CN112094931A - 一组扩增克罗诺杆菌mlst分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用 - Google Patents

一组扩增克罗诺杆菌mlst分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，涉及二代测序技术领域。本发明对行业标准《SNT 4525.5‑2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第5部分：克罗诺杆菌》里规定的7个管家基因同时建立扩增引物组。本发明基于上述引物组建立了用于克罗诺杆菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，同时一次PCR可以实现7个基因的扩增，直接用于建库，操作简单。本发明可以更方便的开展测序工作，加快MLST分型的速度，减少工作量。

Description

一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二 代测序建库方法和应用
技术领域
本发明属于二代测序技术领域，具体涉及一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用。
背景技术
进入21世纪以来，随着全球一体化进程的加快，人流、物流跨境规模突飞猛进，国家和人民群众对平安和健康的需求越来越高。大量的进口物品入境，给人民群众的健康安全带来了新的风险。其中由克罗诺杆菌(Cronobacter)引起的奶粉受污染事件也是层出不穷。
克罗诺杆菌属是一种重要的食源性条件致病菌，可通过污染婴幼儿配方奶粉等食品导致新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎和系统性脓毒疾等疾病。对于克罗诺杆菌感染的预防显得尤为重要。对跨境传播的克罗诺杆菌进行检测、分型和溯源对于防止病原传播，追查感染源等具有重要意义。
克罗诺杆菌的检测目前主要包括培养法、生物化学法、PCR方法等，但是对其分型方法比较多，包括血清学方法和PFGE、RFLP等分子生物学方法等，但是这些方法不统一，数据之间无法比对和印证，并且操作性和重复性等都存在较多的问题，而基于基因序列的多位点测序分型溯源(MLST)技术因为其方法稳定，实验室间可比对，操作简单，可追溯性强，成为了比较通用的方法。
MLST方法一般测定7-11个管家基因内部400～600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的序列差异赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照顺序排列构成其等位基因谱(sequence type，ST)。这样得到的每个ST均代表一类基因型的基因特点，可以通过这些基因型将不同的菌株分为不同的分型，同时根据其来源地的不同或者病理特征等信息，可以进行有效的溯源。
MLST分型中多个管家基因的序列分析比较是基于细菌序列的比较客观的存在，而目前成熟的测序技术也为序列分析提供了有力的保障。二代测序的发展和测序成本的降低，为这项在20世纪末出现的技术在目前得到广泛的推广提供了有效的动力。
目前，MLST分型技术已被应用于20多种病原细菌及3种病原真菌的分型鉴定中，脑膜炎奈瑟(Neisseria meningitidis)是最早用于评价MLST的病原菌，研究发现MLST比MLEE分析生成的遗传进化树更为合理，而且能够清晰覆盖全球大多数侵袭性脑膜炎奈瑟菌，MLST技术现在已被许多实验室用于脑膜炎奈瑟菌的分型鉴定。
针对克罗诺杆菌属的MLST分型技术早有研究，其行业标准更是已经颁布，但是采用的一代测序的方法还有一定的局限性，尤其是在具有多个管家基因时，采用普通PCR的方法一代测序需要针对同一个细菌多次扩增，测序需要外送到第三方公司，操作复杂，工作量大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，一次PCR同时实现7个基因的扩增，直接用于建库，操作简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，所述管家基因包括atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps；
扩增所述管家基因atpD的引物包括atpD-F1和atpD-R1，所述atpD-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述atpD-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
扩增所述管家基因fusA的引物包括fusA-F1、fusA-F2和fusA-R1，所述fusA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述fusA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述fusA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因glnS的引物包括glnS-F1和glnS-R1，所述glnS-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述glnS-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
扩增所述管家基因gltB的引物包括gltB-F1、gltB-F2和gltB-R1，所述gltB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述gltB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
扩增所述管家基因gyrB的引物包括gyrB-F1和gyrB-R1，所述gyrB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述gyrB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
扩增所述管家基因infB的引物包括infB-F1、infB-F2和infB-R1，所述infB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述infB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述infB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
扩增所述管家基因pps的引物包括pps-F1、pps-F2和pps-R1，所述pps-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述pps-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述pps-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的，在所述引物的F1端和R1端还分别包括通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了一种基于上述引物组的克罗诺杆菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，包括以下步骤：(1)利用所述管家基因同时对克罗诺杆菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
(2)将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
(3)取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
(4)对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
优选的，根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，步骤(1)所述一轮扩增的体系以25μL计，包括：克罗诺杆菌gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
优选的，所述引物混合液中：atpD-F1的浓度为0.2μM，atpD-R1的浓度为0.2μM；
fusA-F1的浓度为0.2μM，fusA-F2的浓度为0.3μM，fusA-R1的浓度为0.4μM；
glnS-F1的浓度为0.2μM，glnS-R1的浓度为0.2μM；
gltB-F1的浓度为0.8μM，gltB-F2的浓度为0.28μM，gltB-R1的浓度为0.4μM；
gyrB-F1的浓度为0.2μM，gyrB-R1的浓度为0.2μM；
infB-F1的浓度为0.12μM，infB-F2的浓度为1μM，infB-R1的浓度为0.4μM；
pps-F1的浓度为0.2μM，pps-F2的浓度为0.6μM，pps-R1的浓度为0.4μM。
优选的，步骤(3)所述二轮扩增的体系以25μL计，包括：一轮产物10ng，2×Mix12.5μL，P55080.25μL，P77060.25μL，余量为H2O。
优选的，在得步骤(4)所述二代测序文库后，还包括测定二轮产物的浓度。
本发明还提供了利用上述建库方法构建得到的二代测序文库在克罗诺杆菌二代测序中的应用。
本发明还提供了一种基于上述建库方法构建得到的二代测序文库的克罗诺杆菌二代测序方法，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序；所述电泳检测的电压为130V，时间为60min。
优选的，所述高通量二代测序的测序平台为PE300，或其他等效测序平台，测序数据量为250M。
本发明提供了一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，将行业标准《SNT 4525.5-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第5部分：克罗诺杆菌》里规定的7个管家基因同时建立扩增引物组。本发明还基于上述引物组建立了用于克罗诺杆菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。本发明针对克罗诺杆菌进行分析，在现有的MLST分型标准基础上，建立新的测序建库方法，可以更方便的开展测序工作，加快MLST分型的速度，减少工作量。在本发明实施例中，利用上述方法构建得到的测序文库，可直接进行高通量二代测序，克罗诺杆菌的7个管家基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号。
附图说明
图1为二轮产物电泳检测结果图，其中左侧条带为Marker(翌圣生物100bpDNALadder)。
具体实施方式
本发明提供了一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，其特征在于，所述管家基因包括atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps；
扩增所述管家基因atpD的引物包括atpD-F1和atpD-R1，所述atpD-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述atpD-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
扩增所述管家基因fusA的引物包括fusA-F1、fusA-F2和fusA-R1，所述fusA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述fusA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述fusA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因glnS的引物包括glnS-F1和glnS-R1，所述glnS-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述glnS-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
扩增所述管家基因gltB的引物包括gltB-F1、gltB-F2和gltB-R1，所述gltB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述gltB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
扩增所述管家基因gyrB的引物包括gyrB-F1和gyrB-R1，所述gyrB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述gyrB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
扩增所述管家基因infB的引物包括infB-F1、infB-F2和infB-R1，所述infB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述infB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述infB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
扩增所述管家基因pps的引物包括pps-F1、pps-F2和pps-R1，所述pps-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述pps-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述pps-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明所述7个管家基因来源于行业标准《SNT 4525.5-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第5部分：克罗诺杆菌》，其扩增引物的信息如表1所示。
表1基因引物信息
Figure BDA0002699308680000061
表1中R、Y、H、V、D和N的含义如表2所示。
表2字母含义表征序列信息
字母 含义
R A/G
Y C/T
H A/T/C
V G/A/C
D G/A/T
N A/T/C/G
在本发明中，所述引物在进行一轮扩增时，除用于基因合成的序列之外，优选还包括用于二轮引物结合扩增的通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示(ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC)。以aptD基因引物为例，其中F1(SEQ IDNO.19+SEQ ID NO.1)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGTGTACGGCCAGATGAAC；
R1(SEQ ID NO.20+SEQ ID NO.2)：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCTCCTGGCCTACTACCAG。
本发明提供了一种基于上述引物组的克罗诺杆菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，包括以下步骤：(1)利用所述管家基因同时对克罗诺杆菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
(2)将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
(3)取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
(4)对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
本发明利用所述管家基因同时对克罗诺杆菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min。本发明所述一轮扩增的体系以25μL计，优选包括：克罗诺杆菌gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。本发明对所述克罗诺杆菌gDNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规gDNA提取方法即可。
本发明所述引物混合液(七基因多重PrimerMix)中，各基因的引物浓度并不相同，具体如表3所示。
表3引物浓度
Figure BDA0002699308680000081
本发明将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量。本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，优选使用翊圣DNASelction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。在本发明中，使用26μL水洗脱后，取1μL文库使用
Figure BDA0002699308680000082
3.0Fluorometer(Qubit dsDNAHS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。在本发明实施例中，测得的文库浓度为97.6ng/μL，共获得一轮产物2537.6ng。
本发明取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min。本发明所述二轮扩增为对一轮产物添加高通量测序接头，所述接头引物P5和P7优选为翊圣384dual Index Primers Kit(Cat#12613)。本发明所述二轮扩增的体系以25μL计，优选包括：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，P55080.25μL，P77060.25μL，余量为H2O；所述二轮扩增体系中P5508中508表示P5端Index Primer编号；P7706中706表示P7端IndexPrimer编号。
本发明对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，优选使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。在本发明中，优选使用26μL水洗脱，本发明在所述洗脱后优选还包括测定文库浓度，更优选为取1μL文库使用
Figure BDA0002699308680000091
3.0Fluorometer(Qubit dsDNAHS AssayKit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。在本发明实施例中，测定的文库浓度为104ng/μL，二轮产物共获得2704ng。
本发明还提供了利用上述建库方法构建得到的二代测序文库在克罗诺杆菌二代测序中的应用。
本发明还提供了一种基于上述建库方法构建得到的二代测序文库的克罗诺杆菌二代测序方法，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序；所述电泳检测的电压为130V，时间为60min。本发明所述电泳检测可对建库片段进行初步检测，以确定片段是否得到有效的扩增，条带大小和浓度是否符合预期，如未得到扩增,可进检查体系进行再次实验。本发明所述高通量二代测序的测序平台优选为PE300，也可选用其他等效测序平台，测序数据量优选为250M。
下面结合实施例对本发明提供的一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用表1、表2和表3中所展示的信息进行下列实验：
1、一轮扩增
1)一轮引物除用于基因合成的序列之外，还会带有一段用于二轮引物结合扩增的通用序列，以aptD基因引物为例，其中F1(SEQ ID NO.19+SEQ ID NO.1)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGTGTACGGCCAGATGAAC；
R1(SEQ ID NO.20+SEQ ID NO.2)：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCTCCTGGCCTACTACCAG。
2)一轮扩增体系：25μL计：克罗诺菌株gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
3)扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min，一轮产物在4℃保存。
4)扩增产物纯化(1×beads)
使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。最后使用26μL水洗脱。
5)纯化产物浓度测定(Qubit)
取1μL文库使用
Figure BDA0002699308680000101
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度(97.6ng/μL)并计算产量(2537.6ng)。
2、二轮扩增
取部分一轮产物进行二轮扩增，即高通量测序接头添加过程，引物使用翊圣384dual Index Primers Kit(Cat#12613)。
1)扩增体系(25μL)：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，12613-P55080.25μL，12613-P77060.25μL，余量为H2O。
2)扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min。二轮产物4℃保存。
3)扩增产物纯化：(1×beads)：使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。最后使用26μL水洗脱。
4)纯化产物浓度测定(Qubit)
取1μL文库使用
Figure BDA0002699308680000102
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度(104ng/μL)并计算产量(2704ng)。
5)取150ng二轮产物电泳检测，电泳条件130V，60min。电泳结果如图1所示，表示建库片段基本得到了较好的扩增，但是因为大小基本一致，所以很难区分具体条带，需要测序后进行分析。
3、高通量测序文库信息
测序平台：PE300；测序数据量250M。
4、测序结果分析
1)数据质量如表4所示，原始数据为185M，经过过滤之后的数据为70M，过滤后数据q30达到87.38％，数据符合要求。
表4数据质量
Figure BDA0002699308680000111
2)基因序列匹配情况
表5基因匹配情况
七基因 atpD fusA glnS gltB gyrB infB ppS
匹配编号 atpD_5 fusA_1 glnS_3 gltB_3 gyrB_5 infB_5 ppS_4
表5中，利用引物atpD-F1和atpD-R1的扩增片段如SEQ ID NO.21所示，匹配到的atpD_5序列如SEQ ID NO.22所示；
利用引物fusA-F1和fusA-F2的扩增片段如SEQ ID NO.23所示，利用fusA-F2和fusA-R1的扩增片段如SEQ ID NO.24所示，匹配到的fusA_1序列如SEQ ID NO.25所示；
利用引物glnS-F1和glnS-R1的扩增片段如SEQ ID NO.26所示，匹配到的glnS_3序列如SEQ ID NO.27所示；
利用gltB-F1和gltB-F2的扩增片段如SEQ ID NO.28所示，利用所述gltB-F2和gltB-R1的扩增片段如SEQ ID NO.29所示，匹配到的gltB_3序列如SEQ ID NO.30所示；
利用gyrB-F1和gyrB-R1的扩增片段如SEQ ID NO.31所示，匹配到的gyrB_5的序列如SEQ ID NO.32所示；
利用引物包括infB-F1和infB-F2的扩增片段如SEQ ID NO.33所示，利用infB-F2和infB-R1的扩增片段如SEQ ID NO.34所示，匹配到的infB_5序列如SEQ ID NO.35所示；
利用引物pps-F1和pps-F2的扩增片段如SEQ ID NO.36所示，利用pps-F2和pps-R1的扩增片段如SEQ ID NO.37所示，匹配到的ppS_4序列如SEQ ID NO.38所示。
3)测序结果分析
克罗诺杆菌，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号，且与一代测序结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）
<120> 一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtgtacgg ccagatgaac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcctggcc tactaccag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgacgtac ctgcgatca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
crttyaaaat ygctaccgac c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtccatacgc ggaaagacg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggataacatc accattccgg ttc 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatccagatt tcgccgctaa ac 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctatcagcaa tacgcgaagc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggcggargc vatgaacag 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgatgagatc cgcataggct 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cattccgacc ggtatccac 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttcttgtt caggtattca acg 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctctctgct cgactatatc c 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
dcaggcdacv gayatygt 18
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caggaaggat tcgataacca cg 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtgtatgcc gatacccag 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggayathg artgggcnaa ag 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggaaaccgtc actttttcgt c 21
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33
<210> 21
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgggtccagc tgacggctgg tggaatccag cgggtcaacg gccgggtaga tacccaggga 60
agcaatctga cggctcagta ccacagttgc gtcaaggtgc gcaaaggtgg tggctggtga 120
cgggtcagtc aagtcatccg ccggtacgta taccgcctgt acggaggtga tagaaccggt 180
tttagtggag gtgatacgct cctgcagaac acccatctct tccgccaggg tcggctgata 240
acctaccgct gaaggcatac ggcccagcag tgcggatact tcagtaccgg ccagggtgta 300
acggtagatg ttgtcgacga acagcagaac gtcacgacct tcgtcacgga atttctcagc 360
catggtcagg ccggtcagcg caacgcgcag acggtttccc ggcggctc 408
<210> 22
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtggaatcc agcgggtcaa cggccgggta gatacccagg gaagcaatct gacggctcag 60
taccacagtt gcgtcaaggt gcgcaaaggt ggtggctggt gacgggtcag tcaagtcatc 120
cgccggtacg tataccgcct gtacggaggt gatagaaccg gttttagtgg aggtgatacg 180
ctcctgcaga acacccatct cttccgccag ggtcggctga taacctaccg ctgaaggcat 240
acggcccagc agtgcggata cttcagtacc ggccagggtg taacggtaga tgttgtcgac 300
gaacagcaga acgtcacgac cttcgtcacg gaatttctca gccatggtca ggccggtcag 360
cgcaacgcgc agacggtttc ccggcggctc 390
<210> 23
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acggtatcct ggacgacggt aaagatactc cggctgagcg tcacgctagc gatgaagagc 60
cgttctctgc actggcgttc aaaatcgcta ccgacccgtt cgttggtaac ctgacgttct 120
tccgcgtgta ctctggtgtg gttaactctg gtgataccat cctgaactcc gtgaaatccg 180
cacgtgagcg tttcggtcgt atcgtacaga tgcacgctaa caaacgtgaa gagatcaaag 240
aagttcgcgc aggcgacatc gcggctgcta tcggtctgaa agacgtgact actggtgaca 300
ccctgtgtaa cccggatcac ccgatcattc tggagcgcat ggagttccca gagccggtaa 360
tctctatcgc ggttgaaccg aaaaccaaag ctgaccagga aaaaatgggt ctggctctgg 420
gccgtctggc taaagaagac c 441
<210> 24
<211> 295
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tctggtgata ccatcctgaa ctccgtgaaa tccgcacgtg agcgtttcgg tcgtatcgta 60
cagatgcacg ctaacaaacg tgaagagatc aaagaagttc gcgcaggcga catcgcggct 120
gctatcggtc tgaaagacgt gactactggt gacaccctgt gtaacccgga tcacccgatc 180
attctggagc gcatggagtt cccagagccg gtaatctcta tcgcggttga accgaaaacc 240
aaagctgacc aggaaaaaat gggtctggct ctgggccgtc tggctaaaga agacc 295
<210> 25
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggtatcctgg acgacggtaa agatactccg gctgagcgtc acgctagcga tgaagagccg 60
ttctctgcac tggcgttcaa aatcgctacc gacccgttcg ttggtaacct gacgttcttc 120
cgcgtgtact ctggtgtggt taactctggt gataccatcc tgaactccgt gaaatccgca 180
cgtgagcgtt tcggtcgtat cgtacagatg cacgctaaca aacgtgaaga gatcaaagaa 240
gttcgcgcag gcgacatcgc ggctgctatc ggtctgaaag acgtgactac tggtgacacc 300
ctgtgtaacc cggatcaccc gatcattctg gagcgcatgg agttcccaga gccggtaatc 360
tctatcgcgg ttgaaccgaa aaccaaagct gaccaggaaa aaatgggtct ggctctgggc 420
cgtctggcta aagaagac 438
<210> 26
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggtacgtcgc ggttgcccat ttccggtttg ttcggatggt taggcatcga caccatttcg 60
ctgtggccct gcgggtagtt ttcgataacc agtttcaccg gatcgataac cgccatcgcg 120
cgcggcgcgt tctcgttgag atcttcgcga atgcaggctt ccagcgccgc catttccacg 180
gtgttatcct gtttggtcac accgatacgc ttgcagaatt cacggatgga cgcggcggta 240
taaccgcggc ggcgcaggcc ggaaatcgtc ggcatacgcg ggtcgtccca gccttcgacg 300
tgcttatcgg tgaccagcag gttcagctta cgcttggaca tcaccgtata ttccagattc 360
aggcgcgaga attcatactg gcgcgggt 388
<210> 27
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tacgtcgcgg ttgcccattt ccggtttgtt cggatggtta ggcatcgaca ccatttcgct 60
gtggccctgc gggtagtttt cgataaccag tttcaccgga tcgataaccg ccatcgcgcg 120
cggcgcgttc tcgttgagat cttcgcgaat gcaggcttcc agcgccgcca tttccacggt 180
gttatcctgt ttggtcacac cgatacgctt gcagaattca cggatggacg cggcggtata 240
accgcggcgg cgcaggccgg aaatcgtcgg catacgcggg tcgtcccagc cttcgacgtg 300
cttatcggtg accagcaggt tcagcttacg cttggacatc accgtatatt ccagattcag 360
gcg 363
<210> 28
<211> 563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tggttaacga acgtccggcg gcgacgctgc gcgatctgct ggcgctgaac ccgcaggcgg 60
acgcggtgcg cgtggaagat gtcgaaccgg cgagcgagct gttcaaacgt tttgataccg 120
cggcgatgtc tatcggcgcg ctgagcccgg aagcgcatga gtcgctggcg gaggcgatga 180
acagcctcgg cggtttctcg aactccggcg aaggcggcga agatccggcg cgttacggca 240
ccaataaagt ctcgcgcatt aagcaggtgg cctccggccg ctctggtcaa cgccgatgtg 300
attcagatta aagtggcgca gggcgcgaaa ccgggcgaag gcggccagct gcctggcgat 360
aaagtcaccc cgtacatcgc gcgtctgcgt tattcggtac cgggcgtgac gctgatctcc 420
ccgccgccgc accacgacat ctactcgatt gaagatttgg cgcagctgat tttcgactta 480
aaacaggtca acccgaaggc gatgatctcc gtgaagctgg tgtctgagcc gggcgtgggc 540
accatcgcca ccggcgtggc gaa 563
<210> 29
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctcggcggt ttctcgaact ccggcgaagg cggcgaagat ccggcgcgtt acggcaccaa 60
taaagtctcg cgcattaagc aggtggcctc cggccgcttc ggcgtgacgc ccgcgtatct 120
ggtcaacgcc gatgtgattc agattaaagt ggcgcagggc gcgaaaccgg gcgaaggcgg 180
ccagctgcct ggcgataaag tcaccccgta catcgcgcgt ctgcgttatt cggtaccggg 240
cgtgacgctg atctccccgc cgccgcacca cgacatctac tcgattgaag atttggcgca 300
gctgattttc gacttaaaac aggtcaaccc gaaggcgatg atctccgtga agctggtgtc 360
tgagccgggc gtgggcacca tcgccaccgg cgtggcgaa 399
<210> 30
<211> 506
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacccgcagg cggacgcggt gcgcgtggaa gatgtcgaac cggcgagcga gctgttcaaa 60
cgttttgata ccgcggcgat gtctatcggc gcgctgagcc cggaagcgca tgagtcgctg 120
gcggaggcga tgaacagcct cggcggtttc tcgaactccg gcgaaggcgg cgaagatccg 180
gcgcgttacg gcaccaataa agtctcgcgc attaagcagg tggcctccgg ccgcttcggc 240
gtgacgcccg cgtatctggt caacgccgat gtgattcaga ttaaagtggc gcagggcgcg 300
aaaccgggcg aaggcggcca gctgcctggc gataaagtca ccccgtacat cgcgcgtctg 360
cgttattcgg taccgggcgt gacgctgatc tccccgccgc cgcaccacga catctactcg 420
attgaagatt tggcgcagct gattttcgac ttaaaacagg tcaacccgaa ggcgatgatc 480
tccgtgaagc tggtgtctga gccggg 506
<210> 31
<211> 425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aacgccttga tgccgccttc gtaatggaag tggtcctgct taccgtcgcg cttatccacg 60
agacggatcg acacgccgga gttcaggaac gagagttcgc gcaggcgctt cgccagaata 120
tcgtattcaa actcagtgac gttggtgaag gtttcgaggc ttggccagaa acggacctga 180
gtaccggtct gatcggtgtc gccggttacg gccagcggcg cttgcggcac gccgtgcacg 240
taagtttgct ggtggatttt accttcgcgg cgaatcacca gctccagttt ctgggacagg 300
gcgttaacca cggatacgcc tacgccgtgc agaccaccgg agactttata ggagttatca 360
tcgaatttac cgcccgcgtg cagcacggtc atgataactt ccgccgccga aacgccttct 420
tccgg 425
<210> 32
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gatgccgcct tcgtaatgga agtggtcctg cttaccgtcg cgcttatcca cgagacggat 60
cgacacgccg gagttcagga acgagagttc gcgcaggcgc ttcgccagaa tatcgtattc 120
aaactcagtg acgttggtga aggtttcgag gcttggccag aaacggacct gagtaccggt 180
ctgatcggtg tcgccggtta cggccagcgg cgcttgcggc acgccgtgca cgtaagtttg 240
ctggtggatt ttaccttcgc ggcgaatcac cagctccagt ttctgggaca gggcgttaac 300
cacggatacg cctacgccgt gcagaccacc ggagacttta taggagttat catcgaattt 360
accgcccgcg tgcagcacgg tcatgataac ttccgccgcc ga 402
<210> 33
<211> 466
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccgctcgcca tacctttacg taccgctttc agttccagaa cttcggactg cagcaggatg 60
gcgtccagca gctcatcgat accggtaccc gctttcgcag aaacgtggac gaactggcaa 120
tcgccgcccc actcttccgg gatgatgccg tgctgagaca gttcgttttt aacacgatcc 180
ggatcggcat caggcttatc gattttgttc accgcaacga caaccggcac tttcgccgct 240
ttcgcgtgct ggatagcttc gatggtctga ggcatcacgc cgtcgtccgc cgcaaccacc 300
agaaccacga tatccgttgc ctgcgcacca cgtgcacgca tcgcggtaaa cgcagcgtga 360
cccggggtat ccaggaaggt gatcatgccg ttatcggtct gcacatggta tgcaccgatg 420
tgctgggtaa tgccacccgc ttcgccagat gccactttcg tggagc 466
<210> 34
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccgctcgcca tacctttacg taccgctttc agttccagaa cttcggactg cagcaggatg 60
gcgtccagca gctcatcgat accggtaccc gctttcgcag aaacgtggac gaactggcaa 120
tcgccgcccc actcttccgg gatgatgccg tgctgagaca gttcgttttt aacacgatcc 180
ggatcggcat caggcttatc gattttgttc accgcaacga caaccggcac tttcgccgct 240
ttcgcgtgct ggatagcttc gatggtctga ggcatcacgc cgtcgtccgc cgcaaccacc 300
agaacc 306
<210> 35
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acctttacgt accgctttca gttccagaac ttcggactgc agcaggatgg cgtccagcag 60
ctcatcgata ccggtacccg ctttcgcaga aacgtggacg aactggcaat cgccgcccca 120
ctcttccggg atgatgccgt gctgagacag ttcgttttta acacgatccg gatcggcatc 180
aggcttatcg attttgttca ccgcaacgac aaccggcact ttcgccgctt tcgcgtgctg 240
gatagcttcg atggtctgag gcatcacgcc gtcgtccgcc gcaaccacca gaaccacgat 300
atccgttgcc tgcgcaccac gtgcacgcat cgcggtaaac gcagcgtgac ccggggtatc 360
caggaaggtg atcatgccgt tatcggtctg cacatggtat gcaccgatgt gctgggtaat 420
gccacccgct tcgccagatg c 441
<210> 36
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atctttaata cgctcggtgg cgtcgccgca gccaaccacc gccggaatgc ccagctcgcg 60
ggcgatgatc gccgcgtgac aggtacgccc gccgcggttg gtgacaatcg ccgccgcttt 120
tttcatgata ggttcccagt ccgggtcggt catgtcggtg accagcacat cgcctggctg 180
aatacggttc atctcgctga tgtcatgaat gaccttcacg gtgcccgcgc caatgcgatg 240
gccgatggcg cggccttccg ctaccacttt cccctgcgaa tgcagcgtgt agcgctccat 300
cacctggccg cgcgagcgca cggtttccgg gcgcgcctgg acgataaaca gcttaccggt 360
gtggccatct ttagcccact cgatatccat cgggcggcca tagtgtttct caatctgtac 420
ggcctgtttc gccagctcct gcacctcttc cggcgtgatg cagaaacggt cgcgttcagc 480
ctgcggcaca tcttcgatgc gcacctgctt gccgtgctc 519
<210> 37
<211> 368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atctttaata cgctcggtgg cgtcgccgca gccaaccacc gccggaatgc ccagctcgcg 60
ggcgatgatc gccgcgtgac aggtacgccc gccgcggttg gtgacaatcg ccgccgcttt 120
tttcatgata ggttcccagt ccgggtcggt catgtcggtg accagcacat cgcctggctg 180
aatacggttc atctcgctga tgtcatgaat gaccttcacg gtgcccgcgc caatgcgatg 240
gccgatggcg cggccttccg ctaccacttt cccctgcgaa tgcagcgtgt agcgctccat 300
cacctggccg cgcgagcgca cggtttccgg gcgcgcctgg acgataaaca gcttaccggt 360
gtggccat 368
<210> 38
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtcgccgcag ccaaccaccg ccggaatgcc cagctcgcgg gcgatgatcg ccgcgtgaca 60
ggtacgcccg ccgcggttgg tgacaatcgc cgccgctttt ttcatgatag gttcccagtc 120
cgggtcggtc atgtcggtga ccagcacatc gcctggctga atacggttca tctcgctgat 180
gtcatgaatg accttcacgg tgcccgcgcc aatgcgatgg ccgatggcgc ggccttccgc 240
taccactttc ccctgcgaat gcagcgtgta gcgctccatc acctggccgc gcgagcgcac 300
ggtttccggg cgcgcctgga cgataaacag cttaccggtg tggccatctt tagcccactc 360
gatatccatc gggcggccat agtgtttctc aatctgtacg gcctgtttcg ccagctcctg 420
cacctcttcc ggcgtgatgc agaaacggtc gcgttcagcc tgcggcacat cttcgatgcg 480
cacctgcttg ccgtg 495

Claims (10)

1.一组扩增克罗诺杆菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，其特征在于，所述管家基因包括atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps；
扩增所述管家基因atpD的引物包括atpD-F1和atpD-R1，所述atpD-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述atpD-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
扩增所述管家基因fusA的引物包括fusA-F1、fusA-F2和fusA-R1，所述fusA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述fusA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述fusA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因glnS的引物包括glnS-F1和glnS-R1，所述glnS-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述glnS-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
扩增所述管家基因gltB的引物包括gltB-F1、gltB-F2和gltB-R1，所述gltB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述gltB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
扩增所述管家基因gyrB的引物包括gyrB-F1和gyrB-R1，所述gyrB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述gyrB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
扩增所述管家基因infB的引物包括infB-F1、infB-F2和infB-R1，所述infB-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述infB-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述infB-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
扩增所述管家基因pps的引物包括pps-F1、pps-F2和pps-R1，所述pps-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述pps-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述pps-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，在所述引物的F1端和R1端还分别包括通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
3.一种基于权利要求1或2所述引物组的克罗诺杆菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用所述管家基因同时对克罗诺杆菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
(2)将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
(3)取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
(4)对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
4.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，步骤(1)所述一轮扩增的体系以25μL计，包括：克罗诺杆菌gDNA5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
5.根据权利要求4所述建库方法，其特征在于，所述引物混合液中：atpD-F1的浓度为0.2μM，atpD-R1的浓度为0.2μM；
fusA-F1的浓度为0.2μM，fusA-F2的浓度为0.3μM，fusA-R1的浓度为0.4μM；
glnS-F1的浓度为0.2μM，glnS-R1的浓度为0.2μM；
gltB-F1的浓度为0.8μM，gltB-F2的浓度为0.28μM，gltB-R1的浓度为0.4μM；
gyrB-F1的浓度为0.2μM，gyrB-R1的浓度为0.2μM；
infB-F1的浓度为0.12μM，infB-F2的浓度为1μM，infB-R1的浓度为0.4μM；
pps-F1的浓度为0.2μM，pps-F2的浓度为0.6μM，pps-R1的浓度为0.4μM。
6.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，步骤(3)所述二轮扩增的体系以25μL计，包括：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，P55080.25μL，P77060.25μL，余量为H2O。
7.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，在得步骤(4)所述二代测序文库后，还包括测定二轮产物的浓度。
8.利用权利要求3～7任一项所述建库方法构建得到的二代测序文库在克罗诺杆菌二代测序中的应用。
9.一种基于权利要求3～7任一项所述建库方法构建得到的二代测序文库的克罗诺杆菌二代测序方法，其特征在于，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序；所述电泳检测的电压为130V，时间为60min。
10.根据权利要求9所述测序方法，其特征在于，所述高通量二代测序的测序平台为PE300，或其他等效测序平台，测序数据量为250M。
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