PT1504266E - Método de deteção simultânea de um antigénio e de um anticorpo de um microrganismo infeccioso - Google Patents

Método de deteção simultânea de um antigénio e de um anticorpo de um microrganismo infeccioso Download PDF

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PT1504266E
PT1504266E PT37499381T PT03749938T PT1504266E PT 1504266 E PT1504266 E PT 1504266E PT 37499381 T PT37499381 T PT 37499381T PT 03749938 T PT03749938 T PT 03749938T PT 1504266 E PT1504266 E PT 1504266E
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Muriel Feyssaguet
Stephanie Henriot
Nadine Lambert
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Description

ΡΕ1504266 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO DE DETEÇÃO SIMULTÂNEA DE UM ANTIGÉNIO E DE UM ANTICORPO DE UM MICRORGANISMO INFECCIOSO" A invenção refere-se à deteção in vitro de uma infeção por um microrganismo infeccioso, nomeadamente virai, e em particular a deteção in vitro de uma infeção por um virus da hepatite C (VHC). A invenção refere-se mais precisamente também a um método de deteção simultânea de um antigénio de um microrganismo infeccioso, nomeadamente virai, e de anticorpos dirigidos contra este mesmo microrganismo infeccioso assim como os reagentes e estojos ("kits") que o põem em prática. Mais particularmente, refere-se a um método de deteção simultânea do antigénio VHC e de anticorpos anti-VHC, e os reagentes e estojos ("kits") que os põem em prática. A infeção pelo virus da hepatite C, uma hepatite inicialmente denominada hepatite Não-A, Não-B, é um problema de saúde preocupante e reconhecido há muito tempo, em particular em transfusão sanguínea. 0 pedido de patente EP 318 216 publicado a 31 de Maio de 1989 descreve a clonagem de fragmentos de ADNc de um virus responsável pela hepatite C no homem, denominado HCV (em inglês) ou VHC (em francês). Este descreve também a 2 ΡΕ1504266 sequência de cinco genes que codifica as proteínas não estruturais (NS1 a NS5) do virus (cerca de 78 % do genoma total do VHC), o antigénio C100-3 (que contém 363 aminoácidos da região NS3-NS4 e em fusão com a dismutase do superóxido) assim como um método de deteção de anticorpos anti-VHC com o auxilio do antigénio C100-3. O método de deteção de anticorpos anti-VHC, referido como primeira geração, permitiu, entre outros, estabelecer que o VHC é uma causa maior de hepatite Não-A, Não-B, atualmente denominada hepatite C, em todo o mundo. No entanto, este método não permite detetar mais do que 70 a 80 % dos soros infetados pelo virus. Esta falta de sensibilidade também não permite uma deteção precoce das infeções.
Okamoto et al. (1990a) e o pedido de patente EP 388 232 publicado a 19 de Setembro de 1990 que descreve a sequência terminal 5' do genoma do virus VHC, ou seja a sequência dos genes que codifica as proteínas estruturais (cápside, matriz, envelope) do vírus responsável pela hepatite C.
Okamoto et al. (1990b) publicam a utilização da sequência dos aminoácidos 39-74 da cápside do VHC como alvo de deteção ELISA dos anticorpos anti-VHC. O artigo Hosein et al. (1991), descreve um imunoensaio de deteção de anticorpos anti-VHC com base no emprego de antigénios peptídicos sintéticos estruturais (cápside: na região AA 1-120) e não estruturais (NS3-NS4: 3 ΡΕ1504266 na região AA 1200-1800). Este demonstra o interesse dos péptidos sintéticos na deteção de anticorpos anti-VHC e da combinação dos antigénios estruturais e não estruturais: aumentando esta a sensibilidade, e deste modo a precocidade, da deteção. O ensaio aqui descrito permite uma deteção de anticorpos mais precoce de 4 a 10 semanas. O artigo mostra também que não existe um epitopo principal imunodominante, como o conhecemos, por exemplo, nos virus da SIDA.
Nasoff et al. (1991) constatam que a maior parte dos epitopos imunorreagentes dominantes da cápside estão localizados na região N-terminal (AA 1-40) e que os anticorpos dirigidos contra os epitopos aparecem precocemente após a infeção.
Os ensaios de deteção de anticorpos anti-VHC referidos como de segunda geração (ou seja com bases na utilização simultânea de antigénios de captura não estruturais e estruturais) constituindo um progresso significativo em relação aos ensaios de primeira geração. No entanto, a estes falta ainda sensibilidade: estes detetam com efeito no seu melhor 95 a 98% dos soros amostrados em doentes contaminados pelo VHC. Consequentemente, esta deteção é ainda muito pouco precoce e deixa ainda passar despercebido as doações de sangue infetado na transfusão e o mais sanguínea. Com efeito, para reduzir os riscos pós-transfusão, é necessário detetar a presença do próprio virus, antes do aparecimento de anticorpos, 4 ΡΕ1504266 precocemente possível após a contaminação. Este período entre a contaminação e a seroconversão (ou seja o aparecimento de anticorpos) é denominado «janela serológica».
Diferentes equipas (Garson et al. (1990); Shieh et al. (1991)) propuseram a deteção do ARN virai pela PCR (Reação em cadeia pela polimerase) para resolver o problema de sensibilidade e de precocidade evocado a seguir. Este método permite com efeito uma deteção extremamente sensível e precoce da infeção pelo VHC, ou seja somente alguns dias após a exposição ao vírus, ou seja 4 a 8 semanas antes do aumento dos anticorpos antivirais circulantes. Esta constitui atualmente um método de referência para a deteção do vírus nos fluidos biológicos.
No entanto, o método da PCR aplicado ao VHC enfrenta diversas dificuldades. Por um lado, este implica a realização de pré-etapas de extração, purificação do ARN, depois transcrição inversa do ARN em ADNc, e uma parte do material virai é perdido durante estas etapas anteriores. Por outro lado, este requer um equipamento de amplificação específica e dispendiosa. Além disso, este não permite tratar simultaneamente um número elevado de amostras e dão frequentemente lugar a contaminações.
Uma outra abordagem, com vista à deteção precoce da infeção pelo VHC, consistiu na deteção do antigénio virai (cápside) circulante. Este antigénio aparece igualmente várias semanas antes do aparecimento dos anticorpos 5 ΡΕ1504266 anti-VHC séricos. Takahashi et al., (1992) descrevem uma técnica de ELISA que deteta o antigénio da cápside com o auxílio de um par de anticorpos.
No entanto, a deteção deste antigénio é difícil de desenvolver devido, em grande parte, da pobre taxa de antigénio detetável no sangue e à qualidade dos reagentes imunológicos disponíveis.
Hajime Tokita et al. (2000) descrevem um imunoensaio de tipo sanduíche com o auxílio de um par de anticorpos monoclonais (5F11 e 5E3), conhecidos no mercado sob o nome «Immucheck F HCV Ag Core Kokusai», de deteção muito sensível. Os autores deste artigo sublinham que uma mutação de Thr49Pro na proteína de cápside reduz a sensibilidade do ensaio. Procurando igualmente detetar o antigénio da cápside num estado precoce, Peterson et al. (2000) expõem uma técnica de deteção de ELISA do antigénio da cápside do VHC com o auxílio de anticorpos monoclonais anti-cápside, sem pré-tratamento da amostra. O artigo mostra, graças à comparação de três ensaios independentes (deteção do ARN do VHC pela PCR, de anticorpos anti-VHC e do antigénio da cápside por ELISA), deste modo o antigénio de cápside circulante do VHC pode ser detetado utilmente nos sacos de sangue recolhidos durante a fase seronegativa precoce da infeção (seja cerca de 1 dia após a deteção do ARN) . A precocidade da deteção da infeção pelo vírus da 6 ΡΕ1504266 hepatite C associada à possibilidade de detetar as respostas anticorpos posteriores à seroconversão em toda a duração da infeção continua a ser objetivo de atualidade, muito particularmente na transfusão.
Na ótica de dispor de um método simples, sensivel, especifico, reprodutível, pouco dispendioso e de realização fácil, automatizável - com vista à despistagem de massa - para detetar, em primeiro lugar, o antigénio de VHC durante o período da janela serológica, depois seguir a evolução serológica do doente após a seroconversão, combinar uma deteção dos anticorpos anti-VHC e uma deteção de um antigénio de VHC é bastante desejável.
No entanto, estes põem um problema maior, o da interferência, na dosagem do antigénio de VHC, entre os anticorpos anti-VHC presentes no soro e os anticorpos anti-VHC marcados. Deste modo, a introdução numa fase sólida, com vista à deteção de um dado anticorpo, de um antigénio alvo que tenha os mesmos epitopos que os reconhecidos pelo(s) anticorpos marcado(s), utilizado(s) com vista à deteção simultânea em sanduíche de um antigénio, seria irremediavelmente uma fixação de anticorpos marcado(s) numa fase sólida e deste modo uma resposta falsamente positiva do ensaio.
Isto é particularmente verdade num sistema de deteção simultânea, na mesma fase sólida, de anticorpos anti-cápside do VHC e do antigénio de cápside do VHC. Deste 7 ΡΕ1504266 modo o depósito na fase sólida, com vista à deteção de anticorpos anti cápside do VHC, de um antigénio de cápside que tem os mesmos epitopos que os reconhecidos pelo(s) anticorpos anti-cápside VHC marcado (s) utilizado(s) com vista à deteção do antigénio capsidico resulta numa fixação de anticorpos marcado(s) na fase sólida e resulta numa resposta falsamente positiva do ensaio.
Para contornar o risco de interferência, a Chiron Corp. realizou ensaios detetam o antigénio de cápside e apenas os anticorpos anti-NS3/NS4 de doentes. Para isto, a Chiron preparou uma parte de um antigénio NS3/4a fixado numa fase sólida, para capturar os anticorpos anti-VHC da amostra testada, e por outro lado parte dos anticorpos monoclonais (cll-3 e cll-7) anti-cápside do VHC, igualmente fixados. Os anticorpos capturados foram detetados por um antigénio em fusão com a SOD (dismutase do superóxido) na presença de um anticorpo monoclonal marcado com a peroxidase, enquanto o antigénio capturado foi detetado por um outro anticorpo monoclonal marcado igualmente com peroxidase (VII European Congress of the International Society of Blood Transfusion - Paris, 15-18 julho de 2001) .
Face ao problema das interferências, a patente EP 1 020 727 (Advanced Life Science Institute) propôs um método de medição simultânea do antigénio de cápside VHC e dos anticorpos anti-cápside VHC (um ensaio do tipo «Combo»), na qual o antigénio é capturado e marcado pelos 8 ΡΕ1504266 anticorpos dirigidos contra os epitopos capsidicos diferentes dos epitopos capsidicos servem simultaneamente para a captura e a revelação ou deteção de anticorpos anti-cápside. Um exemplo representativo é dado em que, no ensaio simultâneo de deteção do antigénio em sanduiche e os anticorpos em ensaio indireto, se utiliza, para detetar o antigénio, um primeiro anticorpo (de captura), dirigido contra os epitopos da sequência do aminoácido (AA) 100 ao aminoácido 130 da cápside do VHC, e um segundo anticorpo (de deteção) , dirigido contra os epitopos da sequência AA40-50, e, para detetar os anticorpos, o antigénio de captura utilizado contém pela sua parte as sequências AA1-42 e AA66-80.
Este método não é, no entanto, isento de inconvenientes, em particular porque este necessita de utilização de anticorpos dirigidos contra os epitopos relativamente distantes uns dos outros, e que são com efeito epitopos menores, pouco imunogénicos. Tem ainda um inconveniente, do facto da ausência da sequência AA43-65, de não detetar os anticorpos dirigidos contra esta última sequência e, deste modo, de perder em sensibilidade. Além disso, realiza a captura do antigénio capsídico e a captura dos anticorpos anti-cápside através de duas zonas da proteina da cápside claramente distintas, i. e. não sobreponiveis (AA 1-42 e AA 66-80 para detetar os anticorpos e AA 100-130 para detetar o antigénio) como diferença da presente invenção. 9 ΡΕ1504266 O pedido de patente WO 01/96875 A2 (CHIRON) descreve, entre outros, um ensaio de deteção simultânea da cápside e anticorpos anti NS3 e NS4 (um « Combo incompleto », figura 2) utilizando N-laurilsarcosina como detergente. Este evoca, pelo contrário, muito sumariamente, na figura 8 e página 33, um ensaio « Combo completo », i. e. um ensaio de deteção simultânea do antigénio de cápside (em sanduíche) e anticorpos anti-cápside e anti-proteínas não estruturais do VHC (em sanduíche de antigénio duplo) . Utiliza-se, para capturar o antigénio, dois anticorpos, cll-3 e cll-7, considerado por reconhecer uma vasta porção N-terminal (AA 10-53) da cápside do VHC, e para a deteção um terceiro anticorpo, cll-14, considerado por reconhecer uma porção C-terminal (AA 120-130) da cápside do VHC. Para detetar os anticorpos, o antigénio de captura utilizado é um antigénio de fusão com epitopos múltiplos (« MEFA 12 », ver tabela 2 do pedido WO 01/96875) gue contem, em fusão com um fragmento de superóxido-dismutase (« SOD ») , os antigénios NS3, NS4, NS5 e as séries de seguências capsídicas de várias estirpes de VHC: AA 9-53, portadora da mutação R47L, AA 64-88 e AA 67-84. As sequências AA 54-63 e AA 54-66 estão ausentes destas duas séries de sequências.
No entanto, a implementação rela do ensaio « Combo completo » do pedido de patente WO 01/96875 A2 não é descrito. É deste modo impossível para um especialista da técnica determinar claramente e sem ambiguidade se o ensaio Combo da figura 8 pode funcionar, ainda menos se pode satisfazer o problema apresentado, i. e. detetar também 10 ΡΕ1504266 precocemente a possível infeção por um VHC. Em qualquer caso, é claro que, no melhor dos casos, o Combo do pedido de patente WO 01/96875 A2 perdia inevitavelmente a deteção de todos os anticorpos dirigidos contra as sequências ausentes AA 54-63 e AA 54-66. Seguir-se-ia um risco de perda de sensibilidade. 0 pedido de patente EP 1 251 353 A2 (Ortho-Clinical Diagnostics) descreve um ensaio « Combo completo » utilizando os mesmos anticorpos para a deteção da cápside, sem, no entanto, precisar a sua origem nem a sua especificidade epitópica. Por outro lado, precisa que o detergente utilizado é um detergente de tipo BRIJ ou MYRJ, que é aparentemente preferido à N-laurilsarcosina do estojo ("kit") de deteção do antigénio capsídico comercializado por Ortho Clinicai Diagnostics (ver exemplo 3 [0012]). A deteção dos anticorpos anti-cápside faz-se com o auxílio de um antigénio de cápside modificada (por mutagénese): C22KSNV47,48 (proteína de fusão com uma SOD compreendendo a sequência capsídica AA 10-99 removida dos aminoácidos 47 e 48) ou C22KSR47L (proteína de fusão com uma SOD compreendendo a sequência capsídica AA 10-99, com uma leucina substituindo uma arginina na posição 47). 0 pedido de patente WO 03/002 749 A2 (Abbott) descreve vários antigénios e ensaios de deteção de antigénio capsídico do VHC. O ensaio isolado « Combo completo » que descreve - sob o nome de « Real Combo » (Figura 1, e página 59) utiliza, para a deteção dos 11 ΡΕ1504266 anticorpos anti-cápside, um péptido biotinilado correspondente aos aminoácidos 11-28 da cápside, imobilizado em fase sólida. Para a deteção da cápside, realiza a combinação de anticorpos de Advanced Life Science Institute Cll-14 (reconhecendo a sequência capsidica AA 45-50) em fase sólida e Cll-10 (reconhecendo a sequência capsidica AA 32-36) marcada com acridina. 0 pedido WO 03/002 749 A2 realiza deste modo a captura do antigénio capsidico e a captura dos anticorpos anti-cápside através de dois sitios capsídicos claramente distintos, i. e. não sobrepostos, (AA 11-28 para detetar os anticorpos e AA 45-50 para detetar o antigénio) como diferença da presente invenção.
Os autores da presente invenção foram então determinados a desenvolver um método alternativo para resolver o problema colocado.
Foi agora encontrado um método de deteção simultânea de um antigénio de VHC e de anticorpos de um doente dirigidos contra este antigénio que evita este problema de interferência e que atinge niveis de sensibilidade e de precocidade de deteção que se aproximam dos da PCR, permitindo seguir a evolução serológica do doente após a seroconversão.
Os autores da invenção resolvem este problema tornando artificialmente diferentes, por modificação da estrutura, de certos epitopos de antigénios alvo utilizados para capturar os anticorpos. Os epitopos assim modificados 12 ΡΕ1504266 são deste modo destruídos. Simultaneamente, os anticorpos utilizados para a captura e/ou a deteção dos antigénios são selecionados de forma a reconhecerem com precisão os epitopos não modificados presentes nos antigénios do doente, e a não poderem deste modo ligar-se aos antigénios modificados, que não apresentam mais os mesmos epitopos. Uma vez que os epitopos já não são idênticos, já não existe deste modo competição entre os anticorpos utilizados para capturar e/ou detetar o antigénio de VHC e os anticorpos do doente. Ao inverso de um certo número de técnicas da técnica anterior, a captura do antigénio da cápside e a dos anticorpos anti-cápside poder-se-á fazer numa única e mesma zona proteica da cápside e evitar-se-á a perda de deteção de um certo número de anticorpos anti-cápside, como se verá a seguir.
Foram identificados múltiplos epitopos na parte N-terminal da cápside, esta zona proteica é a mais apropriada para obter à vez uma deteção muito sensível do antigénio da cápside e dos anticorpos anti-cápside.
Graças à presente invenção, é possível utilizar simultaneamente para a deteção dos anticorpos e dos antigénios as sequências mais imunorreativas e aumentar assim a sensibilidade da deteção.
Escusado será dizer que a invenção não está limitada à deteção da infeção isolada devida ao vírus da hepatite C (VHC). Esta engloba também a generalização do 13 ΡΕ1504266 método, dos reagentes e dos estojos ("kits") descritos a seguir, para a deteção da infeção, e/ou da monitorização da infeção, devido a todas as formas de microrganismos infeccioso (como os virus, tais como, por exemplo, os vírus responsáveis pelas diversas hepatites A, B, C, D ou E, os retrovírus, em particular os retrovírus responsáveis de SIDA no homem (VIH-1, VIH-1 grupo 0, VIH-2) ou no macaco, o citomegalovírus (CMV), os flavivírus, em que os vírus do dengue, assim como as bactérias, os parasitas microbiano, etc.) para os quais uma deteção simultânea de antigénios e de anticorpos é adequada. A invenção, aqui mais particularmente descrita para o vírus da hepatite C (VHC), é de um alcance muito geral que o especialista da técnica aprenderá facilmente. A invenção é tal como definido nas reivindicações 1 a 31.
Definições 0 termo « virus da hepatite C » ou « VHC » cobre aqui todas as estirpes, todos os tipos, subtipos e genótipos do vírus responsável da hepatite C. 0 método da invenção visa com efeito detetar toda a infeção pelo VHC, qualquer que seja a sua origem e seu genótipo. Este compreende em particular os tipos e subtipos bem conhecidos do vírus circulante na Europa, aos Estados Unidos, no Japão, etc... (ou seja os 6 genótipos principais: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e seus subtipos 1 a, lb, 3a, ... ) . Ver Stuyver et al. (1994); Bukh (1995). 14 ΡΕ1504266
Por « vírus da imunodeficiência humana » ou « VIH », entende-se todas as estirpes, todos os tipos, subtipos, grupos e genótipos do retrovirus responsável da SIDA no homem. 0 termo VIH reagrupa em particular os VIH-1 (VIH-1 do grupo M, VIH-1 do grupo 0), e os VIH-2 e suas variantes.
No contexto da invenção, uma «amostra biológica » é de preferência constituida por um fluido biológico, tal como sangue, plasma, soro, urina, liquido cefalorraqui-diano, saliva, etc... 0 termo «anticorpo» refere-se a todos os anticorpos inteiros ou fragmento funcional de um anticorpo compreendendo ou consistindo em pelo menos um sitio de combinação antigénica, permitindo que os referidos anticorpos se liguem a pelo menos um determinante antigénico de um composto antigénico. A titulo de exemplo de fragmentos de anticorpo podem citar-se os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 assim como as cadeias scFv (Fragmento Variável de Cadeia Única), dsFv (Fragmento Variável de Cadeia Dupla), etc... Estes fragmentos funcionais podem nomeadamente ser obtidos por engenharia genética. A produção de anticorpos monoclonais ou de soros policlonais monoespecificos úteis no âmbito da invenção reporta técnicas convencionais, que são detalhadas a seguir.
Por « anticorpo de captura », entende-se um 15 ΡΕ1504266 anticorpo ou uma parte dos anticorpos, de preferência fixados numa fase sólida, que é capaz de recordar um antigénio do microrganismo, por exemplo do VHC ou de um VIH, presente numa amostra biológica, por ligação afim. A presença dos anticorpos e antigénios na amostra biológica é revelado através de « meios de deteção ». Tratando-se da deteção do antigénio, a invenção prevê nomeadamente uma deteção com o auxílio de pelo menos um « anticorpo de deteção ». Um destes anticorpos de deteção, marcado, é capaz de se ligar ao antigénio capturado, por ligação de afinidade, reconhecendo um sítio epitópico, diferente do reconhecido pelos anticorpos de captura, ou idêntico devido à presença do motivo repetitivo ao nível da cápside. Tratando-se da deteção dos anticorpos, pode utilizar-se nomeadamente anticorpos anti-imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcados, por exemplo anti-imunoglobulinas G. 0 termo « marcado » refere-se também tanto a uma marcação direta (através de enzimas, radioisótopos, fluorocromos, compostos luminescentes, etc) como a uma marcação indireta (por exemplo, através de anticorpos eles mesmos marcados de maneira direta ou com o auxílio de reagentes de um « par de afinidade » marcado, tal como, mas não exclusivamente, um par avidina marcada-biotina, etc.).
Por « fragmento antigénico », entende-se toda ou parte de uma proteína natural ou recombinada de um microrganismo infeccioso, tal como o vírus da hepatite C ou 16 ΡΕ1504266 o VIH, capaz de induzir a síntese de anticorpos num doente infetado ou num animal imunizado. Pode nomeadamente tratar-se de toda ou parte da proteína da cápside, ou de proteínas não estruturais do VHC, em particular NS3 e NS4, sejam elas obtidas por engenharia genética ou não. Pode igualmente tratar-se de toda ou parte de uma proteína codificada pelo gene gag de um VIH, em particular a P25 (VIH-1) ou a P26 (VIH-2), ou de uma proteína codificada pelo gene do envelope, nomeadamente a gp41 (VIH-1) ou a gp36 (VIH-2).
Por « antigénio de captura », entende-se um fragmento antigénico isolado, de preferência fixado numa fase sólida, que é capaz de ser reconhecido por anticorpos dirigidos contra o microrganismo, tais como os anticorpos anti-VHC ou anti-VIH e de permitir uma ligação de afinidade com estes últimos.
Por « antigénio de deteção », entende-se um antigénio marcado e modificado como o antigénio de captura (i. e. contém pelo menos um sítio epitópico ou epitopo destruído). Permite detetar por competição o antigénio capturado, ou detetar os anticorpos pelo método sanduíche de antigénio-anticorpo-antigénio clássico, também denominado método « sanduíche de duplo antigénio » (Maiolini et al. (1978)).
De acordo com o exposto na presente invenção, o antigénio de captura, e/ou o antigénio de deteção eventualmente utilizado, em particular na deteção de 17 ΡΕ1504266 anticorpos por sanduíche antigénio-anticorpo-antigénio, contém pelo menos um sítio epitópico ou epitopo destruído. Um « sítio epitópico » ou « epitopo » é uma sequência de aminoácidos que é reconhecida por um anticorpo e permite a ligação específica deste.
No que respeita às proteínas do VHC, vários epitopos da proteína da cápside foram identificados. Conhece-se nomeadamente os epitopos localizados entre o aminoácido 16 e o aminoácido 40, e entre o aminoácido 44 e o aminoácido 47. Pode referir-se também, por exemplo, aos artigos ou divulgações de Okamoto et ai. (1990); Nasoff et al. (1991); Leahy et al. (1991); Takahashi et al. (1992); Sállberg et al. (1992), e Ishida, (1993). Vários epitopos de proteínas não estruturais do VHC são conhecidos também do especialista da técnica. Na proteína NS3, conhecem-se os epitopos localizados entre o aminoácido 1188 e o aminoácido 1493 (Yang et al. (1995)), entre o aminoácido 1175 e o aminoácido 1334 (Yang et al. (1999)), e um epitopo entre o aminoácido 1460 e o aminoácido 1532 (Clayes et al. (1995)).
Um dos epitopos NS4 mais conhecidos, o epitopo 5-1-1 (AA 1689-1706), é citado em Cerino et al. (1991).
Por ser o VIH, vários epitopos foram igualmente descritos na técnica anterior. Trata-se nomeadamente de epitopos da proteína P25 do VIH-1 (grupo M) localizados 18 ΡΕ1504266 entre os aminoácidos 293 a 350, mais igualmente do epitopo imunodominante da gp41 descrito por Gnann et al. (1987) ou uma variante desta sequência; trata-se ainda de um epitopo da proteina P26, em particular um epitopo de sequência homóloga à do epitopo da P25 do VIH-1 descrito a seguir, por exemplo, ou de um epitopo da gp36 do VIH-2, em particular o epitopo imunodominante da gp36 descrito por Gnann et al. (1987), ou uma variante desta sequência.
Por sitio epitópico ou epitopo « destruído », entende-se que este é modificado na sua estrutura (primária, secundária, terciária e/ou quaternária) de maneira a que o antigénio de captura, ou de deteção, que compreende este epitopo destruído não pode mais ligar-se ao anticorpo de captura, e/ou ao anticorpo de deteção, dirigido contra o antigénio detetado simultaneamente, conservando no entanto a capacidade de ligar os anticorpos dirigidos contra o microrganismo, tis como os anticorpos anti-VHC ou anti-VIH, eventualmente presentes na amostra biológica, por reconhecimento de outros sitios epitópicos que ficaram intactos. Consequentemente, os anticorpos de captura e/ou de deteção são selecionados de forma a reconhecer especificamente o epitopo em questão na sua forma « intacta », ou seja « não destruida » ou « nativa», no antigénio presente na amostra biológica. No âmbito da presente invenção, este epitopo na forma intacta é igualmente denominado epitopo "homólogo" do epitopo destruido. 19 ΡΕ1504266 O termo «especificamente» quando se refere a um reconhecimento ou uma ligação especifica de um anticorpo para um antigénio, significa que o anticorpo interage com o antigénio sem interação substancial com outros antigénios, ou se se fala de reconhecimento « especifico » com um epitopo, por reconhecimento quase exclusiva deste epitopo. As constantes de associação superiores a 108 L.mol"1 são preferíveis.
Anticorpos de captura e de deteção
Os anticorpos utilizados na presente invenção são anticorpos específicos para o antigénio, e, por esta razão, são anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais monoespecíficos, ou seja, não reconhecem especificamente mais do que um epitopo.
Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de acordo com o método clássico de fusão linfocitária e cultura de hibridomas descrito por Kõhler e Milstein, (1975). Outros métodos de preparação de anticorpos monoclonais são igualmente conhecidos (Harlow et al. (1988)). Os anticorpos monoclonais podem ser preparados em imunizando um mamífero (por exemplo um murganho, um rato, um coelho, ver um ser humano, etc...) e utilizando a técnica de fusão linfocitária conduzindo a hibridomas (Kõhler e Milstein, 1975).
As técnicas alternativas a esta técnica convencional existem. Pode-se, por exemplo, produzir anticorpos 20 ΡΕ1504266 monoclonais por expressão de um acide nucleico clonado a partir de um hibridoma. Pode-se igualmente produzir os anticorpos pela técnica de expressão em fagos (« exposição em fagos »), introduzindo o ADNc dos anticorpos em vetores, que são tipicamente fagos filamentosos (por exemplo, fUSE5 para E. coli, Scott et al. (1990)). Estes últimos constituem bancos e apresentam fragmentos scFv à sua superfície. Os protocolos de construção destes bancos de anticorpos são descritos em Marks et al. (1991).
Os anticorpos policlonais podem ser obtidos a partir do soro de um animal imunizado contra um antigénio de natureza peptídica de acordo com os modos operativos comuns.
De uma maneira geral, pode utilizar-se, por exemplo, como imunogénio, um polipéptido, em particular recombinado, ou um oligopéptido. De acordo com um protocolo clássico, dos coelhos são imunizados com o equivalente de 1 mg do imunogénio peptídico de acordo com um procedimento descrito por Benoit et al. (1982). A intervalos de quatro semanas, os animais são tratados por injeções de 200 mg de antigénio e sangrados 10 a 14 dias mais tarde. Após a terceira injeção, avaliou-se a capacidade do antissoro para se ligar ao péptido antigénio radiomarcado com iodo, preparado pelo método de cloramina-T. Purifica-se a seguir por cromatografia em coluna de troca iónica constituída por carboximetilcelulose (CMC). As moléculas de anticorpos recolhidas por eluição são a seguir ajustadas à concentração adequada por métodos bem conhecidos do especialista 21 ΡΕ1504266 da técnica, por exemplo, utilizando DEAE Sephadex para obter a fração de IgG.
Para aumentar a especificidade do soro policlo-nal, os anticorpos podem ser purificados por uma cromato-grafia de imunoafinidade (ou de imunoabsorção) utilizando péptidos (tais como os péptidos da cápside AA 16-44 e AA 39-74 do VHC, a titulo de exemplo não limitativo) que serviram para a imunização e imobilizados em fase sólida. 0 antissoro é colocado em contacto com um desses péptidos imobilizados em fase sólida durante uma duração suficiente de forma a fazer imunorreagir o péptido com a molécula de anticorpo a fim de formar um complexo imunológico em fase sólida.
Os inventores utilizaram deste modo mais particularmente os anticorpos anti-VHC específicos indicados na Tabela 1 a seguir.
Tabela 1
Anticorpo Monoclonal Classe Epitopo natural reconhecido Acm 1 IgG2a 44LGVR47 (SEQ ID N° 19) Acm 2 IgG2a 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° 20) Acm 3 IgGl 29QIVGGV34 (SEQ ID N° 21) Acm 4 IgGl 29QIVGGV34 (SEO ID N° 21) Acm 5 IgGl 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° 20) Acm 6 IgGl 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° 20) 22 ΡΕ1504266
No que respeita ao teste Combo para a deteção do VIH, o anticorpo utilizado é de um modo preferido um anticorpo monoclonal reconhecendo uma das sequências polipeptidicas seguintes, ou a sequência correspondente de uma estirpe VIH variante: - epitopo da proteína P25 de um VIH-1 do grupo M da sequência 308QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID N° 24), - epitopo da proteína P26, em particular um epitopo de sequência homóloga com a do epitopo da P25 do VIH-1 descrita pelo identificador de sequência SEQ ID N° 24, como por exemplo um epitopo contendo a sequência QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N° 25) (isolado VIH-2: ROD).
Escusado será dizer que será da responsabilidade do especialista da técnica produzir ou procurar anticorpos monoclonais, de especificidade epitópica semelhante ou idêntica à descrito para os anticorpos a seguir, e que convêm à realização da presente invenção.
Antigénios de captura e/ou de deteção 0 antigénio de captura, e/ou o antigénio de deteção, utilizado na invenção contém pelo menos um sítio epitópico destruído. A destruição de pelo menos dois sítios no antigénio pode ser necessária, uma vez que dois anticorpos diferentes, que podem os dois interagir com o 23 ΡΕ1504266 antigénio de captura e/ou o antigénio de deteção, são utilizados. É o caso, por exemplo, para os imunoensaios de tipo sanduíche, que utilizam um anticorpo de captura imobilizado na mesma superfície que o antigénio de captura, e um anticorpo de deteção. 0 anticorpo de captura é deste modo selecionado para que este reconheça especificamente um epitopo, no antigénio natural do doente, homólogo de um dos dois epitopos destruídos no antigénio de captura, desde que o anticorpo de deteção seja selecionado de forma a reconhecer especificamente um epitopo, no antigénio natural do doente, homólogo dos outros dois epitopos destruídos no antigénio de captura. 0 antigénio de captura e/ou o antigénio de deteção, pode compreender, ou consistir, num péptido que mima toda ou uma parte de um epitopo proveniente de uma proteína antigénica do microrganismo, em particular do VHC ou de um VIH.
De preferência, trata-se de um péptido da proteína da cápside, sendo a deteção dos anticorpos anti-cápsides particularmente vantajosa, nomeadamente no caso de hepatites crónicas, em que se observa muito poucos antigénios, e além disso anticorpos anti-cápside circulantes. Pode igualmente tratar-se de péptido(s) de uma proteína não estrutural, tal como a NS3 e/ou a NS4. Diversos antigénios de captura, ou de deteção, podem ser igualmente combinados em conjunto. Este modo de realização, que utiliza vários antigénios de captura, e/ou de deteção, 24 ΡΕ1504266 diferentes, permite, por exemplo, a deteção simultânea de anticorpos anti-cápside e de anticorpos anti-proteinas não estruturais NS3 e/ou NS4 do VHC. Uma deteção simultânea dos anticorpos anti-cápside e dos anticorpos anti-NS3 é particularmente preferida. A invenção compreende igualmente uma deteção simultânea de antigénio capsidico, de anticorpos anti-cápside, de anticorpos anti-proteinas estruturais do envelope El e/ou E2, de antigénio do envelope El e/ou E2, e/ou de anticorpos anti-proteinas não estruturais NS3 e/ou NS4 do VHC. Outras combinações utilizáveis fazem também parte da invenção.
Do mesmo modo, a deteção simultânea do antigénio gag, de anticorpos anti-gag, e/ou de anticorpos anti-envelope de virus do SIDA (VIH-1, VIH-2, etc..) cujas sequências foram publicadas nos artigos de Wain-Hobson et al. (1985), Ratner et al. (1985), Sanchez-Pescador et al. (1985), Guyader et al. (1987) faz também parte da invenção. De um modo preferido, o antigénio gag a detetar é a proteína P25 do VIH-1 ou a P26 do VIH-2 e os anticorpos anti-gag pesquisados são dirigidos contra estas proteínas. Sempre, de um modo preferido, os antigénios do envelope para detetar os anticorpos anti-envelope do VIH-1 e do VIH-2 são a gp41 do VIH-1 e a gp36 do VIH-2.
De um modo semelhante, a deteção do antigénio NS1, descrito por Alcon et al., (2002) em simultâneo com a dos anticorpos anti-NSl, ver também de anticorpos anti-NS2, NS3, e/ou S4 dos vírus do dengue, fazem também parte da invenção. 25 ΡΕ1504266
As técnicas de aplicação são bem conhecidas do especialista da técnica.
De um modo preferido, e também mais prático, os antigénios de captura, e/ou de deteção, são péptidos sintéticos produzidos pelas técnicas convencionais bem conhecidos do especialista da técnica. Pode citar-se como exemplo a sintese de tipo Merrifield que é vantajosa por razões de pureza, de especificidade antigénico, de ausência de produtos secundários não desejáveis e pela sua facilidade de utilização (Merrifield, (1963); R.C.Sheppard (1971), Atherton et al. (1989)). Como sintetizador automático, pode utilizar-se o sintetizador "9050 Plus Pep Syn-thesizer" de Millipore, o sintetizador "Pioneer" de Per-septive, o sintetizador "433A" de ABI (Applied Biosystems Inc.) ou o sintetizador « Symphony » de Rainin. Os péptidos podem igualmente ser obtidos por sintese em fase homogénea. A destruição dos epitopos nestes antigénios de captura, e/ou de deteção, pode ser realizada por diversas maneiras. Uma única condição requerida nesta modificação dos sítios epitópicos é que o antigénio de captura, e/ou de deteção, não se pode ligar ao anticorpo de captura, e/ou ao anticorpo de deteção, conservando substancialmente a capacidade de ligar os anticorpos dirigidos contra o microrganismo, em particular anticorpos anti-VHC ou anti-VIH, eventualmente presentes na amostra biológica. 26 ΡΕ1504266
Uma modificação de pelo menos um aminoácido, de preferência dois aminoácidos, em cada sitio epitópico visado, pode ser suficiente para destruir o epitopo, sem no entanto destabilizar os outros epitopos não modificados. Uma tal modificação pode ser nomeadamente obtida por uma substituição de aminoácido, por exemplo substituindo um resíduo não glicina por um resíduo glicina ou alanina, ou substituindo um aminoácido de uma classe por um aminoácido de uma outra classe. Pode-se, por exemplo, substituir um aminoácido na cadeia lateral polar (tal como a asparagina, a glutamina, a serina, a treonina e a tirosina), por um aminoácido na cadeia lateral não polar (tal como a glicina, a alanina, a valina, a leucina, a isoleucina, a fenilalanina, a metionina, o triptofano e a cisteína), e vice-versa. Pode-se igualmente substituir um aminoácido na cadeia lateral básica (tal como a lisina, a arginina e a histidina), por um aminoácido na cadeia lateral ácida (tal como ácido aspártico e o ácido glutâmico), e vice-versa, ou ainda substituir um aminoácido em que a cadeia lateral é portadora de um ciclo (por exemplo a tirosina, a fenilalanina), por um aminoácido na cadeia lateral linear e vice-versa. Uma deleção de um ou mais aminoácidos, ou uma inserção de um ou mais aminoácidos, em particular de aminoácidos não naturais, no epitopo, permite igualmente destruir o epitopo. As modificações dos grupos funcionais dos aminoácidos, nomeadamente dos grupos OH, NH2, ou SH, são igualmente possíveis.
De entre os péptidos úteis no âmbito da presente 27 ΡΕ1504266 invenção, podem conceber-se péptidos derivados de todos os tipos de microrganismos infecciosos (como os vírus, tais como, por exemplo, os vírus responsáveis por diversas hepatites, os retrovírus, em particular os retrovírus responsáveis da SIDA (VIH-1, VIH-2,..), o vírus CMV, os vírus do dengue, assim como as bactérias, os parasitas microbianos, etc..) para os quais uma deteção simultânea de antigénios e de anticorpos é adequada.
Em particular, e a título de ilustração e não exclusivo, podem citar-se nomeadamente os péptidos da cá-pside do VHC, mais particularmente os contendo os aminoáci-dos 1 a 75, 6 a 68 e 1 à 53. Estas sequências, que correspondem às sequências consenso do genótipo 1 (subtipos la, lb, lc) são apresentados na lista de sequências anexada e designados respetivamente como SEQ ID N°: 1, N°: 2 e N°: 3: SEQ ID No,1 :
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQtV31GGV34YL36LPRRGPRL44GV R47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 SEQ ID No.2:
6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV3iGGVMYULPRRGPRUGVR47ATR KTSERSQPRGRRQPIPKAee SEQ ID No.3:
^STNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVsiGGVwYLaeLPRRGPRUGV R47ATRKTS53
Da mesma maneira, um péptido ou polipéptido útil no âmbito da presente invenção é um polipéptido gag ou do envelope de um VIH. 28 ΡΕ1504266
Trata-se em particular de um péptido correspondente sequência consenso da proteina P25 do VIH-1 em que a sequência é designada pelo identificador de sequência SEQ ID N°:23 na lista de sequências anexada.
Pode tratar-se igualmente de um péptido compreendendo um epitopo da gp41 de um VIH-1, nomeadamente um péptido de sequência SEQ ID N°: 26 à SEQ ID N°: 31: SEQ ID N°: 26: LGLWGCSGKLIC, SEQ ID N°: 27:LGIWGCSGKLIC, SEQ ID N°: 28: LGLWGCSGKHIC,
SEQ ID N°: 29: LGMWGCSGKHIC
SEQ ID N°: 30: RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC SEQ ID N°: 31: RILAVERYLKDQQLLGIWGSGKLICTTAVPWNAS. A utilização de um polipéptido gag ou do envelope de um VIH-2 como antigénio de captura e/ou de deteção faz igualmente parte da presente invenção. Trata-se em particular de um polipéptido da gp36, de sequência SEQ ID N°: 32 ou SEQ ID N°: 33 tal como se segue: SEQ ID N°: 32: LNSWGCAFRQVC, SEQ ID N°: 33: RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS.
Pode também tratar-se de um polipéptido da 29 ΡΕ1504266 proteína P26 de um VIH-2, por exemplo um polipéptido de sequência homóloga à do polipéptido da proteína P25 descrita pelo identificador de sequência SEQ ID N°: 23.
Fazem igualmente parte da invenção dos péptidos ou polipéptidos modificados, úteis como antigénios de captura, e/ou de deteção. Trata-se em particular de fragmentos peptídicos de cápside, portadores de pelo menos um sítio epitópico modificado. Um objetivo da invenção é deste modo um péptido ou polipéptido derivado da proteína da cápside do VHC, portador de pelo menos um sítio epitópico intacto e pelo menos um sítio epitópico destruído, sendo o referido sítio epitópico destruído tornado deste modo incapaz de ser reconhecido por um anticorpo anti-cápside. Os péptidos preferidos apresentam uma substituição de dois, três ou quatro aminoácidos, nomeadamente na parte constituída pelos aminoácidos 20 a 40 e na parte constituída pelos aminoácidos 44 a 47. As mutações seguintes são particularmente interessantes e preferidas: - substituição dos aminoácidos 34, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 4, péptido designado « Cap 1-75 (G34-G44-G47) » ): SEQ ID No.4 : Cap 1-75 (G34-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV3iGGG34YL3eLPRRGPRG44G VG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 - substituição dos aminoácidos 31, 44, e 47 pelos 30 ΡΕ1504266 resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 5, péptido designado «Cap 1-75 (G31-G44-G47) »); SEQ ID No.5 .* Cap 1-75 (G31-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG3iGGV34YL3SÍ-PRRGPRG44G VG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 - substituição dos aminoácidos 36, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 6, péptido designado « Cap 1-75 (G36-G44-G47) »), SEQ ID No.6 : Cap 1-75 (G36-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YG36LPRRGPRG44G VG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 - substituição dos aminoácidos 34, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 7, péptido designado « Cap 6-68 (G34-G44-G47)» ), SEQ ID No.7 : Cap 6-68 (G34-G44-G47) 6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQíV3iGGG34YL3eLPRRGPRG44GVG47A* RKTSERSQPRGRRQPlPKAee - substituição dos aminoácidos 31, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 8, péptido designado « Cap 6-68 (G31-G44-G47)» ), SEQ ID N0.8 : Cap 6-68 (G31-G44-G47)
6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47AT RKTSERSQPRGRRQPlPKAee 31 ΡΕ1504266 - substituição dos aminoácidos 36, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 9, péptido designado « Cap 6-68 (G36-G44-G47)» ), SEQ ID No.9 : Cap 6-68 (G36-G44-G47)
6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGÔQlV3iGGV34YG36LPRRGPRG44GVG47AT RKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRSts - substituição dos aminoácidos 34, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 10, péptido designado « Cap 1-53 (G34-G44-G47) » ), SEQ ID No.10: Cap 1-53 (G34-G44-G47)
iMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQtVaiGGG^YLaeLPRRGPRGwG VG47ATRKTS53 - substituição dos aminoácidos 31, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 11, péptido designado « Cap 1-53 (G31-G44-G47)» ), SEQ ID No. 11 : Cap 1-53 (G31-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG3,GGV34YL3sLPRRGPRG44G VG47ATRKTS53 - substituição dos aminoácidos 36, 44, e 47 pelos resíduos de glicina (sequência SEQ ID N°: 12, péptido designado « Cap 1-53 (G36-G44-G47)» ), SEQ ID No. 12 : Cap 1-53 (G36-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV3,GGV34YG36LPRRGPRG44G VG47ATRKTS53 ΡΕ1504266 32 - deleção dos aminoácidos 45, e 46: SEQ ID No.13 : Cap 1-75 (G34-del(45~46)) iMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGGlVaiGGGMYUsLPRRGPRU»- R47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 - modificação do comprimento do esqueleto: SEQ ID No. 14 : Cap 1-75 {G34-fJA45} tMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVaiGGGwYLaeLPRRGPRU* PAísVRMTRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRSts em que βΑ representa a β-Alanina - modificação do comprimento do esqueleto por inserção do aminoácido e mutações: SEQ «D No.15 : Cap 1-75 (G34-G46-G46*) iMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVaiGGGwYLjieLPRRGPRLMGAs G46G46'R47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75 - inversão de polaridade: SEQ ID No.16 : Cap 1-75 (nL29-G30-G44-G47) ,MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGnL29G3oV3iGGV34Yt36LPRRGPR G44G V G47ATRKT S E RSQ PRGRRQ P í PKARRP EG RS75 em que nL representa a norLeucina - substituição de aminoácidos 33 ΡΕ1504266 SEQ ID No. 17 : Cap 1-75 (G34-F35-G44-G47) ,MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQiV3iGGG34F35L3eLPRRGPRG44 GVGítATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS/s - substituição de aminoácidos SEQ ID No.18 : Cap 1-75 (G34-hS35-G44-G47) ,MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQlV3iGGG34hS3st36LPRRGPRG44 GVG47ATRKTSERSQPRÔRRQPIPKARRPEGRS75 em que hS representa a homoSerina. A invenção trata-se igualmente de um péptido ou polipéptido proveniente de uma proteina gag de um VIH, portador de pelo menos um sitio epitópico intacto e pelo menos um sitio epitópico destruido, sendo o referido sitio epitópico destruido deste modo tornado incapaz de ser reconhecido por um anticorpo dirigido contra a mesma proteina gag. Mais particularmente o referido polipéptido compreende uma sequência consenso da proteina P25 do VIH-1 e pode apresentar uma substituição de um, dois, três, quatro ou cinco aminoácidos, nomeadamente na parte constituída pelos aminoácidos 293 a 322. De um modo preferido, o referido polipéptido modificado apresenta a sequência consenso da proteína P25 do VIH-1 (M) na qual os aminoácidos 295, 298, 310, e 312 foram substituídos por um resíduo de glicina, e o aminoácido 316 por um resíduo de fenilalanina: 34 ΡΕ1504266 293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATL EEMMTACs» (SEQ ID No.22)
Além da utilização destas sequências peptidicas, pode ser vantajoso juntar na posição N-terminal os amino-ácidos C-G-G- (i. e. Cys-Gly-Gly-) afim de poder mais facilmente fixar a um suporte todas as moléculas de interesse. 0 péptido C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47) é parti cularmente vantajoso neste respeito. Métodos de deteção A invenção fornece de maneira geral um método de deteção in vitro de uma infeção por um microrganismo numa amostra biológica, compreendendo a deteção simultânea de um antigénio do referido microrganismo e de um anticorpos dirigido contra o referido microrganismo, presentes numa amostra biológica, sendo o método tal como definido na reivindicação 1.
Entende-se que o método da invenção não está restrito à utilização de um único par anticorpo/antigénio. Pode ser realizou utilizando vários anticorpos de captura diferentes, e vários antigénios de captura diferentes.
Em particular, a invenção proporciona deste modo um método de deteção in vitro de uma infeção pelo virus da hepatite C (VHC) numa amostra biológica, compreendendo a deteção simultânea de um antigénio do VHC e de um anticorpo 35 ΡΕ1504266 anti-VHC, dirigido contra o referido antigénio do VHC, presente numa amostra biológica, compreendendo o método a) colocar na presença da amostra biológica um anticorpo de captura anti-VHC e um antigénio de captura do VHC, b) incubação da mistura nestas condições permitindo a formação de complexos antigénio-anticorpo, c) a revelação dos complexos antigénios- anticorpos formados, que utilizam um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio do VHC capturado, e/ou eventualmente um antigénio de deteção, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti VHC capturado, e no qual o antigénio de captura do VHC compreende, ou é, um fragmento antigénico do VHC em que pelo menos um epitopo é destruído; e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhece o referido pelo menos um epitopo, intacto, do antigénio capturado. A invenção propõe, por outro lado, um método de deteção in vitro de uma infeção por um vírus da imunodeficiência humana (VIH) numa amostra biológica, compreendendo a deteção simultânea de um antigénio de um VIH e de um anticorpo anti-VIH, dirigido contra o referido antigénio do VIH, presente numa amostra biológica, compreendendo o método 36 ΡΕ1504266 a) colocar na presença da amostra biológica um anticorpo de captura anti-VIH e um antigénio de captura de um VIH; b) incubação da mistura em condições que permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a revelação dos complexos antigénios-anticorpos formados, que utilizam um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio do VIH capturado, e/ou eventualmente a um antigénio de deteção, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti-VIH capturado, e no qual o antigénio de captura do VIH compreende, ou é, um fragmento antigénico do VIH em que pelo menos um epitopo é destruído; e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhece o referido pelo menos um epitopo, intacto, do antigénio capturado.
De um modo preferido o referido método permite a deteção de um VIH-1, a deteção de um VIH-2, ou a deteção à vez de um VIH-1 ou de um VIH-2. Em consequência, de acordo com a alternativa considerada, o antigénio de captura do VIH utilizado pode compreender ou ser um antigénio de captura do VIH-1, um antigénio de captura do VIH-2 e um antigénio de captura do VIH-1 e do VIH-2 ou uma combinação de um antigénio de captura do VIH-1 e de um antigénio de captura do VIH-2, respetivamente. A amostra biológica pode ser eventualmente 37 ΡΕ1504266 tratada numa etapa anterior, ou colocada na presença do antigénio de captura e do anticorpo de captura em condições que favorecem a exposição dos antigénios a detetar. Vantajosamente, trata-se a amostra com um agente desnaturante, antes da deteção, e de preferência, antes de a colocar em contacto com os anticorpos utilizados. No caso da deteção da cápside do VHC, ou da proteína gag de um VIH, este agente desnaturante pode ser, nomeadamente, constituído por um ou vários detergentes de tipo não iónico, tal(is) como, por exemplo, o Nonidet P-40 (NP40) (terc-Octilfenoxipoli-(oxietileno)etanol, também denominado IGEPAL CA630), ou ainda de uma solução ácida.
Este imunoensaio combinado pode ser realizado de acordo com diversos formatos bem conhecidos do especialista da técnica: em fase sólida; em um tempo ou em dois tempos, num método de dupla sanduíche (sanduíche para as duas deteções de antigénios e de anticorpos), ou num método indireto (para a deteção de anticorpos) combinado com um método sanduíche (para a deteção de antigénio).
De acordo com a invenção, o anticorpo de captura e o antigénio de captura são imobilizados numa fase sólida. Pode utilizar-se, a título de exemplos não limitativos de fase sólida, microplacas, em particular microplacas de poliestireno, tais como as comercializadas pela sociedade Nunc, Dinamarca. Pode igualmente utilizar-se partículas ou esferas sólidas, esferas paramagnéticas, tais como as fornecidas por Dynal ou Merck-Eurolab (França) (sob a marca 38 ΡΕ1504266
Estapor™), ou ainda tubos de ensaio em poliestireno ou polipropileno, etc...
Um formato de imunoensaio de tipo sanduíche entre dois anticorpos (de captura e de deteção) é particularmente vantajoso para a deteção dos antigénios presentes na amostra biológica, enquanto os anticorpos podem ser revelados utilizando um antigénio de captura e um conjugado marcado que se fixe no anticorpo (de acordo com um formato normalmente designado como « formato indireto ») , por exemplo a proteína A marcada ou ainda um anticorpo anti imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcado. Pode ainda detetar-se vantajosamente os anticorpos utilizando um antigénio de captura e um antigénio marcado que se fixem ao anticorpo (de acordo com um formato designado como « sanduíche antigénio-anticorpo-antigénio » ou « sanduíche de duplo antigénio »).
De uma maneira geral, de acordo com a invenção, o anticorpo de captura e o anticorpo de deteção (nomeadamente utilizado no caso da sanduíche) são selecionados de modo a reconhecerem o antigénio alvo natural a detetar, presente na amostra biológica, num epitopo, intacto, homólogo do epitopo destruído no antigénio de captura e a que não reconheçam o epitopo destruído no antigénio de captura. A deteção simultânea de antigénio de um microrganismo e de anticorpos dirigidos contra o referido microrganismo, nomeadamente a deteção simultânea do antigénio de 39 ΡΕ1504266 VHC e dos anticorpos anti-VHC ou ainda do antigénio de um VIH e dos anticorpos anti-VIH, de acordo com a invenção, pode ser realizada num único tempo, colocando simultaneamente na presença da amostra biológica, os meios de deteção, tais como, nomeadamente, o ou os anticorpos de deteção, ao mesmo tempo que o ou os anticorpos de captura e o ou os antigénio(s) de captura. Neste caso, o imunoensaio de deteção do antigénio e o imunoensaio de deteção dos anticorpos são os dois realizados, de preferência, em sanduiche. De maneira alternativa, os meios de deteção, tais como nomeadamente o ou os anticorpos de deteção, podem ser adicionados à mistura num segundo tempo, ou seja após se terem formado os primeiros complexos antigénios-anticorpos. Fala-se deste modo de ensaio em dois tempos.
Como isto é descrito a seguir, o antigénio de captura pode ser nomeadamente um fragmento antigénico da proteína de cápside do VHC, no qual pelo menos um sítio epitópico é destruído. 0 antigénio de captura pode ser igualmente constituído por um fragmento antigénico de uma proteína não estrutural do VHC, nomeadamente mas não exclusivamente da NS3 ou da NS4, nas quais pelo menos um sítio epitópico é também destruído. Por fim, o antigénio de captura pode ser igualmente constituído por uma combinação de um fragmento antigénico da proteína da cápside, no qual pelo menos um sítio epitópico é destruído, e de um fragmento antigénico de uma proteína não estrutural do VHC, NS3 ou NS4, no qual pelo menos um sítio epitópico é também destruído. Qualquer a variante desejada pelo especialista da técnica faz parte da invenção. 40 ΡΕ1504266
De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o método de deteção de uma infeção pelo vírus da hepatite C (VHC) numa amostra biológica compreende: a) colocar na presença da amostra um anticorpo de captura do VHC e um antigénio de captura do VHC fixados numa fase sólida; b) incubação da mistura em condições gue permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a separação da fase sólida e da fase líguida, d) a colocação em contacto da fase sólida com um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio de VHC capturado, e um ou anticorpos anti-imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti-VHC capturado, compreendendo o antigénio de captura de anticorpos anti-VHC ou sendo um fragmento antigénico da proteína de cápside do VHC, em que dois epitopos foram destruídos, e os anticorpos de captura e de deteção reconhecendo cada um dos referidos epitopos, intactos, do antigénio de cápside capturado.
De acordo com uma outra forma de realização, o método da invenção permite a deteção de uma infeção por um VIH, tal como um VIH-1 ou um VIH-2. De um modo preferido, o 41 ΡΕ1504266 referido método compreende à vez um antigénio de captura derivado de um VIH-1 e um antigénio de captura derivado de um VIH-2 de maneira à poder detetar à vez anticorpos anti-VIH-1 e anti-VIH2. De acordo com este modo preferencial, o método de acordo com a invenção pode deste modo ser utilizado indistintamente para detetar uma infeção pelo VIH-1 e/ou o VIH-2. 0 antigénio de captura compreende no minimo um fragmento antigénico de uma proteina gag de um VIH, por exemplo da proteina P25 do VIH-1 ou da P26 do VIH-2, no qual pelo menos um sitio epitópico é destruido. 0 antigénio de captura pode, por outro lado, compreender um fragmento antigénico de uma proteina do envelope de um VIH, nomeadamente, mas não exclusivamente, da gp41 do VIH-1 ou da gp36 do VIH-2. Por fim, o antigénio de captura pode ser constituído por uma combinação de fragmentos antigénicos de uma proteína gag do VIH-1 e do VIH-2, completada neste caso por fragmentos antigénicos de uma proteína do envelope do VIH-1 e do VIH-2. Todas as variantes desejadas pelo especialista da técnica fazem parte da invenção.
De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o método de deteção de uma infeção por um vírus da imunodeficiência humana (VIH) numa amostra biológica compreende: a) a colocação na presença da amostra de um anticorpo de captura do VIH e um antigénio de captura do VIH fixados numa fase sólida; 42 ΡΕ1504266 b) incubação da mistura em condições que permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a separação da fase sólida e da fase liquida, d) a colocação em contacto da fase sólida com um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio de VIH capturado, e a um ou aos anticorpos anti-imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti-VIH capturado, compreendendo o antigénio de captura de anticorpos anti-VIH, ou sendo, um fragmento antigénico da proteína gag do VIH, em que pelo menos um epitopo foi destruído, e os anticorpos de captura e de deteção reconhecendo cada um dos referidos epitopos, intactos, do antigénio gag capturado.
De um modo preferido, o método de acordo com a invenção visa a deteção de uma infeção seja pelo VIH-1, seja pelo VIH-2, seja pelo VIH-1 e o VIH-2. De acordo com esta última alternativa, o antigénio de captura de anticorpos anti-VIH é a combinação de um fragmento da proteína gag do VIH-1 e de um fragmento da proteína gag do VIH-2.
As dosagens de ELISA, radioimunoensaios, ou qualquer outra técnica de deteção podem ser utilizadas para revelar a presença dos complexos antigénios-anticorpos 43 ΡΕ1504266 formados. Um mesmo tipo ou vários tipos de marcadores podem ser utilizados para detetar, de uma parte, o antigénio de microrganismos infecciosos, nomeadamente o antigénio VHC ou VIH, e, de outra parte, o anticorpo dirigido contra o microrganismo infeccioso, nomeadamente o anticorpo anti-VHC ou anti-VIH. A deteção da presença de antigénios ou de anticorpos na amostra biológica pode ser completada por uma quantificação, por exemplo por medida dos sinais emitidos pelos marcadores (cor, luminescência, radioatividade,...), de acordo com as técnicas convencionais bem conhecidas do especialista da técnica.
Estojos ("Kits")
Os estojos ("kits") e reagentes úteis para a deteção de uma infeção por um microrganismo, tal como o virus da hepatite C (VHC) ou um virus da imunodeficiência humana (VIH), numa amostra biológica, conforme o método da invenção, podem ser fornecidos para uma colocação em prática da invenção fácil e aplicável a várias amostras biológicas. A invenção refere-se também a um estojo ("kit") útil para a deteção de uma infeção por um virus da hepatite C (VHC) ou um virus da imunodeficiência humana (VIH) numa amostra biológica, compreendendo: 44 ΡΕ1504266 - um antigénio de captura, imobilizado numa fase sólida, que compreende um fragmento antigénico de uma proteina do referido VHC ou VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, tenso sido tornado incapaz de ser reconhecido por um anticorpo de captura e um anticorpo de deteção dirigidos contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, selecionado a partir do grupo de epitopos das sequências seguintes 44LGVR47 (SEQ ID N° : 19) , 30IVGGVYL36 (SEQ ID N°: 20), 29QIVGGV34 (SEQ ID N° : 21) , QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N° : 24) e QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N°: 25), qualquer conservando a capacidade de se ligar aos anticorpos dirigidos contra o microrganismo eventualmente presentes na amostra biológica, por reconhecimento de outros sitios epitópicos que ficaram intactos; - o referido anticorpo de deteção, monoclonal ou policlonal monoespecifico, dirigido contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, da referida proteina do VHC ou VIH, e - o referido anticorpo de captura monoclonal ou policlonal monoespecifico, imobilizado numa fase sólida, dirigido contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, da referida proteina do VHC ou VIH; sendo a referida proteina do VHC a proteina da cápside do VHC e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhecendo um epitopo selecionado a partir do grupo de epitopos das sequências seguintes: 44LGVR47 (SEQ ID N° : 19), 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° : 20) e 29QIVGGV34 (SEQ ID N°: 21), ou sendo a referida proteina do VIH a proteina P25 do VIH-1 e o anticorpo de captura e/ou 45 ΡΕ1504266 de deteção reconhecendo o epitopo de sequência QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N°: 24), ou sendo a referida proteína do VIH a proteína P26 do VIH-2 e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhecendo o epitopo de sequência QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N° : 25) .
De maneira vantajosa, este estojo ("kit") pode conter vários antigénios e vários anticorpos de captura.
Como isto é descrito a seguir, o anticorpo de captura e o antigénio de captura são apresentados sob uma forma imobilizada numa fase sólida, tal como uma microplaca.
Um estojo ("kit") preferido compreende a) o antigénio de captura, que compreende, ou é, um fragmento antigénico de uma proteína do VHC, compreendendo o referido fragmento pelo menos dois epitopos destruídos, conservando a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VHC eventualmente presentes numa amostra biológica, b) um anticorpo de captura dirigido contra um dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VHC; sendo o referido antigénio de captura e o referido anticorpos de captura imobilizados numa fase sólida, 46 ΡΕ1504266 cl) um anticorpo de deteção, marcado, dirigido contra um outro dos referidos epitopos, intactos, da referida proteina do VHC, c2) e/ou eventualmente um antigénio de deteção, marcado, que compreende, ou é, um fragmento antigénico de uma
proteina do VHC, compreendendo o referido fragmento pelo menos dois epitopos destruídos, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VHC eventualmente presentes numa amostra biológica, sendo a referida proteína do VHC a proteína de cápside e sendo os referidos pelo menos dois epitopos, intactos, selecionados a partir do grupo de epitopos das sequências seguintes: 44LGVR47 (SEQ ID N° : 19). 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° : 20 ), 29QIVGGV34 (SEQ ID N° : 21).
De maneira preferida, igualmente, um estojo ("kit") de acordo com a invenção compreende a) o antigénio de captura, que compreende, ou é, um fragmento antigénico de uma proteína do VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VIH eventualmente presentes numa amostra biológica, b) um anticorpo de captura dirigido contra um dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VIH; o referido 47 ΡΕ1504266 antigénio de captura e sendo o referido anticorpo de captura imobilizado numa fase sólida, cl) um anticorpo de deteção, marcado, dirigido contra um outro dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VIH, e/ou c2) eventualmente, um antigénio de deteção, marcado, que compreende, ou é, um fragmento antigénico de uma proteína do VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VIH eventualmente presentes numa amostra biológica, sendo a referida proteína do VIH a proteína P25 do VIH-1 e o referido pelo menos um epitopo, intacto, tendo a sequência QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N°: 24), ou sendo a referida proteína do VIH a proteína P26 do VIH-2 e o referido pelo menos um epitopo, intacto, tendo a sequência QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N°: 25).
Um estojo ("kit") pode compreender, por outro lado, um meio de deteção dos referidos anticorpos presentes na amostra biológica e complexados com o referido antigénio de captura, por exemplo um anticorpo anti-imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcado, ou ainda um antigénio de deteção. 0 antigénio de deteção é um fragmento antigénico da proteína de cápside do VHC ou P25 ou P26 de um VIH, que compreende pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos (anti-VHC ou anti-VIH) eventualmente presentes na amostra. 48 ΡΕ1504266
Um estojo ("kit") pode ainda compreender, por outro lado, um detergente, mais particularmente um detergente não iónico, tal como ο NP40 (Sigma) ou qualquer detergente não iónico eguivalente conhecido do especialista da técnica.
Como isto é descrito a seguir, o antigénio de captura, como o antigénio de deteção, pode ser nomeadamente um fragmento da proteina da cápside do VHC, fragmento em que pelo menos um sitio epitópico é destruído, e o anticorpo de captura e/ou de deteção é deste modo selecionado por reconhecer o referido sítio epitópico, intacto, da proteína da cápside.
Em particular, a invenção tem por objetivo um conjunto de reagentes compreendendo ou constituído por um péptido da cápside do VHC mutado em pelo menos dois sítios epitópicos distintos, tal como o péptido 1-75 (G34-G44-G47), e por um par de anticorpos que não pode reconhecer o péptido 1-75 (G34-G44-G47) uma vez que reconhecem a sequência nativa de VHC correspondente.
Em particular, a invenção tem por objetivo um conjunto de reagentes compreendendo ou constituído por um péptido da proteína P25 mutado em pelo menos um sítio epitópico distinto, tal como o péptido de sequência SEQ ID N°: 22, e por um par de anticorpos que não pode reconhecer o péptido de sequência SEQ ID N°: 22 ma vez que reconhecem a sequência nativa da proteína P25 do VIH-1. 49 ΡΕ1504266
As figuras e exemplos seguintes ilustram a invenção sem limitar o alcance. LEGENDA DAS FIGURAS: A figura 1 é um esquema que ilustra um método de deteção do tipo dos utilizados anteriormente à invenção, com, fixados numa fase sólida, um anticorpo de captura e um antigénio de captura não modificado. Este esquema ilustra a competição do anticorpo do doente com o anticorpo de deteção visando a ligação ao antigénio de captura. A figura 2, por comparação, é um esquema que ilustra uma forma de realização da presente invenção. 0 antigénio de captura estando mutado, já não é capaz de ser reconhecido pelo anticorpo de deteção. Não existe, deste modo, mais interferência entre a deteção de anticorpo e a deteção do antigénio.
EXEMPLOS: Deteção de uma infeção pelo vírus da hepatite C
Materiais para os protocolos la e 1 b: 0 conjugado de anticorpo monoclonal anti-cápside-peroxidase (« acm-POD »): um conjugado de anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 2 (ver Tabela 1), marcado com peroxidase é preparado de acordo com o protocolo descrito no pedido de patente EP 0 752 102. O conjugado do anticorpo 50 ΡΕ1504266
Acm2 marcado com peroxidase é diluída no diluente da Ia etapa (descrito a seguir) de forma a permitir obter no final, com um amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada (superior, por exemplo, com 1,5 Unidades) e isto, em condições bem conhecidos do especialista da técnica.
Um outro anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 1 (ver Tabela 1), é também utilizado para ser imobilizado na fase sólida (ver a seguir).
Materiais para o protocolo 1 c: 0 conjugado de anticorpo monoclonal anti-cápside-peroxidase (« acm-POD »): um conjugado de anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 1 (ver Tabela 1), marcado com peroxidase, é preparado de acordo com o protocolo descrito no pedido de patente EP 0 752 102. Este conjugado de anticorpo Acml marcado com peroxidase é diluído no diluente da Ia etapa (descrito a seguir) de forma a permitir de obter no final, com uma amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada (superior, por exemplo, com 1,5 Unidades) e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica.
Um outro anticorpo monoclonal anti-cápside, anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 3 (ver Tabela 1), é também utilizado para ser imobilizado na fase sólida (ver a seguir). ΡΕ1504266 51
Materiais para o protocolo ld: 1) Conjugado anticorpo monoclonal anti-cápside-biotina: um conjugado de anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 5 (ver Tabela 1) , marcado com biotina é preparado de acordo com o protocolo descrito por Greg T. Hermanson em 1996. Este anticorpo Acm 5 marcado com biotina é diluído no diluente da Ia etapa (descrito a seguir) de forma a permitir obter no final, com um amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada (superior, por exemplo, a 1,5 Unidades) e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica.
Um outro anticorpo monoclonal anti-cápside, anticorpo monoclonal anti-cápside, Acm 1 (ver Tabela 1), é também utilizado para ser imobilizado na fase sólida (ver a seguir). 2) Conjugado Estreptavidina marcado com pero-xidase: um conjugado de estreptavidina marcado com pero-xidase é preparado de acordo com o protocolo descrito por Greg T. Hermanson em 1996. No momento de realizar o protocolo ld, este conjugado de estreptavidina marcado com peroxidase é diluído no diluente da 2a etapa (descrito a seguir) de forma a permitir obter no final, com um amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada (superior, por exemplo, a 1,5 Unidades) e isto, em condições bem conhecidos do especialista da técnica. 52 ΡΕ1504266
Materiais comuns para os protocolos la, lb, Ice ld: 1) Fase sólida selecionada: microplaca Maxisorp, Nunc (Dinamarca). 2) Diluentes das Ia e 2a etapas dos protocolos de acordo com a invenção:
Diluente da Ia etapa: Tampão Tris, NaCl 0,05M, a pH 6,7 adicionado de NP40 ((terc-Octilfenoxi poli (oxietileno)etanol - IGEPAL CA 630, Sigma) a 0,25%.
Diluente da 2a etapa: Tampão citrato (50 mM), a pH 6,7, glicerolado a 20%, contendo um conjugado de anticorpo policlonal de murganho anti-IgG (Fc) humana marcado com peroxidase (Jackson Imunoresearch Laboratories, USA) a uma diluição que permita obter no final, com um amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada (superior, por exemplo, a 1,5 Unidades) e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica. 3) Solução de revelação: a solução de revelação foi composta 3a) de um tampão substrato: Solução de ácido cítrico (0,075M), e de acetato de sódio (0,1M), a pH 4,0, contendo H2O2 a 0,015% e Dimetilsulfóxido (DMSO) (PROLABO) a 4%, e 53 ΡΕ1504266 3b) de um reagente cromogénio: tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) a 0,7 mM de concentração final no tampão substrato. 4) Solução de paragem: H2SO4 a 1 N. Métodos:
Protocolo la: Protocolo de deteção simultânea do antigénio cápside e dos anticorpos (anti-cápside e anti-NS3, NS4) do vírus da hepatite C numa amostra (soro ou plasma) 0 principio do teste é baseado num método imu-noenzimático de tipo sanduíche para a deteção do antigénio, e de tipo indireto, para a deteção dos anticorpos.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada: • com uma mistura de antigénios VHC: um péptido mutado C-G- G-Cap 1-75 (G34-G44-G47) (cápside) compreendendo a sequência SEQ ID N° : 4 e duas proteínas recombinadas produzidas por Escherichia coli a partir de clones selecionados nas regiões não estruturais NS3 (clone NS3.1: AA 1192-1492), e NS4 (clone 5-1-1: AA 1694-1735) e • com um anticorpo monoclonal anti-cápside (Acm 1), em tampão Tris 0,5 M, pH 7,4. 54 ΡΕ1504266
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são deste modo sensibilizadas com a solução a seguir na proporção de 110 mL por poço.
As placas de microtitulação são postas a incubar durante uma noite à temperatura ambiente (18-24°C).
Após limitação da solução de sensibilização, as placas são lavadas com o auxilio de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7,4) contendo 0,1 % de Tween 20, depois saturadas por adição de um tampão fosfato (0,01M, pH 7) contendo 5% de sacarose, 25% de leite desnatado (Candia™, França, ou qualquer outro leite desnatado equivalente comercial) e 10 mM de EDTA.
Em cada poço, distribui-se sucessivamente 100 mL de diluente de Ia etapa, contendo anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 2 marcado com peroxidase, depois 50 mL de amostra (soro ou plasma). O meio reacional é posto a incubar a 37 °C durante 1,5 horas. Os antigénios da cápside do VHC eventualmente presentes ligam-se ao anticorpo monoclonal da fase sólida Acm 1 e ao anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 2 marcado com peroxidase, formando assim complexos sanduíche com estes dois anticorpos. Além disso, se os anticorpos anti-VHC estão presentes, estes não se ligam aos antigénios fixados na fase sólida.
As placas são a seguir lavadas (3 vezes) com o 55 ΡΕ1504266 auxílio de uma solução de lavagem (tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1%).
Em cada poço, distribui-se 100 mL de diluente da 2a etapa, contendo os anticorpos anti-IgG humana marcados com peroxidase. O meio reacional é colocado a incubar à temperatura ambiente (18-24°C) durante 30 minutos. Os anticorpos anti-IgG humanos marcados fixam-se por sua vez aos anticorpos específicos retidos na fase sólida.
As placas são a seguir lavadas (5 vezes) com o auxílio de uma solução de lavagem (tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1%). O conjugado anti-IgG humana não ligado é também eliminado.
Em cada poço, distribui-se 100 mL da solução de revelação. Deixa-se a reação desenvolver na obscuridade durante 30 minutos à temperatura ambiente (18-24°C).
Distribui-se a seguir 100 mL de solução de paragem em cada poço.
Após paragem da reação, a leitura da densidade ótica é efetuada no espectrofotómetro a 450/620 nm.
Definição do valor limiar:
Um valor limiar foi determinado após análise estatística dos dados de especificidade e sensibilidade 56 ΡΕ1504266 utilizando a curva de ROC (Receiver Operating Characteristic) (Berck e Schultz, (1986)). 0 estudo de especificidade realizado em 1000 amostras de indivíduos sãos e o estudo de sensibilidade em 200 amostras positivas VHC (nomeadamente dos inicios da seroconversão) de painéis comerciais: BBI (Boston Biomedica Company, USA), Impath (USA), Serologicals (USA), Nabi (USA), ProMedDx (USA)).
Um valor limiar é calculado para cada placa a partir do sinal obtido numa testemunha positiva, dividida por um coeficiente X, constante, especifico do teste. Esta é cerca de 0,280 unidades de DO (Densidade Ótica) nos exemplos apresentados.
Como se pode constatar neste protocolo, ao contrário de certas técnicas da técnica anterior, a captura do antigénio da cápside e a dos anticorpos anti-cápside faz-se, na presente invenção, numa única e mesma zona proteica da cápside: a zona antigénico que captura os anticorpos anti-cápside (AA 1-75) inclui a zona de especificidade antigénica (AA 44-47) através da qual o anticorpo anti-cápside imobilizado (acml) captura o antigénio da cápside. Deste modo, de acordo com a invenção, a perda de deteção de um certo número de anticorpos anti-cápside é reduzida no minimo e a sensibilidade encontra-se melhorada. 57 ΡΕ1504266
Protocolo lb: Protocolo de deteção simultânea do antigénio da cápside e de anticorpos (anti NS3 e NS4) do vírus da hepatite C numa amostra (soro ou plasma) 0 princípio do teste é baseado num método imunoenzimático do tipo sanduíche para a deteção de antigénio e de tipo indireto para a deteção de anticorpos.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada: • com uma mistura de antigénios VHC: duas proteínas recombinadas produzidas por Escherichia coli a partir de clones selecionados nas regiões não estruturais NS3 (clone NS3.1: AA 1192-1492), e NS4 (clone 5-1-1: AA 1694-1735) e • com um anticorpo monoclonal anti-cápside (Acm 1), em tampão Tris 0,5M, pH 7,4.
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc,
Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir à na proporção de 110 mL por poço.
As etapas seguintes são idênticas às do protocolo la.
Protocolo lc: Protocolo de deteção simultânea do antigénio da cápside e de anticorpos (anti-cápside e anti NS3, NS4) do vírus da hepatite C numa amostra (soro ou plasma) 58 ΡΕ1504266 O princípio do teste é baseado num método imunoenzimático de tipo sanduíche para a deteção de antigénio e de tipo indireto para a deteção de anticorpos.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada: • com um mistura de antigénios VHC: um péptido mutado C-G- G-Cap 1-75 (G31-G44-G47) (cápside) compreendendo a sequência SEQ ID N°: 5 ou o péptido mutado C-G-G-Cap 1-53 (G31-G44-G47) compreendendo a sequência SEQ ID N°: 11 ou o péptido mutado C-G-G-Cap 6-68 (G31-G44-G47) compreendendo a sequência SEQ ID N°: 8 e duas proteínas recombinadas produzidas por Escherichia coli a partir de clones selecionados nas regiões não estruturais NS3 (clone NS3.1: AA 1192-1492), e NS4 (clone 5-1-1: AA 1694-1735) e • com um anticorpo monoclonal anti-cápside (Acm 3) , em tampão Tris 0,5 M, pH 7,4.
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir na proporção de 110 mL por poço.
As placas de microtitulação são postas a incubar durante uma noite à temperatura ambiente (18-24°C).
Após limitação da solução de sensibilização, as 59 ΡΕ1504266 placas são lavadas com o auxílio de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20, depois saturadas por adição de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7) contendo 5% de sacarose, 25% de leite desnatado (Candia™, França, ou qualquer outro leite desnatado equivalente ao comercial) e 10 mM de EDTA.
Em cada poço, distribui-se sucessivamente os 100 mL de diluente de Ia etapa, contendo o anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 1 marcado com peroxidase, depois 50 mL de amostra (soro ou plasma). O meio reacional é posto a incubar a 37°C durante 1,5 hora. Os antigénios da cápside do VHC eventualmente presentes ligam-se ao anticorpo monoclonal da fase sólida Acm 3 e ao anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 1 marcado com peroxidase, formando assim complexos sanduíche com estes dois anticorpos. Além disso, se os anticorpos anti-VHC estão presentes, estes ligam-se aos antigénios fixados na fase sólida.
As etapas seguintes são idênticos às do protocolo 1 a.
Como se pode constatar aqui do mesmo modo, também, a captura do antigénio da cápside e a dos anticorpos anti-cápside se faz, na presente invenção, numa única e mesma zona proteica da cápside: a zona antigénica que captura os anticorpos anti-cápside (AA 1-75) inclui a 60 ΡΕ1504266 zona de especificidade para o antigénico (AA 29-34) pela qual o anticorpo anti-cápside imobilizado (acm 3) captura o antigénio da cápside. Assim, de acordo com a invenção, a perda de deteção de um certo número de anticorpos anti-cápside é reduzida no minimo e a sensibilidade encontra-se melhorada.
Protocolo ld: Protocolo de deteção simultânea do antigénio da cápside e de anticorpos (anti-cápside e anti-NS3, NS4) do vírus da hepatite C numa amostra (soro ou plasma) 0 principio do teste é baseado num método imuno-enzimático de tipo sanduíche para a deteção do antigénio, e de tipo indireto, para a deteção dos anticorpos.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada: • com uma mistura de antigénios VHC: um péptido mutado C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47) (cápside) compreendendo a sequência SEQ ID N° : 4, ou um péptido mutado C-G-G-Cap 1-75 (G34-G46-G46' ) compreendendo a sequência SEQ ID N° : 15 ou um péptido mutado C-G-G-Cap 1-75 (G34-3A45) compreendendo a sequência SEQ ID N°: 14 e duas proteínas recombinadas produzidas por Escherichia coli a partir de clones selecionados nas regiões não estruturais NS3 (clone NS3.1: AA 1192-1492), e NS4 (clone 5-1-1: AA 1694-1735) e 61 ΡΕ1504266 • com um anticorpo monoclonal anti-cápside (Acm 1), em tampão Tris 0,5 M, pH 7,4.
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir na proporção de 110 mL por poço.
As placas de microtitulação são postas a incubar durante uma noite à temperatura ambiente (18-24°C).
Após limitação da solução de sensibilização, as placas são lavadas com o auxílio de um tampão fosfato (0,01M, pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20, depois saturadas por adição de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7) contendo 5% de sacarose, 25% de leite desnatado (Candia™, França, ou qualquer outro leite desnatado equivalente comercial) e 10 mM de EDTA.
Em cada poço, distribui-se sucessivamente 100 mL de diluente de Ia etapa, contendo o anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 5 marcado com biotina, depois 50 mL de amostra (soro ou plasma). O meio reacional é posto a incubar a 37°C durante 1,5 horas.
Os antigénios da cápside do VHC eventualmente presentes ligam-se ao anticorpo monoclonal da fase sólida 62 ΡΕ1504266
Acm 1 e ao anticorpo monoclonal anti-cápside Acm 5 marcado com biotina, formando assim complexos sanduíche com estes dois anticorpos.
Do mesmo modo, se os anticorpos anti-VHC estão presentes, estes ligam-se aos antigénios fixados na fase sólida.
As placas são a seguir lavadas (3 vezes) com o auxílio de uma solução de lavagem (tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1%).
Em cada poço, distribui-se 100 mL de diluente de 2a etapa, contendo os anticorpos anti-IgG humana marcados com peroxidase e a estreptavidina marcada com peroxidase. O meio reacional é posto a incubar à temperatura ambiente (18-24°C) durante 30 minutos. Os anticorpos anti-IgG humana marcados fixam-se por sua vez aos anticorpos específicos retidos na fase sólida e a estreptavidina marcada com peroxidase fixe-se ao anticorpo Acm 5 biotinilado retido na mesma fase sólida.
As etapas seguintes são idênticas às do protocolo la.
Como se pode constatar aqui do mesmo modo, também, a captura do antigénio da cápside e a dos anticorpos anti-cápside se faz, na presente invenção, numa 63 ΡΕ1504266 única e mesma zona proteica da cápside: a zona antigénica que captura os anticorpos anti-cápside (AA 1-75) inclui a zone de especificidade antigénico (AA 44-47) pela qual o anticorpo anti-cápside imobilizado (acml) captura o antigénio da cápside. Deste modo, de acordo com a invenção, a perda de deteção de um certo número de anticorpos anti-cápside é reduzida ao minimo e a sensibilidade encontra-se melhorada.
Exemplo 1: Deteção de antigénio da cápside do VHC numa amostra (soro ou plasma), durante a janela serológica
As amostras séricas ou plasmáticas, recolhidas nos doentes contaminados pelo VHC e reunidos nos painéis comerciais (Impath, USA), negativos na deteção de anticorpos e positivos em ácida nucleico (PCR), foram testados seguindo o método descrito no protocolo 1 a.
Os resultados reportados na Tabela 2 são comparados à dos resultados obtidos em PCR.
Tabela 2:
Amostra Impath Densidade ótica Interpre tação Anticorpos em Teste Teste de PCR 1866 0,616 Positivo Negativo Positivo 1883 (1/2)* 0,661 Positivo Negativo Positivo 1889 (1/2)* 0,671 Positivo Negativo Positivo 1999 (1/2)* 0,596 Positivo Negativo Positivo 64 ΡΕ1504266 (continuação)
Amostra Impath Densidade ótica Interpre tação Anticorpos em Teste Teste de PCR 2028 (1/2)* 0,520 Positivo Negativo Positivo 2144 (1/2)* 0,674 Positivo Negativo Positivo 2145 (1/2)* 0,808 Positivo Negativo Positivo 2159 0,547 Positivo Negativo Positivo 1959 0,512 Positivo Negativo Positivo *: diluição
Constata-se que os resultados obtidos pelo método de acordo com a invenção são diretamente correlacionados aos resultados obtidos em PCR. A invenção descrita permite deste modo detetar os antigénios da cápside desde que os anticorpos não estejam também presentes, ou seja em amostras recolhidas na janela serológica.
Exemplo 2: Deteção de anticorpos anti-cápside em amostras (soros ou plasmas) negativos em antigénio VHC
As amostras séricas ou plasmáticas, recolhidas nos doentes contaminados pelo VHC e reunidos nos painéis internos e comerciais, positivos em anticorpos (cápside) e negativos em antigénio (cápside) , foram testados seguindo os métodos descritos nos protocolos 1 a e 1 b.
Na ausência do péptido 1-75 (G34-G44-G47) (compreendendo a SEQ ID N°: 4) na fase sólida (protocolo 65 ΡΕ1504266 lb) , as amostras testadas (específicas da cápside) não são detetadas, desde que se encontrem positivas com o protocolo 1 a e num teste de anticorpos clássico (cf. Tabela 3).
Tabela 3:
Amostra Densidade ótica la lb Interpretação la lb Anticorpos em Teste 16 0,942 0,092 Positivo Negativo Positivo 38 0,409 0,041 Positivo Negativo Positivo 49 3,246 0,080 Positivo Negativo Positivo KJ9-1102-0025 0,916 0,054 Positivo Negativo Positivo A invenção permite deste modo detetar nos indivíduos contaminados pelo VHC das amostras positivas em anticorpos anti-cápside, e negativas em antigénio capsí-dico.
Exemplo 3: Deteção simultânea de antigénio capsí-dico e de anticorpos anti-VHC numa amostra (soro ou plasma)
Dois painéis de amostras de seroconversão PHV 907 e PHV 917 (ou seja duas séries de soros ou plasmas, recolhidos nos dois doentes após infeção pelo VHC ou em curso de seroconversão) comercializados por BBI (Boston Biomedica Company, USA) foram testados seguindo o protocolo la (cf. Tabelas 4 e 5). ΡΕ1504266 66
Tabela 4:
Amostra BBI Dia de colheita Densidade ótica Interpretação Anticorpos em Teste Teste de PCR 907-1 0 0,482 Positivo Negativo Positivo 907-2 + 4 0,344 Positivo Negativo Positivo 907-3 + 7 0,325 Positivo Negativo Positivo 907-4 + 13 0,318 Positivo Negativo Positivo 907-5 + 18 0,395 Positivo Negativo Positivo 907-6 + 21 0,855 Positivo Positivo Positivo 907-7 + 164 2, 991 Positivo Positivo Positivo
Tabela 5:
Amostra BBI Dia de colheita Densidade ótica Interpretação Anticorpos em Teste Teste de PCR 917-1 0 0,045 Negativo Negativo Negativo 917-2 13 0,803 Positivo Negativo Positivo 917-3 20 0,324 Positivo Negativo Positivo 917-4 22 0,448 Positivo Negativo Positivo 917-5 85 2, 652 Positivo Positivo Negativo 917-6 131 2,582 Positivo Positivo Negativo 917-7 135 2,720 Positivo Positivo Positivo 917-8 138 2,736 Positivo Positivo Negativo 917-9 146 3,023 Positivo Positivo Negativo 917-10 152 3,033 Positivo Positivo Negativo 67 ΡΕ1504266
Nas tabelas 4 e 5, observa-se, de maneira correlacionada com a presença de ARN virai (teste de PCR) , um sinal positivo em antigénio com o protocolo la de acordo com a invenção, da mesmo maneira, uma resposta positiva é obtida em amostras de seroconversão, positivas em anticorpos e/ou em antigénio. Isto mostra bem que as 2 deteções (antigénio capsidico e anticorpos anti-cápside) podem funcionar simultaneamente no mesmo ensaio, e sem interferência.
Além disso, a invenção descrita apresenta um interesse muito particular de um ponto de vista de diagnóstico em oposição à PCR, porque esta permite detetar amostras negativas em PCR e positivas em anticorpos.
Exemplo 4: Comparação da proporção dos desempenhos de diferentes péptidos mutados na deteção de anticorpos anti-cápside
As amostras séricas ou plasmáticas, recolhidas nos doentes contaminados pelo VHC e reunidos nos painéis internos e comerciais, positivos em anticorpos (cápside) e negativos em antigénio (cápside), foram testados seguindo os métodos descritos nos protocolos lc e ld (cf Tabelas 6 e ΡΕ1504266 68
Tabela 6: protocolo lc
Amostra SEQ ID NS; 5 SEQ ID NS: 11 SEQ ID NS: 8 DO Interp DO Interp DO Interp 16 (1/2)* 0.434 Pos 0,534 Pos 0,413 Pos 21 (1/2)* 0,520 Pos 0,568 Pos 0,481 Pos 49 (1/20)* 0,405 Pos 0,538 Pos 0,384 Pos 07 0,312 Pos 0,340 Pos 0,285 Pos *: diluição
Tabela 7: protocolo ld
Amostra SEQ ID NS: 4 SEQ ID NS: 15 SEQ ID NS: 14 DO Interp DO Interp DO Interp 16 (1/2)* 0,438 Pos 0,362 Pos 0,327 Pos 21 (1/4)* 0,257 Pos 0,218 Neg 0,197 Neg 38 (1/2)* 0,310 Pos 0,221 Pos 0,206 Neg 49 (1/40)* 0,308 Pos 0,228 Pos 0,201 Neg BCP 453 (1/4)* 0,363 Pos 0,208 Neg 0,175 Neg KJ9-0025 (1/40)* 0,263 Pos 0,237 Pos 0,212 Neg *:diluição
Os péptidos mutados comparados na tabela 6 apresentam desempenhos bastante semelhantes nas amostras testadas.
Pelo contrário, as diferenças de resposta entre 69 ΡΕ1504266 os péptidos são mais marcadas na tabela 7. Os péptidos SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 14 não permitem detetar certas amostras diluídas anti-cápside, sendo as mesmas amostras reconhecidas quando testadas puras.
Exemplo 5: Influência da deteção simultânea do antigénio capsidico e de anticorpos anti-VHC no diagnóstico e a diminuição da janela serológica
Oito painéis de seroconversões comercializados (BBI, Boston Biomedica, US) , (Impath, US) foram testados com o protocolo de acordo com a invenção (designado teste Combo) seguindo os protocolos la (com o péptido C-G-G-Cap 1-75 (G34- G44-G47) contendo a SEQ ID N°: 4), lc (com o péptido C-G-G-Cap 1-75 (G31-G44-G47) contendo a SEQ ID N°: 5) , e ld (com o péptido C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47) contendo a SEQ ID N°: 4).
Na tabela 8 são reportados os resultados obtidos na deteção de antigénio (teste Elisa), ou de ARN (PCR), e em deteção de anticorpos e em Combo (formatos la, lc e 1 d) nestas diferentes seroconversões. Para 4 seroconversões em 8, os protocolos la, lc e ld permitem detetar a primeira amostra positiva de forma concomitante com o aparecimento de ARN virai detetado pela PCR. 0 número de dias meios, entre a deteção de antigénio e a deteção de anticorpos correspondente à redução da janela serológica, é de 33 dias para os dois protocolos la, Ice ld. 70 ΡΕ1504266
Tabela 8:
Painel IMPATH/BBI Atraso (dias) em relação ao l2 dia de deteção de ARN de VHC Redução da ja-nela serológi-ca can o teste Caibo Dias Ag VHC Ac VHC Cento VHC la Caibo VHC lc Caibo VHC ld 6211 (NS3) 0 46 10 10 NT 36 6225 (NS3) 0 33 2 2 2 31 6227 (CAHSIS3- NS4) 0 32 4 4 4 28 6229 (NS3) 0 24 0 0 0 24 9041 (NS3) 0 38 3 3 3 35 907 (CAP) 0 13 0 0 0 13 6222 (CAFNS3) 0 23 0 0 0 23 917 (CAP-NS3) 0 72 0 0 0 72 Media = 33 dias NT = não testado
Exemplo 6: Comparação da proporção de desempenhos e classificação de diversas técnicas nos soros de seroconversão 21 painéis de seroconversão comercializados (BBI, Boston Biomedica Company, USA, Impath, USA), que apresentam especificidades diferentes foram testados com o teste de acordo com a invenção seguindo os protocolos la e lc, e com uma série de testes comercializados, que são em feitos entre os melhores de acordo com a classificação realizada pela MDA (Medicai Devices Agency) nos Estados Unidos em fevereiro de 2002. Esta comparação da proporção tem em conta o número de dias de atraso na deteção em relação à deteção de ARN (teste de PCR) . Deste modo o estojo ("kit") que apresenta a média geral mais baixa é o de melhor desempenho em precocidade de deteção (tabela 9). ΡΕ1504266 71
Tabela 9:
Resultados expressos em Dias de atraso na deteção em relação à PCR Painel Impath/ BBI Protocolo la invenção Protocolo lc invenção Protocolo ld invenção Vitros Eci anti -HVC Axsim HCV versão 3 "Orbo HCV 3.0 incubação curta" Acesso HCV Ab plus Antigénio alvo 907 0 0 0 13 18 18 13 CAP 909 0 0 0 28 33 28 28 CAP 912 4 4 4 7 7 7 7 CAP 913 0 0 0 2 12 7 7 CAP 914 0 0 0 16 16 16 16 CAP 6215 0 0 0 20 20 20 20 CAP Sub-total 4 4 4 86 106 96 91 904 9 9 9 9 9 9 18 NS3 915 12 12 12 12 5 14 17 NS3 6212 23 23 23 12 12 12 23 NS3 6224 19 19 19 19 19 19 19 NS3 9041 3 3 3 62 62 62 62 NS3 9044 0 0 0 25 21 25 25 NS3 9047 0 0 0 28 28 28 28 NS3 Sub-total 66 66 66 167 156 169 192 905 11 11 11 14 14 14 21 NS3/CAP 908 19 19 19 13 11 19 19 NS3/NS4 910 5 5 0 8 8 8 8 CAP/NS4 911 0 0 0 14 14 14 14 CAP/NS3-NS4 917 0 0 0 72 72 72 72 NS3/CAP 6213 32 26 26 26 26 32 32 CAP/NS3-NS4 6214 30 30 30 30 25 30 30 NS3/NS4 6222 0 0 0 21 21 21 21 CAP/NS3 Sub-total 97 91 86 198 191 210 217 Media geral 7,9 7,7 7,4 21,5 21,6 22,6 23,8 72 ΡΕ1504266 Última amostra não detetada: +3d adicionados de forma arbitrária
Os resultados produzidos com os protocolos 1 a, lc e ld de acordo com a invenção permitem uma deteção mais precoce da infeção VHC (somente 8 dias de atraso em média em relação ao PCR para o protocolo la, 7,7 dias para o protocolo lc, 7,4 dias de atraso para o protocolo ld) , antes do aparecimento dos anticorpos.
Deste modo o teste descrito de acordo com a invenção obtém o primeiro lugar nesta classificação e isto com os três protocolos (la, lc e ld) que apelam aos pares de anticorpos e péptidos mutados diferentes.
Em conclusão, os resultados obtidos com os protocolos la, lc e ld de acordo com a invenção mostra bem que esta última permite efetivamente detetar a infeção pelo VHC muito precocemente, com uma sensibilidade bastante próxima daquela da PCR, na medida em que permitem seguir a evolução serológica do doente após a seroconversão.
Exemplo 7: Estudo de especificidade nos 3 protocolos Combo la, lc e ld O estudo de especificidade foi realizado em soros de dadores de sangue (provenientes do Etablissement Français do Sang, Rungis, França). Os resultados obtidos para os diferentes protocolos la, lc e ld foram reportados respetivamente nas tabelas 10, 11 e 12. ΡΕ1504266 73
Tabela 10: Protocolo la Número de soros negativos encontrados 968 Soros reativos confirmados 1 Soros reativos confirmados (%) 99, 9 Média dos negativos em Proporção ( DO da 0,23 amostra/Valor limiar) Intervalo-tipo 0,077 Número de intervalos-tipos para o Valor Limiar 10
Tabela 11: Protocolo 1 c Número de soros negativos encontrados 2475 Soros reativos confirmados 6 Soros reativos confirmados (%) 99,8 Média dos negativos em Proporção ( DO da 0,14 amostra/Valor limiar) Intervalo-tipo 0,063 Número de intervalos-tipos para o Valor Limiar 13, 9
Tabela 12: Protocolo ld Número de soros negativos encontrados 2475 Soros reativos confirmados 4 Soros reativos confirmados (%) 99,8 Média dos negativos em Proporção ( DO da 0,18 amostra/Valor limiar) Intervalo-tipo 0,055 Número de intervalos-tipos para o Valor Limiar 14,8 74 ΡΕ1504266
Notam-se bons desempenhos em especificidade, qualquer que seja o protocolo (la, 1 c ou ld ) utilizado.
Como se pôde constatar durante toda esta descrição, o teste Combo VHC de acordo com a invenção é capaz, de forma surpreendente, graças à captura do antigénio da cápside e à dos anticorpos anti-cápside numa única e mesma zona proteica da cápside, de proporcionar uma sensibilidade que se aproxima daquela da PCR e melhor do que a de certas técnicas da técnica anterior.
Este resultado é surpreendente, porque modificando os péptidos da cápside alvo, os inventores correram o risco de perder a deteção de um certo número significativo de anticorpos.
Exemplo 8: Deteção de uma infeção pelo vírus da Imunodeficiência Humana (VIH-1) 0 método descrito na presente invenção aplica-se igualmente à deteção da infeção devido a todos os tipos de microrganismos infecciosos (como os virus, tais como, por exemplo, os vírus responsáveis por diversas hepatites, os retrovírus, em particular os retrovírus responsáveis pela SIDA no homem (VIH-1, VIH-1 grupo 0, VIH- 2) ou no macaco, o citomegalovírus (CMV), os flavivírus, em que os vírus do dengue, assim como as bactérias, os parasitas microbianos, etc.) para os quais uma deteção simultânea de antigénios e de anticorpos é adequada. 75 ΡΕ1504266 O exemplo 8 mostra a aplicação da presente invenção na deteção simultânea do antigénio virai P25 (gag) do Virus da Imunodeficiência Humana (VIH-1, i. e. « HIV-1 » em lingua inglesa) e de anticorpos anti-P25.
Materiais comuns para os protocolos a, b, c: D Fase sólida selecionada: microplaca Maxisorp, Nunc (Dinamarca). 2) Diluente da Ia etapa: Tampão Tris, NaCl 0,05 M, a pH 6,7 adicionado de NP40 (IGEPAL CA 630, Sigma) a 0,25%. 3) Diluente da 2a etapa: tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1% 4) Solução de revelação: sendo a solução de revelação composta 4a) de um tampão substrato: Solução de ácido cítrico (0,075 M) , e de acetato de sódio (0,1 M), a pH 4,0, contendo H2O2 a 0,015% e de Dimetilsulfóxido (DMSO) (PROLABO) a 4%, e 4b) de um reagente cromogénio: tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) a 0,7 mM de concentração final no tampão substrato. 5) Solução de paragem: H2SO4 1 N. 76 ΡΕ1504266
Materiais do protocolo a: deteção de anticorpos anti-P25 VIHl Péptido sintético mutado correspondente à sequência seguinte SEQ ÍD No.22
mFRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPMTL EEMMTAC3S0
e que comporta as mutações (G295-G298-G310-G312-F316) em relação à sequência de consenso da proteína P25 do VIH-1 M SEQ ID No.23
233FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKHLKALGPAATL EEMMTAC350
Conjugado de anticorpo policlonal de ovelha anti-IgG (H+L) humana marcado com peroxidase (Bio-Rad). este conjugado é diluído, antes de ser empregue, no diluente da 2a etapa (descrito a seguir) de forma a permitir obter no final, com uma amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica.
Materiais para o protocolo b: deteção de anti-génio P25 VIH-1 0 anticorpo monoclonal anti-P25 Pm25 reconhecendo a sequência da proteína P25 VIH-1 M seguinte 308QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID N° : 24) 77 ΡΕ1504266
Conjugado de anticorpo monoclonal Pm25 descrito a seguir marcado com peroxidase. Este conjugado é diluído, antes de ser empregue, no diluente da 2a etapa (descrito a seguir) de forma a permitir obter no final, com uma amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica.
Materiais para o protocolo c: deteção simultânea (« Combo ») de anticorpos anti-P25 e de antigénio P25 VIH-1 Péptido sintético mutado correspondente à sequência seguinte SEQ 10 No. 22
293FRGWGRFYKTLRAEQAGGGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATL EEMMTACaso
Anticorpo monoclonal Pm25 reconhecendo a sequência da proteína P25 VIH-1 M seguinte 308QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID N°: 24)
Conjugado de anticorpo policlonal de ovelha anti-IgG (H+L) humana marcado com peroxidase (Bio-Rad).
Conjugado de anticorpo monoclonal Pm25 descrito a seguir marcado com peroxidase.
Os 2 conjugados imuno-peroxidásicos a seguir são 78 ΡΕ1504266 diluídos em conjunto, antes de serem empregues, no diluente da 2a etapa (descrito a seguir) de forma a permitir de obter no final, com uma amostra positiva bem documentada, uma densidade ótica elevada e isto, em condições bem conhecidas do especialista da técnica. Métodos:
Protocolo a: deteção dos anticorpos anti-P25 VIH-1 0 princípio do teste é baseado num método imuno-enzimático de tipo indireto para a deteção dos anticorpos anti-P25 VIH-1.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada com o péptido mutado SEQ ID N° : 22 (G295-G298-G310-G312- F316) compreendendo a sequência SEQ ID N°: 22 em tampão Carbonato pH 9, 6
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir na proporção de 110 mL por poço.
As placas de microtitulação são postas a incubar durante uma noite à temperatura ambiente (18-24°C).
Após limitação da solução de sensibilização, as placas são lavadas com o auxílio de um tampão fosfato (0,01 79 ΡΕ1504266 Μ, ρΗ 7,4) contendo 0,1% de Tween 20, depois saturadas por adição de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7) contendo 5% de sacarose, 25% de leite desnatado (Candia™, França, ou qualquer outro leite desnatado equivalente comercializado).
Em cada poço, distribui-se sucessivamente 80 mL de diluente da Ia etapa, depois 20 mL de amostra (soro ou plasma). O meio reacional é posto a incubar a 37 °C durante 1 hora. Se os anticorpos anti-P25 VIH-1 estão presentes, estes ligam-se ao péptido fixado na fase sólida.
As placas são a seguir lavadas (3 vezes) com o auxilio de uma solução de lavagem (tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1%).
Em cada poço, distribui-se 100 mL de diluente de 2a etapa, contendo os anticorpos anti-IgG (H+L) humana marcados com peroxidase. 0 meio reacional é posto a incubar à temperatura ambiente (18-24°C) durante 30 minutos. Os anticorpos anti-IgG (H+L) humana marcados fixam-se por sua vez aos anticorpos específicos retidos na fase sólida.
As placas são a seguir lavadas (5 vezes) com o auxilio de uma solução de lavagem (tampão Tris NaCl 0,01 M, pH 7,4 adicionado de Tween 20 a 0,1%) . O conjugado anti-IgG humana não ligado é deste modo eliminado. 80 ΡΕ1504266
Em cada poço, distribui-se 100 mL da solução de revelação. Deixa-se a reação desenvolver na obscuridade durante 30 minutos à temperatura ambiente (18-24°C).
Distribui-se a seguir 100 mL de solução de paragem em cada poço.
Após paragem da reação, a leitura da densidade ótica é efetuada no espectrofotómetro a 450/620 nm.
Protocolo b: deteção do antigénio P25 VIH-1 O principio do teste é baseado num método imunoenzimático do tipo sanduíche para a deteção do antigénio P25 VIH-1. Baseia-se nas etapas seguintes:
Uma solução de sensibilização é inicialmente preparada com anticorpo monoclonal anti-P25 VIH-1 (Pm25) em tampão Carbonato pH 9,6.
Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir à na proporção de 110 mL por poço.
As etapas seguintes são idênticas às do protocolo a até à segunda etapa.
Para a segunda etapa, distribui-se 100 mL de diluente de 2a etapa, contendo o anticorpo monoclonal Pm25 81 ΡΕ1504266 marcado com peroxidase. 0 meio reacional é posto a incubar à temperatura ambiente (18-24°C) durante 30 minutos. 0 anticorpo monoclonal Pm25 marcado fixa-se então ao antigénio P25 retido na fase sólida, quando está presente.
As etapas finais são idênticas às do protocolo a.
Protocolo c: deteção simultânea (« Combo ») do antigénio P25 VIH-1 e de anticorpos anti-P25 VIH-1 numa amostra (soro ou plasma) 0 principio do teste é baseado num método imunoenzimático de tipo sanduíche para a deteção de antigénio e de tipo indireto para a deteção de anticorpo.
Baseia-se nas etapas seguintes: uma solução de sensibilização é inicialmente preparada: • com o péptido mutado SEQ ID N°: 22 (G295-G298-G310-G312-F316) e, • com o anticorpo monoclonal anti-P25 (Pm25) em tampão Carbonato pH 9,6. Os poços de uma placa de microtitulação (Nunc, Maxisorp) são então sensibilizados com a solução a seguir na proporção de 110 mL por poço.
As placas de microtitulação são postas a incubar durante uma noite à temperatura ambiente (18-24°C). 82 ΡΕ1504266
Após limitação da solução de sensibilização, as placas são lavadas com o auxilio de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20, depois saturadas por adição de um tampão fosfato (0,01 M, pH 7) contendo 5% de sacarose, 25% de leite desnatado (Candia™, França, ou qualquer outro leite desnatado equivalente comercializado).
Em cada poço, distribui-se sucessivamente 80 mL de diluente de Ia etapa, depois 20 mL de amostra (soro ou plasma). O meio reacional é posto a incubar a 37°C durante 1 hora. O antigénio P25 eventualmente presente liga-se ao anticorpo monoclonal da fase sólida. Do mesmo modo, se os anticorpos anti-P25 estão presentes, estes ligam-se ao péptido antigénico fixado na fase sólida.
As etapas seguintes são idênticas às do protocolo la até à segunda etapa.
Para a segunda etapa, distribui-se 100 mL de diluente de 2a etapa, contendo o anticorpo monoclonal Pm25 marcado com peroxidase e os anticorpos anti-IgG (H+L) humana marcados com peroxidase. O meio reacional é posto a incubar à temperatura ambiente (18-24°C) durante 30 minutos. O anticorpo monoclonal Pm25 marcado fixa-se então ao antigénio P25 retido na fase sólida. Do mesmo modo, os anticorpos anti-IgG (H+L) humana marcados fixam-se por sua vez aos anticorpos específicos retidos na fase sólida. ΡΕ1504266 83
As etapas finais são idênticas às do protocolo a.
Resultados:
Amostra Protocolo a (D.O.) Protocolo b (D.O.) Protocolo c (D.O.) Positivo an Anticorpos anti-P25 Am.l 0,138 0,316 Am.2 0,513 - 0,946 Positivo no Antigénio P25 N°1 1,104 1,151 N°2 - 0,587 0,695 Negativo no Anticorpo anti-P25 e no Antigénio P25 Am. 3 0,045 0,051 0,125 Am. 4 0,025 0,049 0,179
Como se pode constatar igualmente aqui, também, a captura do antigénio P25 do VIH-1 e a dos anticorpos anti-P25 do VIH-1 se faz, na presente invenção, numa única e mesma zona proteica da cápside: a zona antigénica que captura os anticorpos anti-P25 (AA293-350) inclui a zona de especificidade de antigénico (AA 308-322) através do qual o anticorpo anti-P25 imobilizado (Pm25) captura o antigénio P25.
Obviamente que o especialista da técnica, que se inspira do presente exemplo 8, por exemplo, poderá também realizar facilmente um imunoensaio de deteção simultânea do antigénio P25 (gag) do VIH-1, os anticorpos anti-P25 do VIH-1 e os anticorpos dirigidos contra a glicoproteina gp41 84 ΡΕ1504266 (envelope) do VIH-1. Para a deteção dos anticorpos anti-gp41 do VIH-1, poderá utilizar, a titulo de exemplo não exaustivo, seja a gp 41 inteira, natural ou recombinada, seja conhecida, seja um péptido contendo o epitopo imunodominante da gp41, tal como o descrito pela publicação de Gnann, JW., et al. (1987) .
Fazem parte também da invenção os imunoensaios de deteção simultânea do antigénio P26 (gag) do VIH-2 (i. e. « HIV-2 » em lingua inglesa), os anticorpos anti-P26 do VIH-2 e os anticorpos dirigidos contra a glicoproteína gp36 (envelope) do VIH-2. 0 especialista da técnica poderá ter recursos, para detetar o antigénio P26, os anticorpos anti-P26, já conhecidos, e, para detetar os anticorpos anti-P26, os péptidos antigénicos da p26, por exemplo, deriváveis da sequência do VIH-2 publicado por Guyader et al. (1987). Para a deteção dos anticorpos anti-gp36, o especialista da técnica poderá ter recursos, a titulo de exemplo não exaustivo, seja a gp 36 inteira, natural ou recombinada, já conhecida, seja um péptido contendo o epitopo imunodominante da gp36, tal como o descrito pela publicação de Gnann, JW., et al. (1987).
Será também possível realizar facilmente um imunoensaio « Combo VIH-1 + VIH-2 » aliando simultaneamente a deteção do antigénio P25 do VIH-1, do antigénio P26 do VIH-2, os anticorpos anti-P25 do VIH-1, os anticorpos anti-P26 do VIH-2, os anticorpos anti gp41 do VIH-1 e os anticorpos anti-gp36 do VIH-2, que faz também parte da invenção. 85 ΡΕ1504266
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<210> 1 <211> 75 <212> PRT
<213> Virus da Hepatite C <400> 1 het Ser Thr Asn pro LyS pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Aon Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gin Asp Vai Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile Vai Gly 20 25 20 Gly Vai Tyr Leu Leu Pro Axg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Vai Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr ser <31 u Arg Ser Gin Pro *rg Gly Arg Arg Gin Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser S5 70 75
<210> 2 <211> 63 <212> PRT <213> Virus da Hepatite C <400> 2
Lys Pro Gl« tog Lys Thr Lys Arg Asa Thr Asn Arg Arg Pr© Gin Asp 1 S 10 15
Vai Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile Vai Gly Gly Vai Tyr Leu Leu 20 25 10
Pró tog Arg Gly Pro Arg teu Gly Vai Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser 35 40 45
Glv Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro Ile Pro Lys Ais 50 §5 60 88 ΡΕ1504266
<210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Vírus da Hepatite C <400> 3
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 15 10 IS
Arg Arg Pro Gin Aep Vai Lys Fhe Pro Gly Gly Gly Gin Ile Vai Gly 10 2S 30
Gly Vai Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro ftrg Leu Gly Vai Arg Ala 35 40 4S
Thr Arg Lys Thr ser Sõ
<210> 4 <211> 75 <212> PRT <213> Vírus da Hepatite C <400> 4
Met ser thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Astí Thr Asn
1 5 10 IS
Arg Arg Pro Gin Asp Vai Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin IIe Vai Gly 20 25 30
Gly Gly Tyr Leu Lev Pro Arg Arg Gly Pr© Arg Gly Gly Vai Gly Ala 35 40 45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro 50 55 50
lie pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser Ê5 70 7S
<210> 5 <211> 75 <212> PRT <213> Vírus da Hepatite C <400> 5 89 ΡΕ1504266
Wefc Ser The Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Tfar Lys Arg Asn ffar Aan 1 S 10 15
Arg Arg Pro Gl» Asp Vai Lys Phe pro Giy Gly Gly Glr. Ile Giy Gly 20 25 30
Gly Vai Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro .Arg Gly Gly vai Gly Ala 15 40 45
Thr Arg Lys The Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro 50 55 50
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser 65 ' 70 75
<210> 6 <211> 75 <212> PRT <213> Vírus da Hepatite C <400> 6
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thx Lya Arg Asn Tkr Asn 15 10 15
Arg Arg Pro Gin Asp vai Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin xle vai Gly 20 25 30
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Asp ser 3S 4 de novembro de 2013

Claims (31)

  1. ΡΕ1504266 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de deteção in vitro de uma infeção por um microrganismo numa amostra biológica, compreendendo a deteção simultânea de pelo menos um antigénio do referido microrganismo e de um anticorpo dirigido contra o referido microrganismo, presentes na amostra biológica, compreendendo o método a) colocar em presença da amostra biológica um anticorpo de captura dirigido contra o referido microrganismo imobilizado numa fase sólida, e um antigénio de captura derivado do referido microrganismo imobilizado numa fase sólida; b) incubação da mistura em condições que permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a revelação dos complexos antigénios-anticorpos formados, que utilizam um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio do referido microrganismo capturado e/ou eventualmente também um antigénio de deteção, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo dirigido contra o referido microrganismo capturado; e no qual o antigénio de captura e/ou o antigénio de deteção, marcado, do referido microrganismo compreende um fragmento antigénico do referido microrganismo em que pelo menos um epitopo é destruído, sendo tornado incapaz de ser 2 ΡΕ1504266 reconhecido pelo anticorpo de captura e/ou de deteção dirigido contra o antigénio sendo capaz de se ligar aos anticorpos dirigidos contra o microrganismo, por reconhecimento de outros sitios epitópicos que ficaram intac-tos; e o anticorpo de captura e/ou de deteção, que são anticorpos monoclonais ou policlonais monoespecificos, reconhecem o referido pelo menos um epitopo, intacto, do antigénio capturado.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o microrganismo é selecionado no grupo constituído pelos virus, as bactérias e os parasitas microbianos.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual o microrganismo é um virus da hepatite C (VHC).
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual o antigénio de captura compreende um fragmento antigénico da proteína da cápside do VHC, no qual pelo menos um sítio epitópico é destruído.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, no qual o antigénio de captura compreende um fragmento antigénico da proteína não estrutural do VHC NS3 ou NS4.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual o microrganismo é um vírus da imunodeficiência humana (VIH). 3 ΡΕ1504266
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, no qual o VIH é um VIH-1 e/ou um VIH-2.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, no qual o antigénio de captura compreende um fragmento antigénico da proteína gag do VIH, no qual pelo menos um sítio epitópico é destruído.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, no qual o antigénio de captura compreende um fragmento antigénico de uma proteína do envelope do VIH.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, no qual o antigénio de captura contém pelo menos dois sítios epitópicos diferentes destruídos.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, no qual o antigénio de captura contém um sítio epitópico destruído por substituição, deleção, ou inserção, de pelo menos um aminoácido.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, no qual o anticorpo de deteção é adicionado à mistura depois dos complexos antigénios-anticorpos se terem formado.
  13. 13. Método de acordo com qualquer uma das rei vindicações 3 a 12, no qual anticorpo de deteção, e/ou o antigénio de deteção, é colocado em presença da amostra 4 ΡΕ1504266 biológica ao mesmo tempo que o anticorpo de captura e o antigénio de captura.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo a) colocar em presença da amostra biológica um anticorpo de captura do VHC e um antigénio de captura do VHC fixados numa fase sólida; b) incubação da mistura em condições que permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a separação da fase sólida e da fase liquida, d) a colocação em contacto da fase sólida com, por um lado, um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio de VHC capturado, e por outro lado, um anticorpo, anti-imunoglobulina ou anti-isotipo, ou um antigénio de deteção, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti-VHC capturado, o antigénio de captura,e o antigénio de deteção, anticorpos anti-VHC compreendendo fragmentos antigénicos da proteína da cápside do VHC, em que dois epitopos foram destruídos, e os anticorpos de captura e de deteção reconhecendo cada um dos referidos epitopos, intactos, do antigénio da cápside capturado.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o anticorpo de captura e o anticorpo de deteção reconhecem cada um, um epitopo selecionado a partir do grupo de epitopos de sequências seguintes: 5 ΡΕ1504266 44LGVR47 (SEQ ID N° : 19), 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° : 20) e 29QIVGGV34 (SEQ ID N°: 21).
  16. 16. Método de deteção de acordo com a reivindicação 6 ou 7, compreendendo: a) colocar na presença da amostra um anticorpo de captura do VIH e um antigénio de captura do VIH fixados numa fase sólida; b) incubação da mistura em condições que permitam a formação de complexos antigénios-anticorpos, c) a separação da fase sólida e da fase liquida, d) a colocação em contacto com a fase sólida de um anticorpo de deteção, marcado, capaz de se ligar ao antigénio de VIH capturado, e um ou os anticorpos anti-imunoglobulina, ou anti-isotipo, marcado, capaz de se ligar ao anticorpo anti-VIH capturado, compreendendo o antigénio de captura de anticorpos anti-VIH um fragmento antigénico da proteina gag do VIH, em que pelo menos um epitopo foi destruído, e reconhecendo os anticorpos de captura e de deteção cada um, um dos referidos epitopos, intactos, do antigénio da cápside capturado.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o anticorpo de captura e o anticorpo de deteção reconhecem cada um epitopo de sequência QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N°: 24). 6 ΡΕ1504266
  18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que a colocação em presença da amostra biolóqica com o referido anticorpo de captura e o referido antiqénio de captura fixados numa fase sólida se realiza na presença de pelo menos um detergente de tipo não iónico.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, no qual o referido detergente não iónico é ο NP40.
  20. 20. Estojo ("Kit") útil para a deteção de uma infeção por um virus da hepatite C (VHC) ou um vírus da imunodeficiência humana (VIH) numa amostra biológica, compreendendo: um antigénio de captura, imobilizado numa fase sólida, que compreende um fragmento antigénico de uma proteína do referido VHC ou VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, tendo sido tornado incapaz de ser reconhecido por um anticorpo de captura e um anticorpo de deteção dirigidos contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, selecionado a partir do grupo de epitopos das sequências seguintes: 44LGVR47 (SEQ ID N°: 19), 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° : 20), 29QIVGGV34 (SEQ ID N° : 21), QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N°: 24) e QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N°: 25), conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos dirigidos contra o microrganismo 7 ΡΕ1504266 eventualmente presente na amostra biológica, por reconhecimento de outros sitios epitópicos que ficaram intactos; o referido anticorpo de deteção, monoclonal ou policlonal monoespecifica, dirigido contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, da referida proteina do VHC ou VIH; e o referido anticorpo de captura monoclonal ou policlonal monoespecifico, imobilizado numa fase sólida, dirigido contra o referido pelo menos um epitopo, intacto, da referida proteina do VHC ou VIH; sendo a referida proteina do VHC a proteina da cápside do VHC e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhecendo um epitopo selecionado a partir do grupo de epitopos das sequências seguintes: 44LGVR47 (SEQ ID N°: 19), 30IVGGVYL36 (SEQ ID N° : 20) e 29QIVGGV34 (SEQ ID No, 21), ou sendo a referida proteina do VIH a proteina P25 do VIH-1 e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhecendo o epitopo de sequência QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID N°: 24), ou sendo a referida proteina do VIH a proteina P26 do VIH-2 e o anticorpo de captura e/ou de deteção reconhecendo o epitopo de sequência QTDPAVKNWMTQTLL (SEQ ID N°: 25).
  21. 21. Estojo ("Kit") de acordo com a reivindicação 20, na qual os referidos anticorpos de captura e de deteção são dirigidos contra um epitopo idêntico, intacto, da referida proteina do VHC ou VIH. ΡΕ1504266
  22. 22. Estojo ("Kit") de acordo com a reivindicação 20, no qual o referido antigénio de captura compreende um fragmento antigénico da referida proteina do referido VHC ou VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos dois epitopos destruídos que foram tornados incapazes de serem reconhecidos pelo referido anticorpo de captura e o referido anticorpo de deteção e - o referido anticorpo de captura é dirigido contra um dos referidos dois epitopos, intactos, da referida proteína do VHC ou VIH, enquanto o anticorpo de deteção é dirigido contra o outro dos referidos dois epitopos, intactos, da referida proteína do VHC ou VIH.
  23. 23. Estojo ("Kit") de acordo com uma das reivindicações 20 a 22, compreendendo, para além do antigénio de captura, um meio de deteção dos referidos anticorpos anti-VHC presentes na amostra biológica e complexados com o referido antigénio de captura.
  24. 24. Estojo ("Kit") de acordo com uma das reivindicações 20 a 22, compreendendo, para além do antigénio de captura, um meio de deteção dos referidos anticorpos anti-VIH presentes na amostra biológica e complexados com o referido antigénio de captura. 9 ΡΕ1504266
  25. 25. Estojo ("Kit") de acordo com a reivindicação 23 ou 24 na qual o meio de deteção é um anticorpo anti-imunoglobulina ou anti-isotipo marcado.
  26. 26. Estojo ("Kit") de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, compreendendo: a) um antigénio de captura que compreende um fragmento antigénico de uma proteína do VHC, compreendendo o referido fragmento pelo menos dois epitopos destruídos, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VHC eventualmente presentes numa amostra biológica, b) um anticorpo de captura dirigido contra um dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VHC; estando o referido antigénio de captura e o referido anticorpo de captura imobilizados numa fase sólida, e cl) um anticorpo de deteção, marcado, dirigido contra um outro dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VHC, e/ou c2) eventualmente um antigénio de deteção, marcado, que é um fragmento antigénico de uma proteína do VHC, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VHC eventualmente presentes numa amostra biológica. 10 ΡΕ1504266
  27. 27. Estojo ("Kit") de acordo com a reivindicação 25 compreendendo: a) o antigénio de captura, que compreende um fragmento antigénico de uma proteína de um VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VIH eventualmente presentes numa amostra biológica, b) um anticorpo de captura dirigido contra um dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VIH, estando o referido antigénio de captura e o referido anticorpo de captura imobilizados numa fase sólida, cl) um anticorpo de deteção, marcado, dirigido contra um outro dos referidos epitopos, intactos, da referida proteína do VIH, c2) e/ou eventualmente um antigénio de deteção, marcado, que é um fragmento antigénico de uma proteína do VIH, compreendendo o referido fragmento pelo menos um epitopo destruído, conservando qualquer um a capacidade de se ligar aos anticorpos anti-VIH eventualmente presentes numa amostra biológica.
  28. 28. Estojo ("Kit") de acordo com uma das reivindicações 20 a 27, compreendendo, por outro lado, pelo menos um detergente de tipo não iónico. 11 ΡΕ1504266
  29. 29. Estojo ("Kit") de acordo com a reivindicação 28, no qual o referido detergente de tipo não iónico é o NP4 0 . proveniente da pro-pelo menos um sitio qualquer uma das
  30. 30. Péptido ou polipéptido terna da cápside do VHC, portador de epitópico intacto e compreendendo sequências SEQ ID N°: 4a SEQ ID N.18.
  31. 31. Péptido ou polipéptido proveniente da pro-teina gag de um VIH, portador de pelo menos um sitio epitópico intacto e compreendendo a sequência SEQ ID N°: 22. Lisboa, 4 de novembro de 2013
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