CN106866804B - 一种与植物光合作用相关的cam01蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

一种与植物光合作用相关的cam01蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物叶绿体发育相关的CAM01蛋白及其编码基因和应用。本发明的CAM01蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本发明通过对CAM01基因的分离和基因功能的鉴定分析，证明了CAM01蛋白具有调控植物叶绿色含量的功能，进而对植物光合作用产生影响。

Description

一种与植物光合作用相关的CAM01蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物光合作用相关的CAM01蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
植物的光合作用几乎是所有生物生存和发展的物质基础。叶绿体是绿色植物进行光合作用的重要细胞器。植物胚胎发育时期质体的发育及其向叶绿体的转化与胚胎发生之间有着密切关系。当胚发育到晚球形期时，质体开始分化形成功能的叶绿体，并通过光合作用为胚的发育提供能源物质。尤其在发育后期，胚需要储备足够的能量和代谢原料以利于种子的萌发以及幼苗在具备光合能力之前的生长。此外质体合成许多重要的细胞必需的代谢中间物，如碳骨架、核酸、脂肪酸和氨基酸等，它们参与合成的各种代谢途径的中间物或终产物，进而影响植株整体发育。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。
本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在如下(1)-(5)中至少一种中的应用：
(1)提高植物叶绿素含量；
(2)调控植物根部发育；
(3)降低植物叶绿体基粒片层数量；
(4)降低植物第一对真叶的长宽比；
(5)降低植物激素的含量。
上述方法中，所述叶绿素具体为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和/或叶绿素a/b；所述植物激素为IAA。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控植物光合作用中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育叶绿素含量提高的转基因植物中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种培育叶绿素含量提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育叶绿素含量提高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述叶绿素为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和/或叶绿素a/b。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因是通过互补载体pCAMBIA1305-CAM01导入受体植物的。所述互补载体pCAMBIA1305-CAM01为将序列表中序列1所示的DNA分子替换双元载体pCAMBIA1305的SmaI和NcoI酶切位点间的DNA片段，且保持载体pCAMBIA1305的其他序列不变得到的载体。
上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明从拟南芥中发现一个与植物光合作用相关CAM01基因，分析表明：和野生型拟南芥相比，CAM01基因缺失突变体生长缓慢、植株矮小、根部发育停滞、无健全根部，并且新叶有高荧光表型。通过试验证明：CAM01基因参与了叶绿体光合作用蛋白的表达调控，高效表达于心形胚基部，心形胚基部又是胚胎发生中形成根的部位，这与突变体的根系发育缺陷表型相一致，说明CAM01基因通过调控胚胎发育进而参与了根系发育的调控，对通过转基因途径、激素调节途径来调控叶绿体蛋白合成及影响植物体根系发育具有一定应用价值。
附图说明
图1为拟南芥突变体cam01和野生型拟南芥在培养基生长3周后的表型及子叶长宽比。
图2为拟南芥突变体cam01和野生型拟南芥的叶绿素激发荧光成像。
图3为拟南芥突变体cam01和野生型拟南芥萌发10天后的根发育情况的比较。
图4为拟南芥突变体T-DNA插入的验证结果。其中，LP，PR和LB为引物。
图5为突变体基因表达的RT-PCR验证结果。
图6为突变体植株中CAM01基因组成型表达的GUS染色分析。
图7为CAM01蛋白的定位分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CAM01基因的获得
一、突变体cam01的发现及其表型
1、突变体cam01的发现
将野生型拟南芥种子(和突变体种子(购自拟南芥突变体库，编号为SAIL_564_E05)4℃春化后，分别点播于1/2MS培养基上生长，得到野生型拟南芥植株和突变体植株。与野生型拟南芥植株相比，突变体植株生长缓慢、植株矮小，根部发育停滞，无健全根部，分支多、叶心和新叶发黄，并且有高荧光表型(图1、图2和图3)，将该突变体植株命名为突变体cam01，并将杂合突变体植株命名为HZ，纯合突变体植株命名为HM。
2、突变体cam01的表型
(1)根部发育
观察生长10天的野生型拟南芥植株和突变体cam01的根部生长情况，结果如图3所示：和野生型拟南芥植株相比，突变体cam01的根部发育停滞，无健全根部。
(2)长宽比
观察生长30天的野生型拟南芥植株和突变体cam01的第一对真叶的长宽比，结果如图1所示：和野生型拟南芥植株相比，突变体cam01的第一对真叶的长宽比明显提高。
(3)叶绿体超微结构
电镜观察生长30天的野生型拟南芥植株和突变体cam01的叶绿体超微结构，结果表明：和野生型拟南芥植株相比，突变体cam01的基粒片层明显增多，基粒间的排列不规则。
3、突变体cam01的分子鉴定
以野生型拟南芥植株(WT)、纯合突变体cam01(HM)和杂合突变体cam01(HZ)的DNA为模板，分别以LP和RP、LB和RP为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
LP：TTTGTACCTGGCAACCAAATC；
RP：TGACATTTTCTCTTCCGTTCG；
LB：TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC。
结果如图4所示：以LP和RP为引物时，在野生型拟南芥植株(WT)与杂合突变体cam01(HZ)中均都扩增出1042bp条带，而纯合突变体cam01(HM)则在对应位置没有扩增出条带；以LB和RP为引物时，野生型拟南芥植株(WT)没有扩增出条带，则在纯合突变体cam01(HM)和杂合突变体cam01(HZ)中都可以扩增出459bp条带。说明突变体中确认T-DNA插入在CAM01基因内。
4、突变体cma01的RT-PCR验证
以野生型拟南芥植株和突变体cam01的cDNA为模板，分别采用如下引物：RT-F和RT-R、RT1-F和RT1-R、RT2-F和RT2-R进行PCR扩增，以确定突变体中目的基因的转录情况。以Actin的扩增作为一个内参。RT-PCR引物序列如下：
RT-F:5'-ATGGCGGGAGTGATTAGGGCTAAG-3'；
RT-R:5'-AGTTCAGATTCTGGCCACGAATTC-3'；
Actin sense：5’-AACTGGGATGATATGGAGAA-3’；
Actin antisense：5’-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3’；
RT1-F:5'-ATGGCGGGAGTGATTAGGGCTAAG-3'；
RT1-R:5'-CTGCATAGATGACATTCCCAGGTC-3'；
RT2-F:5'-ACAATCCTGAAAGAGGGTTTAGTG-3'；
RT2-R:5'-CACAACTTCTGAATCACTCTTAAC-3'。
PCR扩增产物的电泳结果如图5所示：结果表明：对照基因Actin在野生型拟南芥植株和突变体cam01中均能正常转录表达，而用三段不同引物扩增均只能在野生型中有扩增条带，说明由于T-DNA插入导致CAM01基因不能正常转录表达。
5、突变体cma01激素含量的测定
分别测定生长7天和28天的野生型拟南芥植株(wt)和突变体cam01(cam)中各个激素(GA、IAA、ZR、ABA、IPA、BR和JA)含量，激素含量的测定方法参考文献“Mechanism ofphytohormone involvement in feedback regulation of cotton leaf senescenceinduced by potassium deficiency.Journal of Experimental Botany,Vol.63,695–709,(2012)。和Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay(icELISA)and simplified icELISA for smallmolecules.Analytica Chimica Acta 571(2006)79–85”中的方法。
结果如表1所示：在突变体cma01的生长后期，IAA的含量较野生型有很大的提高，由此表明CAM01基因的突变引起了生长素含量的变化，进而引起了植物叶形的变化与分支的增多。
表1、野生型植株与突变体植株中各个激素含量
Figure BDA0000874913590000061
二、CAM01基因的获得
以野生型拟南芥的基因组DNA为模板，采用引物cam-NcoI-F3和引物cam-SmaI-R3进行PCR扩增，得到PCR产物。并将PCR产物切胶纯化后连接T-easy载体，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，进行PCR酶切、测序。引物序列如下：
cam-NcoI-F3：CCCCCATGGCAACTTCTGAATCACTC；
cam-SmaI-R3:CCCCCCGGGCGGGAGTGATTAGG。
测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将序列1所示的基因命名为PSF基因，PSF基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
三、CAM01蛋白的定位分析
1、融合表达载体的构建
以序列1所示的CAM01基因插入pPUC18载体(购于Taraka公司，货号D3218)的SalI和NcoI酶切位点间，得到pPUC18-CAM01-GFP融合表达载体。
2、原生质体瞬时表达实验
选择3-4周的野生型拟南芥幼苗的第5、6、7片真叶，用锋利的刀片将叶片的中间部分切成0.5-1mm的细条，放入酶解液中消化，黑暗中消化叶片3-4h，离心原生质体，用PEG法将步骤1获得的pPUC18-CAM01-GFP融合表达载体转化原生质体，过夜光下培养。
3、用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510META，Zeiss)观察叶肉细胞中GFP的表达，观察时物镜放大倍数为40倍，激发光波长为488nm，带通BP 505～530nm，长通LP 560nm。
结果如图7所示：CAM01蛋白定位于叶绿体中。
四、CAM01基因组成型分析
1、将序列表中序列3所示的CAM01基因的启动子替换pCAMBIA1305载体的SalI和NcoI酶切位点间的DNA片段，且保持pCAMBIA1305载体的其他序列不变，得到重组载体。pCAMBIA1305载体含有GUS基因，CAM01基因的启动子位于GUS基因上游。
2、将步骤1得到的重组载体导入农杆菌EHA105(购自上海迈其生物科技有限公司，货号CH5002B)中，得到重组菌。
3、采用花序滴定法用步骤2获得的重组菌侵染转化野生型拟南芥，得到T0代转基因拟南芥，并采用PCR鉴定的方法筛选阳性苗，PCR鉴定的引物如下：
camPGUSSalI-F：5'-CCCGTCGACTGTACCTTCCAAGCTAAGAGAACC-3'；
camPGUSNcoI-R：5'-CCCCCATGGTAAAAGCTTCTTCTTCTCATGCC-3'。
4、GUS基因检测
检测由CAM01基因启动子启动的GUS基因表达情况，GUS基因检测方法参照文献“Leslie E.Sieburth et al Plant Cell,1997,9,355-365”中的方法。
GUS基因表达染色结果如图6所示：其中，a为胚芽、b为子叶及下胚轴、c为莲座叶、d为花序、e为柱头、f为花器官、g为胚。从图中可以看出，GUS基因在不同组织中均有很强表达。用CAM01基因启动子控制的GUS基因表达于植株的不同时期中，说明CAM01基因是一个持家基因，对植株的生长发育具有重要作用。
实施例2、互不植株的获得及其叶绿体发育分析
一、互补植株的获得
1、互补载体的构建
以序列表中序列1所示的CAM01基因为模板，采用cam-NcoI-F3和cam-SmaI-R3引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：
cam-NcoI-F3：5’-CCCCCATGGCGGGAGTGATTAGG-3’；
cam-SmaI-R3:5’-CCCCCCGGGCAACTTCTGAATCACTC-3’。
回收PCR产物，用限制性内切酶SmaI和NcoI双酶切PCR产物和双元载体pCAMBIA1305(双元载体购自Cambia公司，型号VZC0568)，经连接、转化、鉴定出含有目的片段的互补载体pCAMBIA1305-CAM01。
对互补载体pCAMBIA1305-CAM01进行测序验证。结果表明：互补载体pCAMBIA1305-CAM01为将序列表中序列1所示的DNA分子替换双元载体pCAMBIA1305的SmaI和NcoI酶切位点间的DNA片段，且保持载体pCAMBIA1305的其他序列不变得到的载体。
2、重组菌的获得
将步骤1获得的互补载体pCAMBIA1305-CAM01导入农杆菌EHA105(购自上海迈其生物科技有限公司，货号CH5002B)中，得到重组菌。
3、采用花序滴定法用步骤2得到的重组菌侵染转化实施例1中的拟南芥突变体cam01，培养，得到T0代转基因拟南芥的种子，将T0代转基因拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地播撒于含潮霉素的MS培养基上，一周后将生长正常的阳性苗移入土中生长，培养，收种子，即得到T1代转基因拟南芥(拟互补植株)，将表型恢复的T1代转基因拟南芥幼苗挑选出来用于后续鉴定。
4、互补植株的获得
对表型恢复的T1代转基因拟南芥幼苗进行PCR鉴定(PCR鉴定的引物cam-NcoI-F3：5’-CCCCCATGGCGGGAGTGATTAGG-3’和cam-SmaI-R3:5’-CCCCCCGGGCAACTTCTGAATCACTC-3’)，PCR扩增获得大小为1317bp的植株为阳性T1代转CAM01拟南芥，即为成功导入CAM01基因的拟南芥突变体cam01的互补植株，将其命名为互补植株CAM01-com。
二、互不植株的叶绿素含量检测
分别检测互补植株CAM01-com和突变体cam01的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和叶绿素a/b的含量。具体步骤如下：用80％冷丙酮提取互补植株CAM01-com和突变体cam01叶片的叶绿素，分别测定OD663和OD646的值，按照文献“Porra et.al.,Biochim Biophys Acta,975:384-394(1989)”中的方法测定叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和叶绿素a/b的含量。
检测结果如表2所示：从表中可以看出：互补植株CAM01-com的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和叶绿素a/b的含量均高于突变体cam01，说明CAM01基因具有调控叶绿素含量的功能，进而对光合作用产生影响。
表2、互补植株CAM01-com和拟南芥突变体cam01的叶绿素含量
Figure BDA0000874913590000081
Figure BDA0000874913590000091
Figure IDA0000874913670000011
Figure IDA0000874913670000021
Figure IDA0000874913670000031
Figure IDA0000874913670000041
Figure IDA0000874913670000051
Figure IDA0000874913670000061

Claims (5)

1.序列表中序列2所示的蛋白质或其相关生物材料在提高植物叶绿素含量中的应用；
所述相关生物材料，为下述A1）至A12）中的任一种：
A1）编码所述的蛋白质的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；
A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系；
所述植物为拟南芥突变体cam01；
所述拟南芥突变体cam01是使野生型拟南芥中序列2所示蛋白质的编码基因不能正常转录表达而获得的；所述叶绿素为叶绿素a或叶绿素b。
2.序列表中序列2所示的蛋白质的相关生物材料在培育叶绿素含量提高的转基因植物中的应用；
所述相关生物材料，为下述A1）至A12）中的任一种：
A1）编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；
A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系；
所述植物为拟南芥突变体cam01；
所述拟南芥突变体cam01是使野生型拟南芥中序列2所示蛋白质的编码基因不能正常转录表达而获得的；所述叶绿素为叶绿素a或叶绿素b。
3.根据权利要求1或2任一项所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）所示的基因：
1）其核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子；
2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子。
4.一种培育叶绿素含量提高的转基因植物的方法，包括将序列表中序列2所示的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物；
所述受体植物为拟南芥突变体cam01；
所述拟南芥突变体cam01是使野生型拟南芥中序列2所示蛋白质的编码基因不能正常转录表达而获得的；所述叶绿素为叶绿素a或叶绿素b。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
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