CN104602702B

CN104602702B - 外膜囊泡

Info

Publication number: CN104602702B
Application number: CN201380045396.5A
Authority: CN
Inventors: G·格兰迪; 伊若斯 I·马格里特; E·恰洛特
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: RU2015106917A; CN104602702A; EP2897635A1; EP4056198A2; JP6283674B2; JP2015535812A; MX363529B; US9764027B2; RU2662970C2; CA2882382A1; AU2013320313B2; MX2015002484A; WO2014044728A1; EP3400960A1; US20150231232A1; EP4056198A3; AU2013320313A1

Abstract

本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，该OMV包含在其腔中游离的至少一种异源蛋白，其中当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免疫应答。本发明还提供了用于制备本发明的OMV的方法，包含本发明的OMV的药物组合物，尤其是免疫原性组合物和疫苗，以及使用OMV在哺乳动物中产生抗体免疫应答的方法。

Description

外膜囊泡

本申请请求2012年9月18日提交的美国临时申请US61/702,296和2013年3月15日提交的美国临时申请US61/799,311的权益，这两项申请的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及来自革兰氏阴性细菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的异源蛋白。该囊泡特别有用于免疫原性组合物，例如疫苗。

背景技术

由于细胞被膜的膨压，革兰氏阴性菌可在其生长期间自发释放外膜囊泡(OMV)。可通过某些细菌组分的破坏来促进这类OMV的形成，例参考文献1和2中破坏了大肠杆菌Tol-Pal系统以得到在生长期间向培养基释放囊泡的菌株。也可通过破坏完整的细菌来产生OMV。已知的OMV生产方法包括使用去污剂处理(例如，用脱氧胆酸盐)[3和4]，无去污剂方法[5]或声处理[6]等的方法。

OMV在免疫原性细胞表面相关的、周质和分泌的抗原中富集，并且已经用作例如针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组B的疫苗[7]。它们特别适于该用途，因为囊泡含有发挥佐剂作用的化合物，这引发针对该抗原的强免疫应答。从而对于免疫系统而言，囊泡是比纯化的抗原性蛋白质或其他细菌组分更为接近的天然细菌模拟物。OMV因此保持疫苗和其他免疫原性组合物的更具吸引力的靶标。已经提出，通过使用ClyA作为融合伙伴对OMV进行工程改造以在OMV表面上呈现多种抗原能够增加一些蛋白质抗原的免疫原性[8]。

已经进行了多次尝试以使异源蛋白，尤其是异源抗原靶向OMV。然而，很大程度上因为与异源蛋白质向囊泡运输相关联的挑战，迄今为止，相对亲本细菌而言外来的抗原仍然在大部分OMV中显著缺失[11]。大多数使异源蛋白靶向OMV的尝试依赖于异源蛋白与整合膜蛋白的共价连接。这类共价连接的异源蛋白的示例包括FLAG表位与OmpA(外膜蛋白A)的全长序列的融合物、FLAG表位与PagP(PhoPQ-激活基因P)的全长序列的融合物[9]以及GFP与ClyA(溶细胞素)的融合物[10]。凭借它们与膜蛋白的共价连接，所得的融合蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。这些方法具有缺陷，尤其是由于难以在不对转化的细菌造成有害影响的情况下过表达大量的整合膜蛋白。

还已证明，难以使周质蛋白靶向OMV。GFP与Tat(双精氨酸转运体)信号序列的融合导致靶向周质的GFP的过表达，但是GFP荧光几乎没有超过OMV中的背景荧光水平[11]，表明GFP没有进入OMV中或者由于错误折叠而在OMV中没有功能。

仍然存在对开发适于在OMV中表达异源蛋白的方法，尤其是在OMV中表达抗原性蛋白质的方法的需求。也仍然存在对替代或改良的OMV(尤其用于疫苗)的需求。

发明内容

发明人已经发现使异源蛋白靶向OMV的腔克服了许多与使异源蛋白靶向OMV的膜相关的问题。令人惊讶地，发明人也已经发现当给予哺乳动物时，腔中含异源蛋白的OMV能够引发针对该蛋白质的免疫应答。

因此，本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，其中该OMV包含在其腔中游离的至少一种异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免疫应答。

本发明也提供了制备本发明的OMV的方法，该方法包括在革兰氏阴性细菌的周质中表达异源蛋白的步骤。本发明还提供通过该方法获得的或可通过该方法获得的OMV。

本发明也提供包括(a)本发明的OMV和(b)药学上可接受的运载体的药物组合物。

本发明也提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，该方法包括向该哺乳动物给予有效量的来自革兰氏阴性细菌的OMV，其中该OMV在其腔中包含至少一种异源蛋白，并且其中该免疫应答针对OMV中的异源蛋白。在本发明的这一方面的一些实施方式中，在OMV的腔中，该蛋白质是游离的。本发明也提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括向该哺乳动物给予本发明的药物组合物，其中该免疫应答针对OMV中的异源蛋白。

OMV

本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，其中该OMV包含在其腔中游离的至少一种异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免疫应答。

OMV为本领域所熟知并且由细菌自发分泌到培养基中。“天然OMV”(“NOMV”[12])、微囊泡(MV[13])、去污剂提取的OMV(DOMV)、突变体衍生的OMV(m-OMV)和小泡(其在以MV形式释放之前是与细菌保持连接的外膜凸起)([14]；[15])，全部属于本发明的部分并且在本文中统称为OMV蛋白。

可从任何合适的革兰氏阴性细菌中得到本发明的OMV。典型的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(E.coli)。然而，除了大肠杆菌，其可以是不同的革兰氏阴性细菌。本发明所用的优选的革兰氏阴性细菌包括在人体中非致病性的细菌。例如，该细菌可以在人体中是共生的。然而，在一些实施方式中，所用的细菌一般不在人类宿主中出现。本发明所用的示例性物种包括以下任何属中的物种：大肠杆菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、博德特菌属(Bordetella)、伯疏氏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、螺杆菌属(Helicobacter)、沙门菌属(Salmonella)、弧菌(Vibrio)等。具体地，细菌可以是志贺氏菌物种(如痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)或索氏志贺氏菌(S.sonnei))。或者，其可以是奈瑟氏球菌物种，尤其是非致病性物种，如杆状奈瑟氏球菌(N.bacilliformis)、灰色奈瑟氏球菌(N.cinerea)、长奈瑟氏球菌(N.elongata)、浅黄奈瑟氏球菌(N.flavescens)、乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)、恒河猴瑟氏球菌(N.macacae)、粘液瑟氏球菌(N.mucosa)、多糖瑟氏球菌(N.polysaccharea)、干燥瑟氏球菌(N.sicca)或微黄瑟氏球菌(N.subflava)，并且尤其是乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)。或者，可使用奈瑟氏球菌的致病物种，例如，淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)。在其他示例中，细菌可以是百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、山羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(包括不可分型菌株)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)(包括伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，以及副伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、变形杆菌(Proteus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌(Erwinia)、巴斯德氏菌(Pasteurella)等。也可使用光合型革兰氏阴性细菌。细菌一般是感受态菌株。该特征便于对细菌进行遗传修饰。

在一个具体实施方式中，所述革兰氏阴性细菌是该细菌的“高发泡”菌株。WO 02/062378中描述了在自然中更易于以较高产量产生较均匀小泡的高发泡革兰氏阴性细菌。例如，小泡可以衍生自选自下组的细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)。

在一个具体实施方式中，细菌是大肠杆菌ompA突变体和/或大肠杆菌tolR突变体。在一些实施方式中，细菌选自大肠杆菌BL21(DE3)ΔompA、大肠杆菌BL21(DE3)ΔompAΔtolR、大肠杆菌BL21(DE3)ΔtolR、大肠杆菌ΔnlpI或大肠杆菌ΔdegP。本文所用的Δ标记是指一种菌株，其中删除了在Δ标记之后所列基因的编码序列。因此，“ΔompA”的细菌菌株并不包含ompA基因的编码序列。同样，“ΔtolR”的细菌菌株并不包含tolR基因的编码序列。可以删除完整的编码序列。然而，可以替代性地部分删除所述编码序列。例如，可以删除N-末端的那一半或C-末端的那一半。或者，可以通过引入一个或多个取代和/或插入来对ompA和/或tolR基因进行突变。

大肠杆菌ΔtolR突变株和大肠杆菌ΔompA突变株相对于野生型大肠杆菌过量产生OMV。因此，ompA基因和/或Tol-Pal复合物的一个或多个组分的突变产生突变体细菌，该细菌产生与其相应的携带野生型ompA基因和/或Tol-Pal复合物的野生型菌株相比增多量的OMV。ompA是整合膜蛋白并且是大肠杆菌中外膜蛋白中丰度最大的。因此，令人惊讶地发现缺少OmpA蛋白的大肠杆菌是有活力的。事实上，根据Murakami等[16]，大肠杆菌ompA单一突变体不能促进囊泡释放。

异源蛋白

本发明的异源蛋白靶向并且在革兰氏阴性细菌的周质中表达，从而该异源蛋白在OMV的腔内。在一些实施方式中，在OMV的腔中，异源蛋白是游离的。

该蛋白可以是任意长度的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是直链或支链的，其可包含修饰的氨基酸并可被非氨基酸打断。该术语也包括经天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、其他糖基化、部分或完全去糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的蛋白质。蛋白质可以单链或结合链的形式出现。本发明内容中的蛋白质可以是天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖基化模式)。

本文使用的术语“异源”表示蛋白质来自与获得OMV的细菌物种不同的物种(异源生物体)。该蛋白质一般是来自与获得OMV的细菌属不同的病原体属的抗原。

在本发明的具体实施方式中，异源蛋白是可在受体中引发免疫应答的免疫原性蛋白质。在一个具体实施方式中，免疫原性蛋白质，并且因而异源蛋白，包含抗原或由抗原组成。该抗原可引发针对原生生物、细菌、病毒、真菌或任何其他病原体，包括多细胞病原体或寄生虫(或者在一些实施方式中针对变应原；并且在其它实施方式中针对肿瘤抗原)的免疫应答。所述免疫应答可包括抗体应答(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫应答。所述多肽抗原通常会引发免疫应答，所述免疫应答识别对应的细菌、病毒、真菌或寄生虫(或变应原或肿瘤)多肽，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位来引起识别细菌、病毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。所述抗原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、突起糖蛋白等。

在一些实施方式中，所述抗原引发针对下列细菌之一的免疫应答：

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)：可用的抗原包括，但不限于，膜蛋白如粘附素、自体转运蛋白、毒素、摄铁蛋白(iron acquisition proteins)、H因子结合蛋白(fHbp或741)、奈瑟氏球菌肝素结合抗原(NHBA或287)、NadA(或961)、953/936和脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B bp(fHbp)。三种有用多肽的组合公开于参考文献17中。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：有用的多肽抗原公开于参考文献18中。其包括但不限于RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰-己糖胺酶前体(spr0057)、spr0096、一般应激蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)：可用的抗原包括但不限于，参考文献19和20中公开的多肽，例如，GAS25-574，如GAS 25(SEQ ID：41、SEQ ID：42)、GAS40(SEQ ID：43、SEQ ID：44、SEQ ID：45、SEQ ID：46、SEQ ID：47、SEQ ID：48、SEQ ID：49、SEQ ID：50、SEQID：51、SEQ ID：52、SEQ ID：53、SEQ ID：54、SEQ ID：55、SEQ ID：56、SEQ ID：57、SEQ ID：58、SEQ ID：59、SEQ ID：60、SEQ ID：61、SEQ ID：62、SEQ ID：63、SEQ ID：64、SEQ ID：65、SEQ ID：66、SEQ ID：67、SEQ ID：68、SEQ ID：69、SEQ ID：70)、GAS57(SEQ ID：39、SEQ ID：40、SEQ ID：71、SEQ ID：72、SEQ ID：73、SEQ ID：74、SEQ ID：75)、88、23、99、97、24、5、208、193、67、64、101、205、268、68、189、165或201。

粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)：

百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：可用的百日咳抗原包括但不限于：无细胞或全细胞百日咳抗原、百日咳全毒素或类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳菌粘附素和凝集原2及3。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：可用的抗原包括但不限于：参考文献21中公开的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、esxAB、铁色素结合蛋白(sta006)和/或sta011脂蛋白。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)：典型的抗原是破伤风类毒素。

白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)：典型的抗原是白喉类毒素。

流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)：有用的抗原包括但不限于：参考文献22和23中公开的多肽。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)：可用的抗原包括但不限于，参考文献19中公开的多肽，如67、80、1523、3、328或211。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：可用的抗原包括但不限于：PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH-样、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG(例如参考文献24中公开的那些)。LcrE[25]和HtrA[26]是两种优选的抗原。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：可用的抗原包括但不限于：参考文献27中公开的多肽。

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)：有用的抗原包括但不限于CagA、VacA、NAP和/或脲酶[28]。

大肠杆菌(Escherichia coli)：可用的抗原包括但不限于：衍生自肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)的抗原。ExPEC株包括尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症相关的大肠杆菌(MNEC)。可用的UPEC多肽抗原在参考文献29和30中公开。可用的MNEC抗原在参考文献31中公开。多种大肠杆菌类型的可用抗原是AcfD[32]。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)：可用的抗原包括但不限于：参考文献33和34中公开的那些。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，例如，可从ATCC-31432、SE-360和SE-10菌株获得的I、II和/或III型荚膜多糖。

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或肉毒梭菌(Clostridiumbotulinums)

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)

伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetti)

布鲁氏菌(Brucella)例如流产布鲁氏菌(B.abortus)、犬氏布鲁氏菌(B.canis)、羊布鲁氏菌(B.melitensis)、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)、鳍脚类布鲁氏菌(B.pinnipediae)。

弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensi)。

淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)

苍白密螺旋体(Treponema pallidum)

杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitic)

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)

立克次体(Rickettsia)

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)

布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)

克雷伯菌(Klebsiella)

普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)

在一些实施方式中，抗原是来自衣原体(Chlamydia)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、志贺氏菌(Shigella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、奈瑟氏菌(Neisseria)或螺杆菌(Helicobacter)的抗原。

在一些实施方式中，所述抗原引发针对下列病毒之一的免疫应答：

正粘病毒(Orthomyxovirus)：可用的抗原可来自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血凝素、神经氨酸酶或基质M2蛋白。该抗原为甲型流感病毒血凝素时，其可来自任何亚型，例如来自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。

副粘病毒(Paramyxoviridae)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自肺炎病毒(Pneumovirus)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，RSV)、腮腺炎病毒(Rubulaviruses)(例如，流行性腮腺炎病毒(mumps virus))、副粘病毒(Paramyxoviruses)(例如，副流感病毒(parainfluenza virus))、偏肺病毒(Metapneumoviruses)和麻疹病毒(Morbilliviruses)(例如，麻疹病毒(measles virus))的那些。

痘病毒(Poxviridae)：病毒抗原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的抗原，包括但不限于重型天花(Variola major)和轻型天花(Variola minor)。

小核糖核酸病毒(Picornavirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒的抗原。在一个实施方式中，所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是EV71肠道病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是甲型或乙型柯萨奇病毒(coxsackie virus)。

布尼亚病毒(Bunyavirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒或内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热的抗原。

嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒抗原包括但不限于，衍生自嗜肝病毒的那些，如甲型肝炎病毒(HAV)(例如灭活的病毒)、乙型肝炎病毒(例如表面和/或芯抗原)或丙型肝炎病毒。

纤丝病毒(Filovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自纤丝病毒如埃博拉病毒(Ebola virus)(包括扎伊尔(Zaire)、象牙海岸(Ivory Coast)、莱斯顿(Reston)或苏丹(Sudan)纤丝病毒)或马尔堡病毒(Marburg virus)的那些。

披膜病毒(Togavirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自被膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒的抗原。其包括风疹病毒(rubella virus)。

黄病毒(Flavivirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自黄病毒，如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒的抗原。

瘟病毒(Pestivirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)的病毒抗原。

嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的抗原。组合物可包含乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。

其它肝炎病毒：组合物可包含来自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的抗原。

杆状病毒(Phabdovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自杆状病毒如恐水病病毒(Lyssavirus)(如狂犬病病毒(Rabies virus))和水泡病毒(VSV)的那些。狂犬病抗原的一个示例是冻干的灭活病毒。

杯状病毒(Caliciviridae)：病毒抗原包括但不限于：衍生自杯状病毒，如诺沃克病毒(Norwalk virus)(诺如病毒(Norovirus))和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些。

冠状病毒(Coronavirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自SARS冠状病毒(coronavirus)、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)的那些。该冠状病毒抗原可为突起多肽。

逆转录病毒(Retrovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自肿瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒(Spumavirus)，例如，gp120、gp140或gp160。

呼肠病毒(Reovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自正呼肠病毒(Orthoreovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、环状病毒(Orbivirus)或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)的那些。

细小病毒(Parvovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自细小病毒B19的那些。

疱疹病毒(Herpesvirus)：病毒抗原包括但不限于衍生自人疱疹病毒，如仅为示例的单纯疱疹病毒(HSV)(例如1和2型HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。

乳头状多瘤空泡病毒(Papovaviruses)：病毒抗原包括但不限于：衍生自乳头瘤病毒(Papillomavirus)和多瘤病毒(Polyomavirus)的那些。(人)乳头瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如来自血清型6、11、16和/或18的一种或多种。

腺病毒(Adenovirus)：病毒抗原包括但不限于：衍生自腺病毒血清型36(Ad-36)的那些。

在一些实施方式中，抗原引起的免疫应答针对感染鱼的病毒，如：传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA样病毒(又称为大西洋鲑鱼小RNA样病毒)、陆封鲑鱼病毒(LSV)、大西洋鲑鱼轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)、或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。

真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophyton floccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格尼毛癣菌(Trichophtton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，昆克毛癣菌(Trichophtton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白变种(var.album)、盘状变种(var.discoides)、赭黄变种(var.ochraceum)，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、肠间隔微孢子虫(Septata intestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的有短粒虫属(Btachiola spp.)、微孢子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaeaspp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰刀菌属(Fusariumspp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核盘菌属(Monoliniaspp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.)。

在一些实施方式中，所述抗原引起针对来自疟原虫属的寄生虫的免疫应答，所述寄生虫如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵圆疟原虫(P.ovale)。因此本发明可用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，所述抗原引起的免疫应答针对来自鱼虱科的寄生虫，特别是来自疮痂鱼虱属和鱼虱属的那些，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。

在一些实施方式中，该抗原引发针对以下物质的免疫应答：花粉变应原(树、草本、杂草和草花粉变应原)、昆虫或蜘蛛变应原(吸入、唾液和毒液变应原如螨虫变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)、动物毛发和皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)和食物变应原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉变应原是那些源自分类目壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木目的，包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，雪松(柳杉属和圆柏属)，法国梧桐(悬铃木)，禾本目包括黑麦属(Lolium)、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属(Secale)和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和欧蓍草属。其它重要的吸入变应原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。

在一些实施方式中，该抗原是选自下组的肿瘤抗原：(a)睾丸癌抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(例如，可用于检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(例如，与黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(例如，与黑色素瘤有关)、MUM1(例如，与黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(例如，与头颈癌有关)、CIA0205(例如，与膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(例如，与黑色素瘤有关)、TCR(例如，与T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-ab1(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过量表达抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，与结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(例如，与霍奇金病有关)、蛋白酶3(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(例如，与多种白血病有关)、碳酸酐酶(例如，与肾癌有关)、醛缩酶A(例如，与肺癌有关)、PRAME(例如，与黑色素瘤有关)、HER-2/neu(例如，与乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、乳腺珠蛋白(mammaglobin)、甲胎蛋白(例如，与肝细胞癌有关)、KSA(例如，与结直肠癌有关)、胃泌素(例如，与胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(例如，与乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(例如，与肾细胞癌有关)、p53(例如，与乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(例如，与乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如，与黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如与前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，该肿瘤抗原包括但不限于p15、Hom/Me1-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。

在其他具体实施方式中，异源蛋白是β-内酰胺酶(TEM1)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的fHbp、来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)、来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCep、或来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269。

当在其衍生的异源生物体中表达时，即当在其天然环境中存在时，异源蛋白可以是可溶蛋白、外周膜蛋白或整合膜蛋白。例如，如果异源蛋白衍生自革兰氏阴性细菌，其可以是天然革兰氏阴性细菌中的胞质、周质或膜相关蛋白。然而，当存在于OMV中时，异源蛋白在OMV的腔中，并且优选在OMV的腔中游离。因此，与野生型蛋白质相比，可以例如通过删除任何膜锚定物来对异源蛋白进行修饰。

术语OMV的“腔中”涵盖膜相关但并不在表面暴露的蛋白质和在OMV的腔中游离的蛋白质。在本发明中，异源蛋白在OMV的腔中一般是游离的。“腔中游离”表示异源蛋白并不与OMV的膜整合相联。与膜的整合相联描述了需要使用去污剂或其他非极性溶剂来使蛋白质与膜解离的那些蛋白质。用于与膜整合相联的膜锚定物的综述可参见参考文献35。在OMV的腔中游离的蛋白可通过非共价相互作用与膜或整合膜蛋白结合或可完全不与OMV的膜结合。例如，该蛋白质可与膜松散地或暂时性地结合，例如，通过与脂质双层和/或整合蛋白的疏水、电、离子和/或其他非共价相互作用。

异源蛋白在OMV的腔中，而不与膜结合且不暴露的一个优势在于，其可在体内受到保护免于蛋白酶降解。这种保护进而可导致更高效的B细胞活化。

在一个具体的实施方式中，异源蛋白是可溶性蛋白质。“可溶性蛋白质”表示蛋白质并不与脂质膜形成任何联接。可溶性蛋白质不含膜锚定物如肽跨膜结构域、其他肽膜锚定结构域或非肽膜锚定物如脂质。

当给予哺乳动物时，OMV能够引发针对异源蛋白的免疫应答。该免疫应答可以是细胞或体液免疫应答。该免疫应答一般是抗体应答。

在一个实施方式中，本发明的OMV能够引发针对病原体的免疫应答，该异源蛋白源自该病原体。例如，异源蛋白优选引发能中和病原体的感染和/或毒力的T-细胞免疫应答，该异源蛋白源自该病原体。因此，本发明使用的优选的异源蛋白是可在感兴趣的病原体感染后由细胞免疫系统识别的那些异源蛋白。更优选的是引发针对感兴趣的病原体的保护性T-细胞免疫应答的那些异源蛋白。

在一个实施方式中，本发明的OMV能够引发识别病原体的抗体，该异源蛋白源自该病原体。例如，异源蛋白优选引发能结合并优选中和病原体的感染和/或毒力的抗体，该异源蛋白源自该病原体。本发明使用的优选的异源蛋白是可在感兴趣的病原体感染后由抗血清识别的那些异源蛋白。更优选的是引发针对感兴趣的病原体的保护性免疫应答的那些异源蛋白。

在一些实施方式中，该异源蛋白在存在于OMV中时具有免疫原性，但是当以经纯化的形式给予时不具免疫原性。

在一些实施方式中，本发明的异源蛋白在OMV的腔中和/或从OMV的腔中释放后(例如，通过去污剂介导的OMV破坏)有功能活性。功能活性是异源蛋白正确折叠并且具有与其天然状态下的相同蛋白质基本相同的三级和四级结构的指标。“有功能活性”表示异源蛋白保留相同蛋白在其天然环境中(例如，在其来源生物体中)表达时至少一种生物活性的至少50％或更多。例如，如果其保留相同蛋白质在其天然环境中表达时至少一种生物活性的至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，则该异源蛋白可被认为有功能活性。

在异源蛋白包含或由野生型蛋白质或其变体的片段组成的实施方式中，该片段或变体可以有功能活性。“野生型蛋白质的片段”表示异源蛋白包含或由来自该野生型蛋白质的至少7个连续氨基酸组成。在一些实施方式中，该片段由来自野生型蛋白质的至少7、8、9、10、20、30、40个或更多氨基酸组成。该片段可由野生型蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多组成。

优选地，该片段是异源蛋白的免疫原性片段。“免疫原性片段”表示具有与异源蛋白共有的至少一个表位的片段。术语“表位”涵盖任何类型的表位并且包括B-细胞和T-细胞表位，以及线性和非连续表位。在一个实施方式中，特异性结合异源蛋白的抗体也特异性结合免疫原性片段，即含有抗体结合的表位的异源蛋白及其免疫原性片段。“特异性结合”指抗体与本发明异源蛋白结合的亲和性显著强于对BSA的亲和性。优选地，对于本发明的异源蛋白的亲和性比对于BSA强至少100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍等。

可使用本领域已知的任何方法确定和/或预测异源蛋白中存在的表位。例如，表位预测软件如EpiToolKit，其是用于计算分析免疫的网络服务器[36]。这种表位预测软件提供了用于预测MHC I类和MHC II类表位的潜在T-细胞表位的几种方法。

也可使用本领域中任何已知方法来预测B-细胞表位的存在，例如，如参考文献[37-39]所述。可使用本文所述的方法预测连续线性表位和/或非连续表位的存在。

“野生型蛋白质的变体”表示异源蛋白包含或由全长蛋白质组成，例如具有与野生型蛋白质相同数量的氨基酸的蛋白质，或与野生型序列相比含一个或多个差异的野生型蛋白质的片段。变体可具有与野生型蛋白质至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列相同性。在一些实施方式中，该变体也可具有功能活性。

异源蛋白可与融合伙伴融合，即，异源蛋白可以是融合蛋白的一部分。融合蛋白可包含序列-X-Y-或-Y-X-，其中：-X-是上述定义的异源蛋白，而-Y-是其他多肽序列。在一个具体的实施方式中，-Y-是辅助检测该异源蛋白的蛋白质标签，如6xHIS、FLAG、HA、GST、GFP或其他荧光蛋白、和/或荧光素酶或辅助异源蛋白的功能的任何合适的多肽。当异源蛋白是融合蛋白的一部分时，整个融合蛋白会在OMV的腔中。在一些实施方式中，融合蛋白在OMV的腔中是游离的。

本发明的OMV在OMV的腔中包含至少一种的异源蛋白。因此，OMV在OMV的腔中可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种异源蛋白，并且在OMV的腔中优选是游离的。除了在OMV的腔中的至少一种异源蛋白以外，本发明的OMV也可包含与OMV的膜结合的至少一种异源蛋白。例如，本发明的OMV可在OMV的腔中包含至少一种异源蛋白或与OMV的膜结合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种异源蛋白。

在一个具体实施方式中，该异源蛋白包括来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)和来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269。在另一个具体实施方式中，该异源蛋白包括来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)、来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCEP和来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269。

制备本发明的OMV的方法

本发明也提供了制备本发明的OMV的方法，该方法包括在革兰氏阴性细菌的周质中表达异源蛋白的步骤。

在一个具体实施方式中，使用表达载体在革兰氏阴性细菌的周质中表达异源蛋白，所述表达载体包含与周质蛋白的信号序列的编码核酸可操作连接的异源蛋白的编码核酸序列。

可通过将在周质和/或OMV中天然发现的蛋白质的信号序列与异源蛋白融合来实现异源蛋白的靶向。通过内膜并进入周质的蛋白质易位，例如，可伴随着以下三种途径中的一种：SecB-依赖性(SEC)、信号识别颗粒(SRP)或双精氨酸异位(TAT)。可使用任何这些途径。

可用于本发明的周质信号序列的一个示例是OmpA的信号序列。然而，其他可使用的可能的信号序列包括Tat信号序列和DsbA信号序列。可使用一系列载体来使向周质的输出最优化，这些载体各自靶向不同的输出途径。例如，可使用ACES信号序列表达载体[40]来优化异源蛋白向周质的易位。

在一些实施方式中，异源蛋白的天然信号序列被周质蛋白的信号序列取代。在其他实施方式中，异源蛋白与周质蛋白的信号序列融合而不取代可能存在的天然信号序列。

本发明的这一方面的具体实施方式包括使用表达载体，该表达载体包含与异源蛋白的编码核酸可操作连接的OmpA的信号序列的编码核酸序列，例如图1所示的pET-OmpA质粒。在该实施方式中，OmpA信号序列具有以下核苷酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC(SEQ ID NO：1)。在这一实施方式中，该质粒是pET21b-衍生的质粒。然而，也可使用本领域中已知的任何其他合适的质粒主链。合适的质粒主链包括pGEX、pUC19、pALTR、pET、pQE、pLEX、pHAT或能够在革兰氏阴性细菌中复制的任何其他质粒载体。

可以用上述的表达载体来转化能够产生OMV的任何革兰氏阴性细菌，例如本文所述的那些，为了产生在其腔中包含异源蛋白的OMV，并且优选在其腔中是游离的。

用于制备OMV的方法是本领域已知的，并且可以使用任何合适的方法来产生本发明的OMV。这些方法一般包括从细菌的培养基中获得囊泡的步骤。可通过破坏或从细菌的外膜起泡以从中形成囊泡来得到OMV。也可从细菌人工制备OMV，例如，通过来自“ΔGNA33”脑膜炎球菌的OMV的肌氨酰-提取，如参考文献41所述。天然“OMV”(“NOMV”[42])、微囊泡(MV[43])、去污剂提取的OMV(DOMV)、突变体衍生的OMV(m-OMV)和小泡(其在以MV释放之前是与细菌保持连接的外膜凸起)([44]；[45])，全部形成本发明的部分并且在本文中统称为OMV蛋白。

OMV(包括小泡、MV和NOMV)包括天然产生的膜囊泡，其在细菌生长时自发形成并释放到培养基中。优选地，本发明的OMV是天然产生的OMV，因为从培养基中分离自发释放的OMV比涉及外膜的有意破坏以产生人工诱发的OMV的方法(例如，通过去污剂处理或超声)更方便。此外，它们基本不含内膜和胞质污染。OMV一般在电子显微镜下具有35-120nm的直径，例如，50nm的直径并且可从培养基中纯化。纯化理想地包括从活的和/或完整的细菌中分离OMV，例如，通过使用过滤器，如0.22μm过滤器进行基于尺寸的过滤，其使得OMV通过但是不允许完整的细菌通过，或者通过使用低速离心以聚集细胞同时使小泡留在悬浮液中。参考文献46中描述了涉及两步尺寸过滤过程的方法。

因此，与培养基不同，本发明的含OMV的组合物一般不含完整的细菌，无论是活的还是死的。OMV的尺寸表明它们可易于通过过滤，例如一般用于过滤灭菌的那种方法与完整的细菌分离。虽然，OMV会通过标准0.22μm过滤器，但是这些过滤器由于其他材料而迅速堵塞，因此可进行在使用0.22μm过滤器之前通过使用减小孔径的一系列过滤器的过滤灭菌的连续步骤。前述过滤器的示例是具有0.8μm、0.45μm等的孔径的那些过滤器。

在另一个实施方式中，可从细菌人工制备OMV，且可以利用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐或肌氨酰)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献47)制备OMV。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[48和49]处理奈瑟氏球菌)在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[50]处理细菌。其它技术基本可以在没有去污剂存在的情况下[47]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、法式压制、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[47]。因此一种方法可以使用含有脱氧胆酸盐浓度约0.5％或更低如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0的OMV提取缓冲液。

参考文献51描述了一种制备OMV的有用过程，涉及对粗OMV进行超滤，而非代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。

本发明还提供通过上述方法获得的或可通过上述方法获得的OMV。

药物组合物

本发明提供包括(a)本发明的OMV和(b)药学上可接受的运载体的药物组合物。本发明也提供了用于制备这样的组合物的方法，所述方法包括将本发明的OMV与药学上可接受的运载体混合的步骤。

本发明也提供了用本发明的药物组合物预填充的容器(例如，瓶)或递送装置(例如，注射器)。本发明也提供了用于提供这种容器或装置的方法，包括将本发明的含囊泡的组合物导入该容器或装置中。

所述免疫原性组合物可包括药学上可接受的载体，其可以是本身不会诱导产生对接受所述组合物的患者有害的抗体的任何物质，且可以实现无异常毒性的给药。药学上可接受的载体可以包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质也可以存在于该类载体中，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于合适运载体的充分讨论见参考文献52。

细菌可影响机体的各个部分，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式。所述组合物可以制备成局部制剂，例如油膏、乳膏或粉末。所述组合物可以制备成口服制剂，例如，片剂或胶囊，或糖浆(任选调味)。所述组合物可以制备成使用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。所述组合物可制备为栓剂或子宫托。所述组合物可以制成鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。

一种药学运载体可包括温度保护剂，此种组分可能在含佐剂组合物(特别是含有矿物质佐剂，如含铝盐的组合物)中特别有用。如参考文献53所述，可将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其凝固点，例如将凝固点降低至0℃以下。因此该组合物可以储存于0℃以下但在其凝固点以上，以抑制热裂解。温度保护剂也允许冷冻该组合物，同时保护矿物盐佐剂在冻融后不发生团聚或沉降，还可在较高温度，例如40℃以上保护该组合物。可混合初始的水性疫苗与液体温度保护剂使液体温度保护剂占最终混合物体积的1-80％。合适的温度保护剂应该是对人体给药安全的、易于混溶/可溶于水的、并且不应损害组合物的其他成分(如抗原和佐剂)。示例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG的平均分子量可为200-20,000Da。在优选实施方式中，聚乙二醇的平均分子量可以约为300Da(“PEG-300”)。

组合物优选是无菌的。其优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如pH 6-pH8，通常为约pH 7。本发明的组合物可以与人体等张。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原性囊泡，以及任何所需的其它特定组分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。

以前有关囊泡疫苗(例如，针对脑膜炎球菌)的工作为本发明的组合物提供了药学、生理学和制剂方面的指南。本发明组合物中囊泡浓度通常为10至500μg/ml，优选为25至200μg/ml，更优选为约50μg/ml或约100μg/ml(以囊泡中的总蛋白质表示)。一般用于注射的剂量体积为0.5ml。

所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。

可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

适用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献57的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒。

称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)表示的羟基氧化铝与其它铝化合物如氢氧化铝Al(OH)₃相区分，具体区别是1070cm^-1处存在吸收条带和3090-3100cm^-1处存在强肩[参考文献57的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示较强的吸附抗原能力。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力为每mg Al⁺⁺⁺1.8-2.6mg蛋白质。

称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中PO₄/Al摩尔比通常在0.3-1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1处的红外光谱条带(例如，在200℃下)表明存在结构性羟基[参考文献57的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3～1.2，优选为0.8～1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5mg蛋白质/mg Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0至7.0，更优选为5.0至6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以但不必需，含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。所述悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。所述悬浮液也可含有氯化钠。

在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选的范围是0.3至1mg/ml。优选最大值＜0.85mg/剂。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献57的第10章；也参见参考文献54](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

已知各种合适的水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，有利地乳液包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

本发明可使用例如来源于动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选的油是生育酚(参见下文)。包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，诸如吐温80等去污剂可提供下文实施例所见的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是适用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为“MF59”[54-56]，参考文献57的第10章和参考文献58的第12章更详细地描述了该佐剂。该MF59乳液优选包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲剂。

·包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，且鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。鲨烯和吐温80存在的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过下述方法制备一该乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后微流体化该混合物。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括由抗原对这些组分造成的影响。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。

·角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克(Pluronic)^TM L121”)的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP一起用于“SAF-I”佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％PluronicL121和0.2％聚山梨酸酯80)中[59]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)[60]。优选微流体化。

·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或“司盘80”)的乳液。所述乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[61]。所述乳液也可含有一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基糖苷。这类乳液可进行冻干。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献62所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献63所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[64]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[64]。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[65]。

通常在传递给病人时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产时或在递送时将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中佐剂和抗原可以分开保存，当使用时可以配制成最终制剂。所述抗原通常采用水溶液形式，从而最终通过混合两种液体而制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常为约1∶1。

C.皂苷制剂[参考文献57的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定纯化组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献66。皂苷制剂也可以包含甾醇，如胆固醇[67]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献57第23章，还参见参考文献68和69]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。任选地，ISCOM可以不含额外去污剂[70]。

关于开发基于皂苷的佐剂的综述可以参见参考文献71和72。

D.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。

3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献73中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[73]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[74，75]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌，如OM-174的脂质A衍生物。例如参考文献76和77中描述了OM-174。

适用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链。参考文献78、79和80公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献81-86中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

所述CpG序列可以导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[87]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。参考文献88-90中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献91-93。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31^TM[94-96]。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5′-(IC)₁₃-3′(SEQ ID NO：2)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：3)的肽。这种SEQ ID NO：6和7的组合得到IC-31^TM佐剂。

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选该蛋白质获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)菌。参考文献97中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献98中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献99-106中描述了ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途。一种有用的CT突变体是CT-E29H[107]。优选基于参考文献108中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对对氨基酸取代进行编号，特别通过引用将其全文纳入本文。

E.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[109]等)[110]，干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

F.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[111]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[112]。

G.微颗粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径约100nm至约150μm，更优选约200nm至约30μm，最优选约500nm至约10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-共-乙交酯共聚物)，并任选经处理而具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。

H.脂质体(参考文献57的第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的示例参见参考文献113-115所述。

I.咪唑并喹诺酮化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的示例包括咪喹莫特及其同系物(例如，“雷西莫特3M”)，见参考文献116和117中的进一步描述。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳液[118]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[119]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[120]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[121]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普流罗尼-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化形成亚微米乳液或涡旋产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献57的第7章。

可用氢氧化铝佐剂，抗原一般吸附在该盐上。还优选具有包含鲨烯，具有亚微米油滴的水包油乳液是优选的，尤其是在年长者中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和铝盐，或雷西莫特和铝盐。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。

免疫

除提供上述免疫原性组合物外，本发明还提供一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将本发明的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。该免疫应答一般是抗体应答。该抗体应答优选地为保护性抗体应答。本发明也提供这类方法中所用的本发明组合物。

本发明还提供了一种保护哺乳动物免受细菌感染和/或疾病的方法，包含将本发明的免疫原性组合物给予该哺乳动物。

本发明提供用作药物(例如，用作免疫原性组合物或疫苗)的本发明组合物。本发明还提供本发明的OMV在制备预防哺乳动物中细菌感染的药物中的用途。

所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选是儿童。当预防性使用疫苗时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。意图用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。

治疗性措施的功效可以通过在给予本发明中的组合物后对细菌感染进行监测来测试。可通过监测在施用组合物后针对囊泡中的免疫原性蛋白质或其它抗原的免疫应答来测试预防性治疗的效力。本发明的组合物的免疫原性可通过以下方法测定：将它们给予受试对象(如12-16个月的儿童)，然后测定标准血清学参数。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。给予一剂以上的组合物时，可以进行超过一次的给药后测定。

本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选肌肉内给予到大腿或上臂。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。通常的肌肉内剂量为约0.5ml。

本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可采用单剂方案或多剂方案。多剂可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时机。

概述

术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。

优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分＝12且缺口延伸罚分＝1。

附图说明

图1显示了pET-OmpA质粒的图谱，其是pET21b-衍生的质粒，该质粒含有与编码异源蛋白的感兴趣的基因(GOI)融合的大肠杆菌OmpA信号序列(SS)的编码核酸序列。OmpA LS将由GOI编码的蛋白质靶向进入OMV的腔中。

图2显示了用1mM IPTG诱导之前和之后培养基的总裂解物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。由箭头指出对应于SpyCEP、Slo、Bla、fHbp和Spy0269的条带。

图3显示了对通过对转化的ΔltolR和ΔompA菌株的培养基上清进行超速离心制备的30μg OMV的SDS-PAGE。箭头指出了对应于SpyCEP、Slo、Bla和fHbp的重量的条带。

图4显示了Slo(A)和SpyCEP(B)的Western印迹的结果。还加载的空OMV作为阴性对照。比较化学发光信号与来自已知量的纯化蛋白质的那些化学发光信号，证明30μg的OMV含有大约240ng Slo-dm、240ng SpyCEP。

图5显示了Bla(A)和fHbp(B)的Western印迹的结果。还加载的空OMV作为阴性对照。比较化学发光信号与来自已知量的纯化蛋白质的那些化学发光信号，证明30μg的OMV含有大约240ng Bla。

图6显示了Western印迹，其显示了Slo和SpyCEP表达成OMV的发光组分，而不与它们的胞外表面相连。向表达Slo或SpyCEP的15μg完整和溶解的(在1％SDS中)囊泡中加入100μg/ml的蛋白酶K并且在37℃下孵育10分钟。通过Western印迹分析来检测蛋白质降解。

图7显示了Western印迹，其显示Bla表达成OMV的发光组分，而不与它们的胞外表面相连。向表达Bla的15μg完整和溶解的(在1％SDS中)OMV中加入100μg/ml的蛋白酶K并且在37℃下孵育10分钟。通过Western印迹分析来检测蛋白质降解。

图8A显示了含SpyCEP的OMV的SpyCEP活性，其已经用0.5％曲通X-100溶解。在37℃下，不同浓度的表达SpyCep蛋白的OMV与50μg/mlIL-8孵育2小时。10μg/ml的SpyCep野生型蛋白质被用作阳性对照并且通过SDS-PAGE分析IL-8的水解。

图8B显示了含SpyCEP的OMV的SpyCEP活性，其已经用1％曲通X-100溶解。在37℃下，不同浓度的表达SpyCep蛋白的OMV与50μg/mlIL-8孵育2小时。10μg/ml的SpyCep野生型蛋白质被用作阳性对照并且通过SDS-PAGE分析IL-8的水解。

图9A新暗示了含Bla的OMV和空OMV的Bla活性。在37℃下，使OMV制备物与头孢硝噻吩(0.5mg/ml；Oxoid，英国剑桥的热科学公司(Thermo Scientific))避光孵育30分钟。用Tecan分光光度计在OD₄₈₅下立即测定发色团水解和上清的后续颜色变化。使用标准曲线来估计酶活性，其中OD₄₈₅与水解的头孢硝噻吩的量相关。使用重组β-内酰胺酶(VWR)来对此进行定量。

图9B显示了野生型(wt)含Slo的OMV和空OMV在与绵羊血红细胞孵育时的溶血活性，表示为用OMV孵育的血液的吸光度(OD 540nm)与用水孵育的血液(100％溶血)的吸光度之比。

图10显示了在第三次免疫(第49天)后从各免疫组的8只小鼠得到的ELISA效价的几何平均数。

图11显示了在100ng的重组SpyCEP和三次免疫后(3次后)收集的不同稀释度的免疫血清存在下由ELISA试验测定的未切割的IL-8的百分比量。

图12A显示了在100ng的重组SpyCEP和两次免疫后(2次后)收集的不同稀释度的免疫血清存在下由ELISA试验测定的未切割的IL-8的百分比量。

图12B显示了在重组SpyCEP或用含SpyCep的OMV或空OMV和SpyCep两次免疫后(post 2)收集的不同稀释度的免疫血清存在下由ELISA试验测定的未切割的IL-8的百分比量。PBS用作阴性对照。

图13显示了在用重组Slo(作为阳性对照)或用经工程改造的含Slo的OMV(OMV-Slo)免疫的小鼠中收集的不同稀释度的免疫血清存在下的溶血百分比量。

图14显示了用携带Slo和SpyCEP的OMV免疫的8只小鼠的样品的存活曲线，该OMV在吸收至铝盐之前经超声或经未超声。用吸收至铝盐的重组Slo和SpyCEP免疫的小鼠的存活曲线用作对照。

图15A显示了pET-slo+spy0269质粒的图谱。

图15B显示了pET-slo+spy0269+spycep9质粒的图谱。

图16A显示了Western印迹，其显示了在用IPTG诱导之后从双顺反子和三顺反子构建体表达的全部蛋白质。

图16B显示了Western印迹，其显示了Slo和Spy0269蛋白都表达并存在于OMV中。

具体实施方式

实施例1-异源蛋白表达进入大肠杆菌OMV

大肠杆菌BL21(DE3)ΔtolR和ΔompA ko突变体的产生

通过使用高度精通的同源重组系统(红色操纵子(red operon))[122]来产生易于重组的BL21(DE3)细胞。简而言之，用5μg的pAJD434质粒通过电穿孔(2.5kV下5.9ms)来转化电感受态细菌细胞。然后使细菌在37℃下在1ml的SOC肉汤中生长1小时，然后接种在含甲氧苄啶(100μg/ml)的LB培养基上。通过向培养基中加入0.2％的L-阿拉伯糖来诱导由pAJD434携带的红色基因的表达。

通过分别用卡那霉素(kmr)和氯霉素(cmr)抗性盒取代ompA和tolR编码序列来产生已知自发产生大量的OMV的ΔtolR和ΔompA大肠杆菌BL21突变株。使用三步PCR方案来分别将ompA和tolR的上游和下游区域与kmr和cmr基因融合。简而言之，分别使用特定引物对tolR-1/tolR-2和tolR-3/tolR-4；ompA-1/ompA-2和ompA-3/ompA-4(表1)从BL21(DE3)基因组DNA扩增tolR和ompA基因的上游和下游区域。使用引物PUC4K-rev和PUC4K-for从质粒pUC4K中扩增kmr盒并且使用引物CMR-for/CMR-rev扩增cmr。最后，100ng的三种经扩增的片段中的每一种通过在含1/4引物的PCR中混合而融合在一起。

采用其中抗生素抗性基因侧接tolR/ompA的上游和下游区域的线性片段来转化易于重组的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其通过在冷水中洗涤3次制成电感受态。转化通过在2.5kV下5.9ms的电穿孔进行。通过将细胞接种在含30μg/ml卡那霉素或20μg/ml氯霉素的LB平板上来筛选转化子。通过使用引物对tolR-1/PUC4K-rev和PUC4K-for/tolR-4；ompA-1/CMR-rev和CMR-for/ompA-4的基因组DNA的PCR-扩增来确认tolR和ompA基因的删除。

表1

寡核苷酸引物：

名称	序列	SEQ ID NO
			GAS25-F	ACCGTAGCGCAGGCCAACAAACAAAACACTGCTAG	4
GAS25-R	GTGATGGTGATGTTACTACTTATAAGTAATCGAACC	5
			SpyCEP-F3	ACCGTAGCGCAGGCCGCAGCAGATGAGCTAAGCAC	6
SpyCEP-R3	GTGATGGTGATGTTATTAGGCTTTTGCTGTTGCTGA	7
			Bla-omp-F	ACCGTAGCGCAGGCCCGGTAAGATCCTTGAGATTTT	8
Bla-omp-R	GTGATGGTGATGTTATTACCAATGCTTAATCAGTGA	9
			fHbp-F	ACCGTAGCGCAGGCCGTCGCCGCCGACATCG	10
fHbp-R	GTGATGGTGATGTTATTATTGCTTGGCGGCAAGGC	11
			omprev	GGCCTGCGCTACGGTAGCGAAA	12
nohisflag	TAACATCACCATCACCATCACGATTACAAAGA	13
			tolR-l	TCTGGAATCGAACTCTCTCG	14
tolR-2	ATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATGGCTTACCCC	15
			tolR-3	TTCACGAGGCAGACCTCATAAACATCTGCGTTTCCC	16
tolR-4	TTGCTTCTGCTTTAACTCGG	17
			ompA-1	GATCGGTTGGTTGGCAGAT	18
ompA-2	CACCAGGATTTATTTATTCTGCGTTTTTGCGCCTCG	19
			ompA-3	TACTGCGATGAGTGGCAGGCGCAGGCTTAAGTTCT	20
ompA-4	AAAATCTTGAAAGCGGTTGG	21
			PUC4K-rev	AAAGCCACGTTGTGTCTC	22
PUC4K-for	TGAGGTCTGCCTCGTGAA	23
			CMR-for	CGCAGAATAAATAAATCCTGGTG	24
CMR-rev	CCTGCCACTCATCGCAGTA	25
			Spy0269-F	ACCGTAGCGCAGGCCGATGATAGAGCCTCAGGAGA	26
Spy0269-R	GTGATGGTGATGTTATCACTTAGATTCCTTACGGAA	27
			Spy0269-fus	GATTACTTATAAGTAGAGAAGGAGATATACATATG	28
Slo-fus-F	AACAAACAAAACACTGCTAGTACAG	29
			Slo-fus-R3	TATACTCCTTCTCTACTTATAAGTAATCGAACCATA	30
Spy0269-fus	TCACTTAGATTCCTTACGGAACC	31

Spycep-fus-

AAGGAATCTAAGTGAGAAGGAGATATACATATGAA

32

实施例2-质粒构建

选择来自革兰氏阳性和革兰氏阴性的不同细菌物种并且属于不同细胞区室的5种异源蛋白作为模型蛋白以确定异源蛋白是否能够以其天然构型进入大肠杆菌OMV。这些蛋白质包括：(1)来自大肠杆菌的周质TEM1β-内酰胺酶(Bla)、(2)来自脑膜炎奈瑟氏球菌的H因子结合蛋白(fHbp)脂蛋白、(3)来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O(Slo，也称为GAS25)、(4)来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCep(也称为GAS57)和(5)来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269(也称为GAS40)。使用聚合酶不完全引物延伸(PIPE)克隆方法[123]将这5种蛋白质各自的核酸编码序列克隆到pET-OmpA质粒中。pET-OmpA质粒(也在例如[124]和[125]中提供)是pET21b-衍生的质粒。

简而言之，使用GAS25-F/GAS25-R引物(参见表1)从含有slo-dm基因的pET21-Slo-dm质粒中PCR-扩增Slo-dm(slo双突变体，SEQ ID：42)。使用SpyCEP-F3/SpyCEP-R3引物从M1GAS菌株ISS3348中PCR-扩增SpyCEP基因(也以SEQ ID：40提供的双突变体序列)，该引物设计为排除C-末端LPXTG基序细胞壁锚定物(位于氨基酸1614-1647)。使用spy0269-F/spy0269-R引物从M1GAS菌株ISS3348中PCR扩增spy0269(SEQ ID：44)基因。用于fHbp基因扩增的引物设计排除脂盒(其位于fHbp的氨基酸17-25处)以避免膜锚定。为了使蛋白质靶向周质，去除分别编码这些蛋白质的信号序列的序列并用大肠杆菌OmpA信号序列(SS)取而代之(参见图1)。分别使用引物Bla-omp-F/Bla-omp-R和fHbp-F/fHbp-R分别从pET21b和脑膜炎奈瑟氏球菌MC58基因组中扩增Bla和fHbp。使用引物omprev/nohisflag通过PCR扩增pET-OmpA质粒。通过这种方式产生质粒pET-21_Bla(SEQ ID：37)、pET-21_slo(SEQ ID：33)、pET-21_SpyCEP(SEQ ID：34)、pET-21_fHbp(SEQ ID：36)和pET21_spy0269(SEQ ID：35)。

实施例3-异源蛋白表达进入ΔtolR和ΔompA突变体、OMV和总裂解物制备物

为了研究Bla、slo、SpyCEP、fHbp和Spy0269蛋白是否包装到OMV中，用pET-21_Bla、pET-21_slo、pET-21_SpyCEP、pET-21_fHbp质粒和pET21_spy0269转化ΔtolR和ΔompA大肠杆菌BL21菌株。作为阴性对照，用pET-OmpA空载体来转化ΔtolR和ΔompA大肠杆菌BL21菌株。

使所有的菌株在液体培养基中生长至对数期并且通过加入1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)来进行基因的诱导表达。图2显示了用1mM IPTG诱导之前和之后这些培养基的总裂解物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在所有经诱导的样品中存在对应于Bla、slo、SpyCEP、fHbp和Spy0269蛋白的条带并且由箭头指出。因此，在大肠杆菌中成功地诱导了所有5种测试的异源蛋白。

使用各转化子的过夜培养物，200ml的LB培养基在OD₆₀₀＝0.05下孵育。培养物生长直至OD₆₀₀＝0.5并且然后通过加入1mM IPTG来诱导重组蛋白的表达，之后另孵育2小时。对于OMV制备物，通过在8,000x g下离心20分钟来收获细胞。所得的上清经过滤通过0.22μm孔径的过滤器(密理博(Millipore))。然后滤液经过高速离心(200,000x g持续2小时)并且在含蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的PBS中重悬含OMV的团块。对于小鼠免疫，当显示时，OMV在低渗缓冲液(10mM Tris pH 7.5，1.5mM MgCl₂，10mM KCl)中超声处理(每30秒中10次脉冲)，之后在冰上冷却。从1ml的培养物中制备总裂解物，其在13,000x g下离心5分钟。团块在SDS-PAGE上样缓冲液中重悬，在100℃下加热5分钟并且加载在4-12％聚丙烯酰胺胶(英杰公司(Invitrogen))上。胶在MES缓冲液(英杰公司)中跑动并且用考马斯亮蓝染色。图3显示了从ΔtolR和ΔompA菌株中得到的约30μg OMV的聚丙烯酰胺凝胶，该菌株含有表达不同异源蛋白的质粒。箭头指出了对应于SpyCEP、Slo、Bla和fHbp的重量的条带。为了鉴定蛋白质，将条带切下并用胰蛋白酶消化，并且然后通过基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析所得的蛋白质水解肽。

简而言之，从凝胶中切下蛋白质条带，用50mM的碳酸氢铵-乙腈(50/50，体积/体积)洗涤，并用空气干燥。在37℃下在12μl的5mM碳酸氢铵中的0.012-μg/μl测序级修饰的胰蛋白酶(测序级修饰的胰蛋白酶；威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega))中消化经干燥的斑点2小时。在消化后，在矩阵-预点样的(matrix-prespotted)锚芯片(Anchorchip)(PAC 384HCCA；德国不莱梅的Bruker-Daltonics公司)上加载0.6μl的经消化的产物并经空气干燥。用0.6μl的含70％乙醇和0.1％三氟乙酸的溶液洗涤斑点。用ultraflex MALDI-TOF质谱仪(Bruker-Daltonics公司)得到质谱。通过使用PAC芯片(Bruker-Daltonics公司)上存在的标准品的组合来对图谱进行外部校准。使用MASCOT软件(英国伦敦的矩阵科学公司(Matrix Sciences))的许可版本自动进行单一同位素的肽匹配和蛋白质检索。使用的MASCOT检索参数如下：(i)允许的错误切割数量＝1；(ii)可变翻译后修饰＝甲硫氨酸氧化；和(iii)肽容限＝100ppm。只考虑由MASCOT可能性分析定义的显著命中。MASCOT软件分别鉴定了对应于Bla、Slo、SpyCEP和fHbp蛋白的条带。这些结果证明Bla、Slo、SpyCEP和fHbp都能被表达并进入由ΔtolR和ΔompA大肠杆菌菌株产生的OMV中。

实施例4-进入OMV的异源蛋白的定量

为了对进入大肠杆菌OMV的异源蛋白的量进行定量，进行了Western印迹分析。

30μg的含异源蛋白的OMV与递增浓度(20-80ng)的对应的纯化的蛋白质一起加载到4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。也加载的空OMV作为阴性对照。然后通过标准方法[126]将聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素滤纸上。通过在4℃下在封闭液(PBS中10％脱脂牛奶和0.05％吐温)中过夜搅拌封闭滤纸，之后在37℃下与在含3％脱脂牛奶和0.05％吐温的PBS中以1∶1000稀释的需要的抗体血清(抗-Bla(阿柏堪穆公司(Abcam))、抗-slo、抗-SpyCEP和抗-fHbp)孵育90分钟。在PBS-吐温中进行三次洗涤步骤之后，滤纸与在含3％脱脂牛奶和0.05％吐温的PBS中以1∶2000稀释的过氧化氢酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白(Dako公司)孵育1小时，并且进行三次洗涤步骤之后，通过使用SuperSignal West Pico化学发光底物(皮尔斯公司(Pierce))来检测所得的信号。

图4和图5显示了来自进行的4个不同的Western印迹的结果。如从MALDI-TOF中所期望，所有的OMV制剂含有所选的异源蛋白。比较化学发光信号与来自已知量的纯化蛋白的那些化学发光信号，证明30μg的OMV含有大约240ng的Slo、SpyCEP和Bla。

实施例5-异源蛋白位于OMV周质中

如上所述，所有4种异源蛋白的信号序列被大肠杆菌OmpA信号序列取代以使蛋白质靶向大肠杆菌周质。因此，重要的是证明蛋白质被表达为OMV的腔内组分而不是与OMV的胞外表面结合。

为了对此进行测试，向表达Slo-dm或SpyCEP的完整和溶解的(在1％SDS中)15μgOMV中加入100μg/ml蛋白酶K(Fermentas公司)，然后将混合物在37℃下孵育10分钟。在用10mM苯甲基磺酰氟(PMSF；西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))使蛋白酶K失活之后，将样品加载到4-12％聚丙烯酰胺凝胶上并用所需的抗体进行Western印迹分析来检测异源蛋白的存在。

图6和图7显示了在未溶解的OMV(但不在溶解的OMV)中Slo-dm、SpyCEP和Bla全部受到保护而免受蛋白酶K-介导的降解，这证明了它们在大肠杆菌OMV的腔中都表达成周质蛋白。

实施例6-含SpyCEP的OMV能够水解IL-8

已经报道SpyCEP水解IL-8，将其转化成6-kDa的无活性片段[127]。为了确定SpyCEP是否在OMV制剂中保留其水解活性，使表达SpyCEP的OMV在37℃下在不同浓度下与人IL-8(50μg/ml)孵育2小时。使用SpyCEP野生型蛋白(在10μg/ml的浓度下)作为阳性对照。IL-8与作为阳性对照的10ng/ml GAS57纯化的质蛋白(其已知水解IL-8)孵育。使用18％SDS-PAGE和银染分析水解产物。为了测试SpyCEP蛋白的活性形式是否位于OMV中，通过在室温下将OMV在0.5％曲通X-100中通透20分钟来诱导从OMV腔中泄漏SpyCEP(参见图8)。进行使用1％曲通X-100对OMV通透的另一个实验(参见图8B)。

如图8A和8B所示，在与30μg含SpyCEP的OMV孵育2小时后，IL-8几乎被完全切割。因此，在OMV中保留了SpyCEP的生物活性。功能活性的保留表明异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的结构表位。IL-8水解活性在经通透的OMV中增加，表明SpyCEp的活性形式位于OMV内。功能活性的保留表明异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的抗原。

实施例7-含Bla和Slo的OMV

表达Bla的OMV与发色底物头孢硝噻吩孵育并且如本文所述测量Bla活性。在37℃下，使OMV制备物与头孢硝噻吩(0.5mg/ml；Oxoid，英国剑桥的热科学公司)避光孵育30分钟。用Tecan分光光度计在OD₄₈₅下立即测定发色团水解和上清液的后续颜色变化。使用标准曲线来估计酶活性，其中OD₄₈₅与水解的头孢硝噻吩的量相关。使用重组β-内酰胺酶(VWR)来对此进行定量。

图9A显示空OMV没有显示出Bla活性，而在含Bla的OMV中显示出Bla活性。因此，在OMV中保留了Bla的生物活性。

为了测试Bla的活性形式是否位于OMV中，通过在室温下使OMV在1％曲通X-100中通透20分钟来诱导从OMV腔中泄漏Bla。如图9A所示，Bla活性在经通透的OMV中增加，表明Bla的活性形式位于OMV内。

通过使用以下的方法将表达野生型(wt)形式的毒素的OMV与绵羊血红细胞孵育来测试Slo溶血活性。采用PBS+0.5％BSA作为稀释缓冲剂在具有U型底部的96孔板中制备样品的连续稀释物。用PBS将1ml绵羊血液洗涤三次(在3000x g下离心)，最后将血细胞悬浮在5ml PBS中。向50μl的各稀释样品中加入50μl的这种悬浮液并且在37℃下孵育30分钟。用水产生100％溶血作用，并且将PBS+BSA 0.5％用作阴性对照。然后将孔板在1000x g下离心5分钟，并且小心将上清液转移到96孔平底板中以在540nm下读取吸光度[128]。

如图9B所示，阴性对照空OMV显示没有溶血活性，而含Slo-wt的OMV显示出高水平的溶血活性，这依赖于存在的OMV的量。因此，在OMV中保留了Slo的生物活性。Slo和Bla的功能活性的保留表明这些异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的抗原。

实施例8-用工程改造的OMV中的Slo和SpyCEP免疫的小鼠中引发的抗体效价

为了检测大肠杆菌OMV中的Slo和SpyCEP的免疫原性，在第0、21和35天用25μg经超声或未经超声处理的过表达Slo或SpyCEP蛋白的OMV腹膜内免疫一组8只CD15-周龄的雌性小鼠。所有的样品都用2mg/ml氢氧化铝作为佐剂配制。用PBS和佐剂来免疫对照小鼠。由用20μg重组的纯化的Slo或SpyCEP蛋白免疫的小鼠组成阳性对照组。为了测试OMV佐剂特性，也用25μg空OMV或25μg空OMV加20μg的Slo或SpyCEP抗原来免疫小鼠。

在第一次免疫之前(免疫前血清)并且在3次免疫中的每次之后(1次后、2次后和3次后)收集血清，并且分析ELISA效价。使用分别由PBS中的3μg/ml或2μg/ml的Slo或SpyCEP包被的96-孔Maxisorp板(Nunc，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Scientific))来进行ELISA。在室温下孵育板2小时，然后用TPBS(PBS中0.05％吐温20，pH 7.4)洗涤3次并用250μl/孔的2％BSA(西格玛奥德里奇公司)在室温下封闭1小时。各孵育步骤之后是3次TPBS洗涤。血清样品初始以1∶500-1∶1000在含2％BSA的PBS中稀释，转移到包被-封闭的板上(200μL)并连续稀释(2倍稀释)，之后在37℃下孵育2小时。然后，以100μl/孔添加1∶2000稀释的碱性磷酸酶-偶联的山羊抗小鼠IgG并在30℃下放置2小时。通过以100μL/孔添加含3mg/mL对硝苯基磷酸二钠盐六水合物(西格玛奥德里奇公司)的1M二乙醇胺缓冲剂(pH 9.8)来观察结合的碱性磷酸酶。在室温下显色10分钟后，在微孔板分光光度计中于405nm处分析平板。通过在参考校准曲线上内插OD来计算抗体效价，并且表示为每mL的ELISA单位(EU)。

图10显示了在第三次免疫(第49天)后从各免疫组的8只小鼠得到的ELISA效价的几何平均数。来自单独用PBS和佐剂或用空OMV免疫的小鼠的血清给出阴性结果。如图10所示，针对全部5种制剂的抗体效价在统计学上相当，表明工程改造的OMV制剂能够诱导针对Slo和SpyCEP抗原的抗体。

实施例9-OMV-SpyCEP免疫血清抑制SpyCEP介导的的IL8加工

测试了从单独用PBS、空OMV、OMV-SpyCEP和OMV+SpyCEP免疫的小鼠得到的血清的中和SpyCEP的IL-8蛋白质水解活性的能力。为了进行该IL-8抑制测试，在37℃下，SpyCEP(0.1μg/ml)和IL-8(1μg/ml)与5种不同稀释度(1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20和1∶40)下的来自8只免疫小鼠的小鼠多克隆血清的收集池在PBS，0.5mg/ml BSA中孵育2小时。作为对照，SpyCEP仅与缓冲剂孵育，并且使用不含SpyCEP的血清。在2小时后通过ELISA(人IL-8免疫试验试剂盒，英杰公司(Invitrogen))对未切割的IL-8的量进行定量并且表示为反应(与SpyCEP孵育)中未切割的IL-8与对照反应(仅与缓冲剂孵育)中的IL-8相比的百分比。

图11、12A和12B显示了在100ng的重组SpyCEP和不同稀释度的三次(3次后)和两次(2次后)免疫后收集的免疫血清存在下由ELISA试验测定的未切割的IL-8的百分比。

来自作为阳性对照的用重组SpyCEP免疫以及用工程改造的含SpyCEP的OMV(OMV-SpyCEP)免疫的小鼠的血清能够以剂量依赖的方式中和SpyCEP蛋白水解活性并且给出统计学上相当的结果。

实施例10-OMV-Slo免疫血清抑制Slo介导的溶血

测试了从单独用PBS、空OMV、OMV-Slo、20μg Slo和0.5μg Slo(对应于20μg OMV中所含Slo的量)免疫的小鼠得到的血清的中和Slo的溶血活性的能力。为了进行该测试，在室温下将Slo(60ng)与来自每组8只免疫小鼠的收集的多克隆血清在6个不同的稀释度(1∶31.25；1∶63；1∶125；1∶250；1∶500和1∶1000)下在PBS，0.5mg/ml BSA中孵育20分钟。在PBS中将1ml绵羊血液洗涤3次(在3000x g下离心)，最后将血细胞悬浮在5ml PBS中。向各样品中加入50μl的这种悬浮液并且在37℃下孵育30分钟。使用60ng Slo作为阳性对照以得到100％溶血，并且使用PBS+0.5％BSA作为阴性对照。然后将板在1000x g下离心5分钟，并且小心将上清液转移到96孔平底板中并读取540nm处的吸光度[128]。

图13显示了由在不同血清稀释度下的各样品提供的溶血百分比。来自作为阳性对照的用重组Slo免疫以及用工程改造的含Slo的OMV(OMV-Slo)免疫的小鼠的血清能够以剂量依赖的方式中和Slo的溶血活性并且给出统计学上相当的结果。

实施例11-在其腔中携带外来抗原的OMV引发强保护性应答

已经证明即使在OMV的腔中存在重组抗原，用这类OMV免疫诱导抗原特异性功能抗体，我们继续研究该免疫是否也能够诱导抗原特异性保护免疫。为了对此进行测试，在第0、21和35天用包含携带Slo或SpyCEP的25μg的OMV的配制有氢氧化铝的疫苗制剂腹膜内免疫雌性CD15-周龄小鼠。作为阳性对照，也用在即将吸收至氢氧化铝之前超声处理的携带Slo和SpyCEP的25μg OMV，以及重组Slo、重组SpyCEP和来自M1菌株的重组M蛋白(各20μg)免疫小鼠，其全部配制有氢氧化铝。在第三次免疫后3周，用200μl的含约2.5E+06CFU的M13348菌株的细菌悬浮液腹膜内感染小鼠。在处理后每天监测小鼠持续6天并且当它们显示出无痛处死终点时处死它们，该无痛处死终点已经对于符合诺华动物福利政策的研究预先建立。

如报道了来自每组使用8只小鼠的实验的数据图14所示，如果未经超声，携带Slo和SpyCEP的OMV分别给出了87.5％和75％的保护，与如果在吸收至铝盐之前超声处理OMV并免疫所得到的87.5％和100％的保护值相当。这种保护也与用吸收至铝盐的重组Slo和SpyCEP得到的保护值(分别是81.3％和87.5％)相似，考虑到携带约0.2-0.4μg的Slo和SpyCEP的重组OMV大约是用重组Slo和SpyCEP免疫所用的量的1/100，这是一个显著的结果。

实施例12-在OMV腔中用于表达Spy0269和Slo-dm的双顺反子构建体和用于表达Spy0269、Slo和SpyCEP的三顺反子构建体的产生

为了产生双顺反子构建体，分别使用slo-fus-F/slo-fus-R3和Spy0269-fus3/Spy0269-R引物从pET-21_slo和pET-21_spy0269中扩增slo-dm和spy0269基因。产生的片段经磷酸化、连接并且克隆(使用PIPE克隆方法[123])到pET-OmpA质粒中产生pET-slo+spy0269质粒(SEQ ID：38)(图15A)。

将Slo-dm和Spy0269蛋白克隆到pET-OmpA质粒中的相同的T7启动子下以产生双顺反子构建体。OmpA前导序列被克隆到各基因的上游，从而其表达能够导向随后产生的OMV的腔(参见下文)。

为了产生三顺反子构建体，用nohisflag/Spy0269-fus-R引物扩增pET-spy0269+slo质粒，用spycep-fus-F/spycep-R3引物从pET-21_spycep质粒上扩增spycep基因并使用PIPE克隆方法克隆到质粒中。产生的片段经磷酸化、连接并且克隆(使用PIPE克隆方法[123])到pET-OmpA质粒中产生pET-slo+spy0269+spycep质粒(图15B)。

所得的质粒被转化到ΔompA和野生型大肠杆菌BL21突变株用于蛋白质诱导和OMV制备。通过向培养基中加入1mM IPTG来诱导克隆的基因的表达。对总裂解物进行Western印迹来验证蛋白质表达。图16A组图I和组图II显示在用IPTG诱导之后从双顺反子和三顺反子构建体表达的全部克隆的蛋白质。

如上所述，从含双顺反子的ΔompA和野生型菌株中制备OMV。图16B的Western印迹的结果显示了Slo和Spy0269蛋白都表达并存在于OMV中。

SEQ ID：43至69中提供了spy0269(GAS40)的变体序列。SEQ ID：71至75提供了spyCEP(GAS57)的变体序列并且SEQ ID：39和40提供了脱毒或酶失活的突变体(GAS57D151A-S617A)。SEQ ID：41和42提供了slo(GAS25)W535F-P427L双突变体。

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Claims

1.一种来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，其特征在于，所述OMV包含至少一种在其腔中游离的异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，所述OMV能够引发针对所述异源蛋白的免疫应答，所述异源蛋白在所述OMV的腔中有功能活性，所述异源蛋白是可溶性蛋白，所述异源蛋白是(a)异源生物体中的周质蛋白且天然信号序列被周质蛋白的信号序列取代，或是(b)异源生物体中的膜相关蛋白质并且删除了膜锚定物，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌，并且其中所述异源蛋白是来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)或者来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCep。

2.如权利要求1所述的OMV，其特征在于，所述免疫应答是抗体免疫应答。

3.一种制备权利要求1所述的OMV的方法，所述方法包括在所述革兰氏阴性细菌的周质中表达所述异源蛋白的步骤。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，使用表达载体使所述异源蛋白在革兰氏阴性细菌的周质中表达，所述表达载体包含与周质蛋白的信号序列的编码核酸可操作连接的所述异源蛋白的编码核酸序列。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离所述OMV的步骤。

6.通过权利要求3-5中任一项所述的方法得到的OMV。

7.如权利要求1、2和6中任一项所述的OMV，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌是所述革兰氏阴性细菌的高发泡菌株。

8.如权利要求7所述的OMV，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌是ΔtolR大肠杆菌菌株或ΔompA大肠杆菌菌株。

9.如权利要求1、2和6中任一项所述的OMV，其特征在于，所述异源蛋白是抗原。

10.如权利要求1、2和6中任一项所述的OMV，其特征在于，所述OMV包含至少两种在其腔中游离的异源蛋白。

11.如权利要求10所述的OMV，其特征在于，所述OMV包含至少三种在其腔中游离的异源蛋白。

12.如权利要求10所述的OMV，其特征在于，所述异源蛋白包含来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)和来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269。

13.如权利要求11所述的OMV，其特征在于，所述异源蛋白包括来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)、来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCEP和来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269。

14.一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)如权利要求1、2或6-13中任一项所述的OMV和(b)药学上可接受的运载体。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。

16.如权利要求14或15所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物是疫苗。

17.来自革兰氏阴性细菌的OMV用于制备在哺乳动物中产生针对异源蛋白的免疫应答的产品的用途，其中所述OMV在其腔中包含至少一种异源蛋白，并且所述免疫应答针对所述OMV中的所述异源蛋白，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌，并且其中所述异源蛋白是来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O的双突变体(Slo-dm)或者来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCep。

18.权利要求1、2或6-13中任一项所述的OMV或权利要求14-16中任一项所述的药物组合物用于制备在哺乳动物中产生针对异源蛋白的免疫应答的产品的用途，其中所述免疫应答针对所述OMV中的所述异源蛋白。

19.如权利要求1、2或6-13中任一项所述的OMV或权利要求14-16中任一项所述的药物组合物在制备治疗剂中的用途。