CN113564173B

CN113564173B - 一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用

Info

Publication number: CN113564173B
Application number: CN202110777059.1A
Authority: CN
Inventors: 林俊生; 张方
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113564173A

Abstract

本发明公开了一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01、SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.03或SEQ ID NO.04所示。本发明能够高亲和力高选择性地识别并结合重组腺相关病毒rAAV，在不依赖昂贵仪器和专业操作训练的情况下，便可便捷快速有效地分离纯化重组腺相关病毒rAAV。

Description

一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用。

背景技术

rAAV被认为是极具潜力的基因治疗运载工具。rAAV在宿主细胞内长期表达，具有安全稳定、宿主范围广，载体已成功实现在人体器官中安全、高效、长期的目的基因表达，能够实现长期治疗的目的。随着AAV基因药物的上市，rAAV的临床研究逐渐增加，大规模纯化成为其亟待解决的问题。

目前rAAV的纯化过程一般要经过，含rAAV载体细胞的收集、裂解，用核酸酶、去污剂处理，过滤澄清等初步分离后，根据不同要求还要采取后续精细分离如，密度梯度离心分离，色谱纯化、分子排阻色谱纯化、超滤法纯化等。常用的梯度超速离心法是根据病毒粒子的密度与一个密度连续或不连续地升高的溶液中某一区间的密度大致相等时而形成条带，从而得以分离。该方法特异性低，单次纯化量少，不适合于规模化生产。所以，建立一种纯度高、特异性强的纯化方法对于提供符合临床应用安全、有效的基因治疗载体至关重要。碘克沙醇密度梯度离心的优势在于其能保持纯化后rAAV的高活性，且有能部分抑制载体颗粒聚集的优势，研究发现，与氯化铯梯度离心相比，碘克沙醇密度梯度离心纯化之后的rAAV的回收率、产物纯度都显著提高。但仍存在缺点：对初始细胞裂解物纯度要求高，费时费力、重复性差，对设备要求较高且操作繁琐，设备维护困难，运行成本高，难以规模化。

亲和层析法是一种能将特定的病毒粒子从含有蛋白质和DNA混合物中分离出来的层析技术，主要依靠病毒表面衣壳与色谱填料的生物活性配基或者配对受体之间的结合发挥作用，可实现对生物活性材料的高度浓缩。在rAAV纯化领域已有应用且纯化效率较高。但此种方法前提条件是寻找到能够与rAAV选择性结合的配体分子。交联AVB的微球琼脂糖基质该纯化方法以单克隆抗体为载体，抗体生产成本较高；后期纯化过程中抗原抗体结合力过于强大，分离和洗脱条件要求相对苛刻，有损于病毒质量。Auricchio等利用唾液酸受体建立了rAAV5的单步亲和纯化法。有研究工作者将生物素受体肽(Biotin acceptorpeptide，BAP)分别插入rAAV1、rAAV 2、rAAV 3、rAAV 4、和rAAV 5的衣壳，就可以采用纯化柱基质交联了生物素蛋白的亲和色谱柱进行改造后rAAV的纯化，经此方法纯化的AAV产物具有高纯度和高生物活性的特点。固定化金属亲和柱，亦有研究者通过对AAV衣壳文库的插入位置进行筛选后，在衣壳上插入6×组氨酸序列(His6)，通过将次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)结合在亲和柱基质上，然后让其与衣壳插入了His6标签的突变型。AAV结合然后进行亲和纯化，该方法的缺点是病毒需要突变。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用。

本发明的另一目的在于提供上述重组腺相关病毒rAAV核酸适体的应用。

本发明的再一目的在于提供上述一种重组腺相关病毒rAAV的分离纯化方法。

本发明采用技术方案如下：

一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01、SEQ IDNO.02、SEQ ID NO.03或SEQ ID NO.04所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组腺相关病毒rAAV为rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-7-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP和rAAV-8-GFP，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在本发明的一个优选实施方案中，：所述重组腺相关病毒rAAV为rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP和rAAV-8-GFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组腺相关病毒rAAV为rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP和rAAV-8-GFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.03所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组腺相关病毒rAAV为rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP和rAAV-8-GFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.04所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组腺相关病毒rAAV为rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP和rAAV-8-GFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.02和SEQ ID NO.04所示。

本发明的另一技术方案如下：

上述重组腺相关病毒rAAV核酸适体在分离纯化重组腺相关病毒rAAV中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，采用亲和层析法。

本发明的再一技术方案如下：

一种重组腺相关病毒rAAV的分离纯化方法，采用上述的重组腺相关病毒rAAV核酸适体。

在本发明的一个优选实施方案中，基于亲和层析法。

本发明的有益效果是：

1、本发明能够高亲和力高特异性地识别并结合重组腺相关病毒rAAV。

2、本发明在不依赖昂贵仪器和专业操作训练的情况下，便可便捷快速有效地分离纯化重组腺相关病毒rAAV。

附图说明

图1为本发明实施例1中1-5轮筛选流程图。

图2为本发明实施例1中6-10轮筛选流程图。

图3为本发明实施例1中第六轮次级文库富集图。

图4为本发明实施例1中10轮次级文库点杂交阳性膜PCR回收产物再点杂交结果图。

图5为本发明实施例3中的SEQ ID NO.01的二级结构预测图。

图6为本发明实施例3中的SEQ ID NO.02的二级结构预测图。

图7为本发明实施例3中的SEQ ID NO.03的二级结构预测图。

图8为本发明实施例3中的SEQ ID NO.04的二级结构预测图。

图9为本发明实施例4中SEQ ID NO.02与rAAV-2/2-GFP，rAAV-DJ-GFP，rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP的Eastern blotting实验靶向衣壳蛋白情况图。

图10为本发明实施例4中SEQ ID NO.04与rAAV-2/2-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP，rAAV-7-GFP的Easternblotting实验靶向衣壳蛋白情况图。

图11为本发明实施例5中SEQ ID NO.02QCM图。

图12为本发明实施例6中SEQ ID NO.02AuNPs实验结果图。

图13为本发明实施例7中ELISA法测定SEQ ID NO.04与rAAV-2/2-GFP的解离常数。

图14为本发明实施例8中rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP纯化前银染图。

图15为本发明实施例8中rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP用纯化后的SEQ ID NO.04-bio后作为模版PCR和阴性对照电泳图。

图16为本发明实施例8中rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP用图18流程和SEQ ID NO.04-bio纯化后银染图。

图17为本发明实施例8中对照组的流式细胞仪检测图。

图18为本发明实施例8中实验组：纯化后的病毒转染Hela细胞后流式细胞仪检测图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：rAAV-2/2-GFP核酸适体的筛选

本实施例采用SELEX技术(图1)，利用rAAV-2/2-GFP上具有硫酸肝素结合位点、可以和以高度交联的6％琼脂糖微球为基质，肝素钠为配体的Heparin Beads 6FF结合，然后加入随机文库进行适体筛选。具体如下：

1、洗肝素珠子：取20μL(2mg/mL)的以高度交联的6％琼脂糖微球为基质，肝素钠为配体的Heparin Beads 6FF，用200μL的Binding Buffer冲洗3次，清洗去除肝素珠子保存用的缓冲液20％乙醇。

2、向上述处理过的以高度交联的6％琼脂糖微球为基质、肝素钠为配体的HeparinBeads 6FF中加入滴度为3.02×10¹² vg/mL的rAAV-2/2-GFP 5μL；

3、加入10μL3％BSA封闭，室温孵育圆周混匀仪30rpm，获得初始文库。

4、初始文库用binding buffer溶解，使得最终浓度为10μM(1OD文库溶解于260μLBinding buffer(1mM CaCl₂，2.5mM KCl，1.5mM KH₂PO4，0.5mM MgCl₂*6H₂O，137mMNaCl，8mMNa₂HPO₄，pH 7.2)中)。回收的次级文库95℃10min；随后以1℃/10s的速率降到60℃，60℃维持1min，随后继续以1℃/10s的速率降到25℃，提高次级文库的丰富度。向封闭好的以高度交联的6％琼脂糖微球为基质、肝素钠为配体的Heparin Beads 6FF和rAAV混合物中加入1OD的初始文库，(用生工公司合成的ssDNA适体文库，文库信息为5’-attggcactccacgcatagg(SEQ ID NO.05)(N40)cctatgcgtgctaccgtgaa(SEQ ID NO.06)-3′；其中n＝20-60，优选为n＝40)室温孵育圆周混匀仪30rpm。

5、第6轮开始进行灭活rAAV-2/2-GFP病毒的反筛(图2)，然后10000rpm离心3min，吸出上清液后用200μL的Washing buffer重悬，10000rpm离心3min，吸出上清液冲洗3次，将未结合的ssDNA冲洗干净，最后一次沉淀依次稀释为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷作为模板，进行PCR大量扩增(图3)。洗涤上清一起进行采用SYBR Green染料的实时荧光定量PCR扩增，分析候选适体洗脱效果，根据文库量的变化来监测筛选的进程。

核酸适体文库(ssDNA)的PCR：用正向扩增引物6-FAM-5′-attggcactccacgcatagg-3′(SEQ ID NO.05)和反向扩增引物5′-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.07)-Spacer18-ttcacggtagcacgcatagc(SEQ ID NO.08)-3′在PCR仪中按以下程序扩增：预变性：95℃5min；30个循环：95℃60s，60℃60s，72℃60s；后扩增：72℃5min。

次级配体库的回收、纯化：将回收的PCR产物进行8％尿素变性胶分离。切胶回收目的片段(本实施例使用长短链引物进行PCR，单链模板会比下游模板链短约25nt)，利用试剂盒进行核酸纯化，并进行核酸浓度定量。

核酸适体的下一轮筛选：将收集的配体库加入封闭好的以高度交联的6％琼脂糖微球为基质、肝素钠为配体的Heparin Beads 6FF和rAAV-2/2-GFP复合物中，进行下一轮筛选，除文库用量外，筛选方法与第一轮筛选相同。10轮文库点杂交验证后(图4，表1)，继续筛选2轮，再以第12轮文库为模板，通过PCR进行分子克隆，采用非修饰的上下游引物进行PCR：

表1：10轮次级文库点杂交阳性膜PCR回收产物再点杂交

编号	1	2	3
				点样	rAAV-2/2-GFP(2μL)	rAAV-2/2-GFP(2μL)	BSA
一抗	80bp+bio	80bp+bio	80bp+bio
				二抗	HRP-SA	HRP-SA	HRP-SA
结果	阳性	阳性	阴性

实施例2核酸适体的克隆和测序以及候选适体的二级结构的预测

PCR产物的回收：利用非修饰的上下游引物，对实施例1的最后一轮(第10轮)文库进行扩增，随后进行非变性胶分离，切胶回收目的条带，利用Solarbio聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收80bp条带。然后将该回收得到的条带与pEASY-T5 Zero Cloning Vector进行连接。将连接后获得的重组质粒转化感受态细胞并涂平板进行培养以获得的单菌落。

将获得的单菌落分别溶于5mL无菌含氨苄青霉素(100mg/mL)的LB培养基中，220rpm，37℃，摇菌13h直至菌液变浑浊，从5mL浑浊菌液中各取1mL出来做检测，每次各取1μL为模板用于PCR鉴定阳性克隆(克隆鉴定引物为M13F和M13R)；做点杂交和Eastemblotting实验阳性后，将各阳性克隆剩余的4mL培养菌体分别进行核苷酸序列测定。从而获得与rAAV-2/2-GFP选择性结合的适体。具体如下表2所示：

表2

候选适体编号	序列(5-3端)
		SEQ ID NO.01	attggcactccacgcataggtggtgtcctgacaaggcgtgttttccggtgtgtgtgtgggctatgcgtgctaccgtgaa
SEQ ID NO.02	attggcactccacgcataggccgcctgtactccgccttagcagttggtgggagagtttaagctatgcgtgctaccgtgaa
		SEQ ID NO.03	attggcactccacgcataggaagcgtcatgctgtcttgtagacgggatctgctctgtgttgctatgcgtgctaccgtgaa
SEQ ID NO.04	attggcactccacgcataggtcgtaatggtcgtggttttgtgtcgtgctacacattatgcctatgcgtgctaccgtgaa

通过unfold软件设置温度为25℃、Na⁺浓度为137mM，Mg²⁺浓度为0.5mM进行单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，所有适体的吉布斯自由能均在-10kcal/mol以下。

实施例3

本实施例用Dot blotting检测上述适体富集程度以及适体与rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP和rAAV-7-GFP的结合情况，具体步骤如下：

(1)点样：剪取合适大小的0.45um孔径的硝酸纤维素膜(nitrocellulose filtermembrane，NC膜)，置于滤纸上，用铅笔标明组别，确定点样位置。确定点样置的方法：用铅笔在NC膜中间的上、下方各点一点，并确定这两点在一条直上，两点连线的中间位置即为点样点位置。取蛋白样品，轻柔吹打混合均匀，1μL蛋白样品滴在NC膜点样点的位置，等待几分钟，待膜上看不到明显印后再取1μL蛋白样品滴在点样点的位置，室温下静置20min.

(2)封闭：先将NC膜放入蛋清封闭液内封闭蛋白样品内源性生物素，摇50rpm速度，室温下30min。然后取出NC膜，将膜放入5％奶粉封闭液中，室温下50rpm摇床封闭1h。

(3)一抗孵育液的制备：

阴性对照组：取10μL适体分子加入10μBWB溶液，95℃变性4min，再在室温下自然冷却1h.加入到30μL BWB溶液中，充分混匀。

(4)一抗孵育：

A、制备湿盒。

B、从封闭液中小心取出NC膜，放在湿盒中的封口膜上，用滤纸从NC膜边缘吸取膜表面多余的封闭液。将一抗孵育液均匀覆盖在NC膜上，室温下孵育2h。

(5)漂洗：一抗孵育结束后，取出NC膜，用BWB溶液漂洗。置于摇床上，50-60rpm速度，每次漂洗5min，共漂洗三次。

(6)二抗的制备：以1∶1000比例稀释，将辣根过氧化物酶标记Streptavidin加入相应体积的BWB溶液中，混合均匀，配制成二抗孵育液。

(7)二抗孵育：从BWB溶液中取出NC膜，放在湿盒中的封口膜上，用滤纸从NC膜边缘吸取膜表面多余的漂洗液。将二抗孵育液均匀覆盖在NC膜上。再将培养皿倒盖在培养皿盖上，四周用去离子水液封，室温下孵育2h。

(8)漂洗：二抗孵育结束后，取出NC膜，用BWB溶液漂洗。置于摇床上，50-60rpm速度，每次漂洗5min，共漂洗三次。

(9)配制显色剂：采用ECL发光试剂盒，以1∶1的比例，移取相应体积的A液和B液于1.5mL离心管中，充分混合均匀，用锡纸包裹住离心管。

(10)显色曝光：打开凝胶成像仪。将培养皿翻转，底部朝上，用纸巾擦拭干净。将NC膜从漂洗液中小心取出，放在培养皿底面上，用滤纸从NC膜边缘吸取膜表面多余的漂洗液。然后将显色液均匀的滴加在硝酸纤维素膜表面，放入凝胶成像仪中，曝光，拍照记录。用Quantity One软件对实验结果进行分析。结果如表3所示，√为结合，*为不结合空白为没做实验验证：

表3

由表3可知，SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.02的效果最好，该四条序列的二级结构预测结果如图5至图8所示。

实施例4

本实施例用Eastem blotting实验验证适体SEQ ID NO.02和SEQ ID NO.23与靶标的特异性结合，具体步骤如下：

1、样品处理：ssDNA，按照rAAV-EGFP∶6×loading buffer＝5∶1的比例混合，loading buffer中加入尿素，加上盖子，并于95℃金属浴加热10min。

2、灌胶：胶板验漏后，采用5％浓缩胶和12％分离胶灌胶，两块胶板上样

3、电泳：先80v后120V，1.5h。

4、SDS-PAGE染色脱色取下胶板，将标记为“胶1”的胶板进行染色1.5h后脱色观察，将标记为“胶2”的胶板用于下一步的转膜。

5、转膜

A、准备：2张大小相同的厚滤纸，剪一张与胶略大的PVDF膜；

B、转膜：电泳结束，启开胶板，按Marker将目的蛋白所在位置的胶切下，按黑板(负极)、海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、白板的顺序制作转膜夹；c.向电转槽中加满预冷的转膜液，按黑板对转膜槽的黑面、白板对红面的摆放方式将转膜夹放入遇冷的转膜电泳槽中；d.冰浴条件下，200mA，70min。

6、封闭

转膜结束后，取出PVDF膜，浸泡于5％脱脂牛奶中室温封闭1h倾去液体，将膜在TBST中漂洗一下。

7、孵育一抗：将封闭好的膜取出，漂洗后转移至稀释好的rAAV-EGFP，用一抗稀释液进行1∶500稀释，加入用生物素标记的引物(95℃变性)室温下孵育3h。

8、漂洗：孵育完一抗的PVDF膜，于TBST中漂洗3×10min。

9、孵育二抗

漂洗干净的膜，转移至相应的二抗(SSDNA，SSDNA稀释液进行稀释，1∶3000)中，室温摇动孵育2h。

10、漂洗

将膜于TBST中漂洗3×10min，漂洗完的PVDF膜转移至蒸馏水中。

11、显影

加入1∶1的显色剂，用发光成像仪曝光并拍照，用Quantity One软件分析结果如表4、图9和图10所示。

表4 SEQ ID NO.02\SEQ ID NO.04与rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFPhe rAAV-7-GFP的Eastern blotting实验靶向衣壳蛋白情况

实施例5

本实施例用QCM实验验证适体SEQ ID NO.02与靶标的特异性结合情况，

1、取金芯片，UV照射10min，30％H₂O₂∶(NH₃).H₂O∶ddH₂O＝2∶2∶10，水浴75℃，10min，自来水洗涤(二分法洗涤，避免炸裂)

2、用扳手拧开阀门，用N₂将金芯片吹干

3、组装芯片

4、打开泵，通空气，让曲线稳定下来

5、通binding buffer

6、通GSA(巯基修饰的链霉亲和素)，GSA中的巯基与金芯片结合。配置方法：30μL(15μg/mL)GSA+2970μL binding buffer

7、通MCH(β-巯基乙醇)避光处理，起封闭多余位点作用，取0.5μLMCH+7.5mLbinding buffer

8、通0.5μmol的Apt-biotin25μL(配置方法：10μmol Apt-biotin+475μL bindingbuffer)

Apt-biotin的量取决于GSA，1个链霉霉亲和素结合4个生物素

阴性对照组通入binding buffer

9、通rAAV-GFP 25μL

10、5％SDS洗涤

11、存图，关机，倒废液，放回芯片，结果如图11所示。

实施例6：

核酸适体SEQ ID NO.02的比色实验研究(AuNPs实验)

1、NaCl最适合浓度：220μM。

2、Apt最适浓度：300nM。

3、靶标浓度探索实验：3.02×10¹²vg/mL，依次稀释为图12中的浓度。

4、100μL纳米金加入40μL 300nM的适体，圆周混匀仪孵育30min，然后加入不同浓度的靶标，最后加入20μL氯化钠(2M)，然后加20μL的水补足200μL。

5、随后进行图片采集和紫外测定分析(A₅₂₀和A₆₂₀)。

结果表明，本实验获得适体能够引起纳米金粒子的变色(图12)，揭示其具有用作比色传感器检测rAAV-2/2-GFP的潜能。

实施例7

本实施例测定核酸适体SEQ ID NO.04的解离常数(Kd)

(1)ELISA表征适体的特异性和亲和性

A、PBS稀释蛋白至终浓度，每个实验组设2个复孔，包被96孔板。

B、足量分析缓冲液洗板3次，拍干板内液体。

C、1％BSA的PBS溶液封闭1h。

D、洗板：操作同步骤b。

E、用结合缓冲液稀释aptamer至目标浓度。

F、取包被好的板条，每孔加50μL。室温孵育1h。

G、洗板：操作同步骤b。

H、每孔加50μL用清洗缓冲液1∶200稀释SA-HRP，室温孵育0.5h后洗板。

I、每孔加50μL显色液。室温孵育20min，避光。

J、每孔加50μL 0.5M H₂SO₄溶液终止反应。轻轻震荡，以保证充分反应。

K、酶标仪测定A₄₅₀，结果见图13。

所用试剂

包被缓冲液(ppH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1000mL。

洗涤缓冲液(pH7.4PBST)：0.15M KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-200.05％0.5mL，加蒸馏水至1000mL。

终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL。

底物缓冲液(pH5.0)：0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7mL，0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3mL，加蒸馏水50mL。

TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5mL无水乙醇)0.5mL

底物缓冲液(pH 5.0)10mL

0.75％H₂O₂ 32μL

器材

聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μL及100μL加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶.

小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

4℃冰箱，37℃孵育箱。

实施例8：

本实施例将核酸适体分别用于含有rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP的293T细胞上清的纯化

rAAV-EGFP粗提液的制备

(1)转染rAAV病毒三质粒的细胞由华侨大学生物医学学院中试车间提供；

(2)细胞转染后64h进行收获。轻微用力摇晃转瓶，将细胞从转瓶壁上摇晃下来，连同细胞培养液一齐收集到100mL的离心管中，离心条件采用1000g，离心15min；

(3)离心结束后，缓慢倾倒，收集上清至新的容器中，记下上清液的体积，加入硫酸铵饱和溶液(50％饱和度)，混和均匀，冰浴30min后，采用8300g，4℃条件下离心10min，上清液灭活处理，沉淀可暂存于4℃条件下；含有rAAV-2/2-GFP、rAAV-DJ-GFP、rAAV-3-GFP、rAAV-6-GFP、rAAV-8-GFP、rAAV-5-GFP、rAAV-7-GFP的293T细胞上清跑SDS-PAGE电泳，并银染(图14)。

适体SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.04与链霉亲和性磁珠结合时产生位阻(相当于截短5个碱基)后序列以及二级结构前后对比后二级结构无变化。

键霉亲和性磁珠与SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.04-bio结合实验步骤：

英芮诚链霉亲和素琼脂糖磁珠

[作用对象]适用于生物素标记的蛋白、多肽、核酸、药物等生物配体液相捕获。[有效期]两年(2-8℃保存)

1.核酸捕获

B&w Buffer(2×)：10mM Tris HCI(pH 7.5)1mM EDTA，2M NaCl：B&W Buffer(1×)：5mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.5mM EDTA，1M NaCl：

2.DNA捕获

2.1向ep管中加入双倍原始磁珠体积的B&W Buffer(2×)：

2.2加入等体积的生物素化DNA的去离子水溶液至上述ep管中：

2.3室温温柔旋转混匀，孵育20-30min；

2.4磁性分离，吸弃上清液：

2.5使用B&W Buffer(1×)清洗上述磁珠-核酸复合物2-3次：

2.6直接加入一定体积B&WBuffer(1×)重新分散、待用。

3.磁分离，弃上清，加入Binding buffer，加入未纯化病毒，圆周混匀仪孵育1h

4.磁分离，弃上清，加入DEPC水，圆周混匀仪孵育30min

病毒分装放于-80℃，磁珠可回收使用，降低成本

PCR检测验证纯化方法可行性

基于ITR设计的引物，可用于不同血清型的rAAV纯化后的PCR鉴定

ITR F：cggcctcagtgagcga(SEQ ID NO.27)

ITR R：aggaacccctagtgatg(SEQ ID NO.28)

(1)配置反应体系：取1.5mLEP管，分别加入定量的水、引物、dNTP、Tap酶及Buffer，混均后分装到200μL EP管中，每管18μL，分别添加纯化回收样品，单样品反应体系如下：

(2)核酸电泳：

①8％非变性聚丙烯酰胺胶

②制胶：插入梳子，凝胶后使用；

③上样：向8％非变性聚丙烯酰胺胶中每孔5μL上样；

④跑凝：电泳槽中添加TBE缓冲液，调节电高300V，进行11min；

⑤凝凝成像仪观测结果。(图15)

纯化后，跑SDS-PAGE胶，银染

(1)配制10％的分离胶，加入过硫酸铵及TEMED，轻轻摇晃混匀，避免产生气泡，将制备的分离胶液缓慢注入凝胶模具中，随后沿玻璃板加缓慢均匀加入去离子水进行液封；胶凝后，除去封液，用滤纸吸去胶顶部残存的去离子水；

(2)配制5％的浓缩胶，将浓缩胶注入分离胶上部，避免产生气泡；

(3)插入梳子后将胶室温聚合30-45min；

(4)待检样品与蛋白上样缓冲液比例混合，于100℃煮沸变性5min，晾至室温下使用；(5)电泳槽中倒入蛋白电泳缓冲液，拔出梳子后采用实验电压进行预电泳，30min后进行上样步骤；

(6)连接电源，保证蛋白在分离胶内的实验电压为60V；

(7)样品进入浓缩胶后，电压增加至80V直到样品到达分离胶底部，随后关闭电源，卸下凝胶。

(8)银染，操作步骤如下

1.取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，加入20mL由40％乙醇和10％的乙酸组成的固定液，摇床上振荡15min。

2.倾出固定液，重复以上步骤2次。

3.倾出固定液，加入20mL的1倍体积的敏化液，置于摇床上，振荡45min。4.倾出敏化液，用双蒸水振荡清洗5min，重复清洗3次。

2.倾出双蒸水，取4mL的无水乙醇，4mL的5倍浓度的染色液和12mL的双蒸水混合后加入盛胶的器皿中，置于摇床上，振荡30min。

3.倾出染色液，用双蒸水振荡清洗30sec，重复清洗2次。

4.倾出双蒸水，依次加入20mL的1倍体积的显色液A和11μL的显色液B，置于摇床上，振荡10min，摇至蛋白质条带清晰可见。

5.快速倾出显色混合液，加入20mL的1倍体积的终止液，置于摇床上，振荡15min。

6.倾出终止液，用双蒸水振荡清洗5min，重复清洗3次后观察显色条带。(如图16所示)

AAV-EGFP的活性鉴定

用含10％FBS的DMEM/1640培养基培养人宫颈癌细胞株HeLa至对数生长期，用胰蛋白酶消化细胞，终止后用无菌PBS洗涤细胞2次，采用预冷的无水甲醇于-20℃固定，使用前进行细胞计数并调至所需的细胞密度。

将AAV与对数生长期人宫颈癌细胞株HeLa孵育转染，流式测定荧光表达值

对照组：HeLa(图17)

实验组：AAV-EGFP+HeLa(图18)

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attggcactc cacgcatagg tggtgtcctg acaaggcgtg ttttccggtg tgtgtgtggg 60

ctatgcgtgc taccgtgaa 79

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attggcactc cacgcatagg ccgcctgtac tccgccttag cagttggtgg gagagtttaa 60

gctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attggcactc cacgcatagg aagcgtcatg ctgtcttgta gacgggatct gctctgtgtt 60

gctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 4

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attggcactc cacgcatagg tcgtaatggt cgtggttttg tgtcgtgcta cacattatgc 60

ctatgcgtgc taccgtgaa 79

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attggcactc cacgcatagg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctatgcgtg ctaccgtgaa 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcacggtag cacgcatagc 20

Claims

1.一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01、SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.03或SEQ ID NO.04所示。

2.权利要求1所述的重组腺相关病毒rAAV核酸适体在识别和分离纯化重组腺相关病毒rAAV中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：采用亲和层析法。

4.一种重组腺相关病毒rAAV的分离纯化方法，其特征在于：采用权利要求1所述的重组腺相关病毒rAAV核酸适体。

5.如权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于：基于亲和层析法。