CN110734974A - 一种癌症化疗用药snp位点组合以及检测引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种癌症化疗检测位点的组合、检测所述位点的引物设计方法、引物组合和检测方法及试剂盒，针对SNP位点设计特异性引物，并在所述特异性引物上游引物的5’端添加SEQ ID.NO1，在所述特异性引物下游引物5’端添加SEQ ID.NO2。本申请具有如下优点：成本低，通量高，检测范围广，检测时间短；采用多种PCR策略组合的方式，增加检测范围；检测灵活性高，可根据不同的要求设置不同的引物组。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化疗用药SNP位点组合/检测引物设计方法/引物组/试剂盒及其应用。
背景技术
化疗是指使用化学药物抑制细胞生长繁殖、杀死肿瘤细胞或者促进肿瘤细胞分化的一种治疗方法，该方法被广泛应用于癌症治疗，但是越来越多的临床实验表明，化疗药物使用后的治疗效果因人而异。
SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性、或单碱基多型性)是属于第三代遗传标记，广泛地分布于染色体上。SNP主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入和缺失等。目前发现，某些SNP位点的基因型与特定化疗药物的治疗效果有明显的相关性，如果在确定治疗方案前对这些SNP位点进行检测，就能协助诊疗方案确定，减少无效治疗的时间，提高患者生存周期。
目前有很多实验室采用多重PCR技术来检测化疗引物用药相关SNP位点，二代测序技术由于其具有通量高的特性，且随着测序时间的逐步缩短，使用二代测序进行化疗SNP位点检测价格低廉周期较短的普遍筛查可行性增强。
发明内容
本发明提供一种癌症化疗检测位点的组合、检测所述位点的引物设计方法、引物组合和检测方法及试剂盒。本发明主要是使用多重PCR技术对目的区域进行富集后进行二代测序，通过生物信息学手段对化疗SNP位点进行分型，最后对化疗药物治疗是否敏感进行预测。
本申请提供了一种SNP位点组合，包括如下位点：rs1801133、rs2072671、rs60369023、rs1934951、rs1113129、rs183484、rs9937、rs1042858、rs2306283、rs11045879、rs116855232、rs4646、rs8060157、rs2232228、rs1042522、rs183205964、rs151264360、rs25487、rs1799782、rs13181、rs1052555、rs1056836、rs1872328、rs10497203、rs7582141、rs6432512、rs7270101、rs1056892、rs3892097、rs738409、rs2228001、rs1801019、rs924607、rs1801394、rs442767、rs1142345、rs1800460、rs2234693、rs9340799、rs4880、rs121434568、rs7779029、rs1045642、rs7853758、rs885004。
本发明第二个方面是提供一种用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物，包括：针对所述SNP位点设计的特异性引物，并在所述特异性引物上游引物的5’端添加SEQID.NO1，在所述特异性引物下游引物5’端添加SEQ ID.NO2。
在一种优选实施例中，所述用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物还包括第二轮PCR扩增引物。
在一种优选实施例中，所述特异性引物选自SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.88中的至少一对或更多对。
在一种优选实施例中，所述第二轮PCR扩增引物为SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90。
本发明第三个方面是提供一种所述用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物的设计方法，包括：获得SNP位点，针对SNP位点设计特异性引物，并在所述特异性引物上游引物的5’端添加SEQ ID.NO1，在所述特异性引物下游引物5’端添加SEQ ID.NO2。
本发明第四个方面是提供一种连接在用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物两端的核苷酸序列，包括SEQ ID.NO1、SEQ ID.NO2。
本发明第五个方面是提供一种用于多重PCR检测上述SNP位点组合的试剂盒，包括，上述的用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物。
在一种优选实施例中，所述试剂盒还包括PCR扩增用的超纯水。
在一种优选实施例中，所述试剂盒还包括一轮PCR扩增酶，优选为多重PCR扩增酶，更优选为Vazyme多重PCR扩增酶。
在一种优选实施例中，所述试剂盒还包括二轮PCR扩增酶，优选为PCR扩增酶Q5。
和现有发明相比，本申请具有如下优点：
1)成本低，检测范围广；
2)通量高；
3)检测时间短；
4)采用多种PCR策略组合的方式，增加检测范围；
5)检测灵活性高，可根据不同的要求设置不同的引物组。
附图说明
图1为采用本申请引物和试剂盒所得待测序产物的Q-Sep鉴定结果。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明的目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
后续的描述中阐述了很多具体细节以便充分了解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
本发明涉及一种化疗用药检测的位点、引物设计方法及引物组合。本发明针对目前国内常用的化疗药物筛选出45个SNP位点。具体如表1所示：
表1，SNP位点：
根据上述SNP位点，本申请使用primer3设计了86条特异性引物和2条通用引物，所有引物分为两组，第一组包括86条特异性引物(SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.88)和2条通用引物(SEQ ID NO.89-SEQ ID NO.90)。其中，第一组为第一轮PCR引物，每条第一轮PCR上游引物的5’端添加SEQ ID.NO.1，下游引物5’端添加SEQ ID.NO.2。
实施例2
本发明所述引物进行多重PCR扩增方法如下：
1)一轮PCR：使用第一组引物进行PCR反应，优选的其PCR程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，58℃30s，56℃30s，70℃1min(3cycles)；95℃30s，68℃1min(15cycles)；72℃5min；4℃∞。如表2所示：
表2，第一轮PCR扩增反应体系和扩增反应条件
2)一轮纯化，使用Ampure beads和磁珠buffer对目标产物进行两次纯化，优选比例为1X和1.2X；具体地：将两管PCR产物混合至一管；加入15μL(Ampure beads)磁珠混合均匀静置5min然后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清；使用80％乙醇清洗两边后晾干；使用15μL蒸馏水回溶3min后加入18μL beads buffer混匀，静置5min；使用80％乙醇清洗两边后晾干；使用22μL蒸馏水回溶后吸取20μL上清准备进行第二轮PCR反应。
3)二轮PCR，使用引物组6进行二轮PCR,优选的PCR反应程序为95℃5min；95℃30s，65℃1min(8cycles)；72℃5min；4℃∞。如表3所示：
表3，第一轮PCR扩增反应体系和扩增反应条件
4)二轮纯化，使用Ampure beads和纯化buffer进行目标PCR产物进行两次纯化，优选比例为0.9X和1.2X；具体地：加入45μL(Ampure beads)磁珠混合均匀静置5min然后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清；使用80％乙醇清洗两边后晾干；使用20μL蒸馏水回溶3min后加入24μL beads buffer混匀，静置5min；使用80％乙醇清洗两边后晾干；使用22μL蒸馏水回溶后吸取20μL上清准备测序使用。
5)测序，对步骤4)获得的产物进行二代测序，测序方式为PE150。
6)分析，对步骤5获得的数据进行化疗用药SNP位点分型分析。
实施例3
使用5mL EDTA采血管收集某健康自愿者血液，使用QIAGEN试剂盒提取血细胞gDNA，作为多重PCR扩增的DNA模板。采用实施例2多重PCR技术进行检测。
测定样品浓度为15ng/μL。Q-Sep结果如图1所示。
表4，下机数据质量评估
| 测序原始reads(条) | 质控后剩余reads数(条) | 质量控制后剩余数据比例 |
| 725000 | 619254 | 85.4％ |
样品使用illumina测序仪进行测序，共测得reads数目未725000条，经过质控(去除质量不合格的reads)，剩余619254条reads，质控合格reads占总reads数的85.4％。
表5，参考序列比对和depth数据统计
文库插入片段平均长度为294bp，建库过程加上测序通用序列后完整文库大小为(371-598bp)，质控合格的reads有99.72％都能对应比对到人类基因组序列上，数据显示，该样本45个SNP位点都能被检测到。
表6，分型结果
以上为该样本中检测到突变的SNP位点，第一列为SNP位点名称，第二列和第三列为染色体编号和对应的位置坐标，第四列为野生型的碱基类型，第五列为突变型碱基类型，最后一列为该样本对应SNP位点的基因型(列表中未出现的SNP位点为纯合野生型)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海艾汭得基因科技有限公司
<120> 一种癌症化疗用药SNP位点组合以及检测引物
<130> IPI20190813
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tgtgcttctg aagagccagg 20
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gtctctgcca cagcccttag 20
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tgtgggtatt gttgcattgt ttct 24
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cggctctaac cttatcggat tca 23
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tcatattgtg cagttcccca gt 22
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<212> DNA
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aaacacggta ggtggctaaa ca 22
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tcatccatta cattttcagg cttt 24
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tccctgatgt cattcttcat agta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgatgtgag gttccagggc 20
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cacctgcagg cggttctc 18
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cctggcatga acatgaccct 20
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gccacctcct tactttgcct 20
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tgttcccatt tccaggctcc 20
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caaaccagga cagggctgaa 20
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atcaggcagc ttccctatct ac 22
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cagcacctac catgccttac c 21
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<211> 45
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
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<211> 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 268
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgc 53
Claims (10)
1.一种SNP位点组合，其特征在于，包括如下位点：rs1801133、rs2072671、rs60369023、rs1934951、rs1113129、rs183484、rs9937、rs1042858、rs2306283、rs11045879、rs116855232、rs4646、rs8060157、rs2232228、rs1042522、rs183205964、rs151264360、rs25487、rs1799782、rs13181、rs1052555、rs1056836、rs1872328、rs10497203、rs7582141、rs6432512、rs7270101、rs1056892、rs3892097、rs738409、rs2228001、rs1801019、rs924607、rs1801394、rs442767、rs1142345、rs1800460、rs2234693、rs9340799、rs4880、rs121434568、rs7779029、rs1045642、rs7853758、rs885004。
2.一种用于多重PCR检测权利要求1所述SNP位点组合的引物，其特征在于，包括：针对所述SNP位点设计的特异性引物，并在所述特异性引物上游引物的5’端添加SEQ ID.NO1，在所述特异性引物下游引物5’端添加SEQ ID.NO2。
3.根据权利要求2所述的用于多重PCR检测权利要求1所述SNP位点组合的引物，其特征在于，还包括第二轮PCR扩增引物。
4.根据权利要求3所述的用于多重PCR检测权利要求1所述SNP位点组合的引物，其特征在于，所述第二轮PCR扩增引物为SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90。
5.根据权利要求2所述的用于多重PCR检测权利要求1所述SNP位点组合的引物，其特征在于，所述特异性引物选自SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.88中的至少一对或更多对。
6.一种权利要求2所述引物的设计方法，其特征在于，包括：获得SNP位点，针对SNP位点设计特异性引物，并在所述特异性引物上游引物的5’端添加SEQ ID.NO1，在所述特异性引物下游引物5’端添加SEQ ID.NO2。
7.一种连接在权利要求2所述引物两端的核苷酸序列，其特征在于，包括SEQ ID.NO1、SEQ ID.NO2。
8.一种用于多重PCR检测权利要求1所述SNP位点组合的试剂盒，其特征在于，包括，权利要求2的用于多重PCR检测上述SNP位点组合的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增用的超纯水。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一轮PCR扩增酶、二轮PCR扩增酶中的任意一种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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