CN111808828A - 腺相关病毒的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒的分离纯化领域，具体而言，涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法。该方法包括：a）提供层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的抗体，所述抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列依次如SEQ ID NO:1和2所示；b）将包含腺相关病毒的液相组合物与所述层析介质共孵育以使得所述腺相关病毒与所述抗体结合；c）从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒；其中，所述腺相关病毒选自AAV1～13中的任意一种或多种。该方法可通用性地对AAV1～13中的任意一种进行分离纯化，并且无需对AAV本身进行改造，纯化AAV更方便；纯化效率高，特异性好，几乎不与细胞内的其他蛋白发生可检测的非特异性结合。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的分离纯化领域，具体而言，涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法。
背景技术
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。
AAV的传统纯化方法是氯化铯梯度离心。传统技术中，有记载使用非离子碘化醇梯度离心，再用离子交换或肝素亲和层析分离AAV2。AAV1、2、4、5 和 8 都有报道用离子交换层析的方法纯化。AAV4和AAV5可以用粘液素柱子纯化，因为这类载体可结合粘液素中的硅酸残基。AAV6 也具有结合硫酸肝素的能力（比AAV2稍弱），因而可以用肝素亲和住分离纯化。需要注意的是，这些方法不是通用的，因而每个类型的AAV纯化需要各自优化。
有鉴于此，发展一种通用的纯化方法对大规模临床级别的载体生产非常有意义。有人用组氨酸标签和内源性生物素序列来做纯化。然而，这些方法需要在外壳序列中插入或定点突变，会影响转导效率或者组织嗜性。
发明内容
本发明涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法，包括：
a）提供层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的抗体，所述抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列依次如SEQ ID NO:1和2所示；
b）将包含腺相关病毒的液相组合物与所述层析介质共孵育以使得所述腺相关病毒与所述抗体结合；
c）从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒；
其中，所述腺相关病毒选自AAV1～13中的任意一种或多种。
本发明的有益效果为：
通过采用特别制备的抗体，本申请所提供的腺相关病毒的分离纯化方法可以通用性地对AAV1～13中的任意一种或多种进行分离纯化，并且该方法无需对AAV本身进行改造，纯化AAV更方便；纯化效率高，特异性好，几乎不与细胞内的其他蛋白发生可检测的非特异性结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中通过ELISA检测所得抗体的效价；
图2A和图2B为本发明一个实施例中对所得抗体亲和层析应用的验证；其中图2A为AAV1~AAV6洗脱后的电泳结果；图2B为AAV7~AAV13洗脱后的电泳结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法，包括：
a）提供层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的抗体，所述抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列依次如SEQ ID NO:1和2所示；
b）将包含腺相关病毒的液相组合物与所述层析介质共孵育以使得所述腺相关病毒与所述抗体结合；
c）从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒；
其中，所述腺相关病毒选自AAV1～13中的任意一种或多种。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述腺相关病毒包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种不同血清型的腺相关病毒。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述基体支持物为弱阳离子交换柱。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述弱阳离子交换柱的填料为Sepharose Fast Flow。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述弱阳离子交换柱的填料为Sepharose 4 Fast Flow。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述弱阳离子交换柱购自GE公司。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，在所述共孵育之前，先将所述层析介质进行平衡，平衡缓冲液的组成为8 mM ~12 mM Tris-HCl，130mM~170 mM NaCl，pH=7.3~7.7。
可选的，平衡缓冲液的组成为10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH=7.5。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，在所述共孵育之后，先通过冲洗洗去未结合的物质，再从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述冲洗过程包括：
使用5~10倍柱体积的8 mM ~12 mM Tris-HCl，0.8M~1.2 M NaCl, pH=7.3~7.7溶液冲洗杂质。
可选的，所述冲洗过程包括：
使用5~10倍柱体积的10 mM Tris-HCl，1.0 M NaCl, pH=7.5溶液冲洗杂质。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，在所述冲洗过程前后各包括一次柱平衡过程，平衡缓冲液的组成为 8 mM ~12 mM Tris-HCl，130mM~170 mM NaCl，pH=7.3~7.7。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述洗脱过程包括：
使用70 mM~120 mM柠檬酸，pH=3.2~3.7溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并用0.8 M~1.2M Tris溶液调pH至中性。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述洗脱过程包括：
使用100 mM柠檬酸，pH=3.5溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并用1.0M Tris溶液调pH至中性。
可选的，如上所述的腺相关病毒的分离纯化方法，所述液相组合物为细胞裂解液。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 抗体的制备与检测
一、抗体的制备
本发明所用抗原通过以AAV8的VP1为基础，比对AAV1-13，去除大部分非同源序列以后获得VPx序列，构建到pET-21载体上，表达及纯化该代表后，作为抗原，获取小鼠单克隆抗体。
1.单克隆抗体制备
1.1 小鼠免疫：
BALB/c小鼠的免疫 BALB/c小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。
1.2 细胞融合：
用分子量为1450的50%PEG作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行。
1.3 杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：
融合后第7天，采用间接ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选。
1.4 小鼠腹水法生产单克隆抗体：
阳性孔的扩大培养：在24孔细胞培养板加入饲养细胞，4滴/孔，将96孔板内的阳性细胞转到24孔细胞培养板进行扩大培养。
注射：待到细胞长满孔底将24孔板的细胞重悬，1200r/min，离心5min，细胞计数，用RPMI-1640基础培养液稀释成1×106～5×106个/ mL，腹腔注射小鼠0.5mL/只，8天左右观察到小鼠腹部隆起，即可采集腹水。
筛选得到的抗体重链可变区序列和轻链可变区序列依次如SEQ ID NO:1和2所示。
使用ELISA检测VP-18抗体对不同血清型AAV的结合能力及抗体效价：
步骤与方法：
1. 重组AAV(血清型1-13)用包被缓冲液(pH9.6, 0.05mol/L碳酸盐缓冲液)稀释到5×109 vp/ml，100μL/well铺酶标板，37度1小时；
2. 丢弃上清，并用洗涤缓冲液（PBS）洗三遍，每次100μL；
3. 100μL，10%milk，包被缓冲液，37度封闭1小时；
4. 重复洗涤3次；
5. 细胞培养上清，100μL/WELL，37度1小时；
6. 用洗涤缓冲液（PBS）洗涤三次；
7. HRP二抗，按照说明书稀释，用PBS加1%BSA，100μL，37度1小时；
8. 用洗涤缓冲液（PBS）洗涤三次；
9. 加显色底物TMB ；
10. 37度15-30分钟，1M硫酸终止反应；
11. 酶标仪检测OD450光吸收。
检测结果如图1所示。从图中可知VP-18抗体对不同血清型AAV均能有效结合，且具有较高的抗体效价。
实施例2 腺相关病毒的分离纯化方法
1. 抗体偶联活化填料步骤
参考NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow使用手册，将实施例1制备得到的AAV抗体偶联至Sepharose 4 Fast Flow，制备亲和填料。
2. 填料对AAV的亲和纯化步骤
1） 平衡：将装填好的层析柱使用8CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液平衡。
2） 上样：将分别包装AAV1~13的HEK293细胞冻融裂解和离心后，经过0.22 μm过滤，然后上样至平衡好的层析柱，上样载量不超过1E+14 vg/mL填料。
3） 冲洗1：上样结束，用8CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液平衡。
4） 冲洗2：使用8CV的10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH7.5溶液冲洗杂质。
5） 冲洗2：用8CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液再次平衡层析柱。
6） 洗脱：使用100 mM柠檬酸，pH3.5溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并立刻用1M Tris溶液调pH至中性。
7） 再生：使用1 M柠檬酸，pH1.5溶液再生层析柱，将残留杂质从层析柱上洗涤下来。
8） 再平衡：用8CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液平衡层析柱。
9） 保存：使用8CV的20%乙醇溶液保存层析柱。
实施例3 腺相关病毒的分离纯化方法
1. 抗体偶联活化填料步骤
参考NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow使用手册，将实施例1制备得到的AAV抗体偶联至Sepharose 4 Fast Flow，制备亲和填料。
2. 填料对AAV的亲和纯化步骤
1） 平衡：将装填好的层析柱使用5CV的8 mM Tris-HCl, 130mM NaCl, pH=7.3溶液平衡。
2） 上样：将分别包装AAV1~13的HEK293细胞冻融裂解和离心后，经过0.22 μm过滤，然后上样至平衡好的层析柱，上样载量不超过1E+14 vg/mL填料。
3） 冲洗1：上样结束，用5CV的8 mM Tris-HCl, 130mM NaCl, pH=7.3溶液平衡。
4） 冲洗2：使用8 mM Tris-HCl，0.8M NaCl, pH=7.3溶液冲洗杂质。
5） 冲洗2：用8 mM Tris-HCl, 130mM NaCl, pH=7.3溶液再次平衡层析柱。
6） 洗脱：使用70 mM柠檬酸，pH=3.2溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并立刻用0.8 M Tris溶液调pH至中性。
7） 再生：使用1 M柠檬酸，pH1.5溶液再生层析柱，将残留杂质从层析柱上洗涤下来。
8） 再平衡：用5CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液平衡层析柱。
9） 保存：使用5CV的20%乙醇溶液保存层析柱。
实施例4 腺相关病毒的分离纯化方法
1. 抗体偶联活化填料步骤
参考NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow使用手册，将实施例1制备得到的AAV抗体偶联至Sepharose 4 Fast Flow，制备亲和填料。
2. 填料对AAV的亲和纯化步骤
1） 平衡：将装填好的层析柱使用10CV的12 mM Tris-HCl, 130mM, pH=7.7溶液平衡。
2） 上样：将分别包装AAV1~13的HEK293细胞冻融裂解和离心后，经过0.22 μm过滤，然后上样至平衡好的层析柱，上样载量不超过1E+14 vg/mL填料。
3） 冲洗1：上样结束，用10CV的12 mM Tris-HCl, 170 mM NaCl, pH=7.7溶液平衡。
4） 冲洗2：使用12 mM Tris-HCl，1.2 M NaCl, pH=7.7溶液冲洗杂质。
5） 冲洗2：用12 mM Tris-HCl, 170 mM NaCl, pH=7.7溶液再次平衡层析柱。
6） 洗脱：使用120 mM柠檬酸，pH=3.7溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并立刻用1.2M Tris溶液调pH至中性。
7） 再生：使用1 M柠檬酸，pH1.5溶液再生层析柱，将残留杂质从层析柱上洗涤下来。
8） 再平衡：用10CV的10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7.5溶液平衡层析柱。
9） 保存：使用10CV的20%乙醇溶液保存层析柱。
实验例
实施例2洗脱样品经过SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮蓝染色，结果见图2A和图2B。可见，VP-18抗体对不同血清型AAV均具有富集作用，载量较为理想，且VP-18抗体与HEK293细胞裂解液的其他组分几乎不产生非特异性地结合，抗体特异性好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司
<120> 腺相关病毒的分离纯化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Val Gly Asp Asp Thr Ser Tyr Ser Asp Asn Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Asp Gly Phe Tyr Val Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
Claims (11)
1.腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，包括：
a）提供层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的抗体，所述抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列依次如SEQ ID NO:1和2所示；
b）将包含腺相关病毒的液相组合物与所述层析介质共孵育以使得所述腺相关病毒与所述抗体结合；
c）从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒；
其中，所述腺相关病毒选自AAV1～13中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述腺相关病毒包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种不同血清型的腺相关病毒。
3.根据权利要求1所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述基体支持物为弱阳离子交换柱。
4. 根据权利要求3所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述弱阳离子交换柱的填料为Sepharose Fast Flow。
5. 根据权利要求4所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述弱阳离子交换柱的填料为Sepharose 4 Fast Flow。
6. 根据权利要求5所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，在所述共孵育之前，先将所述层析介质进行平衡，平衡缓冲液的组成为 8 mM ~12 mM Tris-HCl，130mM~170mM NaCl，pH=7.3~7.7。
7.根据权利要求5所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，在所述共孵育之后，先通过冲洗洗去未结合的物质，再从所述抗体上洗脱所述腺相关病毒。
8.根据权利要求7所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述冲洗过程包括：
使用5~10倍柱体积的8 mM ~12 mM Tris-HCl，0.8M~1.2 M NaCl, pH=7.3~7.7溶液冲洗杂质。
9. 根据权利要求8所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，在所述冲洗过程前后各包括一次柱平衡过程，平衡缓冲液的组成为 8 mM ~12 mM Tris-HCl，130mM~170 mMNaCl，pH=7.3~7.7。
10.根据权利要求5所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱过程包括：
使用70 mM~120 mM柠檬酸，pH=3.2~3.7溶液洗脱层析柱，出峰后收集样品，并用0.8 M~1.2M Tris溶液调pH至中性。
11.根据权利要求1~10任一项所述的腺相关病毒的分离纯化方法，其特征在于，所述液相组合物为细胞裂解液。
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