JPH05504143A

JPH05504143A - パルボウイルスｂ１９の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド

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Publication number: JPH05504143A
Application number: JP3503659A
Authority: JP
Inventors: ソウトシェク，エルビン; モッツ，マンフレット
Original assignee: ミクロゲン　モレクラルビオロギシェ　エントビクルングス―ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング
Priority date: 1990-02-08
Filing date: 1991-02-08
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2015-07-10
Also published as: EP0514413A1; DE4003826C2; JP3130024B2; WO1991012269A1; JP2000184889A; CA2075366C; EP0514413B1; ES2052370T3; JP3061196B2; DK0514413T3; DE4003826A1; AU650864B2; ATE105303T1; DE59101577D1; AU7211591A; CA2075366A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】バルボウイルスＢ１９の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドヒトのパルポウイルスＢ１９（以後、簡潔のために：Ｂ１９）は、１９７５年において、血液ドナーからの血漿試料（Ｃｏｓｓａｒｔ＋　Ｙ、Ｅ、　＋Ｆｉｅｌｄ、Ａ、Ｍ、、　Ｃａｎｔ、Ｂ、、　Ｗｉｄｄｏｗｓ、Ｄ、：ヒト血清中のパルポウイルス様粒子、Ｌａｎｃｅｔ　Ｉ　（１９７５）　７２−７３）の中に向流電気泳動により偶然発見された。近年、Ｂ１９は慢性溶血性発症（ｓｉｃ）の患者において形成不全性発症を引き起こすことがあり、そして伝染性紅斑（Ｅｌ）の病因学的因子であることが示された。

電子顕微鏡下で、Ｂ１９は約２０ｎｍの大きさを有する。この粒子は二十面体の対称性を有する。ウィルス粒子の外に、また、ＤＮＡを含有しない「空の」カプシドが見られる。ＣｓＣ１ｚＯ中の密度（ｓｉｃ）は１．　３６〜１．　４０　ｇ／ｍｌである。ウィルスのゲノムは５．４ｋｂの一本ｇＤＮＡから成る。Ｂ１９バルポウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、事実上完全なウィルスのゲノムを含有するクローンから誘導された　（Ｒ，Ｏ，５ｈａｄｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ　（１９８６）　ｐ、９２１）、各場合において、プラスまたはマイナスの向きをもつ、１つのＤＮＡ１１のみが、各ウィルス粒子の中にパンケージソゲされる。Ｂ１９は自律的パロウイルス（ｓｊｃ）である、すなわち、複製のためにヘルパーを必要としない。

カプシドば８３ｋＤａ　（ＶＰＩ）および５８ｋＤａ　（ＶＦ６）の分子量から成る２つのポリペプチドから成る。さらに、３つの５２゜６３および７１ｋＤａの非構造的タンパク質を検出することができる。

ＤＮＡはカプシドの構造タンパク質を５′領域においてコードする。構造タンパク質の解読配列はＶＰＩの追加のＮ末端を除外して同一である。この差はｍＲＮＡレベルにおけるスプライシングプロセスにより引き起こされ、ここでＶＦ６の場合において、ＶＰｌのための翻訳開始は除去されており、こうして翻訳はより短いＶＦ６のみで開始することができる。

世界中で見いだされる種々のＢ１９の分離物についての研究により、これらは一部分ＤＮＡレヘルで制限酵素のパターンによってのみ異なることが発見された。

しかしながら、これらの差Ｂ１９感染の臨床的スペクトルと相関関係をもたない。

Ｂ１９を成長させることができる永久的細胞系を今日まで発見することができなかった。Ｂ１９のための実験動物のモデルを確立することは、今日まではんんど成功してきていない。しかしながら、Ｂ１９は主としてエリトロボイエチンの存在下に骨髄細胞の中で成長させることができる。こうして、ウィルスの複製のメカニズムを明瞭にし、そしてエリトロポイエチンの細胞はこの感染の標的細胞であることを示すことができる。胎児エリトロボイエチン細胞および慢性骨髄様白血病の患者の赤芽球の中の８１９細胞の接種は、今回、成功した。

Ｂ１９は伝染性紅斑を引き起こし、そしてこの紅斑（ｅｒｙ　ｔｈｅｓａｉｎｆｅｃｔｉｏｓｕｍ　（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａ）　）は通常良性の過程をとりそして大部分子供および若い大人の間で起こる伝染病である。Ｂ１９の感染は、さらに、慢性の溶血性貧血（鎌状赤血球貧血など）の色者において形成不全性発症を引き起こし、そして先天性および後天性免疫欠損状態の患者において慢性の骨髄形成不全を引き起こす。

妊婦において、Ｂ１９の感染は約１０〜１５％において胎児水腫を生し、その結果子宮間（ｓ　ｉ　ｃ）死を生ずることがある。さらに、Ｂ１９はシエンレインーヘノフ（Ｓｃｈ５ｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ）紫斑の発生に関連する。

概して、Ｂ１９は飛沫感染により移されるが、また、抗原陽性の保存された血液および凝固産生物により移される。

Ｂ１９を大量で得ることができる永久的細胞系はまだ知られていないので、こうして診断試験のための抗原を得るための源が欠如している。今日まで、ちょうど感染のウィルス血症の段階にあるドナーからの保存血液の中に偶然発見されたＢ１９を使用している。

本発明の目的は、ここに記載する試験系で、ＩｇＧまたは１ｇＭクラスの８１９特異的抗体の検出を可能とする、免疫学的に活性なポリペプチドを提供することである。これは次の応用を生ずるニー　皮膚科学、組織学的、婦人科学、リウマチ学および小児科学における急性または前の８１９ｉ染の血清診断。

−妊娠した女性におけるＢ１９免疫状態の決定。

−ＢＩ９ウィルスの転移は抗Ｂ１９ＩｇＧ陽性の血液または血漿によりもはや可能ではないので、Ｂ１９抗原の転移を排除するための、保存された血液または供与された血漿の研究。

−８１９免疫グロブリン過多の産生物の産生のための抗Ｂ１９陽性血漿ドナーの選択。

Ｂ１９により引き起こされる病気の臨床的スペクトルは広く、そしてＢ１９血清陰性の妊婦に対する危険のために、試験試薬の導入は強く要求されている。

利用可能な免疫学的に活性なポリペプチドは直接調製できないことが明らかにされた。遺伝子工学による短いペプチドの調製は、大きいポリペプチドのそれにちょうど類似し、適当な発現ベクターを使用するときにのみ満足すべき収率で可能である。比較的短いペプチドは合成により容易に調製することができるが、免疫学的活性について、いっそう正確な知識が必要である。

本発明は、バルポウイルスＢ１９のキャプシドのタンパク質ＶＰ１およびＶＦ６のアミノ酸配列の一部分を有する免疫学的に活性なペプチドに関する。これらのペプチドは、パルポウイルスＢ１９に対する抗体の検出を妨害する不純物を含有しないことを特徴とする。

この性質は、調製の理由で、検出すべき抗体と反応する成分を含有するペプチド調製物を利用することができないので、非常に重要である。この型の望ましくない不純物の１つの例はプロティンＡであり、これはＩｇＧ抗体のＦｃ部分と特異的に反応することができる。

本発明による免疫学的に活性なペプチドの１つの特定の利点は、それらをすぐれた収量で本発明による調製法により調製できることである。なぜなら、診断試験に要求される調製法において適切な量で合成されない場合、引き続く精製後、要求される収量を得ることができないからである。

さらに、本発明の範囲内で、ＶＰＩから、より正確にはＶＦ６と一致しないＶＰＩの領域から、短いペプチドのセグメントを決定することが可能となり、そのエピトープは研究流体、ことに血清の中のパルポウイルスＥ３１９に対する抗体の信頼性ある検出に適当である。この領域を以後ＶＰＩ−ＶＰ２と呼ぶ、第３図は、例示により、この領域（ＶＰＩ−ＶＦ６）におけるいくつかのペプチドの配置（ＰＡＰＥＰ　１−ＰＡＰＥＰ８）を示す、これらのペプチドは好ましいが、ＶＰＩ−ＶＦ６からの８〜５０アミノ酸、好ましくは１０〜３２アミノ酸をもつ他のペプチドを等しく使用できる。この領域は第２−１図に示すポリペプチドＰＡＮＩにほぼ相当する。

本発明の好ましい実施態様において、免疫優性およびＢ１９特異的領域は血清学的試験において使用される。これに関して、合成ペプチドの混合物を使用することがとくに好ましく、これらのペプチドは実施例３に示すアミノ酸配列ＰＡＰＥＰＩ−ＰＡＰＥＰ８を有する。

本発明の他の好ましい実施態様において、遺伝子工学により調製された免疫学的に活性なペプチドＰＡＮ−１，ＰＡＮ−２，ＰＡＮ３、ＰＡＮ　４．ＰＣＥ、ＰＡＮＳＥ　ＡＮＤ（ｓｉｃ）ＰＡＰＳＴの第２図に描写するアミノ酸配列を使用する。この場合において概して、この試験において１つのペプチドを使用することは十分である。しかしながら、特別の場合において、また、２またはそれ以上のこれらのペプチドを使用することができる。

本発明によるペプチドを合成または遺伝子工学により調製することができる。実施例３の中に詳細に説明されている短いペプチドは、好ましくは、合成により調製される。しかしながら、より長いペプチドは、好ましくは、遺伝子工学により調製される。

第１に、ウィルスのＤＮＡの解読領域は感染した患者の血清から、２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ、）　ｃｏｌｉ）の中でさらに成長させるためにプラスミドの中でクローニングした。それ以上のスクリーニング工程後、それらからの種々の領域をＥ、ｃｏｌｉの中の遺伝子工学により発現し、そしてそれから生ずる抗原をウィルスに対する抗体の検出のための使用について研究した。発現ベクターの中の本発明によるペプチドの直接の調製は、種々の困難のために、不可能であった。この理由で、本発明によれば、ウィルスのタンパク質のセグメントを安定な発現が可能であるタンパク質に融合する。この融合タンパク質は精製後ＩｇＧ検出のための抗原として使用できる。しかしながら、パルボウイルス特異的タンパク質を、好ましくは、適当な方法により切断し、さらに精製し、次いで血清学的試験に使用する。

本発明は、さらに、パルポウィルスＢ１９に対して向けられた抗体の決定のための試験キットに関する０本発明による免疫学的に活性なペプチドは、原理的には、パルポウイルスＢ１９に対する抗体を検出するすべての診断試験キットにおいて使用することができる。

本発明による試験キットの好ましい実施！！様において、適当なマイクロタイタープレートまたはポリスチレンのビーズの固相を本発明による免疫学的に活性なペプチドでコーティングする。適当な希釈で研究流体（血清試料）とインキュベーション後、そして普通の洗浄工程後、酵素および放射能で標識した抗ヒ）ＩｇＧを添加する。

次いで、基質の転化または結合した放射能の程度は、パルボウイルスＢ１９に対して向けられた抗体が血清試料の中に存在するかどうかを示す。

本発明による試験キ７）は、通常、医師の実験室、病院、研究施設などに供給される。それらは、通常、この試験の実施に要求されるすべての試薬を含有する。

しかしながら、普通の試験試薬、例えば、緩衝液は時には含めない。概して、試験キットは、本発明による１種または２種以上のペプチドまたは抗抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートまたはポリスチレンのビーズを含有する。

試験キットは、さらに、試験原理に依存して、本発明による１種または２種以上のペプチドを含有する。最後に、試験キットは、また、試験結果の定量を可能とするインディケータ−成分を包含する。

他の好ましい試験キットにおいて、抗原をマイクロタイタープレートまたはポリスチレンのビーズの固相に結合させる。試験血清のインキュベーション、および適当な洗浄および飽和の工程後、Ｂ１９抗原に対する抗体特定の酵素または放射能で標識した抗体を添加し、そしてその基質の転化または結合した放射能を測定する。

これは阻害試験の形態を取るので、小さい基質の転化または低い放射能は特定の抗体の存在を示す。

同様に、Ｂ１９に対するＩｇＭ抗体の検出に、固相にカンプリングした本発明によるペプチドを使用することができる。この検出法においてまずプロティンＡでコーティングしたビーズを研究流体に添加することによって、ＩｇＧ抗体を排除する。次いで、酵素または放射能で標識した抗ヒｌ−１ｇＭ抗体を使用して、結合した抗体を検出する。

いわゆるμ捕捉アンセイの原理を他の好ましい試験キットにおいて使用する。まず、固相に結合した抗ヒ）ＩｇＭ抗体により、研究流体（血清）からのＩｇＭを結合する。次いで、本発明による免疫学的に活性なペプチドを添加する。抗原の結合の程度、こうして存在する抗Ｂ１９ＩｇＭの量は、放射性標識または他の物質で標識され、こうして検出可能である抗原によるか、あるいはＢ１９抗原に対する第２標識抗体を使用し、そしてその結合を測定することによって、決定することができる。

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）は、本発明の範囲内でとくに好ましい。

また、本発明によれば、研究試料（血清、バイオプシーなど）の中のウィルスの直接検出のために使用できるＤＮＡ配列が提供される。ｖｐｔの中のＤ　Ｎ　Ａ　Ｎ域にそれら自体特異的に結合する２つのＤＮＡプライマーを使用することは好ましい０次いで、商業的に入手可能なポリメラーゼ連鎖反応のキットにより、それらの間に存在する領域の増幅を達成することができる０次いで適当な方法で固定化された増幅したＤＮＡを、適当なりＮＡ配列により検出する。／”ｔイブリダイゼーションに使用したこのＤＮＡを、２つのプライマーの間に存在するＤＮＡ領域を含有するプラスミドにより調製する。

プライマーの配列はハイブリダイゼーションに使用するＤＮＡの中に存在しないことは自明である。使用するプライマーの配列および互いに対する配置を第１図に描写する。

最後に、パルポウイルスＢ１９に対するワクチンは、また、本発明の範囲内で入手可能となる。これにより、本発明による免疫学的に活性なペプチドは、適当なアジュバントと一緒に、必要に応して数回、保護すべき人に投与される。これにより誘発される抗体の産生は、パルボウイルスＢ１９による感染に対して保護することができる。

実施例１：患者の血清からのパルボウイルスＢ１９のＶＰＩおよびＶＦ６をエンコードする配列の調製急性感染（伝染性紅斑）の患者からの１−１の血清から、１％のＳＤＳの中のプロテイナーゼにの消化、フェノール抽出、および引き続くアルコール沈澱により、ウィルスのＤＮＡを分離した（この工程およびＤＮＡの調製、プロセシングおよび発現、ならびに組み換えタンパク質を調製のすべての次の工程、およびそれらの精製の基本的工程は、門ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋Ｅ、Ｆ、、　Ｓａ＋ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、（１９８２）。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、に詳細に記載されている）。このＤＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液の中に取り、次いで１μｌの試料をポリメラーゼ連鎖反応および合成オリゴデオキシヌクレオチドにより増幅した。２対のプライマーを表面タンパク質の解読領域の増幅のために使用した。ＶＰ１タンパク質を得るためのこれらの１つおよびプライマーとして使用した完全なＶＰｐオリゴデオキシヌクレオチドのための第２対は、それらの５′末端の各々においで、バルボウイルスの配列と相同性でない配列を有し、これらの配列は制限酵素切断部位をコードし、したがってＰＣＲから生ずるＤＮＡ断片を適当なベクターの中にクローニングするために適当である。

第５図においてＯ−１〜０−５で表示するプライマーを使用した。

各場合において、各々が１μｍの分離したノイルポウイルスのＤＮＡを含有する５つの混合物を１００μｌの体積の２対のプライマーで増幅した。このための条件は次の通りであった＝９４°Ｃにおａする１、５分の変性、４５°Ｃにおけるプライマーの２分の結合、７２°Ｃにおける４分の合成；合計５０サイクル；緩衝液、基質およびＴａｑポリメラーゼを製造業者（Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ、ニー／Ｎ　ＩＪンゲン、ドイツ国）が述べているように、このために使用した。

２つの異なる混合物（ＶＰＩおよびＶＦ６につ０て）力）らの増幅したＤＮＡ断片を、各場合において、−緒にし、アルコールより沈澱させ、７０％のアルコールで洗浄し、乾燥し、２００μｌの体積のＴＥＩＩ衝液中に溶解し、そして制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで消化した．次いで１．２％のアカ゛ロースゲルの中の電気泳動による断片を分画し、次いで対応するＤＮＡ／＜ンド（ＶＰｌについて７０９ｂｐ１ｖＰ２について１７０４ｂｐ）を分離し、ソしてベクターＰ　Ｕ　Ｃ　１　２　（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ，スウェーデン国）のＥｃ　ｏＲ　１およびＨｉｎｄＨ１部位の中に挿入した．プラスミドをＥ．ｃｏｌｔＪＭ１０９の中に形質転換した後、ノでルポウイルスのＤＮＡのインサートをもつバクテリアのクローンを制限消化により特性決定した。

対応するゾーンに、ＶＰ１部分をエンコードする領域につし）でｐＵｃ１２ＰＡＮの名称およびＶＦ６をエンコードする領域にｐＵｃ１２ＶＰ２の名称を与えた。

実施例２Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのＶＰＩおよびＶＰ２部分の遺伝子工学による調製ＶＰＩをエンコードする領域をプラスミドｐＵｃ１２ＰＡＮ力１らＢｒ１■およびＨｉｎｄｌｌｌで分離しく参照、第１図、ＨｉｎｄｌＩＩはｐＵｃベクターから由来する）そしてベクター（例えば、ｐＢＤ２）の切頭したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の３′末端の背後においてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ制限切断部位の中に挿入した。

それから生ずるプラスミドをもつＥ、ｃｏｌｉ細胞は、Ｉ　ＰＴＧにより誘発後、β−ｇａｌ：：ＶＰＩ融合タンパク質（抗体６７ｋＤａ）を大量に発現し、これはイムノプロット（ウェスタンプロット）において抗パルボウイルスＢ１９陽性血清と非常に強く反応するつこのタンパク質の精製は、タンパク質の不溶性を利用する慣用方法により、非常に容易に達成することができる。細胞の溶解後、沈澱の分画を洗浄剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００およびオクチルグルコ −ピラノシドで洗浄し、引き続いて融合タンパク質を８モルの尿素／１％のメルカプトエタノールで溶解し、そして細胞の不純物からＤＥＡＥクロマトグラフィーによりＮａＣ１の勾配を使用して分離した。

ＶＰＩタンパク質の配列がメチオニンで開始するので、ＶＰ１部分はＢｒＣＮ切断により融合タンパク質から切断することができ、そしてこのアミノ酸は断片それ自体の中にもはや現れない；対照的に、メチオニンはバクテリアの融合タンパク質の中に比較的頻繁に存在するので、この部分は非常に小さい断片に破壊される。３５％のギ酸およびＢｒＣＮの中で室温において４時間切断した後、試料を凍結乾燥し、８モルの尿素、２ミリモルのＤＴＥ　（ｓ　ｉ　ｃ）　（ジチオスレイトール）中に溶解し、そしてＮａＣ１勾配のクロマトグラフィーによるＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製した。それから生ずるＶＰＩ断片をＰＡＮ− １と呼び、そして血清学的決定のために直接使用することができる。アミノ酸配列を第２−１図に示す。

発生したそれ以上の構成体はシストツマ・ジャポニクム（Ｓｃｈｉｓｔｏ−ｓｏｔｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からのグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ（Ｓｎ＋ｉ　ｔｈ、　Ｄ、Ｂ、およびＪｏｈｎｓｏｎ、に、Ｓ、　：大腸菌の中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体として発現されたポリペプチドの単一工程の精製、Ｇｅｎｅ、　６７　（１９８８）　３ｌ−４０）およびＶＰ１部分から成る融合タンパク質をコードするプラスミドであった。しかしながら、また、他の融合相手が診断試験を妨害しないかぎり、その融合相手を使用することができる。

２）ＰＣＥ：Ｂ１９のＤＮＡ断片をＢ　ｃ　Ｉ　Ｉ／Ｐ　ｖ　ｕｌｌ消化（６１８ｂｐ）後ｐＵｃ１２ＰＡＮから分離し、そしてｐＧＥＸ１の中のＢａｍＨＩおよびＳｍａ　ｉ部位の中に挿入した（ｐＧＥＸＩ　ＰＡＮ）。生ずる５２ｋＤａの融合タンパク質を上澄み液からグルタチオンがカンブリングしたアガロースにより精製し、そして実施例４における血清学的試験のための抗原として使用した（名称：ＰＣＥ）。この抗原のアミノ酸配列は第２−２図に示す。

３）ＰＡＮ−２：４５８ｂｐの断片をｐＵｃ１２ＰＡＮからＢｃｌｌ／Ｈｉｎｃｌｌで分離しそして、他のベクターの中で中間のクローニング後、ｐＧＥＸ　２の中に挿入した（ｐＧＥＸ２　ＰＡＮ）。同一リーディングフレームの中の断片の挿入は、また、オリゴデオキシヌクレオチドを使用することによって達成することができる。グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼまたはＶＰＩセグメントの融合部位に、トロンビンにより認識されるアミノ酸配列が存在するので、８１９部分をこの酵素により融合相手から切断することができる。また、他の融合相手がプロテアーゼ認識配列を有するかぎり、その融合相手を使用することができる。抗原のアミノ酸配列、ならびに融合した外来アミノ酸（肉太の印刷）を第２−３図に示す。

４）　ＰＡＩＩ−３：４５８ｂｐの断片をｐＵｃ１２ＰＡＮからＢｃｌｌ／ＨｉｎｃＴＩで分離しそして、他のベクターの中で中間のクローニング後、ｐＧＥＸ　３の中に挿入した（ｐＧＥＸ３ＰＡＮ）。同一リーディングフレームの中の断片の挿入は、また、合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用することによって達成することができる。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはＶＰＩセグメントの融合部位に、プロテアーゼ因子Ｘａにより認識されるアミノ酸配列が存在するので、８１９部分をこの酵素により融合相手から切断することができる。また、他の融合相手がプロテアーゼ認識配列を有するかぎり、その融合相手を使用することができる。抗原のアミノ酸配列、ならびに融合した外来アミノ酸（肉太の印刷）を第２−４図に示す。

５）ＰＡＮ−４：完全なり　１９　ＤＮＡインサートをｐＵＣ１２ＰＡＮからＢｃｌＩおよびＰｓｔｌの消化により分離しそして、種々の中間のクローニング後、ベクターｐＧＥＸ２の中に挿入した。これはプラスミドｐＧＥＸ２．ＰＡＮを生した。同一リーディングフレームの中の断片の挿入は、また、合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用することによって達成することができる。グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼまたは■Ｐ１セグメントの融合部位に、プロテアーゼのトロンビンのためのアミノ酸配列が存在するので、８１９部分をこの酵素により融合相手から切断することができる。また、他の融合相手がプロテアーゼ認識配列を有するかぎり、その融合相手を使用することができる。抗原のアミノ酸配列、ならびに融合した外来アミノ酸（肉太の印刷）を第２−５図に示す。

抗原の精製は、グルタチオンがカップリングしたゲルのマトリックスを使用する簡単な親和クロマトグラフィーにより達成することができる。

ｐＧＥＸ２および３に基づく融合タンパク質のそれ以上の精製のために、８１９部分をトロンビン（ｓｉｃ）または因子Ｘで製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が述べているように消化することによって切断した。次いで断片を再び親和クロマトグラフィーにより精製した。Ｓ−グルタチオン（ｓｉｃ）トランスフェラーゼを、この場合において、選択的に取り出し、バルボウィルスのタンパク譬部分は流れの中に見いだされ、そして最後のＤＥＡＥクロマトグラフィーの分画後、血清学的試験において使用することができる。

しかしながら、これに対する別法として、プロテアーゼを、また、融合タンパク質を結合して有するグルタチオンがカップリングしたゲル懸′ＦｉＪ液に直接添加することができる。約１時間インキユベーシゴンした後、切断されたＶＰＩ　（ｓ　ｉｃ）断片をゲルから洗浄除去することができるが、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ部分はゲルのマトリックスに結合したままである。

ＰＣＲプライマーおよびベクターの選択のために、ＶＦ６の解読領域はプラスミドｐＵｃ１２ＶＰ２中の正しいリーディングフレームの中に既に存在し、そしてＩ　ＰＴＧとインキュベーション後、ｐＧＥＸ２ＰＡＨについて記載したのと同様な方法で、バクテリアのリゼイトの不溶性部分から精製することができる。組み換え抗原のアミノ酸配列を第２−６図に示す。

２）ＰＡＮＳＥ：ＶＦ６をエンコードする配列の切頭はタンパク質の収量の増加にかなり関連すること、この切頭された抗原は安定に発現されることができ、精製の開においてさえ分解せず、そしてなお抗Ｂ１９陽性血清とまた同一の反応性を有することが、驚くべきことには、発見された。この発現プラスミド（Ｐ　ＵＣ１９ＰＡＮＳＥ）４よ、Ｎ５４１部位の遠くまで３５５ｂだけＶＰ２の５′領域を切頭することによって得られた。この断片を、ＢＩ３配列と同一のリーディングフレームをＬａｃＺペプチドの中に有するｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋　スウェーデン国）の中に挿入した。ＰＣＲプライマーのために、Ｈｉｎｄｌ１１部位は３ ′末端に位置するので、また、中間のクローニングによりＥｃｏＲ１部位を生成して、要求される断片をｐＵｃ１９のＰｓｔｌおよびＥｃ　ｏＲ１部位の中に挿入できるようにすることが必要であった。

約３８ｋＤａの大きさの抗原（ＰＡＮＳＥ）を、４モルの尿素の中に溶解した後、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによりバクテリアのリゼイトの沈澱分画から非常に簡単に不純物がら分離することができる。抗原のアミノ酸配列を第２−７図に示す。

３）ＰＡＰＳＴ：ＶＰ−２のＮ末端領域をエンコードする７１６ｂｐの大きさの断片を、Ｐｓｔｌ消化によりプラスミドｐＵｃ１２ＶＰ２がら分離した。

この断片をベクターｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン国）の中にベクターのＬａｃＺと同一のリーディングフレームの向きに挿入（制限酵素の消化により特性決定した）した後、約３３ｋＤａの大きさの８１９抗原は非常に大きい量で産生される（合計のＥ、ｃｏｌｉタンパク譬の約１０％）。ＰＢＤＡＮと同様な方法で不溶性構成成分から８モルの尿素の中に溶解し、引き続いてＤＥＡＥクロマトグラフィーにより、精製を実施することができる。アミノ酸配列を第２−８図に描写するｃ）６　なＶＰＩ　ＶＰ２ニプラスミドｐＧＥＸ２ＰＡＮをＰｓｔｌおよびＨ４ｎｄｌＩＩで開き、そしてＨｉｎｄｌｌ＋および部分的Ｐｓｔｌの消化後、ｐＵｃ１２ＶＰ２からのＶＰ２をエンコードするう■域を１．７ｋｂの断片として挿入した（ＰＵＣ１２ＶＰｌ／２）。

ＶＰＩ／２を含有する抗原のＥ、ｃｏｌｉにおける発現：１）ＰＡＶ−１：ｐＵｃ１２ＶＰ１／２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＴで切断し、大きさ１４６６ｂｐのＤＮＡバンドを分離し、引き続いてベクターｐＵｃ１８ｓｔｏｐのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１部位の中に挿入した。

ＰＵＣ１８ｓＬｏｐは前述のｐｕｃヘクターに類似する；しかしながら、それは後者とＰｓＬ１部位とＨｉｎｄｌ１１部位との間に、翻訳停止シグナルおよび翻訳の停止をコードする合成オリゴデオキシヌクレオチドを含有することによって異なる。こうして、このベクターのポリリンカー領域は次の配列を有する：ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＡＴｌｒ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣＧＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴＣＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＧＴ　ＭＴ　ＴＭ　Ｔ’ｒＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＣＧＣＣＴＡＡ　ＴＧＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ（制限切断部位ＥｃｏＲＩ　 −ＧＡＡＴＴＣ，ＢａｍＨＩ　−ＧＧＡＴＣＣ，Ｐｓ　ｔＩ　ＣＴＧＣＡＧ、Ｂ　ｇ　ＩＩＩ（ｓｉｃ）　−ＡＧＡＴＣＴおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　ＡＡＣＧＴＴ（ｓｉｃ）を肉太の印刷で示す）このようにして得られたベクター（ｐ　ＵＣ−Ｖ　１−Ｂ）は、構造タンパク質を開始からアミノ酸４８６までおよび引き続＜ｐＵｃポリリンカーのいくつかのアミノ酸においてエンコードし、そして挿入されたオリゴデオキシヌクレオチドの停止コドンで終わる。発現された抗原（ＰＡＶ−１−Ｂ）は、ＩＰＴＧの誘発後、非常にすくれた収量で産生され、そして６０ｋＤａの大きさを存する。そのアミノ酸配列を第２−９図に描写し、肉太の印刷により強調されたアミノ酸はＢ１９特異性ではなく、そしてｐＵＣ配列によりエンコー１される。抗Ｂ１９陽性（ｓｉｃ）血清との反応性は非常にすぐれそして、可溶性Ｅ、ｃｏｌｉタンパク質を除去し、８モルの尿素中に溶解し、そして普通のイオン交換クロマトグラフィ＝（前述したように）により、効率よい精製を達成することができる。

２）ＰＡＶ−１−Ｎ：前述のベクターｐＵＣＶＰ’−１−ＢをＥｃｏＲＩおよびＮｓｉ＋で消化した。

このようにして産生された大きさ１１３７ｂｐのハンドを、ベクターＰＡＰＥＰＩ−ＰＡＰＥＰ８ｓｔｏｐの中のＥｃ　ｏＲ■およびＰｓｔ１部位の中に挿入した（上を参照）。生ずるベクターは構造タンパク質を開始からアミノ酸３７７までにおいてエンコードする；抗原（ＰＡＶ−１−Ｎ）は、Ｉ　ＰＴＧの誘発後Ｅ、ｃｏｌｉ細胞において、前述の抗原ＰＡＶ−１−Ｂより多少低いレベルで産生される。それは４５ｋＤａの大きさであり、そして抗Ｂ１９血清との反応性はすぐれる。このアミノ酸配列を第２−１０図に示し、肉太の印刷のアミノ酸はｐＵＣベクターによりエンコードされ、そしてＢ１９特異性ではない、この抗原の精製はＰＡＶ−１−Ｂについてのように達成することができる。

３）ｃ）１）およびｃ）２）に記載した抗原のＧＳＴ融合タンパク質としての発現２つのベクターＰＡＶ−１−ＢおよびＰＡＶ−１−ＮをＥｃｏＲ１／Ｂｇｌｌｌで消化し、そして生ずる、それぞれ、１４８０ｂｐｏｔ１１５０ｂｐの大きさのハンドを分離し、翻訳停止シグナルは導入され、同時にｐＵｃ１８ｓｔｏｐはまた転移される。（Ｂｇ１１１部位は上に示したｐＵｃ１８ｓｔｏｐポリリンカーの中に示され、そして翻訳開始のすぐ前のＢｃ１１部位（ＴＧＡＴＣ，ｌ）はＤＮＡの増幅のために使用したプライマーで導入されたー参照、第１図、０−１）。次いで、同一の５′配列であるがＶＰ−１の異なる長さの領域をエンコードする２つの断片を、前述のベクターｐＧＥＸ−１の中に挿入した。ｐＧＥＸ−１はある断片の３′末端の挿入のために利用可能なＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩの制限切断のみを有するので、最初に、また、ＳｍａＩ（平滑末端）と適合性の部位を生成することが必要であった。これは、２つのＤＮＡ断片をベクターＰＩＣ２０ＨのＥｃｏＲＩおよびＢａｒｒｒＨＩ（Ｂｇ冊■と適合性）認識部位の中に挿入することによって実施した（挿入不活性化による組み換えの選択のために融通性のあるクローニング部位をもつｐ■ｃプラスミドおよびファージのベクター、Ｊ、Ｌ、Ｍａｒｓｈ、　Ｍ、ＥｒｆｌｅおよびＥ、Ｊ、Ｗｙｋｅｓ。

Ｇｅｎｅ、　３２（１９８４）　４８１−４８５）。次いで２つの断片を引き続いて２つの生ずるベクターからＢｃｌｌおよびＨｉｎｃＩＩ（平滑末端の切断）で分離し、そしてｐＧＥＸ−１の中のＢａｍＨＩおよびＳｍａｌの中に挿入した。Ｈ４ｎｃ［は、また、ＢＩ３配列の中で切断するので、２つの断片を部分的Ｈｉｎｃｌｒ消化により分離した。

２つのｐＧＥＸベクターは、ここで、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼおよび引き続く２つの異なる長さのＶＰ−１セグメントから成る融合タンパク質を発現する。ｐＵＣＶＰ−Ｂから由来しそしてここでｐＧＥＸＶＰ−Ｂの中に位置する断片は約８７ｋＤａの融合タンパク質を生ずる；このより小さい断片は大きさ７２ｋＤａの融合タンパク質をアミノ酸３７７までのみにおいてエンコードする。

アミノ酸配列を第２−９図および第２−１０図に示す、唯一の差は、５つのＮ末端のアミノ酸が省略されており、そしてその代わりグルタチオンＳ−トランスフェラーゼで置換されていることである。

４）完全なＶＰＩおよびＶＰ２をエンコードする領域をもつｐＵＣ１２ＶＰ１／２から、ＥｃｏＲＩおよびＨ４ｎｄｌＩＩの消化後、２．４ｋｂの断片を分離し、そして真核生物の発現ベクターｐＭｏｒｒｒ（Ｍｎｔｚ、Ｍ、、　Ｄｅｂｙ　Ｇ、、　Ｊｉｌｇ、Ｗ、　Ｗｏｌｆ、Ｈ，：ニブスティンバー（ｓ　ｉ　ｃ）ウィルスの主要な膜タンパク質のチャイニーズハムスター卵巣細胞の中の発現、Ｇｅｎｅ、　４４（１９８６）　３５３−３５９　（Ａ　Ｔ　ＣＣから入手可能））の中にＥ　ｃ　ｏ　Ｒ，ＩおよびＨｉｎｄｌＩＩの消化後に挿入した。このプラスミドを引き続いて５ａｌｌで再び直線化し、そしてジヒドロフオレートリダクタ−遺伝子（ＤＨＰＲ）および調節配列をもつ２．４ｋｂの５ａｌｌ断片を、また、挿入した。このようにして得られたプラスミ）”ｐＭＤ　Ｉ　ＩＶＰ　１／２をＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞の中にトランスフェクションした。アルファーマイナス培地（ｇｉｂｃｏ（ｓｉｃ））上の選択後生ずるコロニーを分離し、そして増加する濃度のメタトレキセート（ＭＴＸ）で洗浄後、増幅した。ＶＰＩ／ＶＰ２をもつ粒子はこれらの細胞培養物からの培養上澄み液から精製することができる。

さらに、ｐＵｃ１２ＶＰｌ／２からの２．４ｋｂの断片を、ＥｃｏＲ１／Ｈｉ　ｎ　ｄｌ１１消化後、Ｈ４ｎｄｌ１１部位の外に、また、ＢａｍＨ１部位を有するベクターの中に挿入した。次いで、この中間構成体からのパルボウイルスの部分をＢｃｌｌおよびＢａｍＨＩ断片として分離し、そしてバキュロウィルスの発現ベクターのＢａｍＨ１部位の中に挿入した（種々の構成体を使用することができる）。

（ＢｃｌＴ部位はＶＰＩの翻訳開始のすぐ前に位置し、それはＰＣＲプライマーによりエンコードされる、参照、第１図；ＢａｍＨＩの消化は、また、この型の部位がバルボウイルスの配列の中に存在するので、部分的に実施しなくてはならない）、生ずるプラスミドを野生型バキュロウィルスのＤＮＡとともに昆虫の細胞培養系の中に同時トランスフェクションした後、いわゆる封入体をもたない細胞が分離された。細胞内で産生されたＶＰＩはそれらの細胞から大量に精製することができ、細胞内でバキュロウィルスの多面体の遺伝子はＶＰＩ／２遺伝子により置換されている。

５）ＶＰ−２の発現：さらに、より小さいＢ　１９−ＶＰ−２を組み換えバキュロウィルスを使用して発現させた。このために、ＶＰ−２をエンコードするｐＵｃ１２ＶＰ　（参照、実施例１）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで消化し、そして生ずる１、７ｋｂの断片を、Ｈｉｎｄｌ［Ｔの外に、また、ＢａｍＨ１部位をもつ前述のベクターの中に挿入した。次いで、バキュロウィルスの部分をこの中間構成体からＢ　ｃ　Ｉ　Ｉ　（ｓｉｃ）およびＢａｍＨＴ断片として分離し、そしてバキュロウィルスの発現ベクターのＢａｍＨ１部位の中に挿入した（種々の構成体を使用することができる）、（ＢｃｌＩ（ｓｉｃ）部位はＶＰ２の翻訳開始のすぐ前に位置し、それはＰＣＲプライマーによりエンコードされる、参照、第１図、０−３；ＢａｍＨｆの消化は、また、この型の部位がパルボウイルスの配列の中に存在するので、部分的に実施しなくてはならない）。生ずるプラスミドを野生型バキュロウィルスのＤＮＡとともに昆虫の細胞培養系の中に同時トランスフェクションした後、いわゆる封入体をもたない細胞が分離された。ＶＰ２はそれらの細胞から大量に粒子として精製することができ、細胞内でバキュロウィルスの多面体の遺伝子はＶＰ２遺伝子により置換されている。これらの粒子はμ−浦捉試験における使用にとくに適する。

実施例３免疫優性エピトープをもつ合成ペプチドウェスタンプロットにおけるバクテリアの発現産生物（ことにｐｃＥｘ　：　：　ＶＰ　１融合構成体）とバルボウイルス陽性血清との反応のパターンは、ＶＰ１部分からの短い断片がすべての■ｇＧ陽性バルボ血清の同定に十分であるという、驚くべき結論に導く。

断片は、合成により産生ずることができる次のペプチドでカバーすることができる：Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＴｒｐＴｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＡｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＴｙｒＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　１１ｅ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｆ！ｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ｌｅｕ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＶａｌＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＡｓｎ工１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＡｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＳｉｒＡｇｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ＬａｕＬｙｓ　Ｂｉ、ｓ工１ｅ　Ｌｙｓこれらの抗原は、問題なく、合成により大量に調製し、精製し、次いでＥＬＩＳＡにおいて１００〜２００ｎｇ／混合物の濃度で使用することができる。

ペプチドのちょうど１つですくれた結果を達成することができるときでさえ、２または３つのペプチドの同時使用は好ましい。

ある場合において、ＩｇＧまたはＩｇＭの抗体の検出のために、異なるペプチドまたはそれらの組み合わせを使用することができる。

実施例４ａ）バルボウイルスＢ１９に対する血清抗体の決定実施例２において精製しそして記載する抗原を使用して、比較的大量の血清をこれらの抗原との反応性について試験した。このために、種々の組み換えタンバタ質を炭酸塩緩衝液ｐＨ９，５の中の０．５〜１μｇ／Ｉｌｌの濃度で、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡプレートのウェルにそれへの結合のために１６時間の間添加した。結合しない物質を洗浄除去した後、これらのプレートを乾燥状態で４°Ｃにおいて貯蔵することができる。

血清とのインキュベーションを１　：　１００の希釈で２時間実施し、引き続いて洗浄し、そしてペルオキシダーゼをカップリングした抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した抗体を普通の試験手順により検出した。

種々の血清パネルを抗Ｂ１９１ｇＧについて試験した：１、急性Ｂ１９感染の患者からの血清を、連続的に、病気後伝染性紅斑の出現から１９週まで研究した。

結果：すべての血清は臨床的発症の開始からでさえ抗ＢＩ９陽性として認識されそして、ｐＧＥＸＩＰＡＮからの融合タンパク質（ＰＣＥ、して、観測期間にわたって陽性に止まった。

２．血清試料を入院のときおよび４遇後採取した妊婦（ｎ＝２１）からの血清の対を、抗Ｂ１９ＩｇＧについて試験した。同一の血清を各抗原について使用した。

２１人の妊婦のうちで、入院のとき、１５人は抗Ｂ１９陰性であり、そして６人は抗Ｂ１９陽性であった。４週後の第２の血清試料についての血清学的結果は同一の結果を生した。

ＰＡＮ−２：２１人の妊婦のうちで、入院のとき、１４人は抗Ｂ１９陰性であり、そして７人は抗Ｂ１９陽性であった。４週後のこれらの妊婦から採取した血清試料を再試験すると、［ｇＧは前に抗Ｂ１９１ｇＧ陽性であった妊婦においてもはや検出されなかった。

ＰＡＮ−４：２１人の妊婦のうちで、入院のとき、１５人は抗Ｂ１９陰性であり、そして６人は抗Ｂ１９陽性であった。４週後の第２の血清試料についての血清学的結果は同一の結果を生じた。

ｂ）明確にＩｇＧ／Ｍ陽性／陰性の血清の収集物（ｎ＝１３）の試験使用した血清は臨床的に定められた場合から入手し、そして１ｇ０７Ｍ試験において前以てチェフクした。ＩｇＧ／Ｍ試験は抗原として精製したウィルスを使用する。血清１〜６：抗Ｂ１９陰性、７〜９　：　ｒ　ｇＭ／　Ｉ　ｇ　Ｇ陽性、１０〜１３：１ｇＭ陰性、ＩｇＧ陽性。

ＰＡＮ−４は前述の手順により試験した。ＩｇＭ抗体はＩｇＧの決定と同一の試験原理により決定するが、ＰＡＮＳＥおよびＰＡＶ−１−Ｂを抗原としてプレートに１０倍高い濃度で１：１混合吻で結合し、プロティンＡをカップリングしたビーズで前以て吸着することによって血清ＩｇＧ抗体を排除した。

吸収についての次の値が得られた：ＰＡＮ−４　（約２０ｎｇ／試験ウェル）を使用するＩｇＧの決定、ＰＡＮＳＥおよびＰＡＶ−１−Ｂの１＝１混合物（約１５０ｎｇ／試験ウェルの合計のタンパク１ｔ）を使用するＩｇＭの決定血清　ＩｇＧ　ＩｇＭ１　０、０９　０．０７２　０、０５　０．０６３　０、１０　０．０８４　０、０７　０．０６５　０、０７　０．０８６　０、０４　０．０７７　１、８２　１．５３８　０、９０　０．４６９　０、７２　０．５６１０　１、１０　０．０８１１　０．６２　０．１４１２　０．９８　０．１１１３　０．８７　０．０９結果は、ＩｇＧ試験およびＩｇＭ試験の両者について、陽性／陰性の血清の明瞭を弁別を示す。

使用した１ｇＭ陽性の血清は臨床的に定められた場合から入手し、そしてＩ　ｇ　Ｇ／Ｍ試験において前以てチェフクした。ＩｇＧ／Ｍ試験は抗原として精製したウィルスを使用する。ＶＰＩおよびＶＰ２領域からの組み換え抗原との試験混合物は、また、すべての１ｇＭ陽性の血清を認識した。ｒＰＡＰＳＴ、ＶＰ２、しかしことにＰＡＮＳＥＪ　ＶＰ２部分は、この場合において、ＩｇＧ試験より良好に反応した。したがって、両者の領域はＩｇＭの商用試験キットの中に提供される。

感度のそれ以上の改良は、モノクローナル抗体により血清ｒｇＭ抗体を固相プレートに選択的に結合し、組み換え抗原（バキュロウィルスを発現した粒状ＶＰ− ２）を添加し、そして結合を決定することによづて達成することができる（μ− 捕捕捉アノビイ。

これらの実験は、本発明による免疫学的に活性なポリペプチドを使用して実施された高い信頼性の試験を実証する。

ｒＰＡＮｓＥ、ＰＡＰＳＴおよびＶＰ−２Ｊと呼ぶ抗原の中に含有されるＶＰ２ｉ域は、長期間の感染をもつ患者からの抗体の決定の感度をそれ以上増加しない。他方において、これらの抗原とのすぐれた反応は近い過去においてのみ感染内の血清の場合において見いだされる。したがって、この抗原は感染のタイミングについての情報を提供するために適当である。

試験キットにおいて、これらの抗原の１つまたは混合物を、遺伝子工学により産生されたＶＰＩと、あるいは合成ペプチドと混合すること、あるいはまた、これら２つの領域との反応性の弁別が感染のタイミングについての追加の情報を提供する場合、別々の混合物でこれらを使用することができる。

感度のそれ以上の改良は、モノクローナル抗体により血清ＴｇＭ抗体を固相に選択的に結合し、組み換え抗原を添加し、そして結合を決定することによって達成することができる（μ−捕捉ア７セイ）。

実施例５病原体の直接検出のための８１９特異的ＤＮＡプライマーの使用存在するＢ　１９　ＤＮＡは、研究試料（血清、バイオプシー）から、１％のＳＤＳ　（２時間、３７°Ｃ）の存在下のプロテイナーゼに消化、フェノール抽出および７０％のエタノールの中に沈澱により得た。

これ、および引き続＜ＤＮＡ増幅を、実施例１に記載する手順と同様に、実施した。プライマー０−５および０−２（配列およびＢ１９ゲノム上の位置について、第１図参照）を使用した；Ｂ１９陽性の場合において、増幅した断片は３１９ｂｐの大きさを有する。

ＤＮＡ断片の８１９特異性の実証を、次のようにして実施した。

ＰＣＲ混合物を１．５％のアガロースゲルにより分画し、ＤＮＡをニトロセルロース膜に移しくサザンブロノト）およびＤＮＡ片とハイブリダイゼーションさせ、ここでＤＮＡ片をそれらの間に配置し、そして慣用方法（プライマーの伸長）により３２Ｐ　（ｓ　ｉｃ）またはジゴキシゲニン（ｓｉｃ）で放射線標識されている。ハイブリダイゼーションに使用したＤＮＡ断片は次の方法で得た：２６０ｂｐの長さのＤＮＡ断片をＨｉｎｃｌｌおよびＰｓｔＩで消化後プラスミドｐＵｃ１２ＰＡＮから分離し、そしてｐＵｃ１２の中のＨｊｎｃｌｌおよびＰｓｔ１部位の中に挿入した。ここで、増幅に使用した配列をもたないＢＩ３断片をＥｃｏＲ■／Ｐｓｔｌ消化により生ずるプラスミド（ｐＵｃ１２ＰｃＲＤＩＡ）から得ることができ、そして標識後ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

図面の説明第１図：増幅のために使用したプライマー配列をもつバルボウイルスＢ１９のＶＰＩ／２をエンコードする領域の線図的表示。

末端（二本Ｍ）に逆の領域および解読領域をもつ一本鎖Ｂ１９のゲノムの構造は上の部分に線図で描写されている。ポリペプチドとして合成され、そしてプロセシングされる、非構造タンパク質（ＮＳ）のための解読領域は左の領域に存在する。右の領域はウイルスのカプシド（ＶＰＩ／２）の表面タンパク質をコードし、ＶＰｌは、追加のＮ末端領域（陰影を施したバー）を別として、ＶＰ２（！４いバー）と同一である。この下に、オリゴデオキシヌクレオチド０−１〜Ｏ−４の領域が示されており、これらの領域はそれらの間に位置するＢ１９の増幅（ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用した（ＶＰ１領域について○−１および０ −２、そしてＶＰ−２について０−３および０−４）。

対応するＢ１９ならびにオリゴデオキソヌクレオチドのＤＮＡ配列をこの図面の下部に示す。オリゴデオキシヌクレオチドの配列は肉太の印刷により表示し、非相同性領域、すなわち、Ｂ１９とハイブリダイゼーションしない配列は線の間隔で対照させである。これらのハイブリダイゼーションしない配列は、０−１の場合においてＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　（ＧＡＡＴ丁Ｃ）およびＢ　ｃ　Ｉ　Ｉ　（ＴＧＡＴＣＡ）、０−３の場合においてＥｃｏＲＩ　Ｂｃ　］　ＩおよびＢ　ｓ　ｐ　Ｈｌｌ　（ＴＣ−ＡＴＧＡ）　、およびＯ−４の場合においてＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　（ＡＡＧＣＴ−Ｔ）のための制限酵素部位を表す、増幅されたＶＰ２をエンコードする断片（○−３および０−４）を、ｐＵＣベクターの中への挿入の前に、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化Ｌ７、ＶＰＩをエンコードする断片をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで消化し、ＰｓｔＩ切断部位はＢ　１９　ＤＮＡの中に位置する（ｏ−２について示した配列においてＮ０９４の位置から、ＣＴＧＣＡＧ）。

第２図：実施例２に記載し、そしてＥ、ｃｏｌｉ細胞の中の組み換えにより産生された抗原のアミノ酸配列。

クローニング工程のために、各場合において、多少の非Ｂ１９抗原性外来アミノ酸は、また、Ｎ末端においてＣ末端に含存され（ＰＡＮＳＥ　ＡＮＤ（ｓｉｃ）ＶＰ−２を別として）そして肉太の印刷により強調されている。

実施例２に記載する抗原のアミノ酸を下に記載する：第２−１図：　ＰＡＮ−１第２−２図：　ＰＣＥ第２−３図：　ＰＡＩＩ−２第２−４図：　ＰＡＮ−３第２−５図：　ＰＡＮ−４第２−６図：　ＶＰ２第２−７図：　ＰＡＮＳＥ第２−８図：　ＰＡＰＳＴ第２−９図：　ＰＡＶ−ＩＢ第２−１０図：　ＰＡＶ−ＩＮ第３図：互いに関するいくつかのペプチドの配置の線図的表示。

要約書ヒトのバルポウイルスＢ１９に対する抗体を決定するために、低いコストで、鋭敏にかつ特異的に試験の実施を可能とする、ノマルボウイルスＢ１９のカプシドのタンパク１ＶＰ１およびＶＰ２の部分的アミノ酸配列をもつ免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを調製することができる。抗原として使用され、抗Ｂ１９のＩｇＧ陽性血清を同定する働きをする短いペプチド配列が同定される。

さらに、遺伝子工学の手段を使用するこれらのペプチドの産生を開示する。遺伝子工学により産生されそしてＥ、ｃｏｌｉＯ中で高い収率で安定に産生ずることができ、引き続いてそれから精製することができる他の抗原は、ＩｇＧの検出のための追加の抗原として使用される。最後に、１組の抗原はウィルスに対するＩｇＭ抗体を決定する試験の実施を可能とする。

さらに、表面タンパク質の、遺伝子工学により産生された、成分は、予防的免疫化のために使用できる物質を表す。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年り月／夕日

Claims

【特許請求の範囲】

１．パルポウイルスＢ１９特異的抗体の検出を妨害することがある不純物を含有しないことを特徴とする、カプシドタンパク質ＶＰ１またはＶＰ２のアミノ酸配列の一部分を有する、免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
２．８〜８０アミノ酸を有することを特徴とする、上記第１項記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
３．１０〜３２アミノ酸を有することを特徴とする、上記第１項記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
４．ポリペプチドは第２−１図に記載するようなペプチドＰＡＮ１の部分的配列であることを特徴とする、上記第２または３項記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
５．アミノ酸配列【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】を有することを特徴とする、上記第２または３項記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
６．アミノ酸配列【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】及び／又は【配列があります】またはその部分的配列を有することを特徴とする、上記第２または第３項記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
７．融合タンパク質の形態のタンパク質であり、ここでこの融合タンパク質はβ −ガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフエラーゼの少なくとも一部分を有することを特徴とする、上記第１〜６項のいずれかに記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。
８．少なくとも１つの上記第１〜６項のいずれかに記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを有し、研究流体の中に存在する抗体と反応することができること、および免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドの複合体の検出を可能とする、少なくとも１種のインディケーター成分を有することを特徴とする、ヒトのパルボウイルスＢ１９に対する抗体を検出するための試験キット。
９．インディケーター成分は検出すべき抗体に対して向けられかつ標識を有する抗体であることを特徴とする、上記第９項記載の試験キット。
１０．標識は放射性同位元素から成ることを特徴とする、上記第９項記載の試験キット。
１１．標識は色の反応を触媒することができる酵素から成ることを特徴とする、上記第９項記載の試験キット。
１２．免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをビオチニル化し、そしてインディケーター成分は酵素、ことにペルオキシダーゼを共有結合して有するアビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする、上記第９項記載の試験キット。
１３．それはＥＬＩＳＡキットであることを特徴とする、上記第９〜１２項のいずれかに記載の試験キット。
１４．少なくとも１つの上記第１〜７項のいずれかに記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドはマイクロタイタープレートにカップリングされており、そしてインディケーター成分は色反応を触媒する酵素がカップリングされている抗ヒトＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体から成ることを特徴とする、上記第１３項記載の試験キット。
１５．ヒトＩｇＭ抗体に対するモノクローナル抗体がマイクロタイタープレートにカップリングされていること、およびインディケーター成分は上記第１〜７項のいずれかに記載のビチオニル化免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドであり、前記ペプチドまたはポリペプチドはそれに共有結合した酵素をもつアビジンまたはストレプトアビジンと共同することを特徴とする、上記第１３項記載の試験キット。
１６．不安定性構成成分の除去、ＤＥＡＥ−セファゼル（ｓｅｐｈａ−ｚｅｌｌ）（ｓｉｃ）カラムによる分画、および８モルの尿素の中のＨＰＬＣにおけるアニオン交換カラムによる他の精製からなることを特徴とする、上記第１〜７項のいずれかに記載の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチドの精製法。
１７．親和クロマトグラフィーからさらになることを特徴とする、上記第１６項記載の方法。
１８．親和クロマトグラフィーをグルタチオンがカップリングしたゲルマトリックスを使用して実施することを特徴とする、上記第１７項記載の方法。
１９．ＤＮＡの増幅による、ことにポリメラーゼ連鎖反応による病原体の直接検出のための、【配列があります】から選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列の使用。
２０．パルボウイルスＢ１９による感染に対するワクチンとしての上記第１〜７項のいずれかに記載の免疫学的に活性なペプチドの使用。
２１．パルボウイルスＢ１９のカプシドのタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２の部分的アミノ酸配列をもつ免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド。