ES2230851T3 - Ensayos de inmunodiagnostico mejorados que usan agentes reductores. - Google Patents

Ensayos de inmunodiagnostico mejorados que usan agentes reductores.

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Abstract

Un kit de inmunoensayo en fase sólida que comprende en dicha fase sólida una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en presencia de un agente reductor, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV.

Description

Ensayos de inmunodiagnóstico mejorados que usan agentes reductores.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del diagnóstico y tratamiento de infección por HCV. Más particularmente, la presente invención se refiere a NS3 helicasa de HCV, y a sus usos. También, la presente invención se refiere a ensayos mejorados de inmunodiagnóstico.
Antecedentes de la invención
Los virus de la hepatitis C (HCV) constituyen un género dentro de la familia de Flaviviridae, con una homología muy cercana a los virus de la hepatitis G y GB, y los Pestivirus. El genoma de ARN de hebra positiva codifica al menos 9 proteínas. El núcleo, E1 y E2 constituyen las proteínas estructurales. NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B son proteínas no estructurales (NS). Las cepas clínicas de HCV presentan niveles elevados de heterogeneidad de secuencia, permitiendo la clasificación en al menos 11 tipos y 90 subtipos (Maertens y Stuyver, 1997). A menudo, la infección por HCV del hígado humano es clínicamente benigna, con una suave ictericia en la fase aguda. La enfermedad incluso puede pasar desapercibida en algunos casos de hepatitis C de resolución aguda. Sin embargo, en la mayoría de los casos (>70%) la infección por HCV conduce a una infección crónica persistente o activa, a menudo con complicaciones de cirrosis hepática y trastornos autoinmunitarios. El carcinoma hepatocelular puede aparecer después de alrededor de 20 a 35 años (Saito et al., 1990), algunas veces incluso sin la fase intermedia de la cirrosis. Actualmente no existe ninguna profilaxis, y el tratamiento con interferón-\alpha (IFN-\alpha) sólo conduce a una resolución a largo plazo en alrededor de 4 a 36% de los casos tratados, dependiendo del genotipo del HCV (Maertens y Stuyver, 1997).
Puesto que actualmente no existen métodos de cultivo productivos para HCV, y puesto que sólo circulan en el paciente infectado cantidades minúsculas de antígenos de HCV, la detección directa de las partículas de HCV no se puede realizar de forma ordinaria, y el diagnóstico indirecto sólo es posible usando técnicas de amplificación incómodas para la detección de ARN de HCV. A diferencia de muchas otras infecciones víricas, las partículas de HCV generalmente persisten en la sangre, el hígado y en los linfocitos, a pesar de la presencia de una respuesta inmunitaria humoral y celular a la mayoría de las proteínas de HCV. Los anticuerpos del HCV se pueden detectar convenientemente mediante las técnicas de ELISA, que permiten la detección sistemática con muy buen rendimiento en bancos de sangre y en laboratorios clínicos. Se requieren pruebas suplementarias de anticuerpos, y actualmente es obligatorio en la mayoría de los países. De este modo se discrimina la verdadera reactividad del HCV de la falsa reactividad, que puede estar provocada por la unión no específica de inmunoglobulinas del suero o del plasma o de componentes antiidiotípicos a los reactivos de revestimiento o de bloqueo, o a contaminantes presentes en las preparaciones de antígenos de HCV, o incluso a partes de fusión o regiones no específicas de los propios antígenos recombinantes (McFarlane et al., 1990). La detección de ARN de HCV mediante técnicas de PCR o de ADN ramificado (ADNb) se ha introducido recientemente para monitorizar la enfermedad crónica por HCV, especialmente durante la terapia. Sorprendentemente, la detección de ARN de HCV se emplea algunas veces para confirmar ensayos de detección sistemática de Ab de HCV a pesar del hecho de que sólo \sim70-94% de las muestras de pacientes repetidamente positivos de Ab de HCV son positivas mediante PCR interna o anidada (Marin et al., 1994). De los donantes de sangre positivos de Ab de HCV, quienes habitualmente presentan formas más suaves de la enfermedad y niveles bajos de ARN de HCV, la confirmación mediante PCR interna o anidada es habitualmente del orden de \sim40% (Waumans et al., 1993; Stuyver et al., 1996). Por lo tanto, los ensayos a base de bandas proporcionan la única alternativa fiable para la confirmación de Ab de HCV. Incluso en el caso de un resultado indeterminado en el ensayo de confirmación, es aconsejable el seguimiento serológico del paciente en lugar de la detección de ARN de HCV (Di Bisceglie et al., 1998). Puesto que los antígenos nativos de HCV no están disponibles en cantidades suficientes, tales ensayos de confirmación incorporan péptidos sintéticos y/o fragmentos recombinantes de proteínas de HCV. Una de las cuestiones más críticas en la confirmación de anticuerpos lo constituye la reactividad de la proteína NS3 (Zaaijer et al., 1994). Los anticuerpos NS3 a menudo aparecen primero en la serie de seroconversión, y la reactividad de la proteína NS3 parece ser diferente en los diferentes ensayos comerciales disponibles actualmente. El documento EP 0.139.526 describe una proteína NS3 de HCV que se hace reaccionar con un aldehído y que se incuba en presencia de un agente reductor, y describe un método para preparar un inmunoensayo en fase sólida que usa dicha proteína NS3 de HCV.
La inmunogenética introdujo el concepto de tecnología de bandas en la que habitualmente se aplica una combinación de péptidos sintéticos y de proteínas recombinantes como líneas discretas de una manera ordenada y fácilmente legible. Los ensayos de Ab de VIH INNO-LIA han demostrado ser superiores a los usados normalmente en inmunotransferencias Western (Pollet et al., 1990). El Inmunoensayo de Línea permite el ensayo de múltiples parámetros y, de este modo, permite la incorporación de sistemas de corte y de otros sistemas de valoración, permiten el control de la adición de muestras, así como el ensayo de la reactividad falsa de proteínas que no son de HCV usadas como un soporte o pareja de fusión requeridas para algunos antígenos en el ensayo de Elisa. En principio, el formato de ensayo permite combinar antígenos de diferentes agentes etiológicos o condiciones fenotípicamente ligadas en un único ensayo.
El INNO-LIA HCV Ab III es un Inmunoensayo de Línea de 3ª generación que incorpora antígenos de HCV derivados de la región central, de la región hipervariable E2 (HVR), de la región de NS3 helicasa, y de las regiones NS4A, NS4B y NS5A. En el ensayo de tercera generación, la proteína NS3 de subtipo 1b recombinante muy pura, y los péptidos E2, permitieron una sensibilidad superior a la vez que salvaguardaban la especificidad fiable que es característica de los ensayos a base de péptidos (Peeters et al., 1993). Quizás una de las características más importantes de este ensayo es su correlación sin precedentes con la positividad de ARN de HCV (Claeys et al., 1992; De Beenhouer, et al., 1992).
Los antígenos se revisten como 6 líneas discretas en una banda de nailon con un soporte posterior de plástico. Además, en cada banda se revisten cuatro líneas de control: antiestreptavidina, 3+ controles positivos (anti-Ig humana), 1+ control positivo (IgG humana), y \pm la línea de corte (IgG humana). Se incuba una muestra de ensayo diluida en un recipiente colector junto con la banda de LIA III. Si están presentes en la muestra, los anticuerpos de HCV se unirán a las líneas del antígeno de HCV en la banda. Subsiguientemente, se añade un conjugado anti-IgG humana (H+L) de cabra marcado con fosfatasa alcalina y purificado por afinidad, y se hace reaccionar con los complejos de antígeno/anticuerpo de HCV, si se han formado previamente. La incubación con el sustrato de la enzima produce un color de tipo castaño, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico de HCV capturado de la muestra en cualquier línea dada. El desarrollo del color se detiene con ácido sulfúrico. Si no hay anticuerpos específicos de HCV, el conjugado sólo se une a las líneas de control \pm, 1+ y 3+. Si se omite la adición de la muestra, sólo se teñirán las líneas de control \pm y 1+.
Definiciones
Las siguientes descripciones sirven para ilustrar los diferentes términos y expresiones usados en la presente invención.
La expresión "proteína NS3 de HCV" se refiere a un polipéptido o a un análogo del mismo (por ejemplo, mimótopos) que comprende una secuencia de aminoácidos (y/o análogos de aminoácidos) que definen al menos un epítopo de HCV de NS3 proteasa o helicasa de HCV.
La expresión "proteína de funda del virus de hepatitis C" se refiere a un polipéptido o a un análogo del mismo (por ejemplo, mimótopos) que comprende una secuencia de aminoácidos (y/o análogos de aminoácidos) que define al menos un epítopo de HCV de la región E1 o de la región E2 (véase el documento WO 96/04385).
También se debe entender que las cepas clínicas (muestras biológicas) usadas en la sección de ejemplos de la presente invención no estaban destinadas a limitar el alcance de la invención, y que cualquier cepa clínica de HCV que pertenezca al tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o cualquier otro nuevo genotipo de HCV es una fuente adecuada de secuencia de HCV para la práctica de la presente invención.
Los antígenos de HCV, usados en la presente invención, pueden ser proteínas víricas de longitud completa, versiones de longitud sustancialmente completa de las mismas, o fragmentos funcionales de las mismas (por ejemplo, fragmentos a los que no les falta ninguna secuencia esencial para la formación o retención de un epítopo). Además, los antígenos de HCV de la presente invención pueden incluir también otras secuencias que no bloqueen o eviten la formación de cualquier epítopo conformacional de interés. La presencia o ausencia de un epítopo conformacional se puede determinar fácilmente mediante identificación sistemática del antígeno de interés con un anticuerpo (anticuerpo monoclonal o sérico policlonal), y comparando su reactividad con la de una versión desnaturalizada del antígeno que retiene sólo epítopos lineales (si los hay). Cuando se usan anticuerpos policlonales en tal identificación sistemática, puede ser ventajoso adsorber el suero policlonal primeramente con el antígeno desnaturalizado y observar si retiene anticuerpos para el antígeno de interés.
La expresión "polipéptido de fusión" quiere decir un polipéptido en el que el antígeno o antígenos, en particular el antígeno o antígenos de HCV, son parte de una única cadena continua de aminoácidos, cadena la cual no se encuentra en la naturaleza. Los antígenos de HCV pueden estar conectados directamente entre sí mediante enlaces peptídicos, o pueden estar separados mediante secuencias de aminoácidos espaciadoras. Los polipéptidos de fusión también pueden contener secuencias de aminoácidos exógenas al HCV.
La expresión "fase sólida" o "soporte sólido" significa un cuerpo sólido al que están unidos covalentemente los antígenos individuales de HCV o el polipéptido de fusión que comprende a los antígenos de HCV, o por un medio no covalente tal como mediante adsorción hidrófoba. Los ejemplos de fases sólidas son placas de microtitulación, bandas de membranas tales como bandas de nailon o de nitrocelulosa, y chips de silicio.
La expresión "muestra biológica" incluye un fluido o tejido de un mamífero (por ejemplo, un antropoide, un ser humano) que habitualmente contiene anticuerpos producidos por el sujeto, más particularmente anticuerpos frente a HCV. El fluido o tejido también puede contener antígeno de HCV. Tales componentes son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, sangre, plasma, suero, orina, líquido de la médula espinal, fluido linfático, secreciones de los aparatos respiratorio, intestinal o genitourinario, lágrimas, saliva, leche, leucocitos y mielomas. Los componentes corporales incluyen líquidos biológicos. La expresión "líquido biológico" se refiere a un fluido obtenido a partir de un organismo. Algunos fluidos biológicos se usan como fuente de otros productos, tales como los factores de coagulación (por ejemplo Factor VIII), la albúmina del suero, la hormona del crecimiento y similares. En tales casos, es importante que la fuente de fluido biológico esté libre de contaminación por los virus, tal como el HCV.
La expresión "inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará específicamente con anticuerpos anti-HCV presentes en un componente orgánico procedente de un paciente infectado con HCV o que proviene de un sujeto inmunizado.
La expresión "complejo inmunitario" quiere decir la combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epítopo en un antígeno.
Los términos E1 y E2 se usan aquí como se describe de forma más completa en el documento WO 96/04385.
El término "purificada", como se aplica a las proteínas de este documento, se refiere a una composición en la que la proteína deseada comprende al menos 35% del componente proteínico total en la composición. La proteína deseada comprende preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos alrededor del 50%, más preferiblemente al menos alrededor del 60%, aún más preferiblemente al menos alrededor del 70%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 85%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 90%, y lo más preferible al menos alrededor del 95% del componente proteínico total. La composición puede contener otros compuestos tales como hidratos de carbono, sales, lípidos, disolventes, y similares, sin que afecten a la determinación del porcentaje de pureza como se usa en este documento. Una proteína de HCV "aislada" significa una composición proteínica de HCV que tiene una pureza de al menos 35%.
La expresión "proteínas esencialmente puras" se refiere a proteínas purificadas de forma que se pueden usar para métodos de diagnóstico in vitro y como un compuesto terapéutico. Estas proteínas están sustancialmente libres de proteínas o ADN celular, de proteínas o ADN derivados de vectores, o de otros componentes víricos de HCV. Habitualmente, estas proteínas se purifican hasta homogeneidad (al menos 80% puras, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 97%, más preferiblemente 98%, más preferiblemente 99%, incluso más preferiblemente 99,5%, y lo más preferible las proteínas contaminantes deben ser indetectables por métodos convencionales como SDS-PAGE y tinción con plata).
La expresión "expresada recombinantemente", usada en el contexto de la presente invención, se refiere al hecho de que las proteínas de la presente invención se producen mediante métodos de expresión recombinantes, sea en procariotas o sea en eucariotas inferiores o superiores, como se expone con detalle más abajo.
La expresión "eucariota inferior" se refiere a células hospedantes tales como levadura, hongos y similares. Los eucariotas inferiores generalmente (pero no necesariamente) son unicelulares. Los eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies comprendidas dentro de Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), Hansenula (por ejemplo, Hansenula polymorfa), Yarowia, Schwanniomyces, Zygosaccharomzyces y similares. Los hospedantes de tipo levaduras más usados habitualmente son Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis.
El término "procariotas" se refiere a hospedantes tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. Estos hospedantes también se contemplan dentro de la presente
invención.
La expresión "eucariota superior" se refiere a células hospedantes derivadas de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos, y similares. Las células hospedantes de eucariotas superiores actualmente preferidas derivan de células de hámster chino (por ejemplo, CHO), de mono (por ejemplo, células Vero y COS), células de riñón de feto de hámster (BHK), células de riñón de cerdo (PK15), células de riñón de conejo (RK13), la estirpe celular 143 B de osteosarcoma humano, la estirpe celular HeLa humana y las estirpes celulares de tipo Hep G2 de hepatoma humano, y estirpes celulares de insectos (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células hospedantes se pueden proporcionar en cultivos en suspensión o en matraz, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y similares. Como alternativa, las células hospedantes también pueden ser animales transgénicos.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto; de este modo, dentro de la definición de polipéptido se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término tampoco se refiere o excluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.
La expresión "polinucleótido o ácido nucleico recombinante" está destinada a un polinucleótido o ácido nucleico de origen genómico, de ADNc, semisintético o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza, (2) está enlazado a un polinucleótido distinto del que está enlazado en la naturaleza, o (3) no existe en la naturaleza.
La expresión "células hospedantes recombinantes", "células hospedantes", "células", "estirpes celulares", "cultivos celulares", y otros tales términos que representan a microorganismos o estirpes celulares eucariotas superiores, cultivados como entidades unicelulares, se refiere a células que se pueden usar o se han usado como receptores de un vector recombinante o de otro polinucleótido de transferencia, e incluye a la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entenderá que la progenie de una célula progenitora individual no necesariamente tiene que ser idéntica de forma completa en morfología o complemento de ADN total o genómico como el progenitor original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.
El término "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación del polinucleótido en una célula, es decir, es capaz de replicación bajo su propio control.
El término "vector" es un replicón que comprende además secuencias que proporcionan replicación y/o expresión de un marco de lectura abierto deseado.
La expresión "secuencia de control" se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedante; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosómico, y terminadores; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores, y pueden incluir potenciadores. La expresión "secuencias de control" está destinada a incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias líderes que gobiernan la secreción.
El término "promotor" es una secuencia nucleotídica que comprende secuencias de consenso que permiten la unión de ARN polimerasa al molde de ADN de manera tal que la producción de ARNm se inicia en el sitio de iniciación de la transcripción normal para el gen estructural adyacente.
La expresión "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en la manera pretendida. Una secuencia de control "ligada operablemente" a una secuencia de codificación está ligada de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura abierta" (ORF) es una región de una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido y que no contiene codones de parada en el marco de lectura seleccionado; esta región puede representar una parte de una secuencia de codificación, o una secuencia total de codificación.
Una "secuencia de codificación" es una secuencia polinucleotídica que se transcribe en ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación están determinados por un codón de parada de la traducción, en el término 5', y un codón de parada de la traducción en el término 3'. Una secuencia de codificación puede incluir pero no se limita a secuencias de ARNm, ARN vírico, ADN (incluyendo ADNc), y secuencias polinucleotídicas recombinantes.
Como se usa en este documento, "epítopo" o "determinante antigénico" significa una secuencia de aminoácidos que es inmunorreactiva. Generalmente, un epítopo consta de al menos 3 a 4 aminoácidos, y más habitualmente consta de al menos 5 ó 6 aminoácidos; algunas veces, el epítopo consta de alrededor de 7 a 8, o incluso alrededor de 10 aminoácidos. Como se usa en este documento, un epítopo de un polipéptido dado representa epítopos con la misma secuencia de aminoácidos que el epítopo en el polipéptido dado, y equivalentes inmunológicos del mismo. Tales equivalentes también incluyen variantes de cepas, de subtipo (= genotipo), o variantes específicas del tipo (grupo), por ejemplo, de las secuencias actualmente conocidas o cepas que pertenecen a los genotipos 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11a, 12a o cualquier otro (sub)tipo de HCV recientemente definido. Deberá entenderse que los aminoácidos que constituyen el epítopo no necesitan ser parte de una secuencia lineal, sino que pueden estar interespaciados por una o más series de cualquier número de aminoácidos, formando de este modo un epítopo conformacional.
Objetivos de la invención
Es un objetivo de la presente invención proporcionar componentes mejorados de ensayos de diagnóstico del HCV, y proteínas terapéuticas.
Más particularmente, es un objetivo de la presente invención proporcionar preparaciones mejoradas de proteína NS3 de HCV, para uso en el diagnóstico de anticuerpos de HCV.
Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un método para aumentar la reactividad de los anticuerpos de HCV con proteína recombinante o sintética de NS3 helicasa, o una parte de la misma, presente en una fase sólida.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevas secuencias de codificación de la proteína NS3 de HCV.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevas secuencias de codificación de la proteína NS3 de HCV, de las cuales el producto no reacciona con muestras de HCV falsamente positivas.
Es otro objetivo de la presente invención proporcionar nuevos polipéptidos NS3 de HCV.
Es otro objetivo de la presente invención proporcionar nuevos polipéptidos NS3 de HCV que no reaccionan con muestras de HCV falsamente positivas.
Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para la detección de los polipéptidos de la invención.
Se considera que todos los objetivos de la presente invención se han satisfecho mediante las realizaciones que se exponen a continuación.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un kit de inmunoensayo en fase sólida que comprende, en dicha fase sólida, una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en presencia de un agente reductor, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo que comprende una fase sólida que tiene, como antígeno, una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo que comprende una fase sólida que tiene, como antígeno, una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV, y en el que dicho kit se ha producido añadiendo un agente reductor en al menos una de las etapas a continuación:
(i)
en el revestimiento de dicha fase sólida con dicho antígeno;
(ii)
en el bloqueo de dicha fase sólida;
(iii)
en la fijación de las proteínas revestidas sobre dicha fase sólida;
(iv)
en el pretratamiento de dicha fase sólida.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una secuencia de aminoácidos de NS3 de HCV seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3-18.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV está contenida en una proteína de fusión.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína de fusión se selecciona del grupo de secuencias de aminoácidos que constan de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:32.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una proteína NS3 helicasa de HCV, o una parte de la misma, que contiene S1200, A1218, A1384, P1407, V1412, P1424, o F1444, o una combinación de uno de dichos aminoácidos con cualquiera de los siguientes aminoácidos seleccionados del grupo que consta de L1201, S1222, I1274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409, F1410, y en el que dicha proteína NS3 helicasa de HCV, o una parte de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 helicasa de HCV.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una proteína NS3 de HCV tratada mediante un método que comprende las etapas de sulfonación y posterior desulfonación.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV se trata adicionalmente con un detergente bipolar.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicha proteína NS3 de HCV se trata con laurildimetilbetaína como detergente bipolar.
La presente invención se refiere además a un método para producir un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor está presente en al menos una de las siguientes etapas:
(i)
en el revestimiento de dicha fase sólida con dicho antígeno; y
(ii)
después de (i), en el bloqueo de dicha fase sólida;
(iii)
después de (ii), en la fijación de las proteínas revestidas sobre dicha fase sólida;
(iv)
después de (iii), en el pretratamiento de dicha fase sólida.
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (i).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (ii).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (ii).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (iii).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (iii).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (iv).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (iv).
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor es DTT, DTE o TCEP.
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho agente reductor se usa en un intervalo de concentración de 0,1 mM a 1 M, más particularmente de 0,5 mM a 500 mM, incluso más particularmente de 1 mM a 250 mM; algunas aplicaciones pueden requerir intervalos de 0,5 a 50 mM, 1 a 30 mM, 2 a 20 mM, o 5 a 15 mM, o alrededor de 10 mM.
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, que es un kit de ELISA, un kit de ensayo QUICK, o un kit de Inmunoensayo de Línea.
La presente invención se refiere además a un método como se describe anteriormente, en el que dicho kit de inmunoensayo producido es un kit de ELISA, un kit de ensayo QUICK o un kit de Inmunoensayo de Línea.
La presente invención se refiere además a un uso del kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, para detectar anticuerpos de una proteína NS3 de HCV.
La presente invención se refiere además a un uso del kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, para detectar dichos anticuerpos en una muestra biológica.
La presente invención se refiere además a un uso del kit de inmunoensayo como se describe anteriormente, para detectar una seroconversión temprana de NS3 de HCV.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere más particularmente a un inmunoensayo en fase sólida que comprende, en dicha fase sólida, un antígeno de NS3 de HCV en presencia de un agente reductor. Como se demuestra en la sección de los Ejemplos, se ha encontrado que la presencia de un agente reductor, tal como DTT, aparte de un antígeno revestido a una fase sólida, hace al antígeno acoplado al inmunoensayo en fase sólida mucho más reactivo con anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno. También, en disolución, el antígeno se hace más reactivo por reducción.
Un agente reductor, según la presente invención, es cualquier agente que logra la reducción de los puentes disulfuro S-S. La reducción de los puentes disulfuro "S-S" es una reacción química mediante la cual los disulfuros se reducen a tiol (-SH). En el documento WO 96/04385 se describen los métodos y los agentes que rompen los puentes disulfuro. La reducción de S-S' se puede obtener (1) mediante rutas de cascadas enzimáticas, o (2) mediante compuestos reductores. Se sabe que enzimas como tiorredoxina, glutarredoxina, están implicadas en la reducción in vivo de disulfuros, y también se ha demostrado que son eficaces reduciendo puentes de "S-S" in vitro. Los enlaces de disulfuro se rompen rápidamente mediante ruptura por tiorredoxina reducida, a pH 7,0, con una velocidad aparente de segundo orden que es alrededor de 10^{4} veces más grande que la constante de velocidad correspondiente para la reacción con DTT. La cinética de la reducción se puede aumentar dramáticamente mediante la preincubación de la disolución proteínica con 1 mM de DTT o dihidrolipoamida (Holmgren, 1979).
Los compuestos tiólicos capaces de reducir los puentes de disulfuro de las proteínas son, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), \beta-mercaptoetanol, tiocarbamatos, bis(2-mercaptoetil)sulfona y N,N'-bis-(mercaptoacetil)hidrazina, y ditionito de sodio.
También se pueden usar, para la reducción de NS3, agentes reductores sin grupos tiólicos, como ascorbato o cloruro estannoso (SnCl_{2}), que han demostrado ser muy útiles en la reducción de puentes de disulfuro en anticuerpos monoclonales (Thakur et al., 1991). Se ha demostrado que el tratamiento con borohidruro de sodio es eficaz para la reducción de puentes de disulfuro en péptidos (Gailit, 1993). La tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) es capaz de reducir los puentes de disulfuro a pH bajo (Burns et al., 1991). El selenol cataliza la reducción de disulfuro a tioles, cuando se usan como agentes reductores DTT o borohidruro de sodio. La selenocisteamina, un diselenuro comercialmente disponible, se usó como precursor del catalizador (Singh y Kats, 1995).
La presente invención se refiere más particularmente a un método para producir un inmunoensayo como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade a dicha fase sólida durante las etapas de revestimiento, bloqueo y/o fijación de dicho antígeno a dicha fase sólida.
La presente invención también se refiere a un método para llevar a cabo un inmunoensayo como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade durante la etapa del pretratamiento de la fase sólida.
Las condiciones de revestimiento pueden variar ampliamente, como es conocido por la persona experta, e implica aplicar la proteína a una fase sólida y permitir que transcurra una reacción que dé como resultado la unión de la proteína a la fase sólida. La unión puede ser, pero no se restringe a, enlaces covalentemente hidrófobos o enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals, o puentes de hidrógeno. Se pueden usar para esta etapa diferentes tampones conocidos por el experto, que incluyen pero no se limitan a tampones de carbamato y de fosfato.
El bloqueo puede ocurrir vía cualquier método conocido en la técnica, y también se puede realizar, por ejemplo, usando albúmina, proteínas séricas, polivinilpirrolidona (PVP), detergentes, gelatinas, poli(alcohol vinílico) (PVA) o caseína.
La fijación puede ocurrir según cualquier método conocido en la técnica.
En la sección de Ejemplos se dan ejemplos adicionales de las condiciones de bloqueo, fijación y revestimiento.
La presente invención se refiere incluso más particularmente a un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade a dicha fase sólida durante la etapa de revestimiento del antígeno a la fase sólida. En la sección de Ejemplos se proporcionan ejemplos de tampones de revestimiento. Todos los otros tampones de revestimiento conocidos, sabidos en la técnica, también forman parte de la presente descripción.
La presente invención también se refiere a un método como se define anteriormente, en el que o agente reductor se añade a dicha fase sólida durante la etapa del bloqueo de dicha fase sólida, que comprende el agente que se ha aplicado a la misma en presencia o ausencia de un agente reductor. Los ejemplos de tampones de bloqueo se dan en la sección de Ejemplos. También forman parte de la presente descripción otros tampones de bloqueo conocidos en la técnica.
La presente invención también se refiere a un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade a dicha fase sólida durante la etapa de fijación del antígeno revestido a dicha fase sólida, que comprende el antígeno que se ha aplicado a la misma en presencia o ausencia de un agente reductor. La etapa de fijación también puede haber estado precedida por una etapa de bloqueo en presencia o ausencia de un agente reductor. Los ejemplos de tampones de fijación se dan en la sección de Ejemplos. También forman parte de la presente descripción todos los otros tampones de fijación conocidos en la técnica.
La presente invención también se refiere a un método para llevar a cabo un inmunoensayo como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade durante la etapa del pretratamiento de la fase sólida antes de la adición de la muestra. El pretratamiento de las placas se puede hacer con placas que se han tratado con un agente reductor en la etapa de revestimiento, de bloqueo y/o de fijación, o con placas que no se han tratado previamente con un agente reductor.
Finalmente, el agente reductor también se puede añadir durante cualquiera de las otras etapas adicionales llevadas a cabo en inmunoensayos enzimáticos, como parte de la presente invención, posiblemente después de la aplicación de un agente reductor en una o más de las 4 etapas anteriores de revestimiento, bloqueo, fijación y/o pretratamiento. Tales etapas adicionales incluyen pero no se limitan a la incubación de los anticuerpos, la detección de los anticuerpos unidos, y el desarrollo del color.
La presente invención se refiere preferiblemente a un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor es DTT, DTE o TCEP.
La presente invención también se refiere a un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se usa en un intervalo de concentración de 0,1 mM a 1 M, más particularmente de 0,5 mM hasta 500 mM, incluso más particularmente de 1 mM hasta 250 mM, lo más particularmente de 1 hasta 50 mM. Algunas aplicaciones pueden requerir intervalos de 0,5 hasta 50 mM, 1 hasta 30 mM, 2 hasta 20 mM, 5 hasta 15 mM, o alrededor de 10 mM de agente reductor. otras aplicaciones requieren concentraciones de DTT de 50-500 mM, 100-300 mM o 200 mM. Un agente reductor particularmente preferido es DTT.
La presente invención se refiere a un método como se define anteriormente, en el que dicho antígeno es una proteína NS3 de HCV. Más particularmente, una NS3 helicasa de HCV. También se puede hacer reaccionar mejor cualquier otra proteína conocida en la técnica con anticuerpos frente a dicha proteína cuando la proteína se añade a la fase sólida en presencia de DTT, o se trata con DTT después.
La presente invención también se refiere a un método como se describe anteriormente, en el que dicho inmunoensayo en fase sólida comprende una combinación de antígenos de diferentes agentes etiológicos o estados fenotípicamente ligados.
La presente invención también se refiere a un inmunoensayo en fase sólida producido mediante un método como se define anteriormente. Más particularmente, un kit que contiene al menos una fase sólida, tal como una placa de microtitulación, una banda de membrana o un chip de silicio, que contiene un antígeno en presencia de un agente reductor.
Más particularmente, la presente invención se refiere a un ELISA producido mediante un método como se define anteriormente.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un ELISA producido mediante un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade preferiblemente en las etapas de revestimiento y/o de fijación. En una realización preferida, el agente reductor se puede aplicar en la etapa de revestimiento. En otra realización preferida, el agente reductor se puede aplicar en la etapa de fijación. En una realización particularmente preferida, el agente reductor se añade tanto en la etapa de revestimiento como en la etapa de fijación.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un ELISA producido mediante un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade durante el pretratamiento de las placas antes de la adición de la muestra. El pretratamiento de las placas se puede realizar con placas que se han tratado con un agente reductor en la etapa de revestimiento y/o de fijación, o con placas que no se han tratado previamente con un agente reductor. El agente reductor también se puede añadir durante cualesquiera otras etapas llevadas a cabo en los inmunoensayos enzimáticos. Tales etapas adicionales incluyen pero no se limitan a la incubación de los anticuerpos, la detección de los anticuerpos unidos, y el desarrollo del color.
La presente invención también se refiere a un Inmunoensayo de Línea (LIA) producido mediante un método como se define anteriormente.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un Inmunoensayo de Línea (LIA) producido mediante un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade preferiblemente en la etapa de bloqueo y/o en la etapa de lavado. El agente reductor también se puede añadir durante cualesquiera otras etapas en la producción o realización de los inmunoensayos enzimáticos. Tales etapas adicionales incluyen pero no se limitan a la fijación, el pretratamiento y la incubación de los anticuerpos, la detección de anticuerpos unidos y el desarrollo del color.
La presente invención también se refiere a un ensayo QUICK producido mediante un método como se define anteriormente.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un ensayo QUICK producido mediante un método como se define anteriormente, en el que dicho agente reductor se añade preferiblemente durante el revestimiento del antígeno sobre la banda. El ensayo QUICK es un ensayo de flujo lateral en el que los antígenos se revisten sobre las bandas mediante pulverización. En este ensayo, el agente reductor se añade preferiblemente a la disolución de la pulverización. El agente reductor también se puede añadir durante cualesquiera otras etapas en la producción o realización de los inmunoensayos enzimáticos. Tales etapas adicionales incluyen pero no se limitan al bloqueo, a la fijación, al pretratamiento y a la incubación de los anticuerpos, a la detección de los anticuerpos unidos y al desarrollo del color.
La presente invención también se refiere al uso de un ensayo como se define anteriormente, para el diagnóstico in vitro de anticuerpos producidos frente a un antígeno, como se define anteriormente.
La presente invención también se refiere a un kit de inmunoensayo como se define anteriormente, que comprende una proteína NS3 de HCV tratada mediante un método que comprende las etapas de sulfonación y posterior desulfonación.
La sulfonación y desulfonación es una reacción mediante la cual se introducen o se eliminan, respectivamente los grupos -SO_{3} de la proteína.
\newpage
La sulfonación se define como un proceso en el que los grupos tiol (SH) en las proteínas (R), y los enlaces disulfuro, se convierten a S-sulfonatos, según las siguientes reacciones:
(1)RSH \rightarrow RS-SO_{3}{}^{-}
(2)RS-SR + 2-SO_{3}{}^{-}+ H_{2}O \rightarrow 2 RS-SO_{3}{}^{-} + 2 OH^{-}
Los productos de las reacciones son S-sulfoproteínas que son estables habitualmente a pH neutro. La reacción (1) se puede obtener incubando la disolución proteínica con tetrationato a pH > 7 (Inglis y Liu, 1970). La reacción (2) transcurre hasta su terminación, en presencia de iones cobre (Cole, 1967). Chan (1968) ha demostrado que el tratamiento de la proteína con sulfito sódico y con cantidades catalíticas de cisteína en presencia de oxígeno da sulfoproteínas.
La desulfonación se puede obtener (1) mediante un exceso de grupos -SH (tiol) competitivos, (2) mediante agentes reductores, o (3) mediante incubación en condiciones de pH no neutro.
RS-SO_{3}{}^{-} + R'SH \rightarrow RSH + R'S-SO_{3}{}^{-}
RS-SO_{3}{}^{-} + agente \ reductor \rightarrow RSH
Los grupos tioles competitivos se pueden obtener a partir de compuestos de bajo peso molecular, o a partir de grupos -SH proteinosos.
Los ejemplos de compuestos que contienen mono- o ditioles son:
cisteína, cisteamina, glutationa reducida, N-acetilcisteína, homocisteína, \beta-mercaptoetanol, tiocarbamatos, bis(2-mercaptoetil)sulfona (BMS) y N,N'-bis(mercaptoacetil)hidrazina (BMH), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB o reactivo de Elman), ditiotreitol (DTT) y ditioeritritol (DTE).
La presente invención se refiere además a un kit de inmunoensayo como se define anteriormente, que comprende una proteína NS3 de HCV como se define anteriormente que se trata adicionalmente con un detergente bipolar. Empigen es conocido como laurildimetilbetaína, y es un ejemplo particularmente preferido de un detergente bipolar. Otros detergentes adecuados son conocidos por el experto, y se repasan también en el documento WO 96/04385.
La presente invención se refiere además a un método para purificar una proteína expresada recombinantemente, que contiene cisteína, que comprende al menos 2, preferiblemente 3 ó 4, e incluso más preferiblemente todas las siguientes etapas:
(a)
sulfonar un lisado procedente de células hospedantes recombinantes o de la lisis de células hospedantes recombinantes en presencia de cloruro de guanidinio (preferiblemente Gu.HCl 6 M), y la sulfonación del lisado celular,
(b)
tratar con un detergente bipolar, preferiblemente después de la eliminación del desecho celular,
(c)
purificar la proteína recombinante sulfonada, o la purificación de la proteína recombinante sulfonada con la eliminación subsiguiente del detergente bipolar, realizándose dicha purificación mediante cromatografía, más preferiblemente una cromatografía Ni-IMAC, siendo dicha proteína recombinante una proteína recombinante marcada con His,
(d)
desulfonar la proteína recombinante sulfonada, preferiblemente con un exceso molar de un agente reductor tal como DTT,
(e)
almacenar en presencia de un exceso molar de DTT.
Empigen es un ejemplo particularmente preferido de un detergente bipolar. Se ha encontrado que la inclusión de tal detergente bipolar y de DTT mejora el protocolo de purificación para las proteínas NS3 helicasa de HCV y las proteínas de funda de HCV.
La presente invención también se refiere al uso de un ácido polinucleico de HCV que codifica una poliproteína NS3 de HCV, según se muestra en la Figura 1 (SEQ ID Nos 3-18), o una única parte de un ácido polinucleico de HCV que tiene una secuencia según se representa en las Figuras 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1, y 8-1 (SEQ ID NOs 19, 21, 23, 25, 27, 29 y 31), para la preparación de un kit de inmunoensayo como se define anteriormente.
La presente invención también se refiere a un ácido polinucleico de HCV como se define anteriormente, caracterizado en las Figuras 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1, y 8-1, y por el hecho de que su producto no reacciona con muestras de HCV falsamente positivas, una parte del mismo que codifica epítopos de NS3 que no reaccionan con muestras de HCV falsamente positivas. Fue particularmente sorprendente que las proteínas codificadas por los clones representados por SEQ ID NOs 19, 21, 23, 25, 27, 29 y 31 tienen la propiedad de no reaccionar con muestras de HCV falsamente positivas, pero fueron capaces de reaccionar con la mayoría de las muestras positivas de anticuerpos de NS3 conocidos, después del tratamiento con DTT.
La presente invención se refiere además al uso de un vector recombinante que comprende un ácido polinucleico según se describe.
La presente invención se refiere además al uso de una célula hospedante que comprende un vector de la invención.
Además de la reactividad ganada mediante la reducción, la reactividad de NS3 está también determinada de forma importante por la secuencia del antígeno de NS3.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de un polipéptido de HCV que tiene parte o todas las secuencias de aminoácidos según se muestran en las Figuras 1, 2-2, 3-2, 4-2, 5-2, 6-2, 7-2 y 8-2 (SEQ ID NOs 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32). La presente invención también se refiere al uso de una proteína NS3 helicasa de HCV según se representa en la Figura 1 (SEQ ID NOs 1-18), o una parte única de la misma.
La presente invención también se refiere al uso de una proteína NS3 helicasa de HCV, o una parte de la misma, que contiene S1200, A1218, A1384, P1407, V1412, P1424, o F1444, o una combinación de estos aminoácidos con cualquiera de los siguientes aminoácidos L1201, S1222, I1274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409, F1410. Dicha numeración está de acuerdo con el sistema de numeración de aminoácidos de HCV habitualmente aceptado.
La presente invención también se refiere a un inmunoensayo que comprende un polipéptido de NS3 de HCV según se define anteriormente. Dicho inmunoensayo puede ser de cualquier tipo de formato conocido en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 96/13590, y Coligan et al., 1992). En particular, la presente invención se refiere a un método para detectar un polipéptido de la invención que comprende:
-
poner en contacto dicho polipéptido con un ligando que se une a dicho polipéptido;
-
determinar el complejo formado entre dicho polipéptido y dicho ligando.
La expresión "un ligando" se refiere a cualquier molécula capaz de unirse a los polipéptidos de la presente invención. Esta última expresión se refiere específicamente a anticuerpos policlonales y/o monoclonales que surgen específicamente (mediante cualquier método conocido en la técnica) frente a los polipéptidos de la presente invención, y también engloba cualesquiera constructos de tipo anticuerpos y otros constructos como se describen en detalle en el documento EP 97870092.0 de Lorre et al. Tales anticuerpos pueden ser muy útiles para la detección de antígeno en fluidos biológicos. La detección del antígeno se puede realizar mediante cualquier inmunoensayo conocido en la técnica, tales como los ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, los ELISA y la inmunoprecipitación, las técnicas inmunohistoquímicas y los ensayos de aglutinamiento. En el documento WO 96/13590 se da una descripción detallada de estos ensayos.
Las proteínas de NS3 de la presente invención también se pueden usar en cualquier aplicación en la que sea aplicable usar una NS3 helicasa, tal como para los fines de identificación sistemática de fármacos.
Leyendas de las figuras
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de clones de NS3 de HCV aislados de sueros infectados con el subtipo 1a y 1b de HCV.
Figura 2-1. Secuencia codificante de ADN de la proteína de fusión del clon 19b de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 2-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión del clon 19b de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia contiene a la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 3-1. Secuencia de codificación de ADN de la proteína de fusión del clon B9 de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 3-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión del clon B9 de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 4-1. Secuencia codificante de ADN de la proteína de fusión del clon 21 de tipo 3a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 4-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión del clon 21 de tipo 3a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 5-1. Secuencia de codificación de ADN de la proteína de fusión del clon 32 de tipo 3a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 5-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión del clon 32 de tipo 3a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 6-1. Secuencia de codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 6-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2a de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 7-1. Secuencia de codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2b de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 7-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2b de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 8-1. Secuencia de codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2c de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 8-2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2c de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión del clon 19b de NS3 de HCV de tipo 1b en E. coli 1.1 Clonación de los genes de los clones 19a y 19b de NS3 de HCV de tipo 1b
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de suero IG8309 del HCV de subtipo 1b (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores HCPr59 oligonucleotídicos sintéticos (5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3') (SEQ ID NO 1) y HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAA
AGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento 19 de PCR, que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después de aa 1465. El fragmento de PCR se cortó subsiguientemente con ApaI, y el fragmento de ApaI resultante de 833 pb se clonó en el vector de expresión cortado con pmTNFHRP (Innogenetics, Ghent, Bélgica). Se secuenciaron cuatro clones de hepatitis C (HCCl) HCC119a y HCC119b (véase la secuencia de aminoácidos deducida, dada en la Figura 1 y en la Figura 2-2). El clon HCC119b (pmTiNTHRPHCC119b) se retuvo para una subclonación posterior.
1.2 Construcción del plásmido de expresión pEmTNFMPHHCC119b
Partiendo del vector pmTNFHRPHCC119b, la secuencia de codificación del clon 19b de NS3 se aisló como un fragmento NcoI de 900 pb y se insertó en el vector de expresión pEmTNFMPH cortado con NcoI (Innogenetics, Ghent, Bélgica), dando como resultado el vector pEmTNFNFPHHCC119b. Este plásmido expresa el clon 19b de NS3 de HCV como una proteína de fusión N-terminal con los 25 aa N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y un sitio de ruptura con ácido fórmico (SEQ ID NO 19 y 20; Figura 2).
1.3 Expresión del clon 19b de NS3 de HCV en E. coli
Se transformaron las células de la cepa MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) con el plásmido
pEmTNFMPHHCC119b. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pEmTNFMPHHCC119b se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 23ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon 19b de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 2 Expresión del clon B9 de NS3 de HCV en E. coli 2.1 Clonación del gen del clon B9 de NS3 de HCV de tipo 1a
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de suero IG21054 de HCV de subtipo 1a (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos HCPr59 (5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3') (SEQ ID NO 1) y HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAA
AGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento B de PCR que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción de ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después del aa 1465. El fragmento de PCR se clonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron cuatro clones: B7, B9, B12, y B14 (véanse las secuencias de aminoácidos deducidas, en la Figura 1 y en la Figura 3-2). El clon B9 (pGEMTNS3B9) se retuvo para una subclonación posterior.
2.2 Construcción del plásmido de expresión pIGFH111NS3B9
Partiendo del vector pGEMTNS3B9, la secuencia de codificación del clon B9 se aisló como un fragmento despuntado mediante NcoI/SpeI de 850 pb y se insertó en el vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica), cortado mediante NcoI/StuI, dando como resultado el vector pIGFH111NS3B9. Este plásmido expresa el clon B9 de NS3 de HCV como una proteína de fusión N-terminal con los 25 aa N-terminales de TNF murino, seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y un sitio de ruptura mediante ácido fórmico (SEQ ID Nos. 21 y 22; 
\hbox{Figura
3).}
2.3 Expresión del clon B9 de NS3 de HCV en E. coli
Se transformaron las células de la cepa MC106 (pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) con el plásmido pIGFH111
NS3B9. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pIGFH111NS3B9 se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon B9 de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 3 Expresión de los clones A26, C16 y D18 de NS3 de HCV de tipo 1a en E. coli
Los clones A26, C16 y D18 se aislaron de sueros IG21051, IG17790 e IG21068, respectivamente, infectados con HCV subtipo 1a, de forma similar a como se describió para el clon B9 usando los cebadores HCPr59 y HCPr60. Inicialmente, los clones A5, A26, C1, C3, C4, C12, C16, D17, D18 y D19 se clonaron y se secuenciaron (véanse las secuencias de aminoácidos deducidas dadas en la Figura 1). Los clones A26, C16 y D18 se retuvieron para una subclonación posterior.
Ejemplo 4 Expresión de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a en E. coli 4.1 Clonación de los genes de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de sueros IG21349 e IG20014 de HCV de subtipo 3a (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos 403 (5'-GGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTT-3') (SEQ ID NO 33) y 404 (5'-CTATTAGC
TGAAGTCAACGTACTGTTCAACAGC-3') (SEQ ID NO 34). Esto produjo en ambos casos un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). A partir de cada fragmento de PCR clonado se secuenciaron varios clones, pero de cada suero sólo un fragmento clonado demostró ser completamente correcto al secuenciarlo. Este fue el clon 21 (pGEM-TNS3T3a.21) para el suero IG21349, y el clon 32 (pGEM-TNS3T3a.32) para el suero IG20014 (Figuras 4 y 5).
4.2 Construcción de los plásmidos de expresión pIGFH111NS3T3a.21 y pIGFH111NS3T3a.32
Partiendo de los vectores pGEM-TNS3T3a.21 y pGEM-TNS3T3a.32, se aislaron las secuencias de codificación de los clones 21 y 32 como fragmentos de NcoI/SalI de 850 pb, y se insertaron en el vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica), cortado mediante NcoI/SalI, dando como resultado los vectores pIGFH111NS3T3a.21 y pIGFH111NS3T3a.32, respectivamente. Estos plásmidos expresan los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a como proteínas de fusión N-terminales con los 25 aa N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura mediante ácido fórmico (SEQ ID Nos 23-26; Figuras 4 y 5).
4.3 Expresión de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a en E. coli
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con los plásmidos pIGFH111NS3T3a.21 y pIGFH111NS3T3a.32, respectivamente. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH
111NS3T3a.21 o pIGFH111NS3T3a.32 se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 5 Expresión del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a en E. coli 5.1 Clonación del gen del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de un suero IG21342 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2a, usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos 412 (6'-GGGCC
CCACCATGGGCGTGGCCAAGTCCATAGACTT-3') (SEQ ID NO 35) y 413 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAC
TTGAGTGACCGC-3') (SEQ ID NO 36). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 3 (pGEM-TNS3T2a) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 6).
5.2 Construcción del plásmido de expresión pIGFH111NS3T2a
Partiendo del vector pGEM-TNS3T2a, la secuencia de codificación del clon 3 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111S3T2a. Este plásmido expresa el clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a como una proteína de fusión N-terminal con los 25 aa N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido fórmico (SEQ ID Nos 27 y 28; Figura 6).
5.3 Expresión del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a en E. coli
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el plásmido pIGFH111
NS3T2a. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2a se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 6 Expresión del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b en E. coli 6.1 Clonación del gen del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de un suero IG20192 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2b, usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos 401 (5'-GGGC
CCCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 9 se retuvo para una subclonación posterior (Figura 7).
6.2 Construcción del plásmido de expresión pIGFH111NS3T2b
Partiendo del vector pGEM-TNS3T2b, la secuencia de codificación del clon 9 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el vector de expresión pIGFH11 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111NS3T2b. Este plásmido expresa el clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b como una proteína de fusión N-terminal con los 25 aa N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido fórmico (SEQ ID Nos 29 y 30; Figura 7).
6.3 Expresión del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b en E. coli
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el plásmido pIGFH
111NS3T2b. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2b se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 7 Expresión del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c en E. coli 7.1 Clonación del gen del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos 1188-1465) se amplificó mediante RT-PCR a partir de un suero IG20031 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2c, usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos 401 (5'-GGGCC
CCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 14 (pGEM-TNS3T2c) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 8).
7.2 Construcción del plásmido de expresión pIGFH111NS3T2c
Partiendo del vector pGEM-TNS3T2c, la secuencia de codificación del clon 14 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111NS3T2c. Este plásmido expresa el clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c como una proteína de fusión N-terminal con los 25 aa N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido fórmico (SEQ ID Nos 31 y 32; Figura 8).
7.3 Expresión del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c en E. coli
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el plásmido pIGFH111
NS3T2c. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2c se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
Ejemplo 8 Purificación del dominio de la proteína de NS3 helicasa
Se añadieron nueve volúmenes de hidrocloruro de guanidinio (Gu.HCl) 8 M y 1 volumen de NaHPO_{4} 0,2 M a cada equivalente gramo de pasta celular húmeda de E. coli, y la disolución se homogeneizó mediante remolino continuo. Se añadieron Na_{2}S_{4}O_{6} y Na_{2}SO_{3} sólidos a la disolución hasta una concentración final de 65 y 360 mM, respectivamente. Se añadió CuSO_{4} (disolución madre: 0,1 M en NH_{3} al 25%) hasta una concentración final de 100 \muM. La disolución se agitó toda la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y después de la incubación, a -70ºC, se aclaró mediante centrifugación a 4ºC (30 minutos, 20.000 rpm, rotor JA20).
Al sobrenadante se le añadieron laurildimetilbetaína (también conocida como Empigen BB®; Albright & Wilson Ltd., Oldbuly, UK) e imidazol hasta una concentración final de 1% (p/v) y 20 mM, respectivamente. El pH se ajustó hasta 7,2 con HCl 1 N. Se cargó una muestra que corresponde a un equivalente de cultivo celular de 3 l a 2 ml/min en una columna Ni-IDA Sepharose FF de 25 ml (columna XK 16/20, Pharmacia, Upsala, Suecia), que se había equilibrado con un tampón A que contiene 20 mM de imidazol (A: 50 mM de fosfato, 6 M de Gu.HCl, 1% de laurildimetilbetaína pH 7,2). La columna de Ni-IDA Sepharose se lavó consecutivamente con:
-
tampón A que contiene 20 mM de imidazol
-
tampón A que contiene 35 mM de imidazol
-
tampón A que contiene 50 mM de imidazol
-
tampón B que contiene 50 mM de imidazol (tampón B: 50 mM de fosfato, 6 M de Gu.HCl, pH 7,2)
-
tampón B que contiene 200 mM de imidazol.
Cada etapa de lavado se mantuvo durante la cromatografía hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó el nivel de la línea base. La columna se regeneró con 50 mM de EDTA, 500 mM de NaCl, pH 7,0.
Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE usando condiciones no reductoras y tinción con plata. La proteína de fusión mTNF-NS3B9 se recuperó en la elución de imidazol 200 mM. La transferencia Western, que usa anti-TNF humano de conejo (1 \mug de NS3/fila) y anti-E. coli de conejo (10 \mug de NS3/fila), mostró que la proteína NS3 tenía una pureza de alrededor de 99% después de esta única etapa de cromatografía.
Las fracciones de la elución de imidazol de 200 mM se reunieron y se desalaron.
Se cargó una muestra de eluato de Ni-IDA de 40 ml a 10 ml/minuto en una columna de 300 ml Sephadex G25 (XK 50, Pharmacia, Upsala, Suecia), que se había equilibrado con 50 mM de fosfato, 6 M de urea, 1 mM de EDTA, pH 7,2. Se recogieron fracciones de 10 ml, y la concentración de proteína se determinó mediante el método micro BCA (Pierce, Rockford, IL, US). La concentración de proteína se ajustó hasta 500 \mug/ml, con el tampón de desalado antes de la desulfonación y reducción. El rendimiento global fue de 50-55 mg de proteína de fusión de NS3 purificada/l de equivalente de cultivo.
Finalmente, se añadió DTT (disolución madre: 100 mM en agua destilada) en un exceso molar de 100 veces frente al contenido de cisteína en el antígeno de NS3 (por ejemplo, NS3 19b contiene 7 cisteínas). La disolución se inundó con nitrógeno y se incubó durante 1 h a 28ºC. La muestra de NS3 se diluyó subsiguientemente en el tampón apropiado para el revestimiento con ELISA y con LIA.
Ejemplo 9 Reactividad de anticuerpos de NS3 helicasa ensayada en LIA
A fin de ensayar la reactividad de anticuerpos de NS3 helicasa, se aplicó sobre bandas de membrana de nailon una línea de 50 \mug/ml de disolución de antígeno de NS3 en disolución salina tamponada con fosfato. Las bandas se secaron durante al menos 1 hora a una temperatura entre 18 y 24ºC, y se bloquearon subsiguientemente con PBS/caseína en presencia (10 mM) o en ausencia del agente reductor DTT. Las bandas se lavaron subsiguientemente con PBS que contiene Tween 20 y nada de DTT o 10 mM de DTT, y con agua que no contiene DTT o que contiene 10 mM de DTT y 1 mM de EDTA. Las membranas se secaron durante 30 minutos y se cortaron en bandas para el ensayo de diferentes muestras de pacientes.
En la Tabla 1 se dan los resultados de un experimento en el que las bandas se incubaron con el panel PHV903 de seroconversión anti-HCV (Boston Biomedica Inc., Boston, US).
Ejemplo 10 Reactividad de anticuerpos de NS3 helicasa ensayada en ELISA
A fin de ensayar la reactividad de anticuerpos de NS3 helicasa, se revistieron placas de ELISA con los antígenos de NS3 purificados según el Ejemplo 8, de la siguiente manera.
Los pocillos de la placa de microtitulación se revistieron con proteína NS3 a una concentración de 0,3 \mug/ml de proteína NS3 en tampón de revestimiento que contiene 50 mM de tampón de carbonato, 200 mM de DTT o nada de DTT, y 1 mM de EDTA. Las placas de microtitulación se incubaron durante 18 horas a 20ºC, y se bloquearon con 300 \mul de PBS/tampón de caseína por pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 20ºC y se fijaron subsiguientemente con 300 \mul de tampón de fijación que contiene 200 mM de DTT o nada de DTT, y 1 mM de EDTA durante 2 horas a 20ºC. En las Tablas 2 y 3 se muestran los resultados.
La Tabla 2 da los valores de señal a ruido de ensayos que incluyen NS3 revestida y fijada con o sin DTT, con los paneles PHV901 a PHV912 de seroconversión de BBI. La Tabla 3 muestra un resumen del número de días en los que los anticuerpos de HCV se pueden detectar de forma temprana mediante el ensayo que incorpora DTT. Claramente, se puede obtener un número total de 34 días de detección temprana en 12 seroconversiones de HCV, al incorporar DTT en el ensayo.
TABLA 1 
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{145mm}  ^{1}  - : sin reacción; + : reacción
positiva; las puntuaciones de intensidad se dan en comparación con
diferentes líneas de corte pulverizadas sobre la misma
banda.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
2
3
4
5
TABLA 3
6
Referencias
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Claims (25)

1. Un kit de inmunoensayo en fase sólida que comprende en dicha fase sólida una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en presencia de un agente reductor, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV.
2. Un kit de inmunoensayo que comprende una fase sólida que tiene, como antígeno, una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, que se ha reducido mediante un agente reductor, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV.
3. Un kit de inmunoensayo que comprende una fase sólida que tiene, como antígeno, una proteína NS3 de HCV, o un análogo de la misma, en el que dicha proteína NS3 de HCV, o análogo de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 proteasa o helicasa de HCV, y en el que dicho kit se ha producido añadiendo un agente reductor en al menos una de las etapas a continuación:
(i)
en el revestimiento de dicha fase sólida con dicho antígeno; y
(ii)
en el bloqueo de dicha fase sólida;
(iii)
en la fijación de las proteínas revestidas sobre dicha fase sólida;
(iv)
en el pretratamiento de dicha fase sólida.
4. El kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una secuencia de aminoácidos de NS3 de HCV seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3-18.
5. El kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha proteína NS3 de HCV está contenida en una proteína de fusión.
6. El kit de inmunoensayo según la reivindicación 5, en el que dicha proteína de fusión se selecciona del grupo de secuencias de aminoácidos que constan de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:32.
7. El kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una proteína de NS3 helicasa de HCV, o una parte de la misma, que contiene S1200, A1218, A1384, P1407, V1412, P1424, o F1444, o una combinación de uno de dichos aminoácidos con cualquiera de los siguientes aminoácidos seleccionados del grupo que consta de L1201, S1222, I1274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409, F1410, y en el que dicha proteína de NS3 helicasa de HCV, o una parte de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que define al menos un epítopo de NS3 helicasa de HCV.
8. El kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha proteína NS3 de HCV es una proteína NS3 de HCV tratada mediante un método que comprende las etapas de sulfonación y desulfonación subsiguiente.
9. El kit de inmunoensayo según la reivindicación 8, en el que dicha proteína NS3 de HCV se trata adicionalmente con un detergente bipolar.
10. El kit de inmunoensayo según la reivindicación 9, en el que dicha proteína NS3 de HCV se trata con laurildimetilbetaína como detergente bipolar.
11. Un método para producir un kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho agente reductor está presente en al menos una de las siguientes etapas:
(i)
en el revestimiento de dicha fase sólida con dicho antígeno; y
(ii)
después de (i), en el bloqueo de dicha fase sólida; y
(iii)
después de (ii), en la fijación de las proteínas revestidas sobre dicha fase sólida; y
(iv)
después de (iii), en el pretratamiento de dicha fase sólida.
12. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (i).
13. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (ii).
14. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (ii).
15. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (iii).
16. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (iii).
17. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en la etapa (iv).
18. El método según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor se añade en las etapas (i) y (iv).
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que dicho agente reductor es DTT, DTE o TCEP.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que dicho agente reductor se usa en un intervalo de concentración de 0,1 mM hasta 1 M, más particularmente de 0,5 mM hasta 500 mM, incluso más particularmente de 1 mM hasta 250 mM, y algunas aplicaciones pueden requerir intervalos de 0,5 hasta 50 mM, 1 hasta 30 mM, 2 hasta 20 mM, o 5 hasta 15 mM, o alrededor de 10 mM.
21. El kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un kit ELISA, un kit de ensayo QUICK, o un kit de Inmunoensayo de Línea.
22. El método según la reivindicación 11, en el que dicho kit de inmunoensayo producido es un kit de ELISA, un kit de ensayo QUICK o un kit de Inmunoensayo de Línea.
23. Uso del kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para detectar anticuerpos frente a la proteína NS3 de HCV.
24. Uso del kit de inmunoensayo según la reivindicación 23, para detectar dichos anticuerpos en una muestra biológica.
25. Uso del kit de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para detectar la seroconversión temprana de NS3 de HCV.
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