他利单抗抗体或其抗原结合片段的转基因的载体的剂量和施用途径应导致赛他利单抗抗体或其抗原结合片段的表达，所述表达实现和维持与通过剂量120mg的SA237(Roche)的每月皮下注射实现的玻璃体内浓度等效的水平的赛他利单抗抗体或其抗原结合片段的玻璃体内浓度。
在特定实施方案中，提供了将托珠单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少1μg/ml的Cmin(例如1至10μg/ml或10至20μg/ml的Cmin)的剂量。在特定实施方案中，包含编码托珠单抗抗体或其抗原结合片段的转基因的载体的剂量和施用途径应导致托珠单抗抗体或其抗原结合片段的表达，所述表达实现和维持与通过剂量4mg/kg或8mg/kg的RoActemra的每月静脉内注射实现的全身性浓度等效的水平的阿达木单抗抗体或其抗原结合片段的全身性浓度。
在特定实施方案中，提供了将司妥昔单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少20μg/ml的Cmin(例如20至100μg/ml或100至200μg/ml的Cmin)，优选地约80μg/mL至90μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供了将拉瓦利单抗抗体或其抗原结合片段在未接受过补体抑制剂的患者中的血浆浓度维持在至少200μg/mL的Cmin(例如200至300μg/ml、或300至400μg/mL、或400至600μg/mL的Cmin)，优选地约350至450μg/mL的Cmin，以及维持在约450至550μg/mL的Cmin的剂量。
在特定实施方案中，提供了将拉那鲁单抗抗体或其抗原结合片段的血浆浓度维持在至少10μg/mL的Cmin(例如10至50μg/ml、或50至100μg/mL、或100至200μg/mL的Cmin)，优选地约20至30μg/mL的Cmin的剂量。
5.6用于表达HuPTM mAb的构建体和方法
实施例36和37证实拉那鲁单抗的全长重链和轻链是从人类HEK293细胞中的AAV载体转基因表达并分泌于细胞上清液中(图24B至图24D)。经施用携载编码拉那鲁单抗的全长重链和轻链的转基因的重组AAV8和重组AAV9载体的小鼠的血清中存在拉那鲁单抗，如在施用之后七周通过ELISA可检测(图25)。因此，本文提供了AAV构建体、载体、制造方法和治疗方法，其包含转基因，所述转基因编码在表达后缔合以形成具有Fc结构域的抗原结合抗体的全长重链(包括重链可变结构域、重链恒定结构域1(CH1)、铰链和Fc结构域)和全长轻链(轻链可变结构域和轻链恒定结构域)。重组AAV构建体在细胞、细胞培养物或受试者中表达完整(即，全长)或基本上完整HuPTM mAb。(“基本上完整”是指具有与全长mAb序列具至少95％同一性的序列的mAb)。编码重链和轻链的核苷酸序列可针对人类细胞中的表达进行密码子优化并降低CpG二聚体在序列中的出现率以促进人类细胞中的表达。转基因可编码任何全长抗体。在优选的实施方案中，转基因编码本文所公开的治疗性抗体中的任一者的全长形式，例如，本文于图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F中所描绘的那些抗体的Fab片段，并且在某些实施方案中，包括表7中所提供的相关Fc结构域。在其他实施方案中，转基因编码2018年10月17日提交的PCT申请第PCT/US2018/056346号的图2A至图2F、图3A至图3E、图4A、图4B、图5A至图5C、图6、图7A、图7B、图8A至图8H、图9A或图9B中的一者中所描绘的治疗性抗体的Fab片段的全长形式，所述全长形式具有Fc结构域，所述PCT申请通过引用并入本文(其附图作为其附录包括在内)。
由本文所描述的转基因编码的全长mAb优选地具有全长治疗性抗体的Fc结构域，或者是与待表达治疗性抗体相同类型的免疫球蛋白的Fc结构域。在某些实施方案中，Fc区是IgG Fc区，但在其他实施方案中，Fc区可为IgA、IgD、IgE或IgM。Fc结构域优选地是与待表达治疗性抗体相同的同种型，例如，如果治疗性抗体是IgG1同种型，则由所述转基因表达的抗体包含IgG1 Fc结构域。从转基因表达的抗体可具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
完整mAb的Fc区具有一个或多个随抗体同种型变化的效应功能。所述效应功能可与野生型或治疗性抗体的效应功能相同，或者可使用上文章节5.1.9中所公开的Fc修饰从其进行修饰，以添加、增强、修改或抑制一个或多个效应功能。在某些实施方案中，HuPTMmAb转基因编码包含Fc多肽或图23中所列的IgG1、IgG2或IgG4同种型的示例性Fc结构域的mAb，所述Fc多肽包含与表7中所列的本文所描述治疗性抗体的Fc结构域多肽中所列的序列具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，HuPTM mAb包含Fc多肽，所述Fc多肽包含表7或图23中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸取代、插入或缺失的Fc多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，HuPTM mAb包含具有如下序列的Fc多肽，所述序列是表7或图23中的Fc多肽序列的变体，变化之处在于所述序列已通过上文章节5.1.9中所描述的所述技术中的一者或多者修饰以改变Fc多肽的效应功能。
在特定实施方案中，提供了用于向人类受试者施用以便在受试者中表达完整或基本上完整HuPTM mAb的基因疗法的重组AAV构建体，例如图1或图24A中所示的构建体。基因疗法构建体被设计成使得重链和轻链两者以串联方式从包括重链的Fc结构域多肽的载体表达。在某些实施方案中，所述转基因编码具有如下图中的一者中所示的重链和轻链Fab片段多肽的转基因：图2A至图2C、图3、图4A至图4C、图5、图6A至图6C、图7A至图7B、图8A至图8C、图9A至图9C、图10A至图10D、图11、图12A至图12C、图13、图14A至图14B、图15、图16A至图16I、图17、图18、图19和图29A至图29F，或2018年10月17日提交的PCT申请第PCT/US2018/056346号的图2A至图2F、图3A至图3E、图4A、图4B、图5A至图5C、图6、图7A、图7B、图8A至图8H、图9A或图9B(这些附图的副本包括于其附录中并且还通过引用并入本文)，但所述转基因具有重链，所述重链在重链的铰链区的C末端进一步包含Fc结构域多肽(包括表7中所列的对应Fc结构域或如图23中的IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域)。在特定实施方案中，转基因是编码以下的核苷酸序列：信号序列-重链Fab部分(包括铰链区)-重链Fc多肽-弗林蛋白酶-2A接头-信号序列-轻链Fab部分。
提供了重组AAV载体，其包含编码全长抗体的构建体。rAAV包括(但不限于)基于AAV的载体，包含来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10或AAVrh20中的一者或多者的衣壳组分。在优选的实施方案中，本文所提供的基于AAV的载体包含来自AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10或AAVrh20血清型中的一者或多者的衣壳。可针对对本文中详述的特定组织类型的向性有利地选择AAV血清型。
可施用编码和表达全长治疗性抗体的rAAV载体以治疗或防止能够用治疗性抗体治疗、预防或改善症状的疾病或疾患，或改善其症状。还提供了使用编码HuPTM mAb的rAAV载体和构建体在人类细胞中表达HuPTM mAb的方法。
5.6.1.HuPTM mAb在CNS细胞中的全长表达
在关于在视网膜细胞类型中表达完整或基本上完整mAb的特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；以及(3)编码以下的核酸序列：抗AβmAb(例如索拉珠单抗、仑卡奈单抗和GSK933776)、抗分选蛋白mAb(例如AL-001)、抗Tau蛋白mAb(例如ABBV-8E12、UCB-0107、NI-105(BIIB076)和aTAU)、抗SEMA4D mAb(例如VX15/2503)、抗α-突触核蛋白mAb(例如普拉森单抗、NI-202(BIIB054)和MED-1341)、抗SOD1 mAb(例如NI-204)或抗CGRPR mAb(例如伊普汀单抗、福瑞满单抗和伽奈珠单抗)的重链Fab，所述Fc多肽可为与治疗性抗体(表7)相关或具有与治疗性抗体的原生形式相同的同种型的Fc，例如来自图23的IgG同种型氨基酸序列；以及抗AβmAb(例如索拉珠单抗、仑卡奈单抗和GSK933776)、抗分选蛋白mAb(例如AL-001)、抗Tau蛋白mAb(例如ABBV-8E12、UCB-0107、NI-105(BIIB076)和aTAU)、抗SEMA4D mAb(例如VX15/2503)、抗α-突触核蛋白mAb(例如普拉森单抗、NI-202(BIIB054)和MED-1341)、抗SOD1 mAb(例如NI-204)或抗CGRPR mAb(例如伊普汀单抗、福瑞满单抗和伽奈珠单抗)的轻链Fab，其中重链(Fab和Fc多肽)和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/2A或T2A或柔性接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性或完全同一；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码完整或基本上完整抗Aβ、抗分选蛋白、抗Tau蛋白、抗SEMA4D、抗α-突触核蛋白、抗SOD1或抗CGRPR mAb的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类CNS细胞中的表达的调控序列。还提供了产生HuPTM mAb的方法以及通过施用编码HuPTM mAb的rAAV或利用HuPTM mAb来治疗、预防能够用治疗性抗体治疗、预防或改善症状的疾病或疾患或改善其症状的方法。
5.6.2mAB在肝脏细胞或肌肉细胞中的全长表达
在关于在肌肉细胞或肝脏细胞类型中表达完整或基本上完整mAb的特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)诱导型启动子，优选地低氧诱导型启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；以及(3)编码以下的核酸序列：抗VEGF(例如赛伐珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿伐苏单抗)、抗C5(例如特度鲁单抗和拉瓦利单抗)、抗内皮糖蛋白(例如卡妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如艾利扎单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)、抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)、抗CD19(例如英比利珠单抗)、抗ITGF7 mAb(例如艾托珠单抗)、抗SOST mAb(例如若莫珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那鲁单抗)、抗IL/ILR(例如贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗和奈莫利珠单抗)、抗IgE(例如奥马珠单抗)或抗TSLP(例如特泽派单抗)的重链Fab；与治疗性抗体(表7)相关或具有与治疗性抗体的原生形式相同的同种型的Fc多肽，例如来自图23的IgG同种型氨基酸序列；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿伐苏单抗)、抗C5(例如特度鲁单抗和拉瓦利单抗)、抗CD105或抗ENG(例如卡妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如艾利扎单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)、抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)、抗CD19(例如英比利珠单抗)、抗ITGF7 mAb(例如艾托珠单抗)、抗SOST mAb(例如若莫珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那鲁单抗)、抗IL/ILR(例如贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、塔罗金单抗和奈莫利珠单抗)、抗IgE(例如奥马珠单抗)或抗TSLP(例如特泽派单抗)的轻链；其中重链(Fab和Fc区)和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/F2A或T2A或柔性接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码完整或基本上完整抗VEGF、抗EpoR、抗ALK-1、抗Aβ、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal mAb、抗IL6R、抗IL6、抗IL/ILR、抗IgE或抗TSLP的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV9(SEQID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中表达盒包含编码完整或基本上完整抗VEGF、抗EpoR、抗Aβ、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗RGMa、抗TTR、抗CTGF、抗IL6R、抗IL6、抗CD19、抗ITGF7、抗SOST、抗pKal mAb、抗IL/ILR、抗ITGA4、抗IgE或抗TSLP的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在人类肌肉细胞中的表达的调控序列。
5.6.3mAb在视网膜细胞类型中的全长表达
在关于在视网膜细胞类型中表达完整或基本上完整mAb的特定实施方案中，本文所描述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV2反向末端重复序列；(2)控制元件，其包括a)包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的CB7启动子，b)鸡β-肌动蛋白内含子，和c)兔β-珠蛋白poly A信号；以及(3)编码以下的核酸序列：抗VEGF(例如赛伐珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗Aβ(例如索拉珠单抗、仑卡奈单抗和GSK933776)、抗ALK1(例如阿伐苏单抗)、抗C5(例如特度鲁单抗、拉瓦利单抗)、抗CD105或抗ENG(例如卡妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)、抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)、抗CD19(例如英比利珠单抗)的重链Fab；与治疗性抗体(表6)相关或具有与治疗性抗体的原生形式相同的IgG同种型的Fc多肽，例如来自图23的IgG同种型氨基酸序列；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗)、抗Aβ(例如索拉珠单抗、仑卡奈单抗和GSK933776)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿伐苏单抗)、抗C5(例如特度鲁单抗和拉瓦利单抗)、抗CD105或抗内皮糖蛋白(例如卡妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英利昔单抗和戈利木单抗)、抗IL6R(例如赛他利单抗、赛瑞单抗和托珠单抗)、抗CD19(例如英比利珠单抗)和抗IL6(例如司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗和吉瑞利单抗)的轻链，其中重链(Fab和Fc多肽)和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/F2A或柔性接头分开，从而确保等量重链和轻链多肽的表达。示例性构建体提供于图1中。
在特定实施方案中，提供了AAV载体，其包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列具至少95％同一性；和人工基因组，所述人工基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码完整或基本上完整抗VEGF、抗fD、抗MMP9、抗EpoR、抗Aβ、抗ALK-1、抗C5、抗ENG、抗CC1Q、抗TNFα、抗IL6R、抗IL6或抗CD19 mAb的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制转基因在一个或多个视网膜细胞类型(例如人类感光细胞(视锥细胞、视杆细胞)、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、视网膜神经节细胞(侏儒细胞、阳伞细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、感光神经节细胞和穆勒神经胶质)和视网膜色素上皮细胞)中的表达的调控序列。
6.实施例
6.1实施例1：基于索拉珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于索拉珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码索拉珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和2)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化。核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.71和72。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图2A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.2实施例2：基于GSK933776Fab cDNA的载体
构建基于GSK933776Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码GSK933776的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和4)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化。核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.73和74。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图2B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.3实施例3：基于AL-001Fab cDNA的载体
构建基于AL-001Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码AL-001的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5和6)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.75和76。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图3。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.4实施例4：基于ABBV-8E12 Fab cDNA的载体
构建基于ABBV-8E12 Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码ABBV-8E12的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.7和8)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.77和78。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图4A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.5实施例5：基于UCB-0107Fab cDNA的载体
构建基于UCB-0107Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码UCB-0107的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9和10)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.79和80。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图4B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.6实施例6：基于NI-105Fab cDNA的载体
构建基于NI-105Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码NI-105的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.11和12)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.81和82。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图4C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.7实施例7：基于VX15/2503Fab cDNA的载体
构建基于VX15/2503Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码VX15/2503的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.13和14)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.83和84。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图5。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.8实施例8：基于普拉森单抗Fab cDNA的载体
构建基于普拉森单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码普拉森单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.15和16)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.85和86。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图6A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.9实施例9：基于NI-202Fab cDNA的载体
构建基于NI-202Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码NI-202的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.17和18)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.87和88。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图6B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.10实施例10：基于MEDI-1341/TAK 341Fab cDNA的载体
构建基于MEDI-1341/TAK 341Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码MEDI-1341/TAK 341的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.19和20)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.89和90。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图6C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.11实施例11：基于NI-204.10D12 Fab cDNA的载体
构建基于NI-204.10D12 Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码NI-204.10D12的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.21和22)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.91和92。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图7A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.12实施例12：基于NI-204.12G7 Fab cDNA的载体
构建基于NI-204.12G7 Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码NI-204.12G7的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.23和24)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.93和94。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图7B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.13实施例13：基于伊普汀单抗Fab cDNA的载体
构建基于伊普汀单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码伊普汀单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.25和26)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.95和96。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图8A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.14实施例14：基于福瑞满单抗Fab cDNA的载体
构建基于福瑞满单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码福瑞满单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.27和28)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.97和98。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图8B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.15实施例15：基于伽奈珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于伽奈珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码伽奈珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.29和30)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.99和100。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图8C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.16实施例16：基于赛伐珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于赛伐珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码赛伐珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.31和32)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.101和102。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图9A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.17实施例17：基于LKA-651(NVS2)Fab cDNA的载体
构建基于LKA-651(NVS2)Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码LKA-651(NVS2)的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.33和34)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.103和104。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图9B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.18实施例18：基于LKA-651(NVS3)Fab cDNA的载体
构建基于LKA-651(NVS3)Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码LKA-651(NVS3)的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.35和36)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.105和106。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图9C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.19实施例19：基于阿伐苏单抗Fab cDNA的载体
构建基于阿伐苏单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码阿伐苏单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.37和38)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.107和108。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图10A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.20实施例20：基于特度鲁单抗Fab cDNA的载体
构建基于特度鲁单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码特度鲁单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.39和40)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.109和110。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图10B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.21实施例21：基于卡妥昔单抗Fab cDNA的载体
构建基于卡妥昔单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码卡妥昔单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.41和42)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.111和112。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图10C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.22实施例22：基于ANX-007Fab cDNA的载体
构建基于ANX-007Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码ANX-007的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.43和44)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.113和114。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图11。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.23实施例23：基于阿达木单抗Fab cDNA的载体
构建基于阿达木单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码阿达木单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.45和46)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.115和116。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图12A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.24实施例24：基于英利昔单抗Fab cDNA的载体
构建基于英利昔单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码英利昔单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.47和48)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.117和118。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图12B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.25实施例25：基于戈利木单抗Fab cDNA的载体
构建基于戈利木单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码戈利木单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.49和50)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.119和120。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图12C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.26实施例26：基于艾利扎单抗Fab cDNA的载体
构建基于艾利扎单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码艾利扎单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.51和52)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.121和122。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图13。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.27实施例27：基于NI-301Fab cDNA的载体
构建基于NI-301Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码NI-301的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.53和54)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.123和124。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图14A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.28实施例28：基于PRX-004Fab cDNA的载体
构建基于PRX-004Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码PRX-004的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.55和56)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.125和126。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图14B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.29实施例29：基于帕姆单抗Fab cDNA的载体
构建基于帕姆单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码帕姆单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.57和58)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.127和128。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图15。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.30实施例30：基于赛他利单抗Fab cDNA的载体
构建基于赛他利单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码赛他利单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.59和60)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.129和130。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.31实施例31：基于赛瑞单抗Fab cDNA的载体
构建基于赛瑞单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码赛瑞单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.61和62)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.131和132。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.32实施例32：基于英比利珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于英比利珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码英比利珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.63和64)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.133和134。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.33实施例33：基于艾托珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于艾托珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码艾托珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.65和66)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列针对人类CNS细胞中的表达进行密码子优化，并且可分别为核苷酸序列SEQ ID NO.135和136。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图17。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.34实施例34：基于若莫珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于若莫珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码若莫珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.67和68)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:137和138。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图18。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.35实施例35：基于司妥昔单抗Fab cDNA的载体
构建基于司妥昔单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码司妥昔单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.331和332)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:343和344。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.36实施例36：基于克拉扎珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于克拉扎珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码克拉扎珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.333和334)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:345和346。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16D。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.37实施例37：基于思鲁库单抗Fab cDNA的载体
构建基于思鲁库单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码思鲁库单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.335和336)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:347和348。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16E。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.38实施例38：基于奥洛奇单抗Fab cDNA的载体
构建基于奥洛奇单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码奥洛奇单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.337和338)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:349和350。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16F。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.39实施例39：基于吉瑞利单抗Fab cDNA的载体
构建基于吉瑞利单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码吉瑞利单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.339和340)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:351和352。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16G。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.40实施例40：基于托珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于托珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码托珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.341和342)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:353和354。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图16H。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.41实施例41：基于仑卡奈单抗Fab cDNA的载体
构建基于仑卡奈单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码仑卡奈单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.360和361)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:376和377。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图2C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.42实施例42：基于拉瓦利单抗Fab cDNA的载体
构建基于拉瓦利单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码拉瓦利单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.362和363)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:378和379。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图10D。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.43实施例43：基于贝纳利珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于贝纳利珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码贝纳利珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.364和365)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:380和381。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29A。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.44实施例44：基于瑞利珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于瑞利珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码瑞利珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.366和367)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:382和383。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29B。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.45实施例45：基于塔罗金单抗Fab cDNA的载体
构建基于塔罗金单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码塔罗金单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.368和369)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:384和385。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29C。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.46实施例46：基于奈莫利珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于奈莫利珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码奈莫利珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.370和371)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:386和387。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29D。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.47实施例47：基于奥马珠单抗Fab cDNA的载体
构建基于奥马珠单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码奥马珠单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.372和373)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:388和389。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29E。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.48实施例48：基于特泽派单抗Fab cDNA的载体
构建基于特泽派单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码特泽派单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.374和375)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:390和391。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图29F。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.49实施例49：基于拉那鲁单抗Fab cDNA的载体
构建基于拉那鲁单抗Fab cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码拉那鲁单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.69和70)的Fab部分的核苷酸序列。编码重链和轻链的Fab部分的核苷酸序列可分别为核苷酸序列SEQ ID NO:139和140。转基因还包含编码信号肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过IRES元件或2A切割位点(SEQ ID NO:227-230)分开，以产生双顺反子载体。关于转基因产物的氨基酸序列，参见图19。载体另外包括例如CB7的组成型启动子或例如低氧诱导型启动子的诱导型启动子。
6.50实施例50：细胞溶解产物和上清液中的拉那鲁单抗的蛋白质表达分析
进行细胞培养研究以评定来自AAV构建体的全长mAb序列(含有Fc区)在人类细胞中的表达。
方法
构建基于拉那鲁单抗cDNA的载体，其包含转基因，所述转基因包含编码拉那鲁单抗的重链和轻链序列(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.69和70)的核苷酸序列。编码拉那鲁单抗的重链和轻链的核苷酸序列经密码子优化以产生下文表8中所提供的三个核苷酸序列：L01(SEQ ID NO:141)、L02(SEQ ID NO:286)和L03(SEQ ID NO:287)。L02和L03也降低CpG二聚体在序列中的出现率。转基因还包含编码信号肽MYRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列。编码轻链和重链的核苷酸序列通过弗林蛋白酶-F2A接头(SEQ ID NO:231)或弗林蛋白酶T2A接头(SEQ ID NO:429)分开，以产生双顺反子载体。载体另外包括组成型CAG启动子(SEQ ID NO:411)。关于显示基因组配置的示意图参见图24A，并且构建体的序列提供于表8中(SEQ ID NO:435-437)。
上文表1提供了组成型核酸调控序列的序列，所述组成型核酸调控序列可并入表达盒中并且可操作地连接至转基因以促进肝脏特异性表达(LSPX1、LSPX2、LTP1、LTP2或LTP3，分别为SEQ ID NO:315-319)、肝脏和肌肉表达(LMTP6、LMTP13、LMTP15、LMTP18、LMTP19或LMTP20，分别为SEQ ID NO:320-326)、肝脏和骨表达(LTBP1或LPTP2，分别为SEQID NO:327-328)。提供的其他启动子序列包括ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412，上文表1)启动子，其中肝脏特异性载脂蛋白E(ApoE)增强子的四个拷贝位于人类α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子上游。
表8
将HEK293细胞以7.5x105个细胞/孔的密度涂铺在含有供应有10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium；DMEM)的标准6孔培养皿的每个孔中。第二天，根据制造商的方案使用Lifpofectamine 2000(Invitrogen)用CAG.L01(SEQ ID NO:435)、CAG.L02(SEQ ID NO:437)和CAG.L03(SEQ ID NO:436)AAV构建体转染细胞。非转染细胞用作阴性对照。细胞培养基在转染后24小时变成opti-mem I减少的血清培养基(2毫升/孔)。在转染后48小时收获细胞培养上清液，并且用补充有无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂(Pierce)的RIPA缓冲液(Pierce)收获细胞溶解产物。将上清液和溶解产物样本储存于-80℃。
经由NuPAGE电泳系统(Thermo Fisher Scientific)从上清液或细胞溶解产物样本分离蛋白质。除非另有指示，否则针对来源于细胞溶解产物的样本，装载40μg蛋白质。将经纯化人类IgG或拉那鲁单抗IgG(由Genscript制备)用作内参考物(50-100ng)。用70℃的LDS样本缓冲液和NuPAGE还原剂加热样本10分钟，然后装载至NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶。根据制造商的说明使用iBlot2干印迹系统(iBlot2 dry blotting system)将经分离蛋白质转移至PVDF膜(将P3默认设置用于蛋白质转移)。立即在含0.1％v/v Tween-20的磷酸盐缓冲液生理盐水(PBST)中洗涤膜。然后在室温下将膜在含有PBST和1％澄清牛奶封闭缓冲液(Thermo Scientific)的封闭溶液中温育1小时。然后在补充有山羊抗人类κ轻链-HRP抗体(Bethyl Laboratories；1:2000稀释液)和山羊抗人类IgG Fc-HRP抗体(1:2000稀释液)的新鲜封闭溶液中温育膜。抗体温育后，在PBST中洗涤膜三次，每次洗涤5分钟。最后，将膜在SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物中温育5分钟，并且在用于检测辣根过氧化酶(HRP)信号的BioRad Universal Hood II gel doc系统上成像。
结果
在不同质粒量的转染(4μg至非转染)之后的报告转基因(eGFP)的表达分析显示eGFP水平的剂量依赖性增加(图24B)。细胞溶解产物(图24C)和细胞上清液(图24D)中的拉那鲁单抗的蛋白质表达分析显示细胞溶解产物和上清液中的拉那鲁单抗的剂量依赖性水平。用含有L02转基因(SEQ ID NO:286，CAG.L02(SEQ ID NO:437))的构建体(一种经密码子优化并耗乏CpG二核苷酸序列的构造)转染产生相较于L01转基因(SEQ ID NO:141，CAG.L01SEQ ID NO:435)更高的表达水平。CAG.L02(SEQ ID NO:437)和CAG.L03(SEQ ID NO:436)的转染产生类似表达水平。
6.51实施例51：拉那鲁单抗在小鼠中的血清表达
方法
A.用含有包含L01序列(SEQ ID NO:141)的AAV构建体(如图24A中所描绘)的AAV8或AAV9进行小鼠实验，所述L01序列含有弗林蛋白酶和F2A序列(SEQ ID NO:231)。经由静脉内(IV)或肌肉内(IM)途径向免疫功能降低的NSG小鼠施用AAV8和AAV9载体(n＝5只小鼠/组；2e11个基因组拷贝(gc))。IV施用至尾静脉中，并且IM施用是双侧施用至腓肠肌中。包括注射媒介物的小鼠作为对照。施用后七周，处死小鼠，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定血清人类抗体水平。
通过ELISA评定NSG小鼠血清中的拉那鲁单抗水平。简言之，在处理之前和在体内基因转染后1、3、5和7周获得小鼠血清，并且储存于-80℃。用含1μg/ml人类IgG-Fc片段抗体(Bethyl,Montgomery,TX)的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(0.05M，pH 9.6，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)包被96孔板，并在4℃温育过夜。用Tween 20洗涤缓冲液(PBST，0.05％，AlfaAesar,Haverhill,MA)洗涤后，将板与阻断缓冲液(含3％BSA的PBS，ThermoFisherScientific,Waltham,MA)在37℃一起温育1h，接着洗涤。将稀释于样本稀释缓冲液(0.1％Tween 20和含3％BSA的PBS)中的小鼠血清样本添加至板(50微升/孔)中并在37℃温育2h。每个板包括标准曲线的360至0.001ng/mL范围内的已知拉那鲁单抗浓度。温育后用PBST洗涤板五次。通过在37℃与辣根过氧化酶缀合的山羊抗人类IgG(H+L)(200ng/mL；Bethyl,Montgomery,TX)一起温育1h来检测拉那鲁单抗的水平。遵循制造商的说明使用KPL TMB微孔过氧化酶底物系统(Seracare,Milford,MA)评定光学密度。用SoftMax Pro版本7.0.2软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)进行数据分析。
结果
A.来自代表性实验的结果显示于图25中。基因转移后7周的经AAV8注射、经AAV9注射和对照(媒介物)的NSG小鼠的血清分析显示拉那鲁单抗在AAV9递送后的表达和血清积聚(2E11 gc)。经AAV9注射的小鼠中的血清拉那鲁单抗浓度比经AAV8注射的小鼠高100倍，并且经IV AAV9注射的小鼠中的血清拉那鲁单抗浓度比经IM AAV9注射的小鼠略高。在7周时间点处，对照小鼠中的血清人类抗体水平不可检测。
B.在类似实验中，进行AAV9施用后NSG小鼠中的拉那鲁单抗血清水平的时程(n＝5只/组)。IV或IM注射AAV9载体(2E11 gc)(如上，在实验A中)，并且在第7天(D7)、第21天(D21)、第35天(D35)和第49天(D49)通过ELISA测定血清抗体水平。
早在AAV9施用后1周(D7)时，即可检测NSG小鼠中的血清拉那鲁单抗表达。表达水平在注射后3周(D2)增加，在注射后5周(D35)达到峰值，然后维持至注射后7周(D49)。在整个时程内，观测到IV注射的小鼠的血清拉那鲁单抗浓度比IM注射的小鼠更高。参见图26。
C.在类似实验中，进行AAV8施用后C/57BL6小鼠中的拉那鲁单抗血清水平的时程。当使用AAV8载体静脉内递送时，含有肝脏特异性启动子和具有经修饰弗林蛋白酶-2A处理信号的经密码子优化并耗乏CpG的转基因的优化表达盒产生稳固血清抗体浓度。以1E13gc/kg的剂量进行IV载体施用后，C57BL/6小鼠的血清中获得极高(>1mg/ml)水平和维持水平的功能性抗激肽释放酶抗体。
6.52实施例52：驱动拉那鲁单抗的表达的串联肝脏特异性启动子和串联肝脏/肌肉特异性启动子的体外转导和表达的分析
将表达载体化拉那鲁单抗的顺式质粒包装于AAV中，然后评估rAAV粒子的通过AAV转导的效力。每个顺式质粒含有拉那鲁单抗(Mab1)抗体轻链和重链，所述轻链和重链是由CAG、ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)或LMTP6(SEQ ID NO:320)启动子驱动的多顺反子。全长拉那鲁单抗抗体轻链和抗体重链基因通过弗林蛋白酶2A接头分开以确保每个抗体链的单独表达。整个盒由AAV2 ITR侧接，并且基因组包裹于AAV8衣壳中以供递送至C2C12细胞(1E10vg/孔)。为检测抗体蛋白质，在转导后，用FITC缀合的抗Fc(IgG)抗体处理细胞。AAV8.CAG.Mab1和AAV8.LMTP6.Mab1感染的细胞显示肌肉细胞中的高表达，而AAV8.hAAT.Mab1感染不引起抗体在肌肉细胞中的表达(图27)。在所有测试孔中，细胞似乎均匀地汇合和存活，如通过DAPI(DNA)染色所见(图27)。
6.53实施例53：用由各种启动子驱动的AAV8拉那鲁单抗载体处理的小鼠中的抗体表达和载体生物分布
甲状腺素结合球蛋白(TBG)和α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子已在先前临床前和临床基因疗法研究中广泛地用作肝脏特异性启动子。产生来源于多个启动子和增强子的一组经设计启动子盒，并通过转染Huh7细胞(人类肝脏细胞系)来对其进行体外测试。对启动子候选者进行选择，其包括ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)、LSPX1(SEQ ID NO:315)、LSPX2(SEQID NO:316)、LTP1(SEQ ID NO:317)和LMTP6(SEQ ID NO:320)。然后产生通过这些启动子候选者调控的编码载体化拉那鲁单抗的AAV8载体。CAG(SEQ ID NO:411)和TBG(SEQ ID NO:423)启动子分别充当普遍存在的启动子和肝脏特异性启动子的控制件。通过测量相较于每个野生型小鼠中的载体基因组拷贝的拉那鲁单抗蛋白质表达来体内测试这些启动子的强度和载体生物分布。
以等效剂量(2.5×1012vg/kg)将载体静脉内施用至C57BL/6小鼠。每两周收集小鼠血清，并通过ELISA测定拉那鲁单抗蛋白质表达水平。在载体施用后49天收获肝脏样本。通过液滴式数字PCR(Droplet Digital PCR；ddPCR)(来自Stilla的NAICATM系统)使用拉那鲁单抗探针和引物对每个样本中病毒基因组的存在进行定量。还同时测量每个样本中胰高血糖素的基因组拷贝数，然后对病毒基因组进行归一化并以每细胞的载体基因组拷贝数的形式展现(假定2个胰高血糖素/细胞)。使用单因素方差分析在GraphPad Prism 8中进行统计分析。
在具有肝脏特异性启动子的AAV8载体中，由ApoE.hAAT(SEQ ID NO:412)和LMTP6(SEQ ID NO:320)启动子驱动的载体在所有时间点提供最高蛋白质表达量(图28A)。但对于生物分布数据，在用由不同启动子驱动的载体处理的动物中的肝脏样本中，每细胞的载体基因组拷贝数无明显差异(图28B)。
所有肝脏特异性启动子均优于TBG启动子(SEQ ID NO:423)，并且双重特异性LMTP6启动子(SEQ ID NO:320)始终显示在血清中的最高表达(μg/ml)(图28)。
6.54实施例54：施用载体化抗体后大鼠血清中的拉那鲁单抗表达
在经由IV施用而用AAV-拉那鲁单抗处理的小鼠血清中检测到高拉那鲁单抗表达水平。在部分研究中，检验用不同剂量的AAV-拉那鲁单抗载体和对照物处理的不同大鼠品系中的拉那鲁单抗表达水平。
实验1(Wistar大鼠)：
为了评估大鼠中载体施用的途径和剂量，在Wistar大鼠中测试对照载体AAV.CAG-LANv2.T2A(CAG.L02；SEQ ID NO:437)。将八至十周龄雄性Wistar大鼠分成三组(n＝3只/组)，以经由IM或IV注射接受剂量为1×1013vg/kg或1×1014vg/kg的载体施用。在处理前7天和载体施用后7、10、14、17、21、28、35、42和49天收集血液，并处理成血清。
表9.大鼠血清中拉那鲁单抗表达的研究细节，实验1.
通过ELISA检测所收集大鼠血清中的人类IgG抗体的水平。使用Prism，通过单因素方差分析在每个时间点利用多重比较进行统计分析。
表10.Wistar大鼠中的拉那鲁单抗表达的结果，实验1
在治疗后7天可检测大鼠血清中抗体的水平。其随时间推移而增加，并且在IV组中在处理后17天(较低剂量)和21天(较高剂量)达到峰值水平，并且在IM组中在处理后28天达到峰值水平。所有组中的抗体水平逐渐降低并维持直至处理后48天。对于用较低剂量(1×1013vg/kg)载体处理的动物，在载体施用后7、14和21天，IV组中的抗体表达水平显著高于IM组中的抗体表达水平。对于接受IV施用的动物，抗体表达水平在所有时间点都具有剂量依赖性。最高拉那鲁单抗表达水平为252.6±149.4μg/ml，其是在IV施用后21天在用较高剂量(1×1014vg/kg)处理的动物中检测到的。参见图30A。
实验2(Wistar大鼠和Sprague-Dawley大鼠)：
此实验的目的在于研究将用于大鼠功效研究的大鼠品系和载体剂量。将八至十周龄雄性Wistar大鼠和Sprague-Dawley(SD)大鼠分成四个组(n＝3只/组)以接受携载编码拉那鲁单抗的基因组的AAV8载体的处理，所述AAV8载体由通用启动子CAG.L02(SEQ ID NO:437)或肝脏特异性启动子ApoE.hAAT.L02(SEQ ID NO:439)驱动。以5×1013vg/kg的剂量经由IV注射施用载体。在处理前7天和载体施用后7、10、14、17、21、28、35、42和49天收集血液，并处理成血清(表11)。通过ELISA检测所收集大鼠血清中的人类IgG抗体的水平。使用Prism，通过单因素方差分析在每个时间点利用多重比较进行统计分析。
表11.大鼠血清中拉那鲁单抗表达的研究细节，实验2.
在此实验中，分别在Wistar大鼠和SD大鼠中测试对照载体(CAG.L02，SEQ ID NO:437)和载体ApoE.hAAT.L02(SEQ ID NO:439)。在所有时间点，在两个载体组中，Wistar大鼠中的拉那鲁单抗表达水平均比SD大鼠高。在较早时间点，用对照载体处理的动物显示显著高于用含有肝脏特异性启动子的载体处理的动物的血清抗体水平。这是在处理后7天在Wistar大鼠中观测到并且在处理后7、14和17天在SD大鼠中观测到。在Wistar大鼠中，两个载体组中的抗体浓度都随时间推移逐渐增加。经对照CAG-拉那鲁单抗和hAAT-拉那鲁单抗载体处理的动物中的最高抗体水平分别为在35天和49天时的173.1±78.8μg/ml和109.57±18.9μg/ml。然而，在SD大鼠中，经对照载体和前导载体处理的动物中的抗体水平分别在14天和21天达到峰值，并且之后在两个组中逐渐降低。CAG.L02(SEQ ID NO:437)和ApoE.hAAT.L02(SEQ ID NO:439)载体组的最高抗体浓度分别为48.23±3.1μg/ml和22.33±8.98μg/ml。参见表12和图30B。
表12.Wistar大鼠中的拉那鲁单抗表达的结果，实验2：
6.55实施例55：由组织特异性启动子调控的载体化拉那鲁单抗在肌肉内施用之后的表征
在先前研究中，鉴定具有由ApoE.hAAT或LMTP6启动子调控的AAV8的载体化拉那鲁单抗的高肝脏驱动表达。此研究的目标在于表征在将拉那鲁单抗载体直接注射至腓肠肌(GA)肌肉中后，LMTP6启动子的肌肉驱动表达。动物接受5×1010vg至GA肌肉中的双侧注射。每两周收集血清，以测量全身性拉那鲁单抗浓度(图31A)。在注射后49天收获动物，并分析相关组织(肝脏、GA肌肉、心脏)的载体生物分布和转基因表达。
由hAAT和LMTP6启动子调控的载体在所有时间点展现相较于CAG显著增加的血清抗体浓度(图31A)。在此实验中，hAAT和LMTP6彼此无显著差异。在GA、肝脏和心脏中检测并定量载体化拉那鲁单抗的每细胞载体基因组拷贝数(图31B)，与在心脏中针对双重肌肉/肝脏启动子LMTP6载体检测到的基因组的较高量具有显著差异。也在49天针对直接注射至GA肌肉中的所有测试载体检测到增加的肝脏RNA表达(相较于参考基因的相对倍数基因表达)(图31C)。来自肝脏、GA肌肉和心脏中的每一者的基因表达(mRNAμg/mL)数据(图31D)指示在IM施用之后肝脏和肌肉组织中的LMPT6的双重特异性，而相较于LMTP6和CAG，hAAT驱动的样本在肌肉中降低。也在hAAT与LMTP6组之间发现显著差异。
6.56实施例56：来源于用通过不同产生系统产生的AAV-拉那鲁单抗载体处理的小鼠的小鼠血清中的拉那鲁单抗蛋白水平的比较
开发不同AAV产生方案以鉴定可增加AAV滴度和可扩展性的方法，以及评定载体产物的质量。通过适合于经HEK293转染的细胞的熟知方法以及杆状病毒(BV)/Sf9昆虫细胞产生方法来构建用以产生AAV8.拉那鲁单抗rAAV载体(都具有由CAG启动子驱动的相同转基因)的顺式和反式质粒。提供三种不同的BV/Sf9载体系统(BV1、BV2和BV3)，以及作为对照的通过HEK293方法产生的rAAV载体。将经纯化rAAV产物注射至野生型小鼠以供进行此蛋白质表达研究(表13)。
经由尾静脉注射以2.5E12 vg/kg向年轻成年C57BL/6小鼠(年龄8-10周)施用上述载体(n＝5只/组)。在载体施用后7、21、35和49天从每只动物收集血清。在注射之前两天(第0天)收集的血清充当基线对照。经由ELISA检测抗体(拉那鲁单抗)表达水平。使用Prism，通过单因素方差分析在每个时间点利用多重比较进行数据分析。
表13.产生系统表达研究设计
所测试的所有产生方法都基于此研究是可行的，在所测试的时间点，HEK细胞产生方法的产率更大(参见图32)。早在施用后7天即可检测所有组中的血清中的抗体表达。在第7天，HEK产生组中的抗体浓度的平均值是386μg/ml，其显著高于其他组(61-102μg/ml)。在BV1、BV2和BV3组中，抗体表达水平在第21天分别增加1倍、6倍、7倍和4倍。抗体表达水平维持至施用后35和49天。在第21天、第35天和第49天时间点，HEK产生的载体和BV3产生的载体之间不存在显著差异。
6.57实施例57：来源于小鼠血清的载体化人类抗pKal抗体拉那鲁单抗抑制人类pKal功能
为了测量在AAV-拉那鲁单抗施用之后来源于小鼠血清的拉那鲁单抗的pKal功能，我们开发了一种基于荧光的动力学酶功能测定法。首先，将活化人类血浆激肽释放酶(Enzyme Research Laboratories)于样本稀释缓冲液(SDB；1×PBS，3％BSA，0.1％Tween-20)中稀释至100nM的最高浓度。对此pKal进行两倍连续稀释，连续稀释中总计12个浓度(100nM至0.05nM)。从每个稀释液，并且一式两份地，将25μL稀释液与25μL SDB一起置于96孔不透明平底板的一个孔中。然后，将含有以100μM制备的50μL荧光底物Pro-Phe-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素(PFR-AMC)(Bachem)的测定缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，pH 7.5)添加至每个孔中。立即使用SpectraMax 3荧光板读取器使样本分别在380/460nm的激发/发射波长下在用于AMC荧光的动力学模式中运行3小时。
通过将其RFU除以背景PFR-AMC底物荧光来计算每个pKal浓度RFU(所选的最后RFU荧光值)的信噪比。然后选择具有≥2的信噪比的两个最低pKal浓度(6.25nM和12.5nM)以评估拉那鲁单抗剂量反应中pKal功能的拉那鲁单抗抗体的抑制效应和范围。将拉那鲁单抗(GenScript)或人类IgG对照抗体于SDB中稀释至最高浓度200nM，并且两倍连续稀释至0.39nM。接着，将25μL pKal(两个所选浓度中的每一者)与25μL拉那鲁单抗或人类IgG在30℃下一起温育1小时。然后向抗体-pKal混合物提供PFR-AMC并立即使用SpectraMax荧光板读取器分别在380/460nm的激发/发射波长下在用于AMC荧光的动力学模式中运行3小时。
体外pKal功能测定.使用时，将小鼠血清于样本稀释缓冲液中进行稀释，并与6.25nM(1.56nM于孔中)pKal以1:1一起温育，30℃/1小时。对于来自小鼠血清的总IgG纯化，根据制造商的方案使用蛋白质A自旋抗体纯化试剂盒(Protein A Spin AntibodyPurification Kit；BioVision)纯化抗体。使用Nanodrop分光光度计测量总抗体浓度，其中OD吸光度＝280nM。通过在测定缓冲液中稀释的AMC的向下两倍连续稀释液(500nM，十一份稀释液，并减除空白)来产生AMC标准曲线。分别在380/460nm的激发/发射波长下读取AMC以作为端点荧光。特异性血浆激肽释放酶活性经计算为：(经调整的实验样本Vmax，RFU/sec)×(转化因子，AMC标准曲线μM/RFU)/(pKal浓度，nM)。pKal活性的降低百分比是从计算第49天pKal活性除以第-7天pKal活性而得。
为了确定AAV衍生的拉那鲁单抗是否可抑制血浆激肽释放酶功能，我们开发了基于AMC底物的体外功能测定来解决概念验证研究中的此问题(图33A和图33B)。在这项测定中，将含有抗体的培养基与活化人类pKal一起温育，如上文所描述。然后向抗体结合pKal提供与AMC缀合的合成肽底物Pro-Phe-Arg(PFR-AMC)，并且分别在380/460nm的激发/发射波长下测量随时间推移的所释放AMC量，持续3小时。测定显示，在限定酶浓度下，pKal活性受拉那鲁单抗介导的明显抑制而降至0.1nM(孔内浓度)(图33C)。我们首先设法确定来自经施用拉那鲁单抗编码AAV的小鼠的血清是否可抑制pKal活性。将在施用后49天来自小鼠的血清1:25稀释(在经预测具有抑制性的范围内)，与pKal一起体外温育，并测定pKal活性。与施用前7天相反，在载体施用后来自小鼠的血清抑制pKal活性，如两个时间点之间的酶活性的显著降低和pKal活性的约50％降低所反映(图33D和图33E)。
其他实验显示抑制是归因于血清内的拉那鲁单抗。推断人类IgG(即拉那鲁单抗)将仅发现于施用后第49天的IgG部分中，而不会发现于施用前第-7天的样本中，使用来自前述第-7天和第49天的小鼠血清样本的经纯化和总IgG抗体来测试pKal抑制。实际上，仅来自施用后第49天的血清的含有拉那鲁单抗的经纯化IgG抑制，而来自施用前时间点的IgG不抑制人类pKal功能(图33F)。
6.58实施例58：AAV-拉那鲁单抗在角叉菜胶动物模型中的效应
6.58.1实施例58A：AAV-拉那鲁单抗在小鼠中的角叉菜胶脚爪水肿模型中的效应
由角叉菜胶诱发的发炎模型常常用作急性炎症模型。角叉菜胶(Cg)是在刺激发炎性和促炎性介体(包括缓激肽、组胺、速激肽、活性氧物质和活性氮物质)的释放中起作用的强化学剂。炎症的典型体征包括水肿、痛觉过敏和红斑，其紧接在角叉菜胶处理之后出现。此实施例评估AAV介导的拉那鲁单抗基因递送对小鼠的角叉菜胶诱发的脚爪水肿的效应。
将总计八十只年轻成年(8-9周龄)雄性C57BL/6小鼠用于此研究。将动物分成如表14中所列的八个组。通过单次皮下(s.c.)注射30μL0.7％或1％角叉菜胶溶液来诱发脚爪水肿。在角叉菜胶处理之前21天和30分钟施用测试载体和阳性对照双氯芬酸。在载体注射之前和注射后7天和21天从第1组、第3组、第4组、第5组、第7组和第8组中的小鼠收集血液。在角叉菜胶注射之前和在注射后2、4、6、8、24和48小时使用数字器官充满度测量器来测量脚爪体积。在角叉菜胶注射后48小时处死所有动物。也在尸体剖检时收集肝脏和脚爪样本。
表14.角叉菜胶(Cg)脚爪水肿小鼠研究设计
载体1：AAV8-GFP
0.7％和1.0％角叉菜胶都诱发经注射脚爪的肿胀；然而，1.0％角叉菜胶注射的肿胀更明显(图34，A-L)。在阳性对照组(第2组和第6组)中，双氯芬酸处理显著降低1.0％Cg模型(第2组)中角叉菜胶注射后2、4、6、8和24小时的脚爪体积，而在0.7％Cg模型(第6组)中仅在注射后4和24小时观测到脚爪体积的显著降低。
相较于媒介物对照组(第1组，载体制剂缓冲液)，ApoE.hAAT.L02(SEQ ID NO:439)处理显著降低1.0％Cg模型中角叉菜胶注射后2、4、6和8小时的脚爪体积(图35A和图35B)。然而，在0.7％Cg模型中，未在任何时间点观测到ApoE.hAAT.L02处理的效应(图35A和图35B)。在1.0％和0.7％Cg模型中，用媒介物(第1组和第4组)或对照载体(AAV-GFP，第3组和第7组)处理的组之间不存在明显差异(图33A至图33L)。通过单因素方差分析与用于多重比较的Dunnett事后检验来分析所有数据。
这些数据指示急性炎症可在小鼠脚爪中由1％角叉菜胶溶液的单次皮下注射成功诱发。拉那鲁单抗是一种经由AAV介导的基因递送在小鼠血清中产生的人类IgG抗体，其显著降低小鼠1％角叉菜胶模型中的炎症严重程度。
6.58.2实施例58B：AAV-拉那鲁单抗对Wistar大鼠中的角叉菜胶诱发的脚爪水肿的功效研究
此项目旨在评估AAV介导的抗体(拉那鲁单抗)疗法对Wistar大鼠中的角叉菜胶诱发的脚爪水肿的功效。实验包括总计50只雄性Wistar大鼠，分成5组(参见表15)。将通过单次皮下(s.c.)注射100μL1％角叉菜胶溶液来诱发脚爪水肿。将在角叉菜胶处理之前的不同时间点(30分钟、21天、24小时或1小时)施用测试物品。
表15.Wistar大鼠研究的分组和处理
a:制剂缓冲液
b:生理盐水
将一周两次测量体重。在载体施用之前7天以及载体注射后7天和14天，将通过眼框后/颌下采血来收集所有大鼠的0.3mL血液，然后处理成血清。将在角叉菜胶注射之前和在角叉菜胶注射后2、4、6、8、24小时测量脚爪体积。将在角叉菜胶注射后24小时处死所有动物。在尸体剖检时，将通过心内穿刺收集血液以供制备血清。然后，收集来自每只动物的相同叶的三块肝脏(大约每单位50mg)并分别低温保藏于三个分开的管中。从所有大鼠切除右脚爪，福尔马林固定，并包埋于石蜡(FFPE)中。参见表16。
表16.用于Wistar大鼠研究的测量和取样方案
数据将呈现为平均值±SEM。将使用Graphpad,prism 6.0进行包括t检验或ANOVA的统计分析，其中显著性水平α为0.05。
6.59实施例59：用于糖尿病性视网膜病变的AAV介导的抗血浆激肽释放酶抗体治疗
糖尿病性视网膜病变(DR)和糖尿病性黄斑水肿(DME)是糖尿病的最常见并发症，并且是职业期成人当中失明的主要原因。慢性高血糖症引起视网膜微血管损伤并促进微血管渗透性增加、炎性反应上调和神经视网膜中的液体积聚，最终引起视觉丧失。抗VEGF的玻璃体内施用是DME的一线治疗。然而，DME对抗VEGF的反应高度可变。仅54％用连续每月抗VEGF治疗的DME患者获得视力(Elman MJ,Aiello LP,Beck RW等人,Randomized trialevaluating ranibizumab plus prompt or deferred laser or triamcinolone plusprompt laser for diabetic macular edema.Ophthalmology 2010；117:1064-1077；Brown DM,Nguyen QD,Marcus DM等人,Long-term outcomes of ranibizumab therapyfor diabetic macular edema:The 36-month results from two phase III trials:RISE and RIDE.Ophthalmology 2013；120:2013-2022)。近期研究表明，血浆激肽释放酶(一种血管渗漏和炎症的介体)可不依赖于VEGF而在DR和DME的发病机制中起到重要作用(Gao-B-B,Clermont A,Rook S等人,Extracellular carbonic anhydrase mediateshemorrhagic retinal and cerebral vascular permeability through prekallikreinactivation.Nature Medicine 2007；13:181；Clermont A,Chilcote TJ,Kita T等人,Plasma kallikrein mediates retinal vascular dysfunction and induces retinalthickening in diabetic rats.Diabetes2011；60:1590-1598；以及Kita T,Clermont AC,Murugesan N等人,Plasma kallikrein-kinin system as a VEGF-independent mediatorof diabetic macular edema.Diabetes 2015；64:3588-3599)。血浆激肽释放酶抑制剂可为用于对抗VEGF疗法无反应的DR和DME患者的潜在替代性疗法。此研究旨在使用通过腺相关病毒(AAV)基因转移的眼部载体化抗体递送来测试疗法用于DR/DME的可能性。
已构建载体化抗血浆激肽释放酶抗体(抗pKal Ab，例如拉那鲁单抗)序列，并测试其在治疗遗传性血管性水肿(HAE)中的用途，如上文所描述。在此研究中，AAV8.CAG.LAN Ab和AAV8.CAG.GFP将用作测试载体。AAV8.NUL将充当对照载体。
首先，在野生型大鼠中评估转导效率和细胞类型特异性。成年Wistar大鼠(3-4月龄)将用于此研究。将以不同剂量(5×108vg/眼和5×109vg/眼)于3μl制剂缓冲液中经由视网膜下(SR)注射将包括AAV8.CAG.LAN Ab、AAV8.CAG.GFP和AAV8.NUL的载体递送至大鼠眼睛中。将在SR注射之后2、4和8周进行眼底和OCT成像。将在施用后8周收集眼部组织试样。将通过ELISA对包括视网膜和视网膜色素上皮(RPE)的受试者眼部组织中的抗体表达水平进行定量。将通过使用各种视网膜细胞标志物的免疫荧光染色来测定细胞类型特异性。
链佐霉素(STZ)诱发的糖尿病性Wistar大鼠将用作用于功效研究的动物模型。将通过以每千克体重60mg的剂量在年轻成年Wistar大鼠(8-10周龄)中静脉内注射STZ来诱发糖尿病。在此模型中，视觉锐度的显著和进展性丧失一般开始于诱发后8周。将在诱发糖尿病之后4或8周视网膜下注射AAV8.CAG.pKal Ab载体。将用AAV.NUL载体注射另一只眼睛并且其充当对照。将在诱发糖尿病之后8、12和16周测试眼底成像、荧光素血管造影(FA)成像和OCT成像、视网膜电图描记(ERG)和视动性眼球震颤(OKN)。将在糖尿病诱发后16-17周收集眼部组织或完整眼球。将通过ELISA对眼部组织中的抗体表达进行定量。将通过组织学和免疫荧光染色评估视网膜结构变化和神经元存活率。
6.60实施例60：组织限制性转基因免疫原性的表征
此研究的目标在于了解在普遍存在的启动子、组织特异性启动子或串联启动子的情形下的转基因免疫原性和/或耐受性诱导。假设：由肝脏特异性和肝脏-肌肉串联启动子驱动的载体将展现相较于由普遍存在的启动子驱动的载体降低的免疫原性。为了测试此假设，构建驱动高度免疫原性膜结合卵白蛋白(mOVA)的表达的四个AAV载体。这些载体的不同之处在于其启动子序列，其包括：a)普遍存在的CAG启动子(SEQ ID NO:411)；b)肝脏特异性hAAT启动子，具有上游ApoE增强子(SEQ ID NO:412)；c)肌肉特异性CK8启动子盒(SEQ IDNO:413)，由CK核心启动子和经修饰MCK增强子的三个拷贝构成；和d)肝脏-肌肉串联启动子6(LMTP6，SEQ ID NO:320)，含有来源于hAAT和CK8的序列元件。初始实验将测量小鼠内静脉内(IV)载体施用之后的免疫反应。研究试验指标将包括针对mOVA转基因产物的体液介导和细胞介导免疫反应的表征。另外，将收获组织以用于载体生物分布和转基因表达分析。
6.61实施例61：食蟹猴中载体化拉那鲁单抗的血浆表达
将评定经施用编码拉那鲁单抗抗体的AAV载体的非人类灵长类动物中的拉那鲁单抗表达的血浆动力学。目标在于评定和选择引起三个月或更长时间的至少200μg/ml拉那鲁单抗的持续拉那鲁单抗表达的AAV8.ApoE.hAAT.Lan载体剂量。选择食蟹猴作为测试系统，因为其作为用于大型动物物种中的AAV生物分布研究和用于至人类的进一步翻译的模型的效用和接受性已获认可。此研究的所有动物均未接受过先前处理。
将使用九只食蟹猴动物。将基于临床征象数据判定适合于实验并预先筛选抗体滴度的动物置于三个研究组中，每个组使用计算机产生的随机数根据体重接受不同剂量的AAV载体。每组三只动物将以1e12 gc/kg(第1组)、1e13 gc/kg(第2组)和1e14 gc/kg(第3组)的剂量施用单次i.v.剂量的载体AAV8.ApoE.hAAT.Lan载体(上文所描述)。
将每天至少记录一次临床征象，开始于给药起始之前大约两周并持续整个研究期。将观测动物的临床效应、疾病和/或死亡的征象。可基于动物的疾患由研究负责人和/或技术员酌情记录额外观测结果。
将在剂量施用之前和在至少3个月(9周)内以每周的时间间隔从外周静脉收集血液样本以供生物分析。将样本收集于血凝管中并记录时间。试管将维持在室温下直至完全凝结，然后在室温下以大约2400rpm离心15分钟。将收获血清，置于经标记的小瓶中，冷冻于液氮中，并储存在-60℃或更低温度下。
将对所有发现死亡或处死、濒死的动物进行并且在研究期结束时(载体施用之后至少三个月)进行大体尸体剖检。将给除发现死亡的动物以外的所有动物IM使用8mg/kg氯胺酮HCl进行镇静，维持在异氟烷/氧混合物上并提供肝素钠200IU/kg的静脉内推注。将用含0.001％亚硝酸钠的生理盐水经由左心室对动物进行灌注。将对发现死亡的动物进行尸体剖检，但不会进行灌注。
作为主要终点分析，将通过ELISA和/或蛋白质印迹法测定血浆样本的拉那鲁单抗浓度，至少以每毫升血浆的拉那鲁单抗微克数的形式进行报道；并且通过荧光测定分析其拉那鲁单抗活性，例如激肽释放酶抑制。
将通过ELISA和拉那鲁单抗结合测定评估血清中对抗拉那鲁单抗的抗体(ADA)的存在。将通过定量PCR和NGS方法评定尸体剖检样本中载体和拉那鲁单抗编码转录物的生物分布。待测定的组织包括肝脏、肌肉和心脏。将通过完整病理学，包括测定肝脏酶、尿分析、心血管健康和其他来进行毒性评定。
6.62实施例62：载体化阿达木单抗IgG和Fab盒：设计和表征
构建AAV转基因盒(SEQ ID NO:451)，其驱动载体化阿达木单抗IgG(TNF001，SEQID NO:452)的普遍表达。蛋白质编码序列由通过弗林蛋白酶切割位点、Gly-Ser-Gly(GSG)接头(SEQ ID NO:427)和T2A自加工肽序列(SEQ ID NO:429)分开的阿达木单抗的重链和轻链构成。特定序列配置得到单独的重链肽和轻链肽的表达。整个阅读框经密码子优化并耗乏CpG二核苷酸。表达由CAG启动子(SEQ ID NO:411)驱动。类似地，开发额外盒(SEQ ID NO:453)，其驱动含有阿达木单抗可变区的Fab(TNF002，SEQ ID NO:454)的表达。构建体概述于图1和图12A中，并且序列提供于表17中。
表17.
在转染至293T细胞中之后，经由蛋白质印迹法表征质粒表达(图36A)。另外，经由ELISA针对重组人类TNFα的结合来评定质粒表达抗体活性(图36B)。另外，将此质粒用于产生重组AAV8载体。通过前述测定评估从AAV8产生的阿达木单抗的表达和活性(图37A至图37C)。
6.63实施例63：自互补阿达木单抗Fab转基因盒：设计和表征
产生编码载体化阿达木单抗Fab的两个自互补AAV(scAAV)转基因盒。所述转基因由普遍存在的mU1a(SEQ ID NO:414)或EF-1α(SEQ ID NO:415)核心启动子驱动。经由转染至293T细胞中来比较这些质粒的Fab表达(图38)。mU1a驱动的载体显示较高吸光度值，表明细胞上清液内具有较高Fab浓度。
6.64实施例64：载体化阿达木单抗IgG和Fab跨模型物种的TNFα结合
测试载体化阿达木单抗候选者与从包括人类、小鼠和大鼠的模型物种分离的TNFα的结合能力。在顺式质粒转染至293T细胞中之后，载体化抗体表达和分泌于细胞上清液中。在ELISA中测试细胞上清液，其中板包被有来源于前述物种的重组TNFα(图39)。阿达木单抗IgG有效地结合人类和小鼠来源的TNFα。Fab展现的人类TNFα结合概况与IgG类似。然而，相较于阿达木单抗IgG，Fab显示与小鼠TNFα的不良结合。IgG和Fab两者都显示大大降低的大鼠TNFα结合。
6.65实施例65：用于非感染性后葡萄膜炎的AAV介导的眼部基因疗法
非感染性后葡萄膜炎是一种影响眼睛的视网膜和脉络膜并引起失明的眼部炎症形式。其每年影响大约38,000名美国人。患者通常用全身性类固醇或皮质类固醇疗法治疗，这导致全身性并发症的高风险。在2016年，修美乐(阿达木单抗)(一种靶向肿瘤坏死因子-α(TNFα)的人类单克隆抗体)获得FDA批准，并且变成了治疗非感染性葡萄膜炎(NIU)的唯一的全身性非皮质类固醇药剂并在此后被广泛使用。在此研究中，将经由局部施用而针对小鼠眼部组织中的体内AAV介导的抗体表达来评估腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV8.CAG.阿达木单抗.IgG或AAV8.CAG.阿达木单抗.Fab以及AAV8.CAG.GFP)中的全长或Fab阿达木单抗抗体。AAV8.NUL将充当对照载体。还将进行啮齿动物EAU模型中的功效研究，以研究用于NIU的AAV介导的抗TNFα治疗的治疗潜力。
已构建载体化阿达木单抗序列并进行体外测试。将进一步评估野生型小鼠中的转导效率和细胞类型特异性。年轻成年C57BL/6和B10.RIII小鼠(8-10周龄)将用于此研究。将经由视网膜下(SR)注射以不同剂量(1×107、1×108和1×109vg/眼)于1μl制剂缓冲液中将包括AAV8.CAG.阿达木单抗.IgG、AAV8.CAG.阿达木单抗.Fab、AAV8.CAG.GFP和AAV8.NUL的载体递送于小鼠眼睛中。将在SR注射之后1、2和4周进行眼底成像和OCT成像。将在施用后5周收集眼部样本。将通过ELISA对眼部组织中的抗体或融合蛋白表达水平进行定量。将通过使用各种视网膜细胞标志物的免疫荧光染色来测定细胞类型特异性。将选择测试载体以用于功效研究。还将探索包括脉络膜上、前房内和玻璃体内注射的不同施用途径(ROA)。优选ROA将用于功效研究。
将通过在B10.RIII小鼠中经由免疫接种人类IRBP肽而诱发实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)来进行功效研究。将在此模型中出现T细胞介导的眼部自身免疫反应，其中诱发后大约11至18天达到峰值。将在诱发EAU之前2周或之后1周经由优选ROA在小鼠眼睛中施用测试载体。将是另一只眼睛递送AAV.NUL载体，并且其充当对照。将在诱发EAU之后10、17和30天测试眼底成像和OCT成像、视网膜电图描记(ERG)和视动性眼球震颤(OKN)，以监测疾病的进展。将在EAU诱发后5周收集眼部组织或完整眼球。将检测眼部组织中的抗体或融合蛋白表达水平并通过ELISA进行定量。将通过组织学和免疫荧光染色评估视网膜结构变化和神经元存活率。
等同物
尽管本发明参考其特定实施方案进行详细描述，但应理解功能上等同的变化形式属于本发明的范围。实际上，根据前文描述和附图，除本文所显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。此类修改旨在属于所附权利要求的范围内。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所描述的本发明特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由所附权利要求所涵盖。
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请在本文中通过引用并入本说明书中，其程度如同每个个别出版物、专利或专利申请明确地且个别地指示为通过引用整体并入本文一样。
Claims (38)
1.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的血管性水肿，包括遗传性血管性水肿，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗激肽释放酶(抗pKal)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
3.一种药物组合物，所述药物组合物用于将拉那鲁单抗递送至血流以治疗有需要的人类受试者的遗传性血管性水肿，所述组合物包含重组AAV，所述重组AAV包含编码拉那鲁单抗的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在肌肉细胞和/或肝脏细胞中的表达的调控序列，其中所述重组AAV是以一定剂量向所述人类受试者施用，所述剂量足以引起拉那鲁单抗从所述转基因的表达和拉那鲁单抗分泌至所述人类受试者的所述血流中，以便在所述受试者中产生至少5μg/ml至至少35μg/ml拉那鲁单抗的拉那鲁单抗血浆水平。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述拉那鲁单抗血浆水平为20μg/ml至35μg/ml，并且所述拉那鲁单抗血浆水平维持至少三个月。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中分泌至所述血浆中的所述拉那鲁单抗抗体展现pKal活性的大于至少40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的降低，如通过动力学酶功能测定法所测量，其中所述拉那鲁单抗抗体的所述活性是在所述施用之后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周测量。
6.一种药物组合物，所述药物组合物用于将抗体或其抗原结合片段递送至有需要的人类受试者的血流，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)AAV病毒衣壳，其感染肝脏细胞和/或肌肉细胞；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长抗体或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至导引肌肉细胞和肝脏细胞中的表达的嵌合启动子；
其中所述AAV载体被配制以供肌肉内施用。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述嵌合启动子是LMTP6(SEQ ID NO:320)、LMTP13(SEQ ID NO:321)、LMTP14(SEQ ID NO:322)、LMTP15(SEQ ID NO:323)、LMTP18(SEQID NO:324)、LMTP19(SEQ ID NO:325)或LMTP20(SEQ ID NO:326)。
8.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)、AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码基本上全长或全长抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗补体组分5(C5)mAb或其抗原结合片段、基本上全长或全长抗白细胞介素-6(IL-6)mAb或其抗原结合片段、或基本上全长或全长抗白细胞介素-6受体(IL-6R)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内或脉络膜上施用。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述抗TNFαmAb是阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗；所述抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；所述抗IL-6mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗；或者所述抗IL-6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗。
10.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(FD)、Tau蛋白病、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病变、皮克综合征和原发性年龄相关性Tau蛋白病、亨廷顿病、青少年亨廷顿病、帕金森病、突触核蛋白病、ALS、偏头痛或丛集性头痛，所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体具有：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗淀粉样蛋白β(抗Aβ)、抗分选蛋白、抗Tau蛋白(抗Tau)、抗信号蛋白4D(抗SEMA4D)、抗α突触核蛋白(抗SNCA)、抗超氧化物歧化酶-1(抗SOD1)或抗抑钙素基因相关肽受体(抗CGRPR)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞、肌肉细胞或肝脏细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是鞘内、静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；所述抗分选蛋白mAb是AL-001；所述抗Tau mAb是ABBV-8E12、UCB-0107或NI-105(BIIB076)；所述抗SEMA4D mAb是VX15/2503；所述抗SNCA mAb是普拉森单抗、NI-202(BIIB054)或MED-1341；所述抗SOD1 mAb是NI-2041.10D12或NI-204.12G7；并且所述抗CGRPR mAb是伊普汀单抗、福瑞满单抗或伽奈珠单抗。
12.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的视网膜病症，包括糖尿病性视网膜病变、近视脉络膜新生血管(mCNV)、黄斑变性(例如新生血管性(湿性)或干性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、黄斑水肿(例如视网膜静脉栓塞(RVO)后的黄斑水肿或糖尿病性黄斑水肿(DME))、视网膜静脉栓塞、糖尿病性视网膜病变(DR)、非感染性葡萄膜炎或青光眼、或视网膜异常血管形成，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)与AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)、AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性的病毒衣壳；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗血管内皮生长因子(抗VEGF)、抗红细胞生成素受体(抗EPOR)、抗Aβ、抗激活素受体样激酶1(抗ALK1)、抗补体组分5(抗C5)、抗内皮糖蛋白(抗ENG)、抗补体组分1Q(抗CC1Q)、抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)或抗pKal mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者视网膜下、玻璃体内、脉络膜上或鼻内施用。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述抗VEGF mAb是赛伐珠单抗；抗EPOR mAb是LKA-651(NSV2)或LKA-651(NSV3)；抗AβmAb是索拉珠单抗、仑卡奈单抗或GSK933776；抗ALK1 mAb是阿伐苏单抗；抗C5 mAb是特度鲁单抗或拉瓦利单抗；抗ENG mAb是卡妥昔单抗；所述抗CC1Q mAb是ANX-007；其中抗TNFαmAb是阿达木单抗、英利昔单抗或戈利木单抗；并且所述抗pKal mAb是拉那鲁单抗。
14.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的多发性硬化症，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗排斥性导向分子A(抗RGMa)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类CNS细胞、肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是鞘内、静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗RGMa mAb是艾利扎单抗。
16.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的淀粉样变性(ATTR)、家族性淀粉样蛋白心肌病(FAC)或家族性淀粉样蛋白多发性神经病变(FAP)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)、AAVrh20衣壳、AAVrh39衣壳或AAVcy5衣壳的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗TTR mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗TTR mAb是NI-301或PRX-004。
18.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的纤维化病症、肺纤维化、囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、心房纤维化、心内膜纤维化、陈旧性心肌梗塞、关节纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、纵隔纤维化、骨髓纤维化(MF)、肾源性系统性纤维化(NSF)、进行性大块纤维化(PMF)和腹膜后纤维化(RPF)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗结缔组织生长因子(抗CTGF)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述抗CTGF mAb是帕姆单抗。
20.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的非感染性葡萄膜炎、视神经脊髓炎(NMO)、糖尿病性视网膜病变(DR)或糖尿病性黄斑水肿(DME)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV2.7m8(SEQ ID NO:142)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV反向末端重复(ITR)侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)、抗白细胞介素6(IL6)或抗分化簇19(抗CD19)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类视网膜细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是鼻内、视网膜下、玻璃体内或脉络膜上施用。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述抗IL6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗，或者所述抗CD19 mAb是英比利珠单抗。
22.一种药物组合物，所述药物组合物用于减少、抑制或改善有需要的人类受试者的有害免疫反应，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗白细胞介素-6受体(抗IL6R)或抗白细胞介素-6(IL6)的基本上全长或全长mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者皮下、肌肉内、静脉内或经肺施用。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述抗IL6R mAb是赛他利单抗、赛瑞单抗或托珠单抗，或者所述抗IL6 mAb是司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、思鲁库单抗、奥洛奇单抗或吉瑞利单抗。
24.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的炎性肠病(IBD)，包括UC和CD，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)或AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗整合素β7亚基(抗ITGB7)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗ITGB7 mAb是艾托珠单抗。
26.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的骨质疏松或异常骨质流失或无力(例如治疗骨巨细胞瘤、治疗由治疗诱发的骨质流失、减缓乳腺癌和前列腺癌患者的骨质流失(或增加其骨质)、预防骨转移所致的骨骼相关事件或减少骨骼再吸收和转换)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)、AAVrh10衣壳(SEQ ID NO:145)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码全长或基本上全长抗骨硬化蛋白(抗SOST)mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供向所述受试者施用，任选地其中施用是静脉内、皮下、鼻内或肌肉内施用。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述抗SOST mAb是若莫珠单抗。
28.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的特应性皮炎，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL13mAb或抗IL31RA或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述抗IL13或所述IL31RA是塔罗金单抗或奈莫利珠单抗。
30.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的嗜曙红细胞性哮喘，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL5RmAb或抗IgE mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述抗IL5R或抗IgE mAb是瑞利珠单抗或奥马珠单抗。
32.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IL5、抗IL-5R、抗IgE或抗TSLP mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述抗IL-5、抗IL5R、抗IgE或抗TSLP mAb是贝纳利珠单抗、瑞利珠单抗、奥马珠单抗或特泽派单抗。
34.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的慢性特发性荨麻疹，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗IgE mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述IgE mAb是奥马珠单抗。
36.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的人类受试者的重症肌无力，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含：
(a)病毒衣壳，其与AAV8衣壳(SEQ ID NO:143)或AAV9衣壳(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具至少95％同一性；和
(b)人工基因组，其包含由AAV ITR侧接的表达盒，其中所述表达盒包含编码抗C5 mAb或其抗原结合片段的转基因，所述转基因可操作地连接至一个或多个控制所述转基因在人类肝脏细胞或人类肌肉细胞中的表达的调控序列；
其中所述AAV载体被配制以供静脉内施用至所述受试者的肝脏或肌肉。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其中所述抗C5是拉瓦利单抗。
38.一种测定样本中的人类抗pKal抗体活性的方法，所述方法包括：
a.将所述样本与活化人类pKal一起温育；
b.随后将已与所述活化人类pKal一起温育的所述样本与合成底物Pro-Phe-Arg-AMC一起温育；
c.测量AMC在三小时内相较于对照样本的释放。
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