CN107674920B - 嵌合体多重pcr引物组合物和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物、以及使用该引物组合物的嵌合体检测方法。本发明所涉及的嵌合体多重PCR引物组合物包括：一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物由选自表格(I)或表格(II)中的识别引物对1～48或49～96中的任意25对以上的识别引物对组成。在本发明中，通过使用这样的25对以上的识别引物对进行多重PCR，对供体、受体及嵌合体的DNA样本进行二代基因测序分析，筛选出多个SNP差异性位点并计算嵌合率；在此基础上，再通过表(II)中的标签引物样本识别技术对样本污染问题进行控制，由此能够显著地提高检测灵敏度。

Description

嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法
技术领域
本发明涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法。
背景技术
骨髓移植是许多血液系统疾病和免疫缺陷性疾病的有效治疗措施，移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入状况即嵌合状态的形成有关。如果受者的骨髓或外周血中完全是供者的细胞，则形成完全的供者嵌合状态(CC)；如果检测到供者和受者为两种细胞成分时，则形成混合嵌合状态(MC)。在骨髓移植中，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前许多恶性血液病和一些非恶性疾病的主要治疗手段。在allo-HSCT中，移植后区分造血细胞是来源于供者还是受者很重要，对于判断是否植入、疾病复发以及干预性免疫治疗等具有临床指导意义。
正是基于造血细胞的供者或受者的来源区分以及可能的嵌合状态的重要性，近年来针对嵌合状态的检测方法得到了明显的发展。比较流行的检测方法主要根据例如红细胞抗原、细胞遗传学(染色体核型)、HLA、限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复(STR，又称为微卫星)、以及其他特殊的具有多态性的DNA分子等人群中所具有的多态性遗传标记。
在这些方法当中，目前应用最广泛的是检测灵敏度(以下，有时也称“灵敏度”)比较高的PCR法扩增微卫星序列。微卫星序列是分布于整个基因组上的呈高度多态性的串联重复序列，扩增这些区域可以区分供者或受者来源的细胞，临床上主要应用于异基因移植背景下的供体细胞嵌合率的检测。此外，为了改善检测灵敏度，也有利用短串连重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)等进行嵌合体的检测。
然而，现有所采用的PCR法的检测灵敏度例如仅达到1～5％，并且其灵敏度根据检测对象的不同而波动较大。例如，目前临床上所采用SNP识别与STR微卫星的PCR法进行嵌合体检测的方法，其检测水平仅能达到1～5％，检测灵敏度相对较低。
发明内容
本发明有鉴于上述现有的状况，其目的在于提供一种能够明显提高检测灵敏度的嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法。
为此，本发明的第一方面涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物，其包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物由选自表1中的识别引物对1～48中的任意25对以上的识别引物对组成。
表1多重PCR引物组合物中的识别引物对
Figure GDA0001223944340000021
Figure GDA0001223944340000031
Figure GDA0001223944340000041
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Figure GDA0001223944340000071
Figure GDA0001223944340000081
Figure GDA0001223944340000091
Figure GDA0001223944340000101
Figure GDA0001223944340000111
Figure GDA0001223944340000121
Figure GDA0001223944340000131
在本发明中，通过使用这样嵌合体多重PCR引物组合物，特别是经过大量SNP位点的平行检测，能够明显地提高嵌合体的检测灵敏度(例如0.1％-0.5％)。这里，“检测灵敏度”或“灵敏度”是指PCR检测灵敏度或PCR灵敏度的简称。
另外，本发明的第二方面涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物，其包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物由选自表1中的识别引物对49～96中的任意25对以上的识别引物对组成，在各组多重PCR引物组内，包含标签引物。在本发明中，通过使用这样嵌合体多重PCR引物组合物，并且利用标签引物(样本标签)进行污染控制，能够进一步提高嵌合体检测的灵敏度(例如0.01％-0.05％)。
另外，在一个示例中，在各组多重PCR引物组内，标签引物可以相同。由此，能够通过引入少量的标签引物便能够提高嵌合体检测的灵敏度。
另外，标签引物可以为4～6个碱基的核酸序列。进一步地，标签引物可以为4个碱基的核酸序列。更进一步地，标签引物可以为AGTC、CCAA、GTCT、TAGG、ACAG、TGCT、CTTC或GAGA。
此外，在一个示例中，本发明的引物组合物还可以包括一对通用测序引物。进一步地，通用测序引物可以包括表2中的F通用所示的正向引物和R_index所示的反向引物。
表2示例性的通用测序引物
Figure GDA0001223944340000132
Figure GDA0001223944340000141
在表2中，上述index是指测序仪标准配备的测序样本识别标签。
本发明的第三个方面涉及一种嵌合体检测方法，包括如下步骤：
A)使用本发明的多重PCR引物组，对供体、受体以及嵌合体DNA样本进行多重PCR扩增；
B)使用一对通用测序引物对步骤A)得到的PCR产物进行扩增；以及
C)对步骤B)得到的PCR产物进行二代测序分析，计算嵌合比率。
另外，在一个示例中，在步骤A)中可以采用热启动DNA聚合酶或高保真热启动酶进行PCR反应。
另外，在一个示例中，步骤B)使用的通用测序引物可以包括表2中F通用所示的正向引物和R_index所示的反向引物。
另外，在一个示例中，本发明的嵌合体检测方法还可以包括如下步骤：在步骤A)和/或步骤B)后对PCR产物进行纯化。进一步地，纯化步骤可以包括使用磁珠进行DNA纯化。更进一步地，磁珠可以为AMPure XP Beads。
此外，在一个示例中，嵌合体DNA样本可以由骨髓或血液提取。
根据本发明，能够明显地提高嵌合体检测的灵敏度。此外，本发明的引物组合物和检测方法不仅适用于骨髓移植后的嵌合体检测，也适用于由于基因组突变等情况造成的天然嵌合体的检测。
附图说明
图1为使用带有标签的多重PCR引物组进行嵌合体检测的方案图：在多重PCR引物中加入标签序列，同一批次分析中的各样本采用带有不同标签的引物组进行多重PCR检测，如果存在有气溶胶类污染和/或样板间交叉，可在测序结果中通过所加的标签引物来去除干扰；
图2为使用带有标签的多重PCR引物进行嵌合体检测的流程示意图；
图3为实施例1中样本1～5的PCR产物扩增图；
图4为实施例2中样本1～5的PCR产物扩增图；
图5为实施例3中样本1～6的PCR产物扩增图；
图6为实施例4中样本1～6的PCR产物扩增图；
图7为对比例1中样本1～5在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图；以及
图8为对比例2中样本1～6在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。
具体实施方式
在本实施方式中，嵌合体多重PCR引物组合物可以包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物可以由选自表1中的识别引物对1～48中的任意25对以上的识别引物对组成。在这种情况下，通过使用这样嵌合体多重PCR引物组合物，特别是经过大量SNP位点的平行检测，能够筛选出足够多的SNP差异性位点，从而明显地提高嵌合体的检测灵敏度(例如0.1％～0.5％)。
另外，嵌合体多重PCR引物组合物可以包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物可以由选自表1识别引物对1～48(共48对)组成。由此，也能够明显提高嵌合体检测的灵敏度。
另外，嵌合体多重PCR引物组合物可以包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物可以选自表1中的识别引物对49～96中的任意25对以上的识别引物对组成，在该各组多重PCR引物内，包含标签引物。在这种情况下，通过使用这样嵌合体多重PCR引物组合物，并且利用标签引物进行污染控制，能够进一步提高嵌合体检测的灵敏度(例如0.01％～0.05％)。进一步地，在该各组多重PCR引物内，标签引物相同。由此，能够通过引入少量的标签引物便能够有效地提高检测的灵敏度。
另外，嵌合体多重PCR引物组合物可以包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物可以选自表1识别引物对49～96(共48对)组成，在该各组多重PCR引物内，包含标签引物。由此，也能够进一步提高嵌合体检测的灵敏度。进一步地，在该各组多重PCR引物内，标签引物相同。
表1示出了本发明的实施方式所涉及的多重PCR引物组合物中的识别引物对。在表1中，识别引物对可以由正向引物和反向引物构成。另外，在表1中，“引物名称”一栏中下划线前的字母和数字串(例如“rs10140583_F”和“rs10140583_R”中的“rs10140583”)表示SNP位点在NCBI snp数据库中的标准编号。另外，“引物名称”一栏中下划线后的字母“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。
另外，在识别引物对1～48中，正向引物可以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:X构成。其中，SEQ ID NO:1可以位于正向引物的5’端且由通用测序正向引物的3’端序列(CCTACACGACGCTCTTCCG)和ATCT构成。另外，SEQ ID NO:X中的X可以为选自3～97中的任意奇数，且SEQ ID NO:X可以由各SNP位点的特异性引物构成。
另外，在识别引物对1～48中，反向引物可以由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:Y构成。其中，SEQ ID NO:2可以位于反向引物的5’端且由通用测序反向引物的3’端序列(gtTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA)构成，SEQ ID NO:Y中的Y可以为选自4～98中的任意偶数，且SEQ ID NO:Y可以由各SNP位点的特异性引物构成。
另外，在识别引物对49～96中，正向引物可以由SEQ ID NO:1、标签引物与SEQ IDNO:X构成。其中，SEQ ID NO:1可以位于正向引物的5’端且由通用测序正向引物的3’端序列(CCTACACGACGCTCTTCCG)与ATCT构成，SEQ ID NO:X中的X可以为选自3～97中的任意奇数，且SEQ ID NO:X可以由各SNP位点的特异性引物构成。
另外，在识别引物对49～96中，反向引物可以由SEQ ID NO:2、标签引物与SEQ IDNO:Y构成。其中，SEQ ID NO:2可以位于反向引物的5’端且由通用测序反向引物的3’端序列(gtTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA)构成，SEQ ID NO:Y中的Y可以为选自4～98中的任意偶数，且SEQ ID NO:Y可以由各SNP位点的特异性引物构成。
此外，在识别引物对49～96中，标签引物可以为由4～6个任意碱基组成的核酸序列。在一个示例中，标签引物优选为由4个任意碱基组成的核酸序列，例如可以为AGTC、CCAA、GTCT、TAGG、ACAG、TGCT、CTTC或GAGA。
如上所述，在各组多重PCR引物内，标签引物可以相同。在这种情况下，通过在多重PCR引物中引入标签引物，可以在测序结果中通过标签识别而去除特别是大批量的样本分析的污染物干扰，由此提高嵌合体检测的灵敏度。具体而言，例如在相邻检测样本间采用带有不同标签引物的引物组进行多重PCR反应；在间隔较远的检测样本间，交叉污染的可能性较小，可以采用带有相同标签引物的引物组进行多重PCR反应。如此，特别是在大批量的样本分析中，标签引物的种类并不需要很多，只需要保证临近几个样本的多重PCR引物中带有不同标签引物即可。另外，在单样本分析中，由于不存在样本间交叉污染的可能性，可以仅采用不带标签引物的多重PCR引物组进行PCR反应。
在本实施方式的引物组合物中，还可以包括一对通用测序引物。该通用测序引物对可以为任意引物对，只要满足如下要求：
1)其正向引物在3’端含有CCTACACGACGCTCTTCCGATCT或相似序列中的大部分连续碱基片段；
2)其反向引物在3’端包含gtTCCTTGGCACCCGAG AATTCCA或相似序列中的大部分连续碱基片段；
3)该引物对符合其他常规引物设计要求，如长度、GC含量、Tm值等；以及
4)该引物对符合进一步测序的要求。
在一个示例中，在一对通用测序引物中，其正向引物如表2中的F通用所示，反向引物如R_index所示。在一个示例中，反向引物R_index中的index为6-8个碱基组成的样本识别标签。在一个示例中，反向引物R_index中的index为GGTTCA、G ACCGA、ATCTCA、CCTAAC、ACACCG或TCGACA。在一个示例中，反向引物R_index中的index为CGACGTCC、TCCTTCGG、GAAATTCC、TTCCGATC、TGGGCGAT或CCTTCGGA。
由于本实施方式所述的多重PCR引物在5’端包含通用测序引物的3’端序列，因而可以直接在多重PCR反应的产物上直接进行PCR，以使PCR产物适应于下一步测序，包括加上测序中用到的标签等。相应地，由于无需将多重PCR反应产物连接质粒以进行测序扩增，可以避免低拷贝SNP位点信息在检测过程中的丢失，也是检测灵敏度提高的因素之一。
此外，针对嵌合体检测方法进行描述。在本实施方式中，嵌合体检测方法包括如下步骤：
A)使用本发明的多重PCR引物组，对供体、受体及嵌合体DNA样本进行多重PCR扩增；
B)使用一对通用测序引物对步骤A)得到的PCR产物进行扩增；以及
C)对步骤B)得到的PCR产物进行二代测序分析，计算嵌合比率。
在步骤A)中，可以采用任何合适的DNA聚合酶。在一个示例中，在步骤A)中可以采用热启动DNA聚合酶或高保真热启动酶进行PCR反应。在一个示例中，可以直接采用市售的高保真PCR扩增试剂盒进行多重PCR反应。这里，高保真PCR扩增试剂盒可以为PhusionHigh-Fidelity PCR Kit(ThermoFisher赛默飞世尔)或KAPAHiFiTMHotStart ReadyMix(KAPA高保真热启动PCR混合液，NEB Q5系列扩增酶)。
在步骤A)的多重PCR反应中，可以根据实际情况或需要采用合适的反应体系和PCR仪参数设置。在一个示例中，可以将各识别引物稀释到10μmol/L，然后将用到的所有识别引物按照等体积混合，加去离子水稀释到引物终浓度为50～200nmol/L。
另外，在一个示例中，可以将各识别引物稀释到10μmol/L，然后将用到的所有识别引物按照等体积混合，加去离子水稀释到引物终浓度为100nmol/L。
在另一个示例中，可以采用以下的多重PCR反应体系：高保真PCR扩增试剂(优选赛默飞世尔)15μl，引物对混合物(50～200nM，优选100nM)8μl，基因组DNA 1～7μl，加去离子水至30μl。在一个示例中，PCR仪的扩增程序设置如下：95℃3min；95℃15s，60℃4min，18～22个循环。
在步骤B)中，可以使用任何合适的通用测序引物对，且可以根据实际情况或需要采用合适的反应体系和PCR仪参数设置。在一个示例中，步骤B)使用的通用测序引物包括表2中F通用所示的正向引物和R_index所示的反向引物。在一个示例中，PCR仪的扩增程序设置如下：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
本实施方式所涉及的嵌合体检测方法还可以包括，：在步骤A)和/或步骤B)后对PCR产物进行纯化。在一个示例中，纯化步骤可以包括使用磁珠进行DNA纯化。在一个示例中，磁珠可以为AMPure XPBeads。在一个示例中，可以采用市售的核酸纯化试剂盒磁珠进行纯化操作。进一步地，核酸纯化试剂盒磁珠可以为Beckman AMPure XPBeads。
在一个示例中，可以在步骤A)得到的PCR反应液中加入0.5～0.8倍体积(优选0.6倍)AMPure XP Beads，混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠(此时磁珠上吸附的是基因组杂片段)，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.5～1.0倍步骤A)原始反应液体积的AMPureXP Beads，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠(此时磁珠上吸附的是步骤A)的目标产物)，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％体积百分比乙醇洗涤后蒸干。
在一个示例中，向步骤B)得到的PCR反应液加入0.9～1.2倍体积(优选1.0倍)AMPure XP Beads，混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％体积百分比乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
以下结合附图和具体实施例，对本实施方式作进一步的说明。
实施例1
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat:51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat:Q33218)进行定量，分别按照9:1、99:1、995:5、999:1和9995:5的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4和5，模拟嵌合体DNA。
采用化学合成法合成表1中不带标签的引物(引物对1～48)，每条引物的浓度稀释到10μmol/L后，将全部48对引物按照等体积混合，并用去离子水稀释到引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置PCR反应:赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，PrimerMix(100nM)8μl，基因组DNA 7μl，总共30μl。
扩增程序设置如下：保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cyclingstage)95℃15s，60℃4min，18个循环。
产物纯化：向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.6倍AMPμre XP Beads(18μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.6倍原始PCR体积的AMPμreXP Beads(18μl)，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，目标DNA产物结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl(1-5个样本中所用index依次为GGTTCA、GACCGA、ATCTCA、CCTAAC和ACACCG)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序:保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向PCR反应液/酶促反应液加入1.0倍AMPμre XP Beads(30μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)，样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图3示出样本1～5在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图3也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
表3样本1～5嵌合体检测比率
Site 受体基因型 供体基因型 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
rs10140583 G/G A/A 0.08659 0.01001 0.00480 0.00129 0.00141
rs10770083 A/A G/G 0.09781 0.01031 0.00371 0.00088 0.00078
rs11076022 A/A G/G 0.08892 0.00359 0.00470 0.00096 0.00037
rs11686988 T/T C/C 0.09405 0.00718 0.00583 0.00126 0.00086
rs1290018 C/C C/T 0.08530 0.00276 0.00285 0.00074 0.00077
rs1507072 T/T C/C 0.07816 0.00807 0.00399 0.00203 0.00202
rs2211012 G/G T/T 0.09497 0.00423 0.00305 0.00099 0.00044
rs2348478 G/G A/G 0.08788 0.01522 0.00422 0.00197 0.00188
rs2469524 G/G G/A 0.06824 0.00958 0.00371 0.00254 0.00118
rs2749612 A/A G/A 0.08480 0.01684 0.00449 0.00191 0.00189
rs335746 C/C A/A 0.07650 0.00642 0.00382 0.00081 0.00053
rs34471356 A/A A/T 0.07523 0.00883 0.00524 0.00127 0.00044
rs4333997 C/C T/C 0.08795 0.00934 0.00454 0.00130 0.00075
rs4350445 G/G G/T 0.06086 0.00657 0.00666 0.00222 0.00104
rs468696 C/C C/T 0.08408 0.02063 0.00481 0.00140 0.00146
rs6034343 C/C T/T 0.06445 0.00812 0.00352 0.00114 0.00113
rs7667671 C/C T/C 0.05836 0.00948 0.00411 0.00287 0.00211
rs7953166 A/A G/G 0.09731 0.00845 0.00444 0.00093 0.00023
rs842293 G/G G/T 0.09020 0.01577 0.00451 0.00198 0.00321
rs9564669 C/C C/T 0.07968 0.01068 0.00474 0.00205 0.00126
检测比率 0.08207 0.00960 0.00439 0.00153 0.00119
结果判断 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果错误
在本实施例中，采用未加标签的引物进行多重PCR处理，极限检测能够检测到千分之一至千分之五之间(0.001～0.005)；千分之一以下准确性降低。其中Site列表示该样本中挑出的参与计算的基因型位点(挑取的位点在供体和受体中基因型不一致)，第二/三列分别表示对应的受体与供体的基因型；样本列分别是不同样本检测到的嵌合体比率；通过所有参与计算的基因型计算出嵌合比率，即表中的检测比率。
上述表3中数字表示计算出的嵌合体比率；“检测比率”为表格中所有位点嵌合体检测比率平均值。
实施例2
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat:51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat:Q33218)进行定量，分别按照9:1、99:1、995:5、999:1和9995:5的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4和5，模拟嵌合体DNA。
采用化学合成法合成表1中不带标签的引物(引物对1～25)，将25对引物中的每条引物稀释到10μmol/L后按照等体积混合，用去离子水稀释引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置PCR反应：赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，PrimerMix(100nM)8μl，基因组DNA 7μl，总共30μl。
扩增程序设置如下：保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cyclingstage)95℃15s，60℃4min，18个循环。
产物纯化：向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍AMPμre XP Beads(15μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.5倍原始PCR体积的AMPμreXP Beads(15μl)，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，DNA结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl(1-5个样本中所用index依次为CGACGTCC、TCCTTCGG、G AAATTCC、TTCCGATC和TGGGCGAT)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序:保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向PCR反应液/酶促反应液加入0.9倍AMPμre XP Beads(27μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)，样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图4示出样本1～5在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图4也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
表4样本1～5嵌合物检测比率
Site 受体基因型 供体基因型 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
rs10140583 G/G A/A 0.086589 0.010011 0.004798 0.001294 0.001411
rs10770083 A/A G/G 0.097813 0.010311 0.003711 0.000885 0.000781
rs11076022 A/A G/G 0.088923 0.003588 0.004703 0.000955 0.000368
rs11686988 T/T C/C 0.094049 0.007178 0.005834 0.001261 0.000863
rs1290018 C/C C/T 0.085304 0.008761 0.004851 0.000738 0.000774
rs2211012 G/G T/T 0.094971 0.008230 0.005054 0.000991 0.000440
rs2348478 G/G A/G 0.087875 0.015216 0.004216 0.001966 0.001877
rs2749612 A/A G/A 0.084800 0.016842 0.004488 0.001613 0.001887
rs4333997 C/C T/C 0.087951 0.009341 0.004541 0.001304 0.000745
rs468696 C/C C/T 0.084079 0.010630 0.004807 0.001401 0.001459
rs842293 G/G G/T 0.090203 0.015766 0.004509 0.001279 0.003211
检测比率 0.089323 0.010534 0.004683 0.001244 0.001256
结果判断 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果错误
表4：在本实施例中，采用未加标签的引物进行多重PCR处理，极限检测能够检测到千分之一至千分之五之间(0.001～0.005)；千分之一以下准确性降低。其中Site列表示该样本中挑出的参与计算的基因型位点(挑取的位点在供体和受体中基因型不一致)，第二/三列分别表示对应的受体与供体的基因型；样本列分别是不同样本检测到的嵌合体比率；通过所有参与计算的基因型计算出嵌合比率，即表中的检测比率。
上述表4中数字表示计算出的嵌合体比率；“检测比率”为表格中所有位点嵌合体检测比率平均值。
实施例3
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat:51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat:Q33218)进行定量，分别按照9:1、99:1、995:5、999:1、9995:5和9999:1的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4、5和6，模拟嵌合体DNA。
采用与实施例1相同的检测步骤进行嵌合体检测，采用的多重PCR引物为识别引物对49～96。48对引物中的每条引物稀释到10μmol/L后按照等体积混合，用去离子水稀释引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
用于同一检测样本的多种PCR引物组采用相同的标签引物，在本次实验中，1～6个样本采用的标签引物依次为：AGTC、CCAA、GTCT、TAGG、ACAG和TGCT。
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置PCR反应：NEB Q5高保真聚合酶预混液(NEB Q5系列扩增酶)15μl，PrimerMix8μl，基因组DNA 4μl，去离子水3μl，总共30μl。每个样本DNA投入量大于100ng。
扩增程序设置:保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cycling stage)95℃15s，60℃4min，20个循环。
产物纯化
向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍AMPμre XP Beads(15μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.5倍上述步骤PCR反应液体积的AMPμreXP Beads(15μl)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，DNA结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：NEB Q5高保真聚合酶预混液15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl(1-6个样本中所用index依次为GGTTCA、GACCGA、ATCTCA、CCTAAC、ACACCG和TCGACA)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序:保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.9倍AMPμre XP Beads(27μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果先通过书写的perl脚本程序，获得去除非样本的标签序列，只保留该样本的标签序列；通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。这样会较好地避免样本交叉污染。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图5示出样本1～6在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图5也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
由表5可知：在本实施例中，采用加标签的引物进行多重PCR处理，极限检测能够检测到0.0001～0.0005，其中0.0001结果为下限，已经有偏差。其中Site列表示该样本中挑出的参与计算的基因型位点(挑取的位点在供体和受体中基因型不一致)，第二/三列分别表示对应的受体与供体的基因型；样本列分别是不同样本检测到的嵌合体比率；通过所有参与计算的基因型计算出嵌合比率，即表中的检测比率。
上述表5中数字表示计算出的嵌合体比率；“检测比率”为表格中所有位点嵌合体检测比率平均值。
表5样本1～6嵌合体检测比率
Site 受体基因型 供体基因型 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6
rs10140583 G/G A/A 0.086772 0.010714 0.004664 0.000578 0.000663 0.0006568
rs10770083 A/A G/G 0.102994 0.009194 0.004135 0.000533 0.000525 0.0001395
rs11076022 A/A G/G 0.109209 0.009375 0.00482 0.000949 0.000107 0.000192
rs11686988 T/T C/C 0.084572 0.007842 0.00575 0.000348 0.000205 0.0001892
rs1290018 C/C C/T 0.087258 0.01188 0.00439 0.000545 0.000658 0.0001518
rs1507072 T/T C/C 0.076484 0.009238 0.003411 0 0.00093 0.0001361
rs2211012 G/G T/T 0.078586 0.014776 0.003812 0.000833 0.000388 0.0001294
rs2348478 G/G A/G 0.099279 0.012278 0.006623 0.001512 0.000637 0.0001923
rs2469524 G/G G/A 0.071189 0.015051 0.003924 0.000844 0.00075 0.0010275
rs2749612 A/A G/A 0.091034 0.011421 0.006734 0.002071 0.000681 0.0007391
rs335746 C/C A/A 0.080029 0.012494 0.005028 0.000748 0.00045 0.000159
rs34471356 A/A A/T 0.067752 0.013631 0.005042 0.000575 0.00016 0.0004886
rs4333997 C/C T/C 0.076083 0.0005 0.004517 0.001148 0.000493 0.0008537
rs4350445 G/G G/T 0.055319 0.012847 0.00346 0.002887 0.000181 0
rs468696 C/C C/T 0.070073 0.011278 0.005684 0.001704 0.00051 0.0004923
rs6034343 C/C T/T 0.070944 0.011381 0.003182 0.000373 0.000621 0.0003369
rs7953166 A/A G/G 0.090494 0.011282 0.003878 0.00073 0.000105 0.000135
rs842293 G/G G/T 0.121445 0.010347 0.00857 0.002161 0.001481 0.0007508
rs9564669 C/C C/T 0.07367 0.012617 0.003602 0.000766 0.000376 0.0005045
检测比率 - - 0.083852 0.010955 0.004801 0.001016 0.000522 0.0003829
结果判断 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果有偏差
实施例4
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat：51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat：Q33218)进行定量，分别按照9∶1、99∶1、995∶5、999∶1、9995∶5和9999∶1的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4、5和6，模拟嵌合体DNA。
采用与实施例3相同的检测步骤进行嵌合体检测，采用的多重PCR引物为识别引物对49～73。将25对引物中的每条引物稀释到10μmol/L后按照等体积混合，引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
用于同一检测样本的多种PCR引物组采用相同的标签引物，在本次实验中，样本1～6所使用的标签序列依次是GTCT、TAGG、ACAG、TGCT、CTTC和GAGA。
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置6个反应：NEB Q5高保真聚合酶预混液15μl，PrimerMix 8μl，基因组DNA 1μl，去离子水6μl总共30μl。每个样本DNA投入量大于100ng。
扩增程序设置:保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cycling stage)95℃15s，60℃4min，20个循环。
产物纯化
向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.8倍AMPμre XP Beads(24μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入1.0倍原始PCR体积的AMPμreXP Beads(30μl)，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，DNA结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：NEBQ5高保真聚合酶预混液15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl l(1-6个样本中所用index依次为CGACGTCC、TCCTTCGG、G AAATTCC、TTCCGATC、TGGGCGAT和CCTTCGGA)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序:保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向上述PCR反应液/酶促反应液加入1.2倍AMPμre XP Beads(36μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果先通过书写的perl脚本程序，获得去除非样本的标签序列，只保留该样本的标签序列；通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。这样会较好的避免样本交叉污染。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图6示出样本1～6在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图6也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
表6样本1～6嵌合物检测比率
Site 受体基因型 供体基因型 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6
rs2749612 A/A G/A 0.091034 0.011421 0.006734 0.002071 0.000681 0.0007391
rs335746 C/C A/A 0.080029 0.012494 0.005028 0.000748 0.00045 0.000159
rs34471356 A/A A/T 0.067752 0.013631 0.005042 0.000575 0.00016 0.0004886
rs4333997 C/C T/C 0.076083 0.0005 0.004517 0.001148 0.000493 0.0008537
rs4350445 G/G G/T 0.055319 0.012847 0.00346 0.002887 0.000181 0
rs468696 C/C C/T 0.070073 0.011278 0.005684 0.001704 0.00051 0.0004923
rs6034343 C/C T/T 0.070944 0.011381 0.003182 0.000373 0.000621 0.0003369
rs7953166 A/A G/G 0.090494 0.011282 0.003878 0.00073 0.000105 0.000135
rs842293 G/G G/T 0.121445 0.010347 0.00857 0.002161 0.001481 0.0007508
rs9564669 C/C C/T 0.07367 0.012617 0.003602 0.000766 0.000376 0.0005045
检测比率 - - 0.079684 0.01078 0.00497 0.001316 0.000506 0.000446
结果判断 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果正确 结果有偏差
由表6可知，在本实施例中，采用加标签的引物进行多重PCR处理，极限检测能够检测到0.0001～0.0005，其中0.0001结果为下限，已经有偏差。其中Site列表示该样本中挑出的参与计算的基因型位点(挑取的位点在供体和受体中基因型不一致)，第二/三列分别表示对应的受体与供体的基因型；样本列分别是不同样本检测到的嵌合体比率；通过所有参与计算的基因型计算出嵌合比率，即表中的检测比率。
上述表6中数字表示计算出的嵌合体比率；“检测比率”为表格中所有位点嵌合体检测比率平均值。
对比例1
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat:51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat:Q33218)进行定量，分别按照9:1、99:1、995:5、999:1和9995:5的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4和5，模拟嵌合体DNA。
采用化学合成法合成表1中不带标签的引物(引物对1～6)，将6对引物中的每条引物稀释到10μmol/L后按照等体积混合，用去离子水稀释引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置PCR反应：赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，PrimerMix(100nM)8μl，基因组DNA 7μl，总共30μl。
扩增程序设置如下：保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cyclingstage)95℃15s，60℃4min，18个循环。
产物纯化：向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍AMPμre XP Beads(15μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.5倍原始PCR体积的AMPμreXP Beads(15μl)，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，DNA结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：赛默飞世尔高保真PCR扩增试剂15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl(1-5个样本中所用index依次为GGTTCA、GACCGA、ATCTCA、CCTAAC和ACACCG)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序：保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向PCR反应液/酶促反应液加入0.9倍AMPμre XP Beads(27μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)，样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图7示出样本1～5在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图7也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
表7样本1～5嵌合物检测比率
Figure GDA0001223944340000301
表7：在本实施例中，采用未加标签的引物进行多重PCR处理，六对引物仅能挑选出2对可用于分析的位点，由于选取的位点过少，符合计算的位点仅2个，两个位点的检测波动变异较大，无法正确的描述嵌合体比率。其中Site列表示该样本中挑出的参与计算的基因型位点(挑取的位点在供体和受体中基因型不一致)，第二/三列分别表示对应的受体与供体的基因型；样本列分别是不同样本检测到的嵌合体比率；通过所有参与计算的基因型计算出嵌合比率，即表中的检测比率。
对比例2
从两名健康志愿者(分别作为供体与受体)中由血液提取基因组DNA，采用全血基因组DNA提取试剂盒，cat:51185，Qiagen。
将上述取得的两份基因组DNA采用ThermoFisher的Qubit3.0定量仪(cat:Q33218)进行定量，分别按照9:1、99:1、995:5、999:1、9995:5和9999:1的比例进行混合，作为检测样本1、2、3、4、5和6，模拟嵌合体DNA。
采用与实施例1相同的检测步骤进行嵌合体检测，采用的多重PCR引物为识别引物对49～54。6对引物中的每条引物稀释到10μmol/L后按照等体积混合，用去离子水稀释引物终浓度为100nmol/L，该混合物为后续用到的PrimerMix.
用于同一检测样本的多种PCR引物组采用相同的标签引物，在本次实验中，1～6个样本采用的标签引物依次为：AGTC、CCAA、GTCT、TAGG、ACAG和TGCT。
多重PCR扩增
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置PCR反应：NEB Q5高保真聚合酶预混液(NEB Q5系列扩增酶)15μl，PrimerMix8μl，基因组DNA 4μl，去离子水3μl，总共30μl。每个样本DNA投入量大于100ng。
扩增程序设置:保温阶段(Holding stage)95℃3min；循环阶段(cycling stage)95℃15s，60℃4min，20个循环。
产物纯化
向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍AMPμre XP Beads(15μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，弃磁珠，向新的上清液中加入0.5倍上述步骤PCR反应液体积的AMPμreXP Beads(15μl)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl 70％乙醇洗涤后蒸干(最后蒸干得到的是磁珠，DNA结合在磁珠上)，放入回收管内。
第二轮PCR反应与纯化
采用0.2ml PCR管，在超净台里按照如下体系配置反应：NEB Q5高保真聚合酶预混液15μl，F通用(10μM)1μl，R_index(10μM)1μl(1-6个样本中所用index依次为CGACGTCC、TCCTTCGG、GAAATTCC、TTCCGATC、TGGGCGAT和CCTTCGGA)，去离子水13μl，总共30μl，直接加到上步的回收管内。
扩增程序:保温阶段95℃1min；循环95℃15s，60℃15s，72℃15s，6个循环。
向上述PCR反应液/酶促反应液加入0.9倍AMPμre XP Beads(27μl)混匀，用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，小心吸取上清至新的EP管，用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠；加入100μl70％乙醇洗涤后蒸干，最后用20μl去离子水洗脱，得到洗脱液(即PCR产物)。
高通量测序与信息分析
测序结果先通过书写的perl脚本程序，获得去除非样本的标签序列，只保留该样本的标签序列；通过生物信息软件bwa(BWA，2009，PMID19451168)样本序列与标准基因组比较，获取指定SNP位点的碱基序列，通过挑取在供体和受体中基因型不一致的位点，并结合供受体遗传信息，计算嵌合体比率。这样会较好地避免样本交叉污染。
将第二轮PCR得到的洗脱液(即PCR产物)进行凝胶电泳检测，用洗脱液直接进行点样，该凝胶电泳的PCR扩增图的目的是检测到扩增条带；只要检测条带正确，说明扩增成功。
图8示出样本1～6在第二轮PCR之后得到的PCR产物电泳图。由图中可以看出处于图片上方的条带是我们得到的目的PCR产物，分子量在200bp左右，下面的条带是没有扩增的剩下的引物条带。从图8也可以看出，通过本发明多重引物对扩增的目标位点条带均控制在200bp左右。
在本实例中，采用加标签的引物进行多重PCR处理，六对引物未能挑选出可用于分析的位点，由于选取的位点过少，无法正确的描述嵌合体比率。
虽然以上结合附图和实施例对本发明进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本发明。本领域技术人员在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本发明进行变形和变化，这些变形和变化均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学附属第一医院；上海茂槿生物技术有限公司
<120> 嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法
<130> SE160030-01CN
<160> 101
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctacacgac gctcttccga tct 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttccttggc acccgagaat tcca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctatacaat gtttgtgttt caagctaagt g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttttccttc aataataaat cagccttagc tta 33
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaacccat ccctggaact aataag 26
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<213> 人工序列
<400> 6
atggtattat atttttgcct caaattccac tta 33
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ccctttgaga gcctatgtgt ca 22
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<213> 人工序列
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tccaaaatgt gttttctttg tcaccaaaa 29
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<213> 人工序列
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agaaccttgt cagccaagtt ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccactcagga atccaaagat ttggaaa 27
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<213> 人工序列
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agatagtaac agtgttttaa gcactttgga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catgggcaag tgacctctgt ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agcaggtact ttgtcagaaa tgca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tagctcagtg gtttcaaact ttattgagt 29
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcctcataag atagataatg ctgttacca 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttctttaag agggtctctc tcatcca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agaggaaagg gtctgtatgt gtaga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgggaaca atatactaga actatttgct 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttttggtcca ggtaacttgg attcat 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caaaggacat acttcacatt tctttagcac 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cacgtcatga gaaactactt gcct 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtagaagaga caataaatgg gatatgtggt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ataaaagtct tgcagggaca tccttt 26
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcagattcac aaagaatctt aactaggaga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcatatgcat acatgagttg cagatg 26
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgccaaaag tggaagccag aagt 24
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<213> 人工序列
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cctctttgaa aggcactgag aact 24
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<213> 人工序列
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gcaacaagag ctaaatgaat ctcattctta 30
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<213> 人工序列
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ccatgtagca cccagtgaaa ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cttcacggct gataaagaag acac 24
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<213> 人工序列
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cttagagacc tgtgattaca cacatgt 27
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<213> 人工序列
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ggaatctgaa aatccctcaa ctgctta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctttctcag atcttgttac caattttcca 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatattcagt ttgtttggaa ggaaggatg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaaagtcaa tcaaagccaa atgtagt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtcagggat gggaccattt aaaaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ccgcacaaga agtcgttgta ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cagaatggat ggcatgtcac ttg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gggccaggcc taggtttagt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gcccagaggg tactgaaaca c 21
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<213> 人工序列
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gaggaaggcg agatgctgaa t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gcaatgctct ggcttggtac a 21
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<213> 人工序列
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cttttcaatt tgccagcttc acaac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaacctggt aatttgtttt gattatgtgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcacaattg cttttctcat cacagag 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cccattccaa accctccaca a 21
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<213> 人工序列
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acctgggaaa ctagccttct ga 22
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<213> 人工序列
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actgaggtac ttttcagcca tttgg 25
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<213> 人工序列
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cgccgtcctc aaggtcaata 20
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<213> 人工序列
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ggagtttgca cggctacagt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcaggtcta gtccagactc ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagctccaag gaatatatag gcattacaa 29
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<213> 人工序列
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cattttcctc caagatatca ggacctt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttcaaacat aaccagtttg catgttga 28
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<213> 人工序列
<400> 55
gagaatcaat cccacccact tct 23
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<213> 人工序列
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gcaacatgct ttcaaattca ggtgaa 26
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<213> 人工序列
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gctgagcgcc tggatacaat aa 22
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<213> 人工序列
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gcaagttcca gaatccgaag tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cccagtctgt tcctctgcat ta 22
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<213> 人工序列
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ggaaaagaga attccctctt gcact 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cggccttcct cctttttatt ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcaaaatctc cttgggttga gtagag 26
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cagtctagtc tcctttagat ttacagcttt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cccataggca ctcccttgag a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagggaggtt tttaacttga cttagctag 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
ggtggaaggc atttctctcc at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ttcttttgtg gatctatcaa cagctcaa 28
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
agggagtaag ggctgaaaaa cg 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
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<211> 29
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<213> 人工序列
<400> 81
tattcttcca ataataccag gcaccaaaa 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gcaaagcagc agagttcaat ctc 23
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcagttttcc taactttgca tgacca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gatgtagaag gaacccacag aca 23
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<213> 人工序列
<400> 86
caaaaccctc ctcagccttc aa 22
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<213> 人工序列
<400> 87
catttccttt agacctttaa gatgaaattg tt 32
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
aaggcttgaa ataataactc tatgttcaac tca 33
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
cagctgagct gtcacctcat tt 22
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
gcagtcactg tccttttgac atgaa 25
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gctacaaatg ataaccaagc aatattggt 29
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
ctatcctgca attcagtcaa gtcct 25
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
gccatgtgga tgtagggttc at 22
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gagcaaggac tctgccttag ttac 24
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tctcctcagt ctacacaatt tccct 25
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gggagtggga cgtattttag gc 22
<210> 97
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
ggcaccaaga tttttcagca ttagag 26
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gctactgtgt tatcactgct tcca 24
<210> 99
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccg 54
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 101
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
gtgactggag ttccttggca cccgagaatt cca 33

Claims (7)

1.一种嵌合体多重PCR引物组合物，包括：
一组以上的多重PCR引物，并且
表格(I)
Figure FDA0002793345250000011
Figure FDA0002793345250000021
Figure FDA0002793345250000031
Figure FDA0002793345250000041
Figure FDA0002793345250000051
Figure FDA0002793345250000061
各组多重PCR引物由选自表格(I)中的识别引物对1～48中的1～25或1～48的识别引物对组成。
2.一种嵌合体多重PCR引物组合物，包括：
一组以上的多重PCR引物，并且
表格(II)
Figure FDA0002793345250000062
Figure FDA0002793345250000071
Figure FDA0002793345250000081
Figure FDA0002793345250000091
Figure FDA0002793345250000101
Figure FDA0002793345250000111
Figure FDA0002793345250000121
各组多重PCR引物由选自表格(II)中的识别引物对49～96中的49～73或49～96的识别引物对组成，
在所述各组多重PCR引物内，包含标签引物。
3.根据权利要求2所述的引物组合物，其中，
在所述各组多重PCR引物内，所述标签引物相同。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其中，
所述标签引物为4～6个碱基的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的引物组合物，其中，
所述标签引物为AGTC、CCAA、GTCT、TAGG、ACAG、TGCT、CTTC或GAGA。
6.根据权利要求1或2所述的引物组合物，还包括：
一对通用测序引物。
7.根据权利要求6所述的引物组合物，其中，
表格(III)
Figure FDA0002793345250000131
所述通用测序引物包括表格(III)中的F通用所示的正向引物和R_index所示的反向引物。
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