CN111154803A - 一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用。本发明利用聚合酶链式反应PCR技术，获得gH和gL的基因片段，将这两个目的片段分别克隆入昆虫表达载体pMT，经质粒大提去除内毒素后，与抗性筛选质粒pCoBlast一起共转染黑腹果蝇Schneider2细胞，用杀稻瘟菌素进行阳性克隆筛选，筛选出高效分泌表达gHgL的S2稳定细胞系。扩大培养后，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化，即可获得高均一、高产量、高天然保真性的gHgL。通过微量热涌动技术验证了gHgL与受体EphA2的相互作用，适合作为免疫原用于EBV亚单位疫苗以及与gB和gp350联合疫苗的研发。

Description

一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用。

背景技术

爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，简称EB病毒，属于γ疱疹病毒亚科，可感染世界上95％左右的人口，是最早被发现与肿瘤相关的病毒。它与多种人类疾病特别是恶性肿瘤相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌等。据估计，全世界每年新增约20万例EBV相关癌症病人，大约14万病人因它而死亡。因此，安全有效的疫苗亟需用来阻断EBV的感染。鉴于EBV终身感染的特性和其高致癌性，减毒活疫苗等可能存在着安全问题，疫苗研发尝试仍主要集中在亚单位疫苗上面，这样就对免疫原的大量制备提出了很高的要求。

EBV在人体内主要感染B淋巴细胞和上皮细胞，其侵入靶细胞以起始新的感染循环的过程非常复杂，需要多个病毒包膜糖蛋白以及靶细胞表面受体蛋白的参与。EBV对B淋巴细胞的感染起始于病毒包膜糖蛋白gp350与细胞表面受体CR1/CD35或CR2/CD21的结合，紧接着糖蛋白gp42与细胞表面受体分子MHC-II结合，导致与gp42结合的病毒糖蛋白gHgL复合物以一种未知的方式激活病毒融合蛋白gB，激活的gB可以直接介导病毒和细胞的膜融合，使得病毒可将遗传物质释放到细胞中，从而完成病毒的进入以起始新的病毒生活周期。EBV对上皮细胞的侵入则起始于包膜糖蛋白BMRF2对细胞表面整合素β1、α5、α3和αv的吸附，随后病毒糖蛋白gHgL通过与整合素αvβ5，αvβ6或αvβ8，以及最近新发现的EphA2受体直接相互作用，触发gB介导的病毒和细胞膜融合，进而完成病毒的入侵过程。像其它所有疱疹病毒家族成员一样，gHgL和gB组成了入侵所有靶细胞的核心病毒融合机器，而gp350和BMRF2则是EBV特有的用于入侵不同靶细胞的糖蛋白，并且仅仅是利于病毒对特定靶细胞的有效入侵，本身不是严格必需的，对其它的靶细胞也不起作用。。

糖蛋白gp350是EBV表面丰度最高的糖蛋白。最初的研究表明，血清中可阻止B淋巴细胞感染的中和抗体大部分都靶向gp350，因而之前针对EBV疫苗的研发努力主要集中于重组的gp350。但是，尽管经过几十年的努力，基于gp350的疫苗研发策略并不能阻止EBV对B淋巴细胞的感染，甚至有文章报道其引出的抗体反而可以增强病毒对上皮细胞的感染。最新的研究结果表明，血清阳性的患者体内，靶向gp350、gHgL和gp42的抗体分别贡献了44.6％±4.37％、46.9％±3.29％和10.9％±1.85％的B淋巴细胞中和效率,而靶向gHgL的抗体则贡献了76.0％±0.89％的上皮细胞中和效率。鉴于此，再结合gHgL在病毒入所有侵靶细胞中过程中的不可或缺的作用，使得gHgL正成为目前最有希望的EBV候选疫苗组分。

EBV gH蛋白属于I型跨膜蛋白，包含706个氨基酸残基，可分为四个区域：信号肽、胞外区、跨膜区和胞质尾巴。gH蛋白功能的发挥依赖于gL蛋白，gL蛋白是一个没有跨膜区，只有137个氨基酸残基的糖蛋白，其N端23个氨基酸为信号肽。EBV gH和gL蛋白通常形成异二聚体(gHgL)复合物来执行功能，在gL蛋白缺失的情况下，单独表达gH蛋白会导致其大部分滞留在内质网中，而且此时的gH蛋白不能正确折叠、糖基化、转运并最终定位在靶细胞膜上。gL这种分子伴侣的性质决定了二者只能在一起共表达，无疑给二者的表达增添很多难度。目前已建立的gHgL表达系统均存在者产量不高的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，包括：将gH和gL的基因片段分别克隆入昆虫表达载体pMT；分别进行无内毒素质粒大量提取后，与抗性筛选质粒pCoBlast一起共转染黑腹果蝇Schneider2细胞，转染48h后进行阳性克隆筛选，大约2-4周后获得高效分泌表达gHgL的S2稳定细胞系；细胞扩大培养并经诱导表达即可获得重组EBVgHgL蛋白。

进一步地，所述gH的基因片段为EBV包膜糖蛋白gH胞外结构域；所述gL的基因片段为gL的全长片段。

进一步地，gH的核苷酸序列见SEQ ID NO.5；gL的核苷酸序列见SEQ ID NO.6。

进一步地，共转染黑腹果蝇Schneider2细胞后，用杀稻瘟菌素进行阳性克隆筛选。

进一步地，扩大培养阶段使用硫酸铜诱导重组蛋白的表达。

进一步地，细胞扩大培养获得重组EBV gHgL蛋白后，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析对重组蛋白进行两步纯化。

如上述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法在制备重组EBV gHgL蛋白中的应用。

一种利用如上述的重组EBV gHgL免疫原的制备方法制备的重组EBV gHgL蛋白在制备用于治疗爱泼斯坦巴尔病毒感染的药物、单克隆抗体或疫苗中的应用。

进一步地，所述疫苗包括EBV亚单位疫苗，或gB和gp350联合疫苗。

进一步地，所述单克隆抗体包括靶向gHgL的中和抗体。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明选取EBV进入两种主要靶细胞——B淋巴细胞和上皮细胞以及其它所有的非主要靶细胞都必需的糖蛋白gHgL作为免疫原。本发明中删掉EBV gH的跨膜区，获取EBV包膜糖蛋白gH胞外结构域，即gH的片段为第18-679位氨基酸，有利于复合物的分泌表达以及随后的纯化过程；选取gL的全长片段，即23-137位氨基酸；将两个目的基因片段分别克隆入昆虫表达载体pMT；首次选用黑腹果蝇表达系统，通过共转染，并在表达纯化阶段，用镍柱结合缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)替换SFX-Insect昆虫培养基，经镍柱亲和层析(Affinity Chromatography，AF)和凝胶过滤层析(Ge1Filtration Chromatography，GF)纯化，成功实现了高质量、高产量、高纯度、高天然保真性的gHgL重组蛋白的高效、简便和大量制备。

本发明经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)偶联考马斯亮蓝染色检测并结合凝胶过滤色谱的峰图初步判定纯化得到的gHgL的纯度和均一性都非常好，且表达量大。本发明的制备系统，重组蛋白的产量在每升50-100个毫克，较目前已有的表达系统提高了100倍(Kirschner,Austin N.,et al."Soluble Epstein-Barr virus glycoproteins gH,gL,and gp42 form a 1:1:1stable complex that acts like soluble gp42 in B-cellfusion but not in epithelial cell fusion."Journal of virology 80.19(2006):9444-9454，Typical yields of gH/gL protein were 0.5 to 1mg/liter supernatant，该文章用的是杆状病毒表达系统，每升的产量在0.5-1个毫克)。本发明还验证了该重组蛋白与新发现受体EphA2的相互作用，得出的结合常数优于已发表的哺乳动物表达系统制备的gHgL的数据(Snijder,Joost,et al."An antibody targeting the fusion machineryneutralizes dual-tropic infection and defines a site of vulnerability onEpstein-Barr virus."Immunity 48.4(2018):799-811，Fig.6E)，表明本发明中的gHgL具有非常好的天然保真性。用gHgL来进行免疫可产生中和抗体来阻止EBV对所有潜在靶细胞的感染，此外还可能触发比较强的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，非常适合作为免疫原用于亚单位疫苗以及gB和gp350联合疫苗的研发来预防和阻断EBV的感染。

附图说明

图1是gH、gL结构域排列的示意图；

图2是400mL表达上清经镍柱亲和层析纯化后的重组gHgL经Hiload16/60Superdex200凝胶过滤预装柱纯化的图谱；

图3是经凝胶过滤层析纯化后目的蛋白gHgL的SDS-PAGE偶联考马斯亮蓝染色的结果；

图4是纯化后gHgL蛋白的Western blot检测结果；

图5是微量热泳动技术检测纯化后的gHgL与新发现受体EphA2相互作用的结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用，具体如下实施例所示。

实施例1重组gH和gL表达载体的构建

以金唯智生物科技有限公司全基因合成的按照果蝇密码子偏爱性进行密码子优化的gH和gL cDNA为模板，利用PCR技术，获得了有gH胞外结构域和gL全长(见图1)的DNA片段。

载体构建过程中用到的引物为：

pMT EBV gH Bgl II Forward:GAAGATCTGCCTCCCTCTCCGAGGTCAAAC，SEQ ID NO.1；

pMT EBV gH Xba I Reverse:GCTCTAGAGTGGGCACGTTCTTCGTAGAG，SEQ ID NO.2；

pMT EBV gL Bgl II Forward:GAAGATCTAACTGGGCCTATCCGTGCTGTCAC，SEQ IDNO.3；

pMT EBV gL Xba I Reverse:GCTCTAGAGCCACCTCGATGCCAAGCGTAC，SEQ ID NO.4。

PCR反应体系如下：

反应程序如下：

通过经典的双酶切方法将两个目的基因片段分别连接到改造过的pMT/Bip/TEV-HisA载体(该载体的制备参照申请号为CN201410160156.6的中国发明专利中的方法制备，名称为《一种潜在的高效重组HIV-1CRF07-BC gp140免疫原的制备方法》)。通过将原载体中的V5表位替换为烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV酶)的酶切位点，这样就可以利用常见的TEV酶除去目的蛋白羧基末端的组氨酸标签(6×His-tag)，使目的蛋白羧基末端尽可能少地带有不必要的氨基酸残基。具体条件如下：

PCR反应结束获得两个目的基因片段后，用琼脂糖核酸凝胶电泳对酶切产物进行鉴定并回收，根据连接时所选用的酶切位点，利用相应的FastDigest RestrictionEnzymes，分别对基因和载体进行双酶切处理，反应体系如下：

37℃反应1-3h，用琼脂糖核酸凝胶电泳对酶切产物进行鉴定并回收。

将目的基因和载体的双酶切片段用如下体系在37℃下连接至少10min。

将连接产物转化Top10感受态，利用双酶切方法对阳性克隆进行鉴定，进一步利用DNA测序验证目的基因片段的准确性，EBV gH的序列见SEQ ID NO.5；EBV gL的序列见SEQID NO.6。通过无内毒素质粒大提试剂盒对两个目的质粒进行大量抽提以提高目的质粒的浓度、纯度并去除内毒素对转染以及随后筛选的影响。

实施例2黑腹果蝇S2细胞的三质粒共转染及表达目的蛋白的S2稳定细胞系的筛选

提前一天将S2细胞铺于T25培养瓶中，当细胞的汇合度(confluency)达到60-70％时用脂质体法进行共转染。转染步骤按照转染试剂Cellfectin II的说明书进行，两种重组质粒和抗性筛选质粒pCoBlast的质量比为19：19：1，其中gH和gL的比例可以改变以获得最优的表达，但是两者合起来以后与筛选质粒的比例为38:1。将转染后的细胞放入27℃生化培养箱中孵育5小时后，弃去转染液，加入5mL新鲜SFX-Insect培养基，继续培养48h，弃去原培养基，加入含有杀稻瘟菌素(终浓度为25μg/mL)的SFX-Insect培养基进行抗性筛选，未成功转染的细胞在加入杀稻瘟菌素筛选后的一周内会大量死亡，少量的贴壁细胞会在培养瓶中继续生长，大约3周左右，当细胞的汇合度达到100％时，即可获得高效分泌表达重组gHgL的稳定S2细胞系。

实施例3重组gHgL的表达纯化

将筛选出的T25培养的S2稳定细胞系以体积比1：5的比例扩大至T75培养瓶中，并进一步以体积比1：5的比例扩大到500mL转瓶中进行培养，27℃，120-130rpm，培养2-3天，当细胞的密度达到4-6×10⁶，加入终浓度为0.5mM的硫酸铜诱导重组蛋白表达，3天后收集细胞上清。将S2细胞倒入500mL的离心桶中，4000rpm，4℃离心15min。收集细胞上清，经0.22μm微孔滤膜抽滤后，转移到Amicon Stirred Cell 8003型超滤杯中进行浓缩，压缩至50mL左右，用镍柱结合缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)进行10倍稀释，继续压缩至40mL，将蛋白液收集至高速离心管中，20000rpm，4℃离心20min，收集上清，经0.22μm微孔滤膜过滤后，将上清液用于镍柱亲和层析纯化。

用镍柱结合缓冲液将镍柱平衡三个柱长，将上清液挂柱三次，用镍柱洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，50mM咪唑，pH8.0，经梯度洗脱，发现洗脱液中的咪唑浓度不应高于50mM)冲洗镍柱三个柱长，洗去非特异性吸附的杂蛋白，最后用镍柱洗脱缓冲液(50mM Tris-HCL，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)将目的蛋白洗脱洗脱，收集洗脱组分，用4-12％的梯度胶跑SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色法检测分析目的蛋白的纯度。用AmiconUltra超滤管将洗脱并浓缩至1.5mL。

因该蛋白无法用离子交换层析纯化，浓缩至1.5mL的样品进行凝胶过滤纯化。将Hiload16/60Superdex200分子筛预装柱用镍柱结合缓冲液平衡一个柱体积120mL，然后将样品上样到预装柱中，流速1mL/min，柱压设为0.3MPa，将在280nm有吸收的组分进行收集，结果见图2，主峰十分明显，且高度对称，表明均一性十分不错，可以将主峰对应的组分收集后浓缩再过一遍分子筛以进一步提高目的蛋白的纯度。用4-12％的梯度胶进行SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色法检测收集的组分，分析纯度和均一性，结果见图3，在上样量足够大的情况下，仅仅在55kD和40kD大小附近有微弱的杂蛋白条带，纯度在95％以上，20kD处的强弱条带均为gL，原因在于不同的糖基化程度。收集主峰对应的组分并浓缩至4ml，经NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度为13mg/mL，进一步用BCA试剂盒测定浓度为10mg/mL，对应于1L培养基的产量为100mg。

实施例4 EBV gHgL蛋白的Western blot分析

取0.5-1μg实施例3中纯化的gHgL蛋白，用15％的蛋白胶进行SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜(NC)膜上，用5％的脱脂奶粉封闭，以鼠源抗6×His标签的多克隆抗体作为第一抗体(1∶1000稀释)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠IgG为第二抗体(1∶2000稀释)，进行Western blot鉴定。结果见图4，只发现两个目的条带，并没有发现其它杂带。

实施例5 gHgL蛋白与受体EphA2的相互作用分析

利用微量热泳动技术(Microscale Thermophoresis,MST)检测gHgL与新发现受体EphA2的结合能力：使用Monolith NT^TM蛋白标记试剂盒，将20μM的目标蛋白gHgL做荧光标记(NT-647)。标记30分钟后弃去多余染料。将非标记的EphA2分子用镍柱结合缓冲液(50mMTris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)在135μM-4nM之间做梯度稀释，10μl梯度稀释的非标记分子和10μl固定浓度的标记分子混合后静置结合一会，将样品装载到MST NT115标准毛细管中，通过Monolith NT115标记型来测量。X轴的浓度单位为M，测定结果见图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(pMT EBV gH Bgl II Forward)

<400> 1

gaagatctgc ctccctctcc gaggtcaaac 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(pMT EBV gH XbaI Reverse)

<400> 2

gctctagagt gggcacgttc ttcgtagag 29

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(pMT EBV gL BglII Forward)

<400> 3

gaagatctaa ctgggcctat ccgtgctgtc ac 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(pMT EBV gL Xba I Reverse)

<400> 4

gctctagagc cacctcgatg ccaagcgtac 30

<210> 5

<211> 2049

<212> DNA

<213> gH(EBV gH)

<400> 5

agatctgcct ccctctccga ggtcaaactc cacctcgaca ttgagggtca tgcctcccac 60

tacaccatcc cttggaccga actgatggct aaagtgcccg gtctgagccc cgaggcttta 120

tggcgcgagg ctaacgtcac cgaggattta gctagcatgc tcaaccgcta caagctcatc 180

tacaagacct ccggcacttt aggtatcgcc ctcgctgagc ccgtggacat ccccgctgtg 240

tccgagggtt ccatgcaagt cgacgctagc aaggtgcacc ccggtgtcat ctccggcctc 300

aacagccccg cttgcatgct gagcgctcct ctggagaagc agctgttcta ctacattggc 360

accatgctcc ccaacacccg ccctcacagc tacgtgttct accagctgcg ctgtcacctc 420

agctacgtcg ctttatccat caacggtgac aagttccagt ataccggtgc catgactagc 480

aagtttttaa tgggcactta caagcgcgtg actgagaagg gcgacgagca cgtgctctct 540

ttagtcttcg gtaagactaa ggatttaccc gatttacgcg gtcccttctc ctaccccagc 600

ctcaccagcg ctcaaagcgg cgactactct ttagtgatcg tgaccacctt cgtccattac 660

gctaacttcc acaattactt cgtgcctaat ctcaaggaca tgttctcccg tgccgtcacc 720

atgaccgctg ccagctacgc ccgctatgtt ttacagaaac tggtgctgct ggaaatgaag 780

ggtggttgtc gcgagcccga actggacact gagactctca ccaccatgtt cgaggtctcc 840

gtcgctttct tcaaggtggg ccacgctgtg ggtgaaactg gtaacggttg tgtcgacctc 900

cgttggctgg ctaagagctt cttcgagctg accgtcctca aagacatcat cggtatctgt 960

tatggcgcca ccgtgaaggg catgcagagc tatggcttag aacgtctcgc tgctatgctg 1020

atggccaccg tcaagatgga ggaactgggc cacctcacca ccgaaaagca agaatacgct 1080

ttacgcctcg ctactgtggg ttaccccaag gccggtgtct actccggttt aatcggtggt 1140

gctactagcg tgctgctgag cgcctacaat cgtcaccctt tattccagcc tctgcacact 1200

gtgatgcgcg agactttatt catcggctcc cacgtggtgc tccgtgaact gcgcctcaac 1260

gtcaccaccc aaggtcctaa tttagctctc tatcagctgc tgagcactgc tctctgcagc 1320

gctctggaga tcggcgaggt tttacgtggt ctcgctctgg gtactgagtc cggcctcttc 1380

tccccttgtt atttatcttt acgcttcgac ctcactcgcg acaagctcct ctccatggct 1440

cctcaagagg ctactttaga ccaagccgct gtcagcaacg ccgtggatgg tttcctcggt 1500

cgcctctctt tagagcgtga agaccgtgac gcttggcacc tccccgctta caaatgcgtc 1560

gaccgtctgg acaaggtttt aatgatcatc cccctcatca acgtgacctt catcatctcc 1620

agcgaccgtg aagtccgcgg ttccgctctg tatgaagcta gcaccaccta tttatcctcc 1680

tctttattcc tcagccccgt gatcatgaac aagtgctccc aaggtgccgt ggctggtgag 1740

ccccgtcaga tccccaagat ccaaaacttc acccgcaccc agaagtcttg tatcttctgc 1800

ggttttgctt tactgtccta cgacgagaag gagggcctcg aaaccactac ctacatcacc 1860

tcccaagaag tccagaactc cattttatct tctaactact tcgacttcga caatctgcat 1920

gtgcactact tattactcac caccaacggt actgtgatgg agatcgctgg tctctacgaa 1980

gaacgtgccc actctagaga gaacctgtac ttccaatcca ataccggtca tcatcaccat 2040

caccattga 2049

<210> 6

<211> 408

<212> DNA

<213> gL(EBV gL)

<400> 6

agatctaact gggcctatcc gtgctgtcac gtgacccagc tgagggccca acaccttctg 60

gcgctggaga acatctccga catctattta gtgtccaacc agacttgtga tggcttcagc 120

ttggcctccc tcaacagccc gaagaacggc agcaaccagc tggtgatcag ccgatgcgca 180

aacgggctga acgtggtcag cttcttcatc agcattctga agcgctcatc cagcgctctg 240

accggccatt tacgagagct gttgacgacc ttagaaacgc tgtatggctc cttctcagtg 300

gaggatctct tcggagctaa cctgaacagg tacgcttggc atcgaggtgg ctctagagag 360

aacctgtact tccaatccaa taccggtcat catcaccatc accattga 408

Claims (9)

1.一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于，包括：将gH和gL的基因片段分别克隆入昆虫表达载体pMT；分别进行无内毒素质粒提取后，与抗性筛选质粒pCoBlast共转染黑腹果蝇Schneider2细胞，进行阳性克隆筛选获得高效分泌表达gHgL的S2稳定细胞系；细胞扩大培养并诱导表达即可获得重组EBV gHgL蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于：所述gH的基因片段为EBV包膜糖蛋白gH胞外结构域；所述gL的基因片段为gL的全长片段。

3.根据权利要求2所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于：gH的核苷酸序列见SEQ ID NO.5；gL的核苷酸序列见SEQ ID NO.6。

4.根据权利要求1所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于：以不同的gH和gL重组质粒比例与抗性筛选质粒共转染黑腹果蝇Schneider2细胞后，用杀稻瘟菌素进行阳性克隆筛选。

5.根据权利要求1所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于：扩大培养阶段使用硫酸铜诱导重组蛋白的表达。

6.根据权利要求5所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法，其特征在于：细胞扩大培养获得重组EBV gHgL蛋白后，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析对重组蛋白进行两步纯化。

7.如权利要求1-6任一所述的一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法在制备重组EBVgHgL蛋白中的应用。

8.一种利用如权利要求1-6任一所述的重组EBV gHgL免疫原的制备方法制备的重组EBV gHgL蛋白在制备用于治疗爱泼斯坦巴尔病毒感染的药物、单克隆抗体或疫苗中的应用。

9.根据权利要求8所述的重组EBV gHgL蛋白在制备用于治疗爱泼斯坦巴尔病毒感染的药物、单克隆抗体或疫苗中的应用，其特征在于：所述疫苗包括EBV亚单位疫苗，或gB和gp350联合疫苗；所述单克隆抗体包括靶向gHgL的中和抗体。

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