CN113430232A - 一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法 - Google Patents

一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法，涉及医学检测技术领域。其包括如下步骤：将miniAAVR‑荧光报告基因融合基因的过表达载体侵染细胞，过表达miniAAVR‑荧光报告基因，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。利用本发明提供的构建方法，可以将多种动物细胞快速改造成对腺相关病毒敏感的细胞系。由于该方法无需抗生素的重复筛选，从而可以极大程度上缩短细胞系的构建时间。同时基于筛选过程使用荧光报告基因而不使用抗生素标记，可以避免由于细胞产生耐药性导致的假阳性稳定细胞株，从而快速筛选到所需要的稳定细胞系。

Description

一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建 方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法。
背景技术
目前，腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法存在构建周期长，筛选出的细胞系存在假阳性等问题，无法满足稳定细胞株在传代培养过程中的实时监控。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，其包括如下步骤：将miniAAVR-荧光报告基因融合基因的过表达载体侵染细胞，过表达miniAAVR-荧光报告基因，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系；
荧光报告基因选自GFP、RFP、BFP、EGFP、mCherry、mStrawberry、mApple、mRuby或EosFP。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述细胞选自Hela细胞、胰岛细胞、CHO细胞、293细胞、HepG2细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、BHK21细胞、P3X3Ag8.653细胞或BSC-1细胞。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基因选自mcherry，miniAAVR-mcherry融合基因的序列具有与SEQ ID NO.2所示的序列至少85％的序列一致性。
miniAAVR-mcherry融合基因编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.3所示的序列至少85％的序列一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述过表达载体为慢病毒载体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法还包括利用mCherry进行细胞系的筛选，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述筛选是利用细胞流式分选mCherry阳性的细胞作为腺相关病毒感染敏感的细胞系。
本发明还提供了一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法，包括：
将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；
将腺相关病毒敏感的细胞系细胞与混合样本混合培养；检测特征基因。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待检样本为血液样本。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述特征基因包括为GFP基因、EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、和luciferase基因中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述重组腺相关病毒的滴度为1个病毒颗粒/毫升～1020个病毒颗粒/毫升；
优选地，检测方法还包括对待检样本进行稀释，优选地，待检样本稀释按照1-1×109倍的比例稀释；
优选地，孵育的温度为25-60℃，孵育的时间为30-120min。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的快速构建方法。利用本发明提供的构建方法，可以将多种动物细胞快速改造成对腺相关病毒敏感的细胞系。由于该方法无需抗生素的重复筛选，从而可以极大程度上缩短细胞系的构建时间，仅仅通过荧光报告基因的筛选即可实现目标细胞系的筛出，可将细胞系构建周期缩短至12-15天(传统方法约为30-40天)。
同时基于筛选过程使用荧光报告基因而不使用抗生素标记，可以避免由于细胞产生耐药性导致的假阳性稳定细胞株，从而快速筛选到所需要的稳定细胞系。目前，稳定细胞系筛选通常需要嘌呤霉素等抗生素，筛选好的稳定细胞系在培养过程中也会加入抗生素。这些抗生素在换液遗弃后，可能导致环境中耐药菌的产生。而本发明提供的构建方法完全避免了上述耐药菌问题的发生。
该方法本身也可以满足实时监控的需求，能够对构建的稳定细胞系的外源AAVR的稳定性进行实时掌控。稳定细胞株在传代工程中可能会丢失外源基因，本发明通过将荧光报告基因和AAVR融合，借助荧光报告基因的表达水平可以用来判断是否发生丢失，这样也有助于避免外源基因丢失继续培养造成的损失。
本发明还提供了一种不同血清型的腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，该检测方法可以判断待检样品中是否存在腺相关病毒中和抗体及抗体含量，为后续的基因治疗等提供参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1和对比例1提供的细胞系筛选方法的流程图；
图2为实验例1提供的mCherry阳性细胞株的筛选结果图；
图3为实施例1提供的miniAAVR-mCherry线性序列。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。腺相关病毒是一种复制缺陷型、无致病性的一种病毒，它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。腺相关病毒感染的细胞不会产生任何的病理反应，对人类和其他动物的感染也不会产生可感知的症状，其可以感染大部分哺乳动物细胞。因此可以将腺相关病毒应用于基因治疗。
本发明提供了一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，构建方法如下：将miniAAVR-荧光报告基因融合基因的过表达载体侵染细胞，过表达miniAAVR-荧光报告基因，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系；
荧光报告基因选自GFP、RFP、BFP、EGFP、mCherry、mStrawberry、mApple、mRuby或EosFP。
基因治疗中大量应用到腺相关病毒(AAV)，然而腺相关病毒(AAV)作为一种异源病毒，哺乳动物尤其是人类的血清中含有腺相关病毒(AAV)的中和抗体；在进行基因治疗前，需要对患者体内的腺相关病毒(AAV)中和抗体进行检测，腺相关病毒(AAV)的中和抗体含量是一个较为重要的检测指标。若患者体内含有较多的腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(recombinant AAV，rAAV)中和抗体，将会引起较强的免疫反应，导致基因治疗失败；因此对患者体内的中和抗体进行检测是不可或缺且至关重要的。中和抗体的检测可以通过中和抗体与腺相关病毒发生抗原抗体反应后的带有报告基因的重组腺相关病毒(rAAV)对细胞的感染活力测定来实现。
AAVR(AAV receptor，AAVR)是一个在AAV感染过程中起关键作用的受体，且对广泛的AAV的血清型的感染均有促进作用，由于AAVR是一类普遍的受体，因此可以应用于多种血清型的AAV中和抗体的检测。通过构建过表达miniAAVR-mCherry蛋白的细胞系的方式，可以提高检测的最低限度、灵敏度和可靠性。
由于动物细胞自身表达的AAVR蛋白的量不足够高，导致细胞对腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)的感染不够敏感。通过在细胞中过量表达AAVR蛋白，可以明显提高细胞对腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)感染的敏感性，进而将对腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)感染敏感的细胞应用到腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)中和抗体的检测中。
可选的，将miniAAVR-荧光报告基因融合基因的过表达载体和慢病毒包装载体共转染至细胞中，将转染后的细胞进行培养，收集慢病毒，然后将收集的慢病毒侵染细胞，培养后获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。慢病毒包装载体可以是慢病毒载体或其它过表达载体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述细胞选自Hela细胞、胰岛细胞、CHO细胞、293细胞、HepG2细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、BHK21细胞、P3X3Ag8.653细胞或BSC-1细胞。
需要说明的是，上述细胞仅为发明人列举的几种动物细胞，在其他实施方式中，只要能表达miniAAVR-荧光报告基因融合蛋白的细胞，均在本发明的保护范围内，而并不限于上述列举的细胞种类。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述miniAAVR的序列如SEQ ID NO.1所示，荧光报告基因选自mcherry，miniAAVR-mcherry融合基因的序列具有与SEQ ID NO.2所示的序列至少85％的序列一致性。
在其他实施方式中，miniAAVR的序列与SEQ ID NO.1所示的序列相比，至少具有85％的序列一致性均可行。例如，序列一致性为90％、98％或99％。
在其他实施方式中，miniAAVR-mcherry融合基因的序列具有与SEQ ID NO.2所示的序列85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列一致性。
miniAAVR-mcherry融合基因编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.3所示的序列至少85％的序列一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述过表达载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在其他实施方式中任何可以进入细胞的病毒或非病毒载体均可行，也在本发明的保护范围之内。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法还包括利用mCherry进行细胞系的筛选，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述筛选是利用细胞流式分选mCherry阳性的细胞作为腺相关病毒感染敏感的细胞系。
目前，市面上主要使用ELISA等技术进行样品中AAV中和抗体的筛查和含量测定，需要使用价格较为昂贵的特异性抗体，检测成本高，且操作过程复杂，耗时长。鉴于此，本发明还提供了一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法，包括：
培养采用上述的构建方法制备的腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞；将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；将腺相关病毒敏感的细胞系细胞与混合样本混合培养；检测特征基因。
由于制备的腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞过表达了miniAAVR-mCherry蛋白，如果待检样本中含有腺相关病毒(AAV)的中和抗体，将腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)与待检样本混合孵育后，腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)会和抗体发生免疫反应，进行灵敏细胞系的感染时，则无法得到与对照组(无AAV或rAAV中和抗体)相当的感染效率，因此不能检测或只能检测到微弱的特征基因信号。如果待检样本中没有相应的中和抗体，腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)可以较好的感染腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞，则可以检测到与对照组相当的特征基因信号。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待检样本为血液样本。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述特征基因包括为GFP基因、EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、和luciferase基因中的至少一种。
需要说明的是，带特征基因的腺相关病毒可以选自野生型腺相关病毒也可以是获得带特征基因的重组腺相关病毒。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述重组腺相关病毒的滴度为1个病毒颗粒/毫升～1020个病毒颗粒/毫升。
优选地，检测方法还包括对待检样本进行稀释，优选地，待检样本稀释按照1-1×109倍的比例稀释。稀释的浓度可以根据检测的需求进行自适应调整，例如可以是1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍、1×108倍的比例稀释。
在一种实施方式中，上述孵育的温度为25-60℃，孵育的时间为30-120min。例如在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下孵育，孵育的时间可以是30min、40min、50min、60min、70min或80min。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，具体构建步骤如下：
将过表达miniAAVR-mCherry基因的慢病毒载体导入Hela细胞；获得过表达miniAAVR-mCherry的Hela细胞，即腺相关病毒感染敏感的Hela细胞；
培养腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，得到大量的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞。
具体地，miniAAVR-mCherry基因的慢病毒载体的构建过程如下(线性序列参照图3所示)：
(I)原始质粒序列：
AAVR cDNA：从hela细胞中提取RNA，反转录出cDNA，以此作为模板，PCR出AAVRcDNA。
载体序列：载体为pLVX-Puro载体，购自transvector；
mCherry序列：CDS区域来自实验室质粒pAAV-CB-mCherry
(II)构建过程：
(1)酶切位点选择：选择载体上的BamH I和Xba I作为插入的酶切位点；
(2)引物设计：使用重叠延伸PCR，将3个小片段分别扩增出(扩增引物参照如下表所示的F1片段、F2片段和F3片段的F端引物和R端引物)，随后再PCR串联为一条完整的插入片段(即为miniAAVR-mCherry基因)。
Figure BDA0003138113560000091
Figure BDA0003138113560000101
(3)配制PCR体系：采用Q5超保真聚合酶，在基因GC含量高时可选择加入GCenhancer，PCR反应体系如下：
试剂名称 25ul体系加样量 终浓度
5xQ5 Reaction Buffer 5ul 1x
dNTP(10mM) 0.5ul 200uM
Primer-F(10uM) 1.25ul 0.5Um
Primer-R(10uM) 1.25ul 0.5Um
模板DNA 可变 小于1000ng
Q5热启动酶 0.25ul 0.02U/ul
5Xq5 GC enhancer 5ul(可选) 1x
ddH<sub>2</sub>O 补至25ul
PCR反应程序如下：
Figure BDA0003138113560000102
(4)载体以及插入基因的获得：过表达载体为慢病毒载体PLVX-Puro，转入大肠杆菌DH5α中进行扩增。目的基因由上述PCR步骤获得。
(5)载体以及目的基因酶切：根据所设计的酶切位点使用NEB的限制性内切酶对目的基因和载体进行酶切，酶切体系如下：
试剂名称 加入量
10x buffer 5ul
DNA(质粒或PCR片段) 大于2ug
限制性内切酶 0.5ul/每种酶
ddH<sub>2</sub>O 补至50ul
10xbuffer和反应温度根据酶不同有差异，具体见官网推荐反应条件。
(6)酶切片段回收：酶切后的体系加入6x loading buffer终止，150V，30min跑胶回收，切胶后使用胶回收试剂盒回收目的DNA片段。胶回收步骤如下：
(a)称重，加入相同体积的DNA binding buffer，55℃溶化10分钟，颠倒混匀；
(b)液体上胶回收柱，10000g离心1分钟；
(c)弃回收管中液体，回收柱中加入300ul DNA binding buffer，10000g离心1分钟；
(d)弃液体，加入700ul DNA wash buffer，10000g离心1分钟；
(e)重复步骤d；
(f)13000g离心2分钟，彻底去掉酒精残留，将柱子转移到新EP管上；
(g)回收柱中加入30ul Elution buffer，静置1分钟后，13000g离心1分钟。
(7)载体连接：按照以下体系将载体与插入片段连接。
试剂名称 加入量
10xT4 ligase buffer 1ul
T4 DNA连接酶 0.5ul
载体片段 1ul
插入片段 载体：插入＝1:3(摩尔比)
ddH<sub>2</sub>O 补至10ul
反应温度16℃，连接时间不少于1小时。
(8)连接产物转化。将50ul大肠杆菌感受态(DH5α)在冰上溶化，加入5ul连接产物，冰上放置30分钟，后42℃热激30-45s，冰浴两分钟后，加入300ul无抗培养基，220rpm，37℃摇床培养1小时。
(9)涂板：培养后取300ul培养液，均匀涂到含有相应抗生素的平板上，倒扣，37℃恒温培养过夜。
(10)阳性克隆挑选
涂板后16小时左右，挑取克隆菌落2-4个至带有相应抗生素的液体培养基中，220rpm，36℃震荡培养16-18小时。
(11)质粒提取
按照omega质粒小提试剂盒的说明书进行质粒提取，具体步骤如下：
(a)收集1ml菌液至EP管中，10000g离心1min，去上清；
(b)加入250ul带有RNA酶的solutionI，重悬菌液；
(c)加入250ul solutionII，混匀；
(d)加入350ul solutionIII，立即混匀后，13000g离心10min；
(e)将提取柱放入对应收集管中后，向柱子中加入上步骤的上清液，10000g离心1分钟，弃去收集管中液体；
(f)柱子中加入500ul带有异丙醇的HEB buffer，10000g离心1分钟，弃去收集管中液体；
(g)柱子中加入700ul带有无水乙醇的Wash buffer，10000g离心1分钟，弃去收集管中液体；
(h)重复步骤7；
(i)柱子放入收集管中，13000g空转2分钟，去掉残留乙醇；
(j)弃去收集管，将柱子放入新的EP管中，加入50ul Elution buffer将DNA洗脱下来，室温静置1分钟，后13000g离心1分钟，得到体积大约为50ul的质粒溶液。
(12)阳性克隆鉴定：
根据基因和载体序列选择对应的酶进行阳性质粒鉴定，配制以下10ul质粒鉴定体系：
Figure BDA0003138113560000121
Figure BDA0003138113560000131
根据酶选定反应buffer以及最适温度，酶切鉴定反应时间大于30分钟，后跑胶鉴定酶切结果是否正确。
当然，在其他的实施例中，可以先将Hela细胞的AAVR基因、AAVR同源基因或者AAVR基因的片段等敲除或干扰掉，再导入过表达miniAAVR-mCherry的表达载体；另外还可以选用胰岛细胞、CHO细胞、293细胞和HepG2细胞等类型的细胞进行实验，然后导入过表达miniAAVR-mCherry基因的慢病毒载体，获得相应的腺相关病毒敏感的细胞系。
实施例2
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM替代AAV)；
将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12个组，分别取10μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液10μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1020病毒颗粒/毫升；在孵育温度45℃的条件下孵育75min，得到混合样本；
将混合样本感染腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
实施例3
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
(1)将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
(2)将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
(3)并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM替代AAV)；
(4)将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12个组，分别取30μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液10μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1病毒颗粒/毫升；在摇床温度60℃的条件下孵育30min，得到混合样本；
(5)将混合样本感染步骤1.1中的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
(6)感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
实施例4
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
(1)将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
(2)将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
(3)并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM替代AAV)；
(4)将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12组，分别取10μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液30μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1010病毒颗粒/毫升；在摇床温度25℃的条件下孵育120min，得到混合样本；
(5)将混合样本感染步骤1.1中的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
(6)感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
实施例5
细胞系的构建方法包括：
细胞铺板：细胞计数后，以5.0E+5个/孔的密度铺板于6孔板中，置于培养箱中，37℃，5％二氧化碳过夜培养。
慢病毒感染：待细胞贴壁后，将慢病毒以MOI＝1的滴度加入培养基中进行病毒感染，感染后24小时换液。
阳性细胞筛选：使用流式分选仪对细胞进行分选，仅收集mCherry阳性的细胞。因mCherry融合于AAVR蛋白中，因此mChrerry阳性的细胞一定为AAVR过表达细胞。将收集到的细胞计数后铺板于细胞培养皿中传代培养。
阳性细胞鉴定：收集miniAAVR-mCherry阳性细胞的细胞悬液，离心后加入蛋白裂解液裂解，使用western blot的方法，鉴定miniAAVR-mCherry蛋白的表达量。
对比例1
传统细胞系的构建方法参照图1所示，其包括如下步骤：
(1)细胞铺板：细胞计数后，将细胞以5.0E+5个/孔的密度铺板于6孔板中，置于培养箱中，37℃，5％二氧化碳过夜培养。
(2)慢病毒感染：待细胞贴壁后，将慢病毒以MOI＝1的滴度加入培养基中进行病毒感染，感染后24小时换液。
(3)阳性细胞筛选：慢病毒感染后48小时可完全进入细胞，表达所携带的抗性基因；此时向培养基中加入1ug/ml浓度的puromycin(嘌呤霉素)，筛选慢病毒阳性的细胞，通常需连续筛选3代，共耗时9天。
(4)单克隆细胞挑选：因抗生素挑选的细胞存在耐药性导致的假阳性细胞群，因此需要进行单克隆细胞筛选。将细胞消化分散后，以0.5个细胞/孔的密度铺板于96孔板中，置于培养箱中培养。10天后取出孔板在显微镜下观察，标记出孔板上仅有一个细胞群的孔，即为一个单细胞群。待单细胞群生长至70％面积后，消化传代至24孔板中，这样依次传代扩增，直至细胞群长满一个直径为10cm的细胞培养皿。
(5)单克隆细胞鉴定：分别收集所有单克隆细胞株的细胞悬液，离心后加入蛋白裂解液裂解，使用Western blot的方法，鉴定外源过表达蛋白的表达量高低，挑选出表达量最高的细胞株。
实验例1
在实施例1中的miniAAVR-mCherry的病毒表达框架中另加入PKG-Puro抗生素表达框架，使得Lenti virus同时表达AAVR-mCherry和Puro基因，随后感染进入Hela细胞中；感染后48小时对细胞进行嘌呤霉素抗生素筛选，筛选浓度为1ug/ml。连续3代筛选后，观察mCherry阳性率。结果参照图2所示，可看到在嘌呤霉素耐受的细胞中，仅有10-20％为mCherry阳性(也就是AAVR阳性)，细胞出现严重耐药性。
综上所述，本发明实施例的腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，能够通过巧妙的实验设计，构建出对腺相关病毒的感染较为敏感的细胞系，该细胞系可以用于临床基因治疗时病人体内的腺相关病毒中和抗体的检查；腺相关病毒中和抗体的检测和含量测定方法：将待检样本梯度稀释后，和带有报告基因的重组腺相关病毒混合孵育后，感染上述对腺相关病毒感染敏感的细胞系，48小时后检测细胞的荧光信号，通过与对照组的比较，判断待检测样本中是否含有AAV中和抗体并确定中和抗体的含量，为后续的基因治疗等提供可靠的参考。
本发明所述的AAV易感型细胞系可快速构建，利用融合于AAVR序列中的mCherry蛋白，快速筛选出AAVR过表达型的细胞株。此方法的优点有两个：第一是mCherry荧光蛋白的加入，可极大加速细胞系筛选过程，利用荧光显微镜即可确定AAVR过表达基因的保留程度，不再需要繁琐的单细胞挑选，western blot验证的步骤。第二是依赖于mCherry基因所进行的AAVR过表达细胞系筛选方法，相较于传统抗生素筛选标记(如puromycin，neomycin等)，可避免因细胞产生耐药性，所导致的假阳性筛选结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 60
cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 120
ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 180
gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 240
gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 300
atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 360
gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 420
cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480
ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 540
gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 600
atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 660
gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaag 705
<210> 2
<211> 3309
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggagaaga ggctgggagt caagccaaat cctgcttcct ggattttatc aggatattat 60
tggcagacat ctgcgaagtg gttgagaagc ctgtacctgt tttatacttg cttttgcttc 120
agcgttctgt ggttgtcaac agatgccagt gagagcaggt gccagcaggg gaagacacaa 180
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tctctccagt catgtttggc tgcctgctgc caggactctg cctgccatgt cttttggtgg 300
ctagaaggga tgtgcattca ggcagactgc agcaggcccc agagctgccg ggcttttagg 360
acacactcct ccaattccat gctggtgttt ttaaaaaaat tccaaactgc agatgatttg 420
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acacagcatt ctaaagtgaa tgactccaac gaattaggtg gtctgactac cagtggctct 660
gcagaggtcc acaaggcgat tacaatttcc agtcccctaa ccacagacct gactgcagag 720
ctgtctggtg ggccaaagaa tgtatcagtg caacctgaaa tatcagaggg tcttgctact 780
acgcccagca ctcaacaagt aaaaagttct gagaaaaccc agattgctgt cccccagcca 840
gtggctccct cctacagtta tgctacccct accccccagg cctctttcca gagcacctca 900
gcaccatacc cagttataaa ggaactggtg gtatctgctg gagagagtgt ccagataacc 960
ctgcctaaga atgaagttca attaaatgca tatgttctcc aagaaccacc taaaggagaa 1020
acctacacct acgactggca gctgattact catcctagag actacagtgg agaaatggaa 1080
gggaaacatt cccagatcct caaactatcg aagctcactc caggcctgta tgaattcaaa 1140
gtgattgtag agggtcaaaa tgcccatggg gaaggctatg tgaacgtgac agtcaagcca 1200
gagccccgta agaatcggcc ccccattgct attgtgtcac ctcagttcca ggagatctct 1260
ttgccaacca cttctacagt cattgatggc agtcaaagca ctgatgatga taaaatcgtt 1320
cagtaccatt gggaagaact taaggggcct ctaagagaag agaagatttc tgaagataca 1380
gccatattaa aactaagtaa actcgtccct gggaactaca ctttcagctt gactgtagta 1440
gactctgatg gagctaccaa ctctactact gcaaacctga cagtgaacaa agctgtggat 1500
tacccccctg tggccaacgc aggccccaac caagtgatca ccctgcccca aaactccatc 1560
accctctttg ggaaccagag cactgatgat catggcatca ccagctatga gtggtcactc 1620
agcccaagca gcaaagggaa agtggtggag atgcagggtg ttagaacacc aaccttacag 1680
ctctctgcga tgcaagaagg agactacact taccagctca cagtgactga cacaatagga 1740
cagcaggcca ctgctcaagt gactgttatt gtgcaacctg aaaacaataa gggaggcgga 1800
ggaagcgtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca tcaaggagtt catgcgcttc 1860
aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag 1920
ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg 1980
cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag 2040
caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag 2100
cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag 2160
gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc cgacggcccc 2220
gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac 2280
ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg ccactacgac 2340
gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacaac 2400
gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac 2460
gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa gggaggcgga 2520
ggaagcaacc tggtggagat catcttggat atcaacgtca gtcagctaac tgagaggctg 2580
aaggggatgt tcatccgcca gattggggtc ctcctggggg tgctggattc cgacatcatt 2640
gtgcaaaaga ttcagccgta cacggagcag agcaccaaaa tggtattttt tgttcaaaac 2700
gagcctcccc accagatctt caaaggccat gaggtggcag cgatgctcaa gagtgagctg 2760
cggaagcaaa aggcagactt tttgatattc agagccttgg aagtcaacac tgtcacatgt 2820
cagctgaact gttccgacca tggccactgt gactcgttca ccaaacgctg tatctgtgac 2880
cctttttgga tggagaattt catcaaggtg cagctgaggg atggagacag caactgtgag 2940
tggagcgtgt tatatgttat cattgctacc tttgtcattg ttgttgcctt gggaatcctg 3000
tcttggactg tgatctgttg ttgtaagagg caaaaaggaa aacccaagag gaaaagcaag 3060
tacaagatcc tggatgccac ggatcaggaa agcctggagc tgaagccaac ctcccgagca 3120
ggcatcaaac agaaaggcct tttgctaagt agcagcctga tgcactccga gtcagagctg 3180
gacagcgatg atgccatctt tacatggcca gaccgagaga agggcaaact cctgcatggt 3240
cagaatggct ctgtacccaa cgggcagacc cctctgaagg ccaggagccc gcgggaggag 3300
atcctgtag 3309
<210> 3
<211> 1102
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Lys Arg Leu Gly Val Lys Pro Asn Pro Ala Ser Trp Ile Leu
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Tyr Trp Gln Thr Ser Ala Lys Trp Leu Arg Ser Leu Tyr
20 25 30
Leu Phe Tyr Thr Cys Phe Cys Phe Ser Val Leu Trp Leu Ser Thr Asp
35 40 45
Ala Ser Glu Ser Arg Cys Gln Gln Gly Lys Thr Gln Phe Gly Val Gly
50 55 60
Leu Arg Ser Gly Gly Glu Asn His Leu Trp Leu Leu Glu Gly Thr Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Cys Leu Ala Ala Cys Cys Gln Asp Ser Ala Cys His
85 90 95
Val Phe Trp Trp Leu Glu Gly Met Cys Ile Gln Ala Asp Cys Ser Arg
100 105 110
Pro Gln Ser Cys Arg Ala Phe Arg Thr His Ser Ser Asn Ser Met Leu
115 120 125
Val Phe Leu Lys Lys Phe Gln Thr Ala Asp Asp Leu Gly Phe Leu Pro
130 135 140
Glu Asp Asp Val Pro His Leu Leu Gly Leu Gly Trp Asn Trp Ala Ser
145 150 155 160
Trp Arg Gln Ser Pro Pro Arg Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Ser Ser
165 170 175
Ser Asp Gln Gln Ser Leu Ile Arg Lys Leu Gln Lys Arg Gly Ser Pro
180 185 190
Ser Asp Val Val Thr Pro Ile Val Thr Gln His Ser Lys Val Asn Asp
195 200 205
Ser Asn Glu Leu Gly Gly Leu Thr Thr Ser Gly Ser Ala Glu Val His
210 215 220
Lys Ala Ile Thr Ile Ser Ser Pro Leu Thr Thr Asp Leu Thr Ala Glu
225 230 235 240
Leu Ser Gly Gly Pro Lys Asn Val Ser Val Gln Pro Glu Ile Ser Glu
245 250 255
Gly Leu Ala Thr Thr Pro Ser Thr Gln Gln Val Lys Ser Ser Glu Lys
260 265 270
Thr Gln Ile Ala Val Pro Gln Pro Val Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Ala
275 280 285
Thr Pro Thr Pro Gln Ala Ser Phe Gln Ser Thr Ser Ala Pro Tyr Pro
290 295 300
Val Ile Lys Glu Leu Val Val Ser Ala Gly Glu Ser Val Gln Ile Thr
305 310 315 320
Leu Pro Lys Asn Glu Val Gln Leu Asn Ala Tyr Val Leu Gln Glu Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Glu Thr Tyr Thr Tyr Asp Trp Gln Leu Ile Thr His Pro
340 345 350
Arg Asp Tyr Ser Gly Glu Met Glu Gly Lys His Ser Gln Ile Leu Lys
355 360 365
Leu Ser Lys Leu Thr Pro Gly Leu Tyr Glu Phe Lys Val Ile Val Glu
370 375 380
Gly Gln Asn Ala His Gly Glu Gly Tyr Val Asn Val Thr Val Lys Pro
385 390 395 400
Glu Pro Arg Lys Asn Arg Pro Pro Ile Ala Ile Val Ser Pro Gln Phe
405 410 415
Gln Glu Ile Ser Leu Pro Thr Thr Ser Thr Val Ile Asp Gly Ser Gln
420 425 430
Ser Thr Asp Asp Asp Lys Ile Val Gln Tyr His Trp Glu Glu Leu Lys
435 440 445
Gly Pro Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ser Glu Asp Thr Ala Ile Leu Lys
450 455 460
Leu Ser Lys Leu Val Pro Gly Asn Tyr Thr Phe Ser Leu Thr Val Val
465 470 475 480
Asp Ser Asp Gly Ala Thr Asn Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Val Asn
485 490 495
Lys Ala Val Asp Tyr Pro Pro Val Ala Asn Ala Gly Pro Asn Gln Val
500 505 510
Ile Thr Leu Pro Gln Asn Ser Ile Thr Leu Phe Gly Asn Gln Ser Thr
515 520 525
Asp Asp His Gly Ile Thr Ser Tyr Glu Trp Ser Leu Ser Pro Ser Ser
530 535 540
Lys Gly Lys Val Val Glu Met Gln Gly Val Arg Thr Pro Thr Leu Gln
545 550 555 560
Leu Ser Ala Met Gln Glu Gly Asp Tyr Thr Tyr Gln Leu Thr Val Thr
565 570 575
Asp Thr Ile Gly Gln Gln Ala Thr Ala Gln Val Thr Val Ile Val Gln
580 585 590
Pro Glu Asn Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu
595 600 605
Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met
610 615 620
Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu
625 630 635 640
Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys
645 650 655
Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met
660 665 670
Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr
675 680 685
Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn
690 695 700
Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln
705 710 715 720
Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro
725 730 735
Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser
740 745 750
Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys
755 760 765
Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys
770 775 780
Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn
785 790 795 800
Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile
805 810 815
Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met
820 825 830
Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asn Leu Val Glu Ile Ile
835 840 845
Leu Asp Ile Asn Val Ser Gln Leu Thr Glu Arg Leu Lys Gly Met Phe
850 855 860
Ile Arg Gln Ile Gly Val Leu Leu Gly Val Leu Asp Ser Asp Ile Ile
865 870 875 880
Val Gln Lys Ile Gln Pro Tyr Thr Glu Gln Ser Thr Lys Met Val Phe
885 890 895
Phe Val Gln Asn Glu Pro Pro His Gln Ile Phe Lys Gly His Glu Val
900 905 910
Ala Ala Met Leu Lys Ser Glu Leu Arg Lys Gln Lys Ala Asp Phe Leu
915 920 925
Ile Phe Arg Ala Leu Glu Val Asn Thr Val Thr Cys Gln Leu Asn Cys
930 935 940
Ser Asp His Gly His Cys Asp Ser Phe Thr Lys Arg Cys Ile Cys Asp
945 950 955 960
Pro Phe Trp Met Glu Asn Phe Ile Lys Val Gln Leu Arg Asp Gly Asp
965 970 975
Ser Asn Cys Glu Trp Ser Val Leu Tyr Val Ile Ile Ala Thr Phe Val
980 985 990
Ile Val Val Ala Leu Gly Ile Leu Ser Trp Thr Val Ile Cys Cys Cys
995 1000 1005
Lys Arg Gln Lys Gly Lys Pro Lys Arg Lys Ser Lys Tyr Lys Ile
1010 1015 1020
Leu Asp Ala Thr Asp Gln Glu Ser Leu Glu Leu Lys Pro Thr Ser
1025 1030 1035
Arg Ala Gly Ile Lys Gln Lys Gly Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu
1040 1045 1050
Met His Ser Glu Ser Glu Leu Asp Ser Asp Asp Ala Ile Phe Thr
1055 1060 1065
Trp Pro Asp Arg Glu Lys Gly Lys Leu Leu His Gly Gln Asn Gly
1070 1075 1080
Ser Val Pro Asn Gly Gln Thr Pro Leu Lys Ala Arg Ser Pro Arg
1085 1090 1095
Glu Glu Ile Leu
1100

Claims (10)

1.一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：将miniAAVR-荧光报告基因融合基因的过表达载体侵染细胞，过表达miniAAVR-荧光报告基因，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系；
荧光报告基因选自GFP、RFP、BFP、EGFP、mCherry、mStrawberry、mApple、mRuby或EosFP。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞选自Hela细胞、胰岛细胞、CHO细胞、293细胞、HepG2细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、BHK21细胞、P3X3Ag8.653细胞或BSC-1细胞。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述荧光报告基因选自mcherry，miniAAVR-mcherry融合基因的序列具有与SEQ ID NO.2所示的序列至少85％的序列一致性；
优选地，miniAAVR-mcherry融合基因编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.3所示的序列至少85％的序列一致性。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述过表达载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括利用mCherry进行细胞系的筛选获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述筛选是利用细胞流式分选mCherry阳性的细胞作为腺相关病毒感染敏感的细胞系。
7.一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法，其特征在于，包括：
将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；
将权利要求1-6任一项所述的构建方法制备的腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞与所述混合样本混合培养；
检测所述特征基因。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待检样本为血液样本。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述特征基因包括为GFP基因、EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、和luciferase基因中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒的滴度为1个病毒颗粒/毫升～1020个病毒颗粒/毫升；
优选地，所述检测方法还包括对待检样本进行稀释，优选地，待检样本稀释按照1-1×109倍的比例稀释；
优选地，所述孵育的温度为25-60℃，所述孵育的时间为30-120min。
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