TW200817034A - Vaccine - Google Patents

Description

200817034 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 =明係關於奈瑟菌疫苗組合物領域、其製 =物於醫藥之用途。更具體而言，本發明係關於製 新穎基因工程之腦膜炎球菌菌株之方法，該等菌株更適人 於製備奈瑟茵（尤其腦膜炎球菌）外膜囊（或泡（bieb))疫苗: 本發明亦閣述基於使用在人類個體中更安全及更有效的新

穎LOS亞單位或腦膜炎球菌外膜囊（或泡）疫苗之有利方法 及疫苗產品。 ' 【先前技術】 腦膜炎奈瑟菌咖)（腦膜炎球菌）係革 蘭氏陰性細菌，其通常自人類上呼吸道分離得到。其可導 致諸如菌血症及腦膜炎等嚴重侵襲性細菌疾病。腦膜炎球 菌疾病之發病率顯示地理、季節及年份之差異（Schwartz， B·，Moore，P.S·，Broome，C.V.; Clin· Microbiol· Rev· 2 (Supplement)，S18-S24，1989)。該細菌通常根據其莢膜多 糖之血清組（serogroup)分類。 溫帶國家中大部分疾病係由血清組B之菌株導致，並且 發病率在1-1 0/100,000/年總人口（有時達更高值）變化 (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9，1995; Scholten，R.J.P.M·，Bijlmer，H.A·，Poolman，J.T.等 人 Clin. Infect. Dis· 16: 237-246，1993; Cruz，C·，Pavez， G·，Aguilar，E.等人 Epidemiol· Infect· 105: 1 19-126, 1990)。 121392.doc 200817034 血清組A腦膜炎球菌主導之流行病主要發生於中非，有 時發病率水平高達 1000/100,000/年（Schwaftz，B.，Moore， P.S·，Broome，C.V· Clin. Microbiol· Rev· 2 (Supplement)， S18-S24，1989)。總體上，幾乎所有的腦膜炎球菌疾病病 例係由血清組A、B、C、W-135及γ腦膜炎球菌導致，並 且現有四價A、C、W-135、Y莢膜多糖疫苗可得（Armand， J.，Arminjon，F.，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand· 10: 335-339， 1982) 〇 f、 " 在過去的數十年間，許多歐洲國家的腦膜炎奈瑟菌感染 頻率上升。原因是由於社會活動（例如游泳池、電影院等） 增多導致傳播增加。分離到對某些標準抗生素不太敏感或 有抗性之細膜炎奈瑟菌菌株不再罕見。此現象產生對於此 生物體之新穎抗微生物劑、疫苗、藥物篩選方法及診斷測 试之不適當醫學需求及需要。 現有的多糖疫苗目前藉由化學方式使其與載體蛋白結合 : 來改進（Lieberman，J.M·，Chiu，s s，w〇ng，v κ 等人 JAMA 275 : 1499-1503，1996)。 然而，現在無血清組B疫苗。已發現，血清組B莢膜多 糖不具有免疫原性-最有可能係因為其與宿主組份具有結 構類似性（Wyle，F.A·，Artenstein，M.S·，Brandt，M.L·等人 J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M_，Makela，P.M· Lancet n·: 355_357, 1983)。因此，人們 已將努力放在試圖自外膜囊（或泡）或來自外膜囊（或泡）之 純化蛋白質組份開發血清組B疫苗。 121392.doc 200817034 另外用於疫苗開發之腦膜炎球菌抗原係腦膜炎球菌脂募 糖（LOS)。該等係外膜結合之糖脂，其缺少〇側鏈而不同於 腸桿菌科（Enterobacteriaceae)之脂多糠（LPS)，因此類似於 LPS之粗形式（Griffiss等人 RevInfectDis 1988; 10: S287· 295)。LOS寡糖部分内之異源性產生不同腦膜炎球菌菌株 間結構上及抗原性的差異（Griffiss等人；[nf· immun. 1987; 55:1792-1800)。已用此將該等菌株細分成12種免疫型 (Scholtan等人 J Med Microbiol 1994，41:236-243)。免疫 分型通常藉由奥克特洛尼（Ouehterlony)方法使用對抗已知 免疫型之LOS所產生的吸附性多株抗體而實施（p〇〇lman JT，Hopman CTP 及 Zanen HC，FEMS Microbiol Letters (1982) 13: 339-348)。免疫型L3、L7及L9在免疫性上相同 並且在結構上類似（或甚至相同），因此已命名為L3,7,9(或 為本說明書之目的，概稱為"L3")。腦膜炎球菌LOS L3,7,9 (L3)、L2及L5可藉由唾液酸化修飾，或藉由添加胞苷5，_單 磷酸-N-乙醯基神經胺酸修飾。儘管L2、L4及L6 LOS在免 疫性上可區分開來，但彼等在結構上類似，在本文中提及 L2之處，在本發明範圍内可視情況取代乙4或乙6。l〇S之抗 體已顯示可保護實驗大鼠對抗感染，並且在感染腦膜炎奈 瑟菌之兒童中具有殺菌活性（Griffiss等人j Infect Dis !984; 150: 71-79) 〇 然而’在腦膜炎球菌疫苗中使用L〇s伴有一個問題為其 毒性（由於其脂質A部分）。 LOS亦存在於腦膜炎球菌泡之表面上。許多年以來，人 121392.doc 200817034 們已將努力放在開發基於腦膜炎球菌外膜囊（或泡）之疫苗 上（de Moraes，J.C·，Perkins，B·，Camargo，M.C·等人

Lancet 340: 1074-1078. 1992; Bjune, G.? Hoiby5 E.A.

Gronnesby，J.K·等人 338: 1093_1〇96, 1991)。此等疫苗 之優點為幾種完整外膜蛋白質包括於適當折疊之構型中， 當施於宿主時，其可誘發保護性免疫反應。另外，奈瑟菌 菌株（包括腦膜炎奈瑟菌血清組B-menB)分泌足夠量外膜 泡，使得能夠以工業規模製造外膜泡。然而，泡更常藉由 包括細菌細胞（例如EP 1 1243)以〇·5%清潔劑（例如脫氧膽酸 鹽）提取之方法製備。儘管由於上述L〇s(亦稱為内毒素）之 毋性而需要這樣做，但其亦會導致自疫苗去除大部分L〇S 抗原。 使用LOS作為疫苗抗原之另一個問題為12 lpS免疫型以 多種碳水化合物結構存在（Μ· Ρ· jenningS等人，Microbiology 1999，145，3013-3021; Mol Microbiol 2002，43:931- 43)。 所激發的抗一種免疫型之抗體不能識別不同的免疫型。儘 管人們將努力放在產生該等LOS免疫型之寡糖部分之一般 性”核”區域上（例如WO 94/08021)，但所產生之對抗經修飾 之LOS之抗體卻喪失殺菌活性。因此，疫苗可能需要具有 許多不同免疫型之LOS組份才能有效。 於人類疫苗中使用LOS(亦稱為LPS或脂多糖）作為抗原 存在另一個問題，即其具有類似於人類糖結構（例如於人 類紅血球上）之糖結構，故其使用帶來安全問題。但由於 LOS抗原之殺菌效能之結構敏感性，使得改變l〇s結構成 121392.doc 200817034 為問題。 w〇 20G4/G14417闡述對該等問題之某些解決方法。 本發明之發明者已另外發現： -修飾LOS内核對於界定免疫型之殺菌表位(epit〇pe)十分 重要， -已顯示不同結構之L〇s之組合能有效對抗血清組A、B、 C、W1 3 5及Y之腦膜炎球菌疾病， -已知的變異免疫型L3V不會被抗L3血清殺死，但會被抗 L 2血清殺死， -已發現可使L2 LOS在附著於庚糖η之GicNAc殘基〇_乙醯 基化修飾之酶，以及編碼其之基因〇acl， -已發現Ο-乙醯基化之L3免疫型LOS(先前從未報導），此 似乎廣泛分佈於L3菌株中， -儘管對抗常見L3 L0S之抗體可殺死〇·乙醯基化乙3菌株， 但不如殺死常見L 3菌株有效。 上述發現使得本發明之發明者提出以新穎而有益之方式 使用奈瑟菌L0S製造奈瑟菌疫苗調配物。 【發明内容】 因此，本發明提供一種包含奈瑟菌菌株之L2 L0S及L3 L0S之免疫原性組合物，其中該L0S具有以下結構： 121392.doc -10- 200817034 KD〇n |(α2-4)

Gk ——HepI —一'一一KDOI------—脂質 A (β1·4) (al~5) (〇α^)

R4 其中對於該L2 LOS :

GkNac — Gai — Gal — GkNac — Gal —

Rl= (pl， 、 （β1·4) (β1-3) ，或

NeuNac — Gal — GlcNac — Gill 一 (α2-3) ¢1-4) (pi-3) , R2=H、PEA 或 Glc， R3=PEA， R4=H 或 OAc， R5=H、PEA或 Gly， 其中對於該L3 LOS :

GkNac — Gral — Gal — GIcNac — Gal —

Rl= (β1-3) 、 (βΙ-4) (β1-3) ，或

NeuNac — Gal — GIcNac — Gal — (a2-3) (pi-4) (βΐ.3) R2=PEA ， R3=H， R4=H或 OAc， -11 - 121392.doc 200817034 R5=H、PEA 或 Gly。 上述術語為LOS技術中之標準縮寫，舉例而言，Glc表 葡萄糖（或D-。比喃葡萄糖），KDO表2-酮-3-脫氧辛糖酸 (octonate)，Hep表L-甘油-D-甘露-庚糖，GlcNac表N-乙醯 基葡萄糖胺，Gal表半乳糖，NeuNac表唾液酸，OAc表0-乙醯基，PEA表磷酸乙醇胺（或2-胺基乙基磷酸酯），Gly表 甘胺酸等。 在本說明書中每一處’’奈瑟菌’’可指腦膜炎奈瑟菌，舉例 而言，血清組A、B、C、W135及Y。其亦可指任何其他可 產生本發明LOS之菌株（例如淋球菌（gonococcus)或乳醯胺 奈蒸窗（Neisseria lactamicay)。 本發明之L2及L3 LOS可分別涵蓋非L2或L3免疫型之 LOS，舉例而言，本發明之L2 LOS可涵蓋L3V LOS，L3V LOS現在已知係L3免疫型，但帶有L3V LOS之菌株可由所 產生的抗L2免疫型LOS之血清殺死·參見下文。因此，本 發明術語呒2 LOS”及"L3 LOS”之概念應以此廣義闡釋。 本發明之L2或L3 LOS可自腦膜炎奈瑟菌A、B、C、 W135或Y菌株分離。 在本發明之另一態樣中，本發明之免疫原性組合物可另 外包含奈瑟菌菌株之L10 LOS，其視情況自腦膜炎奈瑟菌 A、B、C、W135或Y菌株分離。 舉例而言，本發明之免疫原性組合物可另外包含具有以 下結構之L10 LOS : 121392.doc -12- 200817034 ΚΟΟΠ |(α2-4)

GIc-------Hep I---------KDOI---------脂質 A (β!-4) (al-5) (α2-6)

f、 R4 其中：

Rl =己糖-己糖-R2=H 或 PEA， R3=PEA， R4 = OAc， R5=H 或 Gly。 ”R1=己糖-己糖-’，可涵蓋 Gal-Gal-、Gal-Glc-、Glc-Gal·或 v Glc-Glc-殘基，例如：

Gal — Gal — Gal — Glc — qjc — Qaj — GIc 一 GIc —

Rl= (pi-4) 、 （pi-4) 、 （卜4〉 ，或（β1-4> 。 本發明LI 0 LOS中之R1端己糖可經或不經唾液酸化（若經 唾液酸化，則可視情況經由a-Neu5Ac-(2 — 3)基團唾液酸 化）。 在本發明一態樣中，本發明之免疫原性組合物之L2 LOS 非具有L4免疫型之LOS。 當本發明之免疫原性組合物之L2 LOS具有R2=PEA或Glc 121392.doc -13- 200817034 時，本發明之免疫原性組合物可另外包含具有以下結構之 本發明之L4 LOS : R1

Ole —-----Uep X----------- Φ14) (α^5)

KDOII |(α2>4) KDOI

脂質A (α2-6)

R4 其中對於該L4 LOS : GIcNac — Gal — G«1 — GlcNac — GhI — R1 (βί-3) (βί-4) (β1-3) 或 R2 = H， R3=PEA， R4 = OAc， R5 = Gly o 或者，本發明之L4LOS可具有R4=H及/或R5=H。

本發明之L4 LOS可自腦膜炎奈瑟菌A、B、C、W135或Y 菌株分離。 本文中之”本發明的一或多種LOS”或’’本發明之LOS’’或 類似短語意指本發明之L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 121392.doc -14- 200817034 LOS、L2及 L3 LOS、L2及 L10 LOS、L3及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4 及 L3 LOS、L4 及 L10 LOS、L2 及 L3 及 L10 LOS、L2 及 L3 及 L4 LOS、L2 及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或L2及L3及L10及L4 LOS。本文中之’’本發明之 泡製劑’’或類似短語意指一或多種具有本發明之L2 LOS、 L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 * LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、L2及 L4 f ^ ' 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS之本發明泡。本發明之細菌菌株係可分離一或多種本 發明之LOS之菌株。 一或多種本發明之LOS可與蛋白載體結合，蛋白載體係 T助手（helper)表位之來源-例如破傷風類毒素、白喉類毒 素、CRM197，或腦膜炎球菌泡上之外膜蛋白質（參見下 文）。一或多種之脂質A部分可以化學方式（參見下文）或以 / 基因方式（舉例而言，若自msbB(-)及/或htrB㈠奈瑟菌菌株 (/ 分離-參見下文）去毒。 一或多種本發明之LOS可存在於免疫原性組合物中以純 < KLOS製劑形式、以脂質體製劑（通常包含經純化LOS)形 式、或以泡製劑形式（參見下文）。 本發明之泡製劑可於使用0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、 0.06-0.2、0.08-0· 15或0.09-0.11%清潔劑（較佳脫氧膽酸鹽） 之提取步驟後自其各自的奈瑟菌菌株分離。其各自的奈瑟 菌菌株可能已於存在鐵之條件下培養，或於鐵耗乏之條件 121392.doc -15- 200817034 下（例如添加鐵螯合劑，例如參見下文）培養。本 發明之泡製劑可自不能合成英膜多糖之奈瑟菌菌株分離。 舉例而σ與衍生其之天然菌株相比，該菌株可具有下列 英膜夕糖基因之一之表現下調（d〇wnreguiated),或缺失（即 , 無該基因之功能表現）：ctrA、CtrB、ctrC、CtrD、synA、 synB、SynC或較佳siaD。當^及“泡均存在（或存在一種 以上的本土明泡製劑）時，衍生它們之菌株在每一菌株中 (、#有相同的笑膜多糖基因之表現下調。與衍生其之天然菌 株相比’該奈瑟菌菌株可具有下列脂質A基因之表現下 調’較佳缺失（即無該基因之功能表現）：咖⑽或以化，較 仫則者田L2及L3泡均存在（或存在一種以上的本發明泡 製劑)時’衍生該等泡之菌株在每一菌株中具有相同的脂 質^基因之表現下調。與衍生其之天然菌株相比，該奈瑟 菌菌株可具有一或多種下列外膜蛋白質基因之表現下調， 較佳缺失(即在’亥菌株之外膜上無該I因產物之表現）： Ρ〇ΓΑ、_、opA、—、_、lbp^frpB。當以⑶包 均存在(或存在一種以上的本發明泡製劑)時，該等菌株較 佳在各奈瑟菌菌株t具有相同的外膜蛋白質基因之表現下 調。該奈瑟菌菌株可具有一或多種以下外膜蛋白質抗原之 表現上調（upregulated): NspA、TbpA低、TbpA 高、μ、 Hap、〇MP85、PilQ、NadA、⑽幻請、_Α。㈣心 泡均存在（或存在一種以上的本發明泡製劑）時，衍生它們 之菌株較佳在每-菌株中具有—或多種不同的外膜蛋白質 抗原之表現上調。 ' 121392.doc -16- 200817034 殺j毛明另外提供包含有效量之本發明免疫原性組合物及 面藥上可接受載劑之疫苗組合物。該疫苗可另外包含佐 ^例如氳氧化鋁或鱗酸鋁。該疫苗可另外包含一或多種 衍生自以下菌株之結合莢膜多糖或募糖··腦膜炎球菌血清 組八、腦《炎球g血清組c、腦膜炎球菌血清組w_i35、腦 膜炎球菌血清組y及流感嗜血桿菌（妖型。 本發明亦提供一種本發明之免疫原性組合物或本發明之 疫苗於製備藥物之用途，該藥物用於預防或治療由一或多 種選自下列之腦膜炎奈瑟菌血清組所導致之疾病义、B、 W1 3 5及Y。本發明另外提供一種預防或治療由一或多 種垃自下列之腦膜炎奈瑟菌血清組導致之疾病之方法： A B、C、W135及Y，該方法包括向有需要之人類患者施 〃本表月之免疫原性組合物或本發明之疫苗之步驟。 此外，本|明提供一種製造本發明之免疫原性組合物或 疫苗之方法，其包括以下步驟：分離該L2 l〇s及該U L〇S，合併該L2&L3 L〇s，以及使該L2Al3 l〇s與醫藥 上可接受之賦形劑調配在一起。 本發明之發明者亦發現’令人吃驚地，L3V免疫型菌株 容易由所產生之抗L2免疫型L0S之血清殺死。出於本發明 之目的，該L3V免疫型不歸類M3菌株，此乃因其在免疫 性上更類似於L2免疫型。 因此，在本發明另一態樣中，提供一種包含奈瑟菌菌株 之L3V L0S之免疫原性組合物於製造預防或治療腦膜炎奈 瑟菌L2免疫型疾病用藥物之用途，或一種包含奈瑟菌菌株 121392.doc -17- 200817034 之L2 LOS之免疫原性組合物於製造預防或治療腦膜炎奈瑟 菌L3V免疫型疾病用藥物之用途。本發明亦提供一種治療 或預防腦膜炎奈瑟菌L2免疫型疾病之方法，其包括向有需 要之人類患者施與有效量之包含奈瑟菌菌株L3V LOS之免 疫原性組合物之步驟，或一種預防或治療腦膜炎奈瑟菌 L3V免疫型疾病之方法，其包括向有需要之人類患者施與 有效量之包含奈瑟菌菌株L2 L0S之免疫原性組合物之步 驟。 在本發明之此用途/方法中，該L3V LOS可具有以下結 構：

KDOII |(α2，

Gk ——一 Hep I ——一一一 KD01 ——一一一脂質 A

Ki (β1-4) (α!^5) (ca-6)

Μ 其中=

GkNiic — Gid — Gal — GkNuc — —

Rl= Φ1-3) 、 (β1-4) (β1-3) ，或

NeuNac — Gal -- OIcNac — Gal — ^α2-3) (β!-4) (ρΐ<3) 。 R2=PEA ， R3=PEA， 121392.doc -18 - 200817034 R4=H或 OAc， R5 = H、PEA或 Gly。 上述亦可為上文所提及本發明此態樣之致病腦膜炎奈瑟 菌免疫型L3V所具有的LOS之結構。 在本發明之上述用途/方法中，該L2 LOS可具有以下結 f 構：

• KDOII

Gle ——HepI---------KDOI— --------脂質 A v Ki (β14) (ca-5) (α2·6)

R4 其中：

Grlc^i sic — Oiil — Oiil — OlcP^iic — Osil —

Rl= (Pl-3) 、 (PI-4) (PI-3) ，或 R2 = Glc， R3=PEA， R4=H或 OAc， R5=H、PEA或 Gly。 上述亦可為上文所提及本發明此態樣之致病腦膜炎奈瑟 121392.doc -19- 200817034 菌免疫型L2所具有的LOS之結構。 如整個說明書中對本發明之LOS所闡述，本發明此態樣 之L2或L3V LOS可與蛋白載體（關於進一步的闡釋，請參 見上文及下文）結合，其可包含一個去毒脂質A部分，舉例 而言’缺少與msbB(-)奈瑟菌菌株分離的L0S一致的二級醯 基鏈（及/或經由L0S與下述脂質A去毒肽複合），其可以純 化LOS製劑形式、以脂質體製劑形式、或以泡製劑型存在 於該免疫原性組合物中。若係泡製劑，則其可於使用〇_ 〇·5、〇·〇2-0·4、〇·〇4-〇·3、0.06-0.2、0.08-0.15 或 0.09-0.11 °/〇清潔劑（較佳脫氧膽酸鹽）之提取步驟後自其各自的奈瑟 菌菌株分離。該奈瑟菌菌株可能不能合成莢膜多糖，舉例 而a，與衍生其之天然菌株相比，其可能具有以下莢膜多 糖基因之一之表現下調，較佳缺失（無功能表現）：ctrA、 ctrB、ctrC、ctrD、synA、synB、synC或較佳 siaD。與衍

生其之天然菌株相比，該奈瑟菌菌株可能具有下列脂質A 基因之表現下調，較佳缺失（即無功能表現）：msbB或 htrB，較佳前者。 【實施方式】 本说明書中提及之出版物及專利或專利申請案内揭示之 標題物質及信息以引用方式併入本文中。 提及之’’脂寡糖”（或”LOS”）亦可指”脂多糠”或”LPS，，。 在所有况下，本發明之發明者皆意欲本文中之術語，，包 含η視情況可分別用術語，，由· ·組成”替代。 本發明之發明者已發現，縮短該等l〇s募糖結構會導致 121392.doc •20- 200817034

可誘發殺®免疫反應之表位喪失。反而，本發明之發明者 已發現，為了在疫苗調配物中最有效地使用L〇s，必須盡 可能地保持LOS募糖結構，僅2(或3可4)種1^〇8抗原之組合 便可產生普遍有效之奈瑟菌（較佳腦膜炎球菌）疫苗。本發 月之第t樣係種用於預防或治療奈瑟菌（較佳腦膜炎 球菌或腦膜炎球菌B)疾病之免疫原性組合物，丨包含本發 明之奈瑟菌（較佳腦膜炎球菌）L2&L3(及視情況L1〇及/或 L4)LOS。LOS可藉由已知純化方案分離，或可存在於至少 兩種由例如L2及L3奈瑟菌菌株所衍生之外膜囊（或泡）製劑 中。為自該泡製劑去除鬆散保持之毒性LOS，但在泡中保 持回里元整LOS抗原，較佳使用低濃度之清潔劑_ 0.3%、較佳0·05_〇·2%、更佳約〇•丨❹，較佳為脫氧膽酸鹽 (或DOC)，提取該等泡。令人吃驚地，尤其在泡疫苗中， 此LOS抗原之組合有利’可有效地對抗9㈣以上之腦膜炎 奈瑟菌菌株。 上述本發明之泡免疫原性組 本發明之發明者亦已發現， 括LOS)作用於其表面上 合物’並且事實上任何奈瑟菌(較佳淋球菌或腦膜炎球菌) 何生的泡免疫原性組合物，若免疫顯性外膜蛋白質之某些 、、且口之表現下凋(較佳缺失），可具有增強的保護性抗原(包 因此，本發明之另一態樣係一種 奈瑟菌菌株衍生之一或 未經修飾之菌株相比， 外膜蛋白質之表現下調 〇pC或Pile。較佳地， 多種本發明奈瑟菌泡製劑，與天然 5亥奈瑟菌菌株具有2種或多種以下 ’較佳缺失：porA、P〇rB、OpA、 p〇rA及 〇pA、porA及 OpC、OpA及 121392.doc 200817034 〇Pc、或P〇rA及〇pA及0pc下調或缺失。亦已顯示 之表現下調（較佳缺失）有利於增強交又保護抗原之作用尤 其在生長於鐵受限條件下之奈瑟菌菌株製成之泡製劑中。 因此’衍生自具有此突變之菌株之本發明奈瑟菌泡係本發 明之另-實施例，而自FrpBT調與一或多種上述下調之也 合所衍生之泡㈣本發明之實施例。較佳的是，訊rAT 調’則PorB不應下調，反之亦然。

上述突變在衍生本發明之泡免疫原性組合物之任何奈瑟 囷（較佳腦膜炎球@ ’最佳men削株中有益，尤其本文閣 述者’然而，較佳的是使用叫3免疫型奈瑟菌(較佳腦 膜炎球菌’最佳menB)菌株，通常用本文闡述之低d〇c % 提取方法提取。較佳地’本發明之泡免疫原性組合物含有 L2及L3泡二者，其中至少一種（較佳二者）缺少上述免疫顯 性外膜蛋白質（或〇MPs)之組合。下調該等基因之技術論述 於WO 01/09350(併人本文供參考）。已知在腦膜炎球菌基 因組中存在四種不同的0pa基因（Ah〇等人l99i m〇i MicrobioL 5:1429_37)，因此當稱〇pa基因之表現下調時， 意指腦膜炎球菌中所存在的丨、2、3或（較佳）所有4種基因 如此下調。此下調可如W0 01/09350中所述以基因方式實 她，或藉由尋找容易發現的不具有或具有低〇pa基因座表 現之天然穩定腦膜炎球菌菌株實施。此等菌株可使用

Poolman 等人（1985 J. Med· Micro. 19:203-209)闡述之技術 找出，其中Opa-之細胞具有不同於表現〇pa之細胞之表 型’這可藉由在板上或顯微鏡下觀看細胞之外觀看出。找 121392.doc -22- 200817034 到後，於實施發酵以確立〇pa缺乏後，藉由對細胞内容物 實施西方點潰分析，可顯示該菌株係穩定的〇pa-。 上述LOS免疫原性組合物之安全性 所激發的L 3或L· 2 L Ο S抗體之安全性受到質疑，此乃因 一個類似於人類勒糖月曰中所含乳糖新四糖寡糖基團 (Gaipi-4GlcNAcpi-3Galpl-4Glcpl-;圖 1)之結構存在。儘 管許多人已安全地用含有殘餘量L3 LOS之經脫氧膽酸鹽提 取之囊疫苗接種（G· Bjune等人，Lancet (1991)，338 1093_ 1096; GVG· Sierra等人，NIPH ann (1991)，14，195- 210)， 但右L Ο S欲保持為本文所論述之抗原，本發明之發明者已 發現LOS糖結構之一個末端部份之缺失可有利地防止抗 LOS免疫反應與人類組織表面所存在結構之交叉反應。在 一個較佳實施例中，lgtB基因之不活化產生一個中間體 LOS結構，其中不存在末端半乳糖殘基及唾液酸（參見圖1 及2，該突變產生一個4GlcNAcpl_3Gaipi-4Glcpi_結構於 L2及L3及L4 LOS中）。此等中間體可於L3及/或[2(及/或 L4)LOS菌株中獲得。L0S之替代及不佳（短）形式可藉由關 閉lgtE基因獲得。LOS之另一替代及不佳形式可藉由關閉 IgtA基因獲得。若選擇此一 lgtA-突變，較佳亦關閉lgtc表 現’以防止形成非免疫原性L1免疫型。

LgtB-突變體最佳，因為本發明之發明者已發現，此係 最優的截短，可解決安全問題，同時仍保留可誘發殺菌 (並且甚至交叉殺菌）抗體反應之L0S保護性寡糖表位。 因此，本發明之上述L2及/或以製劑（或一或多種如上所 121392.doc •23- 200817034 二）(無論是純化或在分離之泡中)或本發明 之球囷泡製劑（尤其以/或叫―般有利地衍生自一 種奈瑟囷菌株（較佳腦膜炎球菌），該菌株已受到基因工程 改造而水久下調lgtB、_或_基因之功能性基因產物 之表現，、較佳藉由關閉該基因達成，最佳藉由缺失該基因 的所有或—部分啟動子及/或開放讀碼框達成。 ，佳地，本發明之奈瑟菌菌株不能合成莢膜多糖。 當上述本發明泡製劑衍生自腦膜炎球菌B菌株時，特佳 的是亦移去該莢膜多糖（其亦含有類似於人類之糖結構）。 儘管可關閉許多基因以達成這一點，但本發明之發明者已 有利地顯示’較佳該泡生產菌株已受到基因工程改造而永 久下調該siaD基因之功能性基因產物之表現（即下調a.” 多唾液酸轉移酶活性），較佳藉由關閉該基因達成，最佳 藉由缺失該基因的所有或一部分啟動子及/或開放讀碼框 達成。此一不活化闡述於w〇 〇1/〇935〇中。該siaD(亦稱為 synD)突變是許多可自莢膜多糖去除類似人類表位之突變 中最有利的突變，因為其是唯一不影響L〇s之保護性表位 之生物合成之突變，因此有利於旨在最終使用L〇s作為保 護性抗原之方法，並且對細菌生長之影響極小。因此，本 發明之一個較佳態樣係如上所述之泡免疫原性製劑，其衍

生自 lgtE siaD_、lgtA· siaD·或較佳 lgtB. siaD.腦膜炎球菌 B 突變菌株。該菌株本身係本發明之另一態樣。 儘管上述原因使得siaD-突變較佳，但可使用關閉腦膜炎 球菌B (或一般腦膜炎球菌）莢膜多糖合成之其他突變。因 121392.doc -24- 200817034 此，可對泡生產菌株實施基因工程改造，以永久下調一或 多種以下基因之功能性基因產物之表現：ctrA、以仆、 ctrC ctrD、synA (等於 synX 及 siaA)、synB (等於以叫或 synC (等於siaC)基因，較佳藉由關閉該基因達成，最佳藉 由缺失該基因的所有或一部分啟動子及/或開放讀碼框達 成。該lgtE-突變可與一或多種該等突變組合。較佳地，使 該lgtB·突變與一或多種該等突變組合。因此，本發明之另 一態樣係一種如上所述之泡免疫原性製劑，其衍生自此一 組合之腦膜炎球菌B(或一般腦膜炎球菌）突變菌株。該菌 株本身係本發明之另一態樣。 含有各種lgt基因（包括igtB&lgtE)之奈瑟菌基因座及其 序列在業内已知（參見Μ· P· jennings等人，Micr〇bi〇1〇gy 1999, 145, 3013-3 021及其中引用之參考文獻；j Εχρ Med 180:2181-2190 [1994]; WO 96/10086)。 當本發明之全長（未截短）LOS欲用於最終產品中時，該 LOS最好是不唾液酸化（這樣L〇s便可產生對抗亦未唾液酸 化之最危險的侵襲性腦膜炎球菌B菌株之免疫反應）。在此 情況下使用具有缺失之synA(等於synX及siaA)、synB(等於 siaB)或synC(等於siaC)基因之莢膜陰性菌株較為有利，因 為此一突變亦使得menB LOS不能被唾液酸化。在本發明 之一個實施例中，使該1st基因（Gilbert等人，JBC 1996, 271:28271-6)在功能上不活化（例如經由缺失或破壞或降低 該基因之表現），或選擇一種該基因經天然破壞之菌株（對 於免疫型L3家族，此一缺陷菌株通常稱為L7免疫型）用於 121392.doc -25- 200817034 本發明。lst係α-2,3-唾液酸轉移酶，其添加末端唾液酸於 該LOScc鏈(但對於唾液酸之產生不具作用）。在一個實施例 中’本發明之囷株係lst(-)及siaD(-)。 上述突變在衍生本發明之泡免疫原性組合物之任何奈瑟 菌（較佳腦膜炎球菌，最佳menB)菌株中有益，尤其本I闡 述者，^較佳使㈣或13免疫型奈瑟菌（較佳腦膜炎球 菌，最佳menB)菌株，通常用本文闡述之低1)〇(] %提取方 法提取。較佳地，本發明之泡免疫原性組合物包含^及。 泡二者’其中至少一泡（較佳二泡）係系ί生自缺乏上述基因 表現之菌株。 LOS之毒性 本务明之上述經純化LOS或泡免疫原性組合物亦可藉由 下調某些基因在衍生它們之細菌生產菌株中之表現而變得 具有較低毒性。儘管使用天然0MV之鼻内免疫接種可能不 需要此去毒作用（j.j. Drabick等人，Vaccine (2〇〇〇)，％ 160-172)，但對於非經腸疫苗接種’去毒有益。本發明經 純化LOS或泡免疫原性組合物較佳藉由以下基因工程處理 奈瑟菌生產菌株而去毒：突變/修飾/不活化涉及脂質A生 物合成之基因，尤其涉及二級醯基鏈加入脂質A之基因， 特別經由下調msbB及/或^出基因之功能性基因產物之表 現，較佳經由關閉該基因，最佳經由缺失該基因之啟動子 及/或開放讀碼框之全部或部份。或者（或另外），該等經純 化LOS或泡免疫原性組合物可衍生自一奈瑟菌菌株已經基 因修釋而上調一或多#以下基因（藉由引入一個更強啟動 121392.doc -26- 200817034 子或整合該基因之一個額外拷貝）：pmrA、pmrB、pmrE及 pmrF。或者（或另外），該等經純化LOS或泡免疫原性組合 物可藉由向該等組合物添加多黏菌素B[—種對脂質A具有 高親和性之分子]之無毒肽功能相等物來去毒（參見下文-即，使一或多種本發明之L0S與適於降低LOS毒性之脂質 A結合肽（例如S AEP2或S AEPII)複合）。 關於上述去毒方法之更詳細情況以及關於相關啟動子/ 基因序列及上調和下調方法，請參見W0 01/09350。奈瑟 菌之msbB及htrB基因亦分別稱為lpxLl及lpxL2，（參見W0 00/263 84)，該等基因之缺失突變在表型上之特徵為，與野 生型相比，該msbB·突變L0S失去一個二級醯基鏈（保留4個 一級醯基鏈及1個二級醯基鏈），該htrB_突變L0S失去兩個 二級醯基鏈。此等突變較佳與確保該奈瑟菌生產菌株缺乏 莢膜多糖（參見上文）之突變組合，以確保去毒L0S最優呈 現於該泡上，或有助於該去毒亞單位L0S之純化。 關於可用於本發明組合物中之多黏菌素B之無毒肽功能 相等物（適於降低本發明之L0S之毒性之脂質A-結合肽）之 更詳細内容-尤其是使用肽SAEP 2(具有序列 KTKCKFLKKC，其中2個半胱胺酸形成二硫化物橋）及 SAEP II (W02006/108586之請求項1-10中闡述之肽二聚 體），請參見 W0 93/14115、W0 95/03327、W02006/ 1085 86、Velucchi 等人（1997) J Endotoxin Res 4: 1-12 以及 EP 976402。本文中提及之脂質A結合肽可指上述專利申請 案之申請專利範圍或實例中闡述肽之任何具體或通式。 121392.doc -27- 200817034 ff下調功能基因產物之表現”在本文中意指對所論述基因 之啟動子或開放讀碼框實施添加、缺失或取代以使整個基 因產物之生物合成活性降低（60%、70。/〇、80〇/。、9〇%、95% 或最佳100%)。可引入明顯移碼突變，或較弱啟動子取 代，然而隶佳的是缺失大部分或全部之開放讀碼框及/或 啟動子，以確保永久下調該（活性）基因產物（如WO 01/ ’ 09350中所述）。 上述突變在衍生本發明之泡免疫原性組合物之任何奈瑟 菌（較佳腦膜炎球菌，最佳menB)菌株中有益，尤其本文闡 述者，然而，較佳的是使用L2或L3免疫型奈瑟菌（較佳腦 膜炎球菌，最佳menB)菌株，通常用本文闡述之低d〇c % 提取方法提取。較佳地，本發明之泡免疫原性組合物包含 L2及L3泡二者（或本發明之泡製劑），其中至少一泡（較佳 二者）衍生自缺乏上述基因表現之菌株。 本發明之另外態樣包括可衍生本發明之L〇S或泡免疫原 I 性製劑之上述經基因修釋之奈瑟菌（較佳腦膜炎球菌或淋 球菌或腦膜炎球菌B)菌株。 本發明之LOS或含LOS之泡製劑 ，本發明之另一態樣係自本發明之奈瑟菌菌株分離之L〇s 製劑（較佳上述任一者）。較佳地，該分離2L〇s(或含L〇s 泡）係L2或L3免疫型，及較佳地，本發明之免疫原性組合 物包含本發明之L2及L3 LOS(或泡）製劑二者。 亦可藉由使上述LOS(不管是經純化或存在於泡製劑中） 之养糖部分與包含T細胞表位來源之載體結合（因而使該 121392.doc • 28 · 200817034 LOS成為甚至更佳（τ-依賴型）免疫原）來改進此等製劑。另 一選擇（或另外）可藉由在業内已知之脂質體調配物中遞呈 本發明之純化L0S製劑而使其成為更佳抗原（參見，舉例而 言，W〇 96/40063及其中引用之參考文獻）。 自細菌分離L0S之方法在業内眾所周知（參見例如

Wesphal & jann [Meth· Carb〇e chem. 1965，5:83_91]之熱 水-苯紛程序）。亦參見Galan〇s等人1969，Eur j Bi〇ehem 9, 245-249，及 Wii 等人 1987, Anal Bio Chem 160:281-289。 、、、。。刀離之LOS之技術亦已知（參見，舉例而言，歐洲專利 第94173S號，併入本文供參考）。 出於本發明之目的，”包含τ細胞表位來源之載體，，通常 係肽，或較佳係多肽或蛋白質。結合技術在業内眾所周 知。典型載體包括非分型之流感嗜血桿菌⑼耐/_) 之蛋白質D、破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、或 泡（尤其奈瑟g或腦膜炎球菌）製劑中存在之外膜蛋白質。 本么明之較佳分離之L〇s組合物係：包含二2及U分離之 LOS之組合物，其中各L〇s之募糖部分視情況結合至包含τ 細胞表位來源之載體；包含⑽之組合物，該L2 或L3 LOS具有與衍生其之lgtB-腦膜炎球菌菌株一致之結 構、，其中各LOS之寡糖部分視情況結合至包含丁細胞表位 來源之載體，·及最佳包扣心分離之⑽之組合物，該 ^2及L3~ _^LQS具有與衍生它們之1抑_腦膜炎球菌菌株 -致之結構，#中各L〇s之寡糖部分視情況結合至包含丁 細胞表位來源之載體。 121392.doc -29- 200817034 較佳地’本發明之LOS組合物（一或多種本發明之l〇s) 已去母。此可藉由自該分子去除醯基鏈（但這可降低該分 子之保護功效）之已知肼或鹼水解化學處理技術實施，但 較佳藉由自htrB·或msbB_腦膜炎球菌突變體（如上所述，尤 其在莢膜多糖負菌株中）分離該L0S實施，或藉由向該組合 物添加多黏菌素B (對脂質A具有高親和力之分子）之無毒肽 功能相等物（尤其SAEP 2或SAEPII(如上所述））實施。 本發明之L0S可以分離態（若該脂質a部分仍完整，則通 常呈膠粒形式）施與，或可於脂質體中施與。在此情況 下’可向該脂質體添加外膜蛋白質，該L0S可於脂質體内 結合至此等外膜蛋白質，而使該募糖成為T依賴性抗原。 此可使用類似於下文所述泡内L〇S交聯中所闡述之化學方 法實施。 LOS之募糖部分與該泡之表面上存在之外膜蛋白質之泡内 交聯（結合） 當LOS(尤其本發明之l〇S)存在於該l〇S之泡調配物中 日寸’该LOS較佳藉由能夠使l〇s與亦存在於該泡製劑中之 一或多種外膜蛋白質（例如腦膜炎球菌p〇rA或p〇rB)結合之 方法原位結合。因此，本發明之另一態樣係一種革蘭氏陰 性細菌菌株之泡製劑（一或多種本發明之泡製劑），其外膜 正ά 種與L〇S結合之外膜蛋白質。儘管可向泡製劑中添 加L0S來進行結合，但較佳的是該l〇s天然存在於該泡製 劑之表面上。 此方去了有利地提高該泡調配物内L 0 S之穩定性及/或免 121392.doc -30- 200817034 疫原性（提供τ細胞幫助）及/或抗原性_因此對呈最保護性構 型之非T依賴性寡糖免疫原提供τ細胞幫助-因為L〇s在天 然％ i兄中位於該外膜之表面上。另外，該泡内L〇s之結合 可使该LOS去毒（不欲受理論約束，若結合，該脂質A部分 便可更穩定地包埋於該外膜中，因此更不易於導致毒 性）。因此，可能不需要上述自htrB-或msbB-突變體分離泡 之去毒方法，或向組合物中添加多黏菌素B之無毒肽功能 相等物之去毒方法（但其可組合添加以達成其他安全性）。 本發明之結合泡製劑通常使得泡中L〇S2毒性與具有相 同1的70全未結合LOS之相同泡相比降低。L〇s毒性可容 易地由热習此項技術者測定，例如使用歐洲藥典（Eu⑺pan

Pharmacopoeia)中之 LOS 兔熱原性（pyr〇genicity)分析（參見 W02004/014417 之實例 7)。 本發明之結合泡製劑之有利之處在於該結合之L〇s具有 適於在侣主中誘發免疫反應之構型，在SBA分析中，來自 宿主之血清與未結合之L〇s(較佳存在於製造該泡製劑之細 菌上）反應（能與之結合），最佳以殺菌方式反應。 在奈瑟菌泡與LOS結合並且如本文中所述該等泡係衍生 自一或多種免疫顯性外膜蛋白質下調之菌株之情況下，較 佳的是，若PorA下調，則PorB不應丁調，反之亦然。此能 夠使大多數LOS與主要的外膜蛋白質交聯，並且因此使該 結合對該泡中所含交叉保護性次要外膜抗原之任何影響最 小 〇 具體而言，本發明之發明者已發現一種包含泡之組合 121392.doc -31 - 200817034 物，其中泡中所含LOS已經以泡内方式與亦存在於泡中之 外膜蛋白質結合，可形成疫苗之主要成份來治療或預防衍 生該等泡之生物體所導致之疾病，其中此疫苗之毒性降低 (較佳實質上無毒）及/或能誘發抗天然環境中之LOS之T依 賴性殺菌反應。 因此，本發明另外提供此種泡内L0S結合的泡製劑。”泡 内’’意指天然存在於該泡中之LOS與存在於該同一泡上之外 膜蛋白質結合。 此等泡製劑可自相關細菌分離（參見W0 01/09350)，然 後經已知之結合化學反應，使LOS之募糖部分上之基團（例 如NH2或COOH)與泡外膜蛋白質上之基團（例如NH2或 COOH)連接。可使用利用戊二駿、甲酸、或戊二酸/甲酸 混合物之交聯技術，但較佳的是使用選擇性更強之化學 品，例如EDAC 或 EDAC/NHS (J.V. Staros，R.W. Wright 及 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986);及 Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp 173-176)。可用 於本發明中能夠在LOS與蛋白質分子間產生共價連接之其 他結合化學或處理闡述於歐洲專利第941738號中。 較佳地，該等泡製劑在莢膜多糖不存在下結合。該等泡 可自不生產莢膜多糖（天然或經由突變）之菌株分離，或可 自大部分（60%、70%、80%、90%或99%以上去除）且較佳 所有污染性莢膜多糖純化。這樣，該泡内LOS結合反應更 121392.doc -32- 200817034 為有效。 較佳地，存在於該等泡中之LOS有5%、1〇〇/〇、20%、 30%、40%、50%、60%、7〇%、8〇%、9〇%或 95%以上交聯/ 結合。 較佳地，本發明之泡已製備成該等泡之LOS含量係3%- 3〇%、5%_25%、10%-25%、15%-22%，並且L0S含量最佳 為約或恰好20%，如使用純化之乙〇8作為標準在SDS_pAGE 電泳後藉由銀染色所測量（參見Tsai，L Bi〇1. Standardizati〇n (1986) 14:25-33中之方法）。腦膜炎球菌泡中2〇% l〇s可利 用〇·1/。低DOC提取而達成，此可去除鬆散保持之乙〇§分 子’但可保留大部分抗原。

當該等泡内結合之泡係衍生自腦膜炎球菌時，較佳的是 衍生匕們之菌株係不能生產莢膜多糖之突變菌株（例如上 述突變菌株之一，尤其是siaD-)。亦較佳的是，有效對抗 細膜炎球菌疾病之免疫原性組合物包含L2及乙3泡二者，豆 中该L2及L3 LOS皆結合至泡外膜蛋白質。此外，較佳的 疋’違泡内結合之泡中L〇S結構與衍生自lgtB·腦膜炎球菌 菌株之LOS結構一致。最佳地，免疫原性組合物包含泡内 結合之泡：衍生自一種不能生產莢膜多糖並且係1§汨_之L2 或L3突變腦膜炎球菌菌株；包含衍生自不能生產莢膜多糖 之大、細膜炎球囷菌株之L 2及L 3泡；包含衍生自突變腦膜 炎球菌菌株lgtB·之L2及L3泡；或最佳地包含衍生自不能生 產荚膜多糖且係lgtB·之突變腦膜炎球菌菌株之L2及L3泡。 可用於本發明之典型L3腦膜炎球菌菌株係H44/76 menB 121392.doc 200817034 菌株。典型L2菌株係B16B6 menB菌株或39E腦膜炎球菌c 型菌株或菌株760676。典型L10菌株係3125 menA菌株。 L4菌株係C19 MenC菌株。 如上所述，本發明之泡已經藉由結合作用而去毒至一定 程度’並且不需要再進行去毒，然而可使用另外的去毒方 法來達成另外的安全性，舉例而言，使用衍生自htrB-或 msbB之腦膜炎球菌菌株之泡，或在該泡組合物（如上所 述）中添加多黏菌素B[對脂質A具有高親和性之分子]之無 毒肽功能相等物（較佳SEAP 2或SAEP II)。因此，LOS之結 合（尤其以泡内方式）與包含相同量未結合L〇S之製劑相比 令人吃驚地展示出較低之LOS毒性。因此，由LOS與泡外 膜蛋白質之泡内結合另外提供一種使泡（尤其是腦膜炎球 菌的泡）去毒之一般方法，亦由使L〇s與泡外膜蛋白質結合 而提供一種使LOS去毒之方法。 以上述方法提供腦膜炎球菌泡及包含泡之免疫原性組合 物，彼等具有重要之抗原LOS，該LOS之毒性降低（較佳實 質上無毒），不存在自體免疫問題，具有T依賴特性，存在 於其天然環境中，並且能誘發潛在抗9〇%以上之腦膜炎球 菌（在L2+L3組合物之情況下）之殺菌抗體反應。 亦可使Men A、Men C、Men Y或Men W莢膜多糖或募糖 中之一或多種（較佳至少Men C、或Men A與Men C，或 Men C與Men Y)結合於本發明泡之外膜蛋白質上。儘管此 可於與LOS交聯相同之反應中實施，但較佳在分開的（較佳 以後）反應中實施。 121392.doc -34- 200817034 最k泡内LOS結合之方法係本發明之另一 應併入以下步驟··自 ^ 心、樣。该方法 文所述之低％ D〇fM 一 乂佳使用如本 貫施適於使存在於兮望 L0S(較佳經由其窠揸都八、 什牡^亥專泡中之 蛋白質之化學反靡，八# 上之外Μ …刀離該泡内結合之泡製劑，並且視_ 況使該泡内結合之治制十丨t 11視ί月 X η τ… “1與另-藉由相同方法製備但具有 ”'之泡内結合泡製劑調配在-起(較佳混合 Π

◊不“、目/¾膜炎球g泡）’及/或使該泡製劑與醫藥上 可接受之賦形劑調配在-起以製備疫苗組合物。 、 泡内結合較佳應併入卜2或所有3個以下方法步驟：結 合pH應大於pH 7.0，較佳大於或等於pH 75(最佳在阳9以 下）；在反應期間應保持丨_5%、較佳2_4%、最佳約㈣嚴糖 之條件；在該結合反應中應使NaC丨最少，較佳在〇ι Μ、 〇’〇5 Μ、0·01 Μ、0.005 Μ、0·001 Μ以下，最佳完全不存 在所有σ亥專方法特徵可確保該等泡在整個結合過程期間 保持穩定並且呈溶液狀態。 該EDAC/NHS結合方法係用於泡内結合之較佳方法。 EDAC/NHS優於甲醛，其可能交聯程度過高而對可濾過性 產生不良影響。EDAC與羧酸（例如L0S中之KD0)反應，產 生活性酯中間物。在胺親核劑（例如在外膜蛋白質如p〇rB 中之離胺酸）存在下，形成一個醯胺鍵並釋放異脲副產 物。然而，經由形成Sulfo-NHS酷中間物可增加EDAC-介 導之反應之效率。該Sulfo-NHS酯在水溶液中之存在時間 較單獨EDAC與羧酸反應所形成之活性酯長。因此，使用 121392.doc •35- 200817034 此兩階段方法可達成更高之醯胺鍵形成產率。edac/nhs 結合闡述於 J.v. Staros，R.W. Wright 及 D. Μ· Swingle· Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986);及Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176 中。較佳地，在該反 應中使用0.01-5毫克EDAC/毫克泡，更佳0.05-1毫克EDAC/ 毫克泡。所用EDAC之量取決於試樣中所含LOS之量，後 者又取決於用於提取泡之脫氧膽酸鹽（DOC)%之量。在低 % DOC(例如0.1%)，使用高量EDAC(1毫克/毫克及以上）， 然而在較高％ DOC(例如0.5%)，使用較低量之EDAC(0.025-〇·1毫克/毫克），以避免過多的泡内交聯。 因此，本發明之較佳方法係一種用於產生泡内結合之 LOS(較佳腦膜炎球菌LOS)之方法，其包括以下步驟：在 EDAC/NHS存在下，在pH 7.0與pH 9.0間之ρΗ(較佳約pH 7.5)，在1-5%(較佳約3%)蔗糖中，並且視情況在實質上無 NaCl之條件下（如上所述）使泡結合，及自反應混合物分離 結合之泡。 可於反應混合物之Western分離凝膠上使用抗LOS(例如 抗L2或抗L3)mAbs追蹤該反應，以顯示隨著反應時間進 行，因為較大比例之LOS在泡中，LOS分子量增大。 使用此等技術可回收產率為99%之泡。 已發現EDAC係極佳之泡内交聯劑，因為其可使LOS與 OMP充分交聯以提高LOS T-依賴性免疫原性，但不使其交 121392.doc -36 - 200817034 聯至高到發生諸如可滤過性差、聚集及泡間交聯等問題之 程度。所產生泡之形態類似於未結合泡之形態（由電子顯 微鏡觀察）。另外，上述方案可避免發生過高之交聯（這可 降低諸如TbpA或Hsf等天然存在於泡表面之保護性〇Mps之 免疫原性）。 分離泡之技術 本發明之外膜囊（OMVs或泡）可藉由許多已知技術分離 (Fredriksen等人，NIPH Annals (1991)，14, 67-79; Zollinger 等人，J· Clin lnvest (1979)，63，836 848; “仙心以等人， Infect lmmun (1999)，67，113_119; LJ Drabiek 等人，

Vaccine (1999)，18，160-172)。該等分成兩大類_使用脫氧 膽酸鹽（約0.5%)自腦膜炎球菌提取泡之技術，及使用低量 脫氧膽酸鹽（DOC)或完全無脫氧膽酸鹽之技術。無D〇c 方法之泡具有保持高量L〇S於〇MV中之有益特徵_這在 LOS係保護性抗原之疫苗中有利。與D〇c提取之泡相比， 藉由無D〇C方法所獲得之L3 Ags在OMV中之濃度高約10 倍。因此，對於本發明方法之目的而言，無清潔劑（較佳 無DOC)之泡製備方法較佳，但使用含有低量清潔劑（較佳 DOC)之緩衝液提取亦有利，在於該步驟將使下大多數緊 密相互作用之LOS留在泡中，而去除任何較毒而鬆散保持 之LOS。通常使用0-0 5%，較佳使用〇 〇2-〇 4%、〇 〇4-3% 或0.06-2%清潔劑（較佳D〇C)來實施泡提取，更佳使用 0·08-0·15%，最佳使用約或恰好〇1%來獲得最優量之l〇s 穩定存在於該等泡中。無D〇c(或低DOC-0.3% DOC或以 121392.doc -37- 200817034 下）提取方法尤其佳，其中LOS已藉由一或多種上文詳述 之方法去毒。 較佳地，在所有本發明實施例中，泡之L0S含量係3%-3 0%、5%-25%、10%-25%、15%-22%，最佳 L0S含量為約 或恰好為20%，如使用純化之LOS作為標準在SDS-PAGE電 泳後藉由銀染色所測量（參見Tsai，J· Biol· Standardization (1986) 14:25-33之方法）。在此方法中使用Nmen L3 LOS作 為標準，用0.1% DOC提取之Nmen L3免疫型泡中之LOS含 量通常係約20% LOS，使用0.2% DOC時LOS係約15%，使 用0.3% DOC時LOS係約10%，使用0.5% DOC時LOS係約 5% 〇 泡生產可使用任何適於自細胞或細胞碎片分離泡之技術 實施（例如經由低速離心）。泡製劑可進一步純化，經由使 用超離心（該等泡成粒狀沉澱），或利用較柔和之超濾及/或 透析過濾、技術，如 Frasch 等人’Outer membrane protein vesicle vaccines for meningococcal disease” 於Methods in Molecular Medicine，第 66 卷，Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols 2001 第 81-107 頁（由 A. J. Pollard及 M.C. Maiden，Humana Press Totowa，NJ編輯）中所述。 疫苗組合物 本發明之免疫原性組合物可藉由添加醫藥上可接受之賦 形劑輕易地調配為疫苗組合物。 本發明進一步提供一種製備本發明之奈瑟菌（較佳腦膜 炎球菌）免疫原性組合物或疫苗之方法，其包括以下步 121392.doc -38- 200817034 驟：如上所述分離本發明之純化L0S(較佳L24L3)，或如 上所述生產本發明之分離泡（較佳具有L2或L3免疫型），及 使該LOS或該等泡與醫藥上可接受之賦形劑調配在一起。 較佳地，使本發明之純化免疫型L2及L3 LOS、或本發明 之免疫型L2及L3泡、或純化之L2 L〇s&L3泡（或反之亦然） 於混合步驟中組合。較佳地，本發明之純化L〇s或泡於分 離後如上所述結合。對於純化之L〇s，可增加另一脂質體 調配步驟（使用業内已知技術-參見，舉例而言， 96/40063及其中引用之參考文獻）。較佳地，泡製劑藉由用 低（或無）濃度之DOC提取來分離（如上所述）。 此等L2及L3組合方法可產生一種能有效對抗幾乎所有腦 膜炎球菌B菌株之疫苗。 上述免疫原性組合物（或方法）可能已在該組合物甲添加 1或多種（2、3或4種）血清組A、c、Y或W之腦膜炎球菌多 糖或寡糖（純淨的或者與包含τ細胞表位之載體結合，如上 所述）。較佳至少添加C(最佳結合），更佳添加八及^或丫及 C(較佳均結合），最佳a、C、Y&w(較佳均結合）。有利的 是，在上述組合物中亦包含結合之流感嗜血桿菌B莢膜多 糖或养糖，以產生通用腦膜炎疫苗。 較佳地，本發明不主張w〇 94/〇8〇21中特別個別提出之 組合物所構成或包含之組合物。視情況，本發明不主張美 國專利第2006/0047106中特別個別提出之組合物所構成或 包含之組合物。 本發明之疫苗調配物 121392.doc -39- 200817034 本發明之免疫原性組合物可用適宜佐劑調配以產生本發 明之疫苗組合物。 適宜佐劑包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁凝膠（明像）或磷酸鋁 等（較佳氫氧化鋁），但亦可係鈣鹽（尤其是碳酸鈣）、鐵鹽 或鋅鹽’或可係醢化酿胺酸、或酸化糖、陽離子或陰離子 竹生之多糖或聚鱗腈（polyphosphazenes)之不溶懸浮液。 可添加之適宜Thl佐劑系統包括單磷醯脂質A，尤其3_ 去-〇·醯基化單填酿脂質A(或LPS之其他無毒衍生物），以 及單磷醯脂質A、較佳3-去-〇-醯基化單磷醯脂質a(3d_ MPL)(或無毒LPS衍生物）與鋁鹽（較佳鱗酸鋁）之組合。增 強之糸統包括單填醯脂質A與皂苦衍生物之組合，尤其 QS21 [或其他皂苷]與3D_MPL[或無毒^8衍生物]之組合， 如W0 94/00153中所揭示，或QS21[或皂苷]用膽固醇淬火 之反應性不太強之組合物，如W096/33739中所揭示。包 含QS21、3D-MPL及生育酚於水包油乳液中之特別有效之 佐劑調配物闡述於WO95/17210中並且係可添加之較佳調 配物。可添加之其他佐劑包含皂苷，更佳QS21及/或水包 油乳液及生育酚。亦可添加含有未甲基化CpG之募核脊酸 (W0 96/02555)。 疫苗製劑通常闡述於 Vaccine Design (，，The subunit and adjuvant approach" (P〇well M.F.及 Newman M.J.編輯） (1995) Plenum Press New York)中。 免疫保護性劑量之疫苗可經由全身或黏膜途徑施與。該 等施與可包括經由肌内、腹膜内、皮内或皮下途徑，或經 121392.doc -40- 200817034 由黏膜施與至口腔/消化道（較佳鼻内施與）、呼吸道、生殖 泌尿道。通常，各疫苗劑量中之泡數量選擇成可在典型疫 苗接種者中誘發免疫保護性反應而無顯著之不良副作用之 量。該量將端視使用之特定免疫原以及給予方式而變化。 通常預期每一劑量將包含1 -1 〇〇微克本發明之各泡或LOS， 較佳5-50微克，並且最常5-25微克。 本發明之泡免疫原性組合物之進一步改進 如果衍生上述本發明之泡組合物之奈瑟菌菌株（包括淋 球菌，及較佳腦膜炎球菌，最佳腦膜炎奈瑟菌B)具有一或 多個以下基因（編碼保護性抗原）上調，則該等泡組合物可 進一步在本發明疫苗之功效上得到改進，該上調係藉由在 基因組中插入另外的基因拷貝，或藉由現有基因之上游引 入一個較強之啟動子，或藉由WO 01/09350中闡述之任何 能誘發經修飾菌株產生未經修飾菌株之1·2、1.5、2、3、5 或10倍以上之抗原量之其他方法：NspA (WO 96/ 29412)、Hsf或其截短基因（WO 99/31 132 & WO 01/55182; 亦稱為 NhhA)、Hap (PCT/EP99/02766)、OMP85 (WO 00/ 23595)、PilQ (PCT/EP99/03603)、PldA (PCT/EP99/06718)、 FrpB (WO 96/31618)、TbpA (WO92/03467、美國專利第 5912336號、界〇93/06861及歐洲專利第586266號）、1^?丑 (WO 93/06861及歐洲專利第 586266號）、NadA (Comanducci 等人 J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454; NMB 1994)、 FrpA/FrpC或該等抗原間包含5個或多個重複序列的共同部 分（WO 92/01460; Thompson 等人，(1993) J. Bacteriol. 121392.doc •41 - 200817034 175: 811-818; Thompson 等人，（1993) Infect. Immun· 61:2906-291 1)、LbpA、LbpB (PCT/EP98/051 17)、FhaB (WO98/02547 SEQ ID NO 38 [核苷酸 3083-9025])、HasR (PCT/EP99/05989)、lipo02 (PCT/EP99/083 15)、Tbp2 (WO 99/57280; NMB 0460)、MltA (WO 99/57280; NMB 0033)、 TspA (WO 00/03003)、TspB (WO 00/03003)、ctrA (PCT/ EP00/00135)、MafA (NMB 0652)、MafB (NMB0643)、 Omp26 (NMB 0181)、黏附素 X (NMB 0315)、黏附素 Y (NMB 0995)、黏附素 Z (NMB 1119)及 OstA (NMB 0280)。 NMB序列之實例可見於www.neisseria.org之數據庫。在本 文中提及Hsf時，在所有情況下該術語皆可取代Hsf截短基 因-尤其WO 01/55182中揭示者。 特別佳的是Hsf與TbpA(低或高、或低及高分子量形式二 者[EP 586266])、或 Hsf與 OMP85、或 OMP85與 TbpA (低 或高、或低及高分子量形式二者）、或NspA與Hsf、或 NspA與OMP85、或NspA與TbpA(低或高、或低及高分子量 形式二者）均上調。當在該組合物中包含2種泡時，較佳的 是每一泡具有不同之上調。若高及低TbpA均上調，則較 佳的是它們在衍生自天然包含該等兩種TbpA形式之兩種 菌株之組合物中所存在的兩種不同泡中上調。最佳該兩種 菌株具有L2及L3 LOS免疫型。TbpA可藉由遺傳方式或藉 由奈瑟菌/腦膜炎球菌生產菌株在鐵受限條件下例如在50-70 μΜ Desferal (甲磺酸去鐵胺（deferoxamine)，自 Sigma獲 得）存在下生長而上調。若採用後一種方法，則較佳下調 121392.doc -42- 200817034 (較佳缺失）FrpB基因表現，因為此可變抗原在分離自鐵受 限條件下所分離之腦膜炎球菌菌株之泡中可變為免疫顯 性0

在一個較佳實施例中，本發明之組合物包含一種來自較 佳在高TbpA及Hsf上調之lgtB_(或1st·)莢膜多糖-msbB_菌株 之L3泡以及一種來自在低TbpA及Omp85上調之lgtB-(或1st-)莢膜多糖-msbB·之L2泡。更佳地，兩種泡皆另外在p〇rA 及/或FrpB表現以及視情況〇pC及/或0pA表現下調。該等 泡最佳經由如上所述之低D〇C方法分離，並且兩種泡中之 LOS係泡内交聯至外膜蛋白質。 幽靈（Ghost)或死全細胞疫苗 本發明之發明者設想，上述含泡之組合物及疫苗可容易 地擴展至涉及幽靈或死全細胞製劑及疫苗之方法（具有相 同之優點）。自革蘭氏陰性菌株製備幽靈製劑（具有完整外 Λ又之二細胞）之方法為業内眾所周知（參見例如w〇 92/01791)。权死全細胞來製備不活化細胞製劑用於疫苗中 之方法亦為眾所周知。因此，此文件中所闡述之包含泡之 組合物及疫苗預計可適用於本發明之包含相等幽靈及死全 細胞製劑之相同組合物或疫苗。 對本發明組合物之血清殺菌分析 血清殺菌分析係詩評價纟發明之免疫原性組合物中組 合之抗原間協同（synergistic)關係之較佳方法。 組合所誘發之SBA較各抗 兩倍、三倍、較佳四倍、 此一協同反應之特徵可為抗原 原分別誘發之SBA高至少5〇〇/。、 121392.doc -43- 200817034 五倍、六倍、七倍、八倍、九倍，並且最佳十倍。較佳對 於衍生該等抗原之同源菌株並且較佳亦對於一組異源菌株 測量SBA。（關於代表性組參見下列，例如屬於A_4簇之 BZ10 (B:2b:P1.2);屬於ET-37複合體之扪诏6 (B.2a.pi2). 及則鄉（B:15:P1.7,16))qSBA係估算腦膜炎球菌疫苗功 效最普遍認可之免疫標記（Perkins等人·：时⑽版Η%， 177:683-691)。可藉由任何已知方法確定令人滿意之 r\ SBA。SBA可使用自動物模型或自人類個體獲得之企清實 施0 叫血清實施SBA之較佳方法如下。於第一次接種疫 ^ H接種疫苗後兩個月、以及第三次接種疫苗後 -個月採集血樣(一年中三次疫苗接種係典型人類初次疫 苗接種時間表，舉例而言，在第〇、2及4個月或0、^6個 月她與)。此人類初次疫苗接種時間表可對i歲以下嬰兒實 職而言，與Hib接種同時實施)，物使用此一初次 =接種時間表接種2至4歲兒童或青少年來測試SBA。若 =另可於初次疫苗接種後6至12月以及加強劑量後1個月 抹集另一血樣。 =初次疫苗接種時間表之)第三次疫苗劑量後 =本=或青少年二但較佳為出生第1年之嬰幻，對 效價(盘接種月抗原二之^ W炎球菌菌株之SBA(抗體稀釋度) 30%以上? 效價相比）增加4倍之個體之百分比係 ，較佳40%以上，更佳5〇% 個體’則-種具有同_活性之抗“以上之 丨 < 机原或泡製劑之SB A令 121392.doc -44- 200817034 人滿意。 當然，一種具有異源殺菌活性之抗原或泡製劑，若亦能 誘發令人滿意的對抗衍生其之腦膜炎球菌菌株之sbA，則 亦可構成具有同源殺菌活性之泡製劑。 若在（初次疫苗接種時間表之）第三次疫苗劑量後丨個月 (在2-4歲孩童或青少年，但較佳為出生第1年之嬰兒），對 抗腦膜炎球菌之三種異源菌株之SBA(抗體稀釋度）效價（與 接種疫苗前效價相比）增加4倍之個體之百分比係2〇%以 上，較佳30%以上，更佳35%以上，最佳4〇%以上之個 體，則種具有異源殺_活性之抗原或泡製劑之§ b A令人 滿意。此一測試可清楚顯示具有異源殺菌活性之抗原或泡 製劑是否可誘發對抗各種腦膜炎球菌菌株之交叉殺菌抗 體。ό亥二種異源囷株較佳彼此間並且較佳對於製造或衍生 具有異源殺菌活性之抗原或泡製劑之菌株之間應具有不同 的電冰型（ΕΤ)-複合體或多基因座序列分型（mlst)圖汽 (Maiden 等人 PNAS USA 1 998, 95:3 140-5)。熟習此項技術 者將能夠容易地測定具有不同的ET-複合體之三種菌株， 其反映在細膜炎球囷間、尤其在腦膜炎球菌B型菌株間觀 察到的基因多樣性，腦膜炎球菌B型菌株被視為導致顯著 疾病負擔之原因及/或代表確認的MenB高毒性譜系 (lineages)(參見Maiden等人，見上文）。舉例而言，可使用 之三種菌株係下列：屬於A_4簇之BZ10 (Β··21τ·Ρ1·2);屬於 ΕΤ·37複合體之B16B6 (B:2a:P1.2);及屬於ΕΤ·5複合體之 Η44/76 (Β:15:Ρ1·7，16)，或屬於同一 ΕΤ/簇之任何其他菌 121392.doc -45- 200817034 株。此等菌株可用於測試一種由例如屬於ET-5複合物之腦 膜炎球®菌株CU385 (Β:4:Ρ1·15)所製得或衍生之具有異源 性权菌活性之抗原或泡製劑。另一種可使用之試樣菌株係 來自譜系3流行性選殖株（例如ΝΖ124 [Β:4:Ρ1·7,4])。另一 ΕΤ-37 菌株係 NGP165 (B:2a:P1.2)。 測量SBA活性之方法業内已知。舉例而言，一種可使用 之方法闡述於W0 99/09176之實例1〇c中。概言之，一種 々人測试菌株之培養物生長（較佳在鐵缺乏條件下-藉由在該 生長培養基中添加鐵螯合劑，例如EDDA)於對數生長期 中。此可懸浮於具有BSA之培養基（例如具有0.3% BSA之 Hanks培養基）中，以獲得調節至約2〇〇〇〇 CFU/毫升之工作 細胞懸浮液。可藉由混合待測試血清的一系列兩倍稀釋液 (較佳在56°C下加熱不活化3〇分鐘）[例如50微升/孔體積]與 20000 CFU/毫升待測試腦膜炎球菌菌株懸浮液[例如25微 升/孔體積]製備一系列反應混合物。應培育（例如37它下i 5 分鐘）並振盪（例如以21〇 rpm)反應小瓶。最終反應混合物 [例如100微升體積]另外含有補體來源[例如25〇/❹終體積的 預測試之幼兔血清，或用於人類血清學之人類血清]，並 且如上所述培育[例如37°C下60分鐘]。此分析可使用滅菌 聚苯乙稀U形底96孔微量滴定板。可使用多道吸量管自各 孔取一等分[例如1〇微升]，並且滴至Muelier-Hinton璦脂板 (較佳含有1% IS0vitalex&1%熱不活化馬血清）上並培育（例 如在5¼ C〇2中在37它下18小時）。較佳地，各菌落可計數 達80 CFU/等分試樣。可使用以下三種測試試樣作為對 121392.doc -46- 200817034 ^ ··緩衝液+細菌+補體；緩衝液+細菌+不活化的補體·，血 二+、’、田囷+不活化的補體。SBA效價可直接使用—個處理該 等數據之程序計算，藉由回歸計算獲得對應於5〇%細胞殺 死之稀釋度測量值。 本專彳i.兒明書巾引用之所有參考文獻或專利丨請案皆併 入本文供參考。 實例 '除非另有詳細說明’否則以下實例係使用熟習此項技術 者習知並常用的標準技術實施。該等實例係舉例說明，而 非限制本發明。 實例1 : WO 01/09350中闡述之實例描述編碼腦膜炎球菌⑼如 MenB)之莢膜多糖生產中所涉及蛋白質之基因之缺失， PorA基因之缺失，腦膜炎球菌泡表面上各種保護性外膜蛋 白質之上調，免疫顯性蛋白質或生物合成酵素之下調（例 如siaD㈠突變），及用於分離泡之方法。進一步之資訊示 於 WO 2004/014417 及 WO 2004/014418 中。注意，本文中 之NMB及NMA基因序列參考資料為可自㈣ 獲得之序列之參考號碼。圖1所示係一個顯示L〇s免疫型 之習知結構之示意圖（來自Kahler等人2005 GlycoMc^gy 15:409-419/2006 JBC 281:19939-19948)。亦參見圖 2B。 實例2 ·内核LOS 〇_乙醯基化-對殺菌效價之潛在影窨 121392.doc -47- 200817034 概述 • MS-MS分析已顯示菌株NZ124 (L3)之内核LOS之N-乙醯 基-葡萄糖胺（GlcNAc)O-乙醯基化。菌株H44/76及M687 以及衍生自菌株H44/76之L3 lgtB(-)及L3 lst(-)疫苗菌株 (分別為B 1 854=TrL3及B 1948 = L7)未0-乙醯基化。 •菌株NZ124對於抗體介導的補體殺死之抗性不強於菌株 H44/76及 M687。 •對於菌株NZ124及H44/76，低暴露之表面表位對於殺菌 抗體之可接近性似乎類似。 •在使用四種動物之五個動物模型中，不論使用何種調配 物，抗TrL3及抗-L7泡血清對於介導殺死菌株NZ124比 殺死菌株H44/76及M687之功效要小。 •該等結果表明，内核L0S之GlcNAc之乙醯基化可降低抗 ’’未乙醯基化LOS”抗體所介導之殺死之功效。 導論 根據MS/MS分析，闡述腦膜炎奈瑟菌之L3 LOS之兩種 不同結構。該兩種結構差別之處係在内核之G1 c N A c上是 否存在一個乙醯基（圖2A)。在文獻中闡述L3結構不具有此 另外的乙醯基。

TrL3及L7泡之内核LOS之GlcNAc未乙醯基化。野生型菌 株H44/76及M97250687 (M687)亦如此。反之，WT菌株 NZ1 24具有乙醯基化GlcNAc。該等三種WT血清組B腦膜炎 奈瑟菌菌株之免疫型為L3。NZ124係於1998年分離之紐西 121392.doc -48· 200817034 蘭流行性菌株，並且可自New Zealand Institute of Environmental Science and Research, Wellington, New Zealand獲得。 以TrL3或L7泡免疫小鼠之血清含有高量之抗菌株H44/76 及M68 7之殺菌性抗體。然而，該等血清對抗菌株NZ124不 ‘太有效。事實上，以抗L7/TrL3泡血清對菌株NZ124所測得 _ 之殺菌效價低於對菌株H44/76及M687所測得之效價的3-20 倍。 " 至少有三種假設可解釋對抗菌株NZ124所測得之較低殺 菌抗體效價： •該菌株可能本質上比菌株H44/76及M687對於抗體及補 體所介導之殺死較有抗性； •在此菌株上，LOS表位可能較不易接近殺菌抗體； •該内核LOS之乙醯基化可能對於抗”未乙醯基化”LOS抗 體所介導之殺死之功效產生負面影響。 \ 結果 是否菌株NZ124對於抗體介導之殺死之抗性更強？ 為回答此問題，我們已於SBA中分析用不同PorA+泡疫 苗免疫之小鼠之血清。該等抗血清已在SB A中對於同源及 ’異源Por A菌株測試。表1中所示結果係來自兩個實驗。 用P1.7,16泡免疫小鼠誘發殺菌抗體之產生，該等抗體能 介導殺死同源PorA Ρ1·7，16菌株（對H44/76效價為1/2300)， 但不能殺死異源PorA菌株（Μ687及ΝΖ124)。對Ρ1·19，15疫 121392.doc -49- 200817034 苗實施類似的觀察，P1.19，15疫苗僅能誘發對抗同源PorA 菌株之保護性殺菌反應（對M687效價為1/900)。用含有 P1.7,4 PorA之疫苗免疫之小鼠具有高量對抗菌株NZ124(效 價為1/6200)但不對抗菌株H44/76之殺菌抗體。 表1:用不同PorA +泡免疫對於誘發對抗一組表現不同 PorA之MenB菌株之殺菌抗體的影響（50%殺死的GMT) 在SBA中測試之菌株 疫苗菌株 Η44/76 (Pl.7,16) CU385 (PU9，15) CU385-NZ228/98 (Ρ1·19，15+Ρ1·7,4) H44/76 (P1.7, 16) 2300 <100 <100 M687 (P1.19,15) <100 900 3800 ΝΖ124(Ρ1·7,4) NT <100 6200 在該等實驗中，測量對抗菌株NZ124之最高殺菌抗體效 價，表明此菌株對於抗體及補體所介導的殺死之抗性並不 比菌株H44/76及M687大。 菌株NZ124之LOS表位是否極易接近抗體？ 先前已表明，莢膜之大小可能會限制抗體對NspA表面 表位（epitopes)之接近性，尤其是因為與例如PorA之VR1及 VR2環相比，NspA環相對較小。事實上，莢膜大小與抗 NspA血清誘發補體介導之殺死能力之間之關係已確立 (Moe 等人，1999 I&I 67:5664-75)。 由於腦膜炎奈瑟菌之LOS具有一個短糖鏈，莢膜之厚度 可使抗體對其保護性表位之接近性降低。為確定此一機制 是否能解釋所測得之抗LOS抗體對菌株NZ124之較低殺菌 效價，使用抗NspA MAB(MAb Me-7)對包括NZ124在内之 121392.doc -50- 200817034 三種不同MenB菌株實施殺菌分析。 在補體存在下，菌株H44/76及NZ124容易被MAbMe-7殺 死，由殺菌效價高於1/2560可證明。相反地，菌株M687對 於抗NspA MAb介導的殺死較具抗性，測到僅為1/347之效 價。 總之，菌株H44/76及NZ124之保護性NspA表位之可接近 性類似。因此，我們可斷言，抗TrL3泡抗體在介導殺死菌 株NZ124之較低功效不是由於保護性LOS表位之較低可接 近性導致。 内核心LOS之GlcN Ac之乙醯基化是否能降低抗，，未乙醯基 化"LOS殺菌抗體之功效？ 用porA KO泡免疫小鼠、兔、豚鼠、幼大鼠及成年大 鼠。大多數實驗使用獲自產生五醯基化脂質A LOS之菌株 之泡突變，B 1 853，B 1 854及B1948泡）實施，但少數 實驗亦使用含有六醯基化LOS之泡（Β 1820泡）實施。使用在呂 鹽（Al(OH)3或Α1Ρ〇4)或不使用鋁鹽（非吸附之調配物）及 CpG測試不同調配物。抗泡金清於SBA中使用抗菌株 H44/76、M687及NZ124之幼兔補體測試。 表2中顯示用TrL3 B 1 820泡免疫之動物之血清所測得之 殺菌效價。不論使用哪一種動物，使用菌株Nz 124所興得 之殺菌效價低於使用菌株H44/76及M687所獲得之殺菌六文 價0 121392.doc -51 - 200817034 表2:使用B1820泡免疫小鼠、豚鼠及兔對於誘發對抗三種 MenB菌株之殺菌性抗體之影響（50%殺死之GMT)

小鼠 豚鼠 兔 調配物 H44/76 M687 NZ124 H44/76 M687 NZ124 H44/76 M687 NZ124 Α1(ΟΗ)3 300 300 100 40 20 <10 300 300 20 A1P04 3000 5000 800 NT NT NT NT NT NT 用 TrL3 KO 泡（B 1853 或 B1854)或 L7 KO 泡 (B1948)免疫亦可誘發較抗菌株NZ124高的抗H44/76及 M687之血清殺菌效價。此可在所有五種不同測試動物模 型中觀察到：小鼠、幼大鼠及成年大鼠（表3a)、豚鼠及兔 (表3b)且不論使用哪種調配物。 總之，用含有’’未乙醯基化LOS”之泡免疫動物可誘發較 抗”未乙醯基化菌株’’（H44/76及M687)低的抗’’乙醯基化菌 株’’（NZ124)殺菌抗體反應。 表3a:用五乙醯基化TrL3(B1853或B1854)及L7(B1948)免疫 小鼠、幼大鼠及成年大鼠對於誘發對抗三種MenB菌株之殺 菌性抗體之影響（50%殺死之GMT) 調配物 泡 H44 小鼠 M687 NZ124 H44 幼大鼠 M687 NZ124 H44 大鼠 M687 NZ124 無添加劑 B1853/54 3000 1700 250 260 2000 <20 450 5800 <20 B1948 2600 2900 100 710 230 40 400 2500 <20 Α1(ΟΗ)3 B1853/54 2000 1200 280 30 60 10 B1948 1600 940 140 320 480 10 CpG B1853/54 640 770 20 B1948 3300 1200 60 121392.doc -52- 200817034 表3b :用五乙醯基化TrL3(B1853或B1854)及L7(B1948)免疫 豚鼠及兔對於誘發對抗三種MenB菌株之殺菌性抗體之影響 (50%殺死之GMT) 調配物 泡 豚鼠 H44/76 M687 NZ124 兔 H44/76 M687 NZ124 無添加劑 B1853/54 B1948 300 2200 <20 1000 500 30 Α1(ΟΗ)3 B1853/54 400 400 30 討論、結論及展望 用TrL3或L7泡免疫小鼠可誘發高量的介導殺死菌株 H44/76及M687之殺菌性抗體。該等抗體對菌株NZ124之殺 菌性不太強，以小鼠血清測得抗菌株NZ124之SBA效價較 抗菌株H44/76及M687低3至20倍。 臨床前數據表明，菌株NZ124對於抗體-補體介導的殺死 之抗性並不強於菌株H44/76及M687。另外，有證據表 明，NZ124之低表面暴露保護性表位比菌株H44/76之表面 上類似表位不易接近抗體。可實施電子顯微鏡及/或流式 細胞計數分析以確認此發現。 菌株NZ124之LOS與菌株H44/76及M687之LOS間的一個 差異係僅於NZ124 LOS上觀察到内核之GlcNAc乙醯基化。 此差異可解釋抗TrL3及抗L7泡血清在介導殺死菌株NZ124 較菌株H44/76及M687之效率低。事實上，已知保護性糖 表位之乙醯基化對於抗體識別此等表位可產生正或負影 121392.doc -53- 200817034 響。然而，

類動物及人類中觀察到。 醞基化對 能在其他

誘發之殺菌性抗體可能在介導殺死”乙醯基化”菌株諸如菌 株NZ124中不太有效。 為證實此假設，將開發一種使用第二0乙醯基化菌株 (菌株BZ10)之血清殺菌性分析。另外，亦設計開發使用基 因修飾菌株諸如乙醯基化H44/76菌株及去乙醯基化NZ124 菌株之SBA。基於彼等結果，可評價新的L3泡（具有乙醯 基化 GlcNAc)。 實例3 ·内核LOS 0_乙醯基化-用於l〇s内核〇-乙醯基化之 奈瑟菌基因 在α鏈糖組合物之頂部，，，修飾”庚糖11似乎對L〇s免疫原 性有影響。PEA數量及位置、3位中葡萄糖之存在、7位中 甘胺酸之存在、及GlcNac之0-乙醯基化似乎為交叉保護之 重要決定因素。 基因（MacKinnon等人 2002 Mol Microbiol. 43: 931-943)表現在庚糖π之3位添加PEA之酵素。該基因（NMB 20 10)並非可相轉變的。 lgtG基因表現在庚糖Π之3位添加葡萄糖之酵素。此基因 121392.doc -54- 200817034 係可相轉變的（參見W004/015099)。此基因單獨或與lpt6共 同在許多腦膜炎奈瑟菌菌株中缺失。 //7%基因（Wright等人 2004 J Bact. 186: 6970-6982)表現 在庚糖II之6位添加PEA之酵素。該基因（NMA0408)單獨或 與lgtG共同在許多腦膜炎奈瑟菌菌株中缺失。該基因並非 可相轉變的。lpt6及lgtG位於命名為lgt3之染色體上之相同 區域中。 在庚糖II之7位添加PEA之酵素未知。 在庚糖II之7位添加甘胺酸之酵素未知。 在本研究以前在GlcNAc上添加0-乙醯基之酵素未知。 〇-乙醯基化基因之識別 •於使用OafA蛋白質（來自沙門氏菌，與嗜 血桿菌)0-乙醯基酶 Hi0391+Hi0392 同 源）對轉譯之奈瑟菌基因組（淋病奈瑟菌（见 、腦膜炎奈瑟菌 MenB MC58、MenC FAM18及 MenA Z2491)實施BLAST研究後，在奈瑟菌中發現兩個基因 家族，名為oacl(由MC58基因NMB0285代表）及 〇ac2(由MC5 8基因NMB1836代表），oacl家族較oac2接 近 OafA 0 •兩類基因皆係相可變的：於ORF中存在polyG序列段 (stretch) 〇 •在MC58(未0-乙醯基化LOS)中，該oacl基因（NMB 02 8 5)在相外（〇加（^口11&36)，而該〇&〇2"]\01836)在相 内（in phase) 〇 121392.doc -55- 200817034 •對應於oacl及oac2之PCR產物自各測試菌株獲得。 •測定polyG序列段之序列以研究經由polyG序列段之功 能。 SB A腦膜炎奈瑟菌菌株中NMB 028 5及NMB 183 6基因之存 在及功能：分析數據藉由ARD及MS-MS(質譜分析）獲 得。該等基因之存在/功能藉由分子生物學測定。括號 中數字係該基因ORF中polyG序列段中G之數量。 菌株 血清型 免疫型 O-Ac (ARD) oacl (NMB0285) oac2 (NMB1836) 存在 (PCR) 功能 存在 (PCR) 功能 H44/76 B L3 - + -(6) + + (10) 760676 B L2 + + + (5) + -(14) NZ124 B L3 + + + (5) + -(11) BZ10 B L3 + + + (5) + -(9) M687 B L3 - + -(6) + + (13) B16B6 B L2 + + + (5) + -Π5) 6275(B2003) B L3V + + + (5) + -(12) 2986 B L2 + + + (5) + + (10) C11 (B1983) C L3V + + + (5) + -(14) CC19 C + + + (5) + -(8) YS1975 Y + + + (5) + + (13) YM01-0240539 Y + + + (5) + -(12) W3193 W L3 - + -(5*) + - W S4383 W + + + (5) + -(12) A F8238 A L11 + + + (5) + + (7) A 3048 A + + + (5) + + (10) A3125 A L10 + + + (5) + + (13) *在G序列段之前引入STOP之1個取代 結論 • NMB0285基因之功能與藉由MS-MS測得0-乙醯基之 間完全相關（16/16)。 • NMB 1836基因之功能與藉由MS-MS獲得之數據間無 相關性（7/16)。 •我們有奈瑟菌中之〇-乙醯基化基因係NMB0285之強力 證明。 -56- 121392.doc 200817034 圖3B顯示菌株MC58之腦膜炎奈瑟菌LOS 0-乙醯基化基 因NMB 02 85(oacl)(與菌株Η44/76開放讀碼框基因序列 100%相同）。開放讀碼框為大寫字體，周圍序列（例如啟動 子序列）為小寫字體。注意，開放讀碼框中6個G之序列（下 劃線）使該開放讀碼框移碼（out of frame)。在圖3 A中顯示 菌株Z2491之相等基因NMA 2202(oacl)。注意，開放讀碼 框（大寫字體）中5個G之序列使該開放讀碼框符合讀框（in frame) 〇 1136-GGG GGG ΑΤΑ TTG AA-1150 MC58 1136-GGG GGA TAT TGA A-1149 Z2491 (NMA 2202) 菌株760676亦符合讀框（圖3C)[H44/76及760676 oacl之 開放讀碼框基因序列之間有97%之一致性]。 在菌株W3 193中，LOS未乙醯基化，即使其在上述區域 中具有5 G。已發現，此係由於在該ORF之核苷酸354處開 始之該基因中另一個poly G序列段（tract)導致。對於菌株 MC58、760676及NZ124，4 G存在於此位置之基因中（符合 讀框，活性基因），在W3193中發現3 G(移碼，解釋其去-0-乙醯基化狀態）。 NZ124中Ο-乙醯基化基因之不活化

在 NZ124 中敲除（knocked-out)相等 NMB0285 基因 (oacl)，其為0-乙醯基化（在活性構造中具有oacl)並且對 於H44/76(未乙醯基化）衍生之泡所誘發之血清抗性更強之 L3菌株。0-乙醯基酶基因之不活化首先藉由質譜分析確 認，該KO突變體將在SBA分析中使用以進一步研究LOS 121392.doc -57- 200817034 〇_乙醯基化在疫苗交叉保護中之參與程度。 •測定NMB0285 NZ124基因座之序列（圖4D)，與相等 MC58 NMB0285基因座具有98.6%之一致性（確認 NZ124中’’相内（IN PHASE)nG數量）。於終止後，有另 一個序列相似於IS 1106，亦存在於MC58及760676 中，不存在於NZ124中。 •構建一個NMB0285 KO 質粒（pMG-T-easy vector)，其 含有對應於該0-乙醯基化基因之5’及3’兩側區域之 NZ124重組5’及3’區域。引入KanR標記來替代 NMB0285基因。此質粒命名為pRIT 15574。 •構建NZ124 oacl K0菌株-其所衍生之L0S去-0-乙醯 基化-進一步顯示oac 1係Nmen L0S 0 -乙醯基酶。 在新穎L3衍生之菌株中Ο-乙醯基化基因開啟（ON) 衍生自菌株H44/76之泡係L3免疫型（未乙醯基化）。由於 該等泡誘發抗L3 0-乙醯基化菌株（例如NZ124、BZ10)之殺 菌抗體之能力已降低，故提議重新向衍生自H44/76之泡生 產菌株中引入功能性0-乙醯基化基因（oacl)。 方法： •用NZ124基因（Ο-ac開啟（ON)菌株）替代H44/76 NMB 0285基因（基因關閉）。 •納入NZ124啟動子及上游調節序列（插入NZ124 orf及 NZ124 448上游 bp)。 •使用抗紅黴素基因以有意義位向實施插入。 •測試泡L3 L0S 0-乙醯基化對於疫苗異源保護功效之 121392.doc •58- 200817034 重要性（以觀察以上述方法修飾之H44/76泡殺死NZ124 是否提高）。亦測試此L3泡與來自0-乙醯基化L2菌株 760676之泡之組合，以觀察否有異源殺菌抗體生成。 結果 •實施上述，質譜分析顯示經修飾之H44/76菌株獲得之 LOS在HepII處0-乙酉盛基化。 實例4:藉由奥克特洛尼（Ouchterlony)法（免疫分型）、 MS/MS分析及分子生物學分析記述菌株6275及C11之LOS 之特性 概述 •藉由使用專一性多株抗體之免疫擴散（奥克特洛尼法）確 定菌株6725及C11之免疫型。藉由MS/MS分析確定其内 核LOS組成。經由PCR及定序分析編碼與LOS内核修飾 有關之酵素之基因。 •基於MS/MS分析，菌株6275於Hep II上具有兩個PEA殘 基。將此菌株免疫分型為L3菌株，儘管常見L3菌株僅具 有一個PEA(在HepII之3位上）。 •藉由MS-MS觀察到菌株C11之内核LOS之兩種不同構 成。一類於Hep II上含有一個PEA殘基，而第二類含有 兩個PEA殘基。將該菌株免疫分型為L3菌株，但亦與抗 L2血清有極弱之反應。 導論 腦膜炎球菌L0S之内核L0S成份似乎比先前所述更為複 121392.doc -59- 200817034 雜。直至最近才提出，内核LOS不含PEA或僅在Hep II之3 或6(7)位含有一個pea殘基。但最近闡述一種新内核LOS 在3位及6(或7)位具有兩個pea殘基。由於此新L0S結構被 闡述為來自先前免疫分型為L3之菌株，故此新L〇s結構以 L3變體命名為L3v。 於L3v結構發現之前，基於L〇S之免疫分型之流行病學 數據已顯示’約70%之侵襲性血清組B菌株係L3 (PEA在3 位），而大多數其餘菌株係L2(peA在6位）。 基於使用一組L3及L2菌株及使用L3衍生之泡或L2衍生 之泡免疫動物之血清獲得之殺菌數據，可作出以下結論， 僅抗L3衍生之血清能夠介導補體殺死L3菌株，而僅抗L2 血清能殺死L2菌株。但有趣的是，由兩種新穎L3v菌株所 獲知之殺囟數據不與我們先前之結論一致。事實上，補體 求又死该兩種_株係由抗L2衍生之血清而非抗L3血清介導。 該兩種’’非典型’’菌株係血清組B菌株6275及血清組c參考菌 株 C 11。 為理解免疫型與殺菌結果之間之分歧結果，藉由ms/ms 測定菌株6275及C11之内核構成。另外，使用奥克特洛尼

法（使用專一性多株血清之免疫擴散）實施該等菌株之免疫 分型。亦使用分子生物學方法分析功能性lpt3、lpt6&lgtG 基因之存在。該等基因分別編碼負責在Hep 〇之3位添加 gEA、在6位添加PEA及在3包色加葡萄素〇 結果 1·藉由MS/MS分析測定内核構成 121392.doc -60 - 200817034 MS/MS分析（參見圖4)顯示： •在兩種菌株中，該α鏈LOS係具有一個末端唾液酸基團 之L2及L3菌株中闡述之典型LNnT四糖。 •菌株6275之内核L0S具有兩個最有可能位於3及6(7)位之 PEA殘基，但此有待藉由NMR分析確認。 • C 1 1菌株由兩種不同内核組成： ♦ 一類具有一個PEA(其在Hep II上之位置未界定，但在 Hep II上觀察到甘胺酸之弱信號，此排除pE a在7 位）。 ♦第二類具有兩個PEA(最有可能位於3位及6位上，乃因 亦在此Hep II上檢測到甘胺酸）。 •對於兩種菌株，均未在Hep II上檢測到葡萄糖。 2· LOS免疫分型 免疫分型係使用一組專一性抗血清實施。下文僅闡述使 用L3抗血清及L2抗血清獲得之結果，此乃因使用其他抗血 清（LI、L4、L5···)產生之結果為對於菌株6275&C11呈陰 性。在該等實驗中，比較目前在GSK Bi〇使用之菌株6275 及Cl 1(GSK6275-1&2及GSK Cl 1)與在阿姆斯特丹大學 (Amsterdam University)冷凍裝置中保存20年以上之類似菌 株（菌株 Zol 6275 及 RIV C 11)。 该兩種菌株6275(Zol 6275及GSK6275-1&2)在免疫分型 分析中具有類似之特性。它們與抗L3血清反應極強，但不 與抗L2血清反應。 GSK Cl 1菌株及RIV C1丨菌株亦顯示相同的結果。兩種 121392.doc -61 · 200817034 菌株對於抗L3血清呈陽性，對於抗L2血清呈弱陽性。 為確認使用C 11菌株及抗L2血清獲得的極弱沉澱，結合 先前在1980年確定為L3,2型之5名患者之分離菌株實施新 的免疫擴散實驗。Cl 1結果又顯示使用抗L2血清之極弱沉 澱，同時確認該等5種疾病菌株之分型。 菌株 血清組 1980年分型 2006年分型 2991 B L3,⑵ L3,2 3072 W L3,2 L352 3146 C L3,⑵ L3,⑵ 3151 W L3,2 L3,2 3356 B L3,2 L3,2 GSKC11 C L3,⑵ RIVC11 C L3,⑵ 3.分子特性記述 已識別在3位添加PEA之酵素，該酵素由基因lpt3編碼。 Hep II上3位之PEA係在70%之超毒性腦膜炎奈瑟菌菌株中 檢測到，Wright及同事藉由PCR在86%所分析菌株中檢測 到lpt3基因。此基因並不由相轉變調節，並且發現其在各 種血清組C及A菌株中部分缺失。在3位添加PEA已被假定 為與在相同位置添加葡萄糖競爭。所涉及酵素係由lgtG基 因編碼（參見W004/015 099)，由相轉變及ORF中之polyC序 列段調節。Μοχοη實驗室之假設為若lgtG ORF存在並且符 合讀框，則產生一種功能性酵素，於3位添加葡萄糖，在 該位置未添加PEA。 編碼在6位添加PEA之酵素之基因係lpt6，位於lgtG基因 之旁。此基因未含有容易由相轉變調節之區域，並且在 121392.doc -62- 200817034 48%之腦膜炎奈瑟菌中檢測到（Wright等人，2004)。編碼 在Hep II之7位添加甘胺酸之酵素之基因未知。

MenB菌株6275與menC菌株Cl 1與對應之L3及L2參考菌 株同時分析。實施PCR擴增及定序實驗： •在對lpt3基因之完全拷貝之存在進行評估（PCR)時，繼 續對lgtG基因之功能進行研究（由PCR以及ORF中poly-C序列段之序列證明存在） •藉由PCR評估lpt6基因之存在。若存在該基因之完全 拷貝，則我們將推斷該菌株含有在6位具有一個PEA 之 LOS。 lpt3、lpt6及IgtG基因之PCR及序列分析 lpt3 IgtG lpt6 存在 存在 功能 存在 H44/76 (L3) + + - - NZ124 (L3) + - - - B16B6 (L2) + + + + 760676 (L2) + + + + 6275 + + +氺 + C11 + + +氺 + . 基於該等數據，menB 6275及menC C11菌株似乎與L2免 疫型相關。然而，MS/MS分析顯示此兩種菌株皆具有兩個 PEA基團並且無葡萄糖。*表示該IgtG基因於相可變區中具 有14個而非1 1個（活性基因中之正常數量）連續C核苷酸。 儘管此意為該開放讀框碼符合讀框並且因此可產生一種功 能性蛋白質，但添加另一個脯胺酸殘基亦可能破壞該蛋白 質結構並且因此破壞其功能。 121392.doc -63 - 200817034 4.概述 下表概述使用不同方法對不同腦膜炎球菌菌株之特性記 述0 菌株 免疫分型 SBA 抗-TrL3 殺死 抗-TrL2 MS/] PEA MS Glc Ipt3 分子裝 lpt6 H生記述 功能忖 H44/76 L3 + _ 1 - + NZ124 L3 + - 1 - + 760676 L2 - + 1 + + + + B16B6 L2 - + 1 + + + + 6275 L3 - + 2 - + + +氺 C11 L3(2) - • + 1&2 - + + +* 討論 内核LOS成份之多樣性遠較先前闡述者複雜。最初，描 述在Hep II上不具有或具有一個PEA基團（在3位或6/7位）之 菌株，但最近闡述具有兩個PEA基團之菌株。此等菌株為 例如血清組B菌株6275及血清組C菌株cu。

令人吃驚地，使用菌株6275及cu獲得的 及血清殺菌結果並不一致。事實上，，兩種菌株被分= L3菌株，但其殺死係由抗咖生之泡血清而非由抗= 生之泡血清介導（參見下一實例）。 -個問題產生：糊株之相關性，以及是否兩個心 基_在可能為連續活體外培養傳代所產生之實驗室加 :(artefact)。我們有機會對菌株6”5及⑶之不同菌種 進行比較。對於各一 #址 . 母因株，本發明之發明者目前❹之g 種與一個儲存20年以上（在阿 V ^ 4特丹大學）之較老菌種加 121392.doc -64- 200817034 以比較。對於每一菌株，兩種菌種已於奥克特洛尼分析中 顯示相同特性，表明至少在該過去20年期間未發生遺傳漂 移（drift)。盡管如此，應測定最老菌種之内核LOS成份以 確定是否存在兩個PEA殘基。 根據文獻記載，約70%之侵襲性腦膜炎球菌菌株為L3。 使用L3v菌株獲得的奥克特洛尼結果表明，該方法不能區 分L3及L3v菌株。因此，兩種研究皆可能過高估算”真正 L3”菌株之數量。lpt3及lpt6基因分別負責在Hep II上3位及 6位添加PEA基團。約36%之流行性菌株含有該兩種基因， 5 0%之菌株僅具有lpt3，12%之菌株僅具有lpt6(Wright JC 等人，2004)。因此，可能36%之菌株為L3v，即使分型為 L3。然而，最近使用一組對不同内核LOS結構具專一性之 MAbs所獲得之流行病學數據表明，2%以下之菌株於Hep II 上具有兩個 PEA 基團（Gidney MAJ 等人，Infect Immun. 2004 72: 559-69)。該兩項研究間之差異（36%對2%)可能由 在6位具有PEA基團之菌株對人類補體之敏感性更高來解 釋（Ram S等人 J Biol Chem. 2003 278: 50853-62)。所有該 等數據合起來表明，大多數侵襲性菌株係’’真正的L3"。 已表明，lgtG及lpt-3競爭Hep II之0-3位置，且一個偏見 為添加Glc殘基優先於PEA殘基（Wright JC等人2004)。此假 設可能不為一個普遍原則，因為即使在功能性lgtG基因存 在下，菌株6275及C11之内核LOS中亦存在兩個2個PEA殘 基可證明（除非在相可變區域中具有14 C核苷酸之符合讀 框的lgtG基因無活性-參見上文）。除該Μοχοη實驗室假設 121392.doc -65- 200817034 外，最近闡述在菌株NmB之LOS内核結構之調節/成份中涉 及另一系統。此系統係MisR/MisS兩組份調節系統（Tzeng YL等人J Biol Chem. 2004 279: 35053-62)。總之，涉及内 核LOS成份之機制似乎有多個且未完全闡明。 自患者分離之五種菌株展示令人吃驚的LOS免疫型，因 為彼等顯示使用抗L3血清顯著沉澱以及使用抗L2血清較弱 的沉澱。菌株C11之情況亦如此，即使使用抗L2血清之沉 澱極弱。菌株C11之内核LOS之MS/MS分析亦顯示與L3及 L2 LOS之共表現部分一致之兩種不同内核成份。藉由免疫 沉澱鑑別之L3 LOS可能實際上係L3v LOS(具有2個PEA殘 基），而L2 LOS應與在6位具有一個PEA之内核LOS有關（待 藉由NMR分析確認），即使不存在可檢測的Glc，其應存在 於某些LOS分子上，因為在菌株C 11檢測到明顯具有功能 性之lgtG基因。盡管如此，應對一或多個患者分離菌株之 内核LOS實施分析（MS/MS、分子特性記述及SBA)以確認 該等L3,2菌株共表現L3v及L2 LOS。 總之，於内核上具有兩個PEA基團之菌株免疫分型為L3 菌株，但此免疫分型並不與SB A中之生物學反應性及”功 能性’flgtG、lpt3及lpt6基因存在之分析一致。我們之數據 表明，L3v菌株可能不是衍生自L3菌株（由於存在lpt6基因） 並且因此應重新命名。 實例5 :腦膜炎奈瑟菌疫苗：基於富含LOS泡之疫苗之二 價組合物 所用之泡生產菌株（免疫型、基因修飾等） 121392.doc -66- 200817034 菌株 基於： LOS siaD - porA - msbB - IgtB- 1st ~ frpB- TrHsfup B1854 H44/76 TrL3 X X X X X X B1948 H44/76 L7 X X X X X X B1900 760676 TrL2 X X X X B1987 760676 TrL2 X X X X X B1971 760676 L2 X X X X B1984 760676 L2 X X X X X 使用或不使用desferal培養來生產泡 • B1 854、B 1948、B 1971、B 1984 及 B 1987 泡係由 desferal 存在下之培養物生產 • B 1 900泡係由無desferal之培養物獲得 方法 動物程序··於第0、21及28天藉由肌内途徑（IM)用 OMV(含有約15-20%之去毒LOS)免疫30隻小鼠之各組三 次。每一接種由5微克（蛋白質含量）之未經吸附之OMVs構 成。該等OMVs自腦膜炎奈瑟菌（Nmen)菌株生產，該等菌 株經基因工程處理，以使莢膜多糖及PorA向下調節並且使 LOS去毒（msbB突變）。該等生產菌株（參見上表）衍生自經 基因改造之野生型菌株H44/76(在此情況下其表現L7 LOS 或TrL3 LOS)或經基因改造之野生型菌株760676(在此情況 下其表現經唾液酸化或未經唾液酸化之L2 LOS或表現TrL2 LOS)。泡分離自上述培養條件下生長之菌株。在第42天， 採集血樣，以使用一組腦膜炎奈瑟菌菌株（參見表1)藉由血 清殺菌分析（SB A)加以分析。對彙集之血樣或對各血清（10 至3 0份血清/組）實施SBA。 如下實施幼鼠實驗。於第0、14、28及63天經由IM途徑 121392.doc •67- 200817034 免疫20隻七天齡大鼠之各組。每一接種由1〇微克（蛋白質 含量）之未經吸附之泡構成。於第4次注射後14天採集血 樣。 如下實施豚鼠實驗。於第〇、14、28天經由IM途徑免疫 20隻豚鼠之各組。每一接種由2〇微克（蛋白質含量）之未經 吸附之泡構成。於第3次注射後14天採集血樣。 如下實施兔實驗。於第〇、21 ' 42天經由IM途徑免疫5隻 紐西蘭白兔之各組。每一接種由20微克（蛋白質含量）之未 經吸附之泡構成。於第3次注射後14天採集血樣。 使用含desfera丨之液體培養物之SBA:於37。〇+5% C02下 於MH+1% P〇lyVitex+l%馬血清petri培養皿上過夜培養腦 膜炎奈瑟菌菌株。它們於37°C振盪下於補充有50 μΜ desferal(鐵螯合劑）之液體TSB培養基中次培養3小時，以 達到於470奈米約〇·5之0D。於56°C使血清試樣不活化40分 鐘’然後於PBS-葡萄糖0.1%中稀釋1/1〇或1/5〇，然後於平 底微量板中以25微升之體積實施兩倍稀釋（稀釋8次）。於 PBS·葡萄糖〇· 1%中稀釋細菌以產生5300 CFU/毫升，並向 該血清稀釋液中添加18.8微升此稀釋液。亦在每一孔中添 加兔補體（6.2微升）。於37°C振盪下培養75分鐘後，在該等 孔中添加50微升MH+0.9%瓊脂，並且約30分鐘後添加50微 升PBS+0.9%瓊脂。於37°C+C〇2下過夜培育該等微量板。 計數CFU並且計算殺死百分比。SBA效價係50%殺死之稀 釋度。 使用不含desferal之瓊脂培養物之SBA:於37°C+5% C02 121392.doc -68- 200817034 下於BHI+l%馬血清Petri培養孤上過夜培養腦膜炎奈瑟菌 菌株。它們於37°C+5% C02下於BHI+1%馬血清中次培養4 小時。於56°C使血清試樣不活化40分鐘，然後於PBS-葡萄 糖0.1 %中稀釋1/10，然後於平底微量板中以25微升之體積 實施兩倍稀釋（稀釋8次）。於PBS_葡萄糖0.1%中稀釋細菌 以產生6400 CFU/毫升，並向該血清稀釋液中添加12.5微 升此稀釋液。亦在每一孔中添加兔補體（12.5微升）。於 3 7°C振盪下培育75分鐘後，在該等孔中添加50微升 TSB + 0.9%瓊月旨，並且約30分鐘後添加50微升PBS + 0.9%瓊 脂。於35或37°C+C02下過夜培育該等微量板。計數CFU並 且計算殺死百分比。SB A效價係50%殺死之稀釋度。 不同免疫型之内核LOS成份 • L3 =於HepII上有一個PEA(最可能在3位上）並且在内核 GlcNAc上無另外的乙醯基 • ’’L3” =於HepII上有一個PEA(最可能在3位上）並且在内核 GlcNAc上有另一個乙醯基 • L2 =於HepII上有一個PEA(最可能在6位上）並且在内核 GlcNAc上有另一個乙醯基 •變體=於HepII上有兩個PEA(最可能在3及6位上）並且在 内核GlcNAc上有另一個乙醯基；儘管注意到在菌株 W3193中HepII上不存在OAc • L10及L11 =結構未測定 • L3、nL3”、L2及變體具有LNnT四糖（經唾液酸化或未經 唾液酸化）。 121392.doc -69- 200817034 結果 概述於下表1及圖5中之結果顯示： • L2衍生之泡誘發抗NmenB L2菌株但不抗NmenB L3菌 株（菌株M97250687除外）之殺菌抗體，而L3衍生之泡 誘發抗NmenB L3及nL3n菌株、抗血清組a菌株 3125(L10)及血清組Y菌株M01.0240539(表中之 M0 1.539)但不抗L2菌株之保護性反應。藉由質譜分析 測定之3125 L10 LOS之結構顯示於圖6中。 •另外，L2衍生之泡誘發對抗具有變異L0S之菌株 (NmenB 6275及NmenC Cl 1菌株）以及對抗血清組 C(C19)、血清組 Y (S1975)、血清組 A (F8238, L11)及 血清組W-135 (菌株S4383及3193)之其他菌株之保護 作用。 •基於衍生自L2及L3菌株之富含LOS泡之二價疫苗誘發 對抗所有測試菌株（不論任何血清組及LOS免疫型）之 保護性反應（殺菌抗體）（必須測試具有L2 NS及TrL3 OMVs之二價疫苗）。 •未截短之L2 LOS較lgtB突變（ = TrL2)誘發更佳之”交又 保護’’。L3衍生之泡（TrL3=L7)並不如此。 •未經唾液酸化之L2泡誘發殺菌抗體之量相似於經唾液 酸化之L2泡（至少對抗菌株6275)。 •根據SB A中之靶定菌株，於該等二價疫苗觀察到或未 觀察到干擾，表明需要微調該二價調配物/組合物， 以確保對抗所有測試菌株之最佳功效（SB A效價）。 121392.doc -70- 200817034 •修飾内核對交叉殺菌抗體之誘發具有重大影響。 表1.單價及二價富含LOS之OMV疫苗所誘發的交叉殺菌 抗體·（5〇%殺死之）SBA效價及血清轉化率（％) 菌種 組 LOS 疫苗(未經吸附） L7 L2 L7+L2 TrL3 TrL2 TrL3+TrL2 緩衝液 (B1948) (B1971) (B1854) (B1900) 雜 H44/76 B L3 4979 <100 5267 5507 <100 12754 <100 M97250687 B L3 10123 3800 5739 >51200 469 >51200 <100 NZ124 B ”L3” 479 <20 228 949 <20 523 <20 760676 B L2 <20 329 213 <20 104 40 <20 2986 B L2 <200 5288 2670 <200 1486 1486 <200 B16B6 B L2 <100 1746 1401 <100 2236 1097 <100 泰’ 6275$ B 變體 <20 267 43 <20 28 <20 <20 0% 100% 60% 0% 60% 5% 0% 6275* B 變體 <100 2748 1456 <100 657 456 <100 1, ^ . . y v v ¥< .1 «.a l .灰冰-嘗,_ 丨們,；^|(|亇丨·· I l·:續 身1 ^懸論 ϋβϋϋΙΛΙ 1_Ι_Ι_ΙΙΙβΙ ϋϋΜΙΙΙΙ ISBileil 丄i一二L/—………—_……__……… C11 C 變體 <20 2767 1303 <20 405 176 <20 0% 100% 100% 0% 100% 100% 0% S1975 Y 變體 <20 >5120 >5120 <20 >5120 2205 <20 0% 100% 100% 20% 100% 100% 10% M01.539 Y ?? 235 18 140 168 19 76 <20 100% 20% 75% 89% 20% 70% 20% F8238 A L11 142 >5120 >5120 42 3469 1665 <20 100% 100% 100% 60% 100% 100% 10% 3125 A L10 82 14 NT 207 <20 NT <20 88% 20% 100% 0% 0% S4383 W ”L3” 54 1259 NT NT NT NT NT 55% 100% 3193 W 變體 <20 >5120 NT NT NT NT NT 0% 100%

H44/76、M97250687、NZ124、760676、2986 及 B16B6 :彙集血清之 SBA。其他菌株：各血清之SBA。 非血清組B菌株及L2菌株：自不含desferal之瓊脂培養物實施SBA(不可能 有例外） •71 - 121392.doc 200817034 $使用液體培養物+desferal之兩次分析之平均值 *彙集血清使用瓊脂培養物（不含desferal)測試 表2中之結果顯示： •亦在豚鼠、兔及幼大鼠中觀察到L2衍生之泡（具有或不 具有末端唾液酸之L2及TrL2)賦予對抗非血清組B菌株及 , 菌株6275之交叉保護。 , •通常，L2衍生之泡不能誘發顯著量可介導補體殺死L3菌 株（除菌株M97250687(該表中M687)外）的殺菌性抗體（由 / ^ 於陰性血清上測得活性之背景，使得使用幼大鼠及兔血 清之菌株H44/76之數據不可靠並且必須重複）。 •在豚鼠中，TrL2泡似乎可誘發較L2 1st-及L2泡更高量之 殺菌抗體，而在幼大鼠、小鼠及兔中觀察到以下排列： L2 之 L2 2 TrL2 〇 •該等結果顯示，不需要唾液酸化L2 LOS來誘導殺菌抗體 之誘發，並且TrL2泡（lgtB突變）亦能夠誘發殺菌抗體之 產生（如 TrL3 LOS)。 121392.doc -72- 200817034 表2.單價富含LOS的L2衍生之OMVs所誘發的交叉殺菌抗 體，（50%殺死之）SBA效價及血清轉化率（％) 760676 L2 B16B6 2986 MenB H44/76 L3 M687 NZ124 變體 6275 MenA Lll F8238 MenC 變體 Cll MenY 變體 S1975 MenW ”L3” S4383 幼大鼠 TrL2 (B1987) PIV 463 129 1447 410 122 50 1822 1250 143 6446 6010 L2 1st- (B1984) PIV 1812 486 4396 2188 138 50 385 3090 365 8923 1577 L2 lst+ (B1971) PIV 1519 996 5294 110 168 983? 961 3604 554 11000 1478 Ctrl(-) PIV 50 50 50 360 50 50 50 50 50 50 154 小鼠 TrL2 (B1987) Pin 186 1692 6081 50 107 10 410 1929 1131 2661 2782 L2 1st-(B1984) Pill 232 1645 7557 50 321 10 748 3929 1804 8032 1371 L2 Ist+ (B1971) Pin 790 1330 8216 50 582 10 1305 5082 2525 11731 1040 Ctrl(-) PHI 50 50 50 50 50 10 50 50 50 50 50 豚鼠 TrL2 (B1987) L2 1st-(B1984) Pin >12800 8129 4194 50 182 50 7253 3952 627 10207 7200 Pin >12800 5473 6608 594 770 123 ? 7326 5431 1491 >12800 5417 L2 lst+(B1971) PHI >12800 5945 6484 457 527 50 4148 5061 1051 5967 5036 Ctrl㈠ Pin 50 50 50 50 50 50 50 124 50 665 50 兔 TrL2 (B1987) Pre 59 50 50 562 50 50 50 50 50 50 50 PHI 752 362 346 134 50 50 157 221 66 636 723 L2 1st-(B1984) Pre 63 50 50 318 50 50 50 50 50 50 50 Pill 1541 507 430 307 72 50 317 414 122 1386 1238 L2 lst+ (B1971) Pre 50 50 50 178 50 50 50 50 50 50 62 PHI 4727 1540 551 116 90 50 750 892 224 2419 3667 Ctrl(-) Pre 50 50 50 73 50 50 50 50 50 50 173 Pill 50 50 50 236 50 50 50 50 50 50 372 於彙集血清實施SBA，兔血清除外，其係各自檢測。 結論：基於L2與L3之LOS疫苗之組合可誘發能殺死Men A、B、C、W135及Y菌株之抗體-此係首次顯示。基於 L2之疫苗可殺死L2、變體（L3v)菌株及LI 1菌株。基於L3之 疫苗可殺死L3、nL3’’（不太有效）及L10菌株。儘管截短的 121392.doc -73- 200817034 (lgtB(-))及全長（或lst(-))oc鏈可殺死，但截短的鏈似乎有益 於L3疫苗並且全長（或lst(-))似乎有益於L2疫苗。基於該兩 種LOS之疫苗之組合顯示作為抗腦膜炎奈瑟菌之疫苗之極 大潛力。 實例6 :腦膜炎奈瑟菌疫苗：二價OMVs(L7衍生及L2衍生） _誘發抗ABCWY菌株之交叉保護_ 方法 動物程序： -於第0、21及28天藉由肌内途徑（IM)用二價OMVs調配物 (L3衍生之OMV+L2衍生之OMV，含有約15-20%之去毒 LOS)免疫30隻小鼠之各組三次。每一接種由0.8微克+ 〇·8微克（LOS含量）之未經吸附之OMVs構成。該等OMVs 自腦膜炎奈瑟菌（Nmen)菌株生產，該等菌株經基因工程 處理，以使莢膜多糖及PorA向下調節並且使LOS去毒 (msbB突變）。該等生產菌株衍生自經基因改造之野生型 菌株H44/76(L3)或經基因改造之野生型菌株760676 (L2)(參見下文闡述基因修飾及培養條件之表）。在第42 天，採集血樣，用以使用一組22個來自血清組A、B、 C、W13 5(W)及Y之腦膜炎奈瑟菌菌株藉由血清殺菌分 析（SBA)加以分析。對彙集之血樣實施SBA。血清係來 自實驗 20060425 及 20060426。 -如下實施幼大鼠實驗。於第0、14、28及63天經由IM途 徑免疫七天齡大鼠（n=20/組）。每一接種由1.6微克+1.6 121392.doc -74- 200817034 微克（LOS含量）之未經吸附之OMVs構成。於第4次注射 後14天採集血樣並彙集（實驗20060484)。 -如下實施豚鼠實驗。於第0、14、28天經由IM途徑免疫 20隻豚鼠之各組。每一接種由3.2微克+3.2微克（LOS含 量）之未經吸附之OMV構成。於第3次注射後14天採集血 樣並彙集（實驗20060487)。 -如下實施兔實驗。於第0、21、42天經由IM途徑免疫5隻 紐西蘭白兔之各組。每一接種由3.2微克+3.2微克（LOS 含量）之未經吸附之OMV構成。於第1次注射前及於第3 次注射後14天採集血樣並各於SBA中測試（實驗 20060486) 〇 OMVs生產菌株（免疫型）及基因修飾

siaD - porA - msbB - IgtB- 1st - fipB - TrHsfup NspA up B1854 TrL3 X X X X X X B1948 L7 X X X X X X B2084 TrL2 X X X X X B2071 NSL2 X X X X X 自使用或不使用desferal實施之培養生產OMVs 自使用desferal實施之培養生產B1854及B1948 OMVs 自不使用desferal實施之培養獲得B2071及B2084 OMVs SBA :於37°C+5% C02下於Petri培養皿上過夜培養腦膜 炎奈瑟菌菌株。彼等於37°C+5% C02下不使用或使用 deferal(鐵螯合劑）於Petri培養皿上次培養4小時。於56°C下 使血清試樣不活化40分鐘，然後於PBS-葡萄糖0.1%中稀釋 1/10或1/50，然後於平底微量板中以25微升之體積實施兩 121392.doc -75- 200817034 倍稀釋。然後向該血清稀釋液中添加25微升混合的細菌 (於PBS-葡萄糖0.1%中稀釋以產生約100-150 CFU/孔）及幼 兔補體（在微量孔中之終濃度：12.5% v/v)。在37°C振盪下 培育75分鐘後，在該等孔中添加2層瓊脂（0.9%)。於35或 37°C+C〇2T過夜培育該等微量板。計數CFU並且計算殺死 百分比。SBA效價係50%殺死之稀釋度。 不同免疫型之内核LOS成份 • L3 =於HepII上有一個PEA(最可能在3位上）並且在内核 GlcNAc上無另一個乙醯基 • ”L3” =於HepII上有一個PEA(最可能在3位上）並且在内核 GlcNAc上有另一個乙醯基 • L2 =於HepII上有一個PEA(最可能在6位上）並且在内核 GlcNAc上有另一個乙醯基 •變體=於HepII上有兩個PEA(最可能在3位及6位上）並且 在内核GlcNAc上一般有另一個乙醯基 • L 1 0及L11 =結構未完全測定 • L3、’’L3”、L2及變體具有LNnT四糖（經唾液酸化或未經 唾液酸化）。 結果 基於殺菌效價四倍增加（使用對照動物之彙集血清試樣 或接種疫苗前血清試樣作為比較），結果（參見下頁中之表） 顯示：

•含有L7+NSL2 OMVs或丁rL3+TrL2 OMVs之未經吸附之 二價調配物能夠賦予對抗屬於血清組A、B、C、W及Y 121392.doc •76· 200817034 之腦膜炎奈瑟菌之交又保護。 •此交叉保護不僅在小鼠中而且亦在幼大鼠、豚鼠及兔中 觀察到。 •然而，該等調配物不能激發對抗表現L4 LOS免疫型之菌 株之保護性反應。在該等實驗中，血清對於L1 〇菌株不 具有殺菌性。 •大多數表現L3或” L3”或變體或L2 L0S之菌株由小鼠、

幼大鼠及豚鼠血清殺死。對抗該等菌株之交又保護之百 分比接近90%。 •該交又保護在兔中似乎較低。 結論 基於知生自L3及L2腦膜炎奈瑟菌菌株之〇MV之二價疫 苗：夠提:共對抗表現L3或”L3”或變體(L3 V)或L2 L〇s之腦 菌菌株之保濩作用。此保護作用並不限於一特定 血清組。

121392.doc 77- 200817034 ,1 ^^vOQs(w^^%og)n^g^w^w^^^^^Awowsol^s^M:^ 121392.doc 5 < 8S28d | 4240 | | 4348Ί | 2164 | | 2531 | | 2111 | | 6594 | 391 1280 § < S2W o o ? O <D <D r * ^ * ε8ε女s 1041 I 2164 | | 400 I LJIl | 1226 I I 1179 I 2816 1278 彡 I9l£ | 1261 I | 4178 | I 584 | | 362 I | 3046 I | 2136 I 805 348 ω ZZZZE o o s o s /〇 6 T- r- cq 95εε f3 s GO o 00 CO Ol •to -CD § ω 9862 | 7328 | | 3929 I | 836 I | 1200 I | 3486 I I 4308| 1262 5601 m 9肌S 丨浦I I 415 I 382 | 4722 | 3248 | 304 50：： c〇 9Ζ9092 | 3050 I | 2450 I | 2158 | I 312 | | 2271 | I 3362 | 1047 111 Ο 61^0 -»、* * ri 〇 \s；m\ s 以> V) o k '^r' Ο 168 O f o o o .T 〇> M? ；l·, n O 1〇 Ϊ * 〇· ο η〇 ^ co 9809 | 25600 1023 I | 9371 1105 I I 2426 333 I | 1452 514 I | 25600 392 | | 11200 1269 I 2568 144 1263 293 2 m 1662 | 11947 | | 25600 | | 40960 | | 40960 | | 25600 | | 25600 | 4287 4364 ^ m 關 | 1124 | I 148 I 00 1 >- 9161S | 256001 | 25600| I 7817 | | 9148 I 7200 | 25600| 2497 6760 類 鉍 $ ε6ΐε | 12734 | 18153 | | 6617 I 5635 | 5715 | 5844 | 1085 2538 0Q SZ2S | 7122 | | 5985 | | 1340 | I 430 I | 4520 | | 2914 | 515 Msow CQ 9，，es S I 112 I # 栗, % 、ξ I 125 I I 158 | OO 2 cd mzN 132 I 504 | 呀 V， i S 153 | ,/ v^r ¾ 3 00 Ζ89052Ζ6ΙΛ I 1611 I | 2542 | | 257 I | 8495 I I 662 I | 10278 | 305 514 m 9"沙 H I 3292 I | 40960 | I 614 I I 702 I I 1178 I | 3082 | |小鼠 L7+NSL2 I I TrL3+TrL2 | |幼大鼠 L7+NSL2 I I TrL3+TrL2 | |豚鼠 L7+NSL2 I I TrL3+TrL2 | 兔 L7+NSL2 TrL3+TrL2 (0蝴 9^嬸叫坤#诹«礫^M)iieT#T«垅^JDIT#s>elmT#l"琳嚓^咩卷 gs17es * 78 - 200817034 _實例7 : OAc對L7 OMVs之免疫原性之影響_ 方法 動物程序： -於第0、21及28天藉由肌内途徑（IM)用OMV(含有約15-20%之去毒LOS)免疫30隻小鼠之各組三次。每一接種由 〇·8微克（LOS含量）之未經吸附之OMVs構成。該等OMVs 自腦膜炎奈瑟菌菌株生產，該等菌株經基因工程處理， 以使莢膜多糖及PorA向下調節並且使LOS去毒（msbB突 變）。該等生產菌株衍生自經基因改造之野生型菌株 H44/76(參見下文闡述該等基因修飾及培養條件之表）。 在第42天，採集血樣，以使用腦膜炎奈瑟菌菌株藉由血 清殺菌分析（SBA)實施分析。對各血清實施SBA。血清 來自實驗20060634。 -如下實施豚鼠實驗。於第0、14、28天經由IM途徑免疫 20隻豚鼠之各組。每一接種由3.2微克（LOS含量）之未經 吸附之OMVs構成。於第3次注射後14天採集血樣（實驗 20060636)。 OMVs生產菌株（免疫型）及基因修飾

siaD - porA - msbB - 1st - frpB - TrHsfup nmb0285 B1948 L7 OAc- X X X X X X OFF B2103 L7 OAc+ X X X X X X ON 自使用desferal生長之培養物生產B1948及B2103 OMVs SBA :於37°C+5% C02下於Petri培養孤上過夜培養腦膜 炎奈瑟菌菌株（OAc-之H44/76及M97250687以及OAc+之 121392.doc -79- 200817034 NZIM)。彼等於37°C+5% C02下使用deferal(鐵螯合劑）於 Petri培養皿上次培養4小時。於56°C下使血清試樣不活化 40分鐘，然後於PBS-葡萄糖0.1〇/〇中稀釋1/1〇或1/50，然後 於平底微量板中以25微升之體積實施兩倍稀釋。然後向該 等血清稀釋液中添加25微升混合的細菌（於PBS-葡萄糖 0，1%中稀釋以產生約100-150 CFU/孔）及幼兔補體（在微量 孔中之終濃度：12·5% v/v)。在37°C振盪下培育75分鐘 後，在該等孔中添加2層瓊脂（0.9%)。於35或37°C+C02下 過夜培育該等微量板。計數CFU並且計算殺死百分比。 SBA效價係50%殺死之稀釋度。 結果 在小鼠中，L7 〇Ac+ OMVs之免疫原性強於L7 OAc-〇MVs(參見下表）。事實上，用L7 OAc+ OMVs免疫小鼠 之血清顯示高於用L7 OAc- OMVs免疫小鼠之血清之補體 介導之殺菌活性。此在對抗OAc-及OAc+野生型菌株時觀 察到。然而，僅在對抗OAc-菌株（H44/76及M97205687)時 觀察到顯著之差異。 表：小鼠由 L7 OAc· OMVs (B1948) 及L7 OAc+ OMVs (B2103)所誘發之殺菌抗體 (5 0%殺死之）GMT及95%之可靠間隔 B1948 (OAc-) OMVs B2103 (OAC+) OMVs H44/76 3699 (1987-6886) 9122* (6381-13041) M97.250687 2768 (1741-4401) 7780* (5594-10820) 121392.doc -80- 200817034 NZ124 117 191 (61-225) (105-348) 與B1948免疫小鼠之GMT相比户<0.05 在豚鼠中，兩種類型之OMVs在SBA中皆顯示對抗OAc+ 及OAc-野生型菌株之類似免疫原性（參見下表）。 表：豚鼠由 L7 OAc- OMVs (B1948) 及L7 OAc+ OMVs (B2103)所誘發之殺菌抗體 (5〇°/〇殺死之）GMT及95%之可靠間隔 B1948 (OAc-) OMVs B2103 (OAC+) OMVs H44/76 1283 1392 (896-1836) (876-2212) NZ124 69 43 (38-128) (25-74) 結論 内核GlcNAc之Ο-乙醯基化已證明可增強OMVs在小鼠而 非豚鼠中之免疫原性（SBA效價）。 【圖式簡單說明】 圖1 :如L1-L8免疫型之結構所示之腦膜炎球菌LOS結構 之共同取代圖案（摘自Kahler等人Glycobiology 2005 15: 409-419/2006 JBC 281:19939-19948)。L7 免疫型結構（未顯 示）係L3免疫型結構之未經唾液酸化形式。該保守内核區 域係以R1-R5表示之可變連接物顯示。α-鏈（R1)之成份由 五轉移酶及之相變表現決定，1st編碼連接末端α-Neu5Ac(唾液酸）基團之唾液酸轉移酶。注意，甘胺酸經由 第二個Hep殘基上之7位連接於該等内核。注意，另一個 121392.doc -81 - 200817034 KDO殘基未顯示，已知該KDO殘基存在於所有免疫型連接 於圖中所示KDO殘基之内核中。 圖2 A :藉由質譜分析測定之各種L3腦膜炎奈瑟菌菌株 之LOS結構之示意圖。有趣的是，不易於被H44/76衍生之 血清殺死之某些L3菌株經0-乙醯基化。 圖2B :各種腦膜炎奈瑟菌免疫型之常見LOS結構。顯示 編碼用於形成該LOS結構某些部分之酵素之已知基因之名 稱。 圖3A:菌株Z2491之腦膜炎奈瑟菌LOS 0-乙醯基化基因 NMA 2202。注意，開放讀碼框（大寫字體）中5個G之序列 使該開放讀碼框符合讀框（in frame)。 3B :菌株MC58之腦膜炎奈瑟菌LOS Ο-乙醯基化基因 NMB 02 85。開放讀碼框大寫，周圍序列（例如啟動子序列） 小寫。注意，開放讀碼框中6個G之序列（下劃線）使該開放 讀碼框移碼（out of frame)。 3C:菌株760676之腦膜炎奈瑟菌LOS 0-乙醯基化基因 (ΝΜΒ 0285相等基因）。開放讀碼框大寫，周圍序列（例如 啟動子序列）小寫。注意，開放讀碼框中5個G之序列（下劃 線）使該開放讀碼框符合讀框。 3D : (MenB，L3)菌株ΝΖ124之腦膜炎奈瑟菌LOS 0-乙醯 基化基因（NMB 0285相等基因）。開放讀碼框大寫，周圍序 列（例如啟動子序列）小寫。注意，開放讀碼框中5個G之序 列（下劃線）使該開放讀碼框符合讀框。 圖 4 : A - LOS 6275之内核募糖（ES·) ; B - LOS 6275之 121392.doc -82- 200817034 内核寡糖（MS/MS ES+ m/z 1803.6)，所示結構示意圖顯示 HepII在3位及6位連接於PEA，並且内核經0-乙醯基化；C -Men C菌株C11之内核寡糖（ES-)。 圖5 : L2 LOS之唾液酸化對於L2衍生之OMV疫苗誘發交 叉殺菌抗體之影響。SBA效價（50%殺死之GMT)及血清轉 化率（％)。 圖6 : MenA 3125 L10 LOS之質譜結構分析。

121392.doc -83 -

Claims (1)

1. 200817034 十、申請專利範圍： 1. 一種免疫原性組合物，其包含奈瑟菌菌株之L2 LOS及L3 LOS，其中該L2及L3 LOS具有以下結構： KDOII |(綱 ——_ η— ϊ ιακ) I---------脂質 a (pl-4) (al-S) (α2-6)

   R4 其中對於該L2 LOS : R1 GIcNac —Gal (PI-3) —GkNac — Gal — (Pi-4) (pi-3) ，或 NeuNac — G 叕1 —GkNarc —Gal (a2-3) ((Jl-4) (pi，3)

   R2=H、PEA或 Glc， R3=PEA， R4=H 或 OAc， R5=H、PEA 或 Gly， 及其中對於該L3 LOS : GlcN^c —Gal— Gal — GkNiic — Gal — Rl= (βυ) 、 (βΐ-4) (pl-3) ，或 R2=PEA， 121392.doc 200817034 R3=H， R4=H或 OAc， R5=H、PEA或 Gly。 2.如請求項1之免疫原性組合物，其中對於該L2 LOS : GIcNac — Gal— — GlcNac — Gal — Rl= (Pl-3) 、 (Pl-4) (pl-3) ，或 NeuNac 一 Gsil — GkNac — Gal — (α2-3) (βΙ-4) (β|_3) 其中對於該L2 LOS : 其中對於該L2 LOS : 其中對於該L2 LOS : 其中對於該L3 LOS :

   3. 如請求項1或2之免疫原性組合物 R2=H、ΡΕΑ或 Glc。 4. 如請求項1至3之免疫原性組合物 R5=H、PEA 或 Gly 〇 5. 如請求項1至4之免疫原性組合物 R4=H或 OAc。 6. 如請求項1至5之免疫原性組合物 GkNac — Gal— Grf 一GkN^ic — Gal — Rl= (β1-3) 、 (βϊ-4) (β1-3) ，或 NeuNac^gal ^^IcNiic^ - Gal - 7. 如請求項1至6之免疫原性組合物，其中對於該L3 LOS : R4=H或 OAc。 8. 如請求項1至7之免疫原性組合物，其中對於該L3 LOS : R5=H、PEA或 Gly。 9. 如請求項1至8之免疫原性組合物，其另外包含奈瑟菌菌 株之L10 LOS，視情況自腦膜炎奈瑟菌A、B、C、W135 121392.doc 200817034 或γ菌株分離。 10.如請求項1至9之免疫原性組合物，其另外包含具有以下 結構之L10 LOS : Cpl~4) m γ ip I - IjrIC------Hep 1 .， R1 _) (aUS) KD〇n|(咏4) (a2. 脂質A Mm II - R3 (cel-6) (al-3)/

   (al·?) \ (al«23 GlcN 齡 R4 其中： R1 =己糖-己糖-R2=H 或 PEA， R3=PEA，

   R4 = OAc， R5=H或 Gly 〇 11. 如請求項10之免疫原性組合物，其中對於該li〇l〇s: Rl=Gal-Gal-、Gal-Glc…Glc-Gal-或 Glc-Glc_。 12. 如請求項Η之免疫原性組合物，其中對於該li〇l〇s: Gill — G^I — R 1 = (β1-4) Gal — Glc 〜Gk — Gal _ Φ1 - 4> 、 (βΜ) Gk — GIc — 或 其中對於該L10 情況經由一個α- 13·如請求項l〇至12之免疫原性組合物， LOS，該R1末端己糖經唾液酸化（視 121392.doc 200817034 Neu5Ac_(2 —3)基團）。 14. 如請求項10至13之免疫原性組合物，其中對於該LI0 LOS : R2=H或 PEA。 15. 如請求項10至14之免疫原性組合物，其中對於該L10 LOS : R5=H或 Gly。 16. 如請求項1至15之免疫原性組合物，其中該L2 LOS非具 有L4免疫型之LOS。 17. 如請求項1至16之免疫原性組合物，其中該L2 LOS具有 R2=PEA或Glc，並且其中該組合物另外包含具有以下結 構之L4 LOS : KDOO (α2^4) (β!4) R1 - Glc ——一Η— I--------KBOI-------脂質 A φ1·4) (αΙ-5) (α2·6:)

   m 其中對於該L4 LOS ·· GIcNac — Gal — Gal — GlcNac — Gill — Rl= (PU) 、 (βϊ-4) (pi-3) ，或 NeuNac — Gal — GkNae — Gal — (α2-3) (β1-4) (βΐ.3) R2=H， R3=PEA， 121392.doc 200817034 R4 = OAc， R5=Gly。 18. 如請求項17之免疫原性組合物，其中該L4 LOS具有 R4=H而非OAc及/或具有R5=H而非Gly。 19. 如請求項17或18之免疫原性組合物，其中該L4 LOS係自 腦膜炎奈瑟菌A、B、C、W135或Y菌株分離。 20·如請求項1至19之免疫原性組合物，其中該L2 LOS係自 腦膜炎奈瑟菌A、B、C、W135或Y菌株分離。 21. 如請求項1至20之免疫原性組合物，其中該L3 LOS係自 腦膜炎奈瑟菌A、B、C、W135或Y菌株分離。 22. 如請求項1至21之免疫原性組合物，其中該L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS結合至一種蛋白質載體。 23. 如請求項1至22之免疫原性組合物，其中該L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS具有一個去毒脂質A部分，例如缺少一個二級醯 基鏈，與自msbB(-)奈瑟菌菌株分離之LOS—致。 24. 如請求項1至23之免疫原性組合物，其中該L2 L〇S、L3 121392.doc 200817034 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS與一種適於降低該LOS毒性之脂質A結合肽（諸如 SAEP2 或 SAEPII)複合。 25.如請求項1至24之免疫原性組合物，其中該L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS以經純化之LOS製劑形式存在於該免疫原性組合 物中。 26·如請求項1至25之免疫原性組合物，其中該L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 L4 LOS以脂質體製劑形式存在於該免疫原性組合物中。 2 7.如請求項1至26之免疫原性組合物，其中該L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 L〇S、L2 及 L3 LOS、L2 及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、L4及 L10 LOS、L2及 L3 及 L10 LOS、L2及 L3及 L4 LOS、L2及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10 及 121392.doc 200817034 L4 LOS以泡（bleb)製劑形式存在於該免疫原性組合物 中〇 28·如請求項27之免疫原性組合物，其中該（等）泡製劑已於 使用 0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、0.06-0.2、0.08-0.15 或 0.09-0.11%清潔劑（較佳為脫氧膽酸鹽）之提取步驟後自 其各別奈瑟菌菌株分離。 29·如請求項27或28之免疫原性組合物，其中該（等）L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及 L3 LOS、L2及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、 L4及 L10 LOS、L2及 L3及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、 L2 及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10及L4 LOS泡製劑已於鐵鹽存在下培養後自其各別奈 瑟菌菌株分離。 30.如請求項27至29之免疫原性組合物，其中該（等）L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及 L3 LOS、L2及 L10 LOS、L3 及 L10 LOS、L4及 L2 LOS、L4及 L3 LOS、 L4及 L10 LOS、L2及 L3及 L10 LOS、L2及 L3 及 L4 LOS、 L2 及 L4 及 L10 LOS、L3 及 L4 及 L10 LOS、或 L2 及 L3 及 L10及L4 LOS泡製劑已於鐵鹽不存在下培養後自其各別 奈瑟菌菌株分離。 3 1 ·如請求項27至30之免疫原性組合物，其中該（等）泡製劑 已自一種（多種）不能合成莢膜多糠之奈瑟菌菌株分離。 32.如請求項3 1之免疫原性組合物，其中該（等）奈瑟菌菌 株，與衍生它們之該（等）天然菌株相比，具有以下莢膜 121392.doc 200817034 夕糖基因之一之表現下調（downregulated)，且較佳缺失 (無功月b 表現）· ctrA ' ctrB、ctrC、etrD、synA、synB、 synC或較佳siaD ;且其中當L2及L3泡均存在時，衍生它 們之菌株較佳每一菌株具有相同的莢膜多糖基因之表現 下調。 33·如吻求項27至32之免疫原性組合物，其中該（等）泡製劑 已自一種（多種）奈瑟菌菌株分離，該（等）奈瑟菌菌株與

   何生它們之該（等）天然菌株相比，具有表現下調並且較 佳缺失（無功能表現）之以下脂質A基因之一或兩者： mSbB*htrB，較佳為前者；且其中當L2及L3泡均存在 時，何生它們之菌株較佳每一菌株具有該（等）相同的脂 質A基因之表現下調。 34. 如請求項27至33之免疫原性組合物，其中該（等）泡製劑 已自一種（多種）奈瑟菌菌株分離，該（等）奈瑟菌菌株與 何生它們之該（等）天然菌株相&，具有表現下調並且較 佳缺失之一種或多種以下外膜蛋白質基因：pod、 P〇rB、opA、opC、pilc、lbpAstfrpB4MnuL3 泡均存在時’何生它們之菌株較佳每—菌株具有該（等） 相同的外膜蛋白質基因之表現下調。 35. 如請以34之免疫原性組合物，其中於鐵鹽存在下培養 之任一奈瑟菌菌株與衍生它們之該（等）天然菌株相比， 具有任一以下外膜蛋白質基因之組合之表現下調，並且 較佳缺失：P〇rA及〇pA、_及〇pC、—及⑽、 PorA及 〇pA及 〇pC。 121392.doc 200817034 36. 如請求項34或35之免疫原性組合物，其中於鐵鹽不存在 下培養之任一奈瑟菌菌株與衍生它們之該（等）天然菌株 相比，具有表現下調且較佳缺失之任一以下外膜蛋白質 基因之組合：PorA及OpA、PorA及OpC、OpA及OpC、 PorA 及 OpA及 OpC、PorA及 FrpB、OpC 及 FrpB、ΟρΑ及 FrpB、PorA及 OpA、OpC及 FrpB、PorA及 LbpA、FrpB及 LbpA、PorA及 FrpB 及 LbpA o 37. 如請求項27至36之免疫原性組合物，其中該（等）泡製劑 已自具有一種或多種以下外膜蛋白質抗原之表現上調 (upregulated)之一種（多種）奈瑟菌菌株分離·· NspA、 TbpA低、TbpA 高、Hsf、Hap、OMP85、PilQ、NadA、 GNA1870、MltA ;且其中當L2及L3泡均存在時，衍生它 們之菌株較佳每一菌株具有一種或多種不同的外膜蛋白 質抗原之表現上調。 3 8.如請求項37之免疫原性組合物，其包含自具有NspA之表 現上調之奈瑟菌菌株分離之L2及/或L3泡製劑，較佳在 該奈瑟菌菌株已於鐵鹽存在下培養之情況下。 3 9.如請求項37或38之免疫原性組合物，其包含自具有Hsf 之表現上調之奈瑟菌菌株分離之L2及/或L3泡製劑。 40. 如請求項37至39之免疫原性組合物，其包含自具有Tbp 之表現高度上調之奈瑟菌菌株分離之L2及/或L3泡製劑， 較佳在該奈瑟菌菌株已於鐵鹽不存在下培養之情況下。 41. 如請求項37至40之免疫原性組合物，其包含自具有Tbp 低之表現上調之奈瑟菌菌株分離之L2及/或L3泡製劑， 121392.doc 200817034 較佳在該奈瑟菌菌株已於鐵鹽不存在下培養之情、兄下。 42· —種疫苗組合物，其包含有效量之如請求項1至4丨之免 疫原性組合物及醫藥上可接受的載劑。 43.如請求項42之疫苗，其另外包含佐劑，例如氫氧化銘或 攝酸鋁。 44·如請求項42或43之疫苗，其另外包含一或多種衍生自以 下菌株之結合莢膜多糖或寡糖：腦膜炎球菌血清組 (serogroup) A、腦膜炎球菌血清組c、腦膜炎球菌血清 組W-135、腦膜炎球菌血清組γ及流感嗜血桿菌b型。 45 · —種如請求項i至4丨之免疫原性組合物或如請求項至 44之疫苗於製備藥物之用途，該藥物用於預防或治療由 一或多種選自下列之腦膜炎奈瑟菌血清組所導致之疾 病：A、B、C、W135及 Y。 46· —種預防或治療由一或多種選自下列之腦膜炎奈瑟菌血 清組導致之疾病之方法：A、B、C、W1 3 5及γ ,該方法 包括向需要之人類患者施與有效量之如請求項1至4丨之 免疫原性組合物或如請求項42至44之疫苗之步驟。 47·如請求項45或46之用途或方法，其中該預防或治療係預 防或治療腦膜炎奈瑟菌血清組A疾病。 48·如請求項45至47之用途或方法，其中該預防或治療係預 防或治療腦膜炎奈瑟菌血清組B疾病。 49·如請求項45至48之用途或方法，其中該預防或治療係預 防或治療腦膜炎奈瑟菌血清組C疾病。 50·如請求項45至49之用途或方法，其中該預防或治療係預 121392.doc -10- 200817034 防或治療腦臈炎奈瑟菌血清組wi35疾病。 51.如請求項45至50之用途或方法，其中該預防或治療係預 防或治療腦膜炎奈瑟菌血清組γ疾病。 、 52·種製造如凊求項1至41之免疫原性組合物或如請求項 42至44之疫苗之方法，其包括以下步驟··分離該u l〇s 及該L3 LOS，合併該^及。L〇s，以及用醫藥上可接 受之賦形劑調配該L2及L3 LOS。 、53. 一種包含奈瑟菌菌株之⑽L〇s之免疫原性、组合物於製 造預防或治療腦膜炎奈瑟菌^免疫型疾病之藥物之用 述：或-種包含奈瑟菌菌株之L2 L〇s之免疫原性組合物 於製造預防或治療腦膜炎奈瑟菌L3V免疫型疾病之藥物 之用途。 从-種治療或預防腦膜炎奈瑟扣免疫型疾病之方法，其 。括向而要之人類患者施與有效量之包含奈瑟菌菌株之 匕3V L0S之免疫原性組合物之步驟，或一種治療或預防 , 細膜X奈瑟菌L3V免疫型疾病之方法，其包括向需要之 人類患者施與有效量之包含奈瑟菌菌株之L2⑽之免疫 原性組合物之步驟。 月长員53或54之用途或方法，其中該L3V L〇s具有以 下結構： 121392.doc 200817034 Rl (β14) OIc —·--— Hep·夏—：一 (Pl-4) (al-5) on|(㈣ KBOl一一一一脂質 A _2-β)

   /' 其中： —GIcNsic — Gal — Cpl-4) (β1-3) 或 GrlcN^c —Gal — Rl= (陶） NeuNac — Gal 一 GlcNiic 一 Gal — (α2-3) (β!-4) (βΐ_3) R2=PEA， R3=PEA， R4=H或 OAc， R5=H、PEA或 Gly。 5 6.如請求項55之用途或方法，其中 或 GkNuc —Gal Rl= (βΐ-3) GnI 一 GlcN^c 一 G (PI-4) Cpl-3) NeuNiic — <^ίΐΙ — QkNuc — Gal - (a2-3) (pl-4j (βΐ-3) 〇 57.如請求項55或56之用途或方法，其中：R5=H、PEA或 Gly 〇 5 8.如請求項55至57之用途或方法，其中：R4=H或OAc。 121392.doc -12- 200817034 59.如請求項53或54之用途或方法，其中該L2 LOS具有以下 結構： R1 Φ14) KDOII |{α2^4) ~ ™ ®eP1 (~二一=-KBOI —-——二：脂質 A (〇α·5) (α2.

   R4 其中： GIcN^ic — Gal— Gil1 — GkNuc — Gal — Rl= (Pi-3) 、 （β ㈣ （陶） ，或 NeuNiic —Gal — GkNac — Gal — (α2-3) (β1-4) (βΐ-3) R2 = Glc， { ) R3=PEA， R4=H或 OAc， R5=H、PEA或 Gly。 ' 60.如請求項59之用途或方法，其中： GkN 魏€ — Gal 一 Gal — GkNac — Gal — Rl= (I31-3) 、 (PI-4) (Pl-3) ，或 (a2-l5 (pl>4) (pi.3) 。 61.如請求項59或60之用途或方法，其中：R5=H、PEA或 121392.doc -13 - 200817034 Gly 〇 62.如睛求項59至61之用途或方法，其中：r^h或〇 Ac。 63·如請求項53至62之用途或方法，其中該以乂或乙二二〇8結 合至蛋白質載體。 64. 如請求項53至63之用途或方法，其中L3V或L2 L〇s具有 一個去毒脂質A部分，例如缺少一個與自msbB(_)奈瑟菌 菌株分離之LOS—致的二級醯基鏈。 65. 如請求項53至64之用途或方法，其中L3V或L2 L〇s具有 一個去毒之脂質A部分，係經由與一種適於降低該L〇s 毋性之脂質A結合肽（諸如SAEP2或SAEPII)複合。 66·如請求項53至65之用途或方法，其中該L3v或L2 [〇§以 純化L0S製劑形式、以脂質體製劑形式或以泡製劑形式 存在於該免疫原性組合物中。 67.如請求項66之用途或方法，其中該泡製劑已於使用 、 0.02-0.4 、 0.04-0.3 、 〇 〇6_〇 2 、 〇 〇8〇 15 或 〇 〇9_ 0.11%清潔劑（較佳為脫氧膽酸鹽）之提取步驟後自其各別 奈瑟菌菌株分離。 .如請求項66或67之用途或方法，其中該泡製劑已自不能 合成莢膜多糖之奈瑟菌菌株分離。 •如請求項68之用途或方法，其中該奈瑟㈣株與衍生它 之天然菌株相比，具有表現下調且較佳缺失（無功能表 現）之以下莢膜多糖基因之一：_、⑽、咖、 CtrD、synA、，Β、sync 或較佳 siaD。 •如請求項66至69之用途或方法’其中該泡製劑已自 68 69 70 121392.doc •14- 200817034 瑟菌菌株分離，該奈瑟菌菌株與衍生它之天然菌株相 比，具有表現下調且較佳缺失（無功能表現）之以下脂質A 基因之一或兩者：msbB或htrB，較佳為前者。 121392.doc -15-