JP2014526887A - 造血幹細胞移植の成功率を改善する方法 - Google Patents

造血幹細胞移植の成功率を改善する方法 Download PDF

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Abstract

本明細書に記載される技術は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子（例えばＡｈＲ、Ｐｒｏｘ１および／またはＳＨ２Ｂ３）を標的にする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物と、このようなｄｓＲＮＡ組成物を使用してＭＨＣ増幅の負の制御因子発現を阻害する方法とに関する。例えば移植のためのＭＨＣおよび／または造血始原細胞の量（ｑｕａｎｔｉｔｉｔｅｓ）および／または質の向上を提供し、および／または移植されたＭＨＣ造血始原細胞の生着を向上させるための、このような組成物の使用が記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１１年８月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５１３，８２０号明細書の便益を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その内容全体を参照によって援用する。２０１２年８月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５１５８７１ＰＣＴ．ｔｘｔと命名されて、５３９，７７８バイトの大きさである。
本明細書に記載される技術は、移植材料の可用性と、それらの使用の成功率とを増大させるために、幹細胞および／または始原細胞および／または臍帯血をｓｉＲＮＡで処理する方法に関する。
いくつかの病状および疾患は、造血細胞を含む治療薬に応答性である。このような病状としては、血液悪性腫瘍、骨髄機能不全、異常ヘモグロビン症、および先天性代謝異常（例えば自己免疫疾患、白血病、急性骨髄性白血病、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ホジキン病、好中球減少症、骨髄異形成症候群、ファンコニ貧血、ブラックファンダイヤモンド貧血、重症再生不良性貧血、重症複合型免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、大理石骨病、ハーラー症候群、ハンター症候群、レッシュナイハン症候群、副腎白質ジストロフィー、球様細胞白質萎縮症、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群、鎌状赤血球貧血、ＨＩＶ、ユーイング肉腫、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、関節リウマチ、ゴーシェ病、サラセミア、免疫系の化学療法レスキュー）が挙げられる。造血幹細胞（ＨＳＣ）移植は、このような症例の一般的治療である。臨床的に、ヒトＨＳＣは、骨髄、動員後成人末梢血、および分娩後の臍帯から得られる臍帯血の３つの異なる起源から得られる。
世界的には、５百万人を超える無関係の骨髄ボランティア供与者が登録されているが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の多形性のために、ＨＬＡが完全に一致する無関係の供与者を発見することは、多くの患者にとって未だに問題である。骨髄および成人末梢血と比較して、臍帯血には、特に細胞の幅広く迅速な可用性、そして急性および慢性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクが低いため供与者と受容者間のＨＬＡ同一性要件があまり厳しくないことなど、いくつかの潜在的な利点がある（非特許文献１）。骨髄または成人末梢血からのＨＳＣでなく、臍帯血ＨＳＣを使用する移植の潜在的利点としては、以下が挙げられる。（１）大きな潜在的供与者プール；（２）臍帯血は予備検査され試験されているために、迅速に使用できる；（３）標本として不十分である民族的背景の小児が生まれる病院に、採取努力を集中させることで、バンク中におけるより大きな人種多様性が達成され得る；（４）供与者のリスクまたは不快感がより少ない；（５）ウイルスによる汚染は稀である；および（６）組織が完璧に一致しない受容者でさえも、（供与者の細胞が患者の臓器および組織を攻撃する）移植片対宿主病のリスクが低い。さらに成人ＨＳＣとの比較で、臍帯血から得られるＨＳＣは、培養物中でコロニーを形成でき、より高い細胞周期速度を有し、増殖因子のオートクリン産生を提示して、より長いテロメア（ｔｅｌｏｍｏｅｒｅｓ）を有し、それらは全て移植の成功を支持する。最後に、骨髄とは対照的に、臍帯血採取は、供与者にいかなるリスクも及ぼさない。したがって臍帯血由来ＨＳＣは、近年、骨髄移植のためにますます使用されるようになってきた。
しかし単一臍帯は一般に、１回の小児骨髄移植手順に十分な移植材料のみをもたらす。さらに受容者に提供される生存細胞の濃度が、移植成功の重要な決定因子である（非特許文献２）。場合によっては、特に移植細胞用量に対する懸念のために、骨髄移植が臍帯血移植の代わりに使用され（非特許文献３）、現在のＵＣＢ在庫の１２％のみが、６０ｋｇの患者の処置に十分な移植細胞用量を含有する。総有核細胞数が２．５×１０７細胞／ｋｇ２未満であり、またはＣＤ３４＋数が１．７×１０５細胞／ｋｇ２未満である場合、芳しくない生着、高い非再発死亡率、および芳しくない生存期間が観察される傾向がある。好中球および血小板回復の移植ベンチマークは、移植細胞用量に関係していると思われる。
ＵＣＢ中にあるＨＳＣおよび始原細胞を増幅して、治療用途に利用できる移植材料の量を増大させ得る（非特許文献４）。幹細胞の生体外増幅の成功裏の増幅は、単一臍帯血採取物の可能な用途を増大させ得る。幹細胞増幅は、この治療形態に対するより容易なアクセスを可能にし、より高い移植細胞用量を容易にして、遺伝子療法のために臍帯血が発達できるようにすることで、小児科および成人患者の双方におけるその成功率を増大させる。
Ｒｏｃｈａ，Ｖ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．９７：２９６２−７１．２００１ Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ １９９７ ３３７：３７３−３８１ Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＢＢ＆ＭＴ２００２ ８：２５７−２６０ Ｌｉａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１１ ３９：３９３−４１２
本明細書に記載されるのは、ＵＣＢから採取された多分化能造血細胞（ＭＨＣ）を生体外で増幅する方法である。本明細書の用法では、「多分化能造血細胞」という用語は、造血幹細胞と造血始原細胞の双方を指す。ＭＨＣの集団は、ＨＳＣまたは造血始原細胞、または双方の細胞型の混合物を含んでなり得る。これらの方法の応用は、移植能力を向上させ、したがってＵＣＢ ＨＳＣ移植に関する成功率と回復速度を向上させ得る。一態様では、本明細書に記載される方法は、例えば増幅サイトカインを負に調節する遺伝子標的の発現を低下させ、またはノックダウンするｉＲＮＡコンストラクトを細胞中に導入することで、ＵＣＢからの造血細胞が移植のために増幅される。増幅に続いて、ＭＨＣの治療有効量を患者に投与し得る。成功裏に移植されたＭＨＣは生着し、次に増殖し分化して、損傷を受けたまたは不在である、患者の造血細胞集団に置き換わる。本明細書に記載される方法は、生着に利用できるより多数のＭＨＣ、ならびに生着、増殖、および／または分化能力が増大したＭＨＣの双方の調製をもたらす。
本明細書に記載される方法に従って処理されたＭＨＣの増幅は、全集団の細胞計数によって測定され得る。いくつかの実施形態では、処理されたＭＨＣ集団を分割して、亜集団の増幅が測定され得る。生着を評価する方法は、下で考察される。
本明細書に記載されるのは、例えば細胞中または哺乳類中で、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を低下させる、組成物および方法である。ＭＨＣ増幅の負の制御因子は、細胞周期進行を阻害する因子、ＭＨＣ分裂を阻害する因子、ＭＨＣ成長を阻害する因子、またはＭＨＣ増殖を阻害する因子であり得る。特定の実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子は、分化を促進する因子であり得る。生体外でＭＨＣ増幅を促進し、したがって患者が利用できる移植材料量の増大を可能にして、ならびに同一移植材料の効率および／または潜在力を増大させる、組成物および方法もまた記載される。
移植細胞のＭＨＣ増幅の負の制御因子を標的にするｉＲＮＡの投与を伴う、移植ＭＨＣの増幅または生着を増大させる方法もまた、本明細書に記載される。生体内でＭＨＣ増幅を向上させる、このようなｉＲＮＡ組成物の投与もまた、検討される。
本明細書の用法では、「ｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で定義されるようなＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じてＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する、作用物質を指す。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、細胞または哺乳類中で、ＭＨＣ増幅の負の制御因子の発現を阻害する。さらなる実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば細胞または哺乳類中で、Ｉｔｃｈ、ＳＨ２Ｂ３／Ｌｎｋ、ＰＲＯＸ１、またはＡｈｒの１つまたは複数の発現を阻害する。
本明細書で取り上げる組成物に含まれるｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、３０ヌクレオチド以下、一般に１９〜２４ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有する、ｄｓＲＮＡを包含する。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡ転写物は、Ｉｔｃｈ、ＳＨ２Ｂ３／Ｌｎｋ、ＰＲＯＸ１、またはＡｈｒをコードする。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの領域を含んでなる。
一実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。ｉＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖はＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は、３０ヌクレオチド以下、および少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般にｉＲＮＡは、例えば１９〜２１など、１９〜２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは約１５〜約２５ヌクレオチド長であり、別の実施形態では、ｉＲＮＡは約２５〜約３０ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡは、本明細書に記載される方法などでアッセイすると、ＭＨＣ増幅の負の制御因子を発現する細胞との接触時に、ＭＨＣ増幅の負の制御因子の発現を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％以上阻害する。一実施形態では、ｉＲＮＡは、安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に調合される。
一実施形態では、本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、表２〜７のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列と、表２〜７のアンチセンスセンス配列からなる群から選択される第２の配列とを含む。本明細書で取り上げるｉＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチドを含み得て、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に連結する末端ヌクレオチドをはじめとするが、これに限定されるものではない、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。代案としては、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチド群から選択されてもよい。一般に、このような修飾配列は、表２〜７のセンス配列からなる群から選択されるｉＲＮＡの第１の配列と、表２〜７の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列とをベースとする。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、ｄｓＲＮＡで処理されていない集団との比較で、生体外におけるＭＨＣ数を、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％以上など、少なくとも１０％増大させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、ｄｓＲＮＡで処理されていない集団との比較で、生体外におけるＣＤ３４＋ ＭＨＣ数を、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％以上など、少なくとも１０％増大させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、ｄｓＲＮＡで処理されていない集団との比較で、成功裏の移植に必要な細胞用量を、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上など、少なくとも１０％低下させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、例えば移植の４週間、８週間、１２週間または１６週間後に、ｄｓＲＮＡで処理されていない集団との比較で、移植患者への投与後に生存する所与の細胞の単位用量のＭＨＣ数を、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％以上など、少なくとも１０％増大させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、ｄｓＲＮＡで処理されていないＭＨＣを投与された患者との比較で、移植患者における血小板および／または好中球の回復に要する時間を、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上など、少なくとも５％短縮させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、ｄｓＲＮＡで処理されていないＭＨＣを投与された患者との比較で、移植患者におけるリンパ球回復に要する時間を、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上など、少なくとも５％短縮させる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ投与は、移植の６ヶ月、１年間、または２年間後に、ｄｓＲＮＡで処理されていないＭＨＣを投与された患者との比較で、患者生存率を、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上など、少なくとも５％増大させる。
一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、野生型のＭＨＣ増幅ＲＮＡ転写物の負の制御因子を標的とし、別の実施形態では、ｉＲＮＡは、変異転写物（例えば対立遺伝子変異体を保有する負の制御因子ＲＮＡ）を標的にする。例えばｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子の一塩基多型（ＳＮＰ）などの多型変異体を標的にし得る。別の実施形態では、ｉＲＮＡは、野生型および変異型双方のＭＨＣ増幅転写物の負の制御因子を標的にする。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子の転写変異体を標的にする。
一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、５’または３’非翻訳領域などの、ＭＨＣ増幅ＲＮＡ転写物の負の制御因子の非コード領域を標的にする。
一態様では、本明細書に記載される技術の実施形態は、本明細書で取り上げるｉＲＮＡの少なくとも１つを含有する細胞を与える。細胞は、一般にヒト細胞などの哺乳類細胞である。
別の態様では、本明細書に記載されるのは、一般にＵＣＢから得られるヒトＭＨＣである細胞中において、ＭＨＣ増幅遺伝子の負の制御因子の発現を阻害するための組成物である。組成物は、典型的に、本明細書に記載されるｉＲＮＡの１つまたは複数と、許容できる担体または送達ビヒクルとを含む。
別の実施形態では、例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子を標的にするｄｓＲＮＡなどの、本明細書に記載されるｉＲＮＡを含有する組成物が、サイトカインまたは間質細胞などの非ｉＲＮＡ増幅作用物質と共に、ＭＨＣ細胞に投与される。
別の実施形態では、例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子を標的にするｄｓＲＮＡなどの、本明細書に記載されるｉＲＮＡを含有する組成物が、ＭＨＣ増幅の負の制御因子を標的にする１つまたは複数の追加的なｉＲＮＡと共に、ＭＨＣ細胞に投与される。
別の態様では、本明細書に記載される技術の実施形態は、好ましくはヒト対象である生物中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子の発現を阻害する医薬組成物を与える。組成物は、典型的に、本明細書に記載されるｉＲＮＡの１つまたは複数と、薬学的に許容できる担体または送達ビヒクルとを含む。一実施形態では、悪性または非悪性造血障害を治療するために、組成物が使用される。
別の態様では、本明細書に記載されるのは、以下のステップを含む、細胞中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法である。
（ａ）互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入するステップ。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含み；アンチセンス鎖は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補性領域を有し、相補性領域は３０ヌクレオチド以下、すなわち１５〜３０ヌクレオチド長、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子を発現する細胞との接触時に、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上阻害する。
（ｂ）ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間と条件下で、ステップ（ａ）で生成された細胞を維持し、それによって細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するステップ。
いくつかの実施形態では、上述の方法は、細胞中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、上述の方法は、細胞中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を低下させる。
一実施形態では、方法は、ヒトＭＨＣ細胞またはヒト造血始原細胞中において、遺伝子発現を阻害する。別の実施形態では、方法は、ＵＣＢから得られるヒトＭＨＣ細胞またはヒト造血始原細胞中において、遺伝子発現を阻害する。
一態様では、本明細書に記載される技術は、細胞中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する、少なくとも１つの制御配列を含む。
別の態様では、本明細書に記載される技術は、細胞中において細胞中において（ｉｎ ａ ｃｅｌｌ ｉｎ ａ ｃｅｌｌ）、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するベクターを含有する細胞を提供する。ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの１つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する、制御配列を含む。
本明細書に記載される技術の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本明細書に記載される技術のその他の特性、目的、および利点は、説明と図面から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
ｉＲＮＡ二本鎖によるＳＨ２Ｂ３サイレンシングの生体外試験のグラフを描写する。ｉＲＮＡは、１０ｎＭ（より濃い棒線）または０．１ｎＭ（より薄い棒線）で、Ｈｅｐ３ｂ細胞に投与された。処理の２４時間後のＳＨ２Ｂ３の相対的発現をｙ軸上に示し、二本鎖の同一性をｘ軸上に示す。 ｉＲＮＡ二本鎖によるＳＨ２Ｂ３サイレンシングの生体外試験のグラフを描写する。ｉＲＮＡは、１０ｎＭ（より濃い棒線）または０．１ｎＭ（より薄い棒線）でＲＫＯ細胞に投与された。処理の２４時間後のＳＨ２Ｂ３の相対的発現をｙ軸上に示し、二本鎖の同一性をｘ軸上に示す。 ｉＲＮＡ二本鎖によるＳＨ２Ｂ３サイレンシングの生体外試験の用量応答のグラフを描写する。図３Ａは、ＲＫＯ細胞中で実施された実験を示す。発現は、処理の２４時間後に測定された。ＩＣ５０およびＩＣ８０は、ｎＭで列挙される。図３Ａは、Ｈｅｐ３ｂ細胞中で実施された実験を示す。発現は、処理の２４時間後に測定された。ＩＣ５０は、ｎＭで列挙される。
本明細書に記載されるのは、ｉＲＮＡ、および細胞または哺乳類中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子発現を阻害するためにそれらを使用する方法であり、ｉＲＮＡは、細胞中でＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にする。対象ｉＲＮＡは、移植のためのＭＨＣの増幅を向上させ、それによって移植細胞の成功裏の生着の機会を増大させる。本明細書に記載されるｉＲＮＡを使用した、ＭＨＣ増幅に基づく治療法としては、例えばそれを必要とする対象への増幅ＭＨＣの投与が挙げられる。例えば移植ＭＨＣの生着を向上させるための、本明細書に記載されるＭＨＣとｉＲＮＡの同時投与もまた検討される。自己および非自己のＭＨＣ移植が、検討される。
ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。本明細書で取り上げる組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド以下の長さ、すなわち１５〜３０ヌクレオチド長、一般に１９〜２４ヌクレオチド長の領域を有する、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含んでなり、その領域は、細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と、実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡの使用は、生体外および生体内において、ＭＨＣ増幅を制限する遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。ｉＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介し、細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子発現の顕著な阻害を生じる。細胞ベースのアッセイを使用して、本発明者らは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にするｉＲＮＡが、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介し得て、生体外および生体内において、標的遺伝子発現の顕著な阻害と、ＭＨＣ増幅の増大をもたらすことを実証した。したがってこれらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、患者がＭＨＣ移植を必要とする場合に（例えば白血病、ファンコニ貧血など）、移植材料の量と移植成功を増大させるのに有用である。以下の詳細な説明は、ｉＲＮＡを含有する組成物をどのようにして作成し、使用して、細胞中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するかを開示する。
本明細書で取り上げる組成物の実施形態は、許容される担体と共に、３０ヌクレオチド以下の長さ、一般に１９〜２４ヌクレオチド長の領域を含んでなるアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡを含み、その領域は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、３０ヌクレオチド以下の長さ、一般に１９〜２４ヌクレオチド長の相補性領域を有する、アンチセンス鎖を有するｉＲＮＡを含んでなる。
したがっていくつかの態様では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にするｉＲＮＡと、許容される担体とを含有する医薬組成物、組成物を使用してＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法、およびＭＨＣ移植を必要とする患者に、処理された組成物を投与する方法が包含される。
便宜のため、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語と語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用法と、本節で提供されるその定義との間に明白な矛盾がある場合、本節の定義が優先されるものとする。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、それぞれ塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチの塩基対形成特性を実質的に変更することなしに、その他の部分によって置き換えら得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、その塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成することができる。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本明細書に記載される組成物および方法に適する。
本明細書の用法では、「多分化能造血細胞」または「ＭＨＣ」という用語は、造血幹細胞と造血始原細胞の双方を指す。ＭＨＣの集団は、ＨＳＣまたは造血始原細胞、または双方の細胞型の混合物を含んでなり得る。
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、本明細書の用法では、適切なサイトカインまたは複数のサイトカインへの曝露に際して、リンパ系、赤血球系または骨髄性細胞系の始原細胞に分化し、またはさらなる分化を開始することなく、幹細胞集団として増殖し得る、多能性幹細胞または多分化能幹細胞またはリンパ系または骨髄性（骨髄に由来する）幹細胞を指す。ＨＳＣは、骨髄、末梢血、臍帯血、または胚性幹細胞から単離され得る。ＨＳＣは、赤血球（赤血球）、血小板、顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球など）、マクロファージ、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、およびナチュラルキラー細胞などの細胞を形成し得る。ＨＳＣは自己再生でき、または細胞分裂後に幹細胞のままであり得る。ＨＳＣはまた分化することもでき、または成熟造血細胞になる過程を開始できる。ＨＳＣはまた、それらの運動性または移動が調節され得て、またはアポトーシスまたはプログラム細胞死によって調節され得る。
「始原」および「始原細胞」という用語は、本明細書の用法では、適切なサイトカインまたは一群のサイトカインへの細胞のさらなる曝露時に、発達段階に分化した未分化造血細胞を指し、それらは造血細胞系に沿ってさらに分化する。ＨＳＣとは対照的に、始原細胞は、限定的自己再生のみができる。「始原」および「始原細胞」はまた、本明細書の用法では、始原細胞の分化から誘導され、成熟分化造血細胞の直接前駆体である、「前駆」細胞も含む。「始原」および「始原細胞」という用語は、本明細書の用法では、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＧＭ−ＣＦＣ）、巨核球コロニー形成細胞（Ｍｋ−ＣＦＣ）、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、Ｂ細胞コロニー形成細胞（Ｂ−ＣＦＣ）、およびＴ細胞コロニー形成細胞（Ｔ−ＣＦＣ）を含むが、これに限定されるものではない。「前駆細胞」としては、赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、顆粒球コロニー形成細胞（Ｇ−ＣＦＣ）、好塩基球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｂａｓ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｅｏ）、およびマクロファージコロニー形成細胞（Ｍ−ＣＦＣ）の細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「サイトカイン」という用語は、本明細書の用法ではリンパ球造血幹細胞からリンパ球造血始原細胞または前駆細胞への分化を誘発し、および／またはそれらの増殖を誘発し得る、あらゆるサイトカイン、増殖因子、またはサイトカインと増殖因子との組み合わせを指す。本明細書に記載される実施形態で使用される適切なサイトカインとしては、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、トロンボポエチン、幹細胞因子、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−１５、Ｆｌｔ３Ｌ、白血病５阻害因子、インスリン様増殖因子、およびインスリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。「サイトカイン」という用語は、本明細書の用法では、動物またはヒト組織から単離されたあらゆる天然サイトカインまたは増殖因子、および元の親サイトカインの生物学的活性を保持する、そのあらゆる断片または誘導体をさらに指す。サイトカインまたは増殖因子は、さらに、例えば組換えインスリンなどの組換えサイトカインまたは増殖因子であり得る。「サイトカイン」という用語は、本明細書の用法では、構造的および機能的に関連したサイトカイン群に属しながら、１つの動物種または分類上関連した種の１群に限定される生物学的活性を有する、またはその他の種においては低下した生物学的効果を有する、種特有サイトカインをさらに含む。
本明細書の用法では、「増幅する」および「増幅」という用語は、実質的に分化なしの細胞増殖、すなわちこのような増加に伴う分化のない細胞数増加を指す。
本明細書の用法では、「ＭＨＣ増幅の負の制御因子」という用語は、その発現を検出可能な量で低下させると、ペプチド、遺伝子、または転写物の発現を低下させないこと以外は、同一条件下で維持されるＭＨＣ集団との比較で、ＭＨＣ数増加の増大をもたらす、あらゆるペプチド、遺伝子、または転写物を指す。ＭＨＣ数増加の増大は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％以上であり得る。例示的な実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子は、Ｉｔｃｈ、ＰＲＯＸ−１、ＳＨ２Ｂ３、および／またはＡｈＲを含み得る。
本明細書の用法では、「ｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で定義されるＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じて、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する作用物質を指す。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する。
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡをはじめとする、遺伝子の転写中に形成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。配列の標的部分は、その部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。例えば標的配列は、例えば１５〜３０ヌクレオチド長など、一般に９〜３６ヌクレオチド長であり、その間の部分的な範囲を全て含む。非限定的例として、標的配列は、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２６ヌクレオチド、１５〜２３ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１５〜２１ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１９ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１５〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド、２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書の用法では、「配列を含んでなる鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載される、ヌクレオチド鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、当業者には理解されるであろうように、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含むことができる、ストリンジェントな条件であり得る。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件のセットを判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補性配列としては、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、塩基対合が挙げられる。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現阻害など、それらの究極的用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最高３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の、しかし一般的には５、４、３または２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含んでなるｄｓＲＮＡがあって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含んでなる場合、それは本明細書に記載される目的で、なおも「完全に相補的」と称され得る。
「相補的」配列は、本明細書の用法では、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りは、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから生成される塩基対もまた含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、本明細書において、それらの使用状況から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間で、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間で、マッチする塩基について使用され得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書の用法では、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」配向を有するとされる、２本の逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含んでなる、ハイブリダイズ二本鎖領域を有する、ＲＮＡ分子または分子複合体を含むｉＲＮＡを指す。二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた、所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするあらゆる長さであり得るが、例えば１５〜３０塩基対の長さなどの典型的に９〜３６塩基対の長さの範囲である。９〜３６塩基対の間の二本鎖を考察すると、二本鎖は、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６などのこの範囲内のあらゆる長さ、および１５〜３０塩基対、１５〜２６塩基対、１５〜２３塩基対、１５〜２２塩基対、１５〜２１塩基対、１５〜２０塩基対、１５〜１９塩基対、１５〜１８塩基対、１５〜１７塩基対、１８〜３０塩基対、１８〜２６塩基対、１８〜２３塩基対、１８〜２２塩基対、１８〜２１塩基対、１８〜２０塩基対、１９〜３０塩基対、１９〜２６塩基対、１９〜２３塩基対、１９〜２２塩基対、１９〜２１塩基対、１９〜２０塩基対、２０〜３０塩基対、２０〜２６塩基対、２０〜２５塩基対、２０〜２４塩基対、２０〜２３塩基対、２０〜２２塩基対、２０〜２１塩基対、２１〜３０塩基対、２１〜２６塩基対、２１〜２５塩基対、２１〜２４塩基対、２１〜２３塩基対、または２１〜２２塩基対をはじめとするが、これに限定されるものではない、その間のあらゆる部分的範囲であり得る。ダイサーおよび類似酵素を用いたプロセッシングによって、細胞中で作成されるｄｓＲＮＡは、一般に１９〜２２塩基対の範囲の長さである。ｄｓＤＮＡの二本鎖領域の１本の鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的な配列を含んでなる。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一ＲＮＡ分子に由来し得て、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子から生成され得る。二本鎖領域が、単一分子の２本の鎖から生成される場合、分子は、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのその他の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの一本鎖（本明細書で「ヘアピンループ」と称される）によって隔てられる、二本鎖領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでなり得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含んでなり得る。ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は、必ずしもそうである必要はないが、共有結合的に連結され得る。２本の鎖が、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合的に連結される場合、結合構造は「リンカー」と称される。「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなｄｓＲＮＡに言及するために、本明細書で使用される。
当業者は、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、天然に発現されまたは見られるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の、１つまたは複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体または誘導体を含んでなる、ＲＮＡの類似体および誘導体もまた包含することを認識する。厳密に言えば「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基とリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１、２または３個のリン酸塩部分があるリボヌクレオシドである。しかし「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書の用法では同等物と見なし得る。ＲＮＡは、例えば本明細書で以下に記載されるように、核酸塩基構造中で、またはリボースリン酸主鎖構造中で修飾され得る。しかしリボヌクレオシド類似体または誘導体を含んでなる分子は、二本鎖を形成する能力を保たなくてはならない。非限定的実施例として、ＲＮＡ分子はまた、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミダートまたは非天然塩基包含ヌクレオシド、またはそのあらゆる組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドを含み得る。代案としては、ＲＮＡ分子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上の、最高でｄｓＲＮＡ分子の全長の修飾リボヌクレオシドを含んでなり得る。修飾は、ＲＮＡ分子中のこのような複数の各修飾リボヌクレオシドで同じでなくてもよい。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物中での使用が検討される修飾ＲＮＡは、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であり、それは必要な二本鎖構造を形成する能力を有し、ＲＩＳＣ経路を通じた標的ＲＮＡの特異的分解を可能にし、またはそれを媒介する。
一態様では、修飾リボヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドを含む。このような場合、ｉＲＮＡ剤は、例えばデオキシヌクレオシドオーバーハング、またはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１つまたは複数のデオキシヌクレオシドをはじめとする、１つまたは複数のデオキシヌクレオシドを含んでなり得る。しかしいかなる状況下でも、二本鎖ＤＮＡ分子が「ｉＲＮＡ」という用語に包含されないことは、自明である。
一態様では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する、一本鎖ＲＮＡを含む。理論による拘束は望まないが、植物および無脊椎動物細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解される（シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら著、ジーンズアンドデベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）、２００１年、第１５巻、ｐ．４８５）。リボヌクレアーゼ−ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（バーンシュタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら著、２００１年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４０９巻、ｐ．３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が、標的認識を誘導できるようにする（ニカネン（Ｎｙｋａｎｅｎ）ら著、２００１年、セル（Ｃｅｌｌ）、第１０７巻、ｐ．３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（エルバシャー（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら著、２００１年、ジーンズアンドデベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）、第１５巻、ｐ．１８８）。したがって一態様では、本明細書に記載される技術は、ＲＩＳＣ複合体形成を促進して、標的遺伝子のサイレンシングをもたらす、一本鎖ＲＮＡに関する。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端がその他の鎖の５’末端を越えて伸び、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでなり得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含んでなり得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
本明細書でｄｓＲＮＡに関して用いられる「平滑化された」または「平滑末端化された」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡ末端の片方または双方が、平滑化され得る。ｄｓＲＮＡの双方の末端が平滑化されている場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端化されたと言われる。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、双方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えば標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義される標的配列などの配列と、実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えば５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と、実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、一実施形態では、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡなどの核酸またはそれからｉＲＮＡが転写されるプラスミドを含んでなる還元性水性内部を覆う、脂質の小胞を意味する。ＳＮＡＬＰは、例えば米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、米国特許出願公開第２００７０１３５３７２号明細書、および国際公開第２００９０８２８１７号パンフレットに記載される。これらの出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。「ＳＮＡＬＰ」製剤の例は、本明細書の他の箇所に記載される。
「細胞に導入する」は、ｉＲＮＡに関する場合は、当業者には理解されるように、細胞中への取り込みまたは吸収を容易にし、またはもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、助力を受けない拡散性または活性細胞過程を通じて、または助剤または装置によって生じ得る。この用語の意味は、生体外の細胞に限定されず；ｉＲＮＡはまた、細胞が生きている生物の一部である場合にも、「細胞に導入され」得る。このような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば生体内送達のために、ｉＲＮＡを組織部位に注射し、または全身投与し得る。生体内送達はまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３２，４０１号明細書および米国特許第５，６０７，６７７号明細書、および米国特許公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ−グルカン送達系によることもできる。細胞への生体外導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法を含む。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載され、または当該技術分野で公知である。
本明細書の用法では、「発現を阻害する」という語句は、未処理細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現との比較で、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物で処理された細胞中における、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の遺伝子発現の少なくとも（ａｎ ｌｅａｓｔ）部分的低下を指す。
「発現を停止する」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、「〜の発現を抑制する」などという用語は、それらがＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子に言及する限りにおいて、本明細書では、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、しかるべく処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）との比較で、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を指し、それはＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードするｍＲＮＡ量の低下によって顕在化され、当該ｍＲＮＡは、その中でその遺伝子が転写され、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現が阻害されるように処理されている、第１の細胞または細胞群から単離されまたはその中で検出され得る。阻害の程度は、通常、
Figure 2014526887
 を用いて表される。
代案としては、阻害の程度は、例えば遺伝子によってコードされるタンパク質量または一定の表現型を提示する細胞数などの、遺伝子発現に機能的に連結するパラメータの低下の観点から示し得る。原則的に、遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム工学によって遺伝子発現するあらゆる細胞中で、あらゆる適切なアッセイによって判定し得る。しかし所与のｉＲＮＡがＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を一定レベルで阻害するかどうか、ひいては本明細書に記載される技術に包含されるかどうかを判定するために基準が必要な場合、下の実施例に提供されるアッセイが、そのような基準としての役割を果たす。
例えば、場合によっては、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子発現は、本明細書で取り上げるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子は、本明細書で取り上げるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上抑制される。
本明細書の用法では発現の文脈において、「処理する」、「処理」などの用語は、ＭＨＣ増幅の増大またはＭＨＣ移植の成果を向上させる形質（例えば本明細書に記載されるような、生着能力、好中球置換能力など）の増大をもたらす作用を指す。本明細書に記載される技術の文脈で、（ＭＨＣ増幅の負の制御因子によって制御される表現型の他に）本明細書で以下に列挙されるその他の条件のいずれかに関する限りにおいて、「処理する」、「処理」などの用語は、このような病状に関連する少なくとも１つの症状の軽減または緩和、または白血病などの造血障害進行の減速などの、このような病状の進行または予期される進行の遅延または逆転を意味する。
本明細書の用法では、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、造血細胞の欠陥または異常に起因する病理過程の治療、予防、または管理において、治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な特定量は、通常の開業医によって容易に判定され得て、例えば病理過程のタイプ、患者の病歴と年齢、病理過程段階、および病理過程を抑制するその他の作用物質の投与などの当該技術分野で公知の要素に応じて、変動し得る。
本明細書の用法では、「医薬組成物」は、薬理学的有効量のｉＲＮＡと薬学的に許容できる担体とを含んでなる本明細書の用法では、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、意図される薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なｉＲＮＡの量を指す。例えば疾患または障害と関連する測定可能パラメータに少なくとも１０％の低下があれば、所与の臨床治療が効果的と見なされる場合、その疾患または障害の治療のための薬剤の治療有効量は、パラメータに少なくとも１０％の低下をもたらすのに必要な量である。例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にするｉＲＮＡの治療有効量は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子のタンパク質レベルを少なくとも１０％低下させ得る。
「薬学的に許容できる担体」という用語は、治療薬投与のための担体を指す。このような担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。用語は、細胞培養培地を明確に除外する。経口的に投与される薬剤では、薬学的に許容可能な担体としては、薬学的に許容可能な賦形剤などの不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存料が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、および乳糖が挙げられる一方で、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤としては、デンプンおよびゼラチンが挙げられる一方で、存在する場合、平滑剤は、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石である。所望ならば、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングして、胃腸管内の吸収を遅延させることができる。製剤に含まれる作用物質については、本明細書で以下にさらに詳しく説明する。
本明細書の用法では、「対象」は、例えばイヌ、ウマ、ネコ、またはその他の非ヒト霊長類などの哺乳類である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
本明細書の用法では、「ＬＮＰＸＸ」（式中、「ＸＸ」は数字である）という用語は、本明細書で「ＡＦＸＸ」とも称される。例えばＬＮＰ０９はＡＦ０９とも称され、ＬＮＰ１２はＡＦ１２としてもまた知られており、またそのように言及される。
本明細書の用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでなる）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含んでなる）」という用語は、本明細書に記載される技術に必須の組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に関して使用されるが、本質的であるか否かに関わらず、不特定の要素の包含をなおも受け入れる。
本明細書の用法では、「〜から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。用語は、本明細書に記載される技術の実施形態の基本的および新規または機能特性に、実質的に影響を及ぼさない要素の存在を容認する。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、時に、分化して造血系の全ての細胞を作り出せる原始的細胞として定義されながら、本明細書で使用される用語としてのＨＳＣは、より普遍的に、自己再生能力と、顆粒球（例えば前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、および／または単球（例えば単球、マクロファージ）を含んでなる、より成熟した血液細胞への分化能力とを有する、未熟血液細胞に言及する。発達中に、造血部位は、胎児肝臓から骨髄に移行し、次にそれは成人期全体を通じて造血部位のままである。ＨＳＣが、ＣＤ３４＋細胞を含み得る、または含み得ないことは、当該技術分野で公知である。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカを発現する未熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上で定義された幹細胞特性がある細胞亜集団を含むと考えられている。ＨＳＣとしては、多能性幹細胞、多分化能幹細胞（例えばリンパ系幹細胞）、および／または特定の造血系に決定付けられた幹細胞が挙げられる。特定の造血系に決定付けられた幹細胞は、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、樹状細胞系、ランゲルハンス細胞系および／またはリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系であり得る。これに加えて、ＨＳＣは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）および短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）もまた指す。長期幹細胞は、典型的に、移植後の多系列生着に対する長期（３ヶ月を超える）の寄与を含む。短期幹細胞は、典型的に、３ヶ月未満持続するものであり、および／またはそれは多系列でない。ＬＴ−ＨＳＣおよびＳＴ−ＨＳＣは、例えばそれらの細胞表面マーカ発現に基づいて区別される。ＬＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４−、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙｌ．ｌ＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、Ｕｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆｌ／ＣＤ１５０＋であるのに対し、ＳＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙｌ．ｌ＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆｌ／ＣＤ１５０＋、Ｍａｃ−１（ＣＤｌＩｂ）ｌｏである（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｂｕｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ（２００４））。これに加えて、ＳＴ−ＨＳＣは、ＬＴ−ＨＳＣよりも穏やかさに劣り（すなわち活動性がより高い）、増殖性がより高い。ＬＴ−ＨＳＣが無制限の自己再生を有する（すなわちそれらは成人期全体を通じて生存する）のに対し、ＳＴ−ＨＳＣは限定的な自己再生を有する（すなわちそれらは限定期間のみ生存する）。これらのＨＳＣのいずれかを、本明細書に記載される方法のいずれかで有利に使用し得る。
ＨＳＣは、任意選択的に血液製剤から得られる。血液製剤は、造血性起源の細胞を含有する、身体または身体器官から得られる生成物を含む。このような供給源としては、未分画骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸線、リンパ、および脾臓が挙げられる。前述の粗製または未分画血液製剤は全て、造血幹細胞の特徴を有する細胞をいくつかの方法で濃縮し得る。例えばそれらが発現する細胞表面分子について、より成熟し分化した細胞が選択される。任意選択的に、血液製剤は、ＣＤ３４＋細胞を選択することで分画される。ＣＤ３４＋細胞は、自己再生できる多能性の細胞亜集団を含む。このような選択は、例えば市販される磁性抗ＣＤ３４ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を使用して達成される。未分画血液製剤は任意選択的に、供与者から直接取得され、または冷凍保存から回収される。
ＨＳＣ増幅の供給源としては、大動脈・性腺・中腎（ＡＧＭ）由来細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もまた挙げられる。ＥＳＣは、当該技術分野で周知であり、商業的または学術的供給元から得られ得る。（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２８２Ｓｃｉ．１１４５−４７（１９９８））。ｉＰＳＣは、特定遺伝子の「強制」発現を誘発することで、典型的には成人体細胞である非多能性細胞から人工的に誘導される、多能性幹細胞の一種である（Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｐ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｄｅｃ．６，２００７）；Ｖｏｇｅｌ ＆ Ｈｏｌｄｅｎ，２３ Ｓｃｉ．１２２４−２５（２００７））。ＥＳＣ、ＡＧＭ、およびｉＰＳＣは、動物またはヒト起源に由来し得る。ＡＧＭ幹細胞は大動脈の内側で生じて、胎児肝臓にコロニー形成する細胞である。
本明細書の用法では、造血始原細胞は、造血系の１つまたは複数の成熟細胞型に分化できるが、長期の自己再生はできない。したがって造血始原細胞は、３〜４ヶ月にわたり再生して造血を維持し得て（Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、個人への造血始原細胞移植の直後における回復に重要である。移植に有用な造血始原細胞は、例えば骨髄、末梢血、および臍帯血をはじめとする多様な起源から得られ得る。
骨髄は、針で骨を穿刺して、骨髄細胞をシリンジで取り出すことで得られ得る（本明細書で「骨髄穿刺液」と称される）。造血始原細胞は、移植に先だって、造血始原細胞に対して特異的な表面マーカを使用して骨髄穿刺液から単離され得て、代案としては、骨髄全体を本明細書に記載される方法で処置される個人に移植し得る。
造血始原細胞はまた、始原細胞供与者の末梢血から得られる。末梢血からの細胞採取に先だって、供与者を顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカインで処置して、骨髄から血液区画への細胞遊走を促進し得る。細胞は静脈内管を通じて採取され、移植のために白血球細胞を濾過して単離し得る。得られた白血球細胞集団（すなわち幹細胞、始原細胞、および様々な成熟度の白血球細胞の混合物）は、異成分からなる混合物として移植し得て、または当業者に知られている細胞表面マーカを使用して、造血始原細胞をさらに単離し得る。
造血始原細胞および／または異成分造血始原細胞集団はまた、ヒト臍帯および／または胎盤血からも単離し得る。
ＭＨＣ集団は、骨髄採取を意図する大型針を利用した、大きな骨量からの、供与者の骨髄からの幹細胞の除去をはじめとする、当業者に公知の技術を用いて、供与者から取り出された生検から得られ得る。代案としては、供与者の末梢血が無菌針を通じて抜き取られ、白血球細胞を除去して赤血球を供与者に戻す装置を通過させる処理である、アフェレーシス療法によって、ＭＨＣを採取し得る。末梢幹細胞収量は、顆粒球コロニー刺激因子を毎日皮下注射することで増大させ得る。ＭＨＣは、好ましくはヒト供与者から得られる；しかし非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、およびイヌをはじめとする、非ヒト供与者もまた検討される。ＭＨＣの精製集団は、当業者に知られている、および／またはその内容全体を参照によって援用する、米国特許第５，６７７，１３６号明細書；および米国特許公開第２００６／００４０３８９号明細書に記載されるような、様々な方法を利用して得られ得る。
本明細書に記載される一実施形態では、ＭＨＣは、移植に先だって単離される。造血細胞サンプル（例えば臍帯血、末梢血、骨髄）は、特異的細胞表面タンパク質または受容体、細胞表面タンパク質マーカ、またはその他のマーカの発現を検出することで、例えばＭＨＣを最初に精製して単離し、人工的に高濃度にし得る。高純度ＭＨＣおよびＨＳＣは、高用量化学療法後の患者への自己移植などの多様な応用において、臨床的にますます使用されるようになっている。この状況では、免疫エフェクター細胞（リンパ球など）またはがん細胞による汚染を最小化するように、ＭＨＣまたはＨＳＣを最大純度で単離することが有利である。マウス研究では、これまでに報告された中で最大のＨＳＣ活性の濃縮は、Ｔｈｙ−１．１ｌｏＳｃａ−１＋系統−Ｍａｃ−１−ＣＤ４−ｃ−ｋｉｔ＋細胞の単離に使用されるようなマーカの組み合わせを記載し、静脈内注入された５個の細胞あたり約１個が骨髄に誘導されて生着できる。このような結果は、例えばＵｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）に記載される。
幹細胞、ならびに好中球や赤血球や血小板などになることが運命付けられている始原細胞は、これらの細胞表面に存在するＣＤ３４などの特定の始原マーカ抗原の存在または不在によって、および／または形態学的特性によって、大部分のその他の細胞と区別され得る。高度に濃縮されたヒト幹細胞画分の表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−ｌ＋、およびｌｉｎ−と報告されるが、本明細書に記載される本技術は、この幹細胞集団の増幅に限定されないものと理解される。
ＣＤ３４＋濃縮ヒト幹細胞画分は、ＣＤ３４などの表面抗原に対する抗体を使用した、アフィニティカラムまたはビーズ、磁性ビーズまたはフローサイトメトリーをはじめとする、いくつかの報告された方法によって分離し得る。さらに向流水簸などの物理的分離法を使用して、造血始原細胞を濃縮し得る。ＣＤ３４＋始原細胞は異成分からなり、異なる系統に付随する細胞表面関連分子の同時発現の存在または不在によって特徴付けられる、いくつかの亜集団に分類され得る。最も未熟な始原細胞は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ３８などのいかなる既知の系統関連マーカも発現しないが、それらはＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発現し得る。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲまたはｃ−ｋｉｔなどのその他の表面抗原もまた、造血始原細胞を選択的に単離するのに使用され得る。分離された細胞は、培養フラスコ、無菌バッグまたは中空繊維内の選択された培地中で培養し得る。細胞を選択的に増殖させるために、様々な造血増殖因子を利用し得る。骨髄の生体外増幅のために利用されている代表的な因子としては、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３リガンドまたはそれらの組み合わせが挙げられる。幹細胞の増殖は、培養に先だって、およびそれに引き続いて、標準的な技術（例えば血球計算板、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ）によって、またはフローサイトメトリーによって、幹細胞およびその他の細胞数を数えることでモニターし得る。
既知であるかまたは未知であるかに関わりなく、表面タンパク質を同定するのに適したあらゆる方法を用いて、例えば臍帯血などの均質集団から造血幹細胞を単離し得る。例えば本明細書に記載される方法で使用されるＭＨＣは、蛍光活性化細胞分類分析（ＦＡＣＳ）を使用して同定し得て、それは典型的に、蛍光色素と共役結合する抗体を使用して、造血組織の不均一（または均一）細胞調製品内の個々の細胞上の所与の表面タンパク質の発現レベルを、直接または間接的に評価する。
ＭＨＣは、特定の表面タンパク質の発現または発現欠如に従って、細胞が直接または間接的に区別される、あらゆる以前開発された、またはなおも未開発の技術を使用して、造血組織の細胞調製品内のその他の細胞から、物理的に分離し得る。造血細胞調製品内の不均一な細胞集団内から、特定細胞を物理的に分離するのに使用される一般的方法としては、様々な程度の複雑度および／または検出規格を有し得る血球計数器を使用するフローサイトメトリーと、抗体またはタンパク質被覆ビーズを使用する磁気分離と、特定タンパク質または特定タイプのタンパク質の発現または発現欠如に従って、細胞が基材上に保持されるアフィニティクロマトグラフィーまたは固体支持体アフィニティ分離とが挙げられるが、これに限定されるものではない。このような分離技術は、必ずしもそうである必要はないが、ＭＨＣまたはＭＨＣ濃縮集団を完全に、またはほぼ完全に、精製し得る（例えば９９．９％が完璧に分離される）。
増幅のための幹細胞は、例えば対象の骨髄サンプルからまたは培養物から採取される。ＭＨＣの採取は、細胞の除去または分離として定義される。これは、酵素的、非酵素的、遠心分離、電気的、またはサイズベースの方法、または好ましくは、培養液（例えばその中で細胞が培養された培地）または緩衝液を使用した細胞の洗浄などのいくつかの方法のいずれかを使用して、達成される。細胞は、任意選択的に採取、分離され、さらに増幅されて、より多数のＭＨＣおよび分化した子孫の集団が作り出される。
一般に、本明細書に記載される細胞は、入手可能であり、当該技術分野で周知の培養液中で維持して増殖させ得る。このような培地としては、ダルベッコ改変イーグル、Ｆ−１２Ｋ（登録商標）、イーグル最少必須培地（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地（登録商標）、および無血清（登録商標）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（登録商標）、イスコフ改変ダルベッコ培地（登録商標）が挙げられるが、これに限定されるものではない。造血細胞の培養および増幅のための多数の培地もまた、ピルビン酸ナトリウム含有または非含有の低グルコース配合物として入手できる。
本明細書では、細胞培養液への哺乳類血清の補給もまた検討される。血清は、生存および増幅に必要な細胞因子および成分を含有することが多い。血清の例としては、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替物およびウシ胚液が挙げられる。血清は、補体カスケードの成分を不活性化することが必要と見なされれば、５５〜６５℃で熱不活性化し得るものと理解される。
追加的な補給剤もまた使用して、最適な成長および増幅のために、細胞に必要な微量成分を有利に供給し得る。このような補給剤としては、例えばインスリン、トランスフェリン、ナトリウムセレン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの成分は、（ＨＢＳＳ）、アール塩（登録商標）、ハンク平衡塩類溶液、抗酸化剤補給剤、ＭＣＤＢ−２０１（登録商標）生理食塩水（ＰＢＳ）をはじめとするが、これに限定されるものではない塩溶液、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸−２−リン酸、ならびに追加的なアミノ酸に含まれ得る。多数の細胞培養液は、アミノ酸を既に含有するが、細胞を培養するのに先だって、補給を要するものもある。このようなアミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの補給剤の適切な濃度を判定することは、十分に当業者の技術範囲内である。
Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、．β．−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、およびＬ−サイロニンをはじめとするが、これに限定されるものではないホルモンもまた、本明細書に記載される細胞培養物で有利に使用され得る。
細胞タイプおよび分化細胞の運命に応じて、細胞培養液を補給するために、脂質および脂質担体もまた使用し得る。このような脂質および担体としては、特に、コレステロール、アルブミン共役リノール酸、シクロデキストリン、アルブミン共役リノール酸−オレイン酸、非結合リノール酸、アルブミン共役リノレン酸−オレイン酸−アラキドン酸、および非結合オレイン酸およびアルブミン共役オレイン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書に記載される方法では、支持細胞層の使用もまた検討される。支持細胞は、幹細胞などの偏好性の培養細胞の増殖を支持するのに使用される。支持細胞は、活性代謝はなおも可能であるが、細胞分裂を抑制するためにγ−照射されている正常細胞である。培養中では、支持細胞層は、その他の細胞のための基底不活性化層の役割を果し、それら自身のさらなる増殖または分裂なしに、細胞因子を供給する（Ｌｉｍ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｂｏｄｎａｒ，Ａ．，２００２）。典型的な支持細胞層細胞の例としては、ヒト二倍体肺細胞、マウス胚線維芽細胞、およびＳｗｉｓｓマウス胚線維芽細胞が挙げられるが、ＭＨＣの最適な成長、生存、および増幅を可能にするのに有利な細胞成分および因子を供給できる、あらゆる有糸分裂後細胞であり得る。白血病阻害因子（ＬＩＦ）は抗分化特性を有するため、多くの場合、ＭＨＣを未分化増殖状態に維持するのに、支持細胞層は必要ない。したがってＬＩＦの補給を使用して、細胞を未分化状態に維持し得る。
細胞は、低血清または無血清培地中で培養し得る。細胞を培養するのに使用される無血清培地は、例えば米国特許第７，０１５，０３７号明細書に記載される。多数の細胞が、無血清または低血清培地中で培養されている。例えば培地には、１つまたは複数の増殖因子を添加し得る。一般に使用される増殖因子としては、骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子および表皮増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３リガンドおよび１’−３が挙げられるが、これに限定されるものではない。無血清培地中での細胞培養の教示については、例えば全て参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，１６９，６１０号明細書；米国特許第７，１０９，０３２号明細書；米国特許第７，０３７，７２１号明細書；米国特許第６，６１７，１６１号明細書；米国特許第６，６１７，１５９号明細書；米国特許第６，３７２，２１０号明細書；米国特許第６，２２４，８６０号明細書；米国特許第６，０３７，１７４号明細書；米国特許第５，９０８，７８２号明細書；米国特許第５，７６６，９５１号明細書；米国特許第５，３９７，７０６号明細書；および米国特許第４，６５７，８６６号明細書を参照されたい。
培養中の細胞は、懸濁状態で、または細胞外基質要素などの固体支持体に付着させた状態で、維持し得る。幹細胞は、それらの固体支持体への付着を促進する、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」およびフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ−Ｄおよびポリ−Ｌ−リジン、トロンボスポンジンおよびビトロネクチンなどの追加的な因子を要求することが多い。ＭＨＣはまた、Ｃｏｒｎｉｎｇ低付着性プレートなどであるが、これに限定されるものではない、低付着性フラスコ内で培養し得る。
一実施形態では、造血幹および／または始原細胞は、造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）集団を、本明細書に記載される少なくとも１つのｉＲＮＡを含んでなる組成物に接触させることで、それを必要とする個人への移植に先だって、生体外で処理される。接触は、造血細胞のための適切な細胞培養培地に、ｉＲＮＡを含んでなる組成物を直接添加することで、生体外で実施し得る。ｉＲＮＡの有効濃度は、例えば連続希釈を実施して、ゼブラフィッシュ競合移植モデル中で、またはその他の適切なシステム中で、効力を試験することで、当業者によって判定され得る。造血幹細胞および／または始原細胞を処理するための濃度範囲の例としては、約１ナノモル〜約１０ミリモル濃度；約１ｍＭ〜約５ｍＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ；約５００ｎＭ〜約１，０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１，０００ｎＭ；約１μＭ〜約１，０００μＭ；１μＭ〜約５００μＭ；約１μＭ〜約１００μＭ；約１μＭ〜約１０μＭが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、範囲は５μＭ〜約５００μＭである。
細胞は、様々な時間にわたって処理し得る。適切な時間は、当業者によって判定され得る。例えば細胞は、例えば５分間、１０分間、１５分間、３０分間など数分間にわたり、または例えば１時間、２時間、３時間、４時間、最高２４時間など数時間にわたり、または数日間にさえわたって処理し得る。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される少なくとも１つのｉＲＮＡを含んでなる組成物を含まない培地に変更する前に、２時間にわたって処理される。
ひとたび培養が確立したら、ＭＨＣまたは始原細胞数を向上させるために本明細書に記載されるように処理された細胞、および／または未処理細胞は、新鮮に使用され、または例えば４０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを添加したＤＭＥＭを使用して、冷凍して冷凍保存株として保存され得る。培養細胞のための冷凍保存株を作成するその他の方法もまた、当業者には利用可能である。
これに加えて、本明細書に記載される方法を通じて増殖されたＭＨＣの採取から得られる細胞を、幹細胞冷凍保存の当該技術分野で公知の技術を使用して、冷凍保存し得る。したがって冷凍保存を使用して、ひとたび対象がＭＨＣ移植を必要とすると判定されたら、ＭＨＣを解凍して対象に移植し得るように、細胞を維持し得る。
より具体的には、本明細書に記載される技術の実施形態は、臍帯血または同等の新生児または胎児幹細胞源から採取されたＭＨＣの向上を提供し、それは解凍時のこのような幹細胞の治療用途のために、冷凍保存され得る。このような血液は、当該技術分野で公知のいくつかの方法によって採取し得る。例えば臍帯血はＭＨＣの豊富な供給源であるので（Ｎａｋａｈａｔａ ＆ Ｏｇａｗａ，７０ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３２４−２８（１９８２）；Ｐｒｉｎｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，６７ Ａｃｔａ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ．４１３−１６（１９７８）；Ｔｃｈｅｒｎｉａ ｅｔ ａｌ．，９７（３）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．３２２−３１（１９８１）を参照されたい）、新生児血液の優れた供給源は、臍帯および胎盤である。冷凍保存に先だって、新生児血液は、臍帯からの直接排液によって、および／または根本および拡張した静脈における分娩胎盤の穿刺吸引によって、得られ得る。例えば米国特許第７，１６０，７１４号明細書；米国特許第５，１１４，６７２号明細書；米国特許第５，００４，６８１号明細書；米国特許出願第１０／０７６１８０号明細書（出願公開第２００３００３２１７９号明細書）を参照されたい。確かに、臍帯血幹細胞は、悪性および非悪性疾患がある小児において、骨髄破壊的用量の放射線化学療法による処置後に、造血を再生するために使用されている。Ｓｉｒｃｈｉａ ＆ Ｒｅｂｕｌｌａ，８４ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ７３８−４７（１９９９）。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ２７ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１−６（２００１）；米国特許第６，８５２，５３４号明細書もまた参照されたい。さらに臍帯血中の幹細胞および始原細胞は、培養中で、成人骨髄中のものよりも、より大きな増殖能力を有するようであることが報告されている。Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，５８ Ｂｌｏｏｄ ９３１−３８（１９８１）；Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，５７ Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６１−７０（１９８４）。
代案としては、胎児血液は、超音波によって誘導される針の使用（Ｄａｆｆｏｓ ｅｔ ａｌ．，１５３ Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．６５５−６０（１９８５）；Ｄａｆｆｏｓ ｅｔ ａｌ．，１４６ Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．９８５−８７（１９８３）、胎盤穿刺によって（Ｖａｌｅｎｔｉ，１１５ Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．８５１−５３（１９７３）；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．８１−８７（１９８２））、胎児鏡検査によって（Ｒｏｄｅｃｋ，ｉｎ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，（Ｒｏｄｅｃｋ ＆ Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ＆ Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８４））、胎盤根で胎児循環から採取して、冷凍保存し得る。確かに、臍帯血および胎盤に加えて、絨毛膜絨毛および羊水が、多能性胎児幹細胞の供給源である（国際公開第２００３０４２４０５号パンフレットを参照されたい）。
臍帯血を採取し、処理して、保存するための様々なキットおよび採取装置が知られている。例えば米国特許第７，１４７，６２６号明細書；米国特許第７，１３１，９５８号明細書を参照されたい。採取は無菌条件下で行われるべきであり、血液は抗凝固剤で処理し得る。このような抗凝固剤としては、例えばクエン酸−リン酸−デキストロース、酸性クエン酸−デキストロース、アルセバー液（Ａｌｓｅｖｅｒ ＆ Ａｉｎｓｌｉｅ，４１ Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．１２６−３５（１９４１）、ＤｅＧｏｗｉｎ液（ＤｅＧｏｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１１４ ＪＡＭＡ ８５０−５５（１９４０））、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ−Ｍｇ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，３８ Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５７３−８５（１９５９））、Ｒｏｕｓ−Ｔｕｒｎｅｒ液（Ｒｏｕｓ ＆ Ｔｕｒｎｅｒ，２３Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１９−３７（１９１６））、その他のグルコース混合物、ヘパリン、またはビスクマ酢酸エチルが挙げられる。Ｈｕｒｎ，Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ２６−１６０（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９６８）を参照されたい。
様々な手順が当該技術分野で公知であり、または本明細書に記載され、採取臍帯血のＭＨＣを濃縮するために使用され得る。これらとしては、単独でまた組み合わせで使用される、平衡密度遠心分離、単位重力での速度沈降、免疫ロゼット形成および免疫粘着、向流遠心水簸、Ｔリンパ球枯渇、および蛍光活性化細胞選別が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば米国特許第５，００４，６８１号明細書を参照されたい。
典型的に、採取血液は、ＤＭＳＯ；（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ＆ Ｂｉｓｈｏｐ，１８３ Ｎａｔｕｒｅ １３９４−９５（１９５９）；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ １９０ Ｎａｔｕｒｅ １２０４−０５（１９６１））、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）（Ｒｉｎｆｒｅｔ，８５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５７６−９４（１９６０））、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ＆ Ｒａｖｄｉｎ，１９６ Ｎａｔｕｒｅ ８９９−９００（１９６２））、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール（Ｒｏｗｅ，３（１）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １２−１８（１９６６））、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−乳糖、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１５Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２０−２４（１９６０））、アミノ酸（Ｐｈａｎ ＆ Ｂｅｎｄｅｒ，２０ Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．６５１−５４（１９６０））、メタノール、アセトアミド、グリセリン一酢酸エステル（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，５６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６５−７０（１９５４））、および無機塩（Ｐｈａｎ ＆ Ｂｅｎｄｅｒ，１０４ Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９６０））などの低温保護剤によって極低温保存のために準備される。（例えば２０％〜２５％濃度の）血漿の添加は、ＤＭＳＯの保護効果を増強し得る。
採取血液は、極低温保存のために制御速度で冷却すべきである。異なる低温保護剤および異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を有する。例えばＲａｐａｔｚ，５ Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １８−２５（１９６８），Ｒｏｗｅ ＆ Ｒｉｎｆｒｅｔ，２０ Ｂｌｏｏｄ ６３６−３７（１９６２）；Ｒｏｗｅ，３ Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １２−１８（１９６６）；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，７ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １７−３２（１９６７）；Ｍａｚｕｒ，１６８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９３９−４９（１９７０）を参照されたい。ＭＨＣ供給源の操作、冷凍保存、および長期保存の考察および手順は、当該技術分野で公知である。例えば米国特許４，１９９，０２２号明細書；米国特許第３，７５３，３５７号明細書；米国特許第４，５５９，２９８号明細書；米国特許第５，００４，６８１号明細書を参照されたい。血液保存のための関連プロトコルを伴う、様々な装置もある。米国特許第６，２２６，９９７号明細書；米国特許第７，１７９，６４３号明細書
ＭＨＣ供給源の解凍および再構成における考察もまた、当該技術分野で公知である。米国特許第７，１７９，６４３号明細書；米国特許第５，００４，６８１号明細書。ＭＨＣ供給源血液はまた、処理して、凝集を防止し（Ｓｐｉｔｚｅｒ，４５ Ｃａｎｃｅｒ ３０７５−８５（１９８０）；Ｓｔｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０ Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １７−２４（１９８３）を参照されたい）、低温保護剤の毒性を除去し得る（米国特許第５，００４，６８１号明細書）。さらにＭＨＣ移植単位の生着細胞用量を測定する、様々なアプローチがある。米国特許第６，８５２，５３４号明細書；Ｋｕｃｈｌｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｔｈｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８−１９（Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＆ Ｒｏｓｓ，Ｓｔｒｏｄｓｂｕｒｇ，ＰＡ，１９６４）；１０ Ｍｅｔｈｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３９−４７（Ｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄ．Ｐｕｂ．，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，１９６４）を参照されたい。
ＭＨＣ増幅の負の制御因子の非限定的例としては、Ｉｔｃｈ、ＳＨ２ＢＥ／Ｌｎｋ、Ａｈｒ、およびＰｒｏｘ１が挙げられる。これらについては、下述する。
Ｉｔｃｈ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８３７３７）は、１つの既知のｍＲＮＡ転写物（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿０３１４８３；配列番号１１）を有する、ＨＥＣＴファミリーに属するＥ３ユビキチンリガーゼである。Ｉｔｃｈは、Ｔ細胞ならびに造血の適切な機能のために、重要であることが示されている。Ｉｔｃｈは、ＨＳＣの発達および機能を負に調節する。
本明細書に記載されるＩｔｃｈ発現の阻害剤は、ＭＨＣ増幅に影響を及ぼし得る。
Ｓｈ２ｂ３（Ｌｎｋとしてもまた知られている；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１００１９）は、１つの既知のｍＲＮＡ転写物（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００５４７５；配列番号１）を有する、ＳＨ２−Ｂ／Ｓｈ２ｂ１およびＡＰＳ／Ｓｈ２ｂ２からなる細胞内アダプタータンパク質ファミリーのメンバーである。Ｓｈ２ｂ３は、主にリンパ球および造血前駆細胞中で発現されて、初期リンパ球造血を調節する。Ｓｈ２ｂ３欠損マウスは、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびトロンボポエチンをはじめとするサイトカインに対する過敏性に起因する、Ｂ細胞および巨核球の過剰産生を示す。Ｓｈ２ｂ３を過剰発現するリンパ系前駆体は、ＢおよびＴ細胞の減少をもたらした。
さらにＳｈ２ｂ３は、細胞接着によって制御される応答中で、およびインテグリンとサイトカイン媒介シグナル伝達間のクロストーク中で、機能する。Ｓｈ２ｂ３欠損マウスは、トロンボポエチンに応えて、血小板および巨核球を過剰産生した。Ｓｈ２ｂ３欠損マウスはまた、トロンボポエチンに応えたＥｒｋ１／２シグナル伝達増大も示す一方で、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、およびＡｋｔ応答は正常であった。Ｓｈ２ｂ３−欠損マウスはまた、ＶＣＡＭ−１によるシグナル伝達混乱に対して、非感受性でもあった。
本明細書に記載されるＳＨ２Ｂ３発現阻害剤は、ＭＨＣ増幅に影響を及ぼし得る。
ＰＲＯＸ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６２９；ＰＲＯＸ−１、ｐｒｏｓｐｅｒｏ関連ホメオボックス１、およびホメオドメインタンパク質とも称される）はホメオタンパク質であり、これは、細胞運命決定および体部プラン確立に欠くことのできない役割を果たすことが知られている、タンパク質クラスである。Ｐｒｏｘ−１は、１つのｍＲＮＡ転写物（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００２７６３；配列番号２）をコードすることが知られており、水晶体、心臓、脳、肺、腎臓、および肝臓をはじめとする、いくつかのヒト組織中で発現され、最高発現は水晶体中に見られる。遺伝子関連解析は、目の病態におけるＰＲＯＸ−１多形性の役割を示唆している。
ｐｒｏｘ−１の生物学的機能は、ｐｒｏｘ−１ヌルマウスを作成することで研究されている。これらの研究から、ｐｒｏｘ−１は肝臓の発達中の肝実質細胞の移動、水晶体およびリンパ系の発達に必要であるが、脈管系には必要でないことが判定され、生体内で血管からリンパ管を区別するマーカとして使用されている。（Ｓｏｓａ−Ｐｉｎｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２５，２５４−２５５；Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１，３１８−３２２．；Ｗｉｇｌｅ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｃｅｌｌ，１９９９，９８，７６９−７７８）。Ｐｒｏｘ−１機能はまた、細胞周期阻害物質ＣｄｋｎｌｂおよびＣｄｋｎｌｃの発現に必要である（Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１，３１８−３２２）。転写因子としてのｐｒｏｘ−１のいくつかのその他の機能が、記載されている。Ｐｒｏｘ−１は、目の発達に必須のヒト転写因子である、ＳＩＸ３プロモータを活性化する（Ｌｅｎｇｌｅｒ ａｎｄ Ｇｒａｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，２８７，３７２−３７６）。Ｐｒｏｘ−１は、神経始原細胞中におけるニューロンおよびグリアの分化を調節し（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，／．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．；２００１，２１，９８１４−９８２３）、ｐｒｏｘ−１はまた、多様なレンズ混濁をもたらす変異を有すると報告されている遺伝子である、Ｃｒｙｇｆプロモータを刺激する（Ｌｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，５１５−５２６）。
Ｐｒｏｘ１は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中における神経芽細胞の運命判定および光受容体の発達において重要な、分岐ホメオドメインタンパク質である、Ｐｒｏｓｐｅｒｏの脊椎動物相同体である。（Ｃ．Ｑ．Ｄｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）“Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｃｅｌｌ ｆａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ ６５：４５１−４６４；Ｂ．Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ｉｓ ａ ｐａｎｎｅｕｒａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０９９１−１０９９６；Ｔ．Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）“Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｌｏｒ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆａｔｅｓ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ”，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ４：８５３−８６４）。ヒトＰｒｏｘ１は、Ｎ末端核局在化シグナルと、３つの核内受容体ボックスと、核外搬出シグナルと、分岐ホメオドメインおよび新規Ｐｒｏｓｐｅｒｏドメインを含有する高度に保存されたＣ末端とを含有する、７３６個のアミノ酸のタンパク質である（Ｔ．Ｒ．Ｂｕｒｇｌｉｎ（１９９４）“Ａ Ｃａｅｈｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｍａｉｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：７０−７１；Ｓ．Ｉ．Ｔｏｍａｒｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｘ１ ｇｅｎｅ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４８：６８４−６８９；Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｐｒｏｓｐｅｒｏ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ（Ｐｒｏｘ１）ｉｓ ａ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ−１ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ７−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ”，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：２４２４−２４３９）。Ｐｒｏｘ１は、水晶体中繊維細胞で高度に発現され（Ｍ．Ｋ．Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｐｒｏｘ１ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｌｅｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１１２：１９５−１９８）、Ｐｒｏｘ１ヌルマウスは、水晶体繊維細胞伸長（Ｊ．Ｔ．Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｐｒｏｘ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓ−ｆｉｂｒｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ”，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：３１８−３２２）、およびレチナール水平細胞の分化（Ｍ．Ａ．Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）“Ｐｒｏｘ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｅｔｉｎａ”，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４：５３−５８）に欠陥がある。この文脈で、Ｐｒｏｘ１は転写因子として機能し、ニワトリβＢ１−およびマウスγＦ−クリスタリンプロモータの双方をトランス活性化することが示されている（Ｊ．Ｌｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ３ ａｎｄ ｐｒｏｘ１ ａｔ ｔｈｅ ｇａｍｍａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：５１５−５２６；Ｗ．Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｍａｆｓ，Ｐｒｏｘ１ ａｎｄ Ｐａｘ６ ｃａｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ Ｂ１−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１１０８８−１１０９５）。
Ｐｒｏｘ１は目の発達に重要でありながら、ほとんどの遺伝的背景において、異型接合Ｐｒｏｘ１ヌルウスは誕生後間もなく死亡する一方、同型接合Ｐｒｏｘ１ヌルは１４．５ｄｐｃに死亡するので、このタンパク質の正確な用量は胎芽形成に必須である（Ｊ．Ｔ．Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｐｒｏｘ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓ−ｆｉｂｒｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ”，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：３１８−３２２；Ｊ．Ｔ．Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｐｒｏｘ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ ９８：７６９−７７８）。これらの動物の分析は、Ｐｒｏｘ１が、正常な肝臓発達に必要である、肝芽から周囲の間葉への肝実質細胞の層剥離に必須であることを示した（Ｂ．Ｓｏｓａ−Ｐｉｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２０００）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｐｒｏｘ１”，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：２５４−２５５）。発現研究は、Ｐｒｏｘ１が、肝臓／膵臓に運命づけられた腹側前腸内胚葉の最初期の分子マーカの１つであることを示した。（Ｚ．Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｐｒｏｘ１ ｉｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ”，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１１８：１４７−１５５）。Ｐｒｏｘ１発現は、発達全体を通じて、肝芽細胞および肝実質細胞中で維持され、形質転換肝腫瘍細胞系内で高度に上方制御される（Ｊ．Ｄｕｄａｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｔｈｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｘ１ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，ｂｕｔ ｉｓ ａｂｓｅｎｔ ｆｒｏｍ ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”，Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．（Ｂｅｒｌ）２０８：３５９−３６６）。Ｐｒｏｘ１は、胆汁酸合成に重要な酵素の発現に必須の転写因子である肝臓受容体相同体−１（ＬＲＨ−１）と相互作用して、ＬＲＨ−１のＤＮＡへの結合を損なうことで、その転写活性を抑制する（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｐｒｏｓｐｅｒｏ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ（Ｐｒｏｘ１） ｉｓ ａ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ−１ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ７−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ”，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：２４２４−２４３９）。
Ｐｒｏｘ１はまた、リンパ系の形成における中心的存在である（Ｙ．Ｋ．Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｐｒｏｘ１ ｉｓ ａ ｍａｓｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ”，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２５：３５１−３５７）。静脈内皮細胞の亜集団中におけるＰｒｏｘ１の発現は、リンパ脈管新生が開始され、細胞がリンパ管表現型に偏ったことの最初の徴候の１つである（Ｊ．Ｔ．Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｘ１ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ”，Ｅｍｂｏ．Ｊ ２１：１５０５−１５１３）。Ｐｒｏｘ１ヌルマウスでは、一次血管網からの内皮出芽停止のために、リンパ管が発達しない（Ｊ．Ｔ．Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｐｒｏｘ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ ９８：７６９−７７８）。Ｐｒｏｘ１の過剰発現は、血管内皮細胞をリンパ管内皮細胞に再プログラムし得て、リンパ管の特異化におけるＰｒｏｘ１の中心的役割が確認される（Ｔ．Ｖ．Ｐｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｒｏｘ−１ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ”，Ｅｍｂｏ Ｊ．２１：４５９３−４５９９）。健康なヒト成人、およびリンパ浮腫患者からのリンパ組織のＰｒｏｘ１ポリクローナル抗体による免疫染色法は、Ｐｒｏｘ１が、正常および病的ヒト組織中のリンパ管内皮細胞に対する、信頼できる高度に特異的なマーカであることを示した（Ｊ．Ｗｉｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｘ１ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｆａｓｅｂ Ｊ．１６：１２７１−１２７３；Ｊ．Ｓ．Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）“Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ：ｗｈａｔ ｄｏ ｗｅ ｋｎｏｗ？”，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６０：１７１−１８０；Ｉ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｖｅｒｓｕｓ ｎｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７９６５−７９７１；Ｍ．Ａ．Ａｌ−Ｒａｗｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ”，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０：２８３−２９８）。
本明細書に記載されるＰＲＯＸ１発現阻害剤は、ＭＨＣ増幅に影響を及ぼし得る。
ＡＨＲ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１９６；アリール炭化水素受容体）は、リガンド結合後核に移行する、細胞質リガンド活性化転写因子である。Ａｈｒは、ｍＲＮＡ転写変異体に転写されることが知られている（ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１６２１；配列番号３）。ＡＨＲの阻害は、ＨＳＣ集団（米国特許公開第２００７／００４８３１３号明細書）を増殖し得る一方で、ＡＨＲリガンドは、皮膚科または美容の薬剤として開示されている（米国特許公開第２０１０／０３２４１０９号明細書）。ＡＨＲは、動物において、場合によりヒトにおいて、多数の毒性および発がん効果を媒介することが知られている（Ｓａｆｅ Ｓ ２００１ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ １２０：１−７）。そのリガンドによるＡＨＲ活性化の結果として、チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、およびＣＹＰ２Ｓ１などのＩ相異物代謝酵素と、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼＵＧＴ１Ａ６、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯｌ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ３Ａ１、およびいくつかのグルタチオン−５−トランスフェラーゼなどのＩＩ相酵素とをコードするものをはじめとする、多数の解毒作用遺伝子が転写的に誘導される。
ＡＨＲのリガンドとしては、工業プロセスの副産物である環境有害物質、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）（Ｐｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９７６，２５１，４９３６−４９４６）；タバコの煙やスモッグに見られる多環式（ｐｏｌｙｃｙｌｉｃ）芳香族炭化水素（Ｒｅｉｓｚ−Ｐｏｒｓｚａｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９４，１４，６０７５−６０８６）；およびいくつかの調理肉に見られる複素環アミン（Ｒｅｉｓｚ−Ｐｏｒｓｚａｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９４，１４，６０７５６０８６）が挙げられる。リガンド結合および核転座の後、ＡＨＲはＨＩＦｌ−βと共に二量体を形成し、チトクロームＰ４５０、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰｌＢｌなどの薬剤代謝に関与するいくつかの遺伝子の活性化がもたらされる。ＡＨＲ／ＨＩＦｌ−β二量体は、ダイオキシン応答要素（ＤＲＥ）によって調節される、一連のその他の遺伝子を活性化でき、ＡＨＲリガンドの多くに関連する、免疫毒性、発達および生殖毒性、内分泌経路の破壊、消耗症候群、および腫瘍促進などの毒性および発がん効果のいくつかがもたらされる（Ｓａｆｅ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ，２００１，１２０，１−７）。Ｏｈｔａｋｅ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｏｈｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３，５４５−５５０）は、ＡＨＲ／ＨＩＦｌ−βヘテロ二量体が、エストロゲン受容体ＥＲ−αおよびＥＲ−βと直接結びつくことを実証した。彼らは、この結合が、リガンド非結合エストロゲン受容体と活性化補助因子ｐ３００を、エストロゲン応答遺伝子プロモータに動員して、転写およびエストロゲン様作用の活性化をもたらし、ダイオキシン型環境汚染物質の有害なエストロゲン関連作用を引き起こすことを示した。
本明細書に記載されるＡｈｒ発現阻害剤は、ＭＨＣ増幅に影響を及ぼし得る。
本明細書に記載されるのは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子または遺伝子群の発現を阻害する、ｉＲＮＡ剤である。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えばＵＣＢから得られるヒトＭＨＣ集団中の細胞などの細胞または哺乳類中において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、ｄｓＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有する、アンチセンス鎖を含み、相補性領域は、３０ヌクレオチド以下の長さ、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を発現する細胞との接触、またはその中への導入時に、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法、または免疫測定法またはウエスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する。ＭＨＣなどの細胞培養物中、または対象からの生物学的サンプル中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子の発現は、ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイなどによる、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベル測定によって、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用した、免疫蛍光分析などによるタンパク質レベル測定によって、アッセイし得る。
ｄｓＲＮＡは２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下で相補的であって、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡ配列に由来し得る。他の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般に二本鎖構造は、１５〜３０、より一般的には１８〜２５、なおもより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対の長さである。同様に、標的配列との相補性領域は、１５〜３０、より一般的には１８〜２５、なおもより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５〜２０ヌクレオチド長であり、別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２５〜３０ヌクレオチド長である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質として十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。９塩基対程度に短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡは、状況によっては、ＲＮＡｉ指向ＲＮＡ切断を媒介し得る。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長である。
当業者はまた、二本鎖領域が、例えば１５〜３０塩基対など、例えば９〜３６塩基対の二本鎖領域などのｄｓＲＮＡの主要機能部分であることを認識するであろう。したがって一実施形態では、それがプロセッシングされて、例えば所望のＲＮＡを切断標的とする１５〜３０塩基対などの機能的二本鎖になる限りでは、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがその場合ｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡ切断によって、標的細胞中で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。ｄｓＲＮＡは、例えばバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ），アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）から市販されるものなどの自動化ＤＮＡ合成機の使用によって、以下でさらに考察されるように、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。一実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子は、ヒト遺伝子である。別の実施形態では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子は、マウスまたはラット遺伝子である。特定の実施形態では、第１の配列は、表２〜７のうちの１つからのセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、表２〜７の１つのアンチセンス配列からなる群から選択される。表２〜７に提供される標的配列中の他の箇所を標的にする代案のｄｓＲＮＡ剤は、標的配列と側面に位置する配列とを使用して、容易に判定し得る。
一態様では、ｄｓＲＮＡは、センスおよびアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖は表２〜７に提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は表２〜７から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方と相補的であり、配列の１つは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡ配列と、実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表２〜７でセンス鎖と記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表２〜７からのセンス鎖に対応するアンチセンス鎖と記載される。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
当業者は、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発する上で特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（エルバシャー（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら著、欧州分子生物学機構（ＥＭＢＯ）、２００１年、第２０巻、ｐ．６８７７〜６８８８）。 しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造が、同様に効果的であり得ることを見出している。上で説明した実施形態では、配列識別子によって識別される、表２〜７に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のおかげで、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低２１ｎｔ長さの少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または双方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表２〜７の配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表２〜７の配列の１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続ヌクレオチドの部分配列を有して、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する能力が、完全長配列を含んでなるｄｓＲＮＡからの阻害と、５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下異なるｄｓＲＮＡが、本明細書に記載される技術に従って検討される。
これに加えて、表２〜７に提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高い、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする転写物中の部位を特定する。したがって本明細書に記載される技術は、このような配列の１つ内を標的にするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定の部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた追加的なヌクレオチド配列と連結している、表２〜７に提供される配列の１つからの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを一般に含む。
標的配列は、一般に１５〜３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば配列識別子によって表２〜７中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、作成されたこれらおよび配列を試験することにより、例えば配列識別子によって表２〜７８中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子領域と相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤のＲＮＡ鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの効力の検討は、特にＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子中の特定相補性領域が、集団内で多型配列多様性を有することが知られている場合に重要である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４ヌクレオチドの、一般に１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有する、このようなｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有する。さらに別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本明細書に記載される技術で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で十分確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。修飾としては、例えば（ａ）例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）および３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；（ｂ）例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；（Ｃ）糖の修飾（例えば２’位または４’位における）または糖の置換；ならびに（ｄ）リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。特定の実施形態では、修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’−５’結合、それらの２’−５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェート）が挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７〜１５００にある。
本明細書に記載される技術で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡと、ヘテロ原子主鎖および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然リン酸ジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖があるオリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルとすることができる。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた知られている）（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ．４８６〜５０４）、すなわちアルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、およびこれもまた以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
その他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行うことができる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用し、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、具体的には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、「生化学、バイオテクノロジー、および医学における修飾ヌクレオシド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ヘルデヴィン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ），Ｐ．編、ウィリーＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年で開示されるもの；「高分子科学と工学のコンサイス百科事典（Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、ｐ．８５８〜８５９、クルシュヴィッツ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ），Ｊ．Ｌ編、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０年で開示されるもの、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら著、アンゲヴァンテ ケミー（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ），国際版（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、１９９１年、第３０巻、ｐ．６１３によって開示されるもの、およびサングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ Ｓ．著、第１５章、「ｄｓＲＮＡの研究および応用（ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ｐ．２８９〜３０２、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびルブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本明細書に記載される技術で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに、特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンをはじめとする、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（サングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ．Ｓ．著、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびルブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、「ｄｓＲＮＡの研究および応用（ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、１９９３年、ｐ．２７６〜２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびにそのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書、およびこれもまた参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，７５０，６９２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むように修飾され得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含んでなる。この構造は、リボースを３’−エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（エルメン（Ｅｌｍｅｎ），Ｊ．ら著、２００５年、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３３巻、第１号、ｐ．４３９〜４４７；モーク（Ｍｏｏｋ），ＯＲ．ら著、２００７年、モレキュラーキャンサーセラピューティックス（Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ）、第６巻、第３号、ｐ．８３３〜８４３；グルンベラー（Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ），Ａ．ら著、２００３年、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３１巻、第１２号、ｐ．３１８５〜３１９３）。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない：そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；および米国特許第７，３９９，８４５号明細書。
本明細書に記載される技術で取り上げるｉＲＮＡの別のＲＮＡ修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを向上させるリガンド、部分または抱合体の１つまたは複数を、ＲＮＡに化学的に連結させることを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（レッツンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要、１９８９年、第８６巻、ｐ．６５５３〜６５５６）などの脂質部分；コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック メディカルケミストリー レターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９４年、第４巻、ｐ．１０５３〜１０６０）；例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、ニューヨークアカデミーオブサイエンス紀要（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９２年、第６６０巻、ｐ．３０６〜３０９；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック メディカルケミストリー レターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９３年、第３巻、ｐ．２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（オーバーハウザー（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９２年、第２０巻、ｐ．５３３〜５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（セゾン−ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら著、欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）、１９９１年、第１０巻、ｐ．１１１１〜１１１８；カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９９０年、第２５９巻、ｐ．３２７〜３３０；スビナルチャク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら著、ビオシミ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、１９９３年、第７５巻、ｐ．４９〜５４）などの脂肪族鎖；例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１〜３６５４；シア（Ｓｈｅａ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９０年、第１８巻、ｐ．３７７７〜３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、ヌクレオシド＆ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９５年、第１４巻、ｐ．９６９〜９７３）；またはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１〜３６５４）；パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら著、ビオキミカ ビオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第１２６４巻、ｐ．２２９〜２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら著、ジャーナル オブ ファーマコロジ エクスペリメンタル セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９６年、第２７７巻、ｐ．９２３〜９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子とすることができる。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；またはＨＳＣなどの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含むことができる。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）調節因子の機能を果たす。本明細書の用法では、「ＰＫ調節因子」とは、薬物動態調節因子を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本明細書に記載の技術に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
ＲＮＡエフェクター分子は、宿主細胞中で標的遺伝子の発現レベルを低下できるリボヌクレオチド作用物質、または宿主細胞中で標的遺伝子の発現レベルを低下し得る分子を形成できる、リボヌクレオチド作用物質である。少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０ヌクレオチド長であるＲＮＡエフェクター分子の部分は、実質的に標的遺伝子と相補的である。相補領域は、標的遺伝子のコード領域、プロモータ領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、および／または５’−ＵＴＲであってもよい。好ましくはＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１６連続ヌクレオチドは標的配列と相補的である（例えばＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９個以上の連続ヌクレオチドは、標的配列と相補的である）。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用して、それらの選択的分解を媒介し、またはさもなければそれらの翻訳を妨げる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、Ｉｔｃｈの遺伝子（例えば配列番号２３）、ＳＨ２Ｂ３／Ｌｎｋの遺伝子（例えば配列番号２２）、Ａｈｒの遺伝子（例えば配列番号２１）、およびＰｒｏｘ１の遺伝子（例えば配列番号２０）からなる群から選択される。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用して、それらの選択的分解を媒介し、またはさもなければそれらの翻訳を妨げてもよい。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の配列は、配列番号１〜３、または８〜１２から選択される、ｍＲＮＡ転写物配列である。
ＲＮＡエフェクター分子は、単一ＲＮＡ鎖または２本以上のＲＮＡ鎖を含んでなり得る。ＲＮＡエフェクター分子の例としては、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、プロモータ指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、デコイＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、およびアプタマーが挙げられる。ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は二本鎖領域を有し得て、二本鎖ＲＮＡエフェクターは一本鎖領域を有し得る。好ましくはＲＮＡエフェクター分子は二本鎖ＲＮＡであり、その中でアンチセンス鎖は、標的遺伝子と実質的に相補的な配列を含んでなる。
例えばｄｓＲＮＡ（二本鎖リボ核酸）内などの、ＲＮＡエフェクター分子内の相補配列は、完全に相補的または実質的に相補的であってもよい。一般に最高３０塩基対までの二本鎖では、ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーションに際して、標的遺伝子の発現を調節する能力を保ちながら、５、４、３または２個以下のミスマッチ塩基対を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用してその切断を誘発する、一本鎖オリゴヌクレオチドを含んでなる。例えば一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、１つまたは複数のリン酸基またはそのアナログをはじめとする、５’修飾を含んでなり、エフェクター分子をヌクレアーゼ分解から保護する。ＲＮＡエフェクター分子は、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖、または例えばｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ前駆体のようなＲＮＡ配列など、標的遺伝子の「センス」核酸と相補的である、ヌクレオチド配列を有する一本鎖アンチセンス核酸であり得る。したがってアンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成し得る。
コード鎖配列（例えばｃＤＮＡ分子のセンス鎖配列）を前提として、アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対形成の法則に従ってデザインし得る。アンチセンス核酸は、例えばｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域など、例えば５’ＵＴＲなどのＲＮＡのコードまたは非コード領域と相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約１０〜２５ヌクレオチド長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば分子の生物学的安定性、および／またはアンチセンスと標的核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるようにデザインされた、ホスホロチオエート誘導体および／またはアクリジン置換ヌクレオチドなどの、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含んでなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの双方を含んでなり得る。例えばリボヌクレオチドのみからなるアンチセンス作用物質は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズして、翻訳機構が標的ＲＮＡ転写物にアクセスするのを妨げ、その結果タンパク質合成を妨げ得る。デオキシリボヌクレオチドのみ、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとを含むアンチセンス分子は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズし得て、ＲＮＡ標的は、引き続いて、例えばＲＮＡｓｅＨなどの酵素によって切断されて、翻訳を妨げ得る。側面に位置するＲＮＡ配列は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドとホスホロチオエート結合とを含み得て、内部ＤＮＡ配列は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。ＲＮＡｓｅＨ活性による標的化が所望される場合、内部ＤＮＡ配列は、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド長である。
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばネプロキシンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、調節のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、またはＨＳＣなどの標的に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα−らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似した、定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は疎水性膜移行配列（ＭＴＳ：ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号４）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号５））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号６））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号７））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ−ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ：ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（ラム（Ｌａｍ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５４巻、ｐ．８２〜８４、１９９１年）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを利用し得る。
ＲＧＤペプチド部分を使用して、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的化し得る（ツィッツマン（Ｚｉｔｚｍａｎｎ）ら著、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第６２巻、ｐ．５１３９〜４３、２００２年）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓をはじめとする、多様なその他の組織の腫瘍へのｄｓＲＮＡ剤の標的化を容易にし得る（アオキ（Ａｏｋｉ）ら著、キャンサー ジーン セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第８巻、ｐ．７８３〜７８７、２００１年）。好ましくはＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を容易にする。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であり得て、例えばグリコシル化またはメチル化によって修飾されて、特定組織の標的化を容易にし得る。例えばグリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞に、ｉＲＮＡ剤を送達し得る（ハウブナー（Ｈａｕｂｎｅｒ）ら著、ジャーナル オブ ニュークリア メディスン（Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．）、第４２巻、ｐ．３２６〜３３６、２００１年）。
増殖細胞中に豊富なマーカを標的とするペプチドを使用し得る。例えばＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣薬は、がん細胞、特にαｖβ３インテグリンを呈示する細胞を標的化し得る。したがってＲＧＤペプチド、ＲＧＤ含有環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣薬を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化するその他の部分を使用し得る。一般にこのようなリガンドを使用して、増殖細胞と血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓ）を制御し得る。
「細胞透過ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過ペプチドは、例えばα−らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸のみを含有するペプチド（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を含み得る。例えば細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（シメオニ（Ｓｉｍｅｏｎｉ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第３１巻、ｐ．２７１７〜２７２４、２００３年）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物複合体をさらに含んでなる。炭水化物複合体は、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、以下のいずれかの化合物を指す：各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子を有する（直鎖、分枝または環状であり得る）１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；または各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、それぞれ少なくとも６個の炭素原子を有する（直鎖、分枝または環状であり得る）１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物。代表的炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４〜９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上の（好ましくはＣ５〜Ｃ８）糖類；２または３個の単糖単位（好ましくはＣ５〜Ｃ８）を有する糖類をはじめとする、二糖類および三糖類が挙げられる。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子、エンドソーム溶解リガンド、および細胞透過ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、その他のリガンドをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体は、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、１〜２４個の原子、好ましくは４〜２４個の原子、好ましくは６〜１８個の原子、より好ましくは８〜１８個の原子、および最も好ましくは８〜１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０または１００倍より迅速に切断される。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８ａｎｄ５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを向上させるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの包含された脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を有する。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合させる分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施し得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体の精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
ＭＨＣへのｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。生体外送達は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物に、細胞を接触させることで実施し得る。ｉＲＮＡ調合物、そして培養中の細胞への送達方法は、当業者によく知られている。代案としては、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを細胞に接触させることで、送達を実施し得る。
本明細書に記載される好ましい態様は、移植前のＭＨＣの生体外操作を伴う一方で、ＭＨＣ移植を必要として、それを受ける対象へのｉＲＮＡ配合物の投与もまた、具体的に検討される。生体内送達は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施し得る。代案としては、送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施し得る。これらの代替案は、さらに下で考察される。
一般に、核酸分子のあらゆる送達方法をｉＲＮＡで使用するために、適応させ得る（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、アクタール（Ａｋｈｔａｒ）Ｓ．およびジュリアン（Ｊｕｌｉａｎ）ＲＬ．著、１９９２年、トレンズ イン セルバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２巻、第５号、ｐ．１３９〜１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。しかしｉＲＮＡ分子を生体内に成功裏に送達するために検討することが重要な、３つの要素がある：（ａ）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の防止、および（３）送達される分子の標的組織内蓄積。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織（非限定的例として腫瘍）中への直接注射または移植などの局所投与によって、または調製品を局所的に投与にすることで、最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被ることも、作用物質を分解することもあり得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（トレンティーノ（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ），ＭＪ．ら著、２００４年、レティーナ（Ｒｅｔｉｎａ）、第２４巻、ｐ．１３２〜１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（ライヒ（Ｒｅｉｃｈ），ＳＪ．ら著、２００３年、モレキュラービジョン（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．）、第９巻、ｐ．２１０〜２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（ピル（Ｐｉｌｌｅ），Ｊ．ら著、２００５年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１１巻、ｐ．２６７〜２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（キム（Ｋｉｍ），ＷＪ．ら著、２００６年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１４巻、ｐ．３４３〜３５０；リー（Ｌｉ），Ｓ．ら著、２００７年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）第１５巻、ｐ．５１５〜５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（ドーン（Ｄｏｒｎ），Ｇ．ら著、２００４、ニュークレイック アシッズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ） ３２：ｅ４９；タン（Ｔａｎ），ＰＨ．ら著、２００５年、ジーン セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第１２巻、ｐ．５９〜６６；マキムラ（Ｍａｋｉｍｕｒａ），Ｈ．ら著、２００２年、ＢＭＣニューロサイエンス（ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、第３巻、ｐ．１８；シシュキナ（Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ），ＧＴ．ら著、２００４年、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第１２９巻、ｐ．５２１〜５２８；タッカー（Ｔｈａｋｋｅｒ），ＥＲ．ら著、２００４年、米国科学アカデミー紀要、第１０１巻、ｐ．１７２７０〜１７２７５；アカネヤ（Ａｋａｎｅｙａ），Ｙ．ら著、２００５年、ジャーナル オブ ニューロフィジオロジ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．）、第９３巻、ｐ．５９４〜６０２）、および鼻腔内投与による肺への（ハワード（Ｈｏｗａｒｄ），ＫＡ．ら著、２００６年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１４巻、ｐ．４７６〜４８４；チャン（Ｚｈａｎｇ），Ｘ．ら著、２００４年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ．１０６７７〜１０６８４；ビトコ（Ｂｉｔｋｏ），Ｖ．ら著、２００５年、ネイチャー メディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第１１巻、ｐ．５０〜５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（サウチェック（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ），Ｊ．ら著、２００４年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４３２巻、ｐ．１７３〜１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（マクナマラ（ＭｃＮａｍａｒａ），ＪＯ．ら著、２００６年、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第２４巻、ｐ．１００５〜１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばキム（Ｋｉｍ）ＳＨ．ら著、２００８年、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、第１２９巻、第２号、ｐ．１０７〜１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ），ＤＲ．ら著、２００３年、ジャーナル オブ モレキュラー バイオトｒジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、第３２７巻、ｐ．７６１〜７６６；フェルマ（Ｖｅｒｍａ），ＵＮ．ら著、２００３年、クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第９巻、ｐ．１２９１〜１３００；ア−ノルド（Ａｒｎｏｌｄ），ＡＳら著、２００７年、ジャーナル オブ ハイパーテンション（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．）、第２５巻、ｐ．１９７〜２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ），ＤＲ．ら著、２００３年，前出；フェルマ（Ｖｅｒｍａ），ＵＮ．ら著、２００３年，前出），オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ），“安定な核酸ー脂質粒子（ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ）”（ツィマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ），ＴＳ．ら著、２００６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４４１巻、ｐ．１１１〜１１４）、カルジオリピン（チェン（Ｃｈｉｅｎ），ＰＹ．ら著、２００５年、キャンサー ジーン セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第１２巻、ｐ．３２１〜３２８；パル（Ｐａｌ），Ａ．ら著、２００５年、インターナショナル ジャーナル オブ オンコロジー（Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、第２６巻、ｐ．１０８７〜１０９１）、ポリエチレンイミン（ボネ（Ｂｏｎｎｅｔ）ＭＥ．ら著、２００８年、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．）、８月１６日オンライン先行発表；アイグナー（Ａｉｇｎｅｒ），Ａ．著、２００６年、ジャーナル オブ バイオメディスン＆バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、ｐ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（リュ−（Ｌｉｕ），Ｓ．著、２００６年、モレキュラー ファーマコロジ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．）、第３巻、ｐ．４７２〜４８７）、およびポリアミドアミン（トナリア（Ｔｏｍａｌｉａ），ＤＡ．ら著、２００７年、バイオケミカル ソサエティ トランザクション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．）、第３５巻、ｐ．６１〜６７；ヨー（Ｙｏｏ），Ｈ．ら著、１９９９年、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．）、第１６巻、ｐ．１７９９〜１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
別の態様では、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にするｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．に付与された国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄに付与された国際公開第００／２２１１４号パンフレット、およびＣｏｎｒａｄに付与された米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（ガスマン（Ｇａｓｓｍａｎｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要１９９５年、第９２巻、ｐ．１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本明細書に記載の技術により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（ドチェルティ（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ）ら著、１９９４年、ＦＡＳＥＢジャーナル、第８巻、ｐ．２０〜２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第２１７巻、ｐ．５８１〜５９９、１９９３年を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、ボーゼン（Ｂｏｅｓｅｎ）ら著、バイオセラピー（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、第６巻、ｐ．２９１〜３０２、１９９４年にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、クラウス（Ｃｌｏｗｅｓ）ら著、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９３巻、ｐ．６４４〜６５１、１９９４年；キエム（Ｋｉｅｍ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第８３巻、ｐ．１４６７〜１４７３、１９９４年；サルモンズ（Ｓａｌｍｏｎｓ）およびグンズバーグ（Ｇｕｎｚｂｅｒｇ）著、ヒューマン ジーン セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第４巻、ｐ．１２９〜１４１、１９９３年；およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）著、カレント オピニオン イン ジェネティクス＆ディベロップメント（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、第３巻、ｐ．１１０〜１１４、１９９３年である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、ｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。コザルスキー（Ｋｏｚａｒｓｋｙ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、カレント オピニオン イン ジェネティクス＆ディベロップメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）第３巻、ｐ．４９９〜５０３、１９９３年は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。バウト（Ｂｏｕｔ）ら著、ヒューマン ジーン セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、ｐ．３〜１０、１９９４年は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５２巻、ｐ．４３１〜４３４、１９９１年；ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第６８巻、ｐ．１４３〜１５５、１９９２年；マストランジェリ（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ）ら著、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９１巻、ｐ．２２５〜２３４、１９９３年；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびワン（Ｗａｎｇ）ら著、ジーン セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ．７７５〜７８３、１９９５年にある。本明細書に記載の技術で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、シァ（Ｘｉａ）Ｈら著、２００２年、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、第２０巻、ｐ．１００６〜１０１０に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターの使用もまた、検討される（ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら著、ソサエティ フォー エクスペリメンタル バイオロジー＆メディスン論文集（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、第２０４巻、ｐ．２８９〜３００、１９９３年；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）Ｒら著、１９８７年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６１巻、ｐ．３０９６〜３１０１；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）Ｋ Ｊら著、１９９６年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第７０巻、ｐ．５２０〜５３２；サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）Ｒら著、１９８９年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、ｐ．３８２２〜３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
別の好ましいウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、ラビノビッツ（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ）Ｊ Ｅら著、２００２年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ Ｖｉｒｏｌ）、第７６巻、ｐ．７９１〜８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
一実施形態では、ｉＲＮＡと薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物が、本明細書で提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＭＨＣ移植または増幅から恩恵を被る、疾患または障害の治療に有用である。本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物は、ＭＨＣ増幅および／または生着を向上させ得て（ｅｎｃｈａｎｃｅ）、それによって必要なまたは所望の造血系細胞型に、細胞が分化する可能性を向上させる。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一実施例は、例えば静脈内（ＩＶ）送達による、非経口送達を通じた、全身投与のために調合される組成物である。
本明細書で取り上げる医薬組成物は、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与される。一般にｉＲＮＡの適切な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、一般に１日あたり体重あたりキログラム１〜５０ｍｇの範囲である。例えばｄｓＲＮＡは、単回用量あたり０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与し得る。医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与し得て、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される技術の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために、特に有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現レベルに対する単回投与の効果は長期に持続し得て、引き続く用量は、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要素が、対象を効果的に治療するのに必要な投与量とタイミングに、影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに組成物の治療有効量による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本明細書に記載の技術に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、従来の手順を使用して、または本明細書の他の箇所に記載されるように、適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて推定し得る。
マウス遺伝学における進歩は、ＭＨＣ移植によって治療される造血疾患など、様々なヒト疾患を研究するためのいくつかのマウスモデルを作り出している。このようなモデルは、ｉＲＮＡの生体内試験のために、ならびに治療有効用量を判定するために、使用し得る。適切なマウスモデルは、例えば白血病のマウスである。
本明細書に記載の技術は、本明細書で取り上げるｉＲＮＡ化合物を含む、医薬組成物および製剤もまた含む。本明細書に記載の技術の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与されてもよい。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えば粉末の吸入または吹送またはネブライザーをはじめとする煙霧剤による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口とすることができる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または輸液；例えば埋め込みデバイスを通じた、真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、骨髄（例えば骨髄の中のＭＨＣ）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましいこともある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用となり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本明細書に記載の技術で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本明細書に記載の技術で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成してもよい。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
薬物の調合のために研究され使用されているマイクロエマルション以外にも、多数の組織化界面活性剤の構造が存在する。これらとしては、単層、ミセル、二重層、および小胞が挙げられる。リポソームなどの小胞は、薬物送達の観点から、それらの特異性とそれらが提供する作用持続時間のために、高い注目を集めている。本明細書に記載の技術での用法では、「リポソーム」という用語は、球状二重層または二重層群に配列された両親媒性脂質から構成される、小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれる。
無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。したがって高度に変形可能でこのような細孔を通過できる、リポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる；天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームは、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化した薬剤を代謝および分解から保護し得る（ロゾフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移行および送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜と一体化し始めて、リポソームと細胞の融合が進むにつれて、リポソーム内容物は、そこで活性薬剤が作用することができる細胞中に出される。
リポソーム製剤は、多数の薬剤の送達様式として、大規模な研究の焦点である。局所投与において、リポソームがその他の製剤に優るいくつかの利点を提示する証拠が、上がってきている。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収と結びつく副作用の低下、所望の標的における投与薬剤の蓄積増大、および親水性および疎水性双方の多種多様な薬剤を皮膚内投与する能力が挙げられる。
いくつかの報告は、リポソームが、皮膚内に高分子量ＤＮＡをはじめとする作用物質を送達する能力を詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡをはじめとする化合物が、皮膚に投与されている。用途の大部分は、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電したＲＮＡ分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電したＲＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、バイオケミカル＆バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９８７年、第１４７巻、ｐ．９８０〜９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成でなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で細胞単層に、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら著、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、１９９２年、第１９巻、ｐ．２６９〜２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から生成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから生成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から生成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から生成される。
いくつかの研究が、皮膚へのリポソーム製剤の局所送達を評価している。インターフェロン含有リポソームのモルモット皮膚への塗布が、皮膚ヘルペスによる傷の減少をもたらしたのに対し、別の手段によるインターフェロン送達（例えば溶液としてまたはエマルションとしての）は無効であった（ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら著、ジャーナル オブ ドラッグ ターゲンティング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、１９９２年、第２巻、ｐ．４０５〜４１０）。さらに追加的な研究が、水性系を使用したインターフェロン投与と比較して、リポソーム製剤の一部としてのインターフェロン投与の有効性を試験し、リポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（デュプレシ（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ）ら著、アンチバイラル リサーチ（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９２年、第１８巻、ｐ．２５９〜２６５）。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなる系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（フー（Ｈｕ）ら著、Ｓ．Ｔ．Ｐ．ファーマ サイエンス（Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．）、１９９４年、第４巻、第６号、ｐ．４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含んでなるリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含んでなり、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９８７年、第２２３巻、ｐ．４２；ウー（Ｗｕ）ら著、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９３年、第５３巻、ｐ．３７６５）。
１つまたは複数の糖脂質を含んでなる様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。パパハジョポロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）ら著、ニューヨークアカデミーオブサイエンス紀要（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９８７年、第５０７巻、ｐ．６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、ギャビゾン（Ｇａｂｉｚｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要、１９８８年、第８５巻、ｐ．６９４９によって詳しく説明された。どちらもアレン（Ａｌｌｅｎ）らに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含んでなる、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（ウェブ（Ｗｅｂｂ）ら）は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソームは、国際公開第９７／１３４９９（リム（Ｌｉｍ）ら）号パンフレットで開示される。
１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでなる多数のリポソーム、およびそれらの調製法は、当該技術分野で公知である。スナモト（Ｓｕｎａｍｏｔｏ）ら（日本化学会欧文誌（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．）、１９８０年、第５３巻、ｐ．２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン系洗剤２Ｃ１２１５Ｇを含んでなる、リポソームについて記載した。イルム（Ｉｌｌｕｍ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９８４年、第１６７巻、ｐ．７９は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが、顕著に改善された血液半減期をもたらすことを記述した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボン酸基の付加によって修飾された合成リン脂質は、シアーズ（Ｓｅａｒｓ）（米国特許第４，４２６，３３０号明細書および米国特許第４，５３４，８９９号明細書）によって記載される。クリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）ら（ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９９０年、第２６８巻、ｐ．２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアリン酸塩によって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んでなるリポソームが、血液循環半減期に著しい増大を有することを実証する実験を記載した。ブルム（Ｂｌｕｍｅ）ら（バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９９０年、第１０２９巻、ｐ．９１）は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせから生成される、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧなどのその他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質に、このような観察を広げた。共有結合したＰＥＧ部分を外面に有するリポソームは、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）に付与された欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号明細書および国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載される。１〜２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、ウードル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら（米国特許第５，０１３，５５６号明細書および米国特許第５，３５６，６３３号明細書）、およびマーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号明細書）によって記載される。いくつかのその他の脂質−ポリマー複合体を含んでなるリポソームは、（どちらもマーティン（Ｍａｒｔｉｎ）らに付与された）国際公開第９１／０５５４５号パンフレットおよび米国特許第５，２２５，２１２号明細書、および国際公開第９４／２００７３号パンフレット（ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）ら）で開示される。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含んでなるリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（チョイ（Ｃｈｏｉ）ら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ）ら）および米国特許第５，５５６，９４８号明細書（タガワ（Ｔａｇａｗａ）ら）は、それらの表面を機能的部分でさらに誘導体化し得る、ＰＥＧ含有リポソームを記載する。
核酸を含んでなるいくつかのリポソームは、当該技術分野で公知である。ティエリ（Ｔｈｉｅｒｒｙ）らに付与された国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、高分子量核酸をリポソーム中にカプセル化する方法を開示する。タガワ（Ｔａｇａｗａ）らに付与された米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質結合リポソームを開示し、このようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含むことができると主張する。ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）らに付与された米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載する。ラブ（Ｌｏｖｅ）らに付与された国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子標的化ｄｓＲＮＡを含んでなるリポソームを開示する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８年、ｐ．２８５。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８年、ｐ．２８５）。
一実施形態では、本明細書に記載の技術で取り上げるｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、またはその他の核酸−脂質粒子を形成する。本明細書の用法では、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰをはじめとする、安定核酸−脂質粒子を指す。本明細書の用法では、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含んでなる核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＳＰＬＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本明細書に記載の技術の粒子は、典型的に約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本明細書に記載の技術の核酸−脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸−脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲である。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の実施形態では、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとするが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、またはその混合物であってもよい。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であってもよい。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましくなり得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本明細書に記載の技術で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本明細書に記載の技術で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
本明細書に記載の技術の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。
好都合には単位剤形で提示され得る、本明細書に記載の技術の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本明細書に記載の技術の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合されてもよい。本明細書に記載の技術の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
本明細書に記載の技術の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第２巻、ｐ．３３５；ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら著、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９８５年、ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含んでなる複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２８５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク，リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．３３５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
本明細書に記載の技術の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．編、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（レング（Ｌｅｕｎｇ）および（シャー）著、「薬剤の制御放出：ポリマーおよび凝集体系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ），Ｍ．編、１９８９年、ＶＣＨパブリッシャーズ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、ｐ．１８５〜２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３〜５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）著、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９８５年、ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製することができ、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；コンスタンティニディス（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ）ら著、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９４年、第１１巻、ｐ．１３８５〜１３９０；リチェル（Ｒｉｔｓｃｈｅｌ）著、メソッズ＆ファインディングス イン エクスペリメンタル＆クリニカル ファーマコロジ（Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９３年、第１３巻、ｐ．２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；コンスタンティニディス（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ）ら著、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９４年、第１１巻、ｐ．１３８５；ホー（Ｈｏ）ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、１９９６年、第８５巻、ｐ．１３８〜１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成できることが多い。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本明細書に記載の技術のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本明細書に記載の技術のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高めてもよい。本明細書に記載の技術のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類されてもよい。（リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
一実施形態では、本明細書に記載の技術は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過することができることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤：本明細書に記載の技術との関連で、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルションタカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９８８年、第４０巻、ｐ．２５２）が挙げられる。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそのモノ−およびジ−グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばトィトゥ（Ｔｏｕｉｔｏｕ），Ｅ．ら著、「薬送達の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、２００６年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１〜３３；エルハリリ（Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９２年、第４４巻、ｐ．６５１〜６５４を参照されたい）。
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年，ブラントン（Ｂｒｕｎｔｏｎ）著、第３８章、「グッドマン＆ギルマンの治療学の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第９版より、ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、１９９６年、ｐ．９３４〜９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ−２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、インフォルマ ヘルスケア（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；スウィンヤード（Ｓｗｉｎｙａｒｄ）著、第３９章、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版より、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９９０年、ｐ．７８２〜７８３；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１〜３３；ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら著、ジャーナル オブ エクスペリメンタル セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９２年、第２６３巻、ｐ．２５；ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、１９９０年、第７９巻、ｐ．５７９〜５８３を参照されたい）。
キレート化剤：本明細書に記載の技術との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本明細書に記載の技術における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（ジャレット（Ｊａｒｒｅｔｔ），Ｊ．著、クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．）、１９９３年、第６１８巻、ｐ．３１５〜３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばカダレ（Ｋａｔｄａｒｅ），Ａ．ら著、「製薬、バイオテクノロジー、および薬物送達のための賦形剤の開発（Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、２００６年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１〜３３；ブール（Ｂｕｕｒ）ら著、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．）、１９９０年、第１４巻、４３〜５１を参照されたい）。
非キレート化非界面活性剤：本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１〜３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９８７年、第３９巻、ｐ．６２１〜６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本明細書に記載の技術の医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（ジュンイチ（Ｊｕｎｉｃｈｉ）らに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（ロロ（Ｌｏｌｌｏ）らに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）；スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、またはＦｕｇｅｎｅ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（オズバイオサイエンス（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；フランス，マルセイユ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（オズバイオサイエンス（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；フランス，マルセイユ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；米国マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（インビボゲン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）））、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（ビオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；米国マサチューセッツ州タウントン（Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＰｌａｓＦｅｃｔ（ビオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；米国マサチューセッツ州タウントン（Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２−ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
本明細書に記載の技術の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（ミヤオ（Ｍｉｙａｏ）ら著、ＤｓＲＮＡリサーチ＆ディベロップメント（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．）、１９９５年、第５巻、ｐ．１１５〜１２１；タカムラ（Ｔａｋａｋｕｒａ）ら著、ＤｓＲＮＡ＆ニュークレイック アシッド ドラッグ ディベロップメント（ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．）、１９９６年、第６巻、ｐ．１７７〜１８３。
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体とすることができ、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本明細書に記載の技術の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書に記載の技術の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することも、染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本明細書に記載の技術の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有することもできる。しかしこのような材料は、添加した場合に、本明細書に記載の技術の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術分野で取り上げられる医薬組成物には、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構により機能する１つまたは複数の薬剤が挙げられる。このようなその他の作用薬の例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。増殖因子（例えば骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子および表皮増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３リガンドおよび１’−３。例えばそれぞれその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，１６９，６１０号明細書；米国特許第７，１０９，０３２号明細書；米国特許第７，０３７，７２１号明細書；米国特許第６，６１７，１６１号明細書；米国特許第６，６１７，１５９号明細書；米国特許第６，３７２，２１０号明細書；米国特許第６，２２４，８６０号明細書；米国特許第６，０３７，１７４号明細書；米国特許第５，９０８，７８２号明細書；米国特許第５，７６６，９５１号明細書；米国特許第５，３９７，７０６号明細書；および米国特許第４，６５７，８６６号明細書を参照されたい）、ホルモン（例えばＤ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンおよびＬ−サイロニン）およびリガンド（例えばｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびｆｌｔ−３リガンド）。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に効果的な用量）を判定するための細胞培養または実験的動物における標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための一連の投与量を調合するのに使用し得る。本明細書に記載の組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本明細書に記載の技術で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、動物モデル中で、細胞培養中で判定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合は標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように調合し得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
それらの投与に加えて、上で考察したように、移植のためのＭＨＣの増殖、生体外または生体内におけるＭＨＣ数の増大、およびＭＨＣ移植成功の増大に効果的なその他の既知の作用薬と組み合わせて、本明細書に記載される技術で取り上げるｉＲＮＡを投与し得る。いずれにしても当業者は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的測定を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
本明細書に記載される技術は、特に、ＭＨＣ移植を要する疾患治療のための、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子または遺伝子群を標的にするｉＲＮＡと、少なくとも１つのこのようなｉＲＮＡを含有する組成物との使用に関する。本明細書に記載される組成物を使用して、ＭＨＣおよび／または始原細胞を生体外で処理し得て、それによってこれらの細胞の増幅または生着可能性が向上され、それは次に患者に移植される。本明細書に記載される別の態様では、本明細書に記載されるＭＨＣおよび／または始原細胞およびｉＲＮＡ組成物の双方が、患者に投与される。本明細書に記載される別の態様では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物は、ＭＨＣ増幅および／または生着を必要とする患者に投与される。
例えばＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子を標的にするｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、単なる例として提供される以下の１つを治療するためにＵＣＢ ＭＨＣ移植を受けた患者のＭＨＣ増幅、生着、および造血再構築を向上させる。白血病；ＡＭＬ；ＡＬＬ；ＣＭＬ；ホジキン病；好中球減少症；骨髄異形成症候群；ファンコニ貧血；ブラックファンダイヤモンド貧血；重症再生不良性貧血；重症複合型免疫不全症；ウィスコット・アルドリッチ症候群；大理石骨病；ハーラー症候群；副腎白質萎縮症；鎌状赤血球貧血；ＨＩＶ；ユーイング肉腫；ゴーシェ病；およびサラセミア。「向上させる」とは、この文脈で、このようなレベルの統計的に有意な増大を意味する。増大は、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得る。
本明細書に記載される技術は、例えばＭＨＣ移植を受けた患者に有益であり得るような、既知の医薬品および／または既知の治療法などの、その他の医薬品および／またはその他の治療法と組み合わせた、例えばＭＨＣ移植を受けた患者を処置するための、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物の使用にさらに関する。例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。血小板の輸液、赤血球の輸液、抗生物質（例えばバンコマイシン，アンホテリシン、シクロスポリン、ガンシクロビル、ミカファンギン、フルコナゾール）、抗嘔吐薬、増殖因子（例えば骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、血小板由来増殖因子および表皮増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンドおよび１’−３。例えばそれぞれその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第号明細書７，１６９，６１０号明細書；米国特許第７，１０９，０３２号明細書；米国特許第７，０３７，７２１号明細書；米国特許第６，６１７，１６１号明細書；米国特許第６，６１７，１５９号明細書；米国特許第６，３７２，２１０号明細書；米国特許第６，２２４，８６０号明細書；米国特許第６，０３７，１７４号明細書；米国特許第５，９０８，７８２号明細書；米国特許第５，７６６，９５１号明細書；米国特許第５，３９７，７０６号明細書；および米国特許第４，６５７，８６６号明細書を参照されたい）、ホルモン（例えばＤ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンおよびＬ−サイロニン）、リガンド（例えばｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびｆｌｔ−３リガンド）、アミノグリコシド、静脈内免疫グロビン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（例えばＦＯＲＴＥＯ（登録商標）またはその内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許公開第２００８／００５１３３２号明細書で開示されるペプチド）、酸化窒素経路の調節因子（例えばシルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）−Ｅ、ニトログリセリン、Ｌ−アルギニン、硝酸エステル、亜硝酸アミル（ｉｓｏａｍｙｌｙｎｉｔｒｉｔｅ）、ＳＩＮ−１、システイン、ジチオスレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトコハク酸、チオサリチル酸、およびメチルチオサリチル酸）、ジチオカルバメート、ジスルフラム、またはプロスタグランジンＥ２。
ｉＲＮＡおよび追加的な治療薬は、例えば非経口的に、同一組み合わせ中で投与し得て、または追加的な治療薬は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載される別の方法によって投与し得る。
疾患の治療または予防効力は、例えば好中球および／または血小板の回復、生着、再発、生存またはあらゆるその他の適切な測定可能パラメータを測定することで評価し得る。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
移植回復状態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、またはさもなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、成功裏の治療は明らかである。一例として、回復の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知のＭＨＣ移植のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカの統計的に有意な増大が観察される場合に、立証される。
患者には、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。ｉＲＮＡは、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間などを超える時間にわたる、静脈輸液によって投与し得る。投与は、例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月以上などにわたり隔週（すなわち２週毎）で、定期的に繰り返される。最初の治療計画の後に、治療はより低い頻度で行い得る。例えば３ヶ月にわたる隔週の投与後、６ヶ月または１年以上にわたり毎月１回の投与を反復し得る。ｉＲＮＡの投与は、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の区画中における、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のレベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％以上低下させ得る。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液反応などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターし得る。
ＭＨＣ増幅に対する効果のために、本明細書に記載される技術に従った組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を向上させ得る。
骨髄の致死性アブレーション後の生着は、造血性血液細胞数、特に白血球細胞数を測定することで評価し得る。致死性アブレーションに続く正常な白血球細胞数の回復は、成功裏の生着の機能的測定である。臨床状況では、連続骨髄穿刺（ｐｕｎｃｔｉｏｎｓ）／生検を通じた骨髄中の細胞充実性測定、および／または循環白血球細胞のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分類が、これに付随し得る。生着の尺度として、骨髄穿刺液もまた、供与者キメリズムについて評価し得る。
あらゆる血液細胞型が生着を示し得るが、それらの半減期次第で、多かれ少なかれ高感度の生着尺度が得られる。好中球は非常に短い半減期（血中でわずか数時間）を有し、したがって初期生着の非常に良好な尺度である。血小板もまた短い半減期を有するが、それらは通常、移植前レベルに回復する最後の血液要素であり、初期生着マーカとしては適切でない。
したがって本明細書では、造血始原細胞の生着を測定するのに有用な細胞は、移植に続いて比較的迅速に回復して、比較的短い半減期を有するものであると了解される（例えば好中球）。本明細書に記載される方法の実施形態では、造血始原細胞生着は、個人における好中球回復レベルの検出および／または測定によって評価される。
造血細胞生着を向上させる所与の治療の効力は、熟練した臨床医によって判定され得る。しかし治療は、本明細書に記載される化合物による治療に続いて、例えば少なくとも１０％、例えば芳しくない造血細胞機能または生着などの徴候または症状の１つまたは全てが有益な様式で変化すれば、またはその他の臨床的に認められた症状が改善されれば、または寛解にさえ至れば、本明細書の用法では「効果的治療」と見なされる。効力はまた、入院、医学的介の必要性による評価で、個人に悪化がないこと（すなわち疾患進行の停止）、または生着失敗の発生率によっても測定し得る。これらの指標の測定方法は、当業者に知られておりおよび／または本明細書に記載される。治療としては、（１）例えば生着失敗防止などの疾患の抑制；または（２）例えば１つまたは複数の症状の後退を引き起こすなどの疾患の軽減をはじめとする、個人または動物（いくつかの非限定的例としては、ヒト、または哺乳類が挙げられる）における疾患のあらゆる治療が挙げられる。疾患治療の有効量は、それを必要とする哺乳類に投与されると、その疾患に対して、本明細書定義で定義される効果的な治療をもたらすのに十分な量を意味する。作用物質の効力は、例えば好中球産生、白血球数、造血細胞数、貧血の存在／不在などの、造血細胞生着の身体的指標を評価することで判定し得る。効力は、例えば、骨髄移植、および造血細胞の生着の少なくとも一つの症状の増大をもたらす治療または組成物または製剤の投与に続く、齧歯類の処置などの、骨髄移植の動物モデルで評価することができる。
さらに別の態様では、本明細書に記載される技術は、哺乳類において、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
一実施形態では、方法は、例えば少なくとも２、３、４日間以上、例えば１週間、２週間、３週間、または４週間以上などの長期間にわたり、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする標的遺伝子の発現が低下するように、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物を哺乳類に投与するステップを含む。標的遺伝子低下の効果は、組成物を投与されない哺乳類との比較で、好ましくは好中球および／または血小板回復、生着または生存の増大、または再発の減少をもたらす。
好ましくは、本明細書に記載される方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする標的遺伝子の（一次またはプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的にする。これらの遺伝子の発現を阻害するための、ｉＲＮＡを使用した組成物および方法は、本明細書の他の箇所に記載されるように調製して実施し得る。
一実施形態では、方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与するステップを含み、ｉＲＮＡは、治療される哺乳類のＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療される生物が、哺乳類などのヒトである場合、組成物は、頭蓋内（例えば脳室内、脳実質内、およびクモ膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道内（煙霧剤）、鼻孔内、直腸内、および局所（バッカルおよび舌下をはじめとする）投与をはじめとする、経口、腹腔内、または非経口経路をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の手段によって投与し得る。特定の実施形態では、組成物は静脈輸液または注射によって投与される。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本明細書に記載の技術で取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
本明細書に記載の技術は、決してさらに限定するものとして解釈されるべきでない、以下の実施例によって説明される。
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号付き段落のいずれかに従って定義され得る。
１．ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ＭＨＣ増幅の負の制御因子が、Ｉｔｃｈ、ＳＨ２Ｂ３、Ｐｒｏｘ１、およびＡｈＲからなる群から選択される遺伝子である、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
２．センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、センス鎖が配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖が配列番号８のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
３．センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、センス鎖が配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖が配列番号９のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
４．センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、センス鎖が配列番号３のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖が配列番号１０のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
５．センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、センス鎖が配列番号１１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖が配列番号１２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
６．センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖が表２〜７に列挙されるアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、相補性領域を含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
７．前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオチドからなる群から選択される、段落７に記載のｄｓＲＮＡ。
９．前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される、段落７に記載のｄｓＲＮＡ。
１０．相補性領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
１１．相補性領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
１２．相補性領域が、１９ヌクレオチド長である、段落１１に記載のｄｓＲＮＡ。
１３．各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
１４．少なくとも１本の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
１５．少なくとも１本の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
１６．リガンドをさらに含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
１７．リガンドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合する、段落１６に記載のｄｓＲＮＡ。
１８．相補性領域が表２〜７のアンチセンス配列の１つからなる、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
１９．センス鎖が配列番号１からなり、アンチセンス鎖が配列番号８からなる、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
２０．センス鎖が配列番号２からなり、アンチセンス鎖が配列番号９からなる、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
２１．センス鎖が配列番号３からなり、アンチセンス鎖が配列番号１０からなる、段落６に記載のｄｓＲＮＡ。
２２．ｄｓＲＮＡが、表２〜７から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２〜７から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含んでなる、段落１に記載のｄｓＲＮＡ。
２３．段落１に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
２４．段落１に記載のｄｓＲＮＡを含有する、単離または培養された細胞。
２５．段落１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ鎖の少なくとも１本をコードするベクター。
２６．相補性領域が少なくとも１５ヌクレオチド長である、段落２５に記載のベクター。
２７．相補性領域が１９〜２１ヌクレオチド長である、段落２５に記載のベクター。
２８．請求項２５に記載のベクターを含んでなる細胞。
２９．段落２５に記載のｄｓＲＮＡを含有する、単離または培養された細胞。
３０．（ａ）段落１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを細胞に導入するステップと；
（ｂ）ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり、ステップ（ａ）で生成された細胞を維持し、それによって細胞中におけるＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するステップと
を含んでなる、細胞中においてＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法。
３１．ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現が、少なくとも３０％阻害される、段落３０に記載の方法。
３２．段落３０に記載の方法に従って処理された細胞。
３３．段落３０に記載の方法に従って処理された、単離または培養された細胞。
３４ 段落１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを多分化能造血細胞中に導入するステップと、細胞増幅を可能にするのに十分な時間と条件下において、細胞を維持するステップとを含んでなる、多性能造血細胞を増幅する方法。
３５．得られた増幅細胞が、段落３４に記載の方法に従って処理されていない多分化能造血細胞と比較して、生着および／または分化する向上した能力を有する、段落３４に記載の方法。
３６．前記増幅が生体外で起きる、段落３４に記載の方法。
３７．前記増幅が生体内で起きる、段落３４に記載の方法。
３８．段落３４に記載の方法に従って処理された細胞。
３９．段落３４に記載の方法に従って処理された、単離または培養された細胞。
４０．多分化能造血細胞の増幅および／または生着の向上を必要とする患者に、段落１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ；段落２３、２４、２８、２９、３２、３３、３８、および３９のいずれか一項に記載の細胞；および段落２１〜２３のいずれか一項に記載のベクターの１つまたは複数を含んでなる治療薬を投与するステップを含んでなる、患者を治療する方法。
実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示さない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機上で合成される。市販される制御孔ガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５０Å、プライムシンセシス（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ））および標準保護基があるＲＮＡ亜ホスホルアミド酸、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル亜ホスホルアミド酸、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル亜ホスホルアミド酸、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブトリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル亜ホスホルアミド酸、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル亜ホスホルアミド酸（ピアス ニュークレイックアシッド テクノロジーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））をオリゴヌクレオチド合成のために使用した。２’−Ｆホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは、（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から購入された。グアノシンが１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中で０．２Ｍの濃度で使用される以外は、ホスホラミダイトは、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中で０．２Ｍの濃度で使用される。１６分間のカップリング／リサイクル時間が、使用される。活性化剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、アメリカン インターナショナル ケミカルズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））であり；ＰＯ−酸化ではヨウ素／水／ピリジンが使用され、ＰＳ−酸化ではＰＡＤＳ（２％）ｉｎ２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）が使用される。
３’−リガンド共役結合鎖は、対応するリガンドを含有する固体支持体を使用して合成される。例えばヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホラミダイトから、配列中へのコレステロール単位の導入が実施される。コレステロールは、６−アミノヘキサノエート結合を介してｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールに係留されて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分が得られる。５’−末端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識ｉＲＮＡは、バイオサーチ テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入された、対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホラミダイトから合成される。５’末端および／または内部位置へのリガンドの共役結合は、適切に保護されたリガンド−ホスホラミダイト基本単位を使用することで得られる。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤存在下で、無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍホスホラミダイト溶液を、固体支持体結合オリゴヌクレオチドに、１５分間の長時間にわたりカップリングさせる。ヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化は、報告される（１）標準的なヨウ素−水を使用して、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いて、１０分間の酸化待機時間で、共役結合オリゴヌクレオチドを処理して、行われる。ホスホロチオエートは、ＤＤＴＴ（ＡＭケミカルズ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入）、ＰＡＤＳおよびまたはビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬などのイオウ転移試薬を使用して、亜リン酸エステルをホスホロチオエートに酸化することでに導入される。コレステロールホスホラミダイトは施設内で合成され、ジクロロメタン中の０．１Ｍの濃度で使用される。コレステロールホスホラミダイトのカップリング時間は、１６分間である。
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成完了後、支持体を１００ｍＬガラスボトル（ＶＷＲ）に移す。８０ｍＬのエタノール性アンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］混合物を５５℃で６．５時間用いて、塩基とリン酸基の同時脱保護により、オリゴヌクレオチドを支持体をから切断する。氷上でボトルを短時間冷却し、次にエタノール性アンモニア混合物を新しい２５０ｍＬボトル内に濾過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬ量のエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄する。次に混合物の体積をｒｏｔｏ−ｖａｐで約３０ｍＬに減少させる。次に混合物をドライアイス上で凍結し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃ上で真空乾燥する。
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位置のブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次に反応を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調節する。オリゴヌクレオチドは、精製まで冷凍庫で保存する。
分析
オリゴヌクレオチドは、精製に先だって高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって分析され、緩衝液およびカラムの選択は、配列および／または結合リガンドの性質に左右される。
ＨＰＬＣ精製
リガンド結合オリゴヌクレオチドは、逆相分取ＨＰＬＣによって精製される。非結合オリゴヌクレオチドは、施設内で充填されたＴＳＫゲルカラム上のアニオン交換ＨＰＬＣによって精製される。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）、および１０％ＣＨ３ＣＮ、１Ｍ ＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）である。完全長オリゴヌクレオチド含有画分をプールして脱塩し、凍結乾燥する。ほぼ０．１５ ＯＤの脱塩したオリゴヌクレオチドを水で１５０μＬに希釈し、次にＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のための特殊バイアル内にピペットで移す。次に化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析する。
ｉＲＮＡ調製
ｉＲＮＡの一般的調製のために、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中で５分間９５℃に加熱し、室温に緩慢に冷却する。二本鎖の完全性はＨＰＬＣ分析によって確認される。
核酸配列は、標準命名法、特に表１の略号を使用して、以下に示される。
Figure 2014526887
実施例２．ｓｉＲＮＡデザイン
転写物
ｓｉＲＮＡ標的化Ｉｔｃｈ、ＳＨ２Ｂ３、Ａｈｒ、およびＰｒｏｘ１をデザインして合成した。デザインは、ＮＣＢＩＲｅｆｓｅｑコレクションからのヒト転写物を使用した。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、標的遺伝子との１００％同一性でデザインした。
合計１８６のセンスおよび１８６のアンチセンスヒト由来ｓｉＲＮＡオリゴを合成して、二本鎖を形成した。オリゴは、表２〜７に報告される。
ｉＲＮＡ剤の配列の合成
配列は、１μモル規模でＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機上で合成した。表３中の全ての配列で、以下に詳述されるような「ｅｎｄｏｌｉｇｈｔ」化学を適用した。
センス鎖中のすべてのピリミジン（シトシンおよびウリジン）は、対応する２’−Ｏ−メチル基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換された。
・アンチセンス鎖中では、（５’位置に向けて）リボＡヌクレオシドに隣接するピリミジンは、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドで置換された。
・センスおよびアンチセンス配列の双方の３’末端に、２塩基ｄＴｓｄＴ伸長が導入された。
・配列ファイルをテキストファイルに変換し、それをＭｅｒＭａｄｅ １９２合成ソフトウェアへのロードに適合させた。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト化学を使用する、固体支持オリゴヌクレオチド合成を使用した。
上の配列の合成は、９６ウェルプレート内で、１□ｍ規模で実施した。アミダイト溶液は０．１Ｍ濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性化剤として使用した。
合成配列は、第１のステップではメチルアミン、第２のステップではピリジン．３ＨＦを使用して、９６ウェルプレート内で切断して脱保護した。このようにして得られた粗製配列をアセトン：エタノール混合物を使用して沈殿させ、ペレットを０．５Ｍナトリウム酢酸緩衝液に再懸濁した。各配列からのサンプルをＬＣ−ＭＳによって分析し、得られた大量データは配列同一性を立証した。選択されたサンプルセットはまた、ＩＥＸクロマトグラフィーによって分析した。
次の工程段階は、精製であった。全ての配列は、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムを使用して、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム上で精製した。完全長配列に対応する単一ピークを溶出剤中に収集して、引き続いてイオン交換クロマトグラフィーによって純度を分析した。
精製配列は、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上で脱塩した。脱塩した配列を濃度および純度について分析した。次に一本鎖をアニーリングで使用した。
実施例３：培養細胞中のＳＨ２Ｂ３ ｓｉＲＮＡのスクリーニング
細胞培養および形質移入
５％ＣＯ２大気中３７℃において、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））中で、ＲＫＯおよびＨＥｐ３ｂ細胞をコンフルエンス近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから取り出した。９６ウェルプレート内で、ウェルあたり４４．７５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと、０．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）と共に、ウェルあたり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖を混合して、室温で１５分間培養して形質移入を行った。引き続いて２００００個の細胞（５０ｕｌ）を形質移入ミックスに添加して、ＲＮＡ精製に先だって２４時間培養した。実験は、ＳＨ２Ｂ３二本鎖（図１Ａ〜１Ｃおよび２Ａ〜２Ｃ）のそれぞれを用いて、単回用量スクリーンのための１０ｎＭまたは０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で実施した。単回投与スクリーン中で頑強なサイレンシングを示した１４本の二本鎖の小集団を、連続希釈を使用して１０ｎＭ〜１０ｆＭの一連の濃度にわたってアッセイし、それらのＩＣ５０を判定した（図３Ａ〜３Ｂ）。
全ＲＮＡは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ｍＲＮＡ単離プロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｒｄ ＣＡ，パーツ番号６１０−１２）を使用して単離した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。
反応あたり１０μｌの全ＲＮＡに、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを添加した。ｃＤＮＡは、ＭＪ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持のステップを通じて作成した。
リアルタイムＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４７２９７４００１）内で、ウェルあたり合計１０μｌで、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＳＨ２Ｂ３ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｈｓ００１９３８７８ｍ１）、および５μｌのＲｏｃｈｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、少なくとも２回の独立した形質移入で試験した。各形質移入を二連でｑＰＣＲによってアッセイした。
ΔΔＣｔ法を使用して、リアルタイムデータを分析した。各サンプルをＧＡＰＤＨ発現について正規化し、非標的化二本鎖ＡＤ−１９５５で形質移入した細胞と比較して、ノックダウンを評価した。ＸＬｆｉｔ中で４パラメータ適合モデルを使用して、ＩＣ５０を確定した。図１Ａ〜１Ｃ（Ｈｅｐ３ｂ細胞）および図２Ａ〜２Ｃ（ＲＫＯ細胞）で示されるように、ＳＨ２Ｂ３ ｓｉＲＮＡの単回投与の効力を生体外で調べた。
その他の実施形態は、特許請求の範囲にある。
Figure 2014526887
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Claims (40)

  1. ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ＭＨＣ増幅の負の制御因子が、Ｉｔｃｈ、ＳＨ２Ｂ３、Ｐｒｏｘ１、およびＡｈＲからなる群から選択される遺伝子である、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  2. センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記センス鎖が配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号８のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記センス鎖が配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号９のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記センス鎖が配列番号３のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖が配列番号１０のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記センス鎖が配列番号１１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号１２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が表２〜７に列挙されるアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる、相補性領域を含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. 前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 前記相補性領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 前記相補性領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. リガンドをさらに含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合する、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. 前記相補性領域が、表２〜７のアンチセンス配列の１つからなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. 前記センス鎖が配列番号１からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号８からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. 前記センス鎖が配列番号２からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号９からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. 前記センス鎖が配列番号３からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号１０からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. 前記ｄｓＲＮＡが、表２〜７から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２〜７から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
  24. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含有する、単離または培養された細胞。
  25. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ鎖の少なくとも１本をコードする、ベクター。
  26. 前記相補性領域が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２５に記載のベクター。
  27. 前記相補性領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２５に記載のベクター。
  28. 請求項２５に記載のベクターを含んでなる、細胞。
  29. 請求項２５に記載のベクターを含有する、単離または培養された細胞。
  30. （ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを細胞に導入するステップと；
    （ｂ）ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり、ステップ（ａ）で生成された細胞を維持し、それによって前記細胞中における前記ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害するステップと
    を含んでなる、細胞中においてＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法。
  31. 前記ＭＨＣ増幅の負の制御因子をコードする遺伝子の発現が、少なくとも３０％阻害される、請求項３０に記載の方法。
  32. 請求項３０に記載の方法に従って処理された、細胞。
  33. 請求項３０に記載の方法に従って処理された、単離または培養された細胞。
  34. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを多分化能造血細胞中に導入するステップと、細胞増幅を可能にするのに十分な時間と条件下において、前記細胞を維持するステップとを含んでなる、多性能造血細胞を増幅する方法。
  35. 得られた増幅細胞が、請求項３４に記載の方法に従って処理されていない多分化能造血細胞と比較して、生着および／または分化する向上した能力を有する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記増幅が生体外で起きる、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記増幅が生体内で起きる、請求項３４に記載の方法。
  38. 請求項３４に記載の方法に従って処理された、細胞。
  39. 請求項３４に記載の方法に従って処理された、単離または培養された細胞。
  40. 多分化能造血細胞の増幅および／または生着の向上を必要とする患者に、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ；請求項２３、２４、２８、２９、３２、３３、３８、および３９のいずれか一項に記載の細胞；および請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のベクターの１つまたは複数を含んでなる治療薬を投与するステップを含んでなる、患者を治療する方法。
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