CN114410825B - 用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物、试剂盒以及方法，所述引物选自以下至少一对：SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20所示序列，或其互补序列；SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22所示序列，或其互补序列。本发明的通过找到适合杜鹃花属的鉴定的方法，获得能签别杜鹃花属的目的核酸位置，并设置了理想的引物，从而能实现对杜鹃花属物种间的有效鉴别。

Description

用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于植物物种鉴定领域，具体地，涉及用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法。
背景技术
传统的中药鉴别方法主要包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。这四种方法主要依据药材的表型特征进行鉴定，而这些特征往往不仅受到遗传因素的影响，更与生物体的生长发育阶段、外部环境条件、人类活动(如引种驯化、加工炮制)等有密切关系，从而具有很大的变异性和可塑性，也因此需要鉴定人员大量的积累和总结，导致该方法存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。
近年来，随着分子生物学技术在中药鉴定的渗透与发展，基于DNA序列的分子鉴定技术得到了迅速的发展和应用，该方法与传统的中药鉴定方法相比较，通用性强、鉴定结果重复性好、数据容易整合、便于标准化推广。
中药分子鉴定技术主要包括3大类：一是基于PCR的DNA指纹技术，如RAPD等，该方法不需具备种属特异性，不同的物种基因组可使用同一套引物分析，但RAPD对反应条件非常敏感，实验结果重复性较差；二是基于分子杂交的DNA鉴定技术，如RFLP，该方法所需DNA量较大且对纯度要求较高；三是基于序列分析的DNA鉴定，如DNA条形码等技术，是目前中药鉴定中研究和应用最多的方法。
DNA条形码技术可以与全球生物DNA条形码数据库整合，进行检索并准确鉴定，同时针对药材及基原的任何部位，都具有非常好的适用性和重复性。根据研究对象的DNA信息是否已知，基于PCR的分子鉴定技术分为随机简单限定引物PCR标记技术和特征引物的PCR标记技术，前者可通过特异条带法和聚类分析法实现中药材的准确鉴定，后者则需要获得特异性鉴别条带。位点特异性PCR技术属于后者，在《中国药典》(2010版)已经收录，目前在石斛、紫苏等植物来源的中药材鉴别中也得到广泛应用。其方法原理简单概括如下：首先针对已知待鉴别中药与混伪品基因序列进行比对分析，在确定正品的特异变异位点后，设计引物是将该位点的互补碱基设计在引物3‘端的最末端，这样正品可以扩增出特异性突变位点的基因扩增片段，但混伪品不能，从而实现真伪鉴别(韩建萍,宋经元,姚辉,等.中药材DNA条形码鉴定的基因序列比较[J].中国中药杂志,2012,37(08):1056-1061)。
DNA条形码技术基于通用的DNA片段和充分样本取样，通过两两比较种类变异和中间变异的Barcoding Gap(遗传间隔)，对物种进行区分。陈士林等学者建立了以ITS2为核心序列、trnH-psbA为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系。中国植物条形码研究组分析发现，ITS与matK、rbcL和psbA-trnH三个叶绿体DNA条形码片段任一组合可有效区分70-79％的物种(郑硕理,田晓玲,黄承玲,等.结合分子手段和形态分析验证大白杜鹃与马缨杜鹃的自然杂交[J].生物多样性,2017,25(06):627-637.)。
中国是世界杜鹃花的起源和分布中心，杜鹃花野生资源品种丰富，光是特有种就有409种。但杜鹃花属植物种类繁多，部分种间亲缘关系较近，且自然界普遍存在自然杂交现象(刘仁林,曹利民,肖红.新变种上犹杜鹃的ITS分子标记证据分析[J].广西植物,2009,29(05):576-580)，导致一些物种形态特征及其相似，采用传统形态分类法也难以科学界定种、亚种、变种自和杂交种。目前，杜鹃属分子鉴别研究还薄弱，多集中在非药用品种。
当前，采用分子生物学鉴定杜鹃属的相关研究主要集中在一些景观物种或频临灭绝的物种。其中针对景观物种，主要是侧重于DNA提取技术、PCR反应体系优化；而对于濒危物种，则主要集中在遗传结构和亲缘地理学研究。针对药用杜鹃属物种的研究较为贫乏，刘义梅(刘义梅.杜鹃花属药用植物DNA条形码的鉴定研究[D].湖北中医药大学,2011)等对杜鹃花属药用植物DNA条形码的鉴定研究显示，psbA-trnH序列在杜鹃花属(59个样品)中的鉴定成功率可达到100％，ITS2作为DNA条形码序列能够准确区别10种杜鹃花属药用植物。但其研究样本分别来自杜鹃属的9个亚属，种和种的亲缘关系较远。
本发明的岭南杜鹃Rhododendron mariae等8个易混淆品来自同属、同亚属、同个亚组，亲缘关系非常近。上述文献方法都无法区分岭南杜鹃药材及其同属近缘物种的易混淆品的鉴别，目前也没有这方面的技术报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供确实可行的对杜鹃属物种鉴定的试剂盒和方法。
实现上述目的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物，其选自以下至少一对：
SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20所示序列，或其互补序列；
SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22所示序列，或其互补序列。
在其中一些实施例中，所述引物为SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22所示序列。
在其中一些实施例中，所述杜鹃属物种为映山红亚属，进一步包括Rhododendronmariae Hance、广东杜鹃Rhododendron kwangtungense Merr.et Chun、南昆杜鹃Rhododendron naamkwanense Merr.、溪畔杜鹃Rhododendron rivulare Hand.-Mazz.、映山红Rhododendron simsii Planch.、两广杜鹃Rhododendron tsoi Merr.、乳源杜鹃Rhododendron rhuyuenense Chun ex Tam。
本发明的第二方面，提供一种用于杜鹃属物种鉴定的试剂盒，其包括上述PCR扩增引物。
所述试剂盒还可以包括用于扩增的DNA聚合酶预混液，或者是植物基因组DNA提取试剂。
发明的第三方面，提供上述PCR扩增引物的目的核酸扩增片段在杜鹃属物种鉴定中的应用。
上述应用包括，根据含有该目的核酸片段的基因区域进行引物设计，用于制备杜鹃属物种鉴定的试剂盒。
发明的第四方面，提供一种杜鹃属物种鉴定的方法，包括以下步骤：
1)对待鉴定杜鹃属物种的样本提取DNA；
2)对提取得到的DNA，用上述引物进行扩增，获得扩增产物；
3)对扩增产物进行分析。
在其中一些实施例中，扩增的温度和程序为：95℃，3min；95℃，15s，56℃，15s，72℃，15s，35个循环；72℃，5min。
在其中一些实施例中，所述对产物进行分析，包括：测序，序列拼接得到扩增子，进行比对。
在其中一些实施例中，所述对产物进行分析，还包括：对扩增产物进行比对后建立进化树。
在其中一些实施例中，所述对产物进行分析，还包括：对扩增产物进行比对后，导入基因多态性分析软件(DNasp软件)中进行核苷酸多样性分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过大量的研究，以及发明人的经验，找到适合杜鹃花属(特别是针对亲缘关系非常近的映山红亚属)的鉴定的方法，获得能签别杜鹃花属的目的核酸位置，并设置了理想的引物，从而能实现对杜鹃花属物种间的有效鉴别。
附图说明
图1基于8个杜鹃属样品的ITS2序列比对结果。
图2基于ITS2片段构建的系统发育树。
图3基于8个杜鹃属样品的psbA-trnH序列比对结果。
图4基于psbA-trnH片段构建的系统发育树；其中HHDJ为红花杜鹃(杜鹃花科)；MZM为马醉木(杜鹃花科)。
图5基于8个杜鹃属样品的matK序列比对结果。
图6基于matK片段构建的系统发育树，其中，MZM为马醉木(杜鹃花科)。
图7基于8个杜鹃属样品的rbcL序列比对结果。
图8基于rbcL片段构建的系统发育树，其中，LYDJ为亮叶杜鹃；ZYPDJ为紫玉盘杜鹃；MYBMDJ为毛叶白面杜鹃；MZM为马醉木(杜鹃花科)
图9实施例1中引物S10(左)、S11(右)扩增结果。
图10实施例1中引物S12(左)、S21(右)扩增结果。
图11实施例1中引物S24(左)、S26(右)扩增结果。
图12实施例1中引物1扩增结果。
图13实施例1中引物2和引物3的扩增结果。
图14岭南杜鹃(龙门)和映山红(云浮)的扩增结果，其中，1-2：LNDJ_MN YSH_YF——ITS2阳性对照；3-5：LNDJ_MN YSH_YF空白——引物1；6-8：LNDJ_MN YSH_YF空白——引物2；9-11：LNDJ_MN YSH_YF空白——引物3。
图15引物4的扩增结果，其中，1-11分别为：LNDJ GDDJ NKDJ YSH XPDJ_YD NKDJ_HZ YSH_FJXPDJ_HZ LNDJ_MN YSH_YF。
图16基于引物P1的扩增产物的比对结果。
图17基于引物P1的扩增产物构建的系统发育树。
图18基于引物P2的扩增产物的比对结果。
图19基于引物P2的扩增产物构建的系统发育树。
图20基于引物P3的扩增产物的比对结果。
图21基于引物P3的扩增产物构建的系统发育树。
图22变异位点分析结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)是一种分子，核酸的一类，因分子中含有脱氧核糖而得名。
PCR聚合酶链反应(polymerase chain reaction)
RAPD随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA)
RFLP限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。
在前期工作中，我们采用DNA条形码技术、RPAD聚类分析等分子鉴定方法，开展岭南杜鹃及其混淆品的鉴别研究，实验结果表明：
1)DNA条形码常用的4个片段不能有效鉴定岭南杜鹃及其混伪品：
对岭南杜鹃Rhododendron mariae、映山红Rhododendron simsii、广东杜鹃Rhododendron kwangtungense、溪畔杜鹃Rhododendron rivulare、南昆杜鹃Rhododendronnaamkwanense、两广杜鹃Rhododendron tsoi、乳源杜鹃Rhododendron rhuyuenense等来自杜鹃花科杜鹃花属映山红亚属的7种植物进行DNA条形码研究，发现这7种植物的ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL 4条序列相似度极高，基于4条序列的建树结果显示，7种植物之间的亲缘关系较近，无法通过ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL 4个条形码片段实现岭南杜鹃及其混伪品的有效鉴定。
2)RPAD聚类分析无法有效区分岭南杜鹃及其混伪品：对岭南杜鹃Rhododendronmariae、广东杜鹃Rhododendron kwangtungense、南昆杜鹃Rhododendron naamkwanense、溪畔杜鹃Rhododendron rivulare、映山红Rhododendron simsii、两广杜鹃Rhododendrontsoi、乳源杜鹃Rhododendron rhuyuenense开展RPAD聚类分析研究，结果扩增的总条带数较少，无法获取特异性条带，无法通过RAPD技术对8个杜鹃属样品进行有效的分子鉴定，实现岭南杜鹃正品和混伪品的有效区分。
本发明通过大量的实验研究，发现药用杜鹃花合适的目的基因片段，以及合适的鉴定方法，进一步设计到理想的扩增引物，该引物为SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20所示序列，或其互补序列；或SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22所示序列，或其互补序列。其中，SEQ IDNO.21与SEQ ID NO.22所示序列的鉴别效果最为理想，可实现对药用杜鹃花属物种间的有效鉴别。
以下通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述，但不用于限定本发明的保护范围。
以下实施例中涉及到的试剂和仪器：
超净工作台(苏净安泰，ARTECH)
低温离心机
多功能PCR仪(BioER，GeneTouch)
凝胶成像系统(Biometra，CHAMPCHEMI)
电泳仪(DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司)
天根植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,Plant Genomic DNA Kit(200))
DNA聚合酶预混液(擎科，Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x))
引物：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以ddH2O配制成2.5μmol/L。
实施例1
1样本信息
本研究共检测8个杜鹃属植物的样品，详细信息见表1。
表1样品信息表
2试验方法
2.1 DNA提取
分别称取各植物样品的叶片100mg，用75％乙醇擦拭晾干后，用铝箔纸包好置于液氮中，然后按照天根植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，Plant Genomic DNA Kit(200))说明书进行。
2.2 PCR扩增
以2.1项所得的DNA作为模板建立PCR体系：Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x)(擎科)22.0μL，正反向引物(浓度：2.5μmol/L，引物序列见表2)各1.0μL，DNA模板1.0μL，反应总体积为25.0μL。将PCR小管置于多功能PCR仪(BioER，GeneTouch)中，按各引物相应的温度程序(温度程序见表2)进行反应。
表2 DNA条形码引物序列和温度程序
反应完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物。
2.3 sanger测序及数据处理
选取具有阳性条带的PCR产物送检sanger测序。测序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司广州测序部或广州擎科生物技术有限公司完成。将测序所得的原始峰图导入CodonCode Aligner(Version 5.1.5.0)，去除低质量区和引物区，然后基于overlap进行拼接，得到各扩增子的序列。利用CLC Sequence Viewer(Version 8.0)软件对扩增子序列进行比对；再利用MEGA(Version 7.0)构建NJ树；将各样品的扩增子序列比对结果导入DNA Sequence Polymorphism(Version 6.12.03)软件做变异位点的分析。
2.4高通量测序
选取DNA质量符合高通量测序要求(OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥1.8，浓度50ng/ul)的样品(岭南杜鹃LNDJ与广东杜鹃GDDJ)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司广州测序部进行文库构建和测序，测序平台为Illumina HiSeq 2000，PE150，raw data≥6.0Gb。
2.5叶绿体基因组拼接
2.5.1用软件一次性拼接
采用get_organelle_from_reads.py软件对测序所得的数据进行叶绿体基因组的拼接，软件运行参数：-F embplant_pt-w 0.6-R 30-t 40-k 77,99,115,127--memory-unlimited。
2.5.2自行组合软件拼接
在NCBI下载马缨杜鹃的叶绿体基因组序列(登录号：MN711645.2)作为对照，利用bwa软件将测序所得的数据与对照序列进行比对，抽取其中类似叶绿体基因组的reads，然后利用SPAdes软件进行拼接，运行参数：-t 40-k 55,77,99,115,125--cov-cutoff auto--careful。
2.6 RAPD引物设计与扩增
我们一共设计出6条引物，如表3所示。20μL PCR反应体积中包含18μL DNA聚合酶；1μL模板DNA；1μL引物。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min,35℃退火1min；72℃延伸2min；共30个循环；最后72℃延伸7min。
表3扩增多态性引物和RAPD扩增结果
引物 序列 扩增条带数 特有条带数 共有条带数
S10 CTGCTGGGAC(SEQ ID NO.13) 0 0 0
S11 GTAGACCCGT(SEQ ID NO.14) 6 6 0
S12 CCTTGACGCA(SEQ ID NO.15) 0 0 0
S21 CAGGCCCTTC(SEQ ID NO.16) 3 0 3
S24 AATCGGGCTG(SEQ ID NO.17) 5 5 0
S26 GGTCCCTGAC(SEQ ID NO.18) 13 13 0
3试验结果
采用ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL四个条形码对样品的DNA进行扩增，扩增成功，片段大小符合预期，送检测序。
表4各样品对应的DNA条形码获取情况
3.1 ITS2
3.1.1多序列比对
对8个样品的ITS2序列进行比对，结果(图1)表明样品之间没有显著差异。
3.1.2遗传距离
利用上述得到的8个样品的ITS2序列比对结果，计算样品间的遗传距离，结果介于0.000-0.015之间(见表5)，结果表明样品间的遗传距离非常小。
表5基于ITS2序列计算的物种遗传距离
1 2 3 4 5 6 7 8
1.LN I 0.000 0.005 0.000 0.005 0.000 0.000 0.002
2.GD I -0.000 0.005 0.000 0.005 0.000 0.000 0.002
3.NK I 0.013 0.013 0.005 0.000 0.005 0.005 0.006
4.XPq I -0.000 -0.000 0.013 0.005 0.000 0.000 0.002
5.YSH I 0.013 0.013 -0.000 0.013 0.005 0.005 0.006
6.LG I -0.000 -0.000 0.013 -0.000 0.013 0.000 0.002
7.Ry I -0.000 -0.000 0.013 -0.000 0.013 -0.000 0.002
8.XPz I 0.002 0.002 0.015 0.002 0.015 0.002 0.002
3.1.3系统发育树
从GenBank下载那哈杜鹃、映山红、乳源杜鹃、溪畔杜鹃和马醉木的ITS2序列，与本项目所得的8个ITS2序列一起进行序列比对，进而构建进化树(见图2)，结果发现各物种并不能很好地聚成分支或相互区分。
3.2 psbA-trnH
3.2.1多序列比对
对8个样品的psbA-trnH序列进行比对，结果(图3)表明样品之间没有显著差异。
3.2.2遗传距离
利用上述得到的8个样品的psbA-trnH序列比对结果，计算样品间的遗传距离，结果介于0.000-0.005之间(见表6)，结果表明样品间的遗传距离非常小。
表6基于psbA-trnH序列计算的物种遗传距离
3.2.3系统发育树
从GenBank下载红花杜鹃、映山红、乳源杜鹃、溪畔杜鹃和马醉木的psbA-trnH序列，与本项目所得的8个psbA-trnH序列一起进行序列比对，进而构建进化树(见图4)，结果发现各物种并不能很好地聚成分支或相互区分。
3.3 matK
3.3.1多序列比对
对8个样品的matK序列进行比对，结果(图5)表明样品之间没有显著差异。
3.3.2遗传距离
利用上述得到的8个样品的matK序列比对结果，计算样品间的遗传距离，结果介于0.000-0.006之间(见表7)，结果表明样品间的遗传距离非常小。
表7基于matK序列计算的物种遗传距离
1 2 3 4 5 6 7 8
1.LN m 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.000
2.GD m -0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.000
3.NK m -0.000 -0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.000
4.XPq m -0.000 -0.000 -0.000 0.003 0.000 0.001 0.000
5.YSH m 0.006 0.006 0.006 0.006 0.003 0.003 0.003
6.LG m -0.000 -0.000 -0.000 -0.000 0.006 0.001 0.000
7.Ry m 0.002 0.002 0.002 0.002 0.005 0.002 0.002
8.XPz m -0.000 -0.000 -0.000 -0.000 0.006 -0.000 0.002
3.3.3系统发育树
从GenBank下载岭南杜鹃、映山红、溪畔杜鹃和马醉木的matK序列，与本项目所得的8个matK序列一起进行序列比对，进而构建进化树(见图6)，结果发现各物种并不能很好地聚成分支或相互区分。
3.4 rbcL
3.4.1多序列比对
对8个样品的rbcL序列进行比对，结果(图7)表明样品之间没有显著差异。
3.4.2遗传距离
利用上述得到的8个样品的rbcL序列比对结果，计算样品间的遗传距离，结果介于0.000-1.076(见表8)，结果表明乳源杜鹃与溪畔杜鹃(浙江)两个样品与其他样品之间的遗传距离较大，但其他样品间的遗传距离非常小。
表8基于rbcL序列计算的物种遗传距离
3.4.3系统发育树
从GenBank下载亮叶杜鹃、玉盘杜鹃、毛叶白面杜鹃、映山红、乳源杜鹃、溪畔杜鹃、岭南杜鹃和马醉木的rbcL序列，与本项目所得的8个rbcL序列一起进行序列比对，进而构建进化树(见图8)，结果发现乳源杜鹃与溪畔杜鹃(浙江)两个样品与其他样品之间明显可区分开，但其他各物种并不能很好地聚成分支或相互区分。
3.5结果判定
从序列比对及相似性(BLAST)搜索结果表明，杜鹃属的8个样品的ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL 4条序列相似度极高；而基于4条序列的建树结果也表明，8个样品之间的亲缘关系较近，因此无法通过ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL 4个条形码片段实现杜鹃属8个样品的有效鉴定。
3.6原因分析
DNA条形码的一个挑战在于其区分近缘物种的能力。资料显示，杜鹃花属是被子植物中分化程度非常高的属，具有非常多的物种，并存在人为的和自然的杂交种。因此，杜鹃属植物有效的分子鉴定方法仍需进一步研究。
3.7 RAPD
本研究共获得6对随机引物的RAPD扩增图(上样孔顺序从左到右依次为：LN GD NKXPq YSH LG Ry XPz)。由图9、图10和图11可见，扩增的总条带数较少，特异性条带几乎没有，且条带不够清晰，不可用于RPAD聚类分析，因此我们无法通过RAPD技术对8个杜鹃属样品进行有效的分子鉴定。
3.8叶绿体基因组解析
3.8.1岭南杜鹃
以NCBI数据库中的马樱杜鹃Rhododendron delavayi的叶绿体基因组(MN711645.2)为参照，使用多个拼接软件对岭南杜鹃的测序数据进行迭代拼接，得到一条带gap的叶绿体基因组DNA分子。全长：183,147bp，其中含2200未能具体确定的N，GC含量为36％。
以MN711645.2为参照对岭南杜鹃的叶绿体基因组进行比对，可见大部分序列均能匹配上，说明拼接良好。
3.8.2广东杜鹃
以NCBI数据库中的马樱杜鹃Rhododendron delavayi的叶绿体基因组(MN711645.2)为参照，使用多个拼接软件对广东杜鹃的测序数据进行迭代拼接，得到一条带gap的叶绿体基因组DNA分子。全长：152,160bp，其中含1000未能具体确定的N，GC含量为37％。
以MN711645.2为参照对广东杜鹃的叶绿体基因组进行比对，可见大部分序列均能匹配上，但在末端IR区出现较大空缺。推测原因是该区域是重复序列，拼接难度较高。
3.8.3小结
本次实验，测序质量较高，但仍无法拼接得到无gap的完整叶绿体基因组。尝试过很多次拼接和优化，仍无法获得完整的叶绿体基因组。
推测可能的原因：①DNA降解；②叶绿体基因组可能存在结构重排现象。
实施例2
1样品信息
表9样品信息表
试验方法
2.1 DNA提取
同实施例1。
2.2 PCR扩增
同实施例1，按各引物相应的温度程序(温度程序见表10)进行反应。
表10引物序列和温度程序
反应完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物。
表11引物扩增成功率和测序成功率
2.3测序及数据处理
选取具有阳性条带的PCR产物送检测序。测序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司广州测序部完成。将测序所得的原始峰图导入CodonCode Aligner(Version5.1.5.0)，去除低质量区和引物区，然后基于overlap进行拼接，得到各扩增子的序列(参见 以下序列)。利用CLC Sequence Viewer(Version 8.0)软件对扩增子序列进行比对；再利用MEGA(Version 7.0)构建NJ(Neighbor-Joining)树；将各样品的扩增子序列比对结果导入DNA Sequence Polymorphism(Version 6.12.03)软件做变异位点的分析。
P1扩增子：
TTATATAGTATCGTCGTATCGTTAATGATGTTTTTTTTTTTTCTATAGAA
TCAAATTTTTTAGTTCTAGCCCCATAGAACTAAAAAAATAGATCTTAAAA
ACTCGTGAGGTACCAAAAAATGCCCAAAATTGGAAAAATACTGCATGCGA
TAGCCAGCTGGATCAAAATCAACCAAAAGGAAATATTGGGATTCCTTTGG
GATACAGCCCTCTGGACTCGCGGACTAATCGGAACAACTTCTTTTATATC
TATAAATTTGGTATTGTACTGCGATAACTTCAATCTAGAAGATATATTCT
ATAGATTAGGACCACTTTTTTTCACAAGTTTGGCCCTACATTTTATTTAC
TATGGAATATATTTTCTCTTTTCGAAAATATAATGGAAAAAATAAGTCAG
TGAAAGACCCAGGAA(SEQ ID NO.27)
P2扩增子：
ATATTTCCTTTTGGTTGATTTTGATCCAGCTGGCTATCGCATGCA
GTATTTTTCCAATTTTGGGCATTTTTTGTTACCTCCAAAGTTTTTGGGACTATTTGTTTA
GTTCTATGCCGCTCCAAGGCTAAAACTAGATTCTATATATATTTATAAATAATTCTTAACATCACTAATGATATGATTATAGAATATCCAGAAAATCCA(SEQ ID NO.28)
3试验结果
3.1 PCR产物
本实验基于前期对岭南杜鹃和广东杜鹃的研究，分别设计了引物1(R1，F1)和引物2(R2、F2)，以及杜鹃花属物种的叶绿体基因组序列，设计了引物3(R3，F3)和引物4(R4，F4)，对上述10个杜鹃花属样品进行扩增，并以表10中的物种简称+“_P1”、“_P2”、“P3”和“P4”进行命名，如岭南杜鹃的3条片段分别为“LNDJ_P1”、“LNDJ_P2”和“LNDJ_P3”，相应的扩增产物条带如图12-15所示，引物1、引物2和引物3的PCR产物测序结果较好，可送至生物公司进行Sanger测序；引物4除样品“NKDJ”外，其余样品皆没有相应的目标条带。
3.2序列比对与建树
测序数据经处理后，将各物种的P1、P2和P3对应的扩增子的序列进行比对建树，结果分别如图16-21所示。
3.3核苷酸多样性分析
分别将四个杜鹃属样品的P1－P3的对应的比对序列导入DNasp软件中进行核苷酸多样性分析，以100bp的窗口，25bp的步进展示。结果如图22所示，可见P1的pi值最高(0.31≥pi≥0.29)，说明该片段在四个样品中的核苷酸多样性最好，是最理想的标记物；P2的pi值次之(0.30≥pi≥0.20)；而P3的pi值最低(0.20≥pi≥0.17)，说明其序列保守性较强，差异位点不多。
4结果判定
本实验共设计了三对引物(P1－P3)用于扩增杜鹃花属的10个物种的叶绿体基因组部分序列。基于序列比对、NJ树和核苷酸多态性等分析结果表明，P1和P2序列可用于杜鹃花属10个物种间的有效鉴别，特别是引物P1，综合效果最好，是最理想的标记物，能够实现对杜鹃花物种间(映山红亚属)的鉴别。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州白云山和记黄埔中药有限公司
<120> 用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法
<150> 2021115548004
<151> 2021-12-17
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttatgcatg aacgtaatgc tc 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtacagtac ttttgtgttt acgag 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccagtcca tctggaaatc ttggttc 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgatctattc attcaatatt tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctagcacac gaaagtcgaa gt 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctatatccac ttatctttca ggagt 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaagttctag cacaagaaag tcga 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgtcaccac aaacagagac taaagc 26
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtaaaatcaa gtccaccrcg 20
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgctgggac 10
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtagacccgt 10
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccttgacgca 10
<210> 16
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggcccttc 10
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatcgggctg 10
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtccctgac 10
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgattttcc ttatatagta tcg 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttttcctgg gtctttcac 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggattttcct tatatagtat crtc 24
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agttgttccg attagtccg 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cttcagcaag aagtagagct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagatagagt ttttttcgcc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccccttgac tatgtctgta t 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcctacgaaa ccgaatttc 19
<210> 27
<211> 415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttatatagta tcgtcgtatc gttaatgatg tttttttttt ttctatagaa tcaaattttt 60
tagttctagc cccatagaac taaaaaaata gatcttaaaa actcgtgagg taccaaaaaa 120
tgcccaaaat tggaaaaata ctgcatgcga tagccagctg gatcaaaatc aaccaaaagg 180
aaatattggg attcctttgg gatacagccc tctggactcg cggactaatc ggaacaactt 240
cttttatatc tataaatttg gtattgtact gcgataactt caatctagaa gatatattct 300
atagattagg accacttttt ttcacaagtt tggccctaca ttttatttac tatggaatat 360
attttctctt ttcgaaaata taatggaaaa aataagtcag tgaaagaccc aggaa 415
<210> 28
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atatttcctt ttggttgatt ttgatccagc tggctatcgc atgcagtatt tttccaattt 60
tgggcatttt ttgttacctc caaagttttt gggactattt gtttagttct atgccgctcc 120
aaggctaaaa ctagattcta tatatattta taaataattc ttaacatcac taatgatatg 180
attatagaat atccagaaaa tcca 204

Claims (7)

1.一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物，其特征在于，其序列如下：
SEQ ID NO.19 与SEQ ID NO.20所示序列。
2.根据权利要求1所述的用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物，其特征在于，所述杜鹃属物种为映山红亚属。
3.根据权利要求2所述的用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物，其特征在于，所述映山红亚属包括岭南杜鹃Rhododendron mariae Hance、广东杜鹃Rhododendron kwangtungense Merr. et Chun、南昆杜鹃Rhododendron naamkwanense Merr.、溪畔杜鹃Rhododendron rivulare Hand.-Mazz.、映山红Rhododendron simsii Planch.、两广杜鹃Rhododendron tsoi Merr.、乳源杜鹃Rhododendron rhuyuenense Chun ex Tam。
4.一种用于杜鹃属物种鉴定的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的PCR扩增引物。
5.权利要求1所述的PCR扩增引物的目的核酸扩增片段在杜鹃属物种鉴定中的应用。
6.一种杜鹃属物种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对待鉴定杜鹃属物种的样本提取DNA；
2）对提取得到的DNA，用权利要求1所述的PCR扩增引物进行扩增，获得扩增产物；
3）对扩增产物进行分析，所述分析包括：测序，序列拼接得到扩增子进行比对；对扩增产物进行比对后建立进化树；对扩增产物进行比对后，导入基因多态性分析软件中进行核苷酸多样性分析。
7.根据权利要求6所述的杜鹃属物种鉴定的方法，其特征在于，扩增的温度和程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s，56 ℃，15 s，72 ℃，15 s，35个循环；72 ℃，5 min。
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