CN114317464A

CN114317464A - 腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法

Info

Publication number: CN114317464A
Application number: CN202111619661.9A
Authority: CN
Inventors: 肖胜杰; 皮妮; 曾凡星; 吴阳
Original assignee: Wuhan Huiyan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Huiyan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114317464B

Abstract

本发明涉及病毒的分离纯化领域，具体涉及一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法。该方法包括以下步骤：将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性后过滤，之后采用肝素亲和层析和凝胶过滤层析两步层析法即可达到rAAV9的分离纯化目的，分离后的rAAV9纯度能够达到95％以上，回收率至少能够达到78％以上，当采用汇研生物Heparin Focurose 6FF作为第一步的纯化介质进行纯化时，其收率能达到96％以上。

Description

腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及病毒的分离纯化领域，具体涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用，cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞，rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。

重组腺相关病毒载体(rAAV)是由野生型腺相关病毒(AAV)改造而来，rAAV基因组仅包含AAV两端的末端重复序列(ITR)，所含外源基因完全替代了病毒自身编码基因。通过在包装细胞系中反式补偿AAV的复制基因Rep、结构基因Cap和包装辅助基因可制备获得rAAV。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

目前已注册的AAV种类总数已超过196种，灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV(即AAV1-AAV13)，其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身，不同的rAAV亚型对人体组织有不同的亲和性，而且每个亚型的rAAV其分离纯化方法也是不同的。rAAV9对心脏，肌肉，肺(肺泡)，肝脏及中枢神经有较好的亲和性，且其特殊之处在于rAAV9可穿过血脑屏障。但是目前国内关于纯化rAAV9的研究并不多，且其存在着纯化过程繁琐、杂蛋白含量较多、纯度低、回收率低的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种rAAV9的分离纯化方法。

本发明采用如下技术方案：本发明提供一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，包括以下步骤：

将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性，过滤；

肝素亲和层析：采用带有肝素的层析介质对过滤后的液相组合物进行亲和层析，收集流穿液并浓缩；

凝胶过滤层析：将浓缩后的流穿液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，即得。

作为本发明的一种实施方式，肝素亲和层析的填料为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm。

作为本发明的一种实施方式，所述层析介质为汇研生物Heparin Focurose 6FF。

作为本发明的一种实施方式，亲和层析所用的平衡液为8～12mM PB，pH 7.0。

作为本发明的一种实施方式，亲和层析所用的洗脱液为8～12mM PB，2.0M NaCl，pH 7.0。

作为本发明的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的填料为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，或高度交联4％的琼脂糖。

作为本发明的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的平衡液和缓冲液为15～25mMPB，0.1～0.2M NaCl，pH7.0。

作为本发明的一种实施方式，液相组合物采用0.45μm的膜过滤。

作为本发明的一种实施方式，所述液相组合物为细胞裂解液或细胞培养上清液。

本发明所提供的腺相关病毒rAAV9纯化方法能够很好的分离纯化rAAV9，分离后的rAAV9纯度能够达到95％以上，回收率至少能够达到78％以上，当采用汇研生物HeparinFocurose 6FF作为第一步的纯化介质进行纯化时，其收率能达到96％以上。

附图说明

图1为本发明实施例1中亲和层析后的纯化图谱，其中L1为流穿1，L2为流穿2，L3为流穿3，L4为流穿4，E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4；

图2为本发明实施例1中亲和层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为全液(未离心过滤)，泳道2为原液(离心过滤后)，泳道3为流穿1，泳道4为流穿2，泳道5为流穿2浓缩液，泳道6为流穿3，泳道7为流穿3浓缩液，泳道8为流穿4，泳道9流穿4浓缩液，泳道10为洗脱1，泳道11为洗脱2，泳道12为洗脱3，泳道13为洗脱4；

图3为本发明实施例1中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4，E5为洗脱5，E6为洗脱6，E7为洗脱7；

图4为本发明实施例1中凝胶过滤层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为洗脱1浓缩液，泳道2为洗脱2浓缩液，泳道3为洗脱3浓缩液，泳道4为洗脱4，泳道5为洗脱5，泳道6为洗脱6，泳道7为洗脱7；

图5为本发明实施例2中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4；

图6为本发明实施例2中凝胶过滤层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为原液，泳道2为原液浓缩滤出液，泳道3为洗脱1浓缩液，泳道4为洗脱2浓缩液，泳道5为洗脱3浓缩液，泳道6为洗脱4。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)收集含有rAAV9的sf9昆虫细胞上清液，将上清液用纯化水稀释4倍左右，调节pH至7.0后，0.45μm膜过滤；

(2)肝素亲和层析：采用Heparin Focurose 6FF(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用10mM PB，pH7.0的平衡液平衡10个柱体积以上，流速为60cm/h；

将处理后的昆虫细胞上清液以30cm/h的流速进行上样，根据病毒滴度一般上样20个柱体积，流速为30cm/h，收集流穿峰；上样结束后以平衡液清洗层析柱20个柱体积，流速为60cm/h；采用盐浓度线性梯度洗脱的方式，盐溶液由0M NaCl(0％B)在15个柱体积时间内线性逐步上升至2M NaCl(100％B)，流速为60cm/h，收集洗脱峰；

(3)凝胶过滤层析：将步骤(2)中纯化得到的流穿峰合并，以100KD超滤杯浓缩约15倍左右待用，超滤离心参数为6140rpm、8min、4℃，并采用0.45μm膜过滤后备用；

采用Focudex 200PG(汇研生物，介质为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，粒径范围为25～45μm，平均粒径约为34μm)作为层析柱，用20mM PB，0.15M NaCl，pH 7.0平衡液平衡1.5个柱体积，流速为60cm/h；将浓缩处理后的流穿液以30cm/h的流速进行上样，一般上样2mL，上样流速30cm/h；采用洗脱液20mM PB，0.15M NaCl，pH 7.0以30cm/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；

(4)检测：将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测纯度以及荧光定量PCR测病毒滴度方式检测回收率。

通过SDS-PAGE电泳实验发现：rAAV9的三个结构蛋白纯度为95％以上，通过荧光定量PCR滴度检测回收率为104.76％。

实施例2

采用Focurose 4FF(汇研生物，介质为高度交联4％的琼脂糖，粒径范围为45-165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用20mM PB，0.15M NaCl pH 7.0平衡液平衡1.5个柱体积，流速为60cm/h；将浓缩处理后的流穿液以30cm/h的流速进行上样，一般上样2mL，上样流速30cm/h；采用洗脱液20mM PB，0.15M NaCl pH 7.0以30cm/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。

通过SDS-PAGE电泳实验发现：rAAV9的三个结构蛋白纯度为95％以上，通过荧光定量PCR滴度检测回收率为96.73％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中的Heparin Focurose 6FF(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)层析柱替换为Heparin Sepharose 6FastFlow(cytica，介质为高度交联6％的琼脂糖，平均粒径约为90μm)层析柱，其余步骤与实施例1相同。

检测得到：rAAV9的纯度为95％以上，回收率为78.15％。

实施例4

本实施例与实施例2的区别在于：将步骤(2)中的Heparin Focurose 6FF(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)层析柱替换为Heparin Sepharose 6FastFlow(cytica，介质为高度交联6％的琼脂糖，平均粒径约为90μm)层析柱，其余步骤与实施例1相同。

检测得到：rAAV9的纯度为95％以上，回收率为87.44％。

对比例1

本对比例与实施1的区别在于，分离纯化的对象为腺相关病毒rAAV2，具体操作步骤与实施例1相同。

检测得到：rAAV2的纯度为10％以下(未达到纯化效果)，回收率为58.62％。

对比例2

本对比例与实施例2的区别在于，分离纯化的对象为腺相关病毒rAAV2，具体操作步骤与实施例2相同。

检测得到：rAAV2的纯度为10％以下(未达到纯化效果)，回收率为62.28％。

上述实施例中，纯度、回收率以及蛋白去除率的计算方法如下：

纯度：SDS-PAGE电泳检测rAAV三个结构蛋白灰度值总占比

回收率(％)＝【纯化后样品滴度(VG/ml)*体积(ml)】/【纯化前样品滴度(VG/ml)*体积(ml)】*100％；

蛋白去除率(％)＝1-【纯化后样品总蛋白浓度(mg/ml)*体积(ml)】/【纯化前样品总蛋白浓度(mg/ml)*体积(ml)】*100％；

备注：样品滴度检测用荧光定量PCR法。

样品总蛋白检测用Bradford法(考马斯亮蓝染色法)。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性，过滤；

2.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，肝素亲和层析的填料为高度交联6％的琼脂糖。

3.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，所述层析介质为汇研生物Heparin Focurose 6FF。

4.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，亲和层析所用的平衡液为8～12mM PB，pH 7.0。

5.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，亲和层析所用的洗脱液为8～12mM PB，2.0M NaCl，pH 7.0。

6.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的离纯化方法，其特征在于，凝胶过滤层析所用的填料为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，或高度交联4％的琼脂糖。

7.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，凝胶过滤层析所用的平衡液和缓冲液为15～25mM PB，0.1～0.2M NaCl，pH7.0。

8.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，液相组合物采用0.45μm的水系混合膜过滤。

9.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，所述液相组合物为细胞裂解液或细胞培养上清液。