CN107446995A - 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 - Google Patents
用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107446995A CN107446995A CN201710546580.8A CN201710546580A CN107446995A CN 107446995 A CN107446995 A CN 107446995A CN 201710546580 A CN201710546580 A CN 201710546580A CN 107446995 A CN107446995 A CN 107446995A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- specific
- modification
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 11
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 10
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 10
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 10
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 10
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 10
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 9
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 claims description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 6
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 125000005365 aminothiol group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- -1 thio-modification Chemical compound 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 44
- 239000002585 base Substances 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102100022887 GTP-binding nuclear protein Ran Human genes 0.000 description 3
- 101000774835 Heteractis crispa PI-stichotoxin-Hcr2o Proteins 0.000 description 3
- 101000620756 Homo sapiens GTP-binding nuclear protein Ran Proteins 0.000 description 3
- 101100393821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GSP2 gene Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000283953 Lagomorpha Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组以及使用所述引物组扩增样品中多个目标DNA序列的方法，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物：每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)与目标序列之外的序列不发生扩增、(2)之间不形成二聚体、(3)不形成发卡结构；在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；在所述特异性序列的3’端有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。
Description
本申请是申请日为2016年5月6日，申请号为201610293653.2，发明名称 为“用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组及其应用”的发明专利申请的 分案申请。
技术领域
本发明涉及核酸序列的捕获、富集与分析。更具体来说，本发明涉及基于多 重PCR的目标序列富集方法。
背景技术
全基因组测序可以获得全基因组水平范围的突变、插入、缺失以及结构变异。 然而，由于基因组容量巨大，以30×进行测序就会产生接近100G的数据量。而 肿瘤等相关的低突变频率测序则需要至少1000×的覆盖度，如果进行全基因组 测序，则会产生3000G的数据量。这样规模的数据量除了会对数据的分析工作 造成极大的困难，还会显著增加测序的成本，进而制约测序的应用。为了解决这 个难题，目标区域捕获技术应运而生。
目标区域捕获技术是指通过特定的技术手段定向捕获目标区域的核酸序列， 然后进行建库测序，以达到在对目标区域进行深度测序的目的的同时使得测序成 本大大降低。PCR是一种常见的用于富集目标区域的技术，更为常见的是利用 多重PCR技术一次性的捕获多个目标区域。多重PCR适用于热点区域或者长度 较小的目标区域的捕获。制约多重PCR技术应用的两个重要因素是非特异扩增 和二聚体的产生。
因此，本领域中需要能有效降低非特异扩增和二聚体产生的多重PCR技术 出现。
发明内容
本发明提供了基于多重PCR扩增的目标序列富集方法，所述方法包括：兼 容性多重PCR引物的筛选；进行第一轮特异性多重PCR扩增；进行第二轮通用 引物扩增富集；回收产物并上机测序。
因此，在第一方面，本发明提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引 物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：
a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异 性序列之间满足如下条件：(1)每个特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩 增，(2)特异性序列之间不形成二聚体，(3)特异性序列不形成发卡结构；
b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；
c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不 阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全 匹配的模板的结合与延伸。
在一个具体的实施方案中，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)所述特 异性序列与目标区域的Tm–与非目标区域的Tm≥5℃，优选≥10℃；(2)所述 特异性序列与目标区域的Tm–与其他特异性序列形成二聚体的Tm≥5℃，优选 ≥10℃；(3)所述特异性序列与目标区域的Tm–形成发卡结构的Tm≥5℃，优 选≥10℃，优选Tm的值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。
在本发明中，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰包括在所述特异性序列的 3’端-2、-3位碱基、核糖或磷酸二酯键上；在优选的实施方案中，所述特异性 序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％，即有三个或三个以上的碱基为C 或G，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰还包括在所述特异性序列的3’端-4 位碱基、核糖或磷酸二酯键处。即，在优选的实施方案中，在所述特异性序列的 3’端的5个碱基的GC含量大于50％的情况下，即有三个或三个以上的碱基为 C或G，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰还包括在所述特异性序列的3’ 端-2、-3、-4处位碱基、核糖或磷酸二酯键处。
在一个具体的实施方案中，所述增加空间位阻的修饰选自：脱氧次黄嘌呤 (dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、5-Methyl dC、2'-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、 地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、 TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团和Thiol-C3S-S。
在一个具体的实施方案中，所述3’端的碱基处增加空间位阻的修饰包括3’ 端-1、-2、-3位碱基处的硫代修饰。
在一个具体的实施方案中，所述特异性序列的3’端的5个碱基的GC含量大 于50％，在所述特异性序列的3’端-4位碱基处有硫代修饰。
在一个具体的实施方案中，所述特异性引物序列有一致的热力学参数，优选 Tm标准差≤5℃；更优选Tm标准差≤2℃；最优选Tm标准差≤1℃。Tm标准 差是所述所有特异性引物序列与相应目标DNA序列之间的Tm的标准差。
在第二方面，本发明提供了一种扩增样品中多个目标DNA序列的方法，所 述方法包括：
a)提供包含目标DNA序列和非目标序列的样本、本发明第一方面的引物组 和与所述引物组中特异性引物5’端通用序列互补的通用引物对；
b)以所述引物组中的特异性引物进行PCR反应，扩增所述样本中的目标 DNA序列，所述PCR反应的退火温度按照从高到低的阶梯进行，例如在一个退 火过程中使用等差的3个温度(例如60℃、59℃、58℃)进行退火；
c)以所述通用引物对再次扩增步骤b)中的扩增产物，进一步富集所述扩增 产物。
在一个具体的实施方案中，所述方法还包括步骤d)对步骤c)得到扩增产 物进行测序。
在一个具体的实施方案中，所述方法还包括步骤b’)：回收步骤b)中富集 的扩增产物。
在一个具体的实施方案中，所述回收是通过采用磁珠对第一轮PCR反应产 物进行片段筛选和纯化，去除目标区域外的大片段、基因组DNA、引物二聚体、 引物和其他反应成分，得到目标区域序列的PCR产物。
在一个具体的实施方案中，所述多个退火温度是3个温度，例如60℃、59℃、 58℃。
具体实施方式
本发明提供了基于多重PCR扩增的目标序列富集方法，所述方法包括：兼 容性多重PCR引物的筛选；第一轮特异性多重PCR扩增；第二轮通用引物扩增 富集；回收产物并上机测序，达到检测的目的。因此，本发明提供了用于扩增样 品中多个目标DNA序列的引物组以及使用所述引物组扩增样品中多个目标 DNA序列的方法。
在本发明中，本发明的多重PCR引物组中的引物优选具有如下特性：
1.具有特异性，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所有引物， 除了目标序列之外，不会扩增其他非目标序列。所述具有特异性的引物的设计方 法是：首先对任意一对引物进行全基因组in sillco扩增分析，将预测到的扩增产 物与目标扩增产物进行比较，如果预测产物中有非目标产物，并且这些非目标预 测产物和目标产物之间的热力学参数相近，那么判定这对引物有非特异扩增；如 果这些非目标预测产物和目标产物的热力学参数相差较大，那么可认为不会产生 非特异扩增。热力学参数相差的判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(与非目 标产物)≥5℃，优选Tm(与目标产物)-Tm(与非目标产物)≥10℃；另外，不 同的热力学计算方法以及参数会对计算结果有影响，本发明中优选基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算；
2.无二聚体产生，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所有引物 两两之间不能形成稳定的二聚体，判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(二聚 体)≥5℃，优选Tm(与目标产物)-Tm(二聚体)≥10℃；另外，不同的热力学 计算方法以及参数会对计算结果有影响，本发明中优选基于SantaLucia 2007热 力学参数表的最邻近法计算；
3.无发卡结构产生，即在所述多重PCR体系中任何引物自身都不形成稳定 的发卡结构，判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)≥5℃，优选 Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)≥10℃；另外，不同的热力学计算方法以及 参数会对计算结果有影响，本发明中优选基于SantaLucia 2007热力学参数表的 最邻近法计算；
4.有一致的热力学参数，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所 有引物具有相同或相似的Tm值，优选Tm标准差≤5℃，更优选Tm标准差≤2℃， 最优选Tm标准差≤1℃；
5.扩增产物长度在100-300bp的范围，优选150-250bp，最优选180-220bp；
6.在所有引物的5’端连接有与基因组不同源的通用序列。
在本发明的另一个实施方案中，在引物序列3’端增加空间位阻的方法包括：
1.在所述特异性引物序列的3’端添加能增加空间位阻的修饰，所述修饰不 阻断其对与所述特异性引物序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其对 与所述特异性引物序列不完全匹配的模板的结合与延伸，所述修饰如脱氧次黄嘌 呤(dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、5-Methyl dC、2'-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、 地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、 TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团和Thiol-C3S-S。其中，修饰基团 AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMR和Thiol-C3 S-S为基团名称的简写形式，为引物合成行业公认的名称。
2.一般在所述特异性引物序列的3’端-2、-3位碱基处增加修饰，优选所述 修饰是-1、-2、-3位碱基处增加修饰；
3.当所述特异性引物序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％时，在所 述特异性序列的3’端-4位碱基处增加修饰，例如硫代修饰。
在本发明中，3’端-1、-2、-3位是指3’端往5’数第1、2、3位。以此类推。
在本发明中，使用如下基团进行碱基修饰是为了不阻断其对与所述特异性引 物序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其对与所述特异性引物不完全 匹配的模板的结合与延伸：脱氧次黄嘌呤(dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、5-Methyl dC、 2'-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、 BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团、 Thiol-C3S-S等。所述修饰是在磷酸二酯键上，糖基或碱基上通过化学合成的方 法，添加一些化学基团，目的是降低碱基配对的稳定性。在磷酸键上或者糖基或 碱基上添加化学基团是本领域中已知的。例如，所述脱氧次黄嘌呤(dI)连接到引物磷酸二酯键上、脱氧尿嘧啶(dU)连接到引物的磷酸二酯键上、甲基基团 连接到引物脱氧核糖胞嘧啶的5’(5-Methyl dC)、甲基基团连接到脱氧核糖胞嘧啶 的2’(2'-O-Me-dC)、磷酸基团连接到引物3’的磷酸二酯键上、硫代基团连接到引 物3’的磷酸二酯键上、地高辛基团连接到引物3’的磷酸二酯键上、生物素基团 连接到引物3’的磷酸二酯键上、AminolinkerC7连接到引物3’的磷酸二酯键上、 BHQ1连接到引物3’的磷酸二酯键上、BHQ2连接到引物的3’磷酸二酯键上、 Dabcyl连接到引物的磷酸二酯键上、JOE连接到引物3’的磷酸二酯键上、ROX 连接到引物3’的磷酸二酯键上、FAM连接到引物的磷酸二酯键上、TAMRA连 接到引物3’的磷酸二酯键上、烷基基团连接到引物脱氧核糖鸟嘌呤的6’、氟代 基团连接到脱氧核糖的2’、氨基基团连接到引物脱氧核糖的2’、巯基基团连接 到引物3’磷酸二酯键上(Thiol-C3S-S)。
在本发明中，序列的Tm的计算不拘泥于具体的方法，各种方法计算的Tm 值均可以用于本发明，各种方法得到的Tm值基本不能逆转本发明的效果，只是 效果的程度会有差异。虽然SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法可以计算 Tm，但其他方法计算的Tm值可以与之相对应，本领域技术人员可以经过简单 的试验比较各种方法计算得到的Tm，从而对各种方法计算的Tm值作出适当选 择。
根据发明人的经验，对于人基因组编码区而言，超过99％的目标区域均可以 设计出适合本发明的引物序列，表明我们前述对引物组的过滤都是合理的。
在发明中，术语“样品”以其最广泛的意思使用，其意在包括从任何来源， 优选从生物来源获得的样本或培养物。生物样品可从动物(包括人)获得，并包 括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆、血清等等。因 此，“核酸样品”包含任何来源的核酸(例如DNA、RNA、cDNA、mRNA、tRNA、 miRNA等)。在所述核酸样品是RNA或mRNA的情况下，中步骤c)之前有将 所述RNA或mRNA反转录成DNA的步骤。在本申请中，核酸样品优选源自生物来源，例如人或非人细胞、组织等等。术语“非人”系指所有非人动物和实体， 包括但不限于，脊椎动物例如啮齿动物、非人灵长动物、绵羊、牛、反刍动物、 兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等等。非人还包括无脊椎动物和原核生 物，例如细菌、植物、酵母、病毒等等。因此，用于本发明的方法和系统的核酸 样品为源自任何生物，无论真核或者原核的核酸样品。
某些实施方案中，引物与目标核酸之间的杂交在优选地严格条件下进行，所 述严格条件足以支持所述核酸之间的杂交，其中所述核酸包含连接化合物和所述 目标核酸样品的互补区域，以提供所述核酸杂交复合物。所述复合物随后通过所 述连接化合物捕获，并在足以去除非特应性结合核酸的条件下洗涤，然后所杂交 的目标核酸序列从所捕获的核酸复合物中洗脱。
在某些实施方案中，所述核酸包含化学基团或连接化合物，例如结合部分例 如生物素、地高辛等等，其能结合于固体载体。所述固体载体可以包含相应的捕 获化合物，例如用于生物素的链霉亲和素或用于地高辛的地高辛抗体。本发明不 限于所使用的连接化合物，并且替代的连接化合物等同适用于本发明的方法、诱 饵序列和试剂盒。
在本发明的实施方案中，所述多个目标核酸分子优选包含一种生物的全基因 组或至少一条染色体或一种任意大小分子量的核酸分子。优选地，所述核酸分子 的大小至少约200kb、至少约500kb、至少约1Mb、至少约2Mb、或至少约5Mb, 更优选大小约100kb至约5Mb、约200kb至约5Mb、约500kb至约5Mb、约1Mb 至约2Mb或约2Mb至约5Mb。
在某些实施方案中，所述目标核酸来自动物、植物或微生物，在优选的实施 方案中，所述目标核酸分子选来自人。如果核酸样品的量比较少(例如某些情况 下取得的人核酸样品，例如发育中的胎儿的基因组)，在实施本发明的方法之前 可扩增所述核酸，例如通过全基因组扩增。为进行本发明的方法，预先扩增可能 是必须的，例如在法医应用中(例如在法医学中用于遗传特征目的)。
在某些实施方案中，所述多个目标核酸分子为一组基因组DNA分子。所述 诱饵序列可选自例如限定来自多个遗传基因座的多种外显子、内含子或调控序列 的多个诱饵序列；限定至少一个单独遗传基因座的全序列的多个诱饵序列，所述 基因座大小任意，优选至少1Mb，或至少上述特定大小之一；限定单核苷酸多 态性(SNP)的多种诱饵序列；或限定一种阵列的多种诱饵序列，例如设计为捕 获至少一条完整染色体的全序列的嵌合阵列。
在本文中，术语“杂交”系指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(例如核酸之 间结合的强度)受多种因素的影响，例如核酸之间互补的程度、使用杂交条件的 严格程度、所形成杂交体的解链温度(Tm)以及核酸的GC含量值。虽然本发 明不受限于具体的杂交条件，但优选使用严格的杂交条件。严格的杂交条件取决 于序列并随杂交参数(例如盐浓度、有机物存在等)而变化。通常，“严格的” 条件选择为在规定的离子强度和pH下低于特定核酸序列的Tm约5℃到约20℃。 优选地，严格的条件为低于结合互补核酸的具体核酸的温度熔点约5℃到10℃。 所述Tm是50％核酸(例如目标核酸)与完全配对探针杂交的温度(在规定的离 子强度和pH下)。
在本文中，“严格的条件”，例如可为50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl,0.075 M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液、超 声波处理的鲑鱼精子DNA(50mg/ml)，0.1％SDS，以及10％硫酸葡聚糖在42℃ 下杂交，在42℃以0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和在55℃以50％甲酰胺 洗涤，然后在55℃以含有EDTA的0.1×SSC洗涤。例如，预计包含35％甲 酰胺、5×SSC和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液适合在适度非 严格条件下在45℃杂交16-72小时。
在本文中，术语“引物”系指寡核苷酸，无论天然存在经纯化、酶切后得到 的或者经合成方法产生的，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条 件下(例如在核苷酸和诱导试剂例如DNA聚合酶存在下，并在合适的温度和pH 下)，能够作为合成的起点。所述引物优选为具有最大扩增效率的单链。优选地， 所述引物为寡脱氧核苷酸。所述引物必须足够长以在所述诱导试剂存在下引发延 伸产物的合成。所述引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源和所 使用方法。
在本文中，术语“探针序列”系指寡核苷酸(例如核苷酸序列)，无论天然存 在经纯化、酶切后得到的或者经合成、重组或PCR扩增产生的，能够与另一目 标寡核苷酸例如目标核酸序列的至少一部分杂交。探针可为单链或双链。探针可 用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。
在本文中，术语“目标核酸分子”是指来自目标基因组区域的分子或序列。预 选的探针确定了目标核酸分子的范围。因此，所述“目标”试图与其它核酸序列区 分出来。一个“片段”定义为所述目标序列中的一个核酸区域，如作为核酸序列的 一个“片段”或一“部分”。
在本文中，术语“分离”当用于涉及核酸时，如用于“分离核酸”时，系指核酸 序列从其天然来源通常结合的至少一种其他组分或污染物中被鉴别并分离出来。 分离的核酸以不同于其天然存在的形式存在。相反，未分离的核酸例如DNA和 RNA的核酸以其天然存在的状态存在。所述分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸 可以单链形式或双链形式存在。
在本发明的实施方案中，用于在本文所述的方法、引物组和试剂盒中使用的 引物包含连接化合物，例如结合部分。结合部分包含任何连接或引入用于随后捕 获核酸扩增产物的扩增引物的5’端的部分。结合部分为引入引物序列5’端的任 何序列，例如可捕获的6组氨酸(6HIS)序列。例如，包含6HIS序列的引物可 被镍捕获，例如在镍包被或包含镍包被珠子、颗粒等的管子、微孔、或纯化柱中， 其中所述珠子包装入柱子中，样品装入并通过柱子以捕获复杂度降低的复合物 (例如，和随后的目标洗脱)。用于本发明的实施方案的另一种结合部分的实例 包括半抗原，例如地高辛，例如其连接到扩增引物的5’端。地高辛可使用地高辛 抗体捕获，例如包被或包含抗地高辛抗体的基质。
在某些实施方案中，所述结合部分为生物素，用链霉亲和素包被所述捕获基 质，例如珠子如顺磁颗粒，用于从非特异性杂交目标核酸中分离所述扩增产物。 例如，当生物素为结合部分时，链霉亲和素(SA)包被的基质，例如SA包被的 珠子(例如磁珠/颗粒)用于捕获所述生物素标记的扩增产物。洗涤所述SA结合 的复合物，所杂交的目标核酸从所述扩增产物洗脱进行测序。
可使用无掩膜阵列合成技术在固体载体上并行提供序列中与所述基因组至 少一个区域对应的引物序列。替代性地，引物序列可使用标准DNA合成仪连续 获得并应用到所述固体载体，或可从有机体获得并固定于所述固体载体。扩增之 后，非扩增产物的核酸通过洗涤从所述载体结合的扩增产物中分离。例如在热水 中或在包含例如TRIS缓冲液和/或EDTA的核酸洗脱缓冲液中从所述固体载体洗 脱，以产生所述目标核酸分子富集的洗脱物。
或者，用于目标分子的引物序列可如上所述在固体载体上合成，作为引物序 列集合从所述固体载体释放并扩增。所释放的引物集合可共价或非共价固定于载 体，例如玻璃、金属、陶瓷、或聚合珠子或其它固体载体。所述引物可设计为从 所述固体载体方便释放，例如在最接近载体的核酸类似物末端或其附近提供酸或 碱不稳定的核酸序列，其分别在低或高pH条件下释放所述引物。本领域已知多 种可剪切的连接化合物。所述载体可以，例如，以具有液体进口和出口的圆柱提 供。本领域熟悉将核酸固定到载体的方法，例如通过将生物素标记的核苷酸结合 到所述引物中，并使用链霉亲和素包被所述载体，由此所述包被的载体非共价吸 引并固定所述集合中的所述引物。所述样品在杂交条件下通过所述包含引物的载 体，由此与所述固定载体杂交的扩增后的目标核酸分子可洗脱，用于之后的分析 或其它用途。
实施例1：本发明的方法的示例性步骤
扩增样品中多个目标DNA序列的方法包括以下步骤：
1)提供包含目标DNA序列和非目标序列的样本、本发明的特异性引物组 和与所述特异性引物5’端通用序列互补的通用引物对；
2)以所述引物组中的特异性引物进行第一轮多重PCR反应，扩增所述样 本中的目标DNA序列，所述PCR反应的退火温度按照从高到低的阶梯进行，在 本实施例中一个退火过程中使用等差的3个温度(例如60℃、59℃、58℃)进 行退火，并且扩增循环数小于10，
第一轮多重PCR反应扩增多个目标区域DNA序列以如下方式进行：在该轮 PCR反应中，多对特异性引物放在同一反应体系中同时扩增多个目标区域序列， 其中所有上游引物的3’端含有与目标区域序列互补的特异性序列，5’端含有通用 序列1(GSP1：CTTTCCCTACACGACgctcttccgatct(SEQ ID NO.1))；所有下游 引物的3’端含有与目标区域序列互补的特异性序列，5’端含有通用序列2(GSP2： GGAGTTCAGACGTGTgctcttccgatct(SEQID NO.2))，上下游引物的3’端的碱基 处均具有3或4个基团修饰，增加扩增的特异性；在本轮多重PCR反应中，反 应体系的成分如下：ddH2O、PCR反应缓冲物、底物(dNTP)、多重PCR引物 混合物、样本基因组DNA或cDNA和高保真聚合酶。
本轮多重PCR反应步骤包括如下三步：第一步预变性：95℃维持3.5min；第 二步扩增：变性步骤在96-98℃下维持20s、梯度退火在66℃下维持1min、在65℃ 下维持1min和64℃下维持1min，延伸步骤在72℃下维持30s，第二步扩增根据 模板的投入量扩增10-22个循环，退火时间根据扩增目标序列的个数而相应改变； 第三步扩增在72℃下延伸5min，在本轮多重PCR反应中，采用梯度退火，使每 对引物均能与模板高效互补结合，提高扩增效率，本实施例中如在一个退火过程 中使用等差的3个温度(例如60℃、59℃、58℃)进行退火。本轮多重PCR反 应结束后，得到多个目标区域序列的双链PCR产物。所述双链PCR产物的5’ 端包括通用序列1(GSP1)，3’端包括通用序列2(GSP2)。
采用核酸酶，如Exonuclease VII、Exonuclease I、Mung Bean Nuclease、T7Endonuclease I、Nuclease BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、绿豆核酸酶等对所述 双链PCR产物进行消化。
采用Agencourt AMPure磁珠对所述第一轮多重PCR反应的产物进行片段筛 选和纯化，去除目标区域外的大片段、基因组DNA、引物二聚体、引物和其他 反应成分，得到包含目标区域序列的双链PCR产物；
3)以通用引物进行第二轮PCR扩增反应，对第一轮多重PCR反应中得到 的双链PCR扩增产物进行再次扩增，进一步富集双链PCR所述扩增产物；
在所述第二轮PCR扩增反应的反应体系中，以第一轮多重PCR反应中纯化 得到的包括目标区域序列的双链PCR产物为模板，以通用引物FGSP1(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTacactctttccctacacgac，SEQ ID NO.3)和 RGSP2(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT******gtgactggagttcagacgtgt，SEQ ID NO.4)进行PCR扩增，其中FGSP1的3’端为通用序列1(GSP1)，5端为通 用序列3(AATGATACGGCGACCACCGAGATCT，SEQ ID NO.5)；RGSP2的3’ 端为通用序列2(GSP2)，5’端为通用序列4(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT，SEQ ID NO.6)，中间的6个“*”代 表Index序列，用于区分不同样本。Index序列的设计原则是长度为6，两两之间 确保至少两个碱基的差异。在所述第二轮PCR反应后，扩增得到的目标区域序 列产物的5’端为通用引物序列FGSP1，3’端为通用引物序列RGSP2。
采用Agencourt AMPure磁珠对所述第二轮PCR反应的PCR产物进行纯化， 去除其他成分，得到含通用引物序列FGSP1和通用引物序列RGSP2的目标区域 序列产物；
4)回收上一步富集的目标区域序列产物，进行上机测序。
实施例2
发明人随机选择人基因组上外显子和内含子上1000个位点用于测试本发明 的方法，实验步骤按照实施例1的方法进行。
表1：随机选择的1000个位点的染色体分布
| 染色体 | 个数 | 染色体 | 个数 |
| chr1 | 75 | chr12 | 65 |
| chr2 | 40 | chr13 | 20 |
| chr3 | 60 | chr14 | 10 |
| chr4 | 105 | chr15 | 25 |
| chr5 | 55 | chr16 | 35 |
| chr6 | 65 | chr17 | 40 |
| chr7 | 30 | chr18 | 10 |
| chr8 | 65 | chr19 | 25 |
| chr9 | 30 | chr20 | 35 |
| chr10 | 65 | chr21 | 15 |
| chr11 | 100 | chr22 | 30 |
在本实施例中，基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算Tm。以 下简要说明引物设计情况。
(1)扩增产物长度在100-300bp的范围内随机选取，PCR引物分成多组， 每组中2℃<Tm标准差≤5℃、1℃<Tm标准差≤2℃、Tm标准差≤1℃；另 外设对照组，未考虑Tm标准差，组中存在Tm标准差>5℃的情况；
(2)选择部分引物(其他引物可以作为对照)，在其序列的3’端-1、-2、-3 处碱基、核糖或磷酸二酯键上增加修饰，脱氧次黄嘌呤(dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、 5-Methyl dC、2'-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、地高辛、生物素、AminolinkerC7、 BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基团、氟代基团、 氨基基团和Thiol-C3S-S；
(3)当引物序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％时，选取部分引物 (其他引物作为对照)在其序列的3’端-4处碱基增加连接到脱氧核糖胞嘧啶的5’ 的甲基基团修饰(5-Methyl dC)、3’端-4处碱基增加连接到磷酸二酯键上硫代修饰 基团、3’端-4处增加连接到脱氧核糖2’的氟代修饰基团、3’端-4处增加连接到 磷酸二酯键上的脱氧次黄嘌呤(dI)修饰基团或3’端-4处增加连接到磷酸二酯键 上的脱氧尿嘧啶(dU)修饰基团。
其中，以上这些位置的基团修饰均是由引物合成公司通过有机化学方式合成 得到。
另外，对所有引物还进行如下分组：
(1)Tm(与目标产物)-Tm(与非目标产物)≤5℃、5℃<Tm(与目标产 物)-Tm(与非目标产物)≤10℃；Tm(与目标产物)-Tm(与非目标产物)>10℃；
(2)Tm(与目标产物)-Tm(二聚体)≤5℃、5℃<Tm(与目标产物)-Tm (二聚体)≤10℃、Tm(与目标产物)-Tm(二聚体)>10℃；
(3)Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)≤5℃、5℃<Tm(与目标产物) -Tm(发卡结构)≤10℃；Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)>10℃。
检测结果，以捕获效率和100×覆盖度下的覆盖率来衡量检测结果，检测结 果在后文以表格的形式给出，从这些数据表格中可以看出：
1)Tm标准差越小，捕获效率和覆盖率越高，但为了达到良好的捕获效率 和100×覆盖率而又保证引物的设计空间，优选Tm标准差≤2℃；
2)大部分3’端引物修饰的捕获效率和覆盖率高于不修饰的对照组；
3)当引物序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％时，引物序列的3’ 端-4处碱基硫代修饰的捕获效率和覆盖率高于不修饰的对照组；
4)Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)的差值越大，捕获效率和覆盖率越 高，Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)>10℃才可达到良好的捕获效率和100 ×覆盖率；
5)Tm(目标产物)-Tm(二聚体)的差值越大，捕获效率和覆盖率越高， Tm(目标产物)-Tm(二聚体)>10℃才可达到良好的捕获效率和100×覆盖率；
6)Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)的差值越大，捕获效率和覆盖率越高， 而且Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)>5℃即可达到良好的捕获效率和100× 覆盖率，同时保证比>10℃较多的候选引物可以选择。
优选地，Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)>10℃，Tm(目标产物)-Tm (二聚体)>10℃，Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)>5℃。
其中，对照指的是不做任何修饰的正常引物，用于与相应试验组数据进行比 较。
结果如下：
表2.组中存在Tm标准差对检测结果的影响
| 引物特点 | 捕获效率 | 100x覆盖率 |
| Tm标准差≤1℃ | 80.01％ | 84.37％ |
| 1℃<Tm标准差≤2℃ | 76.34％ | 78.80％ |
| 2℃<Tm标准差≤5℃ | 71.24％ | 72.02％ |
| Tm标准差>5℃ | 60.27％ | 64.99％ |
表3.引物序列的3’端-1、-2、-3处碱基修饰对检测结果的影响
表4.当引物序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％时，引物序列的3’ 端-4处碱基硫代修饰对检测结果的影响
| 引物特点 | 捕获效率 | 100×覆盖率 |
| 3’端-4处氟代基团 | 93.10％ | 100％ |
| 3’端-4处甲基修饰 | 89.23％ | 98.87％ |
| 3’端-4处碱基硫代 | 82.77％ | 91.15％ |
| 3’端-4脱氧尿嘧啶(dU) | 90.92％ | 99.57％ |
| 3’端-4脱氧次黄嘌呤(dI) | 94.03％ | 99.91％ |
| 对照(正常引物) | 79.21％ | 84.09％ |
表5.引物特异性对检测结果的影响
| 引物特点 | 捕获效率 | 100×覆盖率 |
| Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)≤5℃ | 62.35％ | 67.03％ |
| 5℃<Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)≤10℃ | 70.01％ | 73.45％ |
| Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)>10℃ | 78.84％ | 82.47％ |
表6.引物二聚体对检测结果的影响
| 引物特点 | 捕获效率 | 100×覆盖率 |
| Tm(目标产物)-Tm(二聚体)≤5℃ | 45.21％ | 50.74％ |
| 5℃<Tm(目标产物)-Tm(二聚体)≤10℃ | 61.27％ | 68.17％ |
| Tm(目标产物)-Tm(二聚体)>10℃ | 78.64％ | 83.55％ |
表7.引物发夹结构对检测结果的影响
| 引物特点 | 捕获效率 | 100×覆盖率 |
| Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)≤5℃ | 64.28％ | 68.36％ |
| 5℃<Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)≤10℃ | 75.09％ | 80.94％ |
| Tm(目标产物)-Tm(发卡结构)>10℃ | 79.98％ | 83.49％ |
序列表
<110> 艾吉泰康生物科技（北京）有限公司
<120> 用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组及其应用
<130> CP20170647
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttccctac acgacgctct tccgatct 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 28
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg t 51
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatct 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agat 24
Claims (10)
1.用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：
a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异性序列之间满足如下条件：(1)每个所述特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩增；(2)所述特异性序列之间不形成二聚体；(3)所述特异性序列不形成发卡结构；
b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；
c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。
2.权利要求1的引物组，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)所述特异性序列与目标区域的Tm–与非目标区域的Tm≥5℃，优选≥10℃；(2)所述特异性序列与目标区域的Tm–与其他特异性序列形成二聚体的Tm≥5℃，优选≥10℃；(3)所述特异性序列与目标区域的Tm–形成发卡结构的Tm≥5℃，优选≥10℃，优选的Tm值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。
3.权利要求1的引物组，所述增加空间位阻的修饰选自：脱氧次黄嘌呤、脱氧尿嘧啶、5-Methyl dC、2'-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团和Thiol-C3S-S。
4.权利要求1或3的引物组，所述3’端的碱基处增加空间位阻的修饰包括3’端-1、-2、-3位碱基、核糖或磷酸二酯键上的修饰。
5.权利要求1-4任一项的引物组，所述特异性序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％，在所述特异性序列的3’端-4位碱基处有增加空间位阻的修饰，例如氟代修饰、甲基修饰、脱氧尿嘧啶、硫代修饰、脱氧次黄嘌呤、氨基修饰等。
6.权利要求1-5任一项的引物组，所述特异性引物序列有一致的热力学参数，优选Tm标准差≤5℃；更优选Tm标准差≤2℃；最优选Tm标准差≤1℃。
7.一种扩增样品中多个目标DNA序列的方法，包括
a)提供包含目标DNA序列和非目标序列的样本、上述权利要求任一项的引物组和与所述特异性引物5’端通用序列互补的通用引物对；
b)以所述引物组中的特异性引物进行多重PCR反应，扩增所述样本中的多个目标DNA序列，所述多重PCR反应的退火温度按照从高到低的阶梯进行，例如在一个退火过程中使用等差的多个温度进行退火；
c)以所述通用引物对再次扩增步骤b)中的扩增产物，进一步富集所述扩增产物。
8.权利要求7的方法，所述方法还包括步骤b’)：回收步骤b)中富集的扩增产物。
9.权利要求8的方法，所述回收是通过采用磁珠对第一轮PCR反应产物进行片段筛选和纯化，去除目标区域外的大片段、基因组DNA、引物二聚体、引物和其他反应成分，得到目标区域序列的PCR产物。
10.权利要求7-9任一项的方法，所述方法还包括步骤d)对步骤c)得到扩增产物进行测序。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710546580.8A CN107446995B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710546580.8A CN107446995B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
| CN201610293653.2A CN105925678B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610293653.2A Division CN105925678B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107446995A true CN107446995A (zh) | 2017-12-08 |
| CN107446995B CN107446995B (zh) | 2020-06-02 |
Family
ID=56835122
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610293653.2A Active CN105925678B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
| CN201710546580.8A Active CN107446995B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610293653.2A Active CN105925678B (zh) | 2016-05-06 | 2016-05-06 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN105925678B (zh) |
| AU (2) | AU2016405379A1 (zh) |
| WO (1) | WO2017190487A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251502A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-07-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种外周血游离肿瘤dna的富集方法、试剂盒及其应用 |
| CN110592210A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-12-20 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 检测brca1/2全外显序列的序列引物及设计方法 |
| CN110714077A (zh) * | 2019-08-13 | 2020-01-21 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 同时检测brca1/2外显子序列和化疗用药位点的引物及应用 |
| CN110734974A (zh) * | 2019-08-13 | 2020-01-31 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 一种癌症化疗用药snp位点组合以及检测引物 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925678B (zh) * | 2016-05-06 | 2021-10-12 | 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
| CN107254541B (zh) * | 2017-08-03 | 2020-05-08 | 广州万德基因医学科技有限公司 | 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用 |
| CN110295252A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-10-01 | 东莞博盛生物科技有限公司 | 提高特异性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒 |
| CN112011599A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-01 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 用于减少非特异性扩增的pcr引物组及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718737A (zh) * | 2004-07-09 | 2006-01-11 | 南华大学 | 一种可消除非特异性条带的pcr方法以及利用该方法制备的rt－pcr芯片 |
| WO2014110528A1 (en) * | 2013-01-13 | 2014-07-17 | Unitaq Bio | Methods and compositions for pcr using blocked and universal primers |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001055454A1 (en) * | 2000-01-28 | 2001-08-02 | Althea Technologies, Inc. | Methods for analysis of gene expression |
| CN105925678B (zh) * | 2016-05-06 | 2021-10-12 | 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 |
-
2016
- 2016-05-06 CN CN201610293653.2A patent/CN105925678B/zh active Active
- 2016-05-06 CN CN201710546580.8A patent/CN107446995B/zh active Active
- 2016-11-21 AU AU2016405379A patent/AU2016405379A1/en active Pending
- 2016-11-21 WO PCT/CN2016/106608 patent/WO2017190487A1/zh active Application Filing
- 2016-11-21 AU AU2016102399A patent/AU2016102399A4/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718737A (zh) * | 2004-07-09 | 2006-01-11 | 南华大学 | 一种可消除非特异性条带的pcr方法以及利用该方法制备的rt－pcr芯片 |
| WO2014110528A1 (en) * | 2013-01-13 | 2014-07-17 | Unitaq Bio | Methods and compositions for pcr using blocked and universal primers |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 徐阳炎等: "提高窖蛋白基因扩增特异性的逆转录聚合酶链防范", 《中华医学遗传学杂志》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251502A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-07-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种外周血游离肿瘤dna的富集方法、试剂盒及其应用 |
| CN108251502B (zh) * | 2017-12-27 | 2021-12-24 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种外周血游离肿瘤dna的富集方法、试剂盒及其应用 |
| CN110592210A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-12-20 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 检测brca1/2全外显序列的序列引物及设计方法 |
| CN110714077A (zh) * | 2019-08-13 | 2020-01-21 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 同时检测brca1/2外显子序列和化疗用药位点的引物及应用 |
| CN110734974A (zh) * | 2019-08-13 | 2020-01-31 | 上海艾汭得基因科技有限公司 | 一种癌症化疗用药snp位点组合以及检测引物 |
| CN110592210B (zh) * | 2019-08-13 | 2023-10-31 | 阔然生物医药科技(上海)有限公司 | 检测brca1/2全外显序列的序列引物及设计方法 |
| CN110734974B (zh) * | 2019-08-13 | 2023-10-31 | 阔然生物医药科技(上海)有限公司 | 一种癌症化疗用药snp位点组合以及检测引物 |
| CN110714077B (zh) * | 2019-08-13 | 2023-10-31 | 阔然生物医药科技(上海)有限公司 | 同时检测brca1/2外显子序列和化疗用药位点的引物及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107446995B (zh) | 2020-06-02 |
| AU2016405379A1 (en) | 2019-01-03 |
| WO2017190487A1 (zh) | 2017-11-09 |
| AU2016102399A4 (en) | 2019-05-16 |
| CN105925678B (zh) | 2021-10-12 |
| CN105925678A (zh) | 2016-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107446995A (zh) | 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用 | |
| EP3234200B1 (en) | Method for targeted depletion of nucleic acids using crispr/cas system proteins | |
| CN109310784B (zh) | 用于制备和使用指导核酸的方法和组合物 | |
| US9879312B2 (en) | Selective enrichment of nucleic acids | |
| US8986958B2 (en) | Methods for generating target specific probes for solution based capture | |
| CN105925671B (zh) | 一种从核酸样品富集目标序列核酸的方法 | |
| CN105647907B (zh) | 一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法 | |
| US20160251712A1 (en) | Sequential Sequencing | |
| CN107760772A (zh) | 用于核酸配对末端测序的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒 | |
| CN112680797A (zh) | 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法 | |
| US20070072223A1 (en) | Compositions and methods for purifying nucleic acids | |
| CN106191256A (zh) | 一种针对目标区域进行dna甲基化测序的方法 | |
| CN102559856B (zh) | 去除测序文库中的载体片段的方法 | |
| US11414686B2 (en) | Stoichiometric nucleic acid purification using randomer capture probe libraries | |
| US9315807B1 (en) | Genome selection and conversion method | |
| CN113454235A (zh) | 经改进的核酸靶标富集和相关方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200430 Address after: 314100 Building No. 2, 371 Hongye Road, Dayun Town, Jiashan County, Jiaxing City, Zhejiang Province 101 Applicant after: Aiji Taikang (Jiaxing) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 102206 Beijing City, Changping District Beijing city Zhongguancun Life Science Park Life Road No. 8 School District No. 9 Building 3 Room 301 Applicant before: Igenetech Biotech (Beijing) Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Primer sets for amplifying multiple target DNA sequences in samples and their applications Effective date of registration: 20230410 Granted publication date: 20200602 Pledgee: Zhejiang Jiashan rural commercial bank Limited by Share Ltd. science and technology sub branch Pledgor: Aiji Taikang (Jiaxing) Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023450000056 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20200602 Pledgee: Zhejiang Jiashan rural commercial bank Limited by Share Ltd. science and technology sub branch Pledgor: Aiji Taikang (Jiaxing) Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023450000056 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Primer sets for amplifying multiple target DNA sequences in samples and their applications Granted publication date: 20200602 Pledgee: Zhejiang Jiashan rural commercial bank Limited by Share Ltd. science and technology sub branch Pledgor: Aiji Taikang (Jiaxing) Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024330000405 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |