CN105647907B - 一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法 - Google Patents
一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法主要方法为:制备DNA模板,PCR扩增,纯化PCR产物;对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4 DNA聚合酶末端平滑化,Lambda核酸外切酶水解产物的双链DNA中一条带有5′端磷酸化的单链,从而获得带有生物素标记的单链DNA;磁珠富集法纯化带有生物素标记的单链DNA,得修饰性DNA杂交探针。本发明极大了降低了生产成本、使用范围广,包括任意物种基因组的外显子区域、内含子区域、线粒体区域以及内含子区域等。所获得的DNA杂交探针可以应用于二代测序靶向文库的构建以及测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法。
背景技术
2003年,"人类基因组计划"获得首张人类全基因组图谱,这一成果引领开辟了基因组学分析、个体化医疗。伴随着人类技术的革新,二代测序技术(Next GenerationSequencing)出现在人们的视野,它可以一次性完成数十万到数百万条DNA分子的序列测定,使得在极短时间内对基因组进行细致研究成为可能。大量研究表明,人类疾病特别是癌症的产生与其个体相关基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)有着显著的相关性。尽管与传统测序技术相比,下一代测序技术的成本大幅降低,但目前测序一套个人基因组图谱仍然高达数万人民币,而由于受到测序深度的限制,几乎无法提供指标意义判读的数据。所以,在现阶段,如何实现对大批量样本的某个特定区域进行高通量平行靶向样本制备并测序,确定和了解涉及人类疾病的遗传变异,提高诊断、治疗和预防疾病的能力,对许多科学和临床医学研究具有重大意义。
靶向测序文库制备技术充分发挥了二代测序技术的潜能,与全基因组测序相比,富集后再测序大大降低了成本,减轻了后续数据分析的压力,让研究人员能够充分利用二代测序的通量。由于存在着非常高的技术壁垒,目前几种靶向富集方法主要包括以基于RNA:DNA核酸杂交层面上的靶向序列捕获系统。其中基于微阵列芯片上合成制备寡核甘酸池,然后再进一步体外制备RNA探针,虽然在探针制备上具有极强的灵活性,但是RNA杂交捕获探针不具有稳定性,需要严格的储藏与运输条件。同时由于所用的所使用的探针为RNA,需要极高的操作要求、试剂以及实验器皿都需要是无RNA酶的。对于实验操作人员的技术要求性极高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法,无需RNA探针对于环境和操作的严格要求,又保留了RNA:DNA核酸分子极强结合能力的性能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)通过平行制备寡核苷酸池获得包含目标序列以及通用引物区域的DNA模板;
(2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应,同时在PCR过程中引入生物素标记的ATP和甲基化dm5CTP;
(3)磁珠富集法纯化PCR产物;
(4)对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化;
(5)磁珠富集法纯化步骤(4)处理后的产物;
(6)Lambda核酸外切酶水解步骤(5)纯化后产物的双链DNA中一条带有5′端磷酸化的单链,从而获得带有生物素标记的单链DNA;
(7)磁珠富集法纯化带有生物素标记的单链DNA,得修饰性DNA杂交探针。
本发明创造性的点在于步骤2、4、6,以往利用平行制备寡核苷酸池进行捕获探针制备,其主要方法为使用Taq酶将平行制备的寡核苷酸池进行PCR扩增,同时在PCR引物端引入T7启动子序列,然后利用T7启动子线性扩增成RNA序列,扩增过程中引入带有生物素标记的UTP,最终形成RNA捕获探针。相比于该方法,本发明的优势之处在于通过实验捕获了单链DNA捕获探针,使得探针的保存条件更加稳定,同时由于引入了带有甲基化修饰的DNA碱基,增强了DNA分子的结合性。
作为优选,步骤(2)中所述PCR引物为引物对,包括正向引物和反向引物,正向引物的序列为5’-GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3’,反向引物的序列为5’-UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3’。
作为优选,步骤(2)的PCR反应体系中,含有dUTP的PCR引物的终浓度为0.5μM。
本发明的有益效果是:对于环境和操作的要求较低,保留了RNA:DNA核酸分子极强结合能力的性能,本发明极大了降低了生产成本、使用范围广,包括任意物种基因组的外显子区域、内含子区域、线粒体区域以及内含子区域等。所获得的DNA杂交探针可以应用于二代测序靶向文库的构建以及测序。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中,若非特指,所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。
总实施方案:
一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)通过平行制备寡核苷酸池获得包含目标序列以及通用引物区域的DNA模板。
(2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应,同时在PCR过程中引入生物素标记的ATP和甲基化dm5CTP;所述PCR引物为引物对,包括正向引物和反向引物,正向引物的序列为5’-GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3’(SEQ ID No.1),反向引物的序列为5’-UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3’(SEQ ID No.2),正向引物和反向引物由上海生工合成。PCR反应体系中,含有dUTP的PCR引物的终浓度为0.5μM。
(3)磁珠富集法纯化PCR产物。
(4)对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化。
(5)磁珠富集法纯化步骤(4)处理后的产物。
(6)Lambda核酸外切酶水解步骤(5)纯化后产物的双链DNA中一条带有5′端磷酸化的单链,从而获得带有生物素标记的单链DNA。
(7)磁珠富集法纯化带有生物素标记的单链DNA,得修饰性DNA杂交探针。
具体实施案例:
1、试剂和仪器
1.1试剂
1.2仪器
2、操作流程
A.使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应,PCR反应体系如下:
在PCR仪中执行以下反应程序:
步骤 | 温度 | 时间 | |
激活 | 1 | 94℃ | 5min |
变性 | 2 | 94℃ | 30sec |
退火 | 3 | 45-65℃ | 1min |
延伸 | 4 | 68℃ | 1min |
返回步骤2循环35次 | 5 | ||
延伸 | 6 | 68℃ | 5min |
保持 | 7 | 5℃ | Forever |
B.Beads纯化PCR产物
1.向每管PCR产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads(室温)并彻底混匀(移液枪吹打15次);
2.室温孵育5min;
3.将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
4.将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
5.保持反应管于磁力架上加入200μl(新鲜配置)70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
6.两次乙醇清洗后,尽可能多的去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;注意不要将beads过度干燥(通常7~10min);
7.干燥完成后,从磁力架上取下反应管并加入18μl Nulease-free water,充分混匀;
8.将反应管放回磁力架上直到液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下一步实验。
C.对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化
1.准备以下反应:
2.将反应管置于预热的PCR仪中,合上盖子,37℃孵育15min;
3.保持反应管在PCR仪上,加入1μl T4DNA聚合酶(300U/ml),1μldNTP(1mM),用移液枪吸取全部体积轻柔吹打6~8次充分混匀。继续在PCR仪上孵育37℃,10min,然后将反应管置于冰上。
4.选作:取1ul稀释10倍的PCR产物,采用高灵敏度DNA生物分析芯片(Agilent公司)电泳质检判断条带大小。
D.Beads纯化C步产物
1.向每管产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads(室温)并彻底混匀(移液枪吹打15次);
2.室温孵育5min;
3.将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
4.将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
5.保持反应管于磁力架上加入200ul(新鲜配置)70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
6.两次乙醇清洗后,尽可能多的去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;注意不要将beads过度干燥(通常7~10min);
7.干燥完成后,从磁力架上取下反应管并加入18μl Nulease-free water,充分混匀;
8.将反应管放回磁力架上直到液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下一步实验。
E.Lambda核酸外切酶水解双链DNA中5′端磷酸化的单链
1.准备以下反应:
2.将反应管置于预热的PCR中,合上盖子,37℃孵育30min;之后将反应管置于冰上;
3.选作:取1μl稀释10倍的PCR产物采用高灵敏度DNA生物分析芯片(BioanalyzerHigh Sensitivity DNA chip,Agilent公司)电泳质检判断条带大小。
F.Beads纯化单链DNA
1.向每管产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads(室温)并彻底混匀(移液枪吹打15次);
2.向样本-beads的混合液中加入100%的异丙醇并使其终浓度在20%,充分混匀;
3.室温孵育5min;
4.将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
5.将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
6.保持反应管于磁力架上加入200ul(新鲜配置)70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
7.两次乙醇清洗后,尽可能多的去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;注意不要将beads过度干燥(通常7~10min);
8.干燥完成后,从磁力架上取下反应管并加入20μl Nulease-free water,充分混匀;
9.将反应管放回磁力架上知道液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下游实验;
10.选作:取1μl稀释10倍的PCR产物采用高灵敏度DNA生物分析芯片(BioanalyzerHigh Sensitivity DNA chip,Agilent公司)质检判断条带大小。
杂交捕获案例:
为了进一步检验制备的捕获探针,应用于靶向杂交捕获的可行性和高性能性,本实验设计如下,采用本发明的方法,针对人的18个基因的全外显子区域进行修饰性DNA杂交探针的制备,采用制备的DNA杂交探针与DNA文库进行杂交,并高效富集,然后在HiSeq2000/HiSeq2500上进行高通量、高深度测序。
具体实验步骤为:将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180-280bp的片段,经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库pooling后与本发明制备的生物素标记的修饰性DNA杂交探针进行液相杂交,再使用带链霉素的磁珠将18个基因的外显子捕获下来,经PCR线性扩增后进行文库质检,合格即可进行测序。通过对于测序数据的比对分析,即可获得制备的液相捕获探针对于目标区域的捕获信息,结果见表1和表2。
表1所示,18个基因的名字,每个基因捕获的外显子区域个数以及大小以及染色体所在区域:
表2所示,通过捕获的测序数据分析,杂交捕获探针捕获的测序数据目标区域深度大于30X的区域所占的比例均大于99%,显示能够基本完全捕获目标序列,18基因的外显子测序数据的平均覆盖深度约为500层(50X):
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (1)
1.一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应,PCR反应体系如下:
在PCR仪中执行以下反应程序:
2)Beads纯化PCR产物;
2.1)向每管PCR产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads并彻底混匀;
2.2)室温孵育5min;
2.3)将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
2.4)将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
2.5)保持反应管于磁力架上加入200μl 70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
2.6)两次乙醇清洗后,去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;
2.7)干燥完成后,从磁力架上取下反应管并加入18μl Nulease-free water,充分混匀;
2.8)将反应管放回磁力架上直到液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下一步实验;
3)对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化;
3.1)准备以下反应:
3.2)将反应管置于预热的PCR仪中,合上盖子,37℃孵育15min;
3.3)保持反应管在PCR仪上,加入1μl 300U/ml的T4DNA聚合酶,1μl 1mM的dNTP,用移液枪吸取全部体积轻柔吹打6~8次充分混匀,继续在PCR仪上孵育37℃,10min,然后将反应管置于冰上;
3.4)选作:取1ul稀释10倍的PCR产物,采用高灵敏度DNA生物分析芯片电泳质检判断条带大小;
4)Beads纯化步骤3)产物;
4.1)向每管产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads并彻底混匀;
4.2)室温孵育5min;
4.3)将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
4.4)将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
4.5)保持反应管于磁力架上加入200ul 70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
4.6)两次乙醇清洗后,去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;
4.7)干燥完成后,从磁力架上取下反应管并加入18μl Nulease-free water,充分混匀;
4.8)将反应管放回磁力架上直到液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下一步实验;
5)Lambda核酸外切酶水解双链DNA中5′端磷酸化的单链;
5.1)准备以下反应:
5.2)将反应管置于预热的PCR中,合上盖子,37℃孵育30min;之后将反应管置于冰上;
5.3)选作:取1μl稀释10倍的PCR产物采用高灵敏度DNA生物分析芯片电泳质检判断条带大小;
6)Beads纯化单链DNA;
6.1)向每管产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads并彻底混匀;
6.2)向样本-beads的混合液中加入100%的异丙醇并使其终浓度在20%,充分混匀;
6.3)室温孵育5min;
6.4)将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清;
6.5)将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清;
6.6)保持反应管于磁力架上加入200ul 70%的乙醇溶液,静置30s,然后用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次;
6.7)两次乙醇清洗后,去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;
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6.9)将反应管放回磁力架上直到 液体澄清;收集上清液到新的管子中并进行下游实验;
6.10)选作:取1μl稀释10倍的PCR产物采用高灵敏度DNA生物分析芯片质检判断条带大小。
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CB02 | Change of applicant information |
Address after: 310026 No. 6 Street 260, Hangzhou Economic and Technological Development Zone, Zhejiang Province, 16 buildings and four floors Applicant after: Hangzhou Chuan Chuan biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 310018 Room B1805, Building 452, Sixth Street, Xiasha Economic Development Zone, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant before: Hangzhou LC Biotech Co., Ltd. |
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