CN105838821B - 一种检测牛apaf1基因隐性致死突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测牛APAF1基因隐性致死突变的方法，涉及分子生物学领域，本发明方法基于焦磷酸测序技术，采用一对扩增引物、一条通用引物和一条测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、2、3、4所示，对牛5号染色体63150400bp位点的单核苷酸多态性进行分析，结果发现牛APAF1基因野生型纯合子在C碱基处有峰，T碱基处无峰；而致死突变携带者在C碱基与T碱基处均有峰。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高，准确性强，通量高，检测成本低，可快速检测APAF1基因隐性致死突变携带者的个体，在牛的育种过程中具有重要应用价值。

Description

一种检测牛APAF1基因隐性致死突变的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于牛APAF1基因型检测的SNP分子标记、以及检测牛APAF1基因隐性致死突变的方法。
背景技术
单核苷酸多态性标记(SNP)，主要是指基因组上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。
已有多种方法可用于SNP检测，目前比较常用的有基因芯片方法、DNA测序法、质谱法、以及TaqMan荧光定量方法等。不同方法根据所依据的原理不同适用于不同的研究。芯片和质谱技术适用于大规模的多态信息检测。而测序和Taqman技术适用于高精度、高准确性的判定SNP多态信息。在多种测序技术中，焦磷酸测序是一种基于酶级联反应的新型DNA测序技术。是目前少数能够得到定量序列结果的技术之一，其准确度高，重复性好，广泛用于多种遗传多态性分析。
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)等4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。焦磷酸测序技术可以用来研究单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面都有广泛的应用。该技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。
近年来，随着全基因组标记技术的广泛应用，一些影响奶牛繁殖力的基因位点被发现。2011年，美国科学家VanRaden等人在分析牛SNP芯片数据的基因型信息时发现，有5种单倍型从来没有以纯合状态出现在牛群中，由此推断该5中单倍型纯合时导致个体死亡(VanRaden等，2011)。其中，在荷斯坦牛品种中发现的3种单倍型被命名为HH1(HolsteinHaplotype 1)、HH2(Holstein Haplotype 2)和HH3(Holstein Haplotype 3)。研究发现，2011年北美荷斯坦牛群中HH1携带率为4.5％，由HH1导致的妊娠率降低3.1％，死胎率为0.7％，对奶牛产业造成了巨大的经济损失(VanRaden等，2011)。
2012年，Adams等人通过全基因组重测序和高密度单倍型分型技术，确定了HH1的分子机理是牛5号染色体APAF1(Apoptotic Peptidase Activating Factor 1)基因第11外显子上的C/T突变，导致编码谷氨酰胺的密码子突变为终止密码子，APAF1编码的蛋白质大约1/3功能丧失，从而引起胚胎发育所必需的凋亡肽酶激活因子缺乏，最终导致胚胎死亡(Adams等，2012)。该突变物理位置为牛UMD3.1全基因组序列上5号染色体的63150400位点。VanRaden等(2011)报道了基于SNP单倍型的HH1检测方法。该方法需要首先对待检样本进行SNP芯片检测，然后通过统计学方法推断单倍型，进而判定个体携带HH1的概率。此方法不仅因依赖芯片检测而成本很高，同时还需事先建立参考群体的基因型数据库；另外，由于其本质上是利用周围SNP标记对致病突变位点基因型的间接推断，所以结果并非100％准确。因此需要一种能够大通量、低成本、快速、直观且准确地检测牛5号染色体APAF1基因上的C/T突变的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测牛APAF1基因隐性致死突变的方法。
为达到上述目的，本发明根据位于牛5号染色体63150400bp位点处牛APAF1基因隐性致死突变的SNP分子标记，该SNP分子标记的多态性为T/C，提供了用于检测该SNP分子标记的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
进一步地，用于检测该SNP分子标记的引物还包括一条5’端添加生物素标记的通用引物和一条焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。
本发明提供了上述SNP分子标记在牛育种中的应用。
本发明提供了上述SNP分子标记在牛种质资源改良中的应用。
本发明提供了一种用于检测牛APAF1基因隐性致死突变的试剂盒，含有1对引物，一条通用引物和一条焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
进一步地，本发明试剂盒利用焦磷酸测序法对牛5号染色体63150400bp位点的核苷酸进行SNP检测。
优选地，本发明检测牛APAF1基因隐性致死突变试剂盒的工作步骤如下：
(1)提取待测牛的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1-3所示的引物为扩增引物，进行PCR反应；
(2)以步骤(1)的扩增产物为模板，以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为测序引物进行焦磷酸测序，根据突变位点的峰图来判断基因型，当焦磷酸测序结果图上显示C碱基处有峰，T碱基处无峰时，突变位点为C/C基因型，为野生型纯合子；当焦磷酸测序结果图上显示C碱基与T碱基处均有峰时，突变位点为C/T基因型，为致死突变携带者。
其中，步骤(1)中PCR扩增的反应体系为：总体积40μL，其中含dNTP、Mg2+的2×PCRbuffer 20μL，浓度20μM的上游引物1μL，浓度20μM的下游引物0.1μL，浓度10μM的通用引物0.9μL，基因组DNA模板1μg，加水补至40μl反应体系。
步骤(1)中PCR反应条件为：95℃预变性8min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；72℃终延伸10min。
本发明提供了上述试剂盒在牛育种中的应用。
本发明提供了上述试剂盒在牛种质资源改良中的应用。
本发明还提供一种检测牛APAF1基因型的方法，是利用焦磷酸测序法对5号染色体63150400bp位点的核苷酸进行SNP检测。
进一步地，上述方法包括以下步骤：
(1)提取待测牛的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1-3所示的引物为扩增引物，进行PCR反应；
(2)以步骤(1)的扩增产物为模板，以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为测序引物进行焦磷酸测序，根据突变位点的峰图来判断基因型，当焦磷酸测序结果图上显示C碱基处有峰，T碱基处无峰时，突变位点为C/C基因型，为野生型纯合子；当焦磷酸测序结果图上显示C碱基与T碱基处均有峰时，突变位点为C/T基因型，为致死突变携带者。
本发明提供的一种检测牛APAF1基因型的方法，SNP分子标记，试剂盒可应用于选育不携带APAF1致死基因的牛只。
本发明利用牛APAF1基因隐性致死突变的SNP位点设计特异性引物，进行焦磷酸测序，根据T/G峰值判断牛APAF1基因的基因型可实现对牛APAF1基因隐性致死突变携带者个体的快速检测，克服了常规PCR-RFLP方法检测SNP位点时必须有酶切位点的要求，从而大大地提高牛育种和保种效率；本发明的检测方法可高通量实现牛APAF1基因隐性致死突变的检测，且操作简单，费用低廉，准确度高。
附图说明
图1为本发明所用引物及测序序列在牛APAF1基因序列上的位置(基因组序列来源于Ensembl牛基因序列UMD3.1)。下划线显示引物所在位置，其中直线为上下游引物，波浪线为测序引物；阴影处为测序序列，阴影处从左向右第5个碱基为C/T突变位点。
图2为牛APAF1基因隐性致死突变携带者部分测序结果。箭头处为突变位点(C/T突变)。该突变的基因组物理位置为牛5号染色体的第63150400位(牛UMD 3.1基因组图谱http://www.ensembl.org)。
图3为PCR产物电泳胶图。泳道1-4显示PCR产物为单一的188bp条带；M为DNAMarker。
图4为利用本发明方法检测APAF1基因隐性致死突变位点的基因型，其中图4A图为野生型纯合子，C碱基处有峰，T碱基处无峰；图4B图为致死突变携带者,C碱基与T碱基处均有峰。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1检测牛APAF1基因隐性致死突变的焦磷酸测序方法的建立
1、基因组DNA提取
采用高盐法从牛冻精中提取基因组DNA。
2、引物筛选与PCR扩增
从ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/)获取目标DNA序列(UMD3.1:5:63150200:63150600:1)，设计PCR扩增引物和测序引物。下述引物及测序序列在牛APAF1基因序列上的位置见图1。
表1检测牛APAF1基因隐性致死突变的引物组合
其中，上游引物(APAF1-F)、下游引物(APAF1-R)将扩增出包含隐性致死突变位点的APAF1基因片段；通用引物(APAF1-U)序列与下游引物(APAF1-R)的前20bp完全一致，其作用是在PCR产物的5’端添加生物素标记，最终得到5’端带有生物素标记的188bp DNA片段；进行焦磷酸测序时，加入测序引物(APAF1-S)进行测序，根据突变位点的峰图来判断基因型。理论上野生型纯合子在C碱基处有峰，T碱基处无峰；而致死突变携带者在C碱基与T碱基处均有峰。因此，通过测序峰图，可以准确区分野生型纯合子和致死突变携带者。突变纯合子的胚胎不可存活，在妊娠期流产，因此试验中不会观察到突变纯合子的基因型。
野生型纯合子在突变位点处为C/C基因型，在焦磷酸测序结果图上，显示C碱基处有峰，T碱基处无峰；而致死突变携带者突变位点处为C/T基因型，焦磷酸测序结果在C碱基与T碱基处均有峰，见图2。
PCR反应体系：总体积40μL，其中2×PCR buffer(包含dNTP、Mg2+)20μL，上游引物(浓度20μM)1μL，下游引物(浓度20μM)0.1μL，通用引物(浓度10μM)0.9μL，基因组DNA模板1μg，加水补至40μL。
PCR反应条件：95℃预变性8min；然后45个循环，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min。
仪器为Applied Biosystems 9700型PCR仪。
(3)PCR产物的凝胶电泳检测
制作浓度为2％的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物3μL点样，在TAE缓冲液中120V电压下电泳15min。在凝胶成像系统中观察电泳结果，为单一的约188bp条带，见图3。
(4)PCR产物的焦磷酸测序
本实施例所用试剂为QIANGEN公司生产的退火缓冲液(PyroMark AnnealingBuffer)、结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer)、测序反应试剂(PyroMark GoldQ96Reagents试剂盒(包含酶混合物、底物混合物及四种碱基)，以及GE公司(GeneralElectric Company)生产的链霉亲和素琼脂糖珠(Streptavidin Sepharose HighPerformance)。具体步骤为：
1)在37μL标记有生物素的PCR产物中加入200μg链霉亲和素琼脂糖珠和3μL结合缓冲液，室温下震荡20min，使生物素与链霉亲和素充分结合，将PCR产物吸附到琼脂糖珠上。
2)用过滤吸头将吸附了PCR产物的琼脂糖珠吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；变性缓冲液(0.2M NaOH)中清洗5s；清洗缓冲液(0.01M Tris-Acetate，PH＝7.6)中清洗15s；最后将过滤吸头悬空30s(仰角>90°)，由此得到单链PCR产物。
3)将吸头置于酶标板正上方，关掉吸泵开关，待压强变为0时将过滤吸头放入含有1μL测序引物和40μL退火缓冲液的酶标板中，轻轻摇动15s，使单链PCR产物进入酶标板。将装有样品的酶标板放入80℃烘箱2min，再冷却到室温，使测序引物(APAF1-S)与单链PCR产物结合。
4)将装有样品的酶标板放入焦磷酸测序仪，将酶、底物和四种碱基分别加入试剂舱中，打开PyroMark Q96软件，选定SNP检测方法，输入待测序列(TCGGC/TAAGCTAA)，设置相关参数后运行程序进行检测。
5)根据测序峰图进行基因型判型
在PyroMark Q96软件中观察测序结果，见图4A和图4B。根据测序峰图判定每个样品的基因型：野生型纯合子在C碱基处有峰，T碱基处无峰；而致死突变携带者在C碱基与T碱基处均有峰。
本发明研发过程中设计了多对引物，但效果均不如上述引物效果好。例如下述引物
经过琼脂糖凝胶电泳，结果发现该对引物扩增后有杂带，不符合实验要求，故而舍弃。经过筛选比较后，发现本发明表1的引物组合能够获得最佳的检测效果，能够准确、特异、高效地检测牛APAF1基因隐性致死突变。
实施例2本发明方法的临床应用
利用本发明实施例1记载的方法，对北京奶牛中心的152头荷斯坦公牛进行了临床检测，共发现致死突变携带者11头，携带者所占比例为7.2％。根据检测结果，制定了这些公牛的选种和选配方案，从而逐步淘汰有害基因携带者，显著提高了选种效率。
上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种SNP分子标记在牛育种中淘汰APAF1基因隐性致死突变携带者个体中的应用，所述SNP分子标记位于牛5号染色体63150400bp位点处，该SNP分子标记的多态性为T/C。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，可采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物、以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示的一条5’端添加生物素标记的通用引物和一条焦磷酸测序引物对该SNP分子标记进行检测。
3.一种试剂盒在牛育种中淘汰APAF1基因隐性致死突变携带者个体中的应用，其特征在于，所述试剂盒含有1对引物，一条通用引物和一条焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
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