JP7150789B2 - Tmprss6遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 - Google Patents
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Description
2011年3月29日に出願された米国仮特許出願第61/468,830号明細書、および2011年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/568,942号明細書の本出願。これらの先行出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
一実施形態では、本明細書に記載されるiRNAは野生型TMPRSS6 RNA転写物を標的とし、別の実施形態では、iRNAは変異転写物(例えば対立遺伝子変異体を保有するTMPRSS6 RNA)を標的とする。例えば本発明で取り上げるiRNAは、TMPRSS6の一塩基多型(SNP:single nucleotide polymorphism)などの多型変異体を標的とし得る。別の実施形態では、iRNAは、野生型および変異TMPRSS6転写物の双方を標的とする。さらに別の実施形態では、iRNAは、TMPRSS6の転写変異体を標的とする。
一実施形態では、本発明で取り上げるiRNAは、例えば肝臓の肝実質細胞など、または例えば肥大性クッパー細胞などのクッパー細胞など、肝臓に送達される。
別の態様では、本発明で取り上げる実施形態は、一般にヒト対象である生物中で、TMPRSS6遺伝子の発現を阻害する医薬組成物を提供する。組成物は、典型的に、本明細書に記載されるiRNAの1つまたは複数、および薬学的に許容できる担体または送達ビヒクルを含む。一実施形態では、組成物は、例えばヘモクロマトーシスなどの鉄レベル増大を引き起こす障害を治療するのに使用される。例えば組成物は、中間型βサラセミアなどのサラセミアを治療するのに有用である。
(a)互いに相補的な少なくとも2つの配列を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)を細胞に導入するステップ。dsRNAは、第1の配列を有するセンス鎖と、第2の配列を有するアンチセンス鎖とを含み;アンチセンス鎖は、TMPRSS6をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的な相補性領域を有し、相補性領域は30ヌクレオチド以下、すなわち15~30ヌクレオチド長、一般に19~24ヌクレオチド長であり、dsRNAはTMPRSS6を発現する細胞との接触時に、TMPRSS6遺伝子の発現を少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%以上阻害するステップ;および
(b)ステップ(a)で生成された細胞をTMPRSS6遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のTMPRSS6遺伝子の発現を阻害するステップ。
別の態様では、本明細書は、以下のステップを実施することで、細胞中のTMPRSS6遺伝子の発現を調節する方法を提供する:
(a)互いに相補的な少なくとも2つの配列を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)を細胞に導入するステップ。dsRNAは、第1の配列を有するセンス鎖と、第2の配列を有するアンチセンス鎖とを含み;アンチセンス鎖は、TMPRSS6をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的な相補性領域を有し、相補性領域は30ヌクレオチド以下、すなわち15~30ヌクレオチド長、一般に19~24ヌクレオチド長であり、dsRNAはTMPRSS6を発現する細胞との接触時に、TMPRSS6遺伝子の発現を少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%以上調節するステップ;および
(b)ステップ(a)で生成された細胞をTMPRSS6遺伝子のmRNA転写物の分解および保護を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のTMPRSS6遺伝子の発現を調節するステップ。
便宜のため、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語と語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用法と、本節で提供されるその定義との間に明白な矛盾がある場合、本節の定義が優先されるものとする。
vivo)送達のために、iRNAを組織部位に注射し、または全身投与し得る。生体内送達はまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第5,032,401号明細書および米国特許第5,607,677号明細書、および米国特許公開第2005/0281781号明細書に記載されるものなどのβ-グルカン送達系によることもできる。細胞への生体外導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法を含む。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載され、または当該技術分野で公知である。
本明細書の用法では、「LNPXX」(式中、「XX」は数字である)という用語は、本明細書で「AFXX」とも称される。例えばLNP09はAF09とも称され、LNP12はAF12としてもまた知られており、またそのように言及される。
本明細書には、TMPRSS6遺伝子の発現を調節するiRNA剤が記載される。一実施形態では、iRNA剤は、例えばβサラセミアまたはヘマクロマトーシス(hemachromatosis)がある患者などの鉄レベル上昇を有するヒトなど、細胞または哺乳類において、TMPRSS6遺伝子の発現を阻害するための、二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、TMPRSS6遺伝子の発現中に形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、30ヌクレオチド長以下、一般に19~24ヌクレオチド長であり、dsRNAは、TMPRSS6遺伝子を発現する細胞との接触時に、例えばPCRまたは分枝DNA(bDNA)ベースの方法、またはウエスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、TMPRSS6遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する。一実施形態ではiRNA剤は、細胞または哺乳類中で、TMPRSS6遺伝子の発現を活性化する。COS細胞、HeLa細胞、初代培養肝細胞、HepG2細胞、初代培養細胞などの細胞培養物中の、または対象からの生物学的サンプル中のTMPRSS6遺伝子の発現は、bDNAまたはTaqMan(登録商標)アッセイなどによるTMPRSS6 mRNAレベルの測定によって、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用した免疫蛍光分析などによるタンパク質レベルの測定によって、アッセイし得る。
chemistry)」、ボーケージ(Beaucage),S.L.ら編、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley & Sons,Inc.)、米国ニューヨーク州ニューヨークなどに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって合成および/または修飾されてもよい。修飾としては、例えば(a)例えば5’末端修飾(リン酸化、共役結合、逆転結合)および3’末端修飾(共役結合、DNAヌクレオチド、逆転結合など)などの末端修飾;(b)例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去(脱塩基ヌクレオチド)、または共役結合塩基などの塩基修飾;(C)糖の修飾(例えば2’位または4’位における)または糖の置換;ならびに(d)リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なRNA化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するRNA、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないRNAが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するRNAとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾RNAもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。特定の実施形態では、修飾RNAは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
Concise Encyclopedia Of Polymer Science
And Engineering)」、p.858~859、クルシュヴィッツ(Kroschwitz),J.L編、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley & Sons)、1990年で開示されるもの、エングリッシュ(Englisch)ら著、アンゲヴァンテ ケミー(Angewandte Chemie),国際版(International Edition)、1991年、第30巻、p.613によって開示されるもの、およびサングヴィ(Sanghvi),Y S.著、第15章、「dsRNAの研究および応用(dsRNA Research and Aplications)」、p.289~302、クルック(Crooke),S.T.およびルブルー(Lebleu),B.編、CRCプレス(CRC Press)、1993年によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンをはじめとする、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2、N-6および0-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6~1.2℃増大させることが示されており(サングヴィ(Sanghvi),Y.S.著、クルック(Crooke),S.T.およびルブルー(Lebleu),B.編、「dsRNAの研究および応用(dsRNA Research and Aplications)」、CRCプレス(CRC Press)、ボカラトン(Boca Raton)、1993年、p.276~278)、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
Acids Research)、第31巻、第12号、p.3185~3193)。
Nucleotides)、1995年、第14巻、p.969~973);またはアダマンタン酢酸(マノハラン(Manoharan)ら著、テトラヘドロン レターズ(Tetrahedron Lett.)、1995年、第36巻、p.3651~3654);パルミチル部分(ミシュラ(Mishra)ら著、ビオキミカ ビオフィジカ アクタ(Biochim.Biophys.Acta)、1995年、第1264巻、p.229~237);またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分(クルック(Crooke)ら著、ジャーナル オブ ファーマコロジ エクスペリメンタル セラピューティクス(J.Pharmacol.Exp.Ther.)、1996年、第277巻、p.923~937)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
drug delivery)」、ポリマーズ フォー アドバンストテクノロジー(Polymers Adv.Technol.)、第13巻、p.992~999;カクド(Kakudo)、チャキ(Chaki)T.,S.ら著、2004年、「pH応答性融合ペプチドを備えたトランスフェリン修飾リポソーム:人工的ウイルス様送達系(Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive Fusogenic Peptide:An Artificial Viral-like Delivery System)」、バイオケミストリー(Biochemistry)、第436巻、5618-5628;イェシン(Yessine),M.A.およびルロー(Leroux),J.C.著、2004年、「膜不安定化ポリアニオン:脂質二重層と生体高分子との相互作用およびエンドソーム漏出(Membrane-destabilizing polyanions:interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules)」、アドバンスト ドラッグ デリバリー レビュー(Adv.Drug Deliv.Rev.)、第56巻、p.999~1021;オリベラ(Oliveira),S.、ヴァンローイ(van Rooy),I.ら著、2007年、「融合ペプチドはエンドソーム漏出を促進して、発がん遺伝子のiRNA誘導サイレンシングを改善する(Fusogenic peptides enhance endosomal escape improving iRNA-induced silencing of oncogenes)」、インターナショナルジャーナル オブ ファーマシ(Int.J.Pharm.)、第331巻、p.211~4にある。それらは、一般に、リポソームまたはリポプレックスなどの薬物送達システムの文脈で使用されている。例えばリポソーム製剤を使用する葉酸受容体媒介送達では、リポソームにpH感受性融合性ペプチドが組み込まれており、取り込み過程における薬剤の解放の改善を通じて、活性を高めることが示されている(ターク(Turk),M.J.、レディ(Reddy),J.A.ら著、2002年)。ビオキミカ ビオフィジカ アクタ(Biochim.Biophys.Acta)、第1559巻、p.56~68には、エンドソームpHで葉酸を標的とするリポソームから放出される薬剤の放出を促す新規なpH感受性ペプチドの特徴が記載されている。。
第1のアッセイがpH変化に応答する試験化合物単独の能力を評価し、第2のアッセイがpH変化に応答する試験化合物を含むモジュラー組成物の能力を評価する、二段階アッセイもまた実施し得る。
1つのリガンド中では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン(HSA)などの血清タンパク質と結合する。HSA結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。HSAに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばネプロキシンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)複合体の分解耐性を増大させ得て、(b)標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および/または(c)例えばHSAなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
本発明で使用するのに適するペプチドは、例えばtatまたはアンテナペディアペプチドなどの天然ペプチド、合成ペプチド、またはペプチド模倣薬であり得る。さらにペプチドは修飾ペプチドであり得て、例えばペプチドは、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびD-アミノ酸を含んでなり得る。ペプチド模倣薬(本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される)は、天然ペプチドに類似した、定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のiRNA剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、iRNAの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長など、約5~50アミノ酸長であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるiRNAオリゴヌクレオチドは、炭水化物複合体をさらに含んでなる。炭水化物複合体は、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、以下のいずれかの化合物を指す:各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも6個の炭素原子を有する(直鎖、分枝または環状であってもよい)1つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体;または各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、それぞれ少なくとも6個の炭素原子を有する(直鎖、分枝または環状であってもよい)1つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物。代表的炭水化物としては、糖類(単糖類、二糖類、三糖類、および約4~9個の単糖単位を含有するオリゴ糖類)、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、C5以上の(好ましくはC5~C8)糖類;2または3個の単糖単位(好ましくはC5~C8)を有する糖類をはじめとする、二糖類および三糖類が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体は、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、iRNAオリゴヌクレオチドに付着し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質(条件)の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第1の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第2の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第1および第2の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともある。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下)と比較して、細胞中(または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下)で、少なくとも2、4、10または100倍より迅速に切断される。
切断可能連結基の1つのクラスは、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール(DTT)、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。好ましい実施形態では、候補化合物は、血中で最大で10%切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下)と比較して、細胞中(または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下)で、少なくとも2、4、10または100倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断し得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、pH約6.5以下(例えば約6.0、5.5、5.0以下)の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞中では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pH細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式-C=NN-、C(O)O、または-OC(O)を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する(アルコキシ基)場合は、アリール基;置換アルキル基;またはジメチルペンチルまたはt-ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
エステルベースの切断可能連結基は、細胞中でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式-C(O)O-、または-OC(O)-を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞中でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸間に形成されて、オリゴペプチド(例えばジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基(-C(O)NH-)は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレン(alkynelene)間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質をもたらす特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質をもたらすペプチド結合(すなわちアミド結合)に限定され、アミド官能基全体は含まれない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-(式中、RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である)を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
それを必要とする対象へのiRNAの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。生体内送達は、例えばdsRNAなどのiRNAを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施し得る。代案としては、送達は、iRNAをコードして発現を誘導する、1つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施し得る。
一般に、核酸分子のあらゆる送達方法をiRNAで使用するために、適応させ得る(例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、アクタール(Akhtar)S.およびジュリアン(Julian)RL.著、1992年、トレンズ イン セルバイオロジー(Trends Cell.Biol.)、第2巻、第5号、p.139~144および国際公開第94/02595号パンフレットを参照されたい)。しかしiRNA分子を生体内に成功裏に送達するために検討することが重要な、3つの要素がある:(a)送達される分子の生物学的安定性、(2)非特異的効果の防止、および(3)送達される分子の標的組織内蓄積。iRNAの非特異的効果は、例えば組織(非限定的例として腫瘍)中への直接注射または移植などの局所投与によって、または調製品を局所的に投与にすることで、最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被ることもある、または作用物質を分解することもある、全身組織の作用物質への曝露を限定し、iRNA分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、iRNAが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による(トレンティーノ(Tolentino),MJ.ら著、2004年、レティーナ(Retina)、第24巻、p.132~138)、およびマウスにおける網膜下注射による(ライヒ(Reich),SJ.ら著、2003年、モレキュラービジョン(Mol.Vis.)、第9巻、p.210~216)、VEGF dsRNAの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるdsRNAの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ(ピル(Pille),J.ら著、2005年、モレキュラー セラピー(Mol.Ther.)、第11巻、p.267~274)、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た(キム(Kim),WJ.ら著、2006年、モレキュラー セラピー(Mol.Ther.)、第14巻、p.343~350;リー(Li),S.ら著、2007年、モレキュラー セラピー(Mol.Ther.)第15巻、p.515~523)。RNA干渉は、直接注射によるCNSへの(ドーン(Dorn),G.ら著、2004、ニュークレイック アシッズ(Nucleic Acids) 32:e49;タン(Tan),PH.ら著、2005年、ジーン セラピー(Gene Ther.)、第12巻、p.59~66;マキムラ(Makimura),H.ら著、2002年、BMCニューロサイエンス(BMC Neurosci.)、第3巻、p.18;シシュキナ(Shishkina),GT.ら著、2004年、ニューロサイエンス(Neuroscience)、第129巻、p.521~528;タッカー(Thakker),ER.ら著、2004年、米国科学アカデミー紀要、第101巻、p.17270~17275;アカネヤ(Akaneya),Y.ら著、2005年、ジャーナル オブ ニューロフィジオロジ(J.Neurophysiol.)、第93巻、p.594~602)、および鼻腔内投与による肺への(ハワード(Howard),KA.ら著、2006年、モレキュラー セラピー(Mol.Ther.)、第14巻、p.476~484;チャン(Zhang),X.ら著、2004年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(J.Biol.Chem.)、第279巻、p.10677~10684;ビトコ(Bitko),V.ら著、2005年、ネイチャー メディスン(Nat.Med.)、第11巻、p.50~55)局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、iRNAを全身的に投与するために、RNAは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て;どちらの方法も、生体内エンド-およびエキソ-ヌクレアーゼによるdsRNAの迅速な分解を防止するように作用する。RNAまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのiRNA組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってiRNA分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたApoBに対抗するiRNAがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でapoB mRNAノックダウンがもたらされた(サウチェック(Soutschek),J.ら著、2004年、ネイチャー(Nature)、第432巻、p.173~178)。iRNAのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。(マクナマラ(McNamara),JO.ら著、2006年、ネイチャー バイオテクノロジー(Nat.Biotechnol.)、第24巻、p.1005~1015)。代案の実施形態では、iRNAは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、iRNA分子(負に帯電)の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるiRNAの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、iRNAに結合され、またはiRNAを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る(例えばキム(Kim)SH.ら著、2008年、ジャーナル オブ コントロールド リリース(Journal of Controlled Release)、第129巻、第2号、p.107~116を参照されたい)。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にiRNAの分解をさらに防止する。カチオン性iRNA複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である(例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、ソレンセン(Sorensen),DR.ら著、2003年、ジャーナル オブ モレキュラー バイオトrジー(J.Mol.Biol)、第327巻、p.761~766;フェルマ(Verma),UN.ら著、2003年、クリニカル キャンサー リサーチ(Clin.Cancer Res.)、第9巻、p.1291~1300;ア-ノルド(Arnold),ASら著、2007年、ジャーナル オブ ハイパーテンション(J.Hypertens.)、第25巻、p.197~205を参照されたい)。iRNAの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、DOTAP(ソレンセン(Sorensen),DR.ら著、2003年,前出;フェルマ(Verma),UN.ら著、2003年,前出),オリゴフェクトアミン(Oligofectamine),“安定な核酸ー脂質粒子(solid nucleicacid lipidparticles)”(ツィマーマン(Zimmermann),TS.ら著、2006年、ネイチャー(Nature)、第441巻、p.111~114)、カルジオリピン(チェン(Chien),PY.ら著、2005年、キャンサー ジーン セラピー(Cancer Gene Ther.)、第12巻、p.321~328;パル(Pal),A.ら著、2005年、インターナショナル ジャーナル オブ オンコロジー(Int J.Oncol.)、第26巻、p.1087~1091)、ポリエチレンイミン(ボネ(Bonnet)ME.ら著、2008年、ファーマスーティカル リサーチ(Pharm.Res.)、8月16日オンライン先行発表;アイグナー(Aigner),A.著、2006年、ジャーナル オブ バイオメディスン&バイオテクノロジー(J.Biomed.Biotechnol.)、p.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)ペプチド(リュ-(Liu),S.著、2006年、モレキュラー ファーマコロジ(Mol.Pharm.)、第3巻、p.472~487)、およびポリアミドアミン(トナリア(Tomalia),DA.ら著、2007年、バイオケミカル ソサエティ トランザクション(Biochem.Soc.Trans.)、第35巻、p.61~67;ヨー(Yoo),H.ら著、1999年、ファーマスーティカル リサーチ(Pharm.Res.)、第16巻、p.1799~1804)が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、iRNAはシクロデキストリンと複合体を形成する。iRNAおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第7,427,605号明細書にある。
別の態様では、TMPRSS6遺伝子標的化iRNAは、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写単位から発現され得る(例えばクチュール(Couture),Aら著、TIG.、1996年、第12巻、p.5~10;スキラーン(Skillern),A.,ら著に付与された国際公開第00/22113号パンフレット;コンラッド(Conrad)に付与された国際公開第00/22114号パンフレット;およびコンラッド(Conrad)に付与された米国特許第6,054,299号明細書を参照されたい)。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性(数時間から数週間程度)または持続性(数週間から数ヶ月以上)であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る(ガスマン(Gassmann)ら著、米国科学アカデミー紀要1995年、第92巻、p.1292)。
バイオテクノロジー(Nat.Biotech.)、第20巻、p.1006~1010に記載される。
一実施形態では、iRNAと薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物が、本明細書で提供される。iRNAを含有する医薬組成物は、TMPRSS6の発現によって媒介される病理過程など、TMPRSS6遺伝子の発現または活性と関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一実施例は、例えば静脈内(IV)送達による、非経口送達を通じた、全身投与のために調合される組成物である。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましいこともある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用なこともある。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるiRNAが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性(例えばジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロリホスファチジル(distearolyphosphatidyl)コリン)、陰性(例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)およびカチオン性(例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA)が挙げられる。本発明で取り上げるiRNAは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成してもよい。代案としては、iRNAは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成してもよい。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはC1~20アルキルエステル(例えばイソプロピルミリスチン酸IPM)、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第6,747,014号明細書に詳述される。
薬物の調合のために研究され使用されているマイクロエマルション以外にも、多数の組織化界面活性剤の構造が存在する。これらとしては、単層、ミセル、二重層、および小胞が挙げられる。リポソームなどの小胞は、薬物送達の観点から、それらの特異性とそれらが提供する作用持続時間のために、高い注目を集めている。本発明での用法では、「リポソーム」という用語は、球状二重層または二重層群に配列された両親媒性脂質から構成される、小胞を意味する。
Forms)」より、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、1988年、p.285)。
一実施形態では、本発明で取り上げるTMPRSS6 dsRNAは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えばSPLP、pSPLP、SNALP、またはその他の核酸-脂質粒子を形成する。本明細書の用法では、「SNALP」という用語は、SPLPをはじめとする、安定核酸-脂質粒子を指す。本明細書の用法では、「SPLP」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドDNAを含んでなる核酸-脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質(例えばPEG脂質複合体)を含有する。SNALPおよびSPLPは、静脈内(i.v.)注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位(例えば部位投与から物理的に離れた部位)に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。SPLPとしては、国際公開第00/03683号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤-核酸複合体を含む「pSPLP」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約50nm~約150nm、より典型的に約60nm~約130nm、より典型的に約70nm~約110nm、最も典型的に約70nm~約90nmの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸-脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第5,976,567号明細書;米国特許第5,981,501号明細書;米国特許第6,534,484号明細書;米国特許第6,586,410号明細書;米国特許第6,815,432号明細書;および国際公開第96/40964号パンフレットで開示される。
LNP01
一実施形態では、リピドイドND98・4HCl(MW 1487)(その内容全体を参照によって本明細書に援用する、2008年3月26日に出願された米国特許出願第12/056,230号明細書を参照されたい)、コレステロール(シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich))、およびPEG-セラミドC16(アヴァンティ ポーラ リピッズ(Avanti Polar Lipids))を使用して、脂質-dsRNAナノ粒子(すなわちLNP01粒子)を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る:ND98、133mg/ml;コレステロール、25mg/ml;PEG-セラミドC16、100mg/ml。次にND98、コレステロール、およびPEG-セラミドC16の原液を例えば42:48:10のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約35~45%で最終酢酸ナトリウム濃度が約100~300mMになるように、(例えばpH5の酢酸ナトリウム中で)水性dsRNAと混合し得る。脂質-dsRNAナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばLipex Extruder(ノーザンリピッズ(Northern Lipids,Inc))などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン(例えば100nmカットオフ)を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3、または約pH7.4など、約pH7のリン酸緩衝食塩水(PBS:phosphate buffered saline)で交換し得る、
DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリン
DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン
PEG-DMG:PEG-ジジミリストイルグリセロール(C14-PEG、またはPEG-C14)(平均分子量2000のPEG)
PEG-DSG:PEG-ジスチリルグリセロール(C18-PEG、またはPEG-C18)(平均分子量2000のPEG)
PEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(平均分子量2000のPEG)
SNALP(1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA))を含んでなる調合物は、参照によって本明細書に援用する、2009年4月15日に出願された、国際公開第2009/127060号パンフレットに記載される。
例えば本発明で取り上げる核酸-脂質粒子で使用されるカチオン性脂質などの化合物のいずれもが、実施例でより詳細に記載される方法をはじめとする、既知の有機合成技術によって調製され得る。特に断りのない限り、全ての置換基は、以下に定義するとおりである。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる方法は、保護基の使用を要し得る。保護基の手順は、当業者に良く知られている(例えば「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」、グリーン(Green),T.W.ら著、Wiley-Interscience、ニューヨーク州ニューヨーク、1999年を参照されたい)。簡単に述べると、本発明の文脈では、保護基は、官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は官能基に付加されて、特定の反応中にその反応性をマスクし、次に除去されて元の官能基を曝露し得る。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して、付加して除去し得る。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる核酸脂質粒子は、式A、
(式中、R1およびR2は、独立してそれぞれ置換されていてもいなくてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、R3およびR4は、独立して低級アルキルであり、またはR3およびR4は、一緒になって置換されていてもいなくてもよい複素環を形成し得る)のカチオン性脂質を使用して調合される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、XTC(2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン)である。一般に、上の式Aの脂質は、特に断りのない限り全ての置換基が上で定義されるとおりである、以下の反応スキーム1または2によって作成されてもよい。
R1およびR2が独立して、それぞれ置換されていてもいなくてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、R3およびR4が独立して低級アルキルであり、またはR3およびR4が一緒になって、置換されていてもいなくてもよい複素環を形成し得る、脂質Aは、スキーム1に従って調製され得る。ケトン1および臭化物2は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。1と2の反応は、ケタール3をもたらす。ケタール3をアミン4で処理して、式Aの脂質を得る。式Aの脂質は、式5(式中、Xは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などから選択されるアニオン対イオンであるの有機塩によって、対応するアンモニウム塩に変換し得る。
代案としては、ケトン1出発原料は、スキーム2に従って調製され得る。グリニャール試薬6およびシアン化物7は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。6と7の反応は、ケトン1をもたらす。ケトン1の対応する式Aの脂質への変換は、スキーム1に記載されるとおりである。
DLin-M-C3-DMA(すなわち(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-(ジメチルアミノ)ブタン酸)の調製は、次のとおりであった。ジクロロメタン(5mL)中の(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール(0.53g)、4-N,N-ジメチルアミノ酪酸塩酸塩(0.51g)、4-N,N-ジメチルアミノピリジン(0.61g)、および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.53g)溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で、続いて希釈水性炭酸水素ナトリウムで洗浄した。無水硫酸マグネシウム上で有機画分を乾燥させ、濾過して、回転蒸発器上で溶媒を除去した。1~5%のメタノール/ジクロロメタン溶出勾配を使用して、残留物をシリカゲルカラム(20g)に通過させた。精製産物を含有する画分を合わせて溶媒を除去し、無色の油(0.54g)を得た。
以下のスキーム3を使用して、ケタール519[ALNY-100]の合成を実施した。
515の合成
ニ頚RBF(1L)内の撹拌される200mlの無水THF中のLiAlH4(3.74g、0.09852モル)懸濁液に、70mLのTHF中の514(10g、0.04926モル)の溶液を0 0Cにおいて窒素雰囲気下で緩慢に添加した。添加完了後、反応混合物を室温に加温し、次に加熱して4時間還流した、反応の進捗は、TLCによってモニターした。反応完了(TLCによる)後、混合物を0 0Cに冷却し、飽和Na2SO4溶液の注意深い添加によってクエンチした。反応混合物を室温で4時間撹拌し、濾過した。残留物をTHFで良く洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、400mLのジオキサンおよび26mLの濃HClで希釈して、室温で20分間撹拌した。揮発度(volatilities)を真空下で揮散して、515の塩酸塩を白色固体として得た。収量:7.12g 1H-NMR(DMSO,400MHz):δ=9.34(broad,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H). 516の合成
250mLニ頚RBF内の100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌される溶液に、NEt3(37.2mL、0.2669モル)を添加して、窒素雰囲気下で0 0Cに冷却した。50mLの乾燥DCM中のN-(ベンジルオキシ-カルボニルオキシ)-スクシンイミド(20g、0.08007モル)の緩慢な添加後、反応混合物が室温に暖まるまで放置した。反応完了後(TLCによる2~3時間)、混合物を1NのHCl溶液(1×100mL)および飽和NaHCO3溶液(1×50mL)で連続的に洗浄した。次に無水Na2SO4上で有機層を乾燥し、溶媒を蒸発させて粗製物を得て、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、516を粘着性塊として得た。収量:11g(89%).1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H).LC-MS [M+H]-232.3(96.94%).
517Aおよび517Bの合成
室温において、500mL一頚RBF内で、シクロペンテン516(5g、0.02164モル)を220mLアセトンと水(10:1)の溶液中に溶解し、それにN-メチルモルホリン-N-オキシド(7.6g、0.06492モル)を添加し、tert-ブタノール中の4.2mLの7.6%OsO4(0.275g、0.00108モル)溶液がそれに続いた。反応完了後(約3時間)、固体Na2SO3の添加によって混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をDCM(300mL)で希釈して、水(2×100mL)で洗浄し、飽和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)、最後に鹹水(1×50mL)が続いた。有機相を無水Na2SO4上で乾燥させて、真空中で溶媒を除去した。粗製物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製からジアステレオマー混合物を得て、それを予備HPLCによって分離した。
収量:-6g粗製
517A-ピーク-1(白色固体)、5.13g(96%).1H-NMR(DMSO,400MHz):δ=7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H).LC-MS-[M+H]-266.3,[M+NH4+]-283.5存在,HPLC-97.86%.立体化学はX線によって確認された。
化合物505の合成について記載されるものと類似の手順を使用して、化合物518を無色の油として得た(1.2g、41%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H).HPLC-98.65%.
化合物519の合成の基本手順
ヘキサン(15mL)中の化合物518(1eq)溶液をTHF中のLAH(1M,2eq)氷冷溶液に、滴下して添加した。添加完了後、混合物を40℃で0.5時間加熱し、次に氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和水性Na2SO4によって注意深く加水分解し、次にセライトを通して濾過して油に濃縮した。カラムクロマトグラフィーから、純粋な519を無色の油として得た(1.3g、68%)。13C NMR=130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1;エレクトロスプレーMS(+ve):C44H80NO2(M+H)+の分子量、 計算値654.6、測定値654.6.
標準法または押出のない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の様式で特性解析し得る。例えば製剤は、典型的に外観検査によって特徴付けられる。それらは凝集体または沈降物を含まない、白みがかった半透明溶液であるべきである。脂質-ナノ粒子の粒度および粒度分布は、例えばMalvern Zetasizer Nano ZS(マルバーン(Malvern),米国)を使用して、光散乱によって測定し得る。粒度は、40~100nmなど、約20~300nmであるべきである。粒度分布は、単峰型分布であるべきである。製剤ならびに封入画分中の総dsRNA濃度は、色素排除アッセイを使用して推定された。調合されたdsRNAのサンプルを例えば0.5%Triton-X100などの配合破壊性界面活性剤の存在または不在下で、Ribogreen(Molecular Probes)などのRNA結合色素と共にインキュベートし得る。製剤中の総dsRNAは、標準曲線と比較して、界面活性剤含有サンプルからのシグナルによって判定し得る。封入画分は、総dsRNA含量から、「遊離」dsRNA含量(界面活性剤不在下のシグナルにより測定される)を減じて求められる。封入dsRNA百分率は、典型的に>85%である。SNALP製剤では、粒度は、少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nm、および少なくとも120nmである。適切な範囲は、典型的に、少なくとも約50nmから少なくとも約110nm、少なくとも約60nmから少なくとも約100nm、または少なくとも約80nmから少なくとも約90nmである。
エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が0.1μmを超える小滴形態で、別の液体中に分散する1つの液体の不均一系である(例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系(Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)」、アレン(Allen),LV.、ポポビッチ(Popovich)NG.、およびアンセル(Ansel)HC.、2004年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Lippincott Williams & Wilkins)(第8版)、ニューヨーク州ニューヨーク;イドソン(Idson)著、「医薬剤形(Pharmaceutical Dosage Forms)」より、リーバーマン(Lieberman)、リーガ(Rieger)およびバンカー(Banker)編、1988年、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、第1巻、p.199;ロソフ(Rosoff)著、「医薬剤形(Pharmaceutical Dosage Forms)」より、リーバーマン(Lieberman)、リーガ(Rieger)およびバンカー(Banker)編、1988年、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、第1巻、p.245;ブロック(Block)著、「医薬剤形(Pharmaceutical Dosage Forms)」より、リーバーマン(Lieberman)、リーガ(Rieger)およびバンカー(Banker)編、1988年、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、第2巻、p.335;ヒグチ(Higuchi)ら著、「レミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、マック パブリッシング(Mack Publishing Co.)、ペンシルベニア州イートン(Easton,Pa.)、1985年、p.301を参照されたい)。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、2つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型(w/o)または水中油型(o/w)のいずれかであってもよい。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型(w/o)エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型(o/w)エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在してもよい、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在してもよい。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油(o/w/o)および水中油中水型(w/o/w)エマルションなどの場合、2つを超える相を含んでなる複数エマルションであってもよい。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でo/wエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、w/o/wエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、o/w/oエマルションを提供する。
Dosage Forms)」より、リーバーマン(Lieberman)、リーガ(Rieger)およびバンカー(Banker)編、1988年、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、第1巻、p.245;ブロック(Block)著、「医薬剤形(Pharmaceutical Dosage Forms)」より、リーバーマン(Lieberman)、リーガ(Rieger)およびバンカー(Banker)編、1988年、マルセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク州ニューヨーク、第1巻、p.335を参照されたい)。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
リサーチ(Pharmaceutical Research)、1994年、第11巻、p.1385;ホー(Ho)ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス(J.Pharm.Sci.)、1996年、第85巻、p.138~143を参照されたい)。マイクロエマルションは、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することが多い。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはiRNAを調合する場合に、特に有利なこともある。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、iRNAおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにiRNAおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にiRNAの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過することがあることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
delivery)」、Informa Health Care、ニューヨーク州ニューヨーク、2002年;リー(Lee)ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)、1991年、p.92を参照されたい)。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
Systems)、1991年、p.92;ムラニシ(Muranishi)著、治療薬剤送達システムの批判的な批評(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)、1990年、第7巻、p.1~33;エルハリリ(El Hariri)ら著、ジャーナル オブ ファーマシ&ファーマコロジ(J.Pharm.Pharmacol.)、1992年、第44巻、p.651~654を参照されたい)。
in drug delivery)」、Informa Health Care、ニューヨーク州ニューヨーク、2002年,ブラントン(Brunton)著、第38章、「グッドマン&ギルマンの治療学の薬理学的基礎(Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics)」、第9版より、ハードマン(Hardman)ら編、マグロウヒル(McGraw-Hill)、ニューヨーク、1996年、p.934~935を参照されたい)。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸(またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム(STDHF:sodium tauro-24,25-dihydrofusidate)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル(POE)が挙げられる。(例えばマルムステン(Malmsten),M.著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー(Surfactants and polymers in drug delivery)」、インフォルマ ヘルスケア(Informa Health Care)、ニューヨーク州ニューヨーク、2002年;リー(Lee)ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)、1991年、p.92;スウィンヤード(Swinyard)著、第39章、「レミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、第18版より、ジェンナロ(Gennaro)編、マック パブリッシング(Mack Publishing
Co.)、ペンシルベニア州イートン(Easton,Pa.)、1990年、p.782~783;ムラニシ(Muranishi)著、治療薬剤送達システムの批判的な批評(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)、1990年、第7巻、p.1~33;ヤマモト(Yamamoto)ら著、ジャーナル オブ エクスペリメンタル セラピューティックス(J.Pharm.Exp.Ther.)、1992年、第263巻、p.25;ヤマシタ(Yamashita)ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス(J.Pharm.Sci.)、1990年、第79巻、p.579~583を参照されたい)。
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性(すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない)であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートdsRNAの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック(polycytidic)または4-アセトアミド-4’-イソチオシアノ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る(ミヤオ(Miyao)ら著、DsRNAリサーチ&ディベロップメント(Res.Dev.)、1995年、第5巻、p.115~121;タカムラ(Takakura)ら著、DsRNA&ニュークレイック アシッド ドラッグ ディベロップメント(DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.)、1996年、第6巻、p.177~183。
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、1つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤(例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);増量剤(例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有してもよい。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有してもよく、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有してもよい。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および/または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
本発明は、TMPRSS6媒介障害または疾患を治療するための、TMPRSS6標的化iRNA、およびこのような少なくとも1つのiRNAを含有する組成物の使用に特に関する。例えばサラセミア、(例えば中間型βサラセミアまたはαサラセミア)、原発性ヘモクロマトーシス、二次性ヘモクロマトーシス、重度若年型ヘモクロマトーシス、鉄芽球性貧血、溶血性貧血、異常造血性貧血、または鎌状赤血球貧血などの鉄レベル上昇と関連する障害を治療するために、TMPRSS6遺伝子標的化iRNAを含有する組成物が使用される。一実施形態では、TMPRSS6 iRNAを使用して異常ヘモグロビン症を治療する。本発明で取り上げるTMPRSS6 iRNAはまた、慢性アルコール依存症などのその他の病状に起因する、鉄レベル上昇を治療するのに使用される。
患者には、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、または2.5mg/kgのdsRNAなどの治療量のiRNAを投与し得る。iRNAは、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間などを超える時間にわたる、静脈輸液によって投与し得る。投与は、例えば1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月以上などにわたり隔週(すなわち2週毎)で、定期的に繰り返される。最初の治療計画の後に、治療はより低い頻度で行い得る。例えば3ヶ月にわたる隔週の投与後、6ヶ月または1年以上にわたり月に1回投与を反復し得る。iRNA投与は、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の区画中のTMPRSS6レベルを少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%以上低下させ得る。
TMPRSS6遺伝子の発現を調節する方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳類においてTMPRSS6遺伝子の発現を調節(例えば阻害または活性化)する方法を提供する。
実施例1.干渉RNA(iRNA)合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示さない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質/純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
出願人らは、いくつかの異なる方法を使用して、本明細書に記載されるiRNA分子を作成した。本実施例は、使用した1つのアプローチを記載する。当業者は、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、本明細書に記載されるようなiRNAを調製し得る。
ニュークレイックアシッド テクノロジーズ(Pierce Nucleic Acids Technologies))をオリゴヌクレオチド合成のために使用した。2’-Fホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトは、(プロメガ(Promega))から購入された。グアノシンが10%THF/ANC(v/v)中で0.2Mの濃度で使用される以外は、全てのホスホラミダイトは、アセトニトリル(CH3CN)中で0.2Mの濃度で使用される。16分間のカップリング/リサイクル時間が、使用される。活性化剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、アメリカン インターナショナル ケミカルズ(American International Chemicals))であり;PO-酸化ではヨウ素/水/ピリジンが使用され、PS-酸化ではPADS(2%)in2,6-ルチジン/ACN(1:1v/v)が使用される。
Technologies)から購入された、対応するQuasar-570(Cy-3)ホスホラミダイトから合成される。5’末端および/または内部位置へのリガンドの共役結合は、適切に保護されたリガンド-ホスホラミダイト基本単位を使用することで得られる。5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール活性化剤存在下で、無水CH3CN中の0.1Mホスホラミダイト溶液を、固体支持体結合オリゴヌクレオチドに、15分間の長時間にわたりカップリングさせる。ヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化は、報告される(1)標準的なヨウ素-水を使用して、またはtert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水(10:87:3)を用いて、10分間の酸化待機時間で、共役結合オリゴヌクレオチドを処理して、行われる。ホスホロチオエートは、DDTT(AMケミカルズ(AM Chemicals)から購入)、PADSおよびまたはビューケージ(Beaucage)試薬などのイオウ転移試薬を使用して、亜リン酸エステルをホスホロチオエートに酸化することでに導入される。コレステロールホスホラミダイトは施設内で合成され、ジクロロメタン中の0.1Mの濃度で使用される。コレステロールホスホラミダイトのカップリング時間は、16分間である。
合成完了後、支持体を100mLガラスボトル(VWR)に移す。80mLのエタノール性アンモニア[アンモニア:エタノール(3:1)]混合物を55℃で6.5時間用いて、塩基とリン酸基の同時脱保護により、オリゴヌクレオチドを支持体から切断する。氷上でボトルを短時間冷却し、次にエタノール性アンモニア混合物を新しい250mLボトル内に濾過する。CPGを2×40mL量のエタノール/水(1:1v/v)で洗浄する。次に混合物の体積をroto-vapで約30mLに減少させる。次に混合物をドライアイス上で凍結し、speed vac上で真空乾燥する。
乾燥残渣を26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF)またはピリジン-HFおよびDMSO(3:4:6)に再懸濁し、60℃で90分間加熱して、2’位置のブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去する。次に反応を50mLの20mM酢酸ナトリウムでクエンチし、pHを6.5に調節する。オリゴヌクレオチドは、精製まで冷凍庫で保存する。
オリゴヌクレオチドは、精製に先だって高速液体クロマトグラフィー(HPLC:high-performance liquid chromatography)によって分析され、緩衝液およびカラムの選択は、配列および/または結合リガンドの性質に左右される。
リガンド結合オリゴヌクレオチドは、逆相分取HPLCによって精製される。非結合オリゴヌクレオチドは、施設内で充填されたTSKゲルカラム上のアニオン交換HPLCによって精製される。緩衝液は、10%CH3CN中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)、および10%CH3CN、1M NaBr中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液B)である。完全長オリゴヌクレオチド含有画分をプールして脱塩し、凍結乾燥する。ほぼ0.15 ODの脱塩したオリゴヌクレオチドを水で150μLに希釈し、次にCGEおよびLC/MS分析のための特殊バイアル内にピペットで移す。次に化合物をLC-ESMSおよびCGEによって分析する。
iRNAの一般的調製のために、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を1×PBS中で5分間95℃に加熱し、室温に緩慢に冷却する。二本鎖の完全性はHPLC分析によって確認される。
テーブル1:核酸配列の表現で使用されるヌクレオチドモノマー略号。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、5’-3’-リン酸ジエステル結合によって相互に連結するものと理解される。
実施例2.TMPRSS6 siRNAデザイン
転写物
TMPRSS6標的化siRNAをデザインして合成した。デザインは、NCBI Refseqコレクションからのヒト転写物NM_153609.2(配列番号1、図1)を使用した。
合計655本のセンス、および655本のアンチセンスヒトTMPRSS6由来siRNAオリゴをデザインした。オリゴは、テーブル2に提示される。追加的なセンスおよびアンチセンスヒトTMPRSS6由来siRNAオリゴは、テーブル3に提示される。修飾されたセンスおよびアンチセンスヒトTMPRSS6由来siRNAオリゴは、テーブル4に提示される。
センス鎖中の全てのピリミジン(シトシンおよびウリジン)は、2’-O-メチル塩基(2’O-メチルCおよび2’-O-メチルU)を含有した。
センスおよびアンチセンス配列の双方の3’末端に、2塩基dTsdT伸長を導入し得る。
合成、切断、および脱保護
TMPRSS6配列の合成は、ホスホラミダイト化学を使用する、固体支持体オリゴヌクレオチド合成を使用した。
全ての配列は、Source 15Qカラムを使用して、AKTA explorer精製システム上で精製し得る。サンプル注入および収集は、96ウェル(1.8mL深型ウェル)プレート内で実施し得る。完全長配列に対応する単一ピークを溶出剤中に収集し得る。精製配列は、AKTA purifierを使用してSephadex G25カラム上で脱塩し得る。脱塩したTMPRSS6配列は、濃度(A260でのUV測定による)および純度(イオン交換HPLCによる)について分析し得る。次に一本鎖をアニーリングで使用し得る。
生体外でTMPRSS6発現をノックダウンする能力について、TMPRSS6 siRNA二本鎖をスクリーニングした。単回投与スクリーニング、用量応答スクリーニング、および宿主細胞生存度を評価した。
単回投与および用量応答研究のための細胞培養および形質移入:
5%CO2雰囲気内で37℃において、10%FBS、ストレプトマイシン、およびグルタミン(ATCC)を添加したX(ATCC)中で、HeLaまたはHep3B細胞(ATCC,バージニア州マナサス(Manassas,VA))をコンフルエンス近くに培養してから、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。96ウェルプレート内で、ウェルあたり5μlのsiRNA二本鎖に、ウェルあたり14.8μlのOpti-MEM+0.2μlのLipofectamine RNAiMax(インビトロジェン(Invitrogen),カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad CA);カタログ番号13778-150)を添加して室温で15分間インキュベートし、形質移入を実施した。次に約2×104個のHeLaまたはHep3B細胞を含有する、抗生物質を含まない80μlの完全増殖培地をsiRNA混合物に添加した。RNA精製に先だって、細胞を24または120時間のいずれかにわたり培養した。単回投与実験を10nMおよび0.1nMの最終二本鎖濃度で実施し、用量応答実験を10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001nMの最終二本鎖濃度で実施した。
細胞を収集して150μlの溶解/結合緩衝液溶解し、次にEppendorf(登録商標)Thermomixerを使用して、850rpmで5分間混合した(混合速度は、処理全体にわたり同一であった)。10マイクロリットルの磁性ビーズと80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、1分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、5分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を添加して、70℃で5分間混合した。ビーズを磁石上で5分間捕捉した。40μlの上清を除去して、別の96ウェルプレートに入れた。
反応あたり、2μlの10×緩衝液、0.8μlの25×dNTP、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害剤、および3.2μlのH2Oのマスターミックスを10μlの全RNAに添加した。cDNAは、以下のステップを通じて、Bio-RadC-1000またはS-1000サーマルサイクラー(カリフォルニア州ハーキュリーズ(Hercules,CA))を使用して作成した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間、4℃で保持。
50枚の384ウェルプレート内で、ウェルあたり0.5μlのGAPDH TaqMan Probe(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems);カタログ番号4326317E)、0.5μlのTMPRSS6 TaqMan Probe(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems);カタログ番号Hs00542184_m1)、および5μlのLightcycler 480 Probeマスターミックス(ロシュ(Roche);カタログ番号04887301001)(ロシュ(Roche);カタログ番号04887301001)を含有するマスターミックスに、2μlのcDNAを添加した。ΔΔCt(RQ)アッセイを使用して、ABI7900HTリアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))内で、リアルタイムPCRを実施した。各二本鎖は、2つの独立した形質移入で試験され、要約表で特に断りのない限り、各形質移入は複製でアッセイされた。
テーブル5は、TMPRSS6標的化siRNAで形質移入されたHep3B細胞中のTMPRSS6ノックダウンを示すデータを提示する。データは、陰性対照siRNA、AD-1955で形質移入された細胞と比較した、TMPRSS6標的化siRNAで形質移入された細胞中に残存するTMPRSS6メッセージの割合として表される。未処理細胞(「未感作」細胞)が、第2の陰性対照の役割を果たした。全てのsiRNAは少なくとも2回試験して、qPCR反応もまた複製で実施した。単回投与実験は、10nMおよび0.1nMの最終siRNA二本鎖濃度で実施した。
生体外用量応答スクリーニングにおける選択TMPRSS6 siRNA二本鎖のIC50
テーブル6は、生体外用量応答スクリーニングから判定された、選択TMPRSS6 siRNA二本鎖のIC50値を提示する。Hep3B細胞中の形質移入に続く1および5日目の用量応答におけるTMPRSS6ノックダウン活性について、10nMおよび0.1nM単回投与スクリーニングで有効なTMPRSS6 siRNA二本鎖(テーブル5)を試験した。用量応答実験は、10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001nMの最終siRNA二本鎖濃度で実施した。正規化のために、非標的化対照AD-1955と、または試験した各二本鎖の最低siRNA濃度で得られる値と比較して、TMPRSS6のノックダウンを測定した。
TMPRSS6 siRNA二本鎖で形質移入されたHeLaおよびHEP3B細胞系の生体外生存度スクリーニング
テーブル7は、TMPRSS6 siRNA二本鎖で形質移入されたHeLaおよびHEP3B細胞系の生存度データを提示する。生存度データは、平均生蛍光単位として表され、そこではより小さな値は、生存度の低下を表す。誤差は、3つの複製形質移入からの標準偏差として表される。
実施例4.TMPRSS6 siRNA二本鎖手動選択
さらなる生体内実験で使用するための特定のTMPRSS6 siRNAを選択するために、化学修飾siRNAをHEP3Bヒト肝腫瘍細胞に形質移入し、TMPRSS6遺伝子サイレンシング活性についてスクリーニングした。予測されるオフターゲット可能性が最小で、ヒト カニクイザル、ラット、およびマウスをはじめとする多種反応性がある、2つの高度に強力なsiRNAを生体内評価のために選択した。2つの選択されたTMPRSS6 siRNAの効力はまた、マウス初代培養肝細胞中でも確認され、TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)およびTMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)は、どちらも強力なTMPRSS6遺伝子サイレンシング活性を実証し、TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)は、70pMのIC50を示し(図2A)、TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)は、140pMのIC50を示した(図2B)。
WT C57BL/6マウスにおけるTMPRSS6およびHAMP1 mRNA発現に対するTMPRSS6 siRNAの効果
生体内におけるLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)およびLNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)の効果を評価するために、8週齢のメスWT C57BL/6マウスに、尾静脈IV注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)またはLNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)またはLNP-AD-19551(非哺乳類遺伝子ルシフェラーゼ標的化siRNA)を投与した。TMPRSS6 siRNAはLNP11(MC3)と配合された。投与の24時後にマウスを殺処分して肝臓を取り出し、急速冷凍して粉末に粉砕した。少量(約20mg)の肝臓粉末を溶解緩衝液中で破壊して、TaqMan(登録商標)によるmRNA分析のために使用した。群あたり合計5匹のマウスを使用した。データは、β-アクチンmRNAと比較した、標的TMPRSS6 mRNAのLNP-Luc対照比の百分率として表される。図3Aに示されるように、LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)およびLNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)による、肝臓TMPRSS6 mRNA発現の特異的かつ強力な用量依存的阻害があり(データは平均値+/-標準偏差を表す)、それぞれ0.035mg/kgのED50、および0.18mg/kgのED50があった。図3Bで示されるように、LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)およびLNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)による、肝臓HAMP1 mRNA発現の用量依存的阻害もあった。
TMPRSS6およびHAMP1遺伝子発現のTMPRSS6 siRNA媒介ノックダウンの持続期間を評価するために、8週齢のWT C57BL/6マウスに、尾静脈IV注射を通じて、単回1mg/kg用量のLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照(LNP-AD-1955)、またはPBSを投与し;全てのsiRNA剤は、LNP11製剤として送達された。マウスを6時間、24時間、48時間、3日、7日、および14日目に殺処分した。TaqMan(登録商標)アッセイを使用して、肝臓におけるTMPRSS6およびHAMP1のmRNA発現レベルを分析し、β-アクチンに正規化した。群あたり5匹のマウスを使用して、データは平均値+/-標準偏差として図4に表される。図4に示されるように、LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)の1mg/kg単回投与は、早くも投与後6時間目にTMPRSS6 mRNA発現をノックダウンし、2週間の期間中、TMPRSS6 mRNA発現をLNP-Luc対照またはPBS対照のほぼ90%に低下させた。HAMP1遺伝子の発現は、投与後24時間に始まって増大し、2週間の期間中維持され、投与後14日目に最大の対照の200%に増大した(図4)。これに加えて、Olympus AU 400を使用して、血清鉄レベルをトランスフェリン(Tf)飽和の百分率としてアッセイした。トランスフェリン飽和のレベルは、血清鉄と総鉄結合能(TIBC)の比率として計算され、トランスフェリン飽和の百分率として表される。トランスフェリン飽和百分率は、投与後24時間に始まってほぼ50%に低下し、2週間の期間にわたって維持され、血清中の循環鉄レベルが低下したことが示唆された(図4)。WT C57BL/6マウスにおけるHAMP1遺伝子発現と血清鉄レベルに対する、TMPRSS6 siRNA媒介効果を維持するのに必要な、TMPRSS6 siRNA媒介TMPRSS6サイレンシングのレベル。
ヘモグロビン(HGB)およびヘマトクリットをはじめとする血液学的パラメータに対する、TMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;WT C57BL/6マウスに、1mg/kg単回投与のTMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与し;引き続いて、最高2週間の投与後の異なる時点で殺処分した。Advia 120分析器を使用して、ヘモグロビン(HGB)、ヘマトクリット、平均赤血球容積(MCV:mean corpuscular volume)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH:mean corpuscular hemoglobin)、平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC:mean corpuscular hemoglobin concentration)、および網状赤血球ヘモグロビン含量(Chr)をはじめとする、血液学的パラメータをアッセイした。図6Aおよび6Bに示されるように、Th3/+マウス中のTMPRSS6のサイレンシングは、WT C57BL/6マウスにおいてHGB低下(図6A)、およびヘマトクリット低下(図6B)をもたらした。平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)、および網状赤血球ヘモグロビン含量(Chr)に対しても同様の効果があった。
サラセミアのマウス(Th3/+)における血清鉄パラメータに対するTMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果
サラセミアのマウス(Th3/+)における、鉄レベル、不飽和鉄結合能(UIBC:unsaturated iron-binding capacity)、およびTf飽和をはじめとする血清鉄パラメータに対する、TMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために、6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与し、投与後2週間目にマウスを殺処分した。群あたり5匹のマウスを使用して、データは平均値+/-標準偏差として図7に表され、**はp値<0.01および***はp値<0.001を示す。図7に示されるように、Th3/+マウスにおけるTMPRSS6のサイレンシングは、対照PBS群と比較して、血清鉄、UIBC、およびTf飽和に有意な低下をもたらした。
サラセミアのマウス(Th3/+)における網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量(CHr)、および赤血球数(RBC:red blood cell)をはじめとする、網状赤血球および赤血球パラメータに対するTMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与し、投与後2週間目にマウスを殺処分した。Advia 120分析器を使用して網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量(CHr)、および赤血球数(RBC)をはじめとする、網状赤血球および赤血球パラメータをアッセイした。群あたり5匹のマウスを使用して、データは平均値+/-標準偏差として図8A~8Cに表され、**はp値<0.01および***はp値<0.001を示す。それぞれ図8Aおよび8Bに示されるように、Th3/+マウスにおけるTMPRSS6のサイレンシングは、網状赤血球数ならびに網状赤血球(Chr)のヘモグロビン含量の有意な低下をもたらした。これに加えて、Th3/+マウスにおけるTMPRSS6のサイレンシングは、成熟赤血球(RBC)数の有意な増大をもたらし(図8C)、無効造血、髄外造血、および赤血球産生の有意な改善を実証した。
サラセミアのマウス(Th3/+)における、ヘマトクリット(HCT)、ヘモグロビン(HGB)、赤血球分布幅(RDW)、および平均赤血球容積(mean corpuscle value)(MCV)をはじめとする血液学的パラメータに対する、TMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与し、投与後2週間目にマウスを殺処分した。Advia 120分析器を使用して、ヘマトクリット(HCT)、ヘモグロビン(HGB)、赤血球分布幅(RDW)、および平均赤血球容積(mean corpuscle value)(MCV)をはじめとする、血液学的パラメータ(paramters)をアッセイした。群あたり5匹のマウスを使用して、データは平均値+/-標準偏差として図9に表され、**はp値<0.01および***はp値<0.001を示す。Th3/+マウスにおけるTMPRSS6のサイレンシングは、HCT(図9A)の有意な増大、HGBの有意な増大(図9B)、RDWの有意な低下(図9C)、およびMCVの有意な低下(図9D)をもたらした。図9に提示されるデータは、これらの血液学的パラメータにおける、LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)投与後のβサラセミア表現型の正常化を示す。
サラセミアのマウス(Th3/+)における、末梢血形態学に対するTMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)またはLNP-Luc対照を投与して、投与後2週間目にマウスを殺処分した。10×倍率でのメイ・グリュンワルド/ギムザ(Gimsa)染色は、対照と比較して、TMPRSS6 siRNAで処置されたTh3/+マウスにおける多染性の著しい低下を示し、これは網状赤血球数の低下、ならびに成熟赤血球形態学の正常化に向けた全体的傾向を代表する。10×倍率でのメイ・グリュンワルド/ギムザ(Gimsa)染色はまた、WT対照動物と比較して、WTTMPRSS6 siRNA動物によって誘発される、軽微な赤血球大小不同症も示した。
サラセミアのマウス(Th3/+)における、脾臓構造に対するTMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与して、投与後2週間目にマウスを殺処分した。10×倍率でのヘマトキシリン・エオジン(H & E)染色は、対照と比較して、TMPRSS6 siRNAで処置されたTh3/+マウスが、類洞髄外造血の低下および白髄小節の再出現をはじめとする、脾臓構造の正常化を有したことを示した。
サラセミアのマウス(Th3/+)における、脾臓および肝臓鉄含量に対するTMPRSS6のTMPRSS6 siRNA媒介サイレンシングの効果を評価するために;6週齢のTh3/+マウスに、尾静脈注射を通じて、1mg/kgのLNP-TMPRSS6
siRNA-1(AD-46273)、またはLNP-Luc対照、またはPBSを投与して、投与後2週間目にマウスを殺処分した。群あたり5匹のマウスを使用して、データは平均値+/-標準偏差として図10A~10Cに表され、**はp値<0.01および***はp値<0.001を示す。Th3/+マウスにおけるTMPRSS6のサイレンシングは、脾臓鉄含量および脾臓重量の有意な低下をもたらし(それぞれ図10Aおよび図10B)、髄外造血の正常化が示唆された。肝臓鉄含量の低下に向かう傾向もまた観察されたが、統計的に有意でなかった(図10C)。
当業者は、通例の実験法をのみ使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識または見極めることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
(付記)
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、記載する。
(項目1)
TMPRSS6発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、テーブル2、3または4に列挙されたアンチセンス配列の1つと3ヌクレオチド以下で異なる少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含んだ、TMPRSS6転写物との相補性領域を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。
(項目2)
前記dsRNAが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目3)
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、および、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目2に記載のdsRNA。
(項目4)
前記修飾ヌクレオチドが、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される、項目2に記載のdsRNA。
(項目5)
前記相補性領域が、少なくとも17ヌクレオチド長である、項目1に記載のdsRNA。(項目6)
前記相補性領域が、19~21ヌクレオチド長である、項目1に記載のdsRNA。
(項目7)
前記相補性領域が、19ヌクレオチド長である、項目1に記載のdsRNA。
(項目8)
各鎖が30ヌクレオチド長以下である、項目1に記載のdsRNA。
(項目9)
少なくとも1本の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目10)
少なくとも1本の鎖が、少なくとも2ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目11)
リガンドをさらに含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目12)
前記リガンドが、前記dsRNAの前記センス鎖の3’末端に結合する、項目11に記載のdsRNA。
(項目13)
前記相補性領域が、テーブル2、3または4のアンチセンス配列の1つからなる、項目1に記載のdsRNA。
(項目14)
前記dsRNAが、テーブル2、3または4から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、テーブル2、3または4から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目15)
項目1に記載のdsRNAを含有する細胞。
(項目16)
項目1に記載のdsRNAを含む、TMPRSS6遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
(項目17)
脂質製剤をさらに含む、項目16に記載の医薬組成物。
(項目18)
前記脂質製剤が、SNALP、またはXTC調合物である、項目17に記載の医薬組成物。
(項目19)
(a)項目1に記載のdsRNAを細胞に導入するステップと;
(b)ステップ(a)で生成された細胞をTMPRSS6遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のTMPRSS6遺伝子の発現を阻害するステップと
を含む、細胞中でTMPRSS6発現を阻害する方法。
(項目20)
前記TMPRSS6の発現が、少なくとも30%阻害される、項目19に記載の方法。
(項目21)
項目1に記載のdsRNAまたは項目16~18のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量をこのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む、TMPRSS6発現によって媒介される障害を治療する方法。
(項目22)
前記ヒトが、ヘモクロマトーシスと関連する障害を有する、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記ヒトが、βサラセミアを有する、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記ヒトが、中間型βサラセミアを有する、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記対象への前記dsRNAの投与が、前記対象の血清中鉄の少なくとも10%の低下を引き起こす、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記dsRNAが、0.01mg/kg~5mg/kg対象体重の濃度で投与される、項目21に記載の方法。
(項目27)
dsRNAの少なくとも1本の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAがTMPRSS6をコードするmRNAの少なくとも一部との相補性領域を含み、前記dsRNAが30塩基対以下の長さであり、前記dsRNAが前記mRNAを切断標的とする、ベクター。
(項目28)
前記相補性領域が、少なくとも15ヌクレオチド長である、項目27に記載のベクター。(項目29)
前記相補性領域が、19~21ヌクレオチド長である、項目27に記載のベクター。
(項目30)
項目27に記載のベクターを含む細胞。
(項目31)
配列番号111、配列番号455、配列番号109、配列番号524、配列番号89、配列番号494、配列番号445、配列番号592、配列番号47、および配列番号540からなる群から選択される配列からなる、センス鎖と;配列番号112、配列番号456、配列番号110、配列番号525、配列番号90、配列番号495、配列番号446、配列番号593、配列番号48、および配列番号541からなる群から選択される配列からなる、アンチセンス鎖とを含む、項目1に記載のdsRNA。
Claims (22)
- 細胞中のTMPRSS6発現を阻害するための二本鎖RNAi剤であって、
二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列AGAAUGAACCAGAAGAAGC(配列番号110)と3ヌクレオチド以下で異なる少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含み、
各鎖が、独立して15~30ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、
少なくとも1本の鎖がリガンドに結合している、二本鎖RNAi剤。 - 細胞中のTMPRSS6発現を阻害するための二本鎖RNAi剤であって、
二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列AGAAUGAACCAGAAGAAGC(配列番号110)と3ヌクレオチド以下で異なる少なくとも16個の連続ヌクレオチドを含み、
各鎖が、独立して16~30ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、
少なくとも1本の鎖がリガンドに結合している、二本鎖RNAi剤。 - 各鎖が、独立して15~25ヌクレオチド長である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。
- 各鎖が、独立して19~24ヌクレオチド長である、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 各鎖が、独立して19~21ヌクレオチド長である、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 各鎖が、30ヌクレオチド長である、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 各鎖が、独立して16~25ヌクレオチド長である、請求項2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ修飾ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、および2’-アミノ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。
- 少なくとも1本の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。
- 前記剤が、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。
- 前記リガンドが、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。
- 請求項1に記載の剤を含む、TMPRSS6遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
- 請求項2に記載の剤を含む、TMPRSS6遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
- TMPRSS6発現によって媒介される障害を有するヒト対象を治療する方法に使用するための、請求項1もしくは2に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項14もしくは15に記載の医薬組成物。
- 前記ヒトが、ヘモクロマトーシスと関連する障害を有する、請求項16に記載の二本鎖RNAi剤または医薬組成物。
- 前記ヒトが、βサラセミアを有する、請求項16に記載の二本鎖RNAi剤または医薬組成物。
- 前記ヒトが、中間型βサラセミアを有する、請求項16に記載の二本鎖RNAi剤または医薬組成物。
- 前記二本鎖RNAi剤が、皮下または静脈内投与される、請求項16に記載の二本鎖RNAi剤または医薬組成物。
- 細胞中のTMPRSS6発現を阻害する方法に使用するための二本鎖RNAi剤または医薬組成物であって、前記方法が、
(a)請求項1に記載の二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入するステップと;
(b)ステップ(a)で生成された細胞をTMPRSS6遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のTMPRSS6遺伝子の発現を阻害するステップとを含む、
請求項1もしくは2に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項14もしくは15に記載の医薬組成物。 - 前記TMPRSS6の発現が、少なくとも30%阻害される、請求項21に記載の二本鎖RNAi剤または医薬組成物。
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EP3598995A1 (en) * | 2018-07-26 | 2020-01-29 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
WO2020038377A1 (zh) | 2018-08-21 | 2020-02-27 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途 |
US11896674B2 (en) | 2018-09-30 | 2024-02-13 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof |
CN111973619B (zh) * | 2019-05-23 | 2024-01-30 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 |
IL307926A (en) | 2021-04-26 | 2023-12-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Transmembrane assemblies, serine 6 ((TMPRSS6 IRNA) and methods of using them |
AU2022265493A1 (en) | 2021-04-27 | 2023-09-21 | Silence Therapeutics Gmbh | Sirna targeting tmprss6 for the treatment of myeloproliferative disorders |
TW202400193A (zh) | 2022-06-24 | 2024-01-01 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | 抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(tmprss6)表現的組成物及方法 |
WO2024060649A1 (zh) * | 2022-09-29 | 2024-03-28 | 广州必贝特医药股份有限公司 | 用于抑制TMPRSS6基因表达的siRNA或其盐、药物及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090192104A1 (en) | 2002-02-20 | 2009-07-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1 (HIF1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2009134487A2 (en) | 2008-01-31 | 2009-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene |
WO2010148013A2 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene |
JP2011505425A (ja) | 2007-12-04 | 2011-02-24 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドの送達剤としての糖質コンジュゲート |
Family Cites Families (241)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US564562A (en) | 1896-07-21 | Joseph p | ||
US513030A (en) | 1894-01-16 | Machine for waxing or coating paper | ||
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
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US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
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US4920016A (en) | 1986-12-24 | 1990-04-24 | Linear Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
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US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
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US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
GB8824593D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Liposomes |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5032401A (en) | 1989-06-15 | 1991-07-16 | Alpha Beta Technology | Glucan drug delivery system and adjuvant |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5436146A (en) | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
CA2071510C (en) | 1989-10-24 | 2004-07-06 | Chris A. Buhr | 2' modified oligonucleotides |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
CA2029273A1 (en) | 1989-12-04 | 1991-06-05 | Christine L. Brakel | Modified nucleotide compounds |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US6783931B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5852188A (en) | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages |
US7037646B1 (en) | 1990-01-11 | 2006-05-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
AU7579991A (en) | 1990-02-20 | 1991-09-18 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5665710A (en) | 1990-04-30 | 1997-09-09 | Georgetown University | Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
ES2116977T3 (es) | 1990-05-11 | 1998-08-01 | Microprobe Corp | Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente. |
US5981276A (en) | 1990-06-20 | 1999-11-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
WO1992002258A1 (en) | 1990-07-27 | 1992-02-20 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
DE69115702T2 (de) | 1990-08-03 | 1996-06-13 | Sterling Winthrop Inc | Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
CA2092002A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-03-21 | Mark Matteucci | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
EP0556301B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-01-10 | Hybridon, Inc. | Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides |
GB9100304D0 (en) | 1991-01-08 | 1991-02-20 | Ici Plc | Compound |
US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
EP0538194B1 (de) | 1991-10-17 | 1997-06-04 | Novartis AG | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
US6235887B1 (en) | 1991-11-26 | 2001-05-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US6277603B1 (en) | 1991-12-24 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
KR940703846A (ko) | 1991-12-24 | 1994-12-12 | 비. 린네 파샬 | 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides) |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
DE4203923A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
EP1251170A3 (en) | 1992-07-17 | 2002-10-30 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for treatment of NF-kappaB dependent animal diseases |
US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
EP0911413A3 (en) | 1992-12-03 | 2000-11-15 | Genzyme Corporation | Minimal adenovirus-based gene therapy vector |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
KR100334858B1 (ko) | 1993-02-19 | 2006-01-27 | 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 | 핵산공중합체를함유하는의약조성물 |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
ES2107205T3 (es) | 1993-03-30 | 1997-11-16 | Sanofi Sa | Analogos de nucleosidos aciclicos y secuencias oligonucleotidas que los contienen. |
WO1994022891A1 (en) | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US6191105B1 (en) | 1993-05-10 | 2001-02-20 | Protein Delivery, Inc. | Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin |
US5955591A (en) | 1993-05-12 | 1999-09-21 | Imbach; Jean-Louis | Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation |
US6015886A (en) | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US6294664B1 (en) | 1993-07-29 | 2001-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of oligonucleotides |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
AU678085B2 (en) | 1993-11-16 | 1997-05-15 | Genta Incorporated | Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages |
US5540935A (en) | 1993-12-06 | 1996-07-30 | Nof Corporation | Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5599922A (en) | 1994-03-18 | 1997-02-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
WO2000022114A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO) |
US6054299A (en) | 1994-04-29 | 2000-04-25 | Conrad; Charles A. | Stem-loop cloning vector and method |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
US6608035B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5665557A (en) | 1994-11-14 | 1997-09-09 | Systemix, Inc. | Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof |
JP3269301B2 (ja) | 1994-12-28 | 2002-03-25 | 豊田合成株式会社 | ガラスラン用ゴム配合物 |
DE69636160D1 (de) | 1995-03-06 | 2006-06-29 | Isis Pharmaceuticals Inc | Verfahren zur synthese von 2'-0-substituierten pyrimidinen und oligomere davon |
US6166197A (en) | 1995-03-06 | 2000-12-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5756122A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Georgetown University | Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
JP4335310B2 (ja) | 1995-06-07 | 2009-09-30 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用 |
JPH11511128A (ja) | 1995-08-01 | 1999-09-28 | ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト | リポソームオリゴヌクレオチド組成物 |
US5858397A (en) | 1995-10-11 | 1999-01-12 | University Of British Columbia | Liposomal formulations of mitoxantrone |
DE69634606D1 (de) | 1995-10-16 | 2005-05-19 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Neue expressionsvektoren und verfahren zu deren verwendung |
US6160109A (en) | 1995-10-20 | 2000-12-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers |
US5858401A (en) | 1996-01-22 | 1999-01-12 | Sidmak Laboratories, Inc. | Pharmaceutical composition for cyclosporines |
US5994316A (en) | 1996-02-21 | 1999-11-30 | The Immune Response Corporation | Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells |
US6444423B1 (en) | 1996-06-07 | 2002-09-03 | Molecular Dynamics, Inc. | Nucleosides comprising polydentate ligands |
US5849902A (en) | 1996-09-26 | 1998-12-15 | Oligos Etc. Inc. | Three component chimeric antisense oligonucleotides |
US6172209B1 (en) | 1997-02-14 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same |
US6639062B2 (en) | 1997-02-14 | 2003-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom |
US6576752B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy functionalized oligomers |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
CA2294988C (en) | 1997-07-01 | 2015-11-24 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US6528640B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-03-04 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity |
US6617438B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligoribonucleotides with enzymatic activity |
US6320017B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-11-20 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyamide oligomers |
US7273933B1 (en) | 1998-02-26 | 2007-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for synthesis of oligonucleotides |
US7045610B2 (en) | 1998-04-03 | 2006-05-16 | Epoch Biosciences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
US6531590B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds |
US6867294B1 (en) | 1998-07-14 | 2005-03-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages |
WO2000003683A2 (en) | 1998-07-20 | 2000-01-27 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes |
CA2346155A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | Enzymatic synthesis of ssdna |
US6465628B1 (en) | 1999-02-04 | 2002-10-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligomeric compounds |
WO2000050050A1 (en) | 1999-02-23 | 2000-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Multiparticulate formulation |
US7084125B2 (en) | 1999-03-18 | 2006-08-01 | Exiqon A/S | Xylo-LNA analogues |
ATE356824T1 (de) | 1999-05-04 | 2007-04-15 | Santaris Pharma As | L-ribo-lna analoge |
US6593466B1 (en) | 1999-07-07 | 2003-07-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof |
US6147200A (en) | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
AU2001227965A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-31 | Geron Corporation | 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use |
IT1318539B1 (it) | 2000-05-26 | 2003-08-27 | Italfarmaco Spa | Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente |
US6998484B2 (en) | 2000-10-04 | 2006-02-14 | Santaris Pharma A/S | Synthesis of purine locked nucleic acid analogues |
WO2003015698A2 (en) | 2001-08-13 | 2003-02-27 | University Of Pittsburgh | Application of lipid vehicles and use for drug delivery |
US6878805B2 (en) | 2002-08-16 | 2005-04-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide-conjugated oligomeric compounds |
AU2003291678B2 (en) | 2002-11-01 | 2009-01-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha |
AU2003295600A1 (en) | 2002-11-14 | 2004-06-15 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional sirna |
US8092992B2 (en) | 2003-05-29 | 2012-01-10 | Salk Institute For Biological Studies | Transcriptional regulation of gene expression by small double-stranded modulatory RNA |
NZ544637A (en) | 2003-07-16 | 2010-04-30 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipid encapsulated interfering RNA |
JP4731324B2 (ja) | 2003-08-28 | 2011-07-20 | 武 今西 | N−o結合性架橋構造型新規人工核酸 |
US7374927B2 (en) * | 2004-05-03 | 2008-05-20 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of degraded nucleic acid samples |
AU2005248147A1 (en) | 2004-05-11 | 2005-12-08 | Alphagen Co., Ltd. | Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same |
US7740861B2 (en) | 2004-06-16 | 2010-06-22 | University Of Massachusetts | Drug delivery product and methods |
ES2381201T3 (es) | 2005-03-31 | 2012-05-24 | Calando Pharmaceuticals, Inc. | Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos |
ES2400306T3 (es) | 2005-10-21 | 2013-04-09 | Catalyst Biosciences, Inc. | Proteasas modificadas que inhiben la activación del complemento |
CN101370818A (zh) * | 2005-11-01 | 2009-02-18 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | RNAi抑制流感病毒的复制 |
US20070197460A1 (en) | 2005-11-01 | 2007-08-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Rnai inhibition of influenza virus replication |
WO2007051303A1 (en) | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF |
CA2629664A1 (en) | 2005-11-17 | 2007-08-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal dna |
US20080125384A1 (en) | 2005-11-21 | 2008-05-29 | Shuewi Yang | Simultaneous silencing and restoration of gene function |
DE602007009487D1 (de) | 2006-01-27 | 2010-11-11 | Isis Pharmaceutical Inc | 6-modifizierte bicyclische nukleinsäureanaloga |
CA2848238C (en) | 2006-10-03 | 2016-07-19 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Lipid containing formulations |
CA2685127C (en) * | 2007-04-23 | 2019-01-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Glycoconjugates of rna interference agents |
US9006191B2 (en) | 2007-12-27 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA |
AU2009238175C1 (en) | 2008-04-15 | 2023-11-30 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
CA2746527A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna interference in skin indications |
WO2010099341A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of mig-12 gene |
KR102104401B1 (ko) | 2011-03-29 | 2020-04-27 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Tmprss6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 |
US9725722B2 (en) | 2011-11-07 | 2017-08-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of TMPRSS6 expression |
KR102534909B1 (ko) | 2011-11-18 | 2023-05-30 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 변형된 RNAi 제제 |
WO2014190157A1 (en) | 2013-05-22 | 2014-11-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Tmprss6 compositions and methods of use thereof |
WO2016085852A1 (en) | 2014-11-24 | 2016-06-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof |
US10799808B2 (en) | 2018-09-13 | 2020-10-13 | Nina Davis | Interactive storytelling kit |
-
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-
2024
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090192104A1 (en) | 2002-02-20 | 2009-07-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1 (HIF1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
JP2011505425A (ja) | 2007-12-04 | 2011-02-24 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドの送達剤としての糖質コンジュゲート |
WO2009134487A2 (en) | 2008-01-31 | 2009-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene |
WO2010148013A2 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
FINBERG K. et al.,Tmprss6, An Inhibitor of Hepatic Bmp/Smad Signaling, Is Required for Hepcidin Suppression and Iron L,Blood,2010年,116(21),p.164,Abstract 164 |
LAKHAL S. et al.,J. Biol. Chem.,2011年02月,286(6),p.4090-4097 |
MAXSON J.E. et al.,J. Biol. Chem.,2010年,285(50),p.39021-39028 |
PARK T. J. et al.,Mol. Cells,2005年,19(2),p.223-227 |
程 久美子 他,RNAi実験なるほどQ&A,株式会社 羊土社,2006年,p.52-53, 88-96 |
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