KR20190006951A

KR20190006951A - 컬럼-기반 완전히 확장 가능한 rAAV 제조 공정

Info

Publication number: KR20190006951A
Application number: KR1020187031464A
Authority: KR
Inventors: 광 쿠; 영훈 오; 린 루; 존 프레이저 라이트
Original assignee: 스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2019-01-21
Also published as: PT3436051T; JP2022120011A; AU2017240721A1; RU2018138164A3; US20200299650A1; KR102405250B1; CL2018002754A1; EP3436051A1; DK3436051T3; EP3436051B1; WO2017173283A1; SA518400146B1; CA3019133A1; BR112018070256A2; PL3436051T3; ES2896080T3; CO2018011151A2; CN109152821A; JP2019509745A; AU2017240721B2

Abstract

본 발명에 따르면, 재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터 입자를 정제하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

컬럼-기반 완전히 확장 가능한 rAAV 제조 공정

관련 출원

본 출원은 2016년 3월 31일자로 출원된 미국 가특허출원 62/316,252호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 본문, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여, 본원에 참조로서 포함된다.

도입

유전자 전달은 후천성 및 유전성 질환의 치료에 유망한 방법이다. 아데노-관련 바이러스 (AAV)-기반 시스템을 포함하는 유전자 전달 목적을 위한 다수의 바이러스-기반 시스템이 기술되었다.

AAV는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 헬퍼-의존성 DNA 파보바이러스이다. AAV는 증식성 감염을 발생시키기 위해, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 백시니아와 같은 헬퍼 바이러스 기능을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스 기능의 부재 하에, AAV는 이의 유전체를 숙주 세포 염색체에 삽입함에 의해 잠복 상태를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 통합된 바이러스 유전체를 구조하며, 이는 이후 복제되어 감염성 AAV 자손을 생산할 수 있다.

AAV는 광범위한 숙주 범위를 가지며, 적합한 헬퍼 바이러스의 존재 하에 임의의 종으로부터의 세포에서 복제될 수 있다. 예를 들어, 인간 AAV는 개과 아데노바이러스로 공동-감염된 개과 세포에서 복제될 것이다. AAV는 임의의 인간 또는 동물 질환과 관련이 없었고 통합시 숙주 세포의 생물학적 특성에 악영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

AAV 벡터는 AAV 유전체의 내부 부분을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키고 관심 핵산 서열을 ITR 사이에 삽입시킴에 의해 관심 이종성 핵산 서열(예를 들어, 치료용 단백질, 안티센스 분자와 같은 억제성 핵산, 리보자임, miRNA 등을 인코딩하는 선택된 유전자)을 지니도록 조작될 수 있다. ITR은 그러한 벡터에서 기능을 유지하여 관심 이종성 핵산 서열을 함유하는 rAAV의 복제 및 패키징을 허용한다. 이종성 핵산 서열은 또한 전형적으로 환자의 표적 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열에 연결된다. 종결 신호, 예를 들어, 폴리아데닐화 부위가 또한 벡터에 포함될 수 있다.

감염성 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 작제는 많은 간행물에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 5,173,414 and 5,139,941; International Publication Numbers WO 92/01070 and WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; and Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801] 참조.

재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 많은 그룹에 의한 여러 초기 단계 임상 시험에서 양호한 치료 가능성을 보여주었다. 승인을 향한 이 새로운 부류의 생물학적 제품의 개발은 벡터 설계 및 제조 공정 파라미터가 임상 등급 벡터의 불순물 프로파일에 어떻게 영향을 미치는 지를 더 잘 이해하는 것을 포함하는, 벡터 특성화 및 품질 관리 방법의 개선을 포함할 것이다.

rAAV 생산 및 정제 시스템의 설계에서 중요한 목적은, 야생형/슈도 야생형 AAV 종(wtAAV) 및 AAV-캡시드화된 잔류 DNA 불순물을 포함하는, 단백질, 핵산, 및 벡터-관련 불순물과 같은 생산 관련 불순물의 생성을 최소화/제어하기 위한 전략을 구현하는 것이다. AAV 벡터에서 불순물의 제거는 rAAV 벡터가 생산되는 방식 때문에 복잡해진다. 한 생산 공정에서, rAAV 벡터는 3개의 플라스미드를 사용하는 일시적인 트랜스펙션 공정에 의해 생산된다. 상당한 양의 플라스미드 DNA는 세포 내로 도입되어 rAAV 벡터를 생산한다. 또한, rAAV 벡터가 생산 세포로부터 방출되면, 세포 단백질 및 핵산은 동시-방출된다. rAAV 벡터가 바이오매스의 약 1%만을 차지한다는 것을 고려하면, rAAV 벡터를 임상적인 인간 유전자 치료 제품으로 사용할 수 있는 순도 수준으로 정제하는 것은 매우 어렵다. (Smith PH Wright JF. Qu G. et al 2003, Mo. Therapy, 7:8348; Chadeuf G. et al, Mo. Therapy 2005, 12:744. Report from the CHMP gene therapy expert group meeting. European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005, 183989/2004).

인간 질병을 치료하기 위한 제품으로서 재조합 AAV를 정제하는 제조 공정의 개발은 다음 목적을 달성하여야 한다: 1) 일관된 벡터 순도, 효능 및 안전성; 2) 제조 공정의 확장 가능성; 및 3) 허용되는 제조 비용. 현재의 '산업 표준' 확장 가능한 AAV 벡터 정제 공정은 상기 열거된 첫 번째 목표(일관된 벡터 순도, 효능 및 안전성)를 충족시키는데 중요한 불순물 제거를 적절하게 달성하지 못한다. 더욱이, 현재의 산업-표준 확장 가능한 정제 공정을 사용하여 적절하게 불순물을 제거하지 못하였는데, 그 이유는 1) 백신(면역 반응을 전형적으로 오히려 회피하고자 함) 이외의 용도에 대한 재조합 AAV와 같은 바이러스 생성물의 정제 공정의 개발이 비교적 새로운 것이고; 2) AAV 벡터에 대한 확장 가능한 정제 공정의 개발에 관여한 많은 그룹이 벡터-관련 불순물의 높은 수준을 인식하지 못하였고/거나 그러한 불순물이 임상적으로 중요한 벡터 면역원성에 기여하지 않을 것이라고 추정하였고; 3) rAAV 벡터의 산업 규모의 제조에 적합한 확장 가능한 정제 공정을 개발하는 것이 기술적으로 어렵기 때문이다.

개요

본 발명에 따르면, 일부 양태에서, 재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터 입자를 정제하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) rAAV 벡터 입자를 포함하는 세포 및/또는 세포 배양 상청액을 수확하여 수확물을 생산하는 단계; (b) 임의로 단계 (a)에서 생산된 수확물을 농축시켜 농축된 수확물을 생산하는 단계; (c) 단계 (a)에서 생산된 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 농축된 수확물을 용해시켜 용해물을 생산하는 단계; (d) 용해물 중 오염성 핵산을 감소시키기 위해 용해물을 처리함으로써 핵산 감소된 용해물을 생산하는 단계; (e) 단계 (d)에서 생산된 핵산 감소된 용해물을 여과시켜 정화된 용해물을 생산하고, 임의로 정화된 용해물을 희석시켜 정화되고 희석된 용해물을 생산하는 단계; (f) 단계 (e)에서 생산된 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 컬럼 용리액을 생산하고, 임의로 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 컬럼 용리액을 생산하는 단계; (g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용리액 또는 농축된 컬럼 용리액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제2 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 제2 컬럼 용리액을 희석시켜 희석된 제2 컬럼 용리액을 생산하는 단계; (h) 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용리액 또는 희석된 제2 컬럼 용리액을 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제3 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 또는 다른 생산 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 제3 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 제3 컬럼 용리액을 생산하는 단계; 및 (i) 단계 (h)에서 생산된 제3 컬럼 용리액 또는 농축된 제3 컬럼 용리액을 여과시킴으로써 정제된 rAAV 벡터 입자를 생산하는 단계를 포함한다. 하기 구체예 및 양태는 상기 단계 (a) 내지 (h) 중 하나 이상을 지칭한다.

특정 구체예에서, 단계 (f)는 단계 (e)에서 생산된 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함하고/하거나, 단계 (h)는 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용리액 또는 희석된 제2 컬럼 용리액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (f)는 단계 (e)에서 생산된 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함하고/하거나, 단계 (h)는 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용리액 또는 희석된 제2 컬럼 용리액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함한다.

일부 양태에서, 단계 (b) 및/또는 단계 (f) 및/또는 단계 (h)의 농축은, 임의로 접선 유동 여과에 의해, 초미세여과/정용여과에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 농축은 수확된 세포 및 세포 배양 상청액의 부피를 약 2-10배만큼 감소시킨다. 특정 구체예에서, 단계 (f)의 농축은 컬럼 용리액의 부피를 약 5-20배만큼 감소시킨다. 일부 양태에서, 단계 (a)에서 생산된 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 농축된 수확물의 용해는 미세유동화에 의해 수행된다.

특정 구체예에서, 단계 (b) 이후 그리고 단계 (c) 전에, 상기 방법은 단계 (b)(i)를 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (b)(i)는 용해물 중 오염성 핵산을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)(i)는 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 오염성 핵산을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 벤조나제를 포함한다.

일부 구체예에서, 단계 (e)의 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 여과하는 것은 약 0.1부터 0.8 미크론까지의 기공 직경을 갖는 필터를 통해 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (e)의 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 희석하는 것은 완충된 아세테이트 수용액을 사용한다.

일부 구체예에서, 단계 (g)의 제2 컬럼 용리액의 희석은 완충된 아세테이트 수용액을 사용한다. 특정 구체예에서, 완충된 아세테이트 수용액은 약 4.0부터 7.0까지의 pH를 갖는다.

일부 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 계면활성제로 제형화되어 AAV 벡터 제형을 생산한다. 특정 구체예에서, 단계 (i)로부터 생성된 rAAV 벡터 입자는 계면활성제와 함께 제형화되어 AAV 벡터 제형을 생산한다.

일부 구체예에서, 단계 (f)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 조절된 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (f)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 컬럼으로부터 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 PEG 용액으로 컬럼을 세척하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, PEG 용액 중 PEG는 약 1,000부터 50,000까지 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 단계 (e)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 수용액으로 컬럼을 세척하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (h)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 용액으로 컬럼을 세척하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, PEG 용액 및/또는 계면활성제 용액은 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 또는 수성 포스페이트/NaCl 완충제를 포함한다. 특정 구체예에서, NaCl 완충제는 약 20부터 250 mM까지의 NaCl, 또는 약 50부터 200 mM까지의 NaCl을 포함한다.

일부 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 중 단계 (f)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼으로부터 용리된다. 특정 구체예에서, Tris-Cl/NaCl 완충제는 50-200 mM NaCl을 포함한다. 특정 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 수성 포스페이트/NaCl 완충제 중 단계 (h)의 양이온 또는 음이온 교환 컬럼으로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 포스페이트/NaCl 완충제는 약 100부터 500 mM까지의 NaCl을 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (f)의 양이온 교환 컬럼은 4차 암모늄 작용기를 포함한다. 특정 구체예에서, 4차 암모늄 작용기는 4차화된 폴리에틸렌이민을 포함한다.

특정 구체예에서, 예를 들어, 단계 (g)의 크기 배제 컬럼은 약 10,000부터 600,000까지의 분리 범위(분자량)을 갖는다. 일부 구체예에서, 단계 (h)의 양이온 교환 컬럼은 설폰산을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (h)의 양이온 교환 컬럼은 설포프로필을 포함한다.

특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 세슘 클로라이드 구배 초원심분리의 단계를 배제한다.

특정 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모생식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함한다.

일부 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β, 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함한다.

특정 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노석시네이트 합성효소, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, RPE65, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 막횡단 조절제(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 선천성 대사 이상의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV 벡터 입자는 인자 VIII 또는 인자 IX를 인코딩하는 트랜스진을 포함한다.

특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 단계 (a)에서 생산된 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 농축된 수확물로부터 총 rAAV 벡터 입자의 약 40-70%를 회수한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 AAV 친화성 컬럼 정제에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 음이온 교환 컬럼 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 음이온 교환 컬럼 및 양이온 교환 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산한다.

특정 양태에서, rAAV 벡터 입자(예를 들어, 본래의 rAAV 벡터 입자)는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10, AAV tyr^-3, (3YAF, 예를 들어, US 8,445,267 참조) 세포 표적화 펩티드와 같이, 펩티드 변형을 갖는 AAV캡시드로 구성된 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래된다.

일부 양태에서, 본래의 rAAV 벡터 입자는 마지막(예를 들어, 단계 (h)의 제3 컬럼 용리액)에 약 100 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 양태에서, 본래의 rAAV 벡터 입자는 마지막(예를 들어, 단계 (h)의 제3 컬럼 용리액)에 mL 당 10¹⁵개 입자, 또는 그 초과, mL 당 10¹⁶개 입자, 또는 그 초과, 또는, 예를 들어, mL 당 10¹⁷개 입자, 또는 그 초과의 농도로 존재한다.

도 1은 음이온, 겔 여과(크기 배제) 및 양이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 대표적인 모든 컬럼 AAV 정제 계획을 보여준다. AIEX- 음이온 교환 크로마토그래피; UF/DF- 초미세여과/정용여과; SEC- 크기 배제 크로마토그래피; 및 CIEX, 양이온 교환 크로마토그래피. 계획은 역순으로 수행될 수도 있다.
도 2는 컬럼-기반 AAV 정제 공정을 개발하기 위한 다양한 설계 옵션을 보여준다.
도 3은 4개(1-4)의 상이한 정제 계획에 의한 AAV 정제의 비교 결과를 보여준다: (1) AVB(항체-기반 AAV 친화성 컬럼); 및 상이한 컬럼의 조합, 즉 (2) AIEX 및 CIEX와 함께 AVB(AAV 친화성 컬럼); (3) AIEX와 함께 AVB(AAV 친화성 컬럼); 및 (4) SEC-크기 배제 및 CIEX 크로마토그래피와 함께 AIEX. 결과는 불순물이 계획 (1) 및 (2)보다 정제 계획 (4)에서 적고, 계획 (3)보다 적을 수도 있음을 보여준다. UF/DF- 초미세여과/정용여과는 도시된 바와 같이 농축을 위해 사용되었지만, 임의로 컬럼 AAV 정제 계획에 포함된다.

상세한 설명

본 발명은 현재의 '산업-표준' 확장 가능한 AAV 벡터 정제 공정과 구별되는 독특한 특징을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(rAAV) 벡터 정제 플랫폼을 제공한다: 1) 공정 불순물 및 생산 관련 불순물의 제거를 포함하는, 상이한 AAV 벡터 혈청형/캡시드 변이체의 정제에 사용될 수 있는 모듈식 플랫폼 공정. 2) rAAV 벡터의 많은 상이한 혈청형/슈도형을 정제하기 위해 예기치 않은 확장 가능성을 제공하는 공정 단계 및 크로마토그래피 단계의 독특한 조합.

불순물은 단백질, 핵산(예를 들어, DNA), AAV 벡터와 별개인 불순물인 세포내 및 막 구성요소와 같은 세포 구성요소를 포함하는 AAV 벡터 생산 관련 불순물을 포함한다. 용어 "벡터-생산 관련 불순물"은 AAV 생산 과정 동안 방출되는 임의의 구성요소를 지칭한다.

본래의 AAV 벡터는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 이종성 핵산(예를 들어, 트랜스진)을 포함하는 AAV 벡터 입자를 지칭한다. 상기 어구는 빈 AAV 캡시드, 패키징된 유전체에 완전한 삽입체가 없는 AAV 벡터 또는 오염성 숙주 세포 핵산을 함유하는 AAV 벡터를 배제한다. 특정 구체예에서, 본래의 AAV 벡터는 패키징된 벡터 유전체에 또한 오염성 플라스미드 서열이 없는 AAV 벡터 입자를 지칭한다.

"빈 캡시드" 및 "빈 입자"는 AAV 캡시드 껍질을 포함하지만 AAV ITR에 의해 한쪽 또는 양쪽에 측접한 이종성 핵산 서열을 포함하는 유전체가 전체적으로 또는 부분적으로 없는 AAV 입자 또는 비리온을 지칭한다. 그러한 빈 캡시드는 이종성 핵산 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내의 세포로 전달하는 기능을 하지 못한다.

용어 "벡터"는 소형 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터), 또는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 다른 비히클을 지칭한다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입/전달하고, 삽입된 폴리뉴클레오티드를 세포에서 전사 또는 번역하기 위해, 유전자 조작(즉, "클로닝 벡터")에 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 벡터이다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서 증식을 위한 복제 기점 및 임의로 추가 요소, 예를 들어, 이종성 핵산 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, 역전된 말단 반복부(ITR), 임의의 선택 가능한 마커, 폴리아데닐화 신호를 함유한다.

AAV 벡터는 아데노-관련 바이러스로부터 유래된다. AAV 벡터는 세포에 침투하고 핵산/유전 물질을 도입하여 핵산/유전 물질이 세포 내에서 안정하게 유지될 수 있도록 하기 때문에 유전자 치료 벡터로서 유용하다. 또한, 이러한 바이러스는 핵산/유전 물질을 특정 부위, 이를 테면, 예를 들어, 염색체 19 상의 특정 부위에 도입할 수 있다. AAV가 인간의 병원성 질환과 관련이 없기 때문에, AAV 벡터는 실질적인 AAV 발병 또는 질환을 일으키지 않으면서 이종성 핵산 서열(예를 들어, 치료용 단백질 및 제제)을 인간 환자에게 전달할 수 있다.

벡터, 예를 들어, rAAV 벡터의 수식어, 뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. 재조합 AAV 벡터의 특정 예는 야생형 AAV 유전체에 정상적으로 존재하지 않는 핵산이 바이러스 유전체 내에 삽입된 경우일 것이다. 예는 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 유전자)이, 유전자가 AAV 유전체 내에 정상적으로 결합되어 있는 5 ', 3' 및/또는 인트론 영역을 갖거나 갖지 않는 벡터 내로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 AAV 벡터, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, AAV 벡터를 포함하는 재조합 형태, 폴리뉴클레오티드 등은 임의의 그러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.

"rAAV 벡터"는 AAV 유전체로부터 야생형 유전체를 제거하기 위해 분자 방법을 사용함에 의해, 및 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산과 같은 비-천연(이종성) 핵산으로 대체함에 의해, AAV와 같은 바이러스의 야생형 유전체로부터 유래된다. 전형적으로, AAV의 경우, 하나 또는 둘 모두의 AAV 유전체의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열이 rAAV 벡터에서 보유된다. rAAV는, 예를 들어, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산을 갖는 AAV 유전체 핵산에 대해 AAV 유전체의 전부 또는 일부가 비-천연 서열로 대체되었기 때문에 AAV 유전체와 구별된다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 AAV를 "재조합" AAV 벡터로서 정의하며, 이는 "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다.

재조합 AAV 벡터 서열은 패키징될 수 있고- 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 본원에서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 캡시드화되거나 AAV 입자로 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV" 또는 "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"으로도 지칭될 수 있다. 그러한 rAAV, rAAV 입자 및 rAAV 비리온은 벡터 유전체를 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는, AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.

벡터 "유전체"는 rAAV 입자를 형성하기 위해 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 플라스미드 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 AAV 벡터를 작제 또는 제조하는데 사용되는 경우, AAV 벡터 유전체는 재조합 플라스미드의 벡터 유전체 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비 벡터 유전체 부분은 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하지만, 자체적으로 rAAV 입자로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 "플라스미드 백본"으로 지칭된다. 따라서, 벡터 "유전체"는 rAAV에 의해 패키징되거나 캡시드화된 핵산을 지칭한다.

"AAV 헬퍼 기능"은 AAV 유전자 생성물 및 차례로 증식성 AAV 복제 및 패키징을 위해 트랜스로 기능하는 AAV 벡터를 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV-유래된 코딩 서열(단백질)을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV 열린 해독틀(ORF)인 rep 및 cap 둘 모두를 포함한다. Rep 발현 생성물은 특히 AAV의 DNA 복제의 기점의 인지, 결합 및 니킹(nicking); DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사의 조절을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다. Cap 발현 생성물(캡시드)은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터 유전체에서 누락된 AAV 기능을 트랜스로 보완하는데 사용된다.

"AAV 헬퍼 작제물"은 일반적으로, 예를 들어, 대상체에 대한 유전자 요법에 의해, 관심 핵산 서열의 전달을 위해 형질도입 AAV 벡터를 생산하는데 사용되는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. AAV 헬퍼 작제물은 일반적으로 AAV 벡터 복제에 필요한 누락된 AAV 기능을 보충하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적인 발현을 제공하기 위해 이용된다. 헬퍼 작제물은 일반적으로 AAV ITR이 결여되어 있으며, 자신이 복제되거나 패키징될 수 없다. AAV 헬퍼 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태로 존재할 수 있다. 둘 모두의 Rep 및 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945)] 참조). Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 5,139,941호 및 6,376,237호 참조).

용어 "부속 기능"은 AAV가 복제에 의존성인 비-AAV 유래된 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다. 상기 용어는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 패키징과 관련된 모이어티를 포함하는 AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA를 포함한다. 바이러스-기반 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 타입-1이 아님) 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.

"부속 기능 벡터"는 일반적으로 부속 기능을 제공하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 그러한 서열은 부속 기능 벡터 상에 존재할 수 있고, 적합한 숙주 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다. 부속 기능 벡터는 숙주 세포에서 rAAV 비리온 생산을 지지할 수 있다. 부속 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존 또는 코스미드의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 아데노바이러스 유전자의 완전한-보체는 부속 기능에 필요하지 않다. 예를 들어, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이체는 AAV 복제에 허용된다고 보고되어 있다(Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317). 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이체는 AAV 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 E2B 및 E3 영역이 아마도 부속 기능을 제공하는데 관련되지 않음을 나타낸다(Carter et al., (1983) Virology 126:505). E1 영역에 결함이 있거나, 결실된 E4 영역을 갖는 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지할 수 없다. 따라서, E1A 및 E4 영역은 직접적으로 또는 간접적으로 AAV 복제에 필수적인 것으로 보인다(Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505). 다른 특성화된 아데노바이러스 돌연변이체는 다음을 포함한다: E1B(Laughlin et al. (1982), 상기; Janik et al. (1981), 상기; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A(Handa et al., (1975) J. Gen.Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B(Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3(Carter et al. (1983), 상기); 및 E4(Carter et al.(1983), 상기; Carter (1995)). E1B 코딩 영역에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스가 제공하는 부속 기능의 연구는 상반된 결과를 가져 왔지만, E1B55k는 AAV 비리온 생산에 필요할 수 있는 반면 E1B19k는 그렇지 않다(Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210). 또한, 국제 공개 공보 WO 97/17458호 및 문헌[Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945]은 다양한 아데노바이러스 유전자를 인코딩하는 부속 기능 벡터를 기재하고 있다. 예시적인 부속 기능 벡터는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 무손상 E1B55k 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다. 그러한 부속 기능 벡터는, 예를 들어, 국제 공개 공보 WO 01/83797호에 기술되어 있다.

본원에 사용된 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형으로부터 혈청학적으로 별개인 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하는데 사용되는 차이이다. 혈청학적 특수성은 다른 AAV에 비해 한 AAV에 대한 항체 간의 교차-반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 교차-반응성의 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원성 결정인자(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이 때문)의 차이 때문이다.

기존의 정의에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성에 대해 기존의 모든 및 특성화된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 검사를 받았고 관심 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형 중 임의의 것과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학 검사는 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형을 갖는지를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이 바이러스에 대해 여전히 수행되어야 한다. 따라서, 편의상 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 별개인 바이러스(예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 주어진 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 별개가 아닌 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 광범위하게 지칭한다.

rAAV 벡터는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자(캡시드)는, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11과 같은 임의의 AAV 혈청형에 기반할 수 있다. 그러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)에 기반할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 한 혈청형 유전체에 기반한 rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자(캡시드)는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체는 벡터 유전체를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 별개인 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 유전체에 기반할 수 있고, 이 경우에 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 이의 변이체일 수 있었다. 따라서, rAAV 벡터는 특정 혈청형 뿐만 아니라 혼합된 혈청형에 특징적인 유전자/단백질 서열과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다.

다양한 예시적인 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 캡시드 단백질과 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 캡시드서열을 포함하거나 이로 구성된다. 다양한 예시적인 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 ITR(들)과 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11과 같은 rAAV, 및 변이체, 하이브리드 및 키메라 서열은 하나 이상의 기능적 AAV ITR 서열에 측접한 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(트랜스진)을 포함하기 위해 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 그러한 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 야생형 AAV 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 구제, 복제, 및 rAAV 벡터 입자로의 재조합 벡터의 패키징에 필요한 적어도 하나의 기능적 측접 ITR 서열(들)을 보유한다. 따라서, rAAV 벡터 유전체는 복제 및 패키징(예를 들어, 기능적 ITR 서열)을 위해 필요한 서열을 시스로(in cis) 포함할 것이다.

용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 핵산은 유전체 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 마이크로RNA (miRNA), 작거나 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 핵산은 자연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 단일, 이중, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산을 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규정에 따라 본원에 기술될 수 있다.

"이종성" 핵산 서열은 세포로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개 이동/전달을 목적으로 AAV 플라스미드 또는 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종성 핵산 서열은 AAV 핵산과 별개이며, 즉, AAV 핵산에 대해 비-천연이다. 일단 세포 내로 이동/전달되면, 벡터 내에 함유된 이종성 핵산 서열은 발현될 수 있다(예를 들어, 전사되고, 적절한 경우 번역됨). 대안적으로, 벡터 내에 함유된 세포의 이동/전달된 이종성 폴리뉴클레오티드는 발현될 필요가 없다. 용어 "이종성"은 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 언급은 심지어 수식어 "이종성"의 부재시에도 생략에도 불구하고 이종성 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다.

"핵산 서열"에 의해 인코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열을 포함함은 물론, 하위서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 단백질의 어느 정도의 기능을 보유하는 한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 핵산 서열에 의해 인코딩되는 그러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 그의 발현이 불충분하거나, 또는 처리된 포유동물에서 결핍인 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.

"트랜스진"은 본원에서 세포 또는 유기체에 도입하고자 하거나 도입된 핵산(예를 들어, 이종성)을 편리하게 지칭하는데 사용된다. 트랜스진은 임의의 핵산, 예를 들어, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다.

트랜스진을 갖는 세포에서, 트랜스진은 플라스미드 또는 AAV 벡터, 세포의 "형질도입" 또는 "트랜스펙션"에 의해 도입/전달되었다. 용어 "형질도입" 및 "트랜스펙션"은 핵산과 같은 분자를 숙주 세포(예를 들어, HEK293) 또는 유기체의 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 트랜스진은 수용 세포의 유전체 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 핵산이 수용 세포 또는 유기체의 핵산(유전체 DNA)에 통합되는 경우, 이는 그 세포 또는 유기체에 안정하게 유지될 수 있고 추가로 수용 세포 또는 유기체의 세포의 자손 세포 또는 유기체에 전달되거나 유전될 수 있다.

"숙주 세포"는, 예를 들어, AAV 벡터 플라스미드, AAV 헬퍼 작제물, 부속 기능 벡터, 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 나타낸다. 상기 용어는 트랜스펙션된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 지칭한다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태 또는 유전체 또는 전체 DNA 보체에서 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다. 예시적인 숙주 세포는 HEK293과 같은 인간 배아 신장(HEK) 세포를 포함한다.

"형질도입된 세포"는 트랜스진이 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포는 외인성 분자, 예를 들어, 핵산(예를 들어, 트랜스진)이 세포 내로 혼입된 후에 세포에서의 유전적 변화를 의미한다. 따라서, "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 도입된 세포 또는 그 자손이다. 세포(들)는 증식(배양)될 수 있고 도입된 단백질은 발현되거나 핵산은 전사되거나 rAAV와 같은 벡터는 세포에 의해 생산될 수 있다. 유전자 치료 용도 및 방법을 위해, 형질도입된 세포는 대상체에 존재할 수 있다.

본원에 사용된 대로, 세포와 관련하여 용어 "안정한", 또는 "안정하게 통합된"은 선택 가능한 마커 또는 이종성 핵산 서열과 같은 핵산 서열, 또는 플라스미드 또는 벡터가 염색체(예를 들어, 상동성 재조합, 비-상동성 말단 접합, 트랜스펙션 등에 의해)에 삽입되었거나 수용 세포 또는 숙주 유기체 내에 염색체 외에서 유지되고, 염색체 내에 남아 있거나 일정 기간 동안 염색체 외에서 유지되는 것을 의미한다. 배양 세포의 경우, 이종성 핵산 서열과 같은 핵산 서열, 또는 플라스미드 또는 벡터는 염색체에 삽입되었고, 복수의 세포 계대 과정 동안 유지될 수 있다.

"세포주"는 적절한 배양 조건 하에 시험관 내에서 연속적 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포 집단을 지칭한다. 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클론 집단일 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 세포주에서, 자발적 또는 유도된 변화는 조직 배양에서의 장기간의 계대배양 뿐만 아니라 그러한 클론 집단의 저장 또는 이동 중에 핵형에서 발생할 수 있다. 따라서, 세포주로부터 유래된 자손 세포는 조상 세포 또는 배양액과 정확하게 동일하지 않을 수 있다. 본 발명의 정제 방법에 적용될 수 있는 예시적인 세포주는 HEK293이다.

"발현 조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 주는 핵산 서열(들)을 지칭한다. 프로모터 및 인핸서와 같이 본원에 기재된 바와 같은 발현 조절 요소를 포함하는 조절 요소. rAAV 벡터는 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 그러한 요소는 적당한 이종성 폴리뉴클레오티드 전사 및 적절한 경우 번역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 인-프레임(in-frame) 번역을 허용하는 유전자의 정확한 해독틀의 유지, 및 정지 코돈 등)을 촉진하기 위해 포함된다. 그러한 요소는 전형적으로 시스로 작용하여 "시스 작용성" 요소로서 지칭되지만, 트랜스(in trans)로도 작용할 수 있다.

발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사된 핵산의 5' 말단(즉, "상류") 근처에 나란히 놓인다. 발현 조절 요소는 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, "하류")에 또는 전사체 내에(예를 들어, 인트론에) 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열에 인접하여 또는 그로부터 떨어져(예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500, 또는 그 초과의 뉴클레오티드), 심지어 상당한 거리에 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, rAAV 벡터의 길이 제한 때문에, 발현 조절 요소는 전형적으로 전사된 핵산으로부터 1 내지 1000개 뉴클레오티드 내에 있을 것이다.

기능적으로, 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현은 요소가 핵산의 전사 및, 적절하게는 전사체의 번역을 조절하도록 그 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 적어도 부분적으로 조절 가능하다. 발현 조절 요소의 구체적인 예는 전사된 서열의 5'에 일반적으로 위치하는 프로모터이다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현된 양과 비교하여 작동 가능하게 연결된 핵산으로부터 발현되는 양을 증가시킨다.

본원에서 사용되는 "인핸서"는 선택 가능한 마커 또는 이종성 핵산 서열과 같은 핵산 서열에 인접하여 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하지만 또한 기능하고 서열의 하류 또는 서열 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는, 예를 들어, 선택 가능한 마커, 및/또는 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍 내의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 프로모터 요소에 의해 제공되는 발현 이상으로 증가시킨다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 핵산 서열의 발현을 달성하도록 서열에 대해 적절한 위치에 놓이는 것을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 종종 발현 벡터, 예를 들어, rAAV 벡터 내의 핵산 서열 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)의 배치에 적용된다.

핵산과 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소의 예에서, 조절 요소는 핵산의 발현을 조절하는 관계에 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 2개의 DNA가 배치되어 있음을 의미한다(시스 또는 트랜스).

따라서, 벡터에 대한 추가적인 요소는, 비제한적으로, 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 정지 코돈, 서열에 측접한 5' 또는 3' 비번역된 영역(예를 들어, 폴리아데닐화(polyA) 서열), 예를 들어, AAV ITR 서열의 하나 이상의 복사체, 또는 인트론을 포함한다.

추가의 요소는, 예를 들어, 패키징을 개선시키고 오염 핵산의 존재를 감소시키기 위한, 예를 들어, 충전제 또는 스터퍼(stuffer) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. AAV 벡터는 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb, 또는 약간 더 큰 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입체를 전형적으로 허용한다. 따라서, 보다 짧은 서열의 경우, rAAV 입자 내로의 벡터 패키징에 허용되는 바이러스 유전체 서열의 정상 크기 또는 그에 가까운 길이로 조절하기 위해 스터퍼 또는 충전제를 포함시킨다. 다양한 구체예에서, 충전제/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역된(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. 4.7Kb 미만의 핵산 서열에 있어서, 충전제 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 서열과 결합(예를 들어, 벡터 내로 삽입)될 때 총 길이가 약 3.0-5.5Kb, 또는 약 4.0-5.0Kb, 또는 약 4.3-4.8Kb가 되는 길이를 갖는다.

한 구체예에서 "치료용 단백질"은 세포 또는 대상체에서 단백질의 불충분한 양, 부재 또는 결함에서 초래된 증상을 경감시키거나 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질이다. 트랜스진에 의해 인코딩된 "치료용" 단백질은, 예를 들어, 유전적 결함을 교정하고, 유전자(발현 또는 기능) 결핍 등을 교정하기 위해, 대상체에 이익을 줄 수 있다.

본 발명에 따른 유용한 유전자 생성물(예를 들어, 치료용 단백질)을 인코딩하는 이종성 핵산의 비제한적인 예는 "지혈" 또는 혈액 응고 장애, 예를 들어, 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A 환자, 혈우병 B, 응고 인자 VII, VIII, IX 및 X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자의 결핍, 복합 FV/FVIII 결핍, 지중해빈혈, 비타민 K 에폭사이드 환원효소 C1 결핍, 감마-카르복실라제 결핍; 빈혈, 외상과 관련된 출혈, 상해, 혈전증, 저혈소판증, 뇌졸중, 응고병증, 파종 혈관내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 펜타사카라이드, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제)와 관련된 과-항응고; 및 혈소판 장애, 예를 들어, 베르나르 술리에 증후군, 글랜즈먼 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 및 저장풀 결핍증을 비제한적으로 포함하는 질병 또는 장애의 치료에 이용될 수 있는 것들을 포함한다.

핵산 분자, 클로닝, 발현 벡터와 같은 벡터(예를 들어, 벡터 유전체) 및 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 이용 가능성은 다양한 수단에 의해 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, 벡터 및 플라스미드를 포함하는 인자 IX(FIX)를 인코딩하는 이종성 핵산은 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 세포 발현 또는 시험관 내 번역 및 화학 합성 기술을 통해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 등에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 사용하여 핵산을 분리할 수 있다. 그러한 기술은 비제한적으로 (1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 유전체 DNA 또는 cDNA 라이브러리와 프로브의 하이브리드화; (2) 공유된 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하기 위한, 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용한 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용한 유전체 DNA 또는 cDNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 감산된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝을 포함한다.

용어 "분리된"은 조성물의 수식어로 사용될 때, 조성물이 사람의 손에 의해 만들어지거나 이들의 자연 발생 생체 내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리되는 것을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물은 자연 상태에서 이들이 정상적으로 결합하는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수확물, 세포막을 실질적으로 갖지 않는다.

단백질과 관련하여, 용어 "분리된 단백질" 또는 "분리되고 정제된 단백질"은 때때로 본원에서 사용된다. 이 용어는 주로 핵산 분자의 발현에 의해 생산된 단백질을 지칭한다. 대안적으로, 이 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연적으로 결합될 다른 단백질로부터 충분히 분리된 단백질을 지칭할 수 있다.

용어 "분리된"은 사람의 손에 의해 생산된 조합, 예를 들어, 재조합 rAAV 및 약학적 제형을 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한 하이브리드/키메라, 다합체/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 당화, 지질화) 또는 유도체화 형태, 또는 사람의 손에 의해 생산된 숙주 세포에서 발현된 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다.

용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50-60 중량%의 관심 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 포함하는 제조물을 지칭한다. 제조물은 적어도 75 중량%, 또는 약 90-99 중량%의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 순도는 관심 화합물에 적절한 방법에 의해 측정된다(예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등).

특정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 언급할 때 "본질적으로 구성된"이라는 어구는 주어진 서열의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때, 상기 어구는 서열 자체 및 서열의 기본적이고 신규한 특징에 영향을 미치지 않을 분자 변형을 포함한다.

rAAV 비리온을 생성하기 위해 당업계에 공지된 방법: 예를 들어, 한 AAV 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 백시니아 바이러스)에 의한 동시감염과 함께 AAV 벡터 및 AAV 헬퍼 서열을 이용한 트랜스펙션 또는 재조합 AAV 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 및 부속 기능 벡터에 의한 트랜스펙션. rAAV 비리온을 생성하기 위한 비제한적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 6,001,650호 및 6,004,797호에 기술되어 있다. 재조합 rAAV 벡터 생산(즉, 세포 배양 시스템에서의 벡터 생성) 이후, rAAV 비리온은 숙주 세포 및 세포 배양 상청액으로부터 수득되고 본원에 기재된 대로 정제될 수 있다.

초기 단계로서, 임의로 rAAV 비리온을 생산하는 숙주 세포가 배양된 세포 배양 상청액을 수확하는 것과 함께, 전형적으로 rAAV 비리온을 생산하는 숙주 세포를 수확할 수 있다. 본원의 방법에서, 수확된 세포 및 임의로 세포 배양 상청액은 적절한 경우 그대로 사용되거나, 농축될 수 있다. 추가로, 감염이 부속 기능을 발현시키기 위해 이용되는 경우, 잔류 헬퍼 바이러스는 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 약 60℃의 온도로, 예를 들어, 20분 이상 동안 가열함에 의해 비활성화될 수 있고, 이는 AAV가 열 안정한 반면 헬퍼 아데노바이러스가 열 불안정하므로 헬퍼 바이러스만 비활성화시킨다.

상청액 및 수확물의 세포는, 예를 들어, 미세유동화에 의해, 세포를 파괴시킴에 의해 용해되어 rAAV 입자를 방출시킨다. 후속하여, 오염성 DNA를 분해하기 위해 벤조나제와 같은 뉴클레아제를 첨가할 수 있다. 전형적으로, 생성된 용해물은 여과, 원심분리시키는 것과 같이 세포 파편을 제거하기 위해 정화되어 정화된 세포 용해물을 제공한다. 특정 예에서, 용해물을 미크론 직경 기공 크기 필터(예를 들어, 0.45 μm 및/또는 0.2 μm 필터를 통해)로 여과하여 정화된 용해물을 생산한다.

정화된 용해물은 세포 단백질, 지질 및/또는 핵산을 포함할 수 있는 숙주 세포로부터의 가용성 세포 구성요소, 및 세포 배양 배지 구성요소와 같은 AAV 벡터 생산 관련 불순물 및 AAV 입자(본래의 rAAV 벡터, 및 AAV 빈 캡시드)를 함유한다. 이후 정화된 용해물은 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 AAV 입자(본래의 rAAV 벡터 포함)를 정제하기 위한 추가 정제 단계를 거친다. 정화된 용해물은 크로마토그래피의 첫 번째 단계 전에 적절한 완충제로 희석될 수 있다.

복수의 순차적 크로마토그래피 단계는 전형적으로 rAAV 입자를 정제하는데 사용된다. 그러한 방법은 전형적으로 세슘 클로라이드 구배 초원심분리의 단계를 배제한다.

본원에 개시된 바와 같이, 제1 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 제1 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피인 경우, 제3 크로마토 그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 따라서, 한 rAAV 정제 방법에서, 정제는 음이온 교환 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피를 통한 정제, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제에 의해 수행된다.

제1 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피인 경우, 제3 크로마토 그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 따라서, 또 다른 rAAV 정제 방법에서, 정제는 양이온 교환 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피를 통한 정제, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제에 의해 수행된다.

음이온 교환 크로마토그래피는 정화된 용해물 및/또는 크기 배제 크로마토그래피로부터의 컬럼 용리액에 존재하는 단백질, 세포 및 다른 구성요소로부터 AAV 입자를 분리하는 기능을 한다. 음이온 교환 수지는 폴리아민 수지 및 다른 수지에 기반하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 강 음이온 교환 수지의 예는 트리알킬벤질 암모늄 수지와 같은 4차 암모늄 염 수지를 비제한적으로 포함하는 4차화된 질소 원자에 일반적으로 기반한 것들을 포함한다. 적합한 교환 크로마토그래피는 비제한적으로 MACRO PREP Q(BioRad로부터 이용 가능한 강 음이온-교환기, Hercules, Calif.); UNOSPHERE Q(BioRad로부터 이용 가능한 강 음이온-교환기, Hercules, Calif.); POROS 50HQ(Applied Biosystems로부터 이용 가능한 강 음이온-교환기, Foster City, Calif.); POROS 50D(Applied Biosystems로부터 이용 가능한 약 음이온-교환기, Foster City, Calif.); POROS 50PI(Applied Biosystems로부터 이용 가능한 약 음이온-교환기, Foster City, Calif.); SOURCE 30Q(Amersham Biosciences로부터 이용 가능한 강 음이온-교환기, Piscataway, N.J.); DEAE SEPHAROSE(Amersham Biosciences로부터 이용 가능한 약 음이온-교환기, Piscataway, N.J.); Q SEPHAROSE(Amersham Biosciences로부터 이용 가능한 강 음이온-교환기, Piscataway, N.J.)를 포함한다. 추가의 예시적인 음이온 교환 수지는 아미노에틸(AE), 디에틸아미노에틸(DEAE), 디에틸아미노프로필(DEPE) 및 4차 아미노 에틸(QAE)을 포함한다.

양이온 교환 크로마토그래피는 정화된 용해물 및/또는 크기 배제 크로마토그래피로부터의 컬럼 용리액에 존재하는 세포 및 다른 구성요소로부터 AAV 입자를 추가로 분리하는 기능을 한다. 광범위한 pH 범위에 걸쳐 rAAV 비리온에 결합할 수 있는 강 양이온 교환 수지의 예는 아릴 및 알킬 치환된 설포네이트, 예를 들어, 설포프로필 또는 설포에틸 수지를 포함하여, 설포네이트 작용기의 존재에 의해 지시되는 임의의 설폰산 기반 수지를 비제한적으로 포함한다. 대표적인 매트릭스는 비제한적으로 POROS HS, POROS HS 50, POROS SP, POROS S(Applied Biosystems로부터 이용 가능한 강 양이온 교환기, Foster City, Calif.)를 포함한다. 추가의 예는 Aldrich Chemical Company(Milliwaukee, WI)로부터 이용 가능한 상업적 DOWEX®, AMBERLITE®, 및 AMBERLYST® 패밀리의 수지를 포함한다. 약 양이온 교환 수지는 비제한적으로 임의의 카르복실산 기반 수지를 포함한다. 예시적인 양이온 교환 수지는 카르복시메틸(CM), 포스포(포스페이트 작용기에 기반함), 메틸 설포네이트(S) 및 설포프로필(SP) 수지를 포함한다.

양이온 교환, 음이온 교환 및 크기 배제와 같은 크로마토그래피 매질은 평형화되고, 세척되고, pH 및 완충제 부피와 같은 다양한 조건 하에 다양한 완충제로 용리될 수 있다. 다음은 특정 비제한적인 예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.

양이온 교환 크로마토그래피는 표준 완충제를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 평형화될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 매질은 아세테이트 완충제, 5 내지 50 mM, 또는 10-40 mM, 예를 들어, 10-30 mM, 및 소듐 클로라이드로 평형화될 수 있다. 평형화 후, 이어서 샘플을 로딩한다. 후속하여, 크로마토그래피 매질은 적어도 1회, 또는 그 초과, 예를 들어, 2-5회 세척된다. 크로마토그래피 매질로부터의 용리는 적어도 1회는 고염 완충제에 의한 것이지만, 용리는 동일하거나 더 높은 염 완충제로 2회 이상일 수 있다.

양이온 교환 크로마토그래피의 경우 세척 및 용리를 위한 전형적인 평형화 완충제 및 용액은 약 pH 3 내지 pH 8, 보다 전형적으로는 약 pH 4 내지 pH 6, 예를 들어, pH 4.1, 4.2, 4.3, 4.4. 4.5- 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0의 적절한 pH 또는 언급된 범위 또는 그 사이의 임의의 pH이다.

양이온 교환 컬럼용 세척 및 용리를 위한 적절한 평형화 완충제 및 용액은 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 음이온성이다. 그러한 완충제는 비제한적으로 다음 완충제 이온을 갖는 완충제를 포함한다: 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 보레이트, 또는 설페이트.

한 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 매질이 먼저 평형화되고, 샘플이 적용되고, 저염 농도, 예를 들어, 10-100 mM의 NaCl, 예를 들어, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60-100 mM, 또는 이러한 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 농도로 세척된다. 샘플 적용 후, 크로마토그래피 매질은 불순물을 용리시키기 위해 보다 높은 NaCl 농도와 같은 보다 높은 염 농도로, 또는 보다 큰 이온 강도를 갖는 다른 완충제로 처리될 수 있다. 제2 완충제로서 사용하기 위한 한 가지 예는 NaCl 농도가 100 mM-200 mM이거나, 이러한 언급된 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 농도인 아세테이트 완충제이다. 추가의 불순물이 컬럼으로부터 용리된 후, AAV 입자를 용리시키기 위해, 완충제의 이온 강도는 NaCl, KCl, 설페이트, 포르메이트, 또는 아세테이트와 같은 염을 사용하여 증가되고, 회복될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피 매질 세척 용액에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함될 수 있다. 이것은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 조절된 컬럼 크로마토그래피로서 지칭된다. PEG 세척 용액은 AAV 벡터 입자가 용리되기 전에 음이온 교환 크로마토그래피 매질에 적용될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피의 경우 세척 및 용리를 위한 전형적인 평형화 완충제 및 용액은 약 pH 5 내지 pH 12, 보다 전형적으로 약 pH 6 내지 pH 10, 및 심지어 보다 전형적으로 약 pH 7 내지 pH 9.5, 예를 들어, pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4-8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5-9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5의 pH, 또는 언급된 범위 또는 그 사이의 임의의 pH인 것이 적절하다.

음이온 교환 컬럼용 세척 및 용리를 위한 적절한 평형화 완충제 및 용액은 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 자연에서 양이온성 또는 쌍이온성이다. 그러한 완충제는 비제한적으로 다음 완충제 이온을 갖는 완충제를 포함한다: N-메틸피페라진; 피페라진; Bis-Tris; Bis-Tris 프로판; 트리에탄올아민; Tris; N-메틸디에탄올아민; 1,3-디아미노프로판; 에탄올아민; 아세트산 등. 샘플을 용리시키기 위해, 출발 완충제의 이온 강도는 NaCl, KCl, 설페이트, 포르메이트 또는 아세테이트와 같은 염을 사용하여 증가된다.

한 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질이 먼저 평형화되고, 샘플이 적용되고, 저염 농도, 예를 들어, 10-100 mM의 NaCl, 예를 들어, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60-100 mM, 또는 이러한 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 농도로 세척된다. 샘플 적용 후, 크로마토그래피 매질은 불순물을 용리시키기 위해 보다 높은 NaCl 농도와 같은 보다 높은 염 농도로, 또는 보다 큰 이온 강도를 갖는 다른 완충제로 처리될 수 있다. 제2 완충제로서 사용하기 위한 한 가지 예는 NaCl 농도가 100 mM-200 mM이거나, 이러한 언급된 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 농도인 Tris-기반 완충제이다. 추가 불순물이 컬럼으로부터 용리된 후, AAV 입자는 보다 높은 농도의 염을 사용하여 회수될 수 있다.

전형적으로 그러한 세척 용액 중 PEG는 약 1,000부터 50,000까지 범위의 평균 분자량을 갖는다. 그러한 세척 용액 중의 PEG의 전형적인 양은 약 0.1% 내지 약 20% PEG 또는 이러한 언급된 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 양, 또는 약 1% 내지 약 10% PEG 또는 이러한 언급된 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 양의 범위이다.

크기-배제 크로마토그래피 매질은 표준 완충제를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 평형화될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 매질은, 예를 들어, 1 내지 5 mM, 5 내지 50 mM, 또는 5-25 mM의 포스페이트 완충제, 및 예를 들어, 25 내지 50 mM, 50 내지 100 mM, 100-150 mM 또는 125-175 mM의 소듐 클로라이드로 평형화될 수 있다.

평형화 후, 이어서 샘플을 로딩한다. 후속하여, AAV 입자를 함유하는 관통 흐름이 회수된다. AAV 입자 회수를 위해 크로마토그래피 매질 및/또는 컬럼 크기의 양에 기반한 추가 부피의 완충제(예를 들어, 포스페이트 완충제)가 첨가될 수 있다.

특정 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피 매질은 약 10,000부터 600,000까지의 분리 범위(분자량)를 갖는다. 크기 배제 크로마토그래피에 적절한 특정 수지(매질)는 비제한적으로 다공성 셀룰로스의 입자 또는 비드, 가교된 아가로스(Sepharose), 가교된 덱스트란(Sephadex), 스티렌-디비닐벤젠(Dianon HP-20), 폴리아크릴아미드(Bio Gel), 메타크릴산(Toyopearl), 및 제어된 기공 유리를 포함한다.

용리를 위한 완충제의 부피는 AAV 입자 회수를 달성하기 위해 크로마토그래피 매질의 양 및/또는 컬럼 크기에 기반할 수 있다. 전형적인 부피는 1-10 컬럼 부피이다.

컬럼 용리액은 각각의 크로마토그래피 단계로부터 용리(들)/관통 흐름 후에 수집된다. AAV는 260 및 280 nm에서 UV 흡수를 모니터하는 것과 같은 표준 기법을 사용하여 분획에서 검출될 수 있다.

양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 사용, 사용되는 매질의 특성(즉, 강 또는 약 이온 교환기) 및 염 농도, 사용된 완충제, 및 pH의 조건은 AAV 캡시드(즉, AAV 캡시드 혈청형 또는 슈도형)에 기반하여 달라질 수 있다. AAV 캡시드 구조는 전형적으로 크기 및 모양과 같은 특징을 공유하지만, 캡시드는 분자 토폴로지 및 표면 전하 분포의 미묘한 차이를 초래하는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 따라서, 캡시드 서열 변이체는 본 발명의 방법에 의해 정제가 가능할 것으로 기대되며, 상이한 조건이 AAV 캡시드 변이체에 대해 AAV 입자 정제를 위해 사용될 것인지를 결정하기 위해, 크로마토그래피 매질 및 완충제 스크리닝 연구를 사용하여 체계적인 방식으로 적절한 방법을 결정할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 임의의 음이온, 크기 배제, 또는 양이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 AAV 입자를 포함하는 용리액은, 요망되는 경우, 초미세여과/정용여과에 의해 효율적으로 농축될 수 있다. 부피의 감소는 당업자에 의해 제어될 수 있다. 특정 비제한적인 예에서, 달성된 부피 감소는 약 1부터 20배까지이다. 따라서, 1배 감소는 부피를 반으로 줄이며, 예를 들어, 1000 ml는 500 mL로 농축된다. 10배 감소는 부피를 10배만큼 감소시키고, 예를 들어, 2000 ml는 200 mL로 농축된다. 20배 감소는 부피를 20배만큼 감소시키고, 예를 들어, 2000 ml는 100 mL로 농축된다.

초미세여과/정용여과의 비제한적인 예는 접선 유동 여과(TFF)이다. 예를 들어, 100kDa 분자량 컷오프에 상응하는 공칭 기공 크기를 갖는 중공 사막은 더 큰 부피의 용리액에 존재할 때 다량의 AAV 벡터가 제조될 수 있게 한다.

본 발명의 방법은 AAV 입자의 실질적인 회수를 달성한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 수확된 숙주 세포 및 숙주 세포 배양 상청액으로부터 전체 rAAV 벡터 입자의 약 40-70%의 AAV 입자 회수를 달성한다. 또 다른 예에서, AAV 입자는 약 100 mg/mL의 농도로 최종(예를 들어, 제3 컬럼) 용리액에 존재한다. AAV 벡터 입자는 mL 당 10¹⁵개 입자, 또는 그 초과, mL 당 10¹⁶개 입자, mL 당 10¹⁷개 입자의 농도로 최종(예를 들어, 제3 컬럼) 용리액에 존재할 수 있다.

대안적으로, AAV 벡터 입자 농도가 낮다면, 정제된 AAV 입자를 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 정제된 AAV 입자는 초미세여과/정용여과(예를 들어, TFF)에 의해 mL 당 10¹⁵개 입자로 농축될 수 있다. 보다 높은 농도의 벡터가 요망되는 경우, 정제된 AAV 입자는 초미세여과/정용여과(예를 들어, TFF)에 의해 mL 당 10¹⁶개 입자, 또는 심지어 그보다 높게 농축될 수 있다.

모든 컬럼 크로마토그래피 공정에 의해 정화된 세포 용해물로부터 AAV 입자의 정제, 및 초미세여과/정용여과(예를 들어, TFF)에 의해 정제된 AAV 입자의 농축(필요한 경우)의 조합은 고도로 정제된 재조합 rAAV 벡터를 다량으로 제공한다.

다른 구체예에서, 패키징된 유전체(즉, 본래의 rAAV 벡터 입자)를 갖는 rAAV 비리온은 존재하는 비리온 중 적어도 약 60% 이상이 패키징된 유전체(즉, 본래의 rAAV 벡터 입자)를 갖는 rAAV 비리온일 때 "AAV-캡시드화된 핵산 불순물"이 "실질적으로 없다. AAV-캡시드화된 핵산 불순물이 실질적으로 없는 패키징된 유전체(즉, 본래의 rAAV 벡터 입자)를 갖는 rAAV 비리온의 생산은 AAV-캡시드화된 핵산 불순물을 포함하는 생성물의 약 40% 내지 약 20% 이하, 약 20% 내지 약 10% 이하, 약 10% 내지 약 5% 이하, 약 5% 내지 약 1% 이하 또는 1% 이하일 수 있다.

트랜스진을 함유하는 AAV 벡터의 감염성 역가를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Zhen et al., (2004) Hum. Gene Ther. (2004) 15:709)] 참조). 패키징된 유전체를 갖는 빈 캡시드 및 AAV 벡터 입자를 검정하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128)] 참조).

분해/변성된 캡시드를 결정하기 위해, 정제된 AAV는 3개의 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어, 구배 겔로 구성되고, 이후 샘플이 분리될 때까지 겔을 진행시키고, 겔을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막 위에 블롯팅시키는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리될 수 있다. 이어서, 항-AAV 캡시드 항체를 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 일차 항체로서 사용한다(예를 들어, 문헌[Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)] 참조). 일차 항체에 결합하는 이차 항체는 일차 항체를 검출하는 수단을 함유한다. 일차 항체 및 이차 항체 사이의 결합을 반-정량적으로 검출하여 캡시드의 양을 결정한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.

본원에 인용된 모든 출원, 공보, 특허 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 전체적으로 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.

본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, 핵산 서열, 벡터, rAAV 벡터 등)은 동등하거나 유사한 특징의 속의 예이다.

본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "AAV 벡터" 또는 "AAV 입자"에 대한 언급은 복수의 그러한 AAV 벡터 및 AAV 입자를 포함하고, "세포" 또는 "숙주 세포"에 대한 언급은 복수의 세포 및 숙주 세포를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 기준 값의 10%(플러스 또는 마이너스) 이내의 값을 의미한다.

본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 그러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등, 뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등을 포함한다.

초과(더 큰) 또는 미만에 의한 정수의 언급은 각각 참조 숫자보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 숫자 일(1)까지의 모든 99, 98, 97 등을 포함하고; 10 미만은 숫자 일(1)까지의 모든 9, 8, 7 등을 포함한다.

본원에 사용된 모든 수치 값 또는 범위는 포괄적이다. 추가로, 모든 수치 값 또는 범위는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 그러한 범위 내의 값 및 정수의 분수 및 그러한 범위 내의 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 1-10과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 최대 50 및 50을 포함하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등을 포함한다.

일련의 범위에 대한 언급은 계열 내의 다른 범위의 경계 값을 조합시킨 범위를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000-8,000, 또는 8,000-9,000의 일련의 범위에 대한 언급은 10-50, 50-100, 100-1,000, 1,000-3,000, 2,000-4,000 등의 범위를 포함한다.

본 발명은 본원에서 다수의 구체예 및 양태를 설명하기 위해 긍정적인 언어를 사용하여 일반적으로 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계는 배제된다. 따라서, 비록 본 발명이 본 발명에서 명백하게 배제되지 않은 양태를 포함하지 않는 것에 관하여 본 발명에서 일반적으로 표현되지는 않지만, 그럼에도 불구하고 본원에 개시된 것이다.

본 발명의 많은 구체예가 개시되었다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며, 다양한 용도 및 조건에 본 발명을 채용하기 위해 이를 다양하게 변형하고 수정할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.

Claims

재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터 입자를 정제하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
(a) rAAV 벡터 입자를 포함하는 세포 및/또는 세포 배양 상청액을 수확하여 수확물을 생산하는 단계;
(b) 임의로 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물을 농축시켜 농축된 수확물을 생산하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물을 용해시켜 용해물을 생산하는 단계;
(d) 용해물 중 오염성 핵산을 감소시키기 위해 단계 (c)에서 생산된 용해물을 처리함으로써 핵산 감소된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 생산된 상기 핵산 감소된 용해물을 여과시켜 정화된 용해물을 생산하고, 임의로 상기 정화된 용해물을 희석시켜 정화되고 희석된 용해물을 생산하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 생산된 상기 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 컬럼 용리액을 생산하고, 임의로 상기 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 컬럼 용리액을 생산하는 단계;
(g) 단계 (f)에서 생산된 상기 컬럼 용리액 또는 상기 농축된 컬럼 용리액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제2 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 상기 제2 컬럼 용리액을 희석시켜 희석된 제2 컬럼 용리액을 생산하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 생산된 상기 제2 컬럼 용리액 또는 상기 희석된 제2 컬럼 용리액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제3 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 또는 다른 생산 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 상기 제3 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 제3 컬럼 용리액을 생산하는 단계; 및
(i) 단계 (h)에서 생산된 상기 제3 컬럼 용리액 또는 상기 농축된 제3 컬럼 용리액을 여과시킴으로써 정제된 rAAV 벡터 입자를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b) 및/또는 단계 (f) 및/또는 단계 (h)의 상기 농축이 초미세여과/정용여과에 의해, 임의로 접선 유동 여과에 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)의 상기 농축이 상기 수확된 세포 및 세포 배양 상청액의 부피를 약 2-10배만큼 감소시키는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)의 상기 농축이 상기 컬럼 용리액의 부피를 약 5-20배만큼 감소시키는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물의 상기 용해가 미세유동화에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)가 뉴클레아제로 처리하여 오염성 핵산을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 뉴클레아제가 벤조나제를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (e)의 상기 정화된 용해물 또는 상기 정화되고 희석된 용해물의 상기 여과가 약 0.1부터 0.8 미크론까지의 기공 직경을 갖는 필터를 통해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (e)의 상기 정화된 용해물 또는 상기 정화되고 희석된 용해물의 상기 희석이 완충된 아세테이트 수용액을 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (g)의 상기 제2 컬럼 용리액의 상기 희석이 완충된 아세테이트 수용액을 사용하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 완충된 아세테이트 수용액이 약 4.0부터 7.0까지의 pH를 갖는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 단계 (i)로부터 생성된 상기 rAAV 벡터 입자가 계면활성제와 제형화되어 AAV 벡터 제형을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)의 상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 조절된 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 단계 (f)의 상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 PEG 용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 PEG 용액 중 PEG가 약 1,000부터 50,000까지 범위의 평균 분자량을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)의 상기 음이온 교환 컬럼이 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 수용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (h)의 상기 양이온 교환 컬럼이 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 용액 및/또는 상기 계면활성제 용액이 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 또는 수성 포스페이트/NaCl 완충제를 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 NaCl 완충제가 약 20부터 250 mM까지의 NaCl, 또는 약 50부터 200 mM까지의 NaCl을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 중 단계 (f)의 상기 음이온 교환 컬럼으로부터 용리되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 Tris-Cl/NaCl 완충제가 50-200 mM NaCl을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 수성 포스페이트/NaCl 완충제 중 단계 (h)의 상기 양이온 교환 컬럼으로부터 용리되는 방법.
제22항에 있어서, 상기 포스페이트/NaCl 완충제가 약 100부터 500 mM까지의 NaCl을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)의 상기 음이온 교환 컬럼이 4차 암모늄 작용기, 예를 들어, 4차화된 폴리에틸렌이민을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (g)의 상기 크기 배제 컬럼이 약 10,000부터 600,000까지의 분리 범위(분자량)을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (h)의 상기 양이온 교환 컬럼이 설폰산 또는 설포프로필과 같은 작용기를 포함하는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 세슘 클로라이드 구배 초원심분리의 단계를 배제하는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 siRNA, 안티센스 분자, miRNA 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모생식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β, 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노석시네이트 합성효소, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, RPE65, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 막횡단 조절제(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 선천성 대사 이상의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 인자 VIII 또는 인자 IX를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (a)에서 생산된 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물로부터 총 rAAV 벡터 입자의 약 40-70%를 회수하는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 AAV 친화성 컬럼 정제에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온 교환 컬럼 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온 교환 컬럼 및 양이온 교환 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10으로 구성된 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되는 방법.
재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터 입자를 정제하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
(a) rAAV 벡터 입자를 포함하는 세포 및/또는 세포 배양 상청액을 수확하여 수확물을 생산하는 단계;
(b) 임의로 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물을 농축시켜 농축된 수확물을 생산하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물을 용해시켜 용해물을 생산하는 단계;
(d) 용해물 중 오염성 핵산을 감소시키기 위해 단계 (c)에서 생산된 용해물을 처리함으로써 핵산 감소된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 생산된 상기 핵산 감소된 용해물을 여과시켜 정화된 용해물을 생산하고, 임의로 상기 정화된 용해물을 희석시켜 정화되고 희석된 용해물을 생산하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 생산된 상기 정화된 용해물 또는 정화되고 희석된 용해물을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 또는 다른 생산 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 상기 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 컬럼 용리액을 생산하는 단계;
(g) 단계 (f)에서 생산된 상기 컬럼 용리액 또는 상기 농축된 컬럼 용리액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제2 컬럼 용리액을 생산함으로써 단백질 불순물로부터 rAAV 벡터 입자를 분리하고, 임의로 상기 제2 컬럼 용리액을 희석시켜 희석된 제2 컬럼 용리액을 생산하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 생산된 상기 제2 컬럼 용리액 또는 상기 희석된 제2 컬럼 용리액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 rAAV 벡터 입자로 구성된 제3 컬럼 용리액을 생산하고, 임의로 상기 제3 컬럼 용리액을 농축시켜 농축된 제3 컬럼 용리액을 생산하는 단계; 및
(i) 단계 (h)에서 생산된 상기 제3 컬럼 용리액 또는 상기 농축된 제3 컬럼 용리액을 여과시킴으로써 정제된 rAAV 벡터 입자를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
제38항에 있어서, 단계 (b) 및/또는 단계 (f) 및/또는 단계 (h)의 상기 농축이 초미세여과/정용여과에 의해, 임의로 접선 유동 여과에 수행되는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (b)의 상기 농축이 상기 수확된 세포 및 세포 배양 상청액의 부피를 약 2-10배만큼 감소시키는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (f)의 상기 농축이 상기 컬럼 용리액의 부피를 약 5-20배만큼 감소시키는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물의 상기 용해가 미세유동화에 의해 수행되는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (d)가 뉴클레아제로 처리하여 오염성 핵산을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
제43항에 있어서, 뉴클레아제가 벤조나제를 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (e)의 상기 정화된 용해물 또는 상기 정화되고 희석된 용해물의 상기 여과가 약 0.1부터 0.8 미크론까지의 기공 직경을 갖는 필터를 통해 수행되는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (e)의 상기 정화된 용해물 또는 상기 정화되고 희석된 용해물의 상기 희석이 완충된 아세테이트 수용액을 사용하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (g)의 상기 제2 컬럼 용리액의 상기 희석이 완충된 아세테이트 수용액을 사용하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 완충된 아세테이트 수용액이 약 4.0부터 7.0까지의 pH를 갖는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (i)로부터 생성된 상기 rAAV 벡터 입자가 계면활성제와 제형화되어 AAV 벡터 제형을 생산하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (h)의 상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 조절된 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (h)의 상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 PEG 용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 PEG 용액 중 PEG가 약 1,000부터 50,000까지 범위의 평균 분자량을 갖는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (h)의 상기 음이온 교환 컬럼이 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 수용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (f)의 상기 양이온 교환 컬럼이 컬럼으로부터 상기 rAAV 벡터 입자의 용리 전에 계면활성제 용액으로 상기 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 방법.
제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 용액 및/또는 상기 계면활성제 용액이 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 또는 수성 포스페이트/NaCl 완충제를 포함하는 방법.
제55항에 있어서, 상기 NaCl 완충제가 약 20부터 250 mM까지의 NaCl, 또는 약 50부터 200 mM까지의 NaCl을 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 수성 Tris-Cl/NaCl 완충제 중 단계 (h)의 상기 음이온 교환 컬럼으로부터 용리되는 방법.
제57항에 있어서, 상기 Tris-Cl/NaCl 완충제가 50-200 mM NaCl을 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 수성 포스페이트/NaCl 완충제 중 단계 (f)의 상기 양이온 교환 컬럼으로부터 용리되는 방법.
제59항에 있어서, 상기 포스페이트/NaCl 완충제가 약 100부터 500 mM까지의 NaCl을 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (h)의 상기 음이온 교환 컬럼이 4차화된 폴리에틸렌이민 작용기를 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (g)의 상기 크기 배제 컬럼이 약 10,000부터 600,000까지의 분리 범위(분자량)을 갖는 방법.
제38항에 있어서, 단계 (f)의 상기 양이온 교환 컬럼이 설포프로필 작용기를 포함하는 방법.
제38항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 세슘 클로라이드 구배 초원심분리의 단계를 배제하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 siRNA, 안티센스 분자, miRNA 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모생식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β, 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노석시네이트 합성효소, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, RPE65, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 막횡단 조절제(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 선천성 대사 이상의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 인자 VIII 또는 인자 IX를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (a)에서 생산된 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물로부터 총 rAAV 벡터 입자의 약 40-70%를 회수하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 AAV 친화성 컬럼 정제에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온 교환 컬럼 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온 교환 컬럼 및 양이온 교환 정제와 조합된 AAV 친화성 컬럼에 의해 생산되거나 정제된 rAAV 벡터 입자보다 큰 순도를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10으로 구성된 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되는 방법.