JP3130024B2 - ウイルス検出用プライマー - Google Patents
ウイルス検出用プライマーInfo
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Description
ブロウイルスB19の検出のための、PCR用プライマ
ー、又はプローブに関する。
潔のために:B19)は、1975年において、血液ド
ナーからの血漿試料 (Cossart, Y.E., Field, A.M., Ca
nt, B., Widdows. D. :ヒト血清中のパルボウイルス様
粒子、Lancet I (1975) 72−73) の中に向流電気泳動に
より偶然発見された。近年、B19は慢性溶血性発症の
患者において形成不全性発症を引き起こすことがあり、
そして伝染性紅斑(EI)の病因学的因子であることが
示された。
さを有する。この粒子は二十面体の対称性を有する。ウ
イルス粒子の外に、また、DNAを含有しない「空の」
カプシドが見られる。CsCl2 の中の密度は1.36〜
1.40g/mlである。ウイルスのゲノムは5.4kbの
一本鎖DNAから成る。B19パルボウイルスのゲノム
のヌクレオチド配列は、事実上完全なウイルスのゲノム
を含有するクローンから誘導された (R.O.Shade et a
l., Journal of Viro-logy (1986) p.921)。各場合にお
いて、プラスまたはマイナスの向きをもつ、1つのDN
A鎖のみが、各ウイルス粒子の中にパッケージングされ
る。B19は自律的パロウイルスである、すなわち、複
製のためにヘルパーを必要としない。
kDa (VP2)の分子量から成る2つのポリペプチドか
ら成る。さらに、3つの52,63および71kDa の非
構造的タンパク質を検出することができる。DNAはカ
プシドの構造タンパク質を5′領域においてコードす
る。構造タンパク質の解読配列はVP1の追加のN末端
を除外して同一である。この差はmRNAレベルにおけるス
プライシングプロセスにより引き起こされ、ここでVP
2の場合において、VP1のための翻訳開始は除去され
ており、こうして翻訳はより短いVP2のみで開始する
ことができる。
物についての研究により、これらは一部分DNAレベル
で制限酵素のパターンによってのみ異なることが発見さ
れた。しかしながら、これらの差B19感染の臨床的ス
ペクトルと相関関係をもたない。B19を成長させるこ
とができる永久的細胞系を今日まで発見することができ
なかった。B19のための実験動物のモデルを確立する
ことは、今日までほとんど成功してきていない。しかし
ながら、B19は主としてエリトロポイエチンの存在下
に骨髄細胞の中で成長させることができる。こうして、
ウイルスの複製のメカニズムを明瞭にし、そしてエリト
ロポイエチンの細胞はこの感染の標的細胞であることを
示すことができる。胎児エリトロポイエチン細胞および
慢性骨髄様白血病の患者の赤芽球の中のB19細胞の接
種は、今回、成功した。
この紅斑〔erythema infectiosum (infectious erythem
a)〕は通常良性の過程をとりそして大部分子供および若
い大人の間で起こる伝染病である。B19の感染は、さ
らに、慢性の溶血性貧血(鎌状赤血球貧血など)の患者
において形成不全性発症を引き起こし、そして先天性お
よび後天性免疫欠損状態の患者において慢性の骨髄形成
不全を引き起こす。妊婦において、B19の感染は約1
0〜15%において胎児水腫を生じ、その結果子宮間死
を生ずることがある。さらに、B19はシェンレイン−
ヘノフ (Schoenlein−Henoch) 紫斑の発生に関連する。
が、また、抗原陽性の保存された血液および凝固産生物
により移される。B19を大量で得ることができる永久
的細胞系はまだ知られていないので、こうして診断試験
のための抗原を得るための源が欠如している。今日ま
で、ちょうど感染のウイルス血症の段階にあるドナーか
らの保存血液の中に偶然発見されたB19を使用してい
る。
で、IgGまたはIgMクラスのB19特異的抗体の検
出を可能とする、免疫学的に活性なポリペプチドを提供
することである。これは次の応用を生ずる: − 皮膚科学、組織学的、婦人科学、リウマチ学および
小児科学における急性または前のB19感染の血清診
断。 − 妊娠した女性におけるB19免疫状態の決定。 − B19ウイルスの転移は抗B19IgG陽性の血液または
血漿によりもはや可能ではないので、B19抗原の転移
を排除するための、保存された血液または供与された血
漿の研究。 − B19免疫グロブリン過多の産生物の産生のための
抗B19陽性血漿ドナーの選択。
スペクトルは広く、そしてB19血清陰性の妊婦に対す
る危険のために、試験試薬の導入は強く要求されてい
る。利用可能な免疫学的に活性なポリペプチドは直接調
製できないことが明らかにされた。遺伝子工学による短
いペプチドの調製は、大きいポリペプチドのそれにちょ
うど類似し、適当な発現ベクターを使用するときにのみ
満足すべき収率で可能である。比較的短いペプチドは合
成により容易に調製することができるが、免疫学的活性
について、いっそう正確な知識が必要である。
シドのタンパク質VP1およびVP2のアミノ酸配列の
一部分を有する免疫学的に活性なペプチドに関する。こ
れらのペプチドは、パルボウイルスB19に対する抗体
の検出を妨害する不純物を含有しないことを特徴とす
る。この性質は、調製の理由で、検出すべき抗体と反応
する成分を含有するペプチド調製物を利用することがで
きないので、非常に重要である。この型の望ましくない
不純物の1つの例はプロテインAであり、これはIgG
抗体のFc部分と特異的に反応することができる。本発
明による免疫学的に活性なペプチドの1つの特定の利点
は、それらをすぐれた収量で本発明による調製法により
調製できることである。なぜなら、診断試験に要求され
る調製法において適切な量で合成されない場合、引き続
く精製後、要求される収量を得ることができないからで
ある。
より正確にはVP2と一致しないVP1の領域から、短
いペプチドのセグメントを決定することが可能となり、
そのエピトープは研究流体、ことに血清の中のパルボウ
イルスB19に対する抗体の信頼性ある検出に適当であ
る。この領域を以後VP1-VP2 と呼ぶ。図12は、例示に
より、この領域(VP1-VP2) におけるいくつかのペプチド
の配置(PAPEP1-PAPEP8) を示す。これらのペプチドは好
ましいが、VP1-VP2 からの8〜50アミノ酸、好ましく
は10〜32アミノ酸をもつ他のペプチドを等しく使用
できる。この領域は図2に示すポリペプチドPAN1にほぼ
相当する。本発明の好ましい実施態様において、免疫優
性およびB19特異的領域は血清学的試験において使用
される。これに関して、合成ペプチドの混合物を使用す
ることがとくに好ましく、これらのペプチドは実施例3
に示すアミノ酸配列PAPEP1-PAPEP8 を有する。
遺伝子工学により調製された免疫学的に活性なペプチド
PAN-1, PAN-2, PAN-3, PAN-4, PCE, PANSE及びPAPST の
図2,4,5,6,3,8及び9に記載するアミノ酸配
列を使用する。この場合において概して、この試験にお
いて1つのペプチドを使用することは十分である。しか
しながら、特別の場合において、また、2またはそれ以
上のこれらのペプチドを使用することができる。本発明
によるペプチドを合成または遺伝子工学により調製する
ことができる。実施例3の中に詳細に説明されている短
いペプチドは、好ましくは、合成により調製される。し
かしながら、より長いペプチドは、好ましくは、遺伝子
工学により調製される。
染した患者の血清から、2つのポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)により増幅し、そして大腸菌 (Escherichia (E.) c
oli)の中でさらに成長させるためにプラスミドの中でク
ローニングした。それ以上のスクリーニング工程後、そ
れらからの種々の領域をE.coliの中の遺伝子工学により
発現し、そしてそれから生ずる抗原をウイルスに対する
抗体の検出のための使用について研究した。発現ベクタ
ーの中の本発明によるペプチドの直接の調製は、種々の
困難のために、不可能であった。この理由で、本発明に
よれば、ウイルスのタンパク質のセグメントを安定な発
現が可能であるタンパク質に融合する。この融合タンパ
ク質は精製後IgG検出のための抗原として使用でき
る。しかしながら、パルボウイルス特異的タンパク質
を、好ましくは、適当な方法により切断し、さらに精製
し、次いで血清学的試験に使用する。
に対して向けられた抗体の決定のための試験キットに関
する。本発明による免疫学的に活性なペプチドは、原理
的には、パルボウイルスB19に対する抗体を検出する
すべての診断試験キットにおいて使用することができ
る。本発明による試験キットの好ましい実施態様におい
て、適当なマイクロタイタープレートまたはポリスチレ
ンのビーズの固相を本発明による免疫学的に活性なペプ
チドでコーティングする。適当な希釈で研究流体(血清
試料)とインキュベーション後、そして普通の洗浄工程
後、酵素および放射能で標識した抗ヒトIgGを添加す
る。次いで、基質の転化または結合した放射能の程度
は、パルボウイルスB19に対して向けられた抗体が血
清試料の中に存在するかどうかを示す。
実験室、病院、研究施設などに供給される。それらは、
通常、この試験の実施に要求されるすべての試薬を含有
する。しかしながら、普通の試験試薬、例えば、緩衝液
は時には含めない。概して、試験キットは、本発明によ
る1種または2種以上のペプチドまたは抗抗体でコーテ
ィングしたマイクロタイタープレートまたはポリスチレ
ンのビーズを含有する。試験キットは、さらに、試験原
理に依存して、本発明による1種または2種以上のペプ
チドを含有する。最後に、試験キットは、また、試験結
果の定量を可能とするインディケーター成分を包含す
る。
マイクロタイタープレートまたはポリスチレンのビーズ
の固相に結合させる。試験血清のインキュベーション、
および適当な洗浄および飽和の工程後、B19抗原に対
する抗体特定の酵素または放射能で標識した抗体を添加
し、そしてその基質の転化または結合した放射能を測定
する。これは阻害試験の形態を取るので、小さい基質の
転化または低い放射能は特定の抗体の存在を示す。同様
に、B19に対するIgM抗体の検出に、固相にカップ
リングした本発明によるペプチドを使用することができ
る。この検出法においてまずプロテインAでコーティン
グしたビーズを研究流体に添加することによって、Ig
G抗体を排除する。次いで、酵素または放射能で標識し
た抗ヒトIgM抗体を使用して、結合した抗体を検出す
る。
しい試験キットにおいて使用する。まず、固相に結合し
た抗ヒトIgM抗体により、研究流体(血清)からのI
gMを結合する。次いで、本発明による免疫学的に活性
なペプチドを添加する。抗原の結合の程度、こうして存
在する抗B19IgMの量は、放射性標識または他の物質で標
識され、こうして検出可能である抗原によるか、あるい
はB19抗原に対する第2標識抗体を使用し、そしてそ
の結合を測定することによって、決定することができ
る。ELISA (酵素結合免疫吸収アッセイ)は、本発明の
範囲内でとくに好ましい。
バイオプシーなど)の中のウイルスの直接検出のために
使用できるDNA配列が提供される。VP1の中のDN
A領域にそれら自体特異的に結合する2つのDNAプラ
イマーを使用することは好ましい。次いで、商業的に入
手可能なポリメラーゼ連鎖反応のキットにより、それら
の間に存在する領域の増幅を達成することができる。次
いで適当な方法で固定化された増幅したDNAを、適当
なDNA配列により検出する。ハイブリダイゼーション
に使用したこのDNAを、2つのプライマーの間に存在
するDNA領域を含有するプラスミドにより調製する。
ンに使用するDNAの中に存在しないことは自明であ
る。使用するプライマーの配列および互いに対する配置
を図1に描写する。最後に、パルボウイルスB19に対
するワクチンは、また、本発明の範囲内で入手可能とな
る。これにより、本発明による免疫学的に活性なペプチ
ドは、適当なアジュバントと一緒に、必要に応じて数
回、保護すべき人に投与される。これにより誘発される
抗体の産生は、パルボウイルスB19による感染に対し
て保護することができる。
スB19のVP1およびVP2をエンコードする配列の
調製 急性感染(伝染性紅斑)の患者からの1mlの血清から、
1%のSDSの中のプロテイナーゼKの消化、フェノー
ル抽出、および引き続くアルコール沈澱により、ウイル
スのDNAを分離した(この工程およびDNAの調製、
プロセシングおよび発現、ならびに組み換えタンパク質
を調製のすべての次の工程、およびそれらの精製の基本
的工程は、Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook,
J.(1982),Molecular Cloning, コールド・スプリング・
ハーバー, ニューヨーク、に詳細に記載されている)。
取り、次いで1μlの試料をポリメラーゼ連鎖反応およ
び合成オリゴデオキシヌクレオチドにより増幅した。2
対のプライマーを表面タンパク質の解読領域の増幅のた
めに使用した;VP1タンパク質を得るためのこれらの
1つおよびプライマーとして使用した完全なVPpオリ
ゴデオキシヌクレオチドのための第2対は、それらの
5′末端の各々において、パルボウイルスの配列と相同
性でない配列を有し、これらの配列は制限酵素切断部位
をコードし、したがってPCRから生ずるDNA断片を
適当なベクターの中にクローニングするために適当であ
る。図1においてO−1〜O−5で表示するプライマー
を使用した。
パルボウイルスのDNAを含有する5つの混合物を 100
μlの体積の2対のプライマーで増幅した。このための
条件は次の通りであった:94℃における1.5分の変
性、45℃におけるプライマーの2分の結合、72℃に
おける4分の合成;合計50サイクル;緩衝液、基質お
よびTaqポリメラーゼを製造業者 (Cetus/Perkin-Elm
er, ユーバーリンゲン, ドイツ国)が述べているよう
に、このために使用した。
について)からの増幅したDNA断片を、各場合におい
て、一緒にし、アルコール沈澱により沈澱させ、70%
のアルコールで洗浄し、乾燥し、200μlの体積のT
E緩衝液中に溶解し、そして制限酵素EcoRI およびHind
III で消化した。次いで1.2%のアガロースゲルの中
の電気泳動による断片を分画し、次いで対応するDNA
バンド(VP1について 709bp、VP2について1704b
p)を分離し、そしてベクターPUC12 (Pharmacia, スウ
ェーデン国) のEcoRI およびHindIII 部位の中に挿入し
た。プラスミドをE.coli JM109 の中に形質転換した
後、パルボウイルスのDNAのインサートをもつバクテ
リアのクローンを制限消化により特性決定した。対応す
るゾーンに、VP1部分をコードする領域についてpUC1
2PANの名称およびVP2をコードする領域にpUC12VP2の
名称を与えた。
VP2部分の遺伝子工学による調製 a)VP1部分 : 1)PAN-1 VP1をコードする領域をプラスミドpUC12PANからBclI
およびHindIII で分離し(参照、第1図、HindIII はp
UCベクターから由来する)そしてベクター(例えば、
pBD2)の切頭したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の3′末
端の背後においてBamHI およびHindIII 制限切断部位の
中に挿入した。それから生ずるプラスミドをもつE.coli
細胞は、IPTGにより誘発後、β−gal::VPI融合タンパク
質(抗体67kDa)を大量に発現し、これはイムノブロット
(ウェスタンブロット)において抗パルボウイルスB1
9陽性血清と非常に強く反応する。
溶性を利用する慣用方法により、非常に容易に達成する
ことができる。細胞の溶解後、沈澱の分画を洗浄剤、例
えば、Triton−X100およびオクチルグルコ−ピラノシド
で洗浄し、引き続いて融合タンパク質を8モルの尿素/
1%のメルカプトエタノールで溶解し、そして細胞の不
純物からDEAEクロマトグラフィーによりNaClの勾配を使
用して分離した。
始するので、VP1部分はBrCN切断により融合タンパク
質から切断することができ、そしてこのアミノ酸は断片
それ自体の中にもはや現れない;対照的に、メチオニン
はバクテリアの融合タンパク質の中に比較的頻繁に存在
するので、この部分は非常に小さい断片に破壊される。
35%のギ酸およびBrCNの中で室温において4時間切断
した後、試料を凍結乾燥し、8モルの尿素、2ミリモル
のDTE(ジチオスレイトール)中に溶解し、そしてNa
Cl勾配のクロマトグラフィーによるDEAEクロマトグラフ
ィーにより精製した。それから生ずるVP1断片をPAN-
1 と呼び、そして血清学的決定のために直接使用するこ
とができる。アミノ酸配列を図2に示す。
ジャポニクム (Schistosoma japonicum)からのグルタチ
オンS−トランスフェラーゼ (Smith, D.B. およびJohn
son,K.S. :大腸菌の中でグルタチオンS−トランスフ
ェラーゼとの融合体として発現されたポリペプチドの単
一工程の精製、Gene, 67 (1988) 31−40) およびVP1
部分から成る融合タンパク質をコードするプラスミドで
あった。しかしながら、また、他の融合相手が診断試験
を妨害しないかぎり、その融合相手を使用することがで
きる。
vuII消化(618bp)後pUC12PANから分離し、そしてpGEX1
の中のBamHI およびSmaI部位の中に挿入した(pGEX1PA
N)。生ずる52kDa の融合タンパク質を上澄み液から
グルタチオンがカップリングしたアガロースにより精製
し、そして実施例4における血清学的試験のための抗原
として使用した(名称:PCE)。この抗原のアミノ酸
配列は図3に示す。
BclI/HincIIで分離しそして、他のベクターの中で中間
のクローニング後、pGEX2の中に挿入した(pGEX2PA
N)。同一リーディングフレームの中の断片の挿入は、
また、オリゴデオキシヌクレオチドを使用することによ
って達成することができる。グルタチオンS−トランス
フェラーゼまたはVP1セグメントの融合部位に、トロ
ンビンにより認識されるアミノ酸配列が存在するので、
B19部分をこの酵素により融合相手から切断すること
ができる。また、他の融合相手がプロテアーゼ認識配列
を有するかぎり、その融合相手を使用することができ
る。抗原のアミノ酸配列、ならびに融合した外来アミノ
酸(肉太の印刷)を図4に示す。
BclI/HincIIで分離しそして、他のベクターの中で中間
のクローニング後、pGEX3の中に挿入した(pGEX3PA
N)。同一リーディングフレームの中の断片の挿入は、
また、合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用すること
によって達成することができる。グルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼまたはVP1セグメントの融合部位に、
プロテアーゼ因子Xaにより認識されるアミノ酸配列が
存在するので、B19部分をこの酵素により融合相手か
ら切断することができる。また、他の融合相手がプロテ
アーゼ認識配列を有するかぎり、その融合相手を使用す
ることができる。抗原のアミノ酸配列、ならびに融合し
た外来アミノ酸(肉太の印刷)を図5に示す。
C12PANからBclIおよびPstIの消化により分離しそして、
種々の中間のクローニング後、ベクターpGEX2 の中に挿
入した。これはプラスミドpGEX2PANを生じた。同一リー
ディングフレームの中の断片の挿入は、また、合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドを使用することによって達成す
ることができる。グルタチオンS−トランスフェラーゼ
またはVP1セグメントの融合部位に、プロテアーゼの
トロンビンのためのアミノ酸配列が存在するので、B1
9部分をこの酵素により融合相手から切断することがで
きる。また、他の融合相手がプロテアーゼ認識配列を有
するかぎり、その融合相手を使用することができる。抗
原のアミノ酸配列、ならびに融合した外来アミノ酸(肉
太の印刷)を図6に示す。
グしたゲルのマトリックスを使用する簡単な親和クロマ
トグラフィーにより達成することができる。pGEX2 およ
び3に基づく融合タンパク質のそれ以上の精製のため
に、B19部分をトロンビンまたは因子Xで製造業者
(Boehringer Mannheim)が述べているように消化するこ
とによって切断した。次いで断片を再び親和クロマトグ
ラフィーにより精製した。S−グルタチオントランスフ
ェラーゼを、この場合において、選択的に取り出し、パ
ルボウイルスのタンパク質部分は流れの中に見いださ
れ、そして最後のDEAEクロマトグラフィーの分画後、血
清学的試験において使用することができる。
プロテアーゼを、また、融合タンパク質を結合して有す
るグルタチオンがカップリングしたゲル懸濁液に直接添
加することができる。約1時間インキュベーションした
後、切断されたVP1断片をゲルから洗浄除去すること
ができるが、グルタチオンS−トランスフェラーゼ部分
はゲルのマトリックスに結合したままである。
2の解読領域はプラスミドpUC12VP2中の正しいリーディ
ングフレームの中に既に存在し、そしてIPTGとインキュ
ベーション後、pGEX2PANについて記載したのと同様な方
法で、バクテリアのリゼイトの不溶性部分から精製する
ことができる。組み換え抗原のアミノ酸配列を図7に示
す。
頭はタンパク質の収量の増加にかなり関連すること、こ
の切頭された抗原は安定に発現されることができ、精製
の間においてさえ分解せず、そしてなお抗B19陽性血
清とまた同一の反応性を有することが、驚くべきことに
は、発見された。この発現プラスミド(pUC19PANSE)
は、NsiI部位の遠くまで355bだけVP2の5′領域を切
頭することによって得られた。
ングフレームをLacZペプチドの中に有するpUC19(Pharma
cia,スウェーデン国)の中に挿入した。PCRプライマ
ーのために、HindIII 部位は3′末端に位置するので、
また、中間のクローニングによりEcoRI 部位を生成し
て、要求される断片をpUC19 のPstIおよびEcoRI 部位の
中に挿入できるようにすることが必要であった。約38kD
a の大きさの抗原(PANSE)を、4モルの尿素の中に溶解
した後、DEAEクロマトグラフィーによりバクテリアのリ
ゼイトの沈澱分画から非常に簡単に不純物から分離する
ことができる。抗原のアミノ酸配列を図8に示す。
る 716bpの大きさの断片を、PstI消化によりプラスミド
pUC12VP2から分離した。この断片をベクターpUC19 (Pha
rmacia, スウェーデン国)の中にベクターのLacZと同一
のリーディングフレームの向きに挿入(制限酵素の消化
により特性決定した)した後、約33kDa の大きさのB
19抗原は非常に大きい量で産生される(合計のE.coli
タンパク質の約10%)。pBDAN と同様な方法で不溶性
構成成分から8モルの尿素の中に溶解し、引き続いてDE
AEクロマトグラフィーにより、精製を実施することがで
きる。アミノ酸配列を図9に描写する。
をPstIおよびHindIII で開き、そしてHindIII および部
分的PstIの消化後、pUC12VP2からのVP2をコードする
領域を1.7kbの断片として挿入した(pUC12VP1/2)。
VP1/2 を含有する抗原のE.coliにおける発現: 1)PAV-1 :pUC12VP1/2をEcoRI およびBamHI で切断
し、大きさ1466bpのDNAバンドを分離し、引き続いて
ベクターpUC18stop のEcoRI/BamHI 部位の中に挿入し
た。pUC18stop は前述のpUCベクターに類似する;し
かしながら、それは後者とPstI部位とHindIII 部位との
間に、翻訳停止シグナルおよび翻訳の停止をコードする
合成オリゴデオキシヌクレオチドを含有することによっ
て異なる。こうして、このベクターのポリリンカー領域
は次の配列を有する:
−CTGCAG, BglII−AGATCTおよびHindIII AACGTTを肉太
の印刷で示す)
-B)は、構造タンパク質を開始からアミノ酸486まで
および引き続くpUCポリリンカーのいくつかのアミノ
酸においてコードし、そして挿入されたオリゴデオキシ
ヌクレオチドの停止コドンで終わる。発現された抗原(P
AV-1-B)は、IPTGの誘発後、非常にすぐれた収量で産生
され、そして60kDa の大きさを有する。そのアミノ酸
配列を図10に描写し、肉太の印刷により強調されたア
ミノ酸はB19特異性ではなく、そしてpUC配列によ
りコードされる。抗B19陽性血清との反応性は非常に
すぐれそして、可溶性E.coliタンパク質を除去し、8モ
ルの尿素中に溶解し、そして普通のイオン交換クロマト
グラフィー(前述したように)により、効率よい精製を
達成することができる。
をEcoRI およびNsiIで消化した。このようにして産生さ
れた大きさ1137bpのバンドを、ベクターPAPEP1-PAPEP8s
top の中のEcoRI およびPstI部位の中に挿入した(上を
参照)。生ずるベクターは構造タンパク質を開始からア
ミノ酸377までにおいてコードする;抗原(PAV-1-N)
は、IPTGの誘発後E.coli細胞において、前述の抗原PAV-
1-B より多少低いレベルで産生される。それは45kDa
の大きさであり、そして抗B19血清との反応性はすぐ
れる。このアミノ酸配列を図11に示し、肉太の印刷の
アミノ酸はpUCベクターによりコードされ、そしてB
19特異性ではない。この抗原の精製はPAV-1-B につい
てのように達成することができる。
原のGST融合タンパク質としての発現 2つのベクターPAV-1-B およびPAV-1-N をEcoRI/BglII
で消化し、そして生ずる、それぞれ、1480bpot 1150bp
の大きさのバンドを分離し、翻訳停止シグナルは導入さ
れ、同時にpUC18stop はまた転移される。(BglII 部位
は上に示したpUC18stop ポリリンカーの中に示され、そ
して翻訳開始のすぐ前のBclI部位 (TGATCA) はDNAの
増幅のために使用したプライマーで導入された−参照、
図1、O−1)。次いで、同一の5′配列であるがVP-1
の異なる長さの領域をコードする2つの断片を、前述の
ベクターpGEX-1の中に挿入した。
に利用可能なSmaIおよびEcoRI の制限切断のみを有する
ので、最初に、また、SmaI(平滑末端)と適合性の部位
を生成することが必要であった。これは、2つのDNA
断片をベクターpIC20HのEcoRI およびBamHI (BglIIと適
合性)認識部位の中に挿入することによって実施した
(挿入不活性化による組み換えの選択のために融通性の
あるクローニング部位をもつpICプラスミドおよびフ
ァージのベクター、J.L.Marsh, M.ErfleおよびE.J.Wyke
s, Gene, 32 (1984) 481-485) 。次いで2つの断片を引
き続いて2つの生ずるベクターからBclIおよびHincII
(平滑末端の切断)で分離し、そしてpGEX-1の中のBamH
I およびSmaIの中に挿入した。HincIIは、また、B19
配列の中で切断するので、2つの断片を部分的HincII消
化により分離した。
オンS−トランスフェラーゼおよび引き続く2つの異な
る長さのVP-1セグメントから成る融合タンパク質を発現
する。pUCVP-B から由来しそしてここでpGEXVP-Bの中に
位置する断片は約87kDa の融合タンパク質を生ずる;
このより小さい断片は大きさ72kDa の融合タンパク質
をアミノ酸377までのみにおいてコードする。アミノ
酸配列を図10および図11に示す。唯一の差は、5つ
のN末端のアミノ酸が省略されており、そしてその代わ
りグルタチオンS−トランスフェラーゼで置換されてい
ることである。
る領域をもつpUC12VP1/2から、EcoRIおよびHindIII の
消化後、2.4kbの断片を分離し、そして真核生物の発
現ベクターpMDIII (Motz, M., Deby G., Jilg, W.Wolf,
H. :エプステインバーウイルスの主要な膜タンパク質
のチャイニーズハムスター卵巣細胞の中の発現、Gene,4
4 (1986) 353-359 (ATCC から入手可能))の中にEcoRI
およびHindIII の消化後に挿入した。このプラスミドを
引き続いてSalIで再び直線化し、そしてジヒドロフォレ
ートリダクター遺伝子(DHFR)および調節配列をもつ
2.4kbのSalI断片を、また、挿入した。このようにし
て得られたプラスミドpMDIIVP1/2をDHFR陰性CHO細胞
の中にトランスフェクションした。アルファーマイナス
培地(gibco)上の選択後生ずるコロニーを分離し、そし
て増加する濃度のメタトレキセート(MTX)で洗浄
後、増幅した。VP1/VP2 をもつ粒子はこれらの細胞培養
物からの培養上澄み液から精製することができる。
を、EcoRI/HindIII 消化後、HindIII 部位の外に、ま
た、BamHI 部位を有するベクターの中に挿入した。次い
で、この中間構成体からのパルボウイルスの部分をBclI
およびBamHI 断片として分離し、そしてバキュロウイル
スの発現ベクターのBamHI 部位の中に挿入した(種々の
構成体を使用することができる)。(BclI部位はVP1
の翻訳開始のすぐ前に位置し、それはPCRプライマー
によりコードされる、参照、図1;BamHI の消化は、ま
た、この型の部位がパルボウイルスの配列の中に存在す
るので、部分的に実施しなくてはならない)。生ずるプ
ラスミドを野生型バキュロウイルスのDNAとともに昆
虫の細胞培養系の中に同時トランスフェクションした
後、いわゆる封入体をもたない細胞が分離された。細胞
内で産生されたVP1はそれらの細胞から大量に精製す
ることができ、細胞内でバキュロウイルスの多面体の遺
伝子はVP1/2 遺伝子により置換されている。
VP-2を組み換えバキュロウイルスを使用して発現させ
た。このために、VP-2をコードするpUC12VP (参照、実
施例1)をEcoRI およびHindIII で消化し、そして生ず
る1.7kbの断片を、HindIII の外に、また、BamHI 部
位をもつ前述のベクターの中に挿入した。次いで、バキ
ュロウイルスの部分をこの中間構成体からBclIおよびBa
mHI 断片として分離し、そしてバキュロウイルスの発現
ベクターのBamHI 部位の中に挿入した(種々の構成体を
使用することができる)。(BclI部位はVP2の翻訳開
始のすぐ前に位置し、それはPCRプライマーによりコ
ードされる、図1、O−3を参照のこと;BamHI の消化
は、また、この型の部位がパルボウイルスの配列の中に
存在するので、部分的に実施しなくてはならない)。生
ずるプラスミドを野生型バキュロウイルスのDNAとと
もに昆虫の細胞培養系の中に同時トランスフェクション
した後、いわゆる封入体をもたない細胞が分離された。
VP2はそれらの細胞から大量に粒子として精製するこ
とができ、細胞内でバキュロウイルスの多面体の遺伝子
はVP2遺伝子により置換されている。これらの粒子は
μ−捕捉試験における使用にとくに適する。
ペプチド ウェスタンブロットにおけるバクテリアの発現産生物
(ことにpGEX::VP1 融合構成体)とパルボウイルス陽性
血清との反応のパターンは、VP1部分からの短い断片
がすべてのIgG陽性パルボ血清の同定に十分であると
いう、驚くべき結論に導く。断片は、合成により産生す
ることができる次のペプチドでカバーすることができ
る:
量に調製し、精製し、次いでELISAにおいて100〜2
00ng/混合物の濃度で使用することができる。ペプチ
ドのちょうど1つですぐれた結果を達成することができ
るときでさえ、2または3つのペプチドの同時使用は好
ましい。ある場合において、IgGまたはIgMの抗体
の検出のために、異なるペプチドまたはそれらの組み合
わせを使用することができる。
て、比較的大量の血清をこれらの抗原との反応性につい
て試験した。このために、種々の組み換えタンパク質を
炭酸塩緩衝液pH9.5の中の0.5〜1μg/mlの濃度
で、商業的に入手可能なELISA プレートのウェルにそれ
への結合のために16時間の間添加した。結合しない物
質を洗浄除去した後、これらのプレートを乾燥状態で4
℃において貯蔵することができる。血清とのインキュベ
ーションを1:100の希釈で2時間実施し、引き続い
て洗浄し、そしてペルオキシダーゼをカップリングした
抗ヒトIgG抗体と結合した抗体を普通の試験手順によ
り検出した。
した: 1.急性B19感染の患者からの血清を、連続的に、病
気後伝染性紅斑の出現から19週まで研究した。 結果:すべての血清は臨床的発症の開始からでさえ抗B
19陽性として認識されそして、pGEX1PANからの融合タ
ンパク質(PCE、参照、実施例1)およびBrCNにより
切断したVP-1領域(PAN-1 、参照、実施例2)の両者を
使用し、およびまた抗原としてトロンビンにより切断し
たVP1部分(PAN-4)を使用して、観測期間にわたって
陽性に止まった。 2.血清試料を入院のときおよび4週後採取した妊婦
(n=21)からの血清の対を、抗B19IgGについて試験
した。同一の血清を各抗原について使用した。
抗B19陰性であり、そして6人は抗B19陽性であっ
た。4週後の第2の血清試料についての血清学的結果は
同一の結果を生じた。 PAN-2 :21人の妊婦のうちで、入院のとき、14人は
抗B19陰性であり、そして7人は抗B19陽性であっ
た。4週後のこれらの妊婦から採取した血清試料を再試
験すると、IgGは前に抗B19IgG陽性であった妊婦にお
いてもはや検出されなかった。
き、15人は抗B19陰性であり、そして6人は抗B1
9陽性であった。4週後の第2の血清試料についての血
清学的結果は同一の結果を生じた。 b)明確にIgG/M陽性/陰性の血清の収集物(n=
13)の試験使用した血清は臨床的に定められた場合か
ら入手し、そしてIgG/M試験において前以てチェッ
クした。IgG/M試験は抗原として精製したウイルス
を使用する。血清1〜6:抗B19陰性、7〜9:IgM/
IgG 陽性、10〜13:IgM陰性、IgG陽性。
M抗体はIgGの決定と同一の試験原理により決定する
が、PANSE およびPAV-1-B を抗原としてプレートに10
倍高い濃度で1:1混合物で結合し、プロテインAをカ
ップリングしたビーズで前以て吸着することによって血
清IgG抗体を排除した。吸収についての次の値が得ら
れた: PAN-4 (約20ng/試験ウェル)を使用するIgGの決
定、PANSE およびPAV-1-B の1:1混合物(約150ng
/試験ウェルの合計のタンパク質)を使用するIgMの
決定
者について、陽性/陰性の血清の明瞭を弁別を示す。使
用したIgM陽性の血清は臨床的に定められた場合から
入手し、そしてIgG/M 試験において前以てチェックし
た。IgG/M 試験は抗原として精製したウイルスを使用す
る。VP1およびVP2領域からの組み換え抗原との試
験混合物は、また、すべてのIgM陽性の血清を認識し
た。「PAPST ,VP2、しかしことにPANSE 」VP2部
分は、この場合において、IgG試験より良好に反応し
た。したがって、両者の領域はIgMの商用試験キット
の中に提供される。
抗体により血清IgM抗体を固相プレートに選択的に結
合し、組み換え抗原(バキュロウイルスを発現した粒状
VP-2)を添加し、そして結合を決定することによって達
成することができる(μ−捕捉アッセイ)。これらの実
験は、本発明による免疫学的に活性なポリペプチドを使
用して実施された高い信頼性の試験を実証する。「PANS
E, PAPSTおよびVP-2」と呼ぶ抗原の中に含有されるVP
2領域は、長期間の感染をもつ患者からの抗体の決定の
感度をそれ以上増加しない。他方において、これらの抗
原とのすぐれた反応は近い過去においてのみ感染内の血
清の場合において見いだされる。したがって、この抗原
は感染のタイミングについての情報を提供するために適
当である。
または混合物を、遺伝子工学により産生されたVP1
と、あるいは合成ペプチドと混合すること、あるいはま
た、これら2つの領域との反応性の弁別が感染のタイミ
ングについての追加の情報を提供する場合、別々の混合
物でこれらを使用することができる。感度のそれ以上の
改良は、モノクローナル抗体により血清IgM抗体を固
相に選択的に結合し、組み換え抗原を添加し、そして結
合を決定することによって達成することができる(μ−
捕捉アッセイ)。
9特異的DNAプライマーの使用 存在するB19DNAは、研究試料(血清、バイオプシー)か
ら、1%のSDS(2時間、37℃)の存在下のプロテ
イナーゼK消化、フェノール抽出および70%のエタノ
ールの中に沈澱により得た。これ、および引き続くDN
A増幅を、実施例1に記載する手順と同様に、実施し
た。プライマーO−5およびO−2(配列およびB19
ゲノム上の位置について、図1参照)を使用した;B1
9陽性の場合において、増幅した断片は319bpの大き
さを有する。DNA断片のB19特異性の実証を、次の
ようにして実施した。
により分画し、DNAをニトロセルロース膜に移し(サ
ザンブロット)およびDNA片とハイブリダイゼーショ
ンさせ、ここでDNA片をそれらの間に配置し、そして
慣用方法(プライマーの伸長)により32Pまたはジゴキ
シゲニンで放射線標識されている。ハイブリダイゼーシ
ョンに使用したDNA断片は次の方法で得た:260bp
の長さのDNA断片をHincIIおよびPstIで消化後プラス
ミドpUC12PANから分離し、そしてpUC12 の中のHincIIお
よびPstI部位の中に挿入した。ここで、増幅に使用した
配列をもたないB19断片をEcoRI/PstI消化により生ず
るプラスミド(pUC12PCRDIA)から得ることができ、そし
て標識後ハイブリダイゼーションプローブとして使用す
ることができる。
列と共にパルボウイルスB19のVP1/2 をコードする領
域の線図的表示である。末端(二本鎖)に逆の領域およ
び解読領域をもつ一本鎖B19のゲノムの構造は上の部
分に線図で描写されている。ポリペプチドとして合成さ
れ、そしてプロセシングされる、非構造タンパク質(N
S)のための解読領域は左の領域に存在する。右の領域
はウイルスのカプシド(VP1/2)の表面タンパク質をコー
ドし、VP1は、追加のN末端領域(陰影を施したバ
ー)を別として、VP2(黒いバー)と同一である。こ
の下に、オリゴデオキシヌクレオチドO−1〜O−4の
領域が示されており、これらの領域はそれらの間に位置
するB19の増幅(PCR)のためのプライマーとして
使用した(VP1領域についてO−1およびO−2、そ
してVP-2についてO−3およびO−4)。
クレオチドのDNA配列をこの図面の下部に示す。オリ
ゴデオキシヌクレオチドの配列は肉太の印刷により表示
し、非相同性領域、すなわち、B19とハイブリダイゼ
ーションしない配列は線の間隔で対照させてある。これ
らのハイブリダイゼーションしない配列は、O−1の場
合においてEcoRI(GAATTC) およびBclI (TGATCA) 、O−
3の場合においてEcoRI, BclI およびBspHII(TC−ATG
A) 、およびO−4の場合においてHindIII (AAGCT−
T)のための制限酵素部位を表す。増幅されたVP2を
コードする断片(O−3およびO−4)を、pUCベク
ターの中への挿入の前に、EcoRI およびHindIII で消化
し、VP1をコードする断片をEcoRI およびPstIで消化
し、PstI切断部位はB19DNAの中に位置する(O−2につ
いて示した配列において No.4の位置から、CTGCAG) 。
coli細胞の中の組み換えにより産生された抗原のアミノ
酸配列を示す。クローニング工程のために、各場合にお
いて、多少の非B19抗原性外来アミノ酸は、また、N
末端においてC末端に含有され(PANSE AND VP-2を別と
して)そして肉太の印刷により強調されている。
と共に、パブロウイルスB19のVP1/2 をコードする領
域を示す図である。
5)を示す図である。
6)を示す図である。
7)を示す図である。
8)を示す図である。
9)を示す図である。
0)を示す図である。
1)を示す図である。
2)を示す図である。
号:23)を示す図である。
号:24)を示す図である。
を示す図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 DNAの増幅による、パルボウイルスの
検出方法において、 O−1:(配列番号:1) GTG AAT TCT GAT CAT ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG O−2:(配列番号:2) C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC CCC O−3:(配列番号:3) G AGG AAT TCT CTG ATC ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA GCC O−4:(配列番号:4) GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC TTC GAA GAG O−5:(配列番号:5) G CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA AG から選択される少なくとも1つのDNA配列を使用する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 前記DNAの増幅が、ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 下記塩基配列: O−1:(配列番号:1) GTG AAT TCT GAT CAT ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG O−2:(配列番号:2) C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC CCC O−3:(配列番号:3) G AGG AAT TCT CTG ATC ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA GCC O−4:(配列番号:4) GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC TTC GAA GAG O−5:(配列番号:5) G CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA AG を有するDNAの1又は複数を含んで成る、DNAの増
幅を用いる、パルボウイルスの検出のためのプライマー
又はプローブ。 - 【請求項4】 前記DNAの増幅が、ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅である、請求項3に記載のプライマー又
はプローブ。
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