CN117186212A - 宽pH下用于纯化不同AAV的纳米抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了宽pH下用于纯化不同AAV的纳米抗体,属于生物技术领域。本发明提供的纳米抗体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的HCDR1,如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的HCDR3,本发明所提供的纳米抗体可有效结合AAV,并在宽pH的条件下进行洗脱,尤其是在pH2.5~6.5的范围内,有较高的洗脱效率并能保持AAV的活性,降低了生产成本,具备广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及宽pH下用于纯化不同AAV的纳米抗体,属于生物技术领域。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)由于其良好的安全性和对各种靶组织的有效转导,已成为治疗各种疾病的主要基因传递载体,AAV具有安全性好、特异性强、递送效率高、长期有效等特点,已被广泛应用于基因治疗领域,在已获批准的基因治疗产品中已经证实了这些优点。然而,与传统抗体药物相比,病毒载体的大规模生产和长期储存效率不高,产量低,纯度适中,保质期短。在AAV在生产过程中,纯化过程占病毒生产总成本的很大一部分,因此高效且稳定的产生高纯度病毒是非常重要的。
目前,常用的纯化抗体填料是Thermo的AAVX(Thermo ScientificTMPOROSTMCaptureSelect AAVX)。但是,根据AAVX要求,需要在pH2.5的条件下洗脱,并且洗脱时间不能超过3分钟。而根据文献记载,不同血清型的AAV长时间在pH2.5的条件下,感染活性会大幅降低,(参见Adeno-Associated Virus(AAV)Capsid Stability and Liposome RemodelingDuring Endo/Lysosomal pH Trafficking的图8)。同时,通常需要在室温的条件下,进行快速洗脱。这无疑也给设备使用及生产环境提出了巨大的难题,加快了设备的老化。
因此,需要一种,在宽pH条件下,能够匀速洗脱的AAV纯化抗体填料。
发明内容
发明要解决的问题
目前对于AAV的纯化方法,条件苛刻,必须在pH2.5的条件下洗脱,大大降低了AAV的感染活性,生产成本高。
用于解决问题的方案
[1].靶向血清型腺相关病毒(AAV)的纳米抗体,其包含重链可变区,所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR):HCDR1、HCDR2和HCDR3;并且,
所述HCDR1包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:6中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:3中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR3包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:7中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体。
[2].根据[1]所述的纳米抗体,其包含以下(i)和/或(ii):
(i)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:4所示的HCDR3;
(ii)如SEQ ID NO:6所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3。
[3].根据[1]或[2]所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体包含以下序列中的一种或多种:
(i)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(ii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列;或者,
(iii)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的功能。
[4].根据[1]~[3]任一项所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体在其N端和/或C端包含Fc片段;以及,
任选地,所述纳米抗体在N端和/或C端包含信号肽序列;
可选地,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,或在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
[5].根据[1]~[3]任一项所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体所述纳米抗体在其N端和/或C端包含标签序列;和/或,在其N端包含信号肽序列;
可选地,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
[6].一种多核苷酸,其编码[1]~[5]任一项所述的纳米抗体。
[7].一种表达载体,其含有[6]所述的多核苷酸。
[8].一种宿主细胞,其包含[6]所述的多核苷酸、[7]所述的表达载体或[1]~[5]任一项所述的纳米抗体。
[9].一种制备[1]~[5]任一项所述的纳米抗体方法,其包括:培养[8]所述的宿主细胞、从培养物中分离纳米抗体、以及,可选地,对所述纳米抗体进行纯化。
[10].一种检测样品中AAV的方法,其包括将[1]~[5]任一项所述的纳米抗体与所述样品接触,并检测所形成的免疫复合物的量。
[11].一种试剂盒,其包括如[1]~[5]任一项所述的纳米抗体。
[12].一种固相载体,其表面偶联有[1]~[5]任一项所述的纳米抗体。
[13].一种纯化AAV的方法,其包括:
1)将包括AAV的样品与[1]~[5]任一项所述的纳米抗体或[10]所述的固相载体接触;
2)将所述纳米抗体或固相载体与所述样品分离;以及,
3)用溶液从所述纳米抗体或固相载体洗脱所述AAV;
可选地,步骤3)所述溶液的pH为2.5~7.0,优选为2.5~6.5;
任选地,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的一种或多种。
[14].[1]~[5]任一项所述的纳米抗体、[6]所述的多核苷酸、[7]所述的表达载体、[8]所述的宿主细胞、[11]所述的检测试剂盒或[12]所述的固相载体在纯化AAV中的用途;
任选地,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的一种或多种。
发明的效果
在一些实施方式中,本发明提供的纳米抗体可有效结合AAV;
在一些实施方式中,本发明提供的纳米抗体在结合AAV之后,可在宽pH条件下进行洗脱,尤其是在pH2.5~6.5的范围内,都能有较高的洗脱效率,同时也能将AAV的感染活性得以较好地保持;
在一些实施方式中,通过本发明提供的多核苷酸、表达载体、宿主细胞均可生产所述纳米抗体,可用于AAV的纯化;
在一些实施方式中,本发明所提供的固相载体包含了所述纳米抗体,其可在宽pH下有效洗脱AAV。
附图说明
图1为纳米抗体2315与AAV结合测试结果图。
图2为纳米抗体4038与AAV结合测试结果图。
图3为纳米抗体2135的Elisa洗脱测试结果图。
图4为纳米抗体4038的Elisa洗脱测试结果图。
图5为纳米抗体4038的层析柱洗脱测试结果图。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外,为了更好地说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在另外一些实例中,对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明,本说明书中所使用的单位均为国际标准单位,并且本发明中出现的数值,数值范围,均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中,所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如,特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中,并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外,应理解,所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中,使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中,使用“常温”、“室温”时,其温度可以是10-40℃。
本说明书中,术语“腺相关病毒(AAV)”是细小病毒科的非包膜二十面体衣壳病毒,包括单链DNA病毒基因组。细小病毒科包括依赖病毒属,其包括AAV,依赖于辅助病毒如腺病毒的存在来进行其复制。野生型AAV病毒基因组是一个线性、单链DNA(ssDNA)分子,长度为约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复序列(ITR)通常在5'和3'末端对病毒基因组封端,为病毒基因组提供复制起点。AAV病毒基因组通常包括两个ITR序列。这些ITR具有特征性T形发夹结构。双链发夹结构包括多种功能,包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物来充当DNA复制的起点。野生型AAV病毒基因组还包括两个开放阅读框的核苷酸序列,一个为四个非结构性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40,由Rep基因编码),并且另一个为三个衣壳蛋白VP的亚基编码(VP1、VP2、VP3,由衣壳基因或Cap基因编码)。交替的剪接和交替的起始密码子和启动子导致从单个开放阅读框产生四种不同的Rep蛋白,并从单个开放阅读框产生三种衣壳蛋白。Rep蛋白与复制和包装相关,而衣壳蛋白则组装形成AAV的蛋白外壳或AAV衣壳。VP蛋白由三种亚基VP1、VP2和VP3组成,通过相互作用形成二十面体对称的衣壳。提及AAV情况下所用的术语“血清型”用于指AAV的衣壳蛋白在血清学上不同于其它AAV血清型的区别。血清学独特性的确定通常是基于一种抗体与一种AAV之间具有反应性,而与其他或另一种AAV缺乏交叉反应性。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原表位的差异(例如,由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)所致。目前已经发现了多种AAV血清型,包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12,以及它们的突变体。本文在提及AAV时,还包括重组AAV(rAAV),其基因组与野生AAV基因组不同:通过使用分子生物学方法从AAV基因组中去除部分野生型基因(例如Rep基因和Cap基因),并以异源核酸序列(例如用于治疗目的的蛋白或RNA的编码序列)替换。归因于结构相对简单,能够感染多种细胞(包括静止和分裂细胞)而不整合到宿主基因组中以及其相对温和的免疫原性特征,AAV已被证明可用作生物学工具用于在体内进行目的基因的表达。本文在提及具体的AAV血清型时,例如AAV5,不仅包括野生型AAV5,还包括其各种突变体,只要其能够与本文提供的纳米抗体特异性结合即可。
本说明书中,“纳米抗体(nanobody)”,也称“单域抗体(singledomain antibody,sdAb)”或“VHH抗体”,指具有抗原结合能力,包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看,纳米抗体也可以认为是经典四链抗体分子的片段。纳米抗体首先在骆驼科动物中被发现,随后,研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的纳米抗体。纳米抗体相对于普通抗体分子(例如,经典抗体分子)具有一些优势,例如包括但不限于:分子量更小,使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位,或者,能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位;更加稳定,能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
本说明书中,术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”在本文中可互换的使用,指任何长度的氨基酸的聚合形态,可包括编码的和非编码的氨基酸,化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸,和具有相似的肽骨架的多肽。
本说明书中,术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸”可互换的使用,指任何长度的核苷酸的聚合形态,不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构,可实施任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。
本说明书中,术语“载体”是指,可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒、噬菌体、柯斯质粒等等。
本说明书中,术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员,例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
在本发明中,术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。因此,单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物,而不考虑转移数目。还应当理解的是,由于故意或非有意的突变,所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下,其由上下文清楚可见。
在本发明中,所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
在本发明中,氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸;氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸;氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基,插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻,或插入的氨基酸之间都不彼此相邻;氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代,其中,“取代”可以是保守氨基酸取代。
在本发明中,“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸,使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓,一般而言,多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页,(第4版))。另外,结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
示例性氨基酸保守取代
原始残基 | 保守取代 |
Ala(A) | Gly;Ser |
Arg(R) | Lys;His |
Asn(N) | Gln;His;Asp |
Asp(D) | Glu;Asn |
Cys(C) | Ser;Ala;Val |
Gln(Q) | Asn;Glu |
Glu(E) | Asp;Gln |
Gly(G) | Ala |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;His |
Met(M) | Leu;Ile;Tyr |
Phe(F) | Tyr;Met;Leu |
Pro(P) | Ala |
Ser(S) | Thr |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe |
Tyr(Y) | Trp;Phe |
Val(V) | Ile;Leu |
在本发明中,“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100%的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源。一般而言,当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。
根据本发明,术语“标签”是指这样的短肽,其与目的蛋白(例如本发明的抗体)融合或连接,并由此促进重组蛋白的可溶性表达、检测和/或纯化。标签可融合或连接至目的蛋白的N端和/或C端(任选地通过接头或蛋白酶切割位点)。
在本发明中,“Fc片段”指“Y”形抗体分子的柄部区域,即可结晶片段(fragmentcrystallizable,Fc)包括重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3结构域)。可通过蛋白水解酶(如木瓜蛋白酶)水解抗体分子得到抗体Fc区。在一些实例中,Fc区可包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时可介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc片段可来自IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在一些实例中,Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。“Fc片段”还包括来自天然Fc片段,经改动但仍保持其效应功能的变体Fc片段。“变体Fc片段”包含在天然Fc片段的氨基酸序列上具有至少一个氨基酸变动的氨基酸序列。
根据本发明,术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。因此,术语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物,而不考虑转移数目。还应当理解的是,由于故意或非有意的突变,所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
以下对于本发明的技术方案进行详细说明:
靶向AAV的纳米抗体
在本发明的一些实施方式中,提供了靶向AAV的纳米抗体,所述纳米抗体在结合了AAV之后,可通过pH2.5~7.0的溶液、更优选为pH2.5~6.5的溶液,将AAV进行洗脱,并确保AAV的感染活性能够较好地保持。
在一些具体的实施方式中,所述纳米抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR):HCDR1、HCDR2和HCDR3;并且,
所述HCDR1包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:6中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:3中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR3包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:7中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体。
进一步地,所述的纳米抗体,其包含以下(i)和/或(ii):
(i)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:4所示的HCDR3;
(ii)如SEQ ID NO:6所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3。
在一些可选的实施方式中,所述纳米抗体包含以下序列中的一种或多种:
(i)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(ii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列;或者,
(iii)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的功能。
在一些任选的实施方式中,所述纳米抗体在其N端和/或C端包含Fc片段,以及,任选地,所述纳米抗体在N端和/或C端包含信号肽序列;
示例性地,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,或在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
在另一些任选的实施方式中,所述纳米抗体在其N端和/或C端包含标签序列;和/或,在其N端包含信号肽序列。
在一些优选的实施方式中,在所述纳米抗体的N端包含标签序列,优选为His标签。
在一些实施方式中,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
多核苷酸、表达载体、宿主细胞、制备方法
在本发明的一些实施方式中,提供了多核苷酸序列,其包含上述纳米抗体的编码序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%同一性的多核苷酸。本公开特别涉及在严格条件下与本公开所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本公开中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与融合蛋白有相同的生物学功能和活性。
在一些可选的实施方式中,所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12或SEQ ID NO:14所示的序列。
在本发明的一些实施方式中,提供了一种表达载体,其含有上述的多核苷酸。所述表达载体还包含适当启动子或者控制序列等,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
在本发明的一些实施方式中,提供了一种宿主细胞,其导入或含有上述的表达载体。
在一个具体的实施方式中,所述的宿主细胞为细菌。
在另一个具体的实施方式中,所述的宿主细胞为真菌。
在本发明的一些实施方式中,提供了一种制备上述纳米抗体的方法,培养宿主细胞、从培养物中分离纳米抗体、以及,可选地,对所述纳米抗体进行纯化。
试剂盒
根据本发明的一些实施方式,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包含所述的纳米抗体,还可包括免疫检测中可使用的各种酶(如HRP)或荧光蛋白(GFP),可方便对AAV的检测。
在本发明的一些实施方式中,本发明所提供的纳米抗体可用于检测样品中AAV的存在或其含量。本领域有多种利用抗体进行抗原检测方法,包括但不限于,抗原抗体沉淀反应、免疫扩散实验、免疫比浊、免疫电泳(包括免疫印迹)、免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA),其中ELISA方法还可以细分为直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等多种类型。直接ELISA的方法为将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上,包被完成后简单洗涤,再加入封闭液,封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液,加入稀释好的特异性的酶标抗体,37℃温育1h或4℃温育过夜后,洗涤除去多余的抗体,加入底物显色并判读结果。间接ELISA的步骤与直接ELISA步骤前面的部分基本一致,不同的是,间接ELISA中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体,而是非酶标的(一抗),另外再引入经过酶标的二抗与一抗特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。双抗体夹心ELISA的方法是:将第一抗体(捕获抗体)包被在固相载体上,封闭后加入待检抗原,温育后加入第二抗体(检测抗体),捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种抗体,也可以是针对同一抗原的相同抗体,前提是该抗原含有多个相同表位。这些检测方法均可用于利用本文提供的纳米抗体进行AAV检测。优选地,采用直接ELISA或夹心ELISA进行AAV检测。
固相载体
根据本发明的一些实施方式,提供了一种固相载体,其表面偶联有所述的纳米抗体。
本发明提供的纳米抗体可用于AAV的分离和/或纯化。在一些实施方式中,分离和/或纯化过程包括:将本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段偶联至固相载体,让包括AAV的样品与该固相载体接触,随后将固相载体与样品分离并洗脱吸附的AAV。本发明提供的纳米抗体其抗原结合片段可通过偶联剂与固相载体表面的羟基、羧基、氨基等官能团结合而被固着在固相载体表面。所用的固相载体包括聚合物微球、琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、聚碳酸脂、消化纤维、二氧化硅或磁性微球等。在一些实施方式中,将固相基质作为层析填料用于AAV或其VP蛋白的分离和/或纯化。在另一些实施方式中,固相基质为磁珠形式,在将偶联有本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段磁珠加入含AAV的样品中,再通过磁力分离磁珠(及其吸附的AAV),随后通过洗脱分离出AAV。
纯化AAV的方法
根据本发明的一些实施方式,提供了一种纯化AAV的方法,所述方法包括:
1)将包括AAV的样品与所述的纳米抗体或所述的固相载体接触;
2)将所述纳米抗体或固相载体与所述样品分离;以及,
3)用溶液从所述纳米抗体或固相载体洗脱所述AAV;
在一些可选的实施方式中,步骤3)所述溶液的pH为2.5~7.0,优选为2.5~6.5,更优选为2.5~5.5,进一步优选为2.5~5.0或3.5~5.5;利用上述这些pH的溶液进行洗脱,洗脱效率高。
在一些任选的实施方式中,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的一种或多种。
通过上述的纯化方法,可在高效洗脱的同时,尽可能保持AAV的活性,降低了生产的成本,提升了生产效率。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:纳米抗体的获得
设计获得纳米抗体2135和纳米抗体4038。
纳米抗体2135的序列(SEQ ID NO:1):
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLMHGHYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGS
对于上述纳米抗体序列,基于Kabat定义规则确定了HCDR序列,HCDR区具体如下所示:
HCDR1(SEQ ID NO:2):SYAMG,
HCDR2(SEQ ID NO:3):VQDLSASNTYYSSAVKG,
CDR-H3(SEQ ID NO:4):GPTLMHGHYNSAREYDY。
纳米抗体4038的序列(SEQ ID NO:5):
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLAHGSHNSARHYDYWGQGTQVTVSSGS
对于上述纳米抗体序列,基于Kabat定义规则确定了HCDR序列,HCDR区具体如下所示:
HCDR1(SEQ ID NO:6):LYAMG,
HCDR2(SEQ ID NO:3):VQDLSASNTYYSSAVKG,
HCDR3(SEQ ID NO:7):GPTLAHGSHNSARHYDY。
实施例2:纳米抗体的表达及纯化
1、2135-mFc、4038-mFc、2135-His和4038-His的表达
根据实施例1筛选到的2135和4038这两个克隆,将纳米抗体2135和纳米抗体4038分别与胞外分泌信号肽以及小鼠IgG2a的Fc片段、6×His标签融合,得到2135-mFc、4038-mFc、2135-His和4038-His。
具体为将SEQ ID NO:8所示的序列连接至PTT5载体上,构建得到PTT5-2135-mFc载体,再转入293T细胞,经过表达并收集上清,得到2135-mFc(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)。
通过与上述相同的方法,得到4038-mFc(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)。
2135-mFc核酸序列(SEQ ID NO:8):
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCCACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAAGCCGGAGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCAGAACATTCAGCAGCTACGCCATGGGCTGGTTTCGGCAGGCCCCTGGCAAGGAAAGAGAGTTCGTGGCCGTGCAGGACCTGTCTGCCAGCAACACATACTACAGCTCTGCTGTGAAAGGCAGGTTCACCATCAGCAGAGATAATGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCGTCTACTATTGTGCCGCCGGCCCTACCCTGATGCACGGCCACTACAACAGCGCTAGAGAATACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTTACAGTGTCCTCCGGATCCGAGCCCCGCGGCCCCACCATCAAGCCCTGCCCCCCCTGCAAGTGCCCCGCCCCCAACCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCAGCCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGACCCAGACCCACCGCGAGGACTACAACAGCACCCTGCGCGTGGTGAGCGCCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACAAGGACCTGCCCGCCCCCATCGAGCGCACCATCAGCAAGCCCAAGGGCAGCGTGCGCGCCCCCCAGGTGTACGTGCTGCCCCCCCCCGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACCCTGACCTGCATGGTGACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAGTGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACAGCAAGCTGCGCGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGGAGCGCAACAGCTACAGCTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGCACCCCCGGCAAGTGA
4038-mFc核酸序列(SEQ ID NO:9):
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCCACCGGTGTACATTCCCAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGACTCGTGCAGGCTGGAGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCCGCACCCACGGCCTGTACGCCATGGGCTGGTTTAGACAGGCCCCTGGCAAGGAACGGGAATTCGTGGCCGTGCAGGACCTGTCCGCCAGCAATACCTACTATTCTAGCGCTGTTAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACAGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGCCGCTGGCCCCACCCTGGCCCACGGCAGCCACAACAGCGCCAGACACTACGACTACTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACAGTGTCCAGCGGATCCGAGCCCCGCGGCCCCACCATCAAGCCCTGCCCCCCCTGCAAGTGCCCCGCCCCCAACCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCAGCCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGACCCAGACCCACCGCGAGGACTACAACAGCACCCTGCGCGTGGTGAGCGCCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACAAGGACCTGCCCGCCCCCATCGAGCGCACCATCAGCAAGCCCAAGGGCAGCGTGCGCGCCCCCCAGGTGTACGTGCTGCCCCCCCCCGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACCCTGACCTGCATGGTGACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAGTGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACAGCAAGCTGCGCGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGGAGCGCAACAGCTACAGCTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGCACCCCCGGCAAGTGA
2135-mFc氨基酸序列(SEQ ID NO:10,单下划线处为胞外分泌信号肽序列,双下划线处为mFc序列):
4038-mFc氨基酸序列(SEQ ID NO:11,单下划线处为胞外分泌信号肽序列,双下划线处为mFc序列):
具体为将SEQ ID NO:12所示的序列连接至PTT5载体上,构建得到PTT5-2135-His载体,再转入293T细胞,经过表达并收集上清,得到2135-His(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)。
通过与上述相同的方法,得到4038-mFc(氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)。
2135-His核酸序列(SEQ ID NO:12):
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCCACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAAGCCGGAGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCAGAACATTCAGCAGCTACGCCATGGGCTGGTTTCGGCAGGCCCCTGGCAAGGAAAGAGAGTTCGTGGCCGTGCAGGACCTGTCTGCCAGCAACACATACTACAGCTCTGCTGTGAAAGGCAGGTTCACCATCAGCAGAGATAATGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCGTCTACTATTGTGCCGCCGGCCCTACCCTGATGCACGGCCACTACAACAGCGCTAGAGAATACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTTACAGTGTCCTCCGGATCCCACCACCACCACCATCACTGA
2135-His氨基酸序列(SEQ ID NO:13,下划线处为胞外分泌信号肽序列):
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLMHGHYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH*
4038-His核酸序列(SEQ ID NO:14):
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCCACCGGTGTACATTCCCAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGACTCGTGCAGGCTGGAGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCCGCACCCACGGCCTGTACGCCATGGGCTGGTTTAGACAGGCCCCTGGCAAGGAACGGGAATTCGTGGCCGTGCAGGACCTGTCCGCCAGCAATACCTACTATTCTAGCGCTGTTAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACAGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGCCGCTGGCCCCACCCTGGCCCACGGCAGCCACAACAGCGCCAGACACTACGACTACTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACAGTGTCCAGCGGCTCTCACCACCACCACCATCACTGA
4038-His氨基酸序列(SEQ ID NO:15,下划线处为胞外分泌信号肽序列):
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLAHGSHNSARHYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH*
2、2135-mFc、4038-mFc、2135-His和4038-His的表达
对于2135-mFc和4038-mFc,利用LIPO3000转染到293T细胞,48小时后,收集上清,用ELISA的方法检测2135-mFc和4038-mFc的浓度。对4038-His,用细菌表达后,然后用镍柱纯化。
实施例3:纳米抗体2135对AAV的亲和力
将AAV3、AAV5、AAV8分别加入到包被缓冲液中,然后加入到96孔酶标板中,100μl/孔,置于4℃孵育过夜。包被完成后用250μL PBST溶液洗3次,拍干。用1%(v/v)BSA封闭液封闭,37℃下封闭1h。随后,将封闭液弃掉,用250μL PBST洗三次,拍干。每孔加入100ng 2135-mFc,在37℃下孵育1h。孵育后,用PBST洗三次,拍干。加入山羊抗鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch Cat.No.115-035-144),在37℃下孵育11h。随后,用PBST洗四次,拍干。按每孔100μL加入TMB显色液进行显色,再每孔加入100μL终止液终止,并使用酶标仪检测各孔的OD450值。
实验结果:本实施例测试纳米抗体2135对不同血清型AAV的结合能力。用AAV3、AAV5和AAV8包被后,再加入纳米抗体2135-mFc,本实施例发现纳米抗体2135对AAV3、AAV5和AAV8都有较好的结合能力(图1)。
实施例4:纳米抗体4038对AAV的亲和力
将AAV5加入到包被缓冲液中,然后加入到96孔酶标板中,100μl/孔,置于4℃孵育过夜。包被完成后用250μL PBST溶液洗3次,拍干。用1%(v/v)BSA封闭液封闭,37℃下封闭1h。随后,将封闭液弃掉,用250μL PBST洗三次,拍干。每孔加入100ng 4038-mFc,在37℃下孵育1h。孵育后,用PBST洗三次,拍干。加入山羊抗鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearchCat.No.115-035-144),在37℃下孵育11h。随后,用PBST洗四次,拍干。按每孔100μL加入TMB显色液进行显色,再每孔加入100μL终止液终止,并使用酶标仪检测各孔的OD450值。
实验结果:本实施例测试纳米抗体4038对不同血清型AAV的结合能力。用AAV5包被后,再加入纳米抗体4038-mFc,本实施例发现纳米抗体4038对AAV5有较好的结合能力(图2)。
实施例5:纳米抗体2135的Elisa洗脱测试
将AAV3、AAV5、AAV8分别加入到包被缓冲液中,然后加入到96孔酶标板中,100μl/孔,置于4℃孵育过夜。包被完成后用250μL PBST溶液洗3次,拍干。用1%(v/v)BSA封闭液封闭,37℃下封闭1h。随后,将封闭液弃掉,用250μL PBST洗三次,拍干。每孔加入100ng 2135-mFc抗体,在37℃下孵育1h。孵育后,分别加入100μl pH2.5、pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5的溶液(含有20mM柠檬酸,100mM NaCl,0.001% F68,2% Gly),室温孵育2分钟后再用PBST(PBS+0.05%吐温20)洗板3次。加入山羊抗鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Cat.No.115-035-144),在37℃下孵育1h。随后,用PBST洗四次,拍干。按每孔100μL加入并用TMB显色液进行显色,再每孔加入100μL终止液终止,并使用酶标仪检测各孔的OD450值,OD450值越低说明洗脱效率越高。
实验结果:本实施例测试纳米抗体2135对不同血清型AAV结合后的洗脱pH。用AAV3,AAV5,AAV8包被后,再加入2135-mFc,然后用pH2.5、pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5的溶液进行洗脱,结果显示AAV3,AAV5,AAV8在pH2.5-5.5范围内均有较高比例的洗脱(图3)。
实施例6:纳米抗体4038的Elisa洗脱测试
将AAV5加入到包被缓冲液中,然后加入到96孔酶标板中,100μl/孔,置于4℃孵育过夜。包被完成后用250μL PBST溶液洗3次,拍干。用1%(v/v)BSA封闭封闭液,37℃下封闭1h。随后,将封闭液弃掉,用250μL PBST洗三次,拍干。每孔加入100ng 4038-mFc抗体,在37℃下孵育1h。孵育后,分别加入100μl pH2.5、pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5的溶液(20mM柠檬酸,100mM NaCl,0.001% F68,2% Gly),室温孵育2分钟后再用PBST(PBS+0.05%吐温20)洗板3次。加入山羊抗鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Cat.No.115-035-144),在37℃下孵育1h。随后,用PBST洗四次,拍干。按每孔100μL加入并用TMB显色液进行显色,再每孔加入100μL终止液终止,并使用酶标仪检测各孔的OD450值,OD450值越低说明洗脱效率越高。
实验结果:本实施例测试纳米抗体4038对AAV5结合后的洗脱pH。用AAV5包被后,再加入4038-mFc,然后用pH2.5、pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5的溶液进行洗脱,结果显示AAV5在pH2.5-5.5范围内均有较高比例的洗脱(图4)。
实施例7:用纳米抗体交联的亲和填料纯化AAV
用实施例2制备的纳米抗体4038-His与NHS填料(Biorad Affi Gel 102MediaCat.No.115-035-144)交联得到可用于AAV纯化的亲和填料,并装入重力柱当中。加入含有AAV5的病毒溶液(样本1、样本2)进行孵育后,用10倍体积的平衡液清洗,依次用pH5.0、pH4.5、pH2.5的溶液进行洗脱,分别接收25mL不同pH洗脱的洗脱液,再用数字PCR方法检测不同pH洗脱下来的样品基因组滴度,计算各pH溶液的回收率。
样本1数字PCR引物和探针:
引物F:5'-CCGACAACCACTACCTGAG-3'(SEQ ID NO:16),
引物R:5'-CCATGCCGAGAGTGATCC-3'(SEQ ID NO:17),
探针P:5'-CAATGGTGGCTCTGTACAACGCTG-3'(SEQ ID NO:18,5’端用6-羧基荧光素(6-FAM)标记,3’端用BHQ-1标记)。
样本2数字PCR引物和探针:
引物F:5'-TCTGCTGAAACTGTGGGTG-3'(SEQ ID NO:19),
引物R:5'-TGCTCTTGTCAATCTGCTTG-3'(SEQ ID NO:20),
探针P:5'-CAATGGTGGCTCTGTACAACGCTG-3'(SEQ ID NO:21,5’端用6-羧基荧光素(6-FAM)标记,3’端用BHQ-1标记)。
反应体系:
名称 | 用量(μl) |
2×ddPCR mix | 11 |
引物F | 1 |
引物R | 1 |
探针P | 0.5 |
水 | 3.5 |
样品 | 5 |
反应程序:
样品总滴度=各pH洗脱下来的样品滴度的总和,
回收率=该pH洗脱滴度/样品总滴度×100%。
实验结果:用纳米抗体4038-His制备亲和填料,并对上游发酵的AAV5样品进行亲和纯化,依次用pH5.0、pH4.5、pH2.5的溶液进行洗脱,结果显示,在pH为5.0的溶液中洗脱,可洗脱93%以上的AAV5,之后依次用pH为4.5和pH2.5的溶液洗脱,可将残余的AAV5全部洗脱。
需要说明的是,尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案,但本领域技术人员能够理解,本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (14)
1.靶向血清型腺相关病毒(AAV)的纳米抗体,其包含重链可变区,所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR):HCDR1、HCDR2和HCDR3;并且,
所述HCDR1包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:3中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体;
所述HCDR3包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7中任一项具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高序列同一性的其变体。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体,其包含以下(i)和/或(ii):
(i)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:4所示的HCDR3;
(ii)如SEQ ID NO:6所示的HCDR1、如SEQ ID NO:3所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体包含以下序列中的一种或多种:
(i)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(ii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列;或者,
(iii)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的功能。
4.根据权利要求1~3任一项所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体在其N端和/或C端包含Fc片段;以及,
任选地,所述纳米抗体在N端和/或C端包含信号肽序列;
可选地,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,或在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
5.根据权利要求1~3任一项所述的纳米抗体,其中,所述纳米抗体在其N端和/或C端包含标签序列;和/或,在其N端包含信号肽序列;
可选地,所述纳米抗体包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列,SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
6.一种多核苷酸,其编码权利要求1~5任一项所述的纳米抗体。
7.一种表达载体,其含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞,其包含权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的表达载体或权利要求1~5任一项所述的纳米抗体。
9.一种制备权利要求1~5任一项所述的纳米抗体方法,其包括:培养权利要求8所述的宿主细胞、从培养物中分离纳米抗体、以及,可选地,对所述纳米抗体进行纯化。
10.一种检测样品中AAV的方法,其包括将权利要求1~5任一项所述的纳米抗体与所述样品接触,并检测所形成的免疫复合物的量。
11.一种试剂盒,其包括如权利要求1~5任一项所述的纳米抗体。
12.一种固相载体,其表面偶联有权利要求1~5任一项所述的纳米抗体。
13.一种纯化AAV的方法,其包括:
1)将包括AAV的样品与权利要求1~5任一项所述的纳米抗体或权利要求10所述的固相载体接触;
2)将所述纳米抗体或固相载体与所述样品分离;以及,
3)用溶液从所述纳米抗体或固相载体洗脱所述AAV;
可选地,步骤3)所述溶液的pH为2.5~7.0,优选为2.5~6.5;
任选地,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的一种或多种。
14.权利要求1~5任一项所述的纳米抗体、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求11所述的检测试剂盒或权利要求12所述的固相载体在纯化AAV中的用途;
任选地,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的一种或多种。
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