ES2389562T3 - Antígenos de Chlamydia trachomatis para uso en vacuna y diagnóstico - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de(a) SEQ ID NO. 1, o(b) una porción inmunógena de la secuencia 5 indicada en (a), o(c) una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con unacualquiera de las secuencias en (a) o (b) y es al mismo tiempo inmunógena, o el ácido nucleico codificante delos polipéptidos indicados en (a), (b) o (c), para preparación de una composición farmacéutica paraprevención o tratamiento de infecciones causadas por una bacteria de una especie de Chlamydia, en dondeel polipéptido está fusionado a una pareja de fusión.

Description

Antígenos de Chlamydia trachomatis para uso en vacuna y diagnóstico

Campo de la Invención

La presente invención describe el uso de polipéptidos inmunógenos y composiciones inmunógenas basadas en polipéptidos y ácido nucleico derivado de C. trachomatis como vacuna y agentes de diagnóstico.

Antecedentes Generales

Las especies Chlamydiales causan una extensa gama de enfermedades tanto en animales como en humanos. De particular importancia es C. trachomatis, una bacteria intracelular forzosa, que infecta y se multiplica en las células epiteliales. Es la causa más frecuente de enfermedad de transmisión sexual (STD) en los países desarrollados y es la causa más común de enfermedad oftálmica en los países en desarrollo (Schachter, Moncada et al. 1988). Hay una cifra estimada de 92 millones de individuos que son portadores de la infección en todo el mundo (WHO, 1999).

La duración de la STD por Chlamydia sin tratar es prolongada, y el aclaramiento completo no se consigue a menudo antes de los primeros 12 meses. Se cree que la inmunidad protectora inducida durante la infección es específica de serovariantes y de vida corta, permitiendo así re-infecciones frecuentes (Katz, Batteiger et al. 1987). Estas circunstancias, el curso prolongado de la infección y las posibles re-infecciones pueden conducir al desarrollo de secuelas graves, con inclusión de enfermedad inflamatoria pélvica, infertilidad y embarazos ectópicos (Brunham 1999).

La infección se controla eficazmente por terapia con antibióticos; sin embargo, la alta prevalencia de casos asintomáticos sugiere que el control sostenible de Chlamydia puede preverse únicamente si se desarrolla una vacuna eficaz contra Chlamydia. Si bien se han destinado muchos esfuerzos a una vacuna contra las infecciones de Chlamydia a lo largo de las últimas décadas, hasta ahora no se ha desarrollado ninguna vacuna.

Esto hace que el desarrollo de una vacuna contra Chlamydia sea una cuestión urgente. Se han realizado muchos intentos para definir sustancias protectoras contra Chlamydia; sin embargo, la demostración de una respuesta específica inmune protectora de larga duración no se ha conseguido todavía. A lo largo de las últimas décadas se han destinado muchos esfuerzos al desarrollo de una vacuna contra las infecciones por Chlamydia; sin embargo, hasta ahora no se ha desarrollado ninguna vacuna. Algunos de los primeros esfuerzos estuvieron enfocados en el control del tracoma, y se utilizaron organismos enteros viables o desactivados como el antígeno para inmunizar humanos y monos (Wang, Grayston et al. 1967; Grayston y Wang 1978). Los niños vacunados con una vacuna de células enteras desactivadas daban como resultado protección inicial, pero la protección era serovar-específica y de vida corta (Grayston y Wang 1978). Adicionalmente, la reinfección de los individuos parcialmente protegidos daba como resultado una enfermedad clínica que era más grave que la enfermedad existente en los controles no vacunados (Grayston y Wang 1978). El hecho de que las pruebas iniciales con organismos enteros desactivados daban como resultado algunos casos de lo que parecía ser una reacción de hipersensibilidad impulsó los intentos para desarrollar vacunas subunitarias.

C. trachomatis contiene, al mismo tiempo que secreta, varias proteínas de potencial relevancia para la generación de una vacuna contra Chlamydia. Durante varios años, la investigación para moléculas candidato se han enfocado fundamentalmente en proteínas asociadas con la superficie de la forma infecciosa del Cuerpo Elemental (EB). A pesar de la caracterización de un gran número de tales proteínas, sólo un número muy pequeño de éstas han demostrado provocar protección parcial como vacunas subunitarias en modelos animales. La primera molécula inmunógena descrita fue la proteína mayor de la membrana externa (MOMP), y esta molécula ha sido estudiada por ello con gran detalle como vacuna candidata. Sin embargo, muchos intentos de inmunizar diferentes animales con MOMP extraída de C. trachomatis o preparaciones recombinantes han dado resultado variables (Su, Parnell et al. 1995; Pal, Barnhart et al. 1999; Zhang, Yang et al. 1999; Pal, Theodor et al. 2001; Shaw, Grund et al. 2002). La razón para la ineficacia relativa de MOPM como vacuna no se conoce, pero puede ser resultado de adyuvantes o sistemas de suministro inadecuados o del uso de inmunógenos de MOMP que no mimetizan la estructura natural de la proteína (Pal, Theodor et al. 2001).

Más recientemente, se han identificado varias otras moléculas inmunógenas ((Hassell, Reynolds et al. 1993; Kubo y Stephens 2000; LaVerda, Albanese et al. 2000; Fling, Sutherland et al. 2001; Goodall, Yeo et al. 2001; Starnbach, Loomis et al. 2003). La inmunidad a C. trachomatis se caracteriza por ciertos rasgos básicos; los linfocitos T sensibilizados específicamente median la protección (Su y Caldwell 19995; Morrison, Su et al. 2000; Morrison y Caldwell 2002), y la molécula mediadora más importante parece ser el interferón gamma (IFNγ) (Morrison y Caldwell 2002). Adicionalmente, anticuerpos de los isotipos IgG, IgM e IgA pueden jugar también un papel (Cotter, Meng et al. 1995).

En 1995 Tripples et al (Tipples y McClarty 1995) aislaron el gen para la CTP-sintetasa y Gu et al. (Gu, Wenman et al. 1995) clonaron la región que rodea el gen para la subunidad alfa de la RNA-polimerasa. Esta región contiene

también genes para las proteínas SecY, S13, S11, y L17, que son equivalentes a proteínas de Escherichia coli y Bacillus subtilis. El 1997, se aisló el gen para el factor de elongación Ts (Zhang, Tao et al. 1997).

En 1998, Stevens et al. publicaron la secuencia genómica completa de C. trachomatis y predijeron la presencia de aproximadamente 875 marcos de lectura abiertos. Entre otras, se describen secuencias de nucleótidos que comprenden CT442, CT460, CT509, CT579, CT587, CT713, CT812, o CT681 (MOMP), y se sugieren secuencias proteínicas supuestas para las secuencias anteriores. Aunque es importante, esta información de secuencias no puede utilizarse para predecir si el DNA se transcribe y se traduce en proteínas in vivo.

Es todavía más importante que, sobre la base de las secuencias, no es posible predecir si una secuencia dada codificará una proteína inmunógena o inactiva. WO 9928475 describe la secuencia genómica completa de C. trachomatis, pero no proporciona evidencia alguna en apoyo de ningún efecto inmunógeno. Correspondientemente, WO 9927105 describe la secuencia genómica completa de C. pneumoniae.

La base de datos TREMBL, entrada 084047-CHLTR de 1 de noviembre de 1998 describe una proteína CT043 hipotética de Chlamydia trachomatis con una secuencia dada correspondiente a SEQ ID NO. 1 de la presente invención.

La única manera de determinar si una proteína es reconocida por el sistema inmunitario durante o después de una infección con C. trachomatis consiste en producir la proteína dada y testarla en un ensayo apropiado como se describe en esta memoria y determinar si es posible el fragmento o epítope que tiene un efecto inmunógeno.

Sumario de la invención

La invención se refiere a la prevención, tratamiento y detección de infecciones causadas por especies de Chlamydia

(C. trachomatis ssp y C. pneumonia) por el uso de un polipéptido que comprende un antígeno de C. trachomatis o una porción inmunógena u otra variante del mismo, o por el uso de una secuencia de DNA que codifica un antígeno de C. trachomatis o una porción inmunógena u otra variante del mismo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe el uso de un polipéptido sustancialmente puro del antígeno de Chlamydia (polipéptidos o ácidos nucleicos) ctO43, o fragmentos (porción inmunógena, p.ej. un epítope de células T o células B) u homólogos de éstos para preparación de una composición farmacéutica para prevención o tratamiento o diagnóstico de infecciones causadas por una bacteria de las especies Chlamydia, en donde el polipéptido está fusionado a una pareja de fusión.

La presente invención describe también una composición farmacéutica en forma de una vacuna o un agente de diagnóstico.

El polipéptido utilizado para preparación de la composición farmacéutica puede estar lipidado para permitir un efecto auto-adyuvante y está fusionado a una pareja de fusión en donde la pareja de fusión puede ser otro polipéptido derivado de C. trachomatis, con inclusión, pero sin carácter limitante, de uno o más fragmentos polipeptídicos derivados de CT812, CT579, CT587, Cap, CT713, CT442 o MOMP o al menos un epítope de células T o células B de cualquiera de los arriba mencionados. La invención se refiere también a un polipéptido de fusión que comprende fusiones mutuas de dos o más de los polipéptidos (o porciones inmunógenas de los mismos) de la invención.

La vacuna descrita por la invención puede utilizarse para prevención o tratamiento de una infección de la especies Chlamydia, v.g. C. trachomatis.

El agente de diagnóstico descrito por la invención (polipéptido arriba mencionado o un anticuerpo contra el mismo) puede utilizarse para diagnosis de una infección de las especies de Chlamydia, v.g. C. trachomatis.

Los métodos de diagnóstico descritos están basados en inmunidad mediada por células, serología o un simple test de piel. La diagnosis por la inmunidad mediada por células de infección previa o en curso con una bacteria de las especies Chlamydia, comprende poner en contacto una muestra, v.g. una muestra de sangre que comprende células mononucleares (v.g. linfocitos T), con el reactivo de diagnóstico a fin de detectar una reacción positiva, v.g. proliferación de las células o liberación de citoquinas tales como IFNγ. La diagnosis por serología o infección previa

o en curso con una bacteria de las especies Chlamydia, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra, v.g. una muestra de sangre, con un anticuerpo contra el antígeno a fin de detectar una reacción positiva en el caso de infección o por puesta en contacto del antígeno con un fluido corporal del individuo y en su caso detección de la fijación de un anticuerpo a dicho polipéptido, siendo dicha fijación una indicación de que dicho individuo está infectado por una bacteria de las especies Chlamydia. Un test de piel comprende inyectar o aplicar intradérmicamente a la piel, v.g. por un parche, el reactivo de diagnóstico, siendo una respuesta de piel positiva en la localización de la inyección o aplicación indicativa de una infección con una bacteria de las especies Chlamydia.

La presente invención describe también un método para inmunización contra una infección de una bacteria de las especies Chlamydia, que comprende administrar la vacuna arriba mencionada de la invención a un mamífero.

Definiciones

Polipéptidos

El término "polipéptido" en la presente invención debe tener su significado usual. Es decir una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, que incluye una proteína de longitud total, oligopéptidos, péptidos cortos y fragmentos de los mismos, en donde los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes.

El polipéptido puede estar modificado químicamente por glicosilación, por lipidación (v.g. por lipidación química con palmitoiloxi-succinimida como ha sido descrito por Mowat et al. 1991 o con cloruro de dodecanoílo como ha sido descrito por Lustig et al. 1976), por inclusión de grupos prostéticos, o por contener aminoácidos adicionales tales como v.g. un marcador his o un péptido señal.

Cada polipéptido puede caracterizarse así por aminoácidos específicos y puede estar codificado por secuencias específicas de ácido nucleico. Se comprenderá que tales secuencias incluyen análogos y variantes producidas por métodos recombinantes o métodos de síntesis en donde tales secuencias polipeptídicos han sido modificadas por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido recombinante, y serán todavía inmunógenos en cualquiera de los ensayos biológicos descritos en esta memoria. Las sustituciones son preferiblemente "conservadoras". Éstas se definen de acuerdo con la tabla siguiente. Los aminoácidos del mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse unos por otros. Los aminoácidos de la tercera columna están indicados en el código de una sola letra.

ALIFÁTICO

No-polar GAP

ILV

Polar-sin carga

CSTM

NQ

Polar-con carga

DE

KR

AROMÁTICO

HFWY

Un polipéptido preferido dentro de la presente invención es un antígeno inmunógeno de C. trachomatis. Dicho antígeno puede derivarse por ejemplo de la célula de C. trachomatis y/o de un filtrado de cultivo de C. trachomatis. Así, un polipéptido que comprende una porción inmunógena de uno de los antígenos anteriores puede estar constituido enteramente por la porción inmunógena, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse del antígeno natural de C. trachomatis o ser heterólogas, y tales secuencias pueden, pero sin carácter necesario, ser inmunógenas.

Cada polipéptido está codificado por una secuencia de ácido nucleico específica. Se comprenderá que tales secuencias incluyen análogos y variantes de los mismos en donde dichas secuencias de ácido nucleico han sido modificadas por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más ácidos nucleicos. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones silenciosas en el uso de codones, que no conducirán a cambio alguno en la secuencia de aminoácidos, pero pueden introducirse para mejorar la expresión de la proteína.

En el presente contexto, el término "fragmento polipeptídico sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptidos que contiene como máximo 5% en peso de otro material polipeptídico con el cual está asociada la misma naturalmente (se prefieren porcentajes menores de otro material polipeptídico, v.g. como máximo 4%, como máximo 3%, como máximo 2%, como máximo 1%, y como máximo 0,5%). Se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro tenga al menos una pureza de 96%, es decir que el polipéptido constituirá al menos 96% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes mayores, tales como al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,25%, al menos 99,5%, y al menos 99,75%. Es especialmente preferido que el fragmento polipeptídico se encuentre en "forma esencialmente pura", es decir que el fragmento polipeptídico esté esencialmente exento de cualquier otro antígeno con el cual esté asociado naturalmente, es decir exento de cualquier otro antígeno de bacterias pertenecientes a las especies de Chlamydia. Esto puede conseguirse preparando el fragmento polipeptídico por medio de métodos recombinantes en una célula hospedadora distinta de Chlamydia como se describirá en detalle más adelante, o por síntesis del fragmento

polipeptídico por métodos bien conocidos de síntesis de péptidos en fase sólida o líquida, v.g. por el método descrito por Merrifield o variaciones del mismo.

Por el término "especies de Chlamydia" se entiende una bacteria capaz de causar la infección de Chlamydia en un animal o un ser humano. Ejemplos son C. trachomatis, C. pneumoniae y C. muridarum.

La Proteína Principal de la Membrana Exterior (MOMP) de C. trachomatis, se expresa durante todas las fases del ciclo del desarrollo vital de C. trachomatis y constituye aproximadamente el 60% del contenido proteínico total de la membrana exterior de Chlamydia. MOMP puede dividirse en dominios conservados interrumpidos por cuatro dominios sumamente variables (VD1-4) (Stephens, Wagar et al. 1988). En general, los epítopes de las células T están localizados en las regiones conservadas (Ortiz, Demick et al. 1996) en tanto que la respuesta humana a los anticuerpos está dirigida fundamentalmente contra los dominios variables. Basándose en la reactividad de anticuerpos monoclonales específicos y el análisis detallado de la secuencia de las regiones variables, C. trachomatis puede dividirse en 15 serovariantes diferentes, y de estas serovariantes A, B, Ba y C causan tracoma, D-K causan enfermedad transmitida sexualmente (STD), L1-L3 causan Lymphogranuloma venereum y MoPn (C. muridarum) infecta los ratones.

Por "un paciente de Chlamydia" se entiende un individuo con infección demostrada por cultivo o PCR con Chlamydia spp. Las diagnosis por cultivo, microscopia y PCR de Chlamydia son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Por el término "reacción de hipersensibilidad de tipo retardado" (DTH) se entiende una respuesta inflamatoria mediada por las células T suscitada después de la inyección de un polipéptido en, o aplicación a la piel, apareciendo dicha respuesta inflamatoria 72-96 horas después de la inyección o aplicación del polipéptido.

Por el término "IFNγ" se entiende interferón-gamma. La medida de IFNγ se utiliza como indicación de una respuesta inmunológica.

Por los términos "fragmento de ácido nucleico" y "secuencia de ácido nucleico" se entiende cualquier molécula de ácido nucleico que incluya DNA, RNA, LNA (ácidos nucleicos inmovilizados), PNA, RNA, dsRNA e híbridos RNADNA. Se incluyen también moléculas de ácido nucleico que comprenden nucleósidos no existentes naturalmente. El término incluye moléculas de ácido nucleico de cualquier longitud, v.g. de 10 a 10.000 nucleótidos, dependiendo del uso. Cuando la molécula del ácido nucleico es para uso como producto farmacéutico, v.g. en terapia con DNA, o para uso en un método para producir un polipéptido de acuerdo con la invención, se utiliza preferiblemente una molécula que codifique al menos un epítope, que tenga una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 1000 nucleótidos, estando insertada opcionalmente la molécula en un vector. Cuando la molécula de ácido nucleico se utiliza como sonda, como cebador o en terapia antisentido, se utiliza preferiblemente una molécula que tenga una longitud de 10-100. De acuerdo con la invención, pueden utilizarse otras longitudes de molécula, por ejemplo una molécula que tenga al menos 12, 15, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 ó 1000 nucleótidos (o derivados de nucleótidos), o una molécula que tenga como máximo 10000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30 ó 20 nucleótidos (o derivados de nucleótidos).

El término "severo" cuando se utiliza en conjunción con condiciones de hibridación es como se define en la técnica, es decir que la hibridación se realiza a una temperatura no mayor que 15-20ºC bajo el punto de fusión Tm, véase Sambrook et al, 1989, páginas 11.45-11.49. Preferiblemente, las condiciones son "de alta severidad", es decir 5-ºC por debajo del punto de fusión Tm.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término "comprenden" o variaciones del mismo tales como "comprende" o "que comprende(n)", implica la inclusión de un elemento o entero o grupo de elementos o enteros indicado(s), pero no la exclusión de ningún otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Identidad de secuencia

El término "identidad de secuencia" indica una medida cuantitativa del grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos de igual longitud o entre dos secuencias de nucleótidos de igual longitud. Las dos secuencias a comparar tienen que alinearse para la coincidencia máxima posible con la inserción de lagunas o alternativamente, truncación en los extremos de las secuencias proteínicas. La identidad de secuencia puede calcularse como

en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando están alineadas y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por tanto, la secuencia de DNA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Ndif = 2 y Nref = 8). Una laguna se cuenta como falta de identidad del o de los residuos específicos, es decir la secuencia de DNA AGTGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia de DNA AGTCAGTC (Ndif = 2 y Nref = 8). La identidad de secuencia puede

calcularse alternativamente por el programa BLAST, v.g. el programa BLASTP (Pearson y Lipman 1988) (www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). En un aspecto de la invención, la alineación se realiza con el método de alineación de secuencias ClustalW con parámetros por defecto como han sido descritos por Thompson J., et al. 1994, disponible en http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.

Un porcentaje mínimo preferido de identidad de secuencia es al menos 90%.

Porción inmunógena

En una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende una porción inmunógena del polipéptido, tal como un epítope para una célula B o célula T.

La porción inmunógena de un polipéptido es una parte del polipéptido, que provoca una respuesta inmune en un animal o ser humano, y/o en una muestra biológica determinada por cualquiera de los ensayos biológicos descritos en esta memoria. La porción inmunógena de un polipéptido puede ser un epítope de células T un epítope de células

B. Las porciones inmunógenas pueden referirse a una o un número relativamente pequeño de partes del polipéptido, pueden estar dispersadas a lo largo de la secuencia del polipéptido o estar situadas en partes específicas del polipéptido. Para unos cuantos polipéptidos, se ha demostrado que los epítopes están dispersados a lo largo del polipéptido, abarcando la secuencia completa (Ravn, Demissie et al. 1999).

Con objeto de identificar epítopes relevantes de células T que son reconocidos durante una respuesta inmune, es posible utilizar un método de "fuerza bruta". Dado que los epítopes de las células T son lineales, los mutantes de deleción del polipéptido revelarán, si se construyen sistemáticamente, qué regiones del polipéptido son esenciales en el reconocimiento de la inmunidad, v.g. por sometimiento de estos mutantes de deleción v.g. al ensayo de IFNγ descrito en esta memoria. Otro método utiliza oligopéptidos superpuestos para la detección de epítopes del MHC clase II, preferiblemente sintéticos, que tengan una longitud de v.g. 20 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Estos péptidos pueden testarse en ensayos biológicos (v.g. el ensayo de IFNγ que se describe en esta memoria) y algunos de ellos darán una respuesta positiva (y por consiguiente serán inmunógenos) como se evidencia por la presencia de un epítope de células T en el péptido. Para la detección de los epítopes de MHC clase I, es posible predecir péptidos que se fijarán (Stryhn, Pedersen et al. 1996) y producirán después de ello estos péptidos sintéticos y testar los mismos en ensayos biológicos relevantes, v.g. el ensayo de IFNγ que se describe en esta memoria. Los péptidos tendrán preferiblemente una longitud de v.g. 8 a 11 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Los epítopes de células B pueden determinarse por análisis del reconocimiento de las células B para péptidos superpuestos que abarcan el polipéptido de interés como se describe v.g. en Harboe et al (Harboe, Oettinger et al. 1996).

Aunque se ha demostrado que la longitud mínima de un epítope de células T es al menos 6 aminoácidos, es normal que tales epítopes estén constituidos por tramos más largos de aminoácidos. Por tanto, se prefiere que el fragmento polipeptídico de la invención tenga una longitud de al menos 7 residuos de aminoácidos, tal como al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 22, al menos 24, y al menos 30 residuos de aminoácidos. Por tanto, en realizaciones importantes del método de inventiva, se prefiere que el fragmento polipeptídico tenga una longitud de como máximo 50 residuos de aminoácidos, por ejemplo como máximo 40, 35, 30, 25, y 20 residuos de aminoácidos. Es de esperar que los péptidos que tienen una longitud comprendida entre 10 y 20 residuos de aminoácidos demuestren ser más eficientes como epítopes del MHC clase II y por consiguiente las longitudes especialmente preferidas del fragmento polipeptídico utilizado en el método de inventiva son 18, tal como 15, 14, 13, 12 e incluso 11 residuos de aminoácidos. Es de esperar que los péptidos que tienen una longitud comprendida entre 7 y 12 residuos de aminoácidos demuestren ser más eficientes como epítopes del MHC clase I y por consiguiente las longitudes especialmente preferidas del fragmento polipeptídico utilizado en el método de inventiva son 11, tal como 10, 9, 8 e incluso 7 residuos de aminoácidos.

Las porciones inmunógenas de los polipéptidos pueden ser reconocidas por una gran parte (alta frecuencia) o por una parte menor (baja frecuencia) de la población humana genéticamente heterogénica. Adicionalmente, algunas porciones inmunógenas inducen respuestas inmunológicas altas (dominantes), mientras que otras inducen respuestas menores, pero todavía significativas (subdominantes). La alta frecuencia >< baja frecuencia puede estar relacionada con la porción inmunógena que se fija a moléculas del MHC ampliamente distribuidas (tipo HLA) o incluso por moléculas MHC múltiples (Kilgus, Jardetzky et al. 1991) (Sinigaglia, Guttinger et al. 1988).

En el contexto de proporcionar moléculas candidato para una nueva vacuna contra la infección de Chlamydia, los epítopes subdominantes son sin embargo tan relevantes como lo son los epítopes dominantes, dado que se ha demostrado que tales epítopes pueden inducir protección con indiferencia de ser subdominantes.

Variantes

Una característica común de los polipéptidos de la invención es su capacidad para inducir una respuesta inmunológica como se ilustra en los ejemplos. Se entiende que una variante de un polipéptido de la invención producida por sustitución, inserción, adición o deleción es también inmunógena, como se determina por cualquiera de los ensayos descritos en esta memoria.

Individuo inmune

Un individuo inmune se define como una persona o un animal, que ha aclarado o controlado una infección con Chlamydia.

Inmunógeno

5 Un polipéptido inmunógeno se define como un polipéptido que induce una respuesta inmune en una muestra biológica o un individuo infectado actual o previamente con una Chlamydia. La respuesta inmune puede monitorizarse por uno de los métodos siguientes:

● Una respuesta celular in vitro se determina por liberación de una citoquina relevante tal como IFNγ, de linfocitos extraídos de un animal o ser humano que está infectado actualmente o ha estado infectado 10 previamente con Chlamydia, o por detección de la proliferación de estas células T; realizándose la inducción por la adición del polipéptido o la porción inmunógena a una suspensión que comprende desde 1 x 105 células a 3 x 105 células por pocillo, aislándose las células de la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón y dando la adición del polipéptido o la porción inmunógena como resultado una concentración no mayor que 20 µg por ml de suspensión y realizándose la estimulación durante 2 a 5 días. Para monitorización de la 15 proliferación celular, las células se pulsan con timidina etiquetada radiactivamente, detectándose la proliferación después de 16-22 horas de incubación por recuento mediante centelleo de líquido. Una respuesta positiva es una respuesta mayor que el ruido de fondo más dos desviaciones estándar. La liberación de IFNγ puede determinarse por el método ELISA, que es bien conocido por una persona experta en la técnica, siendo una respuesta positiva una respuesta mayor que el ruido de fondo más dos 20 desviaciones estándar. Otras citoquinas distintas de IFNγ podrían ser relevantes cuando se monitoriza la respuesta inmunógena para el polipéptido, tales como IL-12, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6 y TGF-β. Otro método, más sensible, para determinación de la presencia de una citoquina (v.g. IFNγ) es el método ELISPOT en el que las células aisladas de la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón se diluyen hasta una concentración de preferiblemente 1 a 4 x 106 células/ml y se incuban durante 18-22 horas en presencia del 25 polipéptido o la porción inmunógena, dando como resultado una concentración no mayor que 20 µg por ml. Las suspensiones de células se diluyen después de ello a 1 a 2 x 106/ml y se transfieren a placas Maxisorp recubiertas con anti-IFNγ y se incuban durante preferiblemente 4 a 16 horas. Las células productoras de IFNγ se determinan por el uso de anticuerpo anti-IFNγ secundario etiquetado y un sustrato relevante que da lugar a manchas, que pueden enumerarse utilizando un microscopio de disección. Es también una posibilidad

30 determinar la presencia de mRNA codificante de la citoquina relevante por el uso de la técnica PCR. Usualmente se medirán una o más citoquinas utilizando por ejemplo la PCR, ELISPOT o ELISA. Se apreciará por una persona experta en la técnica que un aumento o disminución significativo(a) en la cantidad de cualquiera de estas citoquinas inducidas por un polipéptido específico puede utilizarse en la evaluación de la actividad inmunológica del polipéptido.

35 ● Una respuesta celular in vitro puede determinarse también por el uso de líneas de células T derivadas de un individuo inmune o una persona infectada por C. trachomatis en donde las líneas de células T han sido activadas por cualquier Chlamydia viva o por extractos de la célula bacteriana durante 10 a 20 días con la adición de IL-2. La inducción se realiza por adición de no más que 20 µg de polipéptido por ml de suspensión a las líneas de células T que contienen de 1 x 105 células a 3 x 105 células por pocillo y realizándose la

40 incubación durante 2 a 6 días. La inducción de IFNγ o liberación de cualquier otra citoquina relevante se detecta por ELISA. La estimulación de las células T puede monitorizarse también por detección de la proliferación celular utilizando timidina etiquetada radiactivamente como se ha descrito arriba. Para ambos ensayos, una respuesta positiva es una respuesta mayor que el ruido de fondo más dos desviaciones estándar.

45 ● Una respuesta celular in vivo que puede determinarse como una respuesta DTH positiva después de inyección intradérmica o parche de aplicación local de como máximo 100 µg del polipéptido o la porción inmunógena a un individuo que está clínica o subclínicamente infectado con Chlamydia, teniendo una respuesta positiva un diámetro de al menos 5 mm 72-96 horas después de la inyección o aplicación.

● Una respuesta humoral in vitro se determina por una respuesta específica de anticuerpos en un individuo

50 inmune o infectado. La presencia de anticuerpos puede determinarse por la técnica ELISA o una transferencia Western donde el polipéptido o la porción inmunógena se absorbe en una membrana de nitrocelulosa o una superficie de poliestireno. El suero se diluye preferiblemente en PBS de 1:10 a 1:100 y se añade al polipéptido absorbido, realizándose la incubación durante 1 a 12 horas. Por el uso de anticuerpos etiquetados secundarios, puede determinarse la presencia de anticuerpos específicos por medida de la DO,

55 v.g. por ELISA donde una respuesta positiva es una respuesta mayor que el ruido de fondo más dos desviaciones estándar o, alternativamente, una respuesta visual en una transferencia Western.

● Otro parámetro relevante es la medida de la protección en modelos animales inducida después de vacunación con el polipéptido en un adyuvante o después de vacunación con DNA. Modelos animales adecuados incluyen primates, cobayos o ratones, que están enfrentados a una infección de Chlamydia. La

lectura para la protección inducida podría ser disminución de la carga bacteriana en órganos diana comparada con animales no vacunados, tiempos de supervivencia prolongados comparados con los animales no vacunados y disminución de la pérdida de peso comparada con los animales no vacunados.

Métodos de preparación

En general, los antígenos de C. trachomatis, y las secuencias de DNA que codifican tales antígenos, pueden prepararse utilizando uno cualquiera de una diversidad de procedimientos.

Los mismos pueden purificarse como proteínas nativas de la célula de C. trachomatis por procedimientos tales como los arriba descritos. Pueden producirse también antígenos inmunógenos recombinantemente utilizando una secuencia de DNA que codifica el antígeno, que ha sido insertada en un vector de expresión y expresada en un hospedador apropiado. Ejemplo de células hospedadoras son E. coli. Los polipéptidos o porción inmunógena de los mismos pueden producirse también sintéticamente teniendo menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de 50 aminoácidos, y pueden generarse utilizando métodos bien conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica, tales como técnicas en fase sólida disponibles comercialmente en las que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento.

En la construcción y preparación de DNA plasmídico codificante del polipéptido como se define para vacunación con DNA, puede utilizarse una cepa hospedadora tal como E. coli. El DNA plasmídico puede prepararse luego a partir de cultivos nocturnos de la cepa hospedadora que lleva el plásmido de interés, y purificarse utilizando p.ej. el kit de columnas Qiagen Giga-Plasmid (Qiagen, Santa Clarita, CA, EE.UU.) incluyendo un paso de eliminación de endotoxinas. Es esencial que el DNA plasmídico utilizado para la vacunación con DNA esté exento de endotoxinas.

Proteínas de fusión

Los polipéptidos inmunógenos pueden producirse también como proteínas de fusión, por cuyos métodos pueden conseguirse características excelentes del polipéptido de la invención. Por ejemplo, parejas de difusión que facilitan la exportación del polipéptido cuando se producen recombinantemente, parejas de fusión que facilitan la purificación del polipéptido, y parejas de fusión que mejoran la inmunogenicidad del fragmento de polipéptido de la invención, son todas ellas posibilidades interesantes. Por tanto, la invención se refiere también a un polipéptido de fusión que comprende al menos un polipéptido o porción inmunógena arriba definida y al menos una pareja de fusión. A fin de mejorar la inmunogenicidad, la pareja de fusión puede ser otro polipéptido derivado de C. trachomatis, tal como un fragmento de polipéptido derivado de especies de Chlamydia, tales como CT812, CT579, CT587 (Goodall, Yeo et al. 2001), Cap (Fling, Sutherland et al. 2001), CT713 (Kubo y Stephens 2000), CT442 (Starnbach, Loomis et al. 2003),

o MOMP (Stephens, Wagar et al. 1998) o al menos un epítope de células T o epítope de células B de cualquiera de los arriba mencionados. La invención se refiere también a un polipéptido de fusión que comprende fusiones mutuas de dos o más de los polipéptidos (o porciones inmunógenas de los mismos) de la invención.

Otras parejas de fusión, que podrían mejorar la inmunogenicidad del producto, son linfoquinas tales como IFNγ, IL-2 e IL-12. Con objeto de facilitar la expresión y/o purificación, la pareja de fusión puede ser v.g. una proteína bacteriana fimbrial, v.g. los componentes del pilus pilina y papA; proteína A; el péptido ZZ (las fusiones ZZ están comercializadas por Pharmacia en Suecia); la proteína de fijación de maltosa; glutatión S-transferasa; βgalactosidasa; o poli-histidina. Las proteínas de fusión pueden producirse recombinantemente en una célula hospedadora, que podría ser E. coli, y es una posibilidad inducir una región enlazadora entre las diferentes parejas de fusión.

Otras parejas de fusión interesantes son polipéptidos que están lipidados a fin de que el polipéptido inmunógeno se presente de una manera adecuada al sistema inmunitario. Este método es conocido v.g. por vacunas basadas en el polipéptido OspA de C Borrelia burgdorferi como se describe v.g. en WO 96/40718A o vacunas basadas en la lipoproteína OprI de Pseudomonas aeruginosa (Cote-Sierra, Jongert et al. 1998). Otra posibilidad es la fusión N-terminal de una secuencia señal conocida y una cisteína N-terminal al polipéptido inmunógeno. Una fusión de este tipo da como resultado la lipidación del polipéptido inmunógeno en la cisteína del terminal N, cuando se produce en un hospedador de protección adecuado.

Composición farmacéutica

Una composición farmacéutica se define como cualquier vacuna (tanto terapéutica como profiláctica) o cualquier reactivo de diagnóstico como se describe en lo que sigue.

Vacuna, proteína

Otra parte de la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende un polipéptido de fusión polipeptídica de acuerdo con la invención. A fin de asegurar la eficiencia óptima de una composición de vacuna de este tipo, se prefiere que la misma comprenda un portador, vehículo o adyuvante inmunológica y farmacéuticamente aceptable.

Una vacuna eficaz, en la que un polipéptido de la invención es reconocido por el animal, será capaz de reducir en un modelo animal la carga bacteriana en órganos diana, prolongar los tiempos de supervivencia y/o reducir la pérdida de peso después de enfrentamiento con Chlamydia virulenta, comparada con los animales no vacunados.

Portadores adecuados se seleccionan del grupo constituido por un polímero al que se fija(n) el o los polipéptidos por interacción hidrófoba no covalente, tal como un plástico, v.g. poliestireno, o un polímero al que se fija(n) covalentemente el o los polipéptidos, tal como un polisacárido, un polipéptido, v.g. seroalbúmina bovina, ovoalbúmina, o hemocianina de lapa bocallave. Vehículos adecuados se seleccionan del grupo constituido por un diluyente y un agente de suspensión. El adyuvante se selecciona preferiblemente del grupo constituido por bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), Quil A, poli-LC, hidróxido de aluminio, adyuvante incompleto de Freund, IFNγ, IL2, IL-12, lípido monofosforilado A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), dibehenato de trehalosa (TDB) y muramildipéptido (MDP).

La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos está generalmente bien comprendida en la técnica, como se ilustra por las patentes U.S. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231 y 4.599.230, todas las cuales se incorporan en esta memoria por referencia.

Pueden emplearse también otros métodos de consecución de efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alumbre), polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol), agregación de la proteína en la vacuna por tratamiento térmico, agregación por reactivación con anticuerpos para albúmina tratados con pepsina (Fab), mixtura con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas, emulsión en vehículos aceitosos fisiológicamente aceptables tales como mono-oleato de manida (Aracel A), o emulsión con solución al 20% de un perfluorocarbono (Fluosol-DA) utilizado como sustituto de bloqueo. Otras posibilidades implican el uso de sustancias inmunomoduladoras tales como citoquinas o inductores de IFNγ sintéticos tales como poli I:C en combinación con los adyuvantes arriba mencionados.

Otra posibilidad interesante para conseguir el efecto adyuvante consiste en emplear la técnica descrita en Gosselin, Wardwell et al. 1992 (que se incorpora por la presente en esta memoria por referencia). En resumen, un antígeno relevante tal como un antígeno de la presente invención puede conjugarse con un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de fijación de antígeno) contra los receptores Fcγ en monocitos macrófagos.

Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunógena. La cantidad a administrar depende del individuo a tratar, incluyendo, v.g., la capacidad del sistema inmunitario del individuo para montar una respuesta inmune, y el grado de protección deseado. Intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios centenares de microgramos de ingrediente activo por vacunación, con un intervalo preferido de aproximadamente 0,11 µg a 1000 µg, comprendido por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 1 µg a 300 µg, especialmente en el intervalo de aproximadamente 10 µg a 50 µg. Los regímenes adecuados para administración inicial y dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones u otras administraciones subsiguientes.

La manera de aplicación puede variar ampliamente. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para administración de una vacuna. Se cree que éstos incluyen aplicación oral sobre una base fisiológicamente aceptable

o en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, por inyección o métodos análogos. La dosificación de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunar y, en menor grado, con el volumen de la persona a vacunar.

Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, aglomerantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilen-glicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden estar formados por mixturas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y análogos. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen ventajosamente 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.

En muchos casos, será necesario realizar administraciones múltiples de la vacuna. Especialmente, las vacunas pueden administrarse para prevenir una infección con Chlamydia y/o para tratar una infección de Chlamydia establecida. Cuando se administra para prevenir una infección, la vacuna se aplica profilácticamente, antes que se presenten signos o síntomas clínicos definitivos de una infección.

Debido a la variación genética, diferentes individuos pueden reaccionar al mismo polipéptido con respuestas inmunes de intensidad variable. Por consiguiente, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender varios polipéptidos diferentes a fin de aumentar la respuesta inmunitaria. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos o porciones inmunógenas, donde la totalidad de los polipéptidos son como se ha definido arriba, o algunos, pero no todos los polipéptidos pueden derivarse de una o más de las otras serovariantes de Chlamydia. En

el último ejemplo, los polipéptidos que no satisfacen necesariamente los criterios arriba indicados para los polipéptidos pueden actuar debido a su propia inmunogenicidad o actuar simplemente como adyuvantes.

La vacuna puede comprender 1-20, tal como 2-20 o incluso 3-20 polipéptidos de fusión diferentes tales como 3-10 polipéptidos de fusión diferentes.

DNA de vacuna

Los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para efectuar la expresión in vivo de antígenos, es decir que los fragmentos de ácido nucleico pueden utilizarse en las denominadas vacunas de DNA como se ha revisado en Ulmer, Donmelly et al. 1993, que se incluye por referencia.

Por tanto, la invención se refiere también a una vacuna que comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, efectuando la vacuna la expresión in vivo del antígeno por un animal, con inclusión de un ser humano, al que se ha administrado la vacuna, siendo la cantidad de antígeno expresada eficaz para conferir una resistencia sustancialmente incrementada a las infecciones causadas por Chlamydia virulenta en un animal, con inclusión de un ser humano.

La eficacia de una vacuna de DNA de este tipo puede mejorarse posiblemente por administración del gen codificante del producto de expresión junto con un fragmento de DNA que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de modular una respuesta inmune.

Vacunas recombinantes vivas

Una posibilidad para activar eficazmente una respuesta celular inmune a una vacuna puede conseguirse por expresión del antígeno relevante en una vacuna en un microorganismo o virus no patógeno. Ejemplos bien conocidos de tales microorganismos son Mycobacterium bovis BCG, Salmonella y Pseudomonas, y ejemplos de virus son el virus Vaccinia y Adenovirus.

Otra posibilidad consiste en integrar el DNA codificante del polipéptido de acuerdo con la invención en un virus atenuado tal como el virus Vaccinia o Adenovirus (Rolph y Ramshaw) 1997). El virus Vaccinia recombinante puede replicarse dentro del citoplasma de la célula hospedadora infectada y el polipéptido de interés puede inducir por tanto una respuesta inmune, que se considera induce protección contra Chlamydia.

Vacuna terapéutica

La invención se refiere también al uso de un polipéptido o ácido nucleico de la invención para uso como vacunas terapéuticas, como se ha descrito en la bibliografía ilustrada por D. Lowry (Lowry et al 1999). Los antígenos con propiedades terapéuticas pueden identificarse basándose en su capacidad para reducir la gravedad de la infección de C. trachomatis en animales experimentales o prevenir la reactivación de una infección previa, cuando se administran como vacuna. La composición utilizada para vacunas terapéuticas puede prepararse como se ha descrito arriba para vacunas.

Proteína de diagnóstico

Cuando la finalidad es el diagnóstico de una infección previa o en curso con Chlamydia virulenta, una muestra de sangre que comprende células mononucleares (es decir linfocitos T) de un paciente podría ponerse en contacto con una muestra de uno o más polipéptidos de la invención. Esta puesta en contacto puede realizarse in vitro y una reacción positiva podría ser, v.g., la proliferación de las células T o la liberación de citoquinas tales como IFNγ en la fase extracelular. Es también imaginable la puesta en contacto de una muestra de suero de un individuo con un polipéptido de la invención, siendo la demostración de una unión entre los anticuerpos en la muestra de suero y el polipéptido indicativa de infección previa o en curso.

La invención se refiere también por consiguiente a un método in vitro para diagnóstico de la sensibilización en curso

o previa en un animal o un ser humano con una especie de Chlamydia, comprendiendo el método proporcionar una muestra de sangre del animal o ser humano, y poner en contacto la muestra del animal con el polipéptido de la invención, siendo una liberación significativa en la fase extracelular de al menos una citoquina por las células mononucleares en la muestra de sangre indicativa de que el animal está sensibilizado. Una respuesta positiva es una respuesta mayor que la liberación de una muestra de sangre derivada de un paciente sin el diagnóstico de Chlamydia más dos desviaciones estándar. La invención se refiere también al método in vitro para diagnóstico de una sensibilización en curso o previa en un animal o ser humano con Chlamydia, comprendiendo el método proporcionar una muestra de sangre del animal o ser humano, y poner en contacto la muestra del animal con el polipéptido de la invención, demostrando la presencia de anticuerpos que reconocen el polipéptido de la invención en la muestra de suero. La composición inmunógena utilizada para diagnóstico puede comprender 1-20, tal como 220 o incluso 3-20 polipéptidos o polipéptidos de fusión diferentes, tales como 3-10 polipéptidos o polipéptidos de fusión diferentes.

DNA de diagnóstico

Las sondas de ácido nucleico que modifican el polipéptido de la invención pueden utilizarse en una diversidad de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra dada. Se incluye también en la invención un método de determinación de la presencia de ácidos nucleicos de Chlamydia en un 5 animal, con inclusión de un ser humano, o en una muestra, que comprende administrar un fragmento de ácido nucleico de la invención al animal o incubar la muestra con el fragmento de ácido nucleico de la invención o un fragmento de ácido nucleico complementario del mismo, y detectar la presencia de ácidos nucleicos hibridados como resultado de la incubación (por utilización de los ensayos de hibridación que son bien conocidos en la técnica),. Un método de este tipo de diagnóstico de la infección de Chlamydia podría implicar el uso de una

10 composición que comprenda al menos una parte de una secuencia de nucleótidos como se ha definido arriba y detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en una muestra del animal o ser humano a testar que se hibrida con el fragmento de ácido nucleico (o un fragmento complementario) por el uso de la técnica PCR.

Anticuerpos

Un anticuerpo monoclonal, que reacciona específicamente con un polipéptido de la invención en un inmunoensayo,

15 o un fragmento de fijación específico de dicho anticuerpo, es también una parte de la invención. Los anticuerpos pueden producirse por métodos conocidos por la persona experta en la técnica. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención pueden producirse, por ejemplo, por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein (1975), o pueden producirse por métodos de DNA recombinante tales como los descritos en la patente U.S. No. 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse también de bibliotecas de fago

20 generadas utilizando las técnicas descritas por McCafferty, Griffiths et al. 1990), por ejemplo. Métodos para producción de anticuerpos se describen en la bibliografía, v.g. en US 6.136.958.

Una muestra de un órgano potencialmente infectado puede ponerse en contacto con un anticuerpo de este tipo que reconoce un polipéptido de la invención. La demostración de la reacción por medio de métodos bien conocidos en la técnica entre la muestra y el anticuerpo será indicativa de una infección en curso. Por supuesto es también una

25 posibilidad demostrar la presencia de anticuerpos anti-Chlamydiales en suero por puesta en contacto de una muestra de suero de un individuo con al menos uno de los fragmentos polipeptídicos de la invención y utilizando métodos bien conocidos para visualización de la reacción entre el anticuerpo y el antígeno.

En diagnósticos, un anticuerpo, un fragmento de ácido nucleico y/o un polipéptido de la invención pueden utilizarse sea solos, o como un constituyente en una composición. Tales composiciones se conocen en la técnica, y 30 comprenden composiciones en las cuales el anticuerpo, el fragmento de ácido nucleico o el polipéptido de la invención se acopla, preferiblemente de modo covalente, a al menos otra molécula, v.g., una etiqueta (v.g. radiactiva

o fluorescente) o una molécula portadora.

La presente invención describe componentes antigénicos de C. trachomatis que tienen:

1) la capacidad para estimular las células T de pacientes con una infección urogenital de Chlamydia para 35 secretar IFNγ,o

2) la capacidad para estimular las células T de pacientes con una infección urogenital de Chlamydia para secretar citoquinas que inhiben el crecimiento de Chlamydia in vitro, o

3) es reconocida por los anticuerpos IgG, y/o IgM, y/o IgA del suero de pacientes con una infección urogenital de Chlamydia,o

40 4) es reconocida por las células T y/o anticuerpos de ratones infectados experimentalmente con Chlamydia muridarum y/o C. trachomatis,o

5) es capaz por administración de inducir una respuesta inmunitaria en ratones que reconocen el antígeno bacteriano de C. trachomatis,o

6) es capaz por vacunación de proporcionar al menos una inmunidad parcial contra una infección por 45 enfrentamiento experimental a Chlamydia muridarum y/o C. trachomatis.

En primer lugar, con objeto de identificar las dianas moleculares de las células T protectoras entre proteínas de C. trachomatis, se fraccionó un lisado de proteínas de C. trachomatis serovar D (cepa UW-3/Cx, ATCC No: VR-885) por la técnica de multi-elución (Andersen y Heron 1993). Esta técnica separa las proteínas en una mixtura proteínica compleja de acuerdo con sus pesos moleculares en fracciones estrechas que se utilizan luego para estimular 50 Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMCs) in vitro. Después de varios días de incubación, se monitoriza la liberación de IFNγ por ELISA (Fig. 1). Las respuestas de los pacientes de Chlamydia se compararon con las respuestas de donantes de sangre normales sin diagnóstico previo de infección de Chlamydia. Esta comparación permite la identificación de las proteínas de C. trachomatis que tienen la capacidad para desencadenar las células efectoras T para liberar IFNγ durante las primeras fases de la infección humana. Utilizando este enfoque, se 55 demostró que las dianas para estas células T protectoras son proteínas o fragmentos de proteínas con pesos

moleculares aparentes de 5-12, 16-20, 25-35 y 58-74 kDa (Figs. 2 y 3). La identidad precisa de las proteínas bacterianas dentro de cada región estimuladora se determinó por espectrometría de masas.

Para identificar y caracterizar adicionalmente los antígenos estimuladores, cada uno de los antígenos específicos de

C. trachomatis pueden ser a) antígenos purificados de extractos de C. trachomatis como se ilustra en el Ejemplo 1, b) antígenos producidos y purificados de E. coli como se ilustra en el Ejemplo 1, c) péptidos sintéticos superpuestos como se ilustra en el Ejemplo 1, o d) transducción de PBMC de un paciente diana directamente con constructos recombinantes de Adenovirus como se ilustra por el Ejemplo 5. Este método permitía la identificación de antígenos simples y péptidos derivados de los mismos dentro de cada región estimuladora con capacidad estimulante excesiva medida por la liberación de IFNγ como se ilustra en la Figura 4.

En segundo lugar, se construyó una biblioteca de expresión dirigida por amplificación de genes de C. trachomatis de longitud total por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos de genes que contenían una secuencia Kozak en el cebador 5' y un codón de parada en el cebador 3'. Se utilizó DNA genómico de

C. trachomatis serovar D como molde para las reacciones PCR y se utilizó un programa UNIX recientemente desarrollado para diseño automático de cebadores incluyendo la posición de los cebadores en el gen de interés y Tm. Se insertaron primeramente amplicones por recombinación en el "vector de entrada" Gateway (Invitrogen) y se transfirieron luego por recombinación al vector de expresión pDEST17 (Invitrogen), que contiene un marcador His6 y las mismas secuencias de recombinación que el vector de entrada. Se cribaron clones individuales respecto a la expresión de antígenos de C. trachomatis por el método de transferencia de colonias (French Maul y Maul 1986) utilizando una agrupación de muestras de suero humano con niveles elevados de anticuerpos específicos de C. trachomatis IgG, IgM o IgA. Los filtros de nitrocelulosa utilizados para el levantamiento de las colonias se habían impregnado previamente en solución de arabinosa al 1% a fin de inducir la transcripción originada por el promotor de plásmido codificado antes de la lisis celular. Los clones positivos que se fijaban a los anticuerpos IgG, IgM, IgA del suero de los pacientes de Chlamydia se seleccionaron para análisis ulterior por transferencia Western utilizando la misma agrupación de muestras de suero utilizada para el cribado inicial. Este método condujo a la identificación de clones que codifican proteínas de C. trachomatis inmunorreactivas de relevancia como vacunas y agentes de diagnóstico.

En tercer lugar, se construyó una biblioteca de expresión genómica en el fago lambda gt11 de E. coli (λgt11). Se extrajo el DNA cromosómico de peso molecular alto de C. trachomatis serovar D a partir de cuerpos elementales en un tampón de lisis que contenía SDS (1%) y Proteinasa K (100 µg/ml) seguido por extracción con fenol y precipitación con etanol. El DNA se degradó parcialmente por tratamiento con ultrasonidos y los fragmentos de DNA de 0,2-0,8 kb de tamaño se ligaron en λgt11. La mixtura de ligación se empaquetó in vitro y los fagos recombinantes se extendieron en placas sobre E. coli Y1090r -produciendo una biblioteca de expresión genómica que contenía aproximadamente 3,4 x 105 fagos lambda primarios. Esta biblioteca primaria se amplificó para dar como resultado una biblioteca de expresión aleatoria del genoma con 0,7 x 106 PFU/ml. En un primer experimento, esta biblioteca se cribó por un método de levantamiento de calvas utilizando la misma agrupación de muestras de suero humano utilizada anteriormente para el cribado de la biblioteca de expresión de longitud total. Se identificaron 88 calvas inmunorreactivas que se fijaban a los anticuerpos IgG, IgM o IgA específicos de C. trachomatis. Estas placas se agruparon en 8 agrupaciones (2 agrupaciones de placas reactivas de IgA, 5 agrupaciones de placas reactivas de IgG y una agrupación de placas reactivas de IgM) y se cribaron de nuevo con la misma agrupación de sueros (anticuerpo primario) utilizada en el cribado inicial. Se aislaron placas de fago sero-reactivas individuales y se determinaron las secuencias de las inserciones de DNA de los fagos serorreactivos individualmente. Este método identificó varios clones que codificaban péptidos inmunorreactivos con C. trachomatis de relevancia como vacunas y como agentes de diagnóstico.

Por último, se han establecido modelos animales de la enfermedad en roedores pequeños a fin de identificar antígenos que son reconocidos por el sistema inmune de los murinos durante una infección experimental de Chlamydia o proporcionar al menos inmunidad parcial contra una infección de Chlamydia. Las diferentes especies de Chlamydia exhiben un alto grado de especificidad frente a su hospedador natural. Así, C. trachomatis serovar D utilizada en las diferentes estrategias de cribado arriba descritas es un patógeno humano, que no causa cambios patológicos en los ratones como los asociados normalmente con la infección humana. Por el contrario, los ratones pueden ser infectados experimentalmente con la cepa estrechamente relacionada de Chlamydia muridarum MoPn, y varios investigadores han demostrado previamente la inducción de inmunidad parcial contra la infección experimental de MoPn. Por ello ha sido establecido y validado un modelo de infección genital en ratones C57. La eficacia protectora de diferentes antígenos se estudió en este modelo por evaluación 1) de los recuentos bacterianos por frotis cervicales, 2) cambios patológicos en el tracto genital, y 3) ensayos celulares in vitro para células inmunes reactivas.

Tabla 1: Antígenos de Chlamydia

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

CT043

SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2

CT511

SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4

CT521

SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 6

CT616

SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8

CT803

SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 10

CT067

SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 12

CT679

SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14

CT583

SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16

CT603

SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 18

CT026

SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 20

CT093

SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 22

CT357

SEQ ID NO. 23 SEQ ID NO. 24

CT659

SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 26

CT111

SEQ ID NO. 27 SEQ ID NO. 28

CT509

SEQ ID NO. 29 SEQ ID NO. 30

CT587

SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 32

CT023

SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 34

CT025

SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 36

CT078

SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 38

CT082

SEQ ID NO. 39 SEQ ID NO. 40

CT118

SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 42

CT174

SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44

CT003

SEQ ID NO. 45 SEQ ID NO. 46

CT005

SEQ ID NO. 47 SEQ ID NO. 48

CT027

SEQ ID NO. 49 SEQ ID NO. 50

CT032

SEQ ID NO. 51 SEQ ID NO. 52

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

CT008

SEQ ID NO. 53 SEQ ID NO. 54

CT016

SEQ ID NO. 55 SEQ ID NO. 56

CT028

SEQ ID NO. 57 SEQ ID NO. 58

CT035

SEQ ID NO. 59 SEQ ID NO. 60

CT141

SEQ ID NO. 61 SEQ ID NO. 62

CT643

SEQ ID NO. 63 SEQ ID NO. 64

CT414

SEQ ID NO. 65 SEQ ID NO. 66

CT874

SEQ ID NO. 67 SEQ ID NO. 68

CT456

SEQ ID NO. 69 SEQ ID NO. 70

CT681

SEQ ID NO. 71 SEQ ID NO. 72

CT123

SEQ ID NO. 73 SEQ ID NO. 74

CT125

SEQ ID NO. 75 SEQ ID NO. 76

CT126

SEQ ID NO. 77 SEQ ID NO. 78

CT133

SEQ ID NO. 79 SEQ ID NO. 80

CT150

SEQ ID NO. 81 SEQ ID NO. 82

CT175

SEQ ID NO. 83 SEQ ID NO. 84

CT376

SEQ ID NO. 85 SEQ ID NO. 86

CT083

SEQ ID NO. 87 SEQ ID NO. 88

CT089

SEQ ID NO. 89 SEQ ID NO. 90

CT155

SEQ ID NO. 91 SEQ ID NO. 92

CT168

SEQ ID NO. 93 SEQ ID NO. 94

CT184

SEQ ID NO. 95 SEQ ID NO. 96

CT124

SEQ ID NO. 97 SEQ ID NO. 98

CT336

SEQ ID NO. 99 SEQ ID NO. 100

CT342

SEQ ID NO. 101 SEQ ID NO. 102

CT842

SEQ ID NO. 103 SEQ ID NO. 104

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

CT323

SEQ ID NO. 105 SEQ ID NO. 106

CT080

SEQ ID NO. 107 SEQ ID NO. 108

CT084

SEQ ID NO. 109 SEQ ID NO. 110

CT110

SEQ ID NO. 111 SEQ ID NO. 112

CT119

SEQ ID NO. 113 SEQ ID NO. 114

CT541

SEQ ID NO. 115 SEQ ID NO. 116

CT443

SEQ ID NO. 117 SEQ ID NO. 118

CT795

SEQ ID NO. 119 SEQ ID NO. 120

CT396

SEQ ID NO. 121 SEQ ID NO. 122

CT283

SEQ ID NO. 123 SEQ ID NO. 124

CT051

SEQ ID NO. 125 SEQ ID NO. 126

CT002

SEQ ID NO. 185 SEQ ID NO. 186

CT009

SEQ ID NO. 187 SEQ ID NO. 188

CTO15

SEQ ID NO. 189 SEQ ID NO. 190

CT030

SEQ ID NO. 191 SEQ ID NO. 192

CT048

SEQ ID NO. 193 SEQ ID NO. 194

CT061

SEQ ID NO. 195 SEQ ID NO. 196

CT063

SEQ ID NO. 197 SEQ ID NO. 198

CT068

SEQ ID NO. 199 SEQ ID NO. 200

CT071

SEQ ID NO. 201 SEQ ID NO. 202

CT115

SEQ ID NO. 203 SEQ ID NO. 204

CT678

SEQ ID NO. 205 SEQ ID NO. 206

CT561

SEQ ID NO. 207 SEQ ID NO. 208

CT538

SEQ ID NO. 209 SEQ ID NO. 210

CT582

SEQ ID NO. 211 SEQ ID NO. 212

CT875

SEQ ID NO. 213 SEQ ID NO. 214

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

CT322

SEQ ID NO. 215 SEQ ID NO. 216

CT112

SEQ ID NO. 217 SEQ ID NO. 218

CT315

SEQ ID NO. 219 SEQ ID NO. 220

CT610

SEQ ID NO. 221 SEQ ID NO. 222

CT147

SEQ ID NO. 223 SEQ ID NO. 224

CT228

SEQ ID NO. 225 SEQ ID NO. 226

CT232

SEQ ID NO. 227 SEQ ID NO. 228

CT614

SEQ ID NO. 229 SEQ ID NO. 230

CT098

SEQ ID NO. 231 SEQ ID NO. 232

CT265

SEQ ID NO. 233 SEQ ID NO. 234

CT375

SEQ ID NO. 235 SEQ ID NO. 236

CT004

SEQ ID NO. 237 SEQ ID NO. 238

CT038

SEQ ID NO. 239 SEQ ID NO. 240

CT040

SEQ ID NO. 241 SEQ ID NO. 242

CT052

SEQ ID NO. 243 SEQ ID NO. 244

CT053

SEQ ID NO. 245 SEQ ID NO. 246

CT201

SEQ ID NO. 247 SEQ ID NO. 248

CT245

SEQ ID NO. 249 SEQ ID NO. 250

CT246

SEQ ID NO. 251 SEQ ID NO. 252

CT405

SEQ ID NO. 253 SEQ ID NO. 254

CT420

SEQ ID NO. 255 SEQ ID NO. 256

CT426

SEQ ID NO. 257 SEQ ID NO. 258

CT507

SEQ ID NO. 259 SEQ ID NO. 260

CT512

SEQ ID NO. 261 SEQ ID NO. 262

CT513

SEQ ID NO. 263 SEQ ID NO. 264

CT514

SEQ ID NO. 265 SEQ ID NO. 266

Antígeno de Chlamydia

Secuencia de proteína Secuencia de DNA

CT516

SEQ ID NO. 267 SEQ ID NO. 268

CT316

SEQ ID NO. 269 SEQ ID NO. 270

CT439

SEQ ID NO. 271 SEQ ID NO. 272

CT492

SEQ ID NO. 273 SEQ ID NO. 274

CT520

SEQ ID NO. 275 SEQ ID NO. 276

CT523

SEQ ID NO. 277 SEQ ID NO. 278

CT526

SEQ ID NO. 279 SEQ ID NO. 280

CT611

SEQ ID NO. 281 SEQ ID NO. 282

CT613

SEQ ID NO. 283 SEQ ID NO. 284

CT626

SEQ ID NO. 285 SEQ ID NO. 286

CT630

SEQ ID NO. 287 SEQ ID NO. 288

CT647

SEQ ID NO. 289 SEQ ID NO. 290

CT649

SEQ ID NO. 291 SEQ ID NO. 292

CT725

SEQ ID NO. 293 SEQ ID NO. 294

CT734

SEQ ID NO. 295 SEQ ID NO. 296

CT779

SEQ ID NO. 297 SEQ ID NO. 298

CT801

SEQ ID NO. 299 SEQ ID NO. 300

CT833

SEQ ID NO. 301 SEQ ID NO. 302

CT835

SEQ ID NO. 303 SEQ ID NO. 304

CT836

SEQ ID NO. 305 SEQ ID NO. 306

CT845

SEQ ID NO. 307 SEQ ID NO. 308

Tabla : Fragmentos antigénicos de Chlamydia

Fragmento peptídico

Secuencia de aminoácidos Secuencia de DNA

CT541-PF1 (aa pos. 111-243)

SEQ ID NO. 127 SEQ ID NO. 128

CT443-PF1 (aa pos. 214-291)

SEQ ID NO. 129 SEQ ID NO. 130

Fragmento peptídico

Secuencia de aminoácidos Secuencia de DNA

CT795-PF1 (aa pos. 1-163)

SEQ ID NO. 131 SEQ ID NO. 132

CT396-PF1 (aa pos. 170-318)

SEQ ID NO. 133 SEQ ID NO. 134

CT842-PF1 (aa pos.433-515)

SEQ ID NO. 135 SEQ ID NO. 136

CT283-PF1 (aa pos. 477-577)

SEQ ID NO. 137 SEQ ID NO. 138

CT874-PF1 (aa pos. 330-426)

SEQ ID NO. 139 SEQ ID NO. 140

CT051-PF1 (aa pos. 38-177)

SEQ ID NO. 141 SEQ ID NO. 142

CT141-PF1 (aa pos. 17-126)

SEQ ID NO. 143 SEQ ID NO. 144

CT643-PF (aa pos. 769-841)

SEQ ID NO. 145 SEQ ID NO. 146

CT681-PF1 (aa pos. 156-391)

SEQ ID NO. 147 SEQ ID NO. 148

CT681-PF2 (aa pos. 199-329)

SEQ ID NO. 149 SEQ ID NO. 150

CT681-PF3 (aa pos. 294-349)

SEQ ID NO. 151 SEQ ID NO. 152

CT414-PF1 (aa pos. 605-722)

SEQ ID NO. 153 SEQ ID NO. 154

CT414-PF2 (aa pos. 463-530)

SEQ ID NO. 155 SEQ ID NO. 156

CT456-PF1 (aa pos. 695-840)

SEQ ID NO. 157 SEQ ID NO. 158

CT456-PF2 (aa pos. 137-229)

SEQ ID NO. 159 SEQ ID NO. 160

CT456-PF3 (aa pos. 243-321)

SEQ ID NO. 161 SEQ ID NO. 162

CT456-PF4 (aa pos. 209-291)

SEQ ID NO. 163 SEQ ID NO. 164

CT456-PF5 (aa pos. 175-279)

SEQ ID NO. 165 SEQ ID NO. 166

CT456-PF6 (aa pos. 567-730)

SEQ ID NO. 167 SEQ ID NO. 168

CT456-PF7 (aa pos. 210-540)

SEQ ID NO. 169 SEQ ID NO. 170

CT456-PF8 (aa pos. 190-279)

SEQ ID NO. 171 SEQ ID NO. 172

CT521-PF1 (aa pos. 14-36)

SEQ ID NO. 173 SEQ ID NO. 174

CT521-PF2 (aa pos. 40-62)

SEQ ID NO. 175 SEQ ID NO. 176

CT521-PF3 (aa pos. 52-75)

SEQ ID NO. 177 SEQ ID NO. 178

CT521-PF4 (aa pos. 66-88)

SEQ ID NO. 179 SEQ ID NO. 180

CT521-PF5 (aa pos. 116-138)

SEQ ID NO. 181 SEQ ID NO. 182

Fragmento peptídico

Secuencia de aminoácidos Secuencia de DNA

CT504-PF1 (reverse)

SEQ ID NO. 183 SEQ ID NO. 184

Leyendas de las figuras

Figura 1 Reactividad celular para un lisado de C. trachomatis serovar D. Respuestas a IFNγ de PBMC's aislados de 6

donantes de control y 15 pacientes. Se estimularon PBMC's con 5 µg/ml de un lisado de C. trachomatis y se determinó la liberación de IFNγ 5 días más tarde en los sobrenadantes. Figura 2 Fracciones de proteína de C. trachomatis serovar D. Un lisado de la bacteria se separó en fracciones

moleculares estrechas por la técnica de multielución. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y tinción con plata. La migración de los marcadores de peso molecular se muestra a la derecha (pista 1) en kilodaltons. El lisado se muestra en las pistas tercera y última.

Figura 3 Reconocimiento por las células T humanas de fracciones proteínicas de C. trachomatis serovar D. PBMC's aislados de 8 pacientes de Chlamydia (que respondían al lisado completo > 1000 pg/ml) y 6 donantes de

control se estimularon con 2 µg/ml de las fracciones individuales. La liberación de IFNγ se midió en los sobrenadantes 5 días más tarde. La línea corta indica la liberación media de IFNγ. Figura 4 Respuestas de las células T a proteínas recombinantes en cuatro pacientes y 3 controles. Se estimularon

PBMC's con 5 µg/ml de rCT521, rCT511, rCT616, rCT043 y rCT803. Los valores que se muestran son las medias de IFNγ para cultivos triplicados. Figura 5 El reconocimiento de rCT521 en 41 pacientes de Chlamydia (todos los cuales respondían a un lisado de C.

trachomatis serovar D con más 1500 pg/ml de IFNγ y 11 donantes de control que respondían con menos de 1500 pg/ml de IFNγ al lisado. Se estimularon PBMC's con rCT521 (5 µg/ml) y una agrupación de péptidos CT521 superpuestos (10 µg/ml cada uno) y se midió el nivel de IFNγ en los sobrenadantes. C: pocillos de control sin antígeno. Las líneas cortas indican el valor medio de IFNγ (pg/ml).

Figura 6

Liberación de IFNγ estimulada con péptidos CT521 (10 µg/ml). Las líneas cortas indican la liberación media de IFNγ para cada péptido. El punto de corte se establece a 200 pg/ml de IFNγ (línea). Figura 7 Liberación de IFNγ por PBMC transducidos con diferentes Adenovirus recombinantes codificantes de

antígenos de C. trachomatis. Los PBMC de los pacientes se transdujeron con los Adenovirus indicados a una multiplicidad de infección de 1, y se determinó la liberación de IFNγ el día 2. AdVaMock indica la actividad de un Adenovirus transducido sin inserción.

Figura 8 Unidades Formadoras de Inclusiones en PID7 y PID14. Figura 9 Registros de Hidrosalpinges en PID49. Figura 10 Respuesta de las células T a proteínas de C. trachomatis (Fig10 a-10i). Las proteínas se testaron en 10

pacientes (●) y 5 controles (□). C, cultivo de células sin antígeno. Los valores representados son las medias y los percentiles de 75 y 25%.

Figura 11

Respuesta de las células T a proteínas de C. trachomatis donde 5 o más pacientes responden con un nivel de IFNγ por encima de todos los controles. Las proteínas se testaron en 10 pacientes (●) y 5 controles (●). C, cultivos de células sin antígeno. Los valores representados son las medias y los percentiles de 75 y 25%.

Figura 12

Respuestas específicas de antígeno por los linfocitos de la sangre una semana después de la última inmunización. Las respuestas de IFNγ se midieron en cultivos de células agrupados de 10 animales. Cada barra representa las medias de valores triplicados ± la desviación estándar.

Figura 13

Unidades formadoras de inclusiones 7, 14 y 21 días después de la infección en ratones C3H/HeN. Los valores se muestran como log10 IFU/ml. Todos los valores representan la media de 10 animales ± el error estándar de la media.

Fig. 14

Reactividad sérica contra el inmunógeno medida por ELISA, determinada como dilución a DO = 1,0. Cada punto representa una media de 4 animales ± el error estándar de la media.

Fig. 15

Reactividad sérica específica contra lisados totales de cuerpos elementales de Chlamydia muridarum (MoPn EB's) o Chlamydia trachomatis (serovar D EB's). Los positivos están marcados por un punto rojo. Los positivos son bandas con tamaño de acuerdo con el tamaño teórico.

Fig. 16

Respuestas específicas de antígeno por los esplenocitos 3 semanas después de la última inmunización. Las respuestas de IFNγ se midieron en cultivos de células de 4 animales individuales. Cada barra representa las medias de valores triplicados ± la desviación estándar.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de antígenos de células T humanas de C. trachomatis serovar D, Introducción

Se han analizado las respuestas de las células T humanas a proteínas de C. trachomatis utilizando fracciones estrechas de peso molecular derivadas de mixturas complejas de proteínas separadas por SDS-PAGE seguido por electroelución. Esta técnica permite el análisis directo de la respuesta inmune y hace posible la comparación de fracciones de proteínas estimuladoras. Esto ha conducido a la identificación de cierto número de fracciones de proteínas estimuladoras y la identificación de dianas de las células T. La evaluación ulterior de estas dianas de células T se ha hecho utilizando tecnologías recombinantes y péptidos superpuestos que abarcan la secuencia entera de la proteína.

Materiales y métodos

Microorganismo y cultivo

Se propagó C. trachomatis serovar D (cepa UW-3/Cx) en células Hela 229 (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio de pasaje RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) que contenía 5% de suero de ternero fetal (Gibco BRL; desactivado por calentamiento), 1% v/v Hepes, 1% v/v L-glutamina, 1% v/v piruvato y 10 µg/ml de gentamicina.

Monocapas semiconfluentes de células Hela 229 en matraces de 175 cm2 se pretrataron durante 15 minutos a la temperatura ambiente con DEAE-dextrano (45 µg/ml en HBSS), y se infectaron con una unidad formadora de inclusiones por células de C. trachomatis serovar D en 3 ml de HBSS. Los matraces se incubaron en un balancín de placas durante 2 horas a 37ºC. Después de 2 horas, se añadieron 50 ml de medio de pasaje RPMI1640 suplementado con 5% de glucosa y 1 µg/ml de cicloheximida por matraz y las células se incubaron ulteriormente durante 72 horas en una atmósfera con 5% de CO2 en aire humidificado.

Recolección de C. trachomatis

Se recolectaron Chlamydias 72 horas después de la infección. Las células se desalojaron de los matraces con un rascador de células y se centrifugaron 30 minutos a 35.000 g y 4ºC. Los pelets se resuspendieron en 5 ml de HSS por matraz, se trataron por ultrasonidos en hielo y se centrifugaron a 500 g y 4ºC durante 15 minutos. Se recogió el sobrenadante y se guardó en hielo, y el pelet se resuspendió al mismo volumen que anteriormente y se repitieron la

sonicación y la centrifugación. Los dos sobrenadantes se agruparon y se centrifugaron 30 minutos a 30.000 g y 4ºC, y el pelet se resuspendió con una aguja y jeringuilla en un tampón SPG (3 ml/T175). Después de una breve sonicación, la suspensión se estratificó suavemente sobre una solución de diatrizoato al 30% (50 g de diatrizoato de meglumina, 7,7 g de diatrizoato de sodio en 76 ml de agua) y se centrifugó a 40.000 g durante 30 min. Después de la centrifugación, se resuspendieron los pelets en tampón SPG y se guardaron a -70ºC.

Preparación del lisado de C. trachomatis para fraccionamiento

Una cantidad de 6-8 mg de C. trachomatis se centrifugó a 30.000 g durante 30 minutos y el pelet se resuspendió 1:1 en WFI y tampón de muestra/DTT y se hirvió durante 5 minutos. Después de 2 x 12 segundos de sonicación, se centrifugó la suspensión a 30.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se guardó a -70ºC hasta su utilización.

Fraccionamiento del lisado de C. trachomatis

El lisado de C. trachomatis se fraccionó como ha sido descrito por Andersen y Heron (1993). Resumidamente, el lisado de C. trachomatis en una cantidad de aproximadamente 6-8 mg de proteína se separó por SDS-page (gel al 10 a 20%) durante una noche (pocillo central de 11 cm de anchura, 0,75 mm de gel). Los geles preequilibrados en tampón de elución (tampón Caps de amoníaco, pH 10,2) se transfirieron a un Multi-eluter y se sometieron a electroelución durante 20 min. Las fracciones proteínicas se aspiraron y se analizaron por separación en geles SDS10-20% poliacrilamida, seguido por tinción con plata (Blum y Gloss 1987). La concentración de proteínas en las fracciones se estimó por el método Micro BCA (Pierce, Oud-beijerland, Países Bajos). Se estabilizaron 0,5 ml de todas las fracciones por suero humano AB al 0,5% y se mantuvieron congelados a -70ºC hasta su utilización. El resto se guardó a -70ºC sin suero a fin de ser utilizado para análisis por espectrometría de masas.

Análisis por espectrometría de masas

Las muestras para mapeado de masas de péptidos se cortaron de un gel SDS-PAGE teñido con plata. La banda se lavó, se secó, se redujo y se alquiló con yodoacetamida antes de someterla a digestión durante una noche por tripsina modificada esencialmente como ha sido descrito por Shevchenko et al., 1998.

Donantes

Pacientes diagnosticados con Chlamydia en el hospital Bispebjerg de Dinamarca fueron consultados acerca de su participación en el estudio y a fin de proporcionar una muestra de sangre antes de la iniciación de la terapia con anticuerpos. Individuos de control sin registros de infecciones de Chlamydia fueron consultados también a fin de participar en el estudio. Las muestras de pacientes individuales se anotaron con una anotación identificable única por asignación de un número consecutivo, M o K para varones o mujeres, y opcionalmente A, B, C, ... para la 1ª, 2ª, 3ª, ... muestra recogida del paciente particular. En todos los casos, la muestra A se recogió antes de iniciarse cualquier tratamiento. Por ejemplo, 12 MB designa la segunda muestra tomada del paciente varón número 12. Las muestras de control se anotaron KK-xx.

Preparación de linfocitos y cultivo de células

Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC's) de sangre entera por centrifugación en gradiente de densidad Lymphoprep (Nycomed A/S, Oslo, Noruega) y se congelaron en nitrógeno líquido hasta su utilización. Se descongelaron los PBMC y se resuspendieron en RPMI1640, suplementado con 1% penicilina/estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de glutamina (Gibco), 1% de piruvato, 1% de Hepes y 10% de suero humano AB (banco de sangre local, Rigs hospitalet, Copenhague). La viabilidad y el número de células se determinaron por tinción con Nigrosina. Las células se cultivaron por triplicado en placas de microtitulación con fondo redondo (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 1,25 x 105 células/pocillo en un volumen total de 100 µl. Basándose en estudios iniciales dosis-respuesta, se añadieron antígenos en las concentraciones siguientes: lisado de SvD: 2 µ*g/ml, fracciones de SvD 2 µg/ml, rCT521 5 µg/ml, péptidos superpuestos de CT521 10 µg/ml. Se utilizó fitohemaglutinina (PHA, 2 µg/ml) como control positivo y se incluyeron cultivos de células sin antígeno como control negativo. Después de 5 días de incubación a 37ºC en aire humidificado (5% CO2 y 95% aire), se recolectaron los sobrenadantes.

Ensayo de IFNγ

Se determinó la cantidad de IFNγ en los sobrenadantes por ELISA con anticuerpos disponibles comercialmente (Endogen) y se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó IFNγ recombinante como estándar (Endogen).

Péptidos superpuestos

Se sintetizaron 10 péptidos sintéticos 22-23 meros (superposición de 9-12 aminoácidos) que abarcaba la secuencia primaria completa de CT521, por métodos de fase sólida (Schafer-N).

Producción de antígenos de C. trachomatis en E. coli

Los genes CT que codificaban antígenos identificados por espectrometría de masas se clonaron en marco con la secuencia NH2-terminal (His)6 del vector pDEST17 de acuerdo con el Manual de Tecnología de Clonación Gateway (Invitrogen). Para la producción de los antígenos recombinantes de C. trachomatis, los vectores de plásmido se clonaron en la cepa BL21-AI de E. coli (Invitrogen) facilitando la producción de alto nivel de la proteína recombinante en presencia de arabinosa.

Purificación en mini-escala de antígenos recombinantes de C. trachomatis

Se suspendieron pelets de células bacterianas en imidazol 10 mM, NaH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM, urea 8 M, se sometieron a disrupción celular por BeadBeater de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioSpec Products, Inc.), después de incubación con sacudidas suaves a la temperatura ambiente durante una hora. El sobrenadante aclarado se aplicó a una columna HisTrap (Pharmacia Biotech), se lavó y se eluyó con imidazol 0,5 M, NaH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM, y urea 8 M. la muestra eluida se separó por electroforesis en un SDS-PAGE preparativo. El polipéptido recombinante de interés se identificó por tinción con azul Coomassie, se cortó y se separó por electroelución de la pieza de gel utilizando el Electro-Eluter modelo 422 de acuerdo con el manual de instrucciones (BioRad). El antígeno recombinante separado por electroelución se precipitó en acetona al 80%-95% (Aldrich, grado HPLC), se lavó en etanol de 95%, y se resuspendió en un volumen mínimo de imidazol 10 mM, NaH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM, y urea 8 M. la muestra se dializó finalmente a Tris 50 mM de pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 40% y se guardó a -20ºC.

Resultados:

Respuesta de las células T a un lisado de Chlamydia

Pacientes de Chlamydia se seleccionaron respecto a su reconocimiento por las células T de un lisado de C. trachomatis serovar D recolectado 72 horas después de infección de células Hela. El lisado representa una mixtura de todos los componentes de las bacterias y abarca el repertorio de antígeno total de las bacterias. Esta preparación se utilizó para estimular PBMCs de 15 pacientes de Chlamydia y 6 donantes de control (Fig. 1). La respuesta al lisado se asociaba con un nivel alto de IFNγ (> 1000 pg/ml) en 8 de 15 pacientes. Solamente un donante de control respondía al lisado con más de 1000 pg/ml de IFNγ.

Los pacientes de Chlamydia reconocen antígenos múltiples

La especificidad de la respuesta de las células T se investigó por estimulación de PBMCs con fracciones de proteínas obtenidas por la técnica de multielución. La técnica se utilizó en el lisado y dio como resultado fracciones estrechas con una superposición mínima entre las fracciones vecinas (Fig. 2). Se estima que los números de polipéptidos en cada fracción son 10 a 30. Se utilizó un panel de fracciones de este tipo para cribar los patrones de reconocimiento de antígeno de los 8 pacientes que respondían al lisado entero y los 6 donantes de control (Fig. 3). La respuesta celular a las fracciones demostró que la respuesta estaba dirigida a antígenos múltiples. Sin embargo, la producción pico de IFNγ se observó en las regiones de masa molecular 5-12, 16-20, 25-35 y 58-74 KDa.

Reconocimiento de proteínas recombinantes por los pacientes de Chlamydia

Se ejecutó una SDS-PAGE con la fracción 7 y las fracciones vecinas 6 y 8 que abarcaban la región de masa molecular 16-20 (Fig. 2), se tiño el gel con plata y las áreas que contenían las fracciones se separaron del gel por corte, se pusieron en agua Mili Q y se enviaron a la espectrometría de masas para identificación de las proteínas. Se identificaron 6 aciertos: CT521, CT043, CT511, CT616, CT315 y CT803. Adicionalmente, se enviaron también a espectrometría de masas las fracciones 10, 11, 12, 13, 14 y 15 que abarcaban la región de masa molecular 25-35. Se identificaron 10 aciertos: CT603, CT678, CT561, CT610, CT538, CT582, CT583, CT679, CT067 y CT681. La fracción 22 que abarcaba la región de masa molecular 58-74 se envió a espectrometría de masas. Se identificaron 3 aciertos: CT875, CT110, y CT112. Finalmente, se envió a espectrometría de masas una fracción 18 y se identificaron dos aciertos: CT587 y CT322.

Las proteínas recombinantes, rCT043, rCT511, rCT521, rCT616, rCT803, se purificaron de E. coli y se investigaron las actividades inmunológicas de las 5 proteínas de C. trachomatis en 4 pacientes, 1KA, 15KA, 7KA y 12 KA (Fig. 4). rCT521 era el antígeno más prometedor de los 4 testados. 3 de 4 pacientes (1KA, 7KA y 15KA) respondían fuertemente (> 1000 pg/ml) a rCT521 comparados con los donantes de control. rCT803, rCT511 y rCT616 inducían niveles altos de IFNγ en dos (1 KA, 7KA) de 4 pacientes, mientras que rCT043 inducía niveles bajos de IFNγ en todos los pacientes. Las proteínas recombinantes CT043, CT511, CT603, CT561, CT610, CT583, CT679, CT067, CT681 CT875, CT110, CT112 CT587 y CT322 se produjeron en E. coli y se testaron para reconocimiento de las células T en 10 pacientes y 5 controles (Ejemplo 8).

Reconocimiento de CT521 por los pacientes de Chlamydia

El reconocimiento de CT521 por los pacientes infectados de Chlamydia se testó en un panel de donantes mayor. Un total de 41 pacientes de Chlamydia, todos los cuales respondían a un lisado de Chlamydia con más de 1500 pg/ml de IFNγ se testaron respecto a reconocimiento de CT521. Adicionalmente, se incluyeron 11 donantes de control que

respondían con menos de 1500 pg/ml de IFNγ al lisado (Fig. 5). Los pacientes podían dividirse en CT521-positivos y CT521-negativos, basándose en respuestas de IFNγ que excedían de 500 pg/ml. 34 de los 41 pacientes eran CT521-positivos (82,9%), mientras que solamente 2 de 11 controles respondían a CT521 (18,2%). Estos resultados demuestran que CT521 es reconocido frecuentemente por los pacientes de Chlamydia que responden al lisado de Chlamydia entero.

Especificidad fina de la respuesta de las células T a CT521 mapeada por péptidos sintéticos

La especificidad fina de la respuesta de las células T a CT521 se mapeó por cribado de un panel de péptidos superpuestos que cubría la secuencia CT521 completa. Los péptidos se sintetizaron como 22-23 meros con superposición de 9-12 aminoácidos y se utilizaron para estimular PBMC de 41 pacientes de Chlamydia y 11 controles (Fig. 6). Aun cuando la respuesta era muy heterogénea, existía cierta jerarquía, siendo ciertas regiones dianas acusadas para la respuesta. Los epítopes presentes en la parte N-terminal de la proteína (aa14 a aa36), la parte central (aa40 a aa88), y la parte C-terminal (aa116 a aa138) de la proteína eran más fuerte o más frecuentemente reconocidos que los otros.

Ejemplo 2: Estrategia dirigida de biblioteca (cribado para dianas de anticuerpos)

Introducción

Se adoptó un enfoque de Capacidad Alta para testar en relación con antígenos reactivos al suero en el genoma de

C. trachomatis serovar D. Se construyó una biblioteca de longitud total de los primeros 200 Marcos de Lectura Abiertos (ORFs). Esta biblioteca se diseñó para expresar los antígenos recombinantemente en E. coli. Para el cribado de esta biblioteca, se utilizó una agrupación de suero de 5 pacientes de respuesta fuerte que se seleccionaron basándose en su reactividad frente a un extracto de Cuerpo Elemental (EB) entero de C. trachomatis por análisis mediante transferencia Western.

Materiales y métodos

Construcción de la biblioteca de longitud total

El genoma de C. trachomatis serovar D está disponible al público y la anotación fundamental se utilizó como ha sido definido por Stephens et al. (Stephens, Kalman et al. 1998). Se seleccionaron los genes Ct001 a Ct200 para clonación. Los cebadores 5' y 3' para amplificación de los genes específicos se diseñaron con un software creado en la propia empresa. Las secuencias de longitud total de los 200 genes específicos de C. trachomatis se clonaron en el Vector de Entrada, pDONR 201 (Invitrogen), que permite clonar los genes de interés en diferentes vectores de destino del sistema de clonación Gateway (Invitrogen). El vector de destino pDEST17 se utilizó para expresión de la proteína recombinante de C. trachomatis en E. coli con un marcador de afinidad de 6XHistidina. El hospedador bacteriano era BL21-AI ™ para producción de las proteínas recombinantes de C. trachomatis por inducción con arabinosa.

Expresión

Placas de 2 * 96 pocillos profundos que contenían cultivos de 1 ml se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El cultivo se diluyó hasta DO600 = 0,1 y se incubó a 37ºC con sacudidas (180 rpm) hasta que se alcanzó DO600 = 0,5, y el cultivo se indujo luego por adición de L-arabinosa hasta una concentración final de 0,2%. Después de 4 horas de inducción, los cultivos se pusieron en hielo y el pelet bacteriano se recogió por centrifugación (3000 g/20 min). Los pelets se guardaron en el frigorífico hasta que se obtuvieron los resultados de la transferencia de colonias.

Suero de pacientes

Se seleccionó suero de 5 pacientes positivos de C. trachomatis, 3KA, 11KA, 12KA, 13KA y 17KA, para preparación de una agrupación de suero de pacientes destinada a utilización en el cribado de la biblioteca. Estos sueros de paciente se seleccionaron por su reactividad específica y alta contra un extracto de cuerpos elementales de C. trachomatis serovar D en análisis por transferencia Western utilizando anti-IgA, -IgG e -IgM humanas de conejo conjugadas con fosfatasa alcalina, respectivamente, como marcador de selección secundario (DakoCytomation, Dinamarca).

La agrupación de suero de pacientes (diluida 10 veces) se pretrató con extracto de proteínas totales de E. coli a2 mg/ml durante 3 horas a la temperatura ambiente. El suero de trabajo de pacientes agrupado era 1:200 en Tris-HCl 10 mM, pH 8, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05% (TBST).

Transferencia de colonias

El cribado de la biblioteca de expresión de E. coli de longitud total se realizó básicamente de acuerdo con French et al (1996). Cultivos bacterianos (1 ml) que codificaban los genes Ct001-Ct200 y genes seleccionados a lo largo de todo el genoma se dejaron crecer durante una noche a 37ºC en dos placas de 96 Pocillos Profundos. Utilizando un instrumento de "agarre" (6 x 8), los cultivos bacterianos se transfirieron a cápsulas Petri que contenían LB-agar (que

contenía 100 µg/ml de ampicilina). Las colonias se dejaron durante una noche a 30ºC. Se replicaron las colonias sobre una membrana de nitrocelulosa preimpregnada en L-arabinosa al 1% y se transfirieron a nuevas placas de LB-agar (con 100 µg/ml de ampicilina y 0,2% de L-arabinosa) con el lado de la colonia hacia abajo. Se incubaron las placas a 37ºC durante 4 horas y finalmente se transfirieron las membranas a una cápsula Petri vacía con el lado de

5 la colonia hacia arriba durante 15 min sobre un papel de filtro preimpregnado en cloroformo, exponiéndose con ello las bacterias al vapor de cloroformo. Se incubaron las membranas durante una noche en tampón de lisis que contenía lisozima y DNasa. Después de pasos de lavado repetidos, las membranas se incubaron con anticuerpo primario (suero de trabajo de pacientes agrupado) durante 2 horas a la temperatura ambiente.

Las membranas se lavaron repetidamente (4 veces con 1 x TBST en exceso) antes de la incubación en anticuerpo 10 secundario durante 1 h. El anticuerpo secundario era:

A. IgG anti-humana de conejo (DO336) DakoCytomation

B. IgA anti-humana de conejo (DO338) DakoCytomation

C. IgM anti-humana de conejo (DO337) DakoCytomation

o

15 D. Una agrupación de IgG anti-humana de conejo (DO336) e IgA anti-humana de conejo (DO338).

Se conjugó el todo a fosfatasa alcalina.

Después de un segundo lavado en 1 x TBST, las membranas se revelaron con sustrato BCI/NBT (Sigma Fast).

Se seleccionaron los clones positivos en todas las categorías (IgG, IgA e IgM).

Transferencia Western de los clones positivos en la transferencia de colonias

20 Pelets bacterianos de los cultivos de 1 ml se resuspendieron en 200 µl de tampón de muestra SDS-PAGE y se calentaron a 95ºC durante 5 min, se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa por el método de la transferencia Western estándar. Las membranas se incubaron con la misma agrupación de sueros de pacientes y una agrupación de anticuerpos secundarios (A-C) como se ha descrito arriba. Como control para la inducción de proteínas, se incubó una membrana replicada con anticuerpo anti-Penta-His y se procesó de acuerdo

25 con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Se incluyeron como controles dos colonias que no reaccionaban en la transferencia de colonias.

Resultados:

La identidad de los antígenos CT reconocidos por suero de pacientes en el enfoque de cribado de colonias bacterianas es:

Antígeno

IgG IgA IgM Transferencia Western

Ct080

+ ++

Ct084

+++ +

Ct089

++ I ++

Ct110

+++ ++ +

Ct115

++ ++ +

Ct118

++ +

Ct119

++ +++

Ct125

+ ++ ++

Ct147

+ ++

Antígeno

IgG IgA IgM Transferencia Western

Ct155

+++ +++ -

Ct168

+ +

Ct174

++ ++

Ct184

+ ++

Ct228

+ ++

Ct232

+ +

Ct614

+ +

Ct795

+++ +++ +++

donde +, ++, +++, y -, indican "intensidad visual de reactividad" relativa cuando se analizan en la transferencia de colonias o por transferencia Western.

Ejemplo 3: Estrategia de bibliotecas aleatorias

Introducción

Con objeto de realizar el cribado para antígeno sero-reactivo en el genoma de C. trachomatis serovar D, se construyó una biblioteca de expresión aleatoria en el vector de expresión λgt11. Esta biblioteca se diseñó para expresar aleatoriamente fragmentos peptídicos de C. trachomatis de 100-400 residuos de aminoácidos en marco con la β-galactosidasa. La biblioteca se cribó con suero de pacientes que se seleccionaron basándose en su reactividad frente a un extracto de Cuerpo Elemental (EB) de C. trachomatis entero por análisis mediante transferencia Western.

Materiales y métodos

Aislamiento de DNA genómico de C. trachomatis serovar D de peso molecular alto

Una preparación bruta de cuerpo elemental de C. trachomatis serovar D que contenía ~ 8,6 x 109 IFU (unidades infecciosas) se purificó ulteriormente por ultracentrifugación en gradiente de densidad escalonado de solución de Diatrizoato al 44-54% a 40.000 x g durante 60 min. Los cuerpos elementales estratificados en la interfaz de 54% se recogieron, se diluyeron en 10 volúmenes de tampón SPG (sacarosa 250 mM, Na2HPO4 10 mM, ácido L-glutámico 5 mM), y se precipitaron por centrifugación a 30.000 x g durante 30 min. El pelet de cuerpos elementales se resuspendió en 5 ml de tampón TENS (Tris 50 mM de pH 9; EDTA 100 mM; NaCl 200 mM; SDS 1%) y se incubó con 100 µg/ml de proteinasa K a 37ºC durante 60 min. La muestra se diluyó una sola vez en tampón TENS y los ácidos nucleicos se purificaron por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol (Maniatis et al., 1987). El RNA se separó por tratamiento con 25 U/ml de coctel de RNasa T1 y RNasa A (Stratagene) a 37ºC durante 60 min seguido por otra extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. La preparación de DNA genómico de

C. trachomatis serovar D se resuspendió en TE a 0,4 µg/µl y se testó una parte alícuota por electroforesis en gel de agarosa, demostrándose que contenía DNA de peso molecular alto >> 50 kb.

Construcción de la biblioteca de expresión aleatoria genómica de C. trachomatis entera

La generación de fragmentos de DNA genómicos aleatorios de C. trachomatis por sonicación se realizó poniendo un tubo de microcentrífuga que contenía 50 µg de DNA en 175 µl de tampón TM (Tris 10 mM de pH 8; MgCl2 10 mM) en un baño de hielo y agua introducido en el aparato de ultrasonidos Soniprep 150 (MSE). La micropunta (1/8" de diámetro) se dispuso ~ 2 mm por debajo de la superficie de la muestra y la sonicación se realizó continuamente durante 80 min a 15 micrómetros de amplitud. En estas condiciones, el DNA genómico se fraccionó aleatoriamente a intervalos de tamaños de fragmento de 0,05 a 1 kb cuando se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Durante la preparación subsiguiente del DNA genómico de CT tratado por ultrasonidos se incluyeron pasos de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol en caso apropiado. Se realizaron reparación de las extremos y fosforilación de los fragmentos de DNA sonicados de ~ 10 µg en una incubación combinada con DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa de Klenow y polinucleótido-quinasa T4. Adicionalmente, el DNA genómico de CT aleatorio

fragmentado se sometió a tratamiento con metilasa de EcoRI antes de la ligación de los enlazadores con el enlazador EcoRI fosforilado con un exceso molar de 50 veces (12-mero, BioLabs). El DNA se trató con EcoRI y la preparación de DNA final se fraccionó por tamaños en un gel de acrilamida al 6% y se recogieron fragmentos de 0,20,8 kb de tamaño de la pieza de gel por incubación en 500 µl de tampón GES (acetato de amonio 0,5 M; acetato de magnesio 10 mM; EDTA 0,1 mM; SDS 0,1%) a 42ºC durante una noche. El sobrenadante aclarado se precipitó dos veces con etanol, y el pelet final se resuspendió en 10 µl de TE. El DNA se ligó a ramas del vector de fago λgt11 digeridas con EcoRI y desfosforiladas (Stratagene). La mezcla de ligación se empaquetó in vitro con extractos Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene). Los fagos recombinantes se extendieron en placas sobre E. coli Y1090r-y se generó un total de ~ 340.000 fagos lambda primarios, de los cuales ~ 60% eran fagos recombinantes verdaderos a juzgar por el ensayo de selección de colores azul/blanco después de extender los fagos en placas en presencia de IPTG y X-gal. La biblioteca primaria de expresión de fagos se amplificó a densidades de aproximadamente 3 x 104 PFU/placa de 135 milímetros de diámetro, se recogió y se guardó en partes alícuotas en 7% v/v DMSO a -80ºC. El título de la biblioteca de expresión aleatoria de C. trachomatis genómica entera y amplificada era 6,7 x 109 PFU/ml.

Suero de pacientes

El suero agrupado de pacientes utilizado en el cribado de la biblioteca de expresión aleatoria era idéntico al descrito previamente en el Ejemplo 2.

Cribado de la biblioteca de expresión aleatoria genómica de C. trachomatis entera

La biblioteca de expresión amplificada de λgt11 se absorbió en células E. coli Y1090r-y se extendió en placas a 5 x 104 -1 x 105 PFU por placa de agar de 135 mm y se incubó a 42ºC durante 3 ½ h. Las placas se cubrieron con filtros de membrana de nitrocelulosa secos (BioTrace NT, Pall Corporation) pre-saturados con IPTG 10 mM en agua y se incubaron ulteriormente a 37ºC durante 3 ½ horas adicionales. Los filtros se transfirieron a TBST que contenía 1,5% de BSA y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 min, después de incubación con el suero agrupado de pacientes diluido en una ratio 1:200 a la temperatura ambiente durante 30 min. El exceso de suero de pacientes se separó por tres lavados en TBST durante 10 min cada vez, después de incubación con anti-IgA, -IgG o -IgM humanas de conejo conjugadas con fosfatasa alcalina a la temperatura ambiente durante 30 min. Después de 3 lavados finales en TBST durante 10 min cada vez, los filtros se revelaron con sustrato BCIP/NBT (Sigma Fast).

Las áreas de las placas inmunorreactivas positivas se recogen en agrupaciones de 10 áreas, se titulan, y se criban de nuevo a densidades de plaqueado de 2,5-5 x 103 PFU por placa de agar de 135 mm para identificación de las calvas individuales positivas.

Secuenciación del DNA y análisis de las secuencias

Las calvas de fago seleccionadas positivas individuales se recogieron por punzonamiento del área de las calvas, se suspendieron en 20 µl de agua, se agitaron vorticialmente durante 10 segundos y se incubaron a 37ºC durante 15 min. La suspensión se centrifugó en una microcentrífuga a la velocidad máxima durante 30 s, y se utilizaron 4,5 µl del sobrenadante aclarado para amplificación PCR utilizando 2,5 pmol cada uno de Cebador Directo, 5'ccagccatcgccatctgctgcacg-3', y Cebador Inverso de EcoRI λgt11 (BioLabs) y un volumen de Hot Start Taq Master Mix (Qiagen). La suspensión de fago remanente se diluyó en 100 µl de tampón SM y se guardó como stock de fago a 4ºC con 25 µl de CHCl3.

La amplificación PCR se realizó en un termociclador Gene Amp PCR Systems 9700 (Applied Biosystems) a 95ºC durante 15 min, seguido por 30 ciclos a 95ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min. Se testaron 4 µl por electroforesis en gel de agarosa. Para secuenciación del DNA amplificado, los 6 µl remanentes de la reacción PCR se diluyen 5 veces y se purifican en columnas MicroSpin S-300 HR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences). La secuenciación se realizó por el método de terminación de cadenas didesoxi (establecido por MWG-BIOTECH, Alemania) utilizando el cebador de secuenciación, 5'CACCAGACCAACTGGTAATG-3', 28 bases de cebado aguas abajo del sitio de clonación EcoRI en el gen LacZ,o el 5'-GCCATCGCCATCTGCTGCACG-3', 85 bases de cebado aguas arriba del sitio de clonación EcoRI en el gen LacZ. Las secuencias se analizaron con el paquete de software Vector NTI Suite (InforMax).

Resultados:

Identificación de los antígenos sero-reactivos de C. trachomatis por cribado de la biblioteca de expresión

El primer cribado de la biblioteca de expresión de C. trachomatis λgt11 utilizando el suero de pacientes agrupado como anticuerpo primario identificó varias áreas de calvas inmunorreactivas cuando se utilizaron anti-IgA, IgG o -IgM humanas como anticuerpos de detección secundarios, respectivamente. En resumen, se seleccionaron y agruparon 88 áreas de calvas positivas:

Número de áreas de calva seleccionado para repetición del cribado:

Clase Serorreactiva

# aciertos de calvas # agrupaciones para cribado

IgA

24 2 agrupaciones de 12 áreas de calva

IgG

50 5 agrupaciones de 10 áreas de calva

IgM

14 1 agrupación de 14 áreas de calva

Total

88 8 agrupaciones

Las agrupaciones de fago generadas se cribaron de nuevo utilizando las mismas condiciones de cribado que en el cribado inicial, excepto que la densidad de extensión en placas era mucho menor, a fin de permitir la identificación de calvas de fago positivas individuales. En suma, se seleccionaron un total de 129 calvas positivas individuales, se anotaron y se utilizaron para análisis directos de la secuencia y generación de stocks de fago, respectivamente:

Número de calvas positivas individuales seleccionadas:

Clase Serorreactiva

# calvas individuales

IgA

41

IgG

79

IgM

9

Total

129

La identidad de la inserción expresada como fusión de β-galactosidasa en los fagos positivos individuales aislados se identificó por secuenciación y análisis Blast (EMBL-EBI).

10 La identidad de los antígenos CT se identificó por cribado de la biblioteca de expresión aleatoria. Las secuencias de un total de 103 calvas individuales se determinaron y se agruparon en 22 identidades de secuencia únicas (PF = fragmento peptídico): CT541-PF1 (aa pos. 111-243) CT443-PF1 (aa pos. 214-291)

15 CT795-PF1 (aa pos. 1-163) CT396-PF1 (aa pos. 170-318) CT842-PF1 (aa pos. 433-515) CT283-PF1 (aa pos. 477-577) CT874-PF1 (aa pos. 330-426)

20 CT051-PF1 (aa pos. 38-177) CT141-PF1 (aa pos. 17-126) CT643-PF1 (aa pos. 769-841) CT681-PF1 (aa pos. 156-391) CT681-PF2 (aa pos. 199-329)

25 CT681-PF3 (aa pos. 294-349)

CT414-PF1 (aa pos. 605-722) CT414-PF2 (aa pos. 463-530) CT456-PF1 (aa pos. 695-840) CT456-PF2 (aa pos. 137-229)

5 CT456-PF3 (aa pos. 243-321) CT456-PF4 (aa pos. 209-291) CT456-PF5 (aa pos. 175-279) CT456-PF6 (aa pos.567-730) CT456-PF7 (aa pos. 71-180)

10 CT456-PF8 (aa pos. 190-279) CT504-PF1

Ejemplo 5: Generación de Adenovirus recombinantes codificantes de antígenos de C. trachomatis.

Introducción

15 Con objeto de explorar una ruta de suministro alternativa de antígenos de C. trachomatis a células diana a fines de cribado para reactividad de las células T, se construyeron y testaron Adenovirus recombinantes que codificaban los antígenos por transducción directa de PBMC de pacientes.

Materiales y métodos.

Construcción de stocks de Adenovirus recombinantes

20 Se generaron Adenovirus recombinantes que codificaban antígenos seleccionados de C. trachomatis utilizando esencialmente el Sistema de Expresión ViraPower Adenoviral Gateway (Invitrogen) introduciendo los genes CT en marco con un codón de iniciación ATG en el contexto de la secuencia Kozak, ACCATGG, en el vector pAd/CMV/V5DEST (Invitrogen). Se introdujeron codones de parada inmediatamente aguas abajo de los ORF's del gen CT. Se producen Adenovirus recombinantes viables en células 293A transfectadas de acuerdo con las instrucciones del

25 fabricante (Invitrogen). Se preparan stocks de Adenovirus primarios recombinantes por el método de congelación-descongelación y se guardan en partes alícuotas a -80ºC. Los títulos medidos como TCID50 en células 293A de los stocks de Adenovirus recombinantes se determinaron por el método del Punto Final.

Resultados:

Preparación de los stocks de Adenovirus

30 Se clonaron antígenos de longitud total de C. trachomatis en Adenovirus para transducción directa y expresión de los antígenos CT en los ensayos de células diana PBMC.

Los siguientes antígenos CT están disponibles como stocks de Adenovirus:

CT460, CT529, CT579, CT587, CT681, CT509, CT713, CT043, CT511, CT521, CT616.

Respuesta de las células T a antígenos de C. trachomatis transducidos por Adenovirus

35 Las actividades inmunológicas de 4 constructos de Adenovirus (AdVpCT043, AdVpCT511, AdVpCT521 y AdVpCT616) se investigaron en 9 pacientes y 4 controles (Figura 7). AdVpCT521 inducía una respuesta fuerte de IFNγ (> 500 pg/ml) en 6 de 9 pacientes. AdVpCT511 se reconocían con niveles de IFNγ que excedían de 500 pg/ml en 4 de 9 pacientes, mientras que AdVpCT616 y AdVpCT043 estimulaban solamente una respuesta en 2 y 3 pacientes, respectivamente. En el grupo de control, un solo donante respondía a AdVpCT511 y AdVpCT521.

40 Ejemplo 6: Estrategia de protección de los roedores

Introducción

La estrategia de protección de los roedores se utiliza para evaluar la eficacia de los antígenos de Chlamydia. De modo resumido, los animales inmunizados con antígenos se infectarán con una exposición vaginal de C. muridarum.

La capacidad protectora del antígeno inmunizante se evaluará por cuantificación de la carga vaginal de Chlamydia y por registro de los cambios patológicos crónicos. La respuesta inmune antes del enfrentamiento al antígeno de la vacuna puede lograrse por cuantificación de IFNγ después de reestimulación de células del bazo y por evaluación de la reactividad de anticuerpos séricos contra un lisado de EB de C. trachomatis y la reactividad ELISA contra el inmunógeno. Los antígenos comprobados en este modelo son: Ct015, Ct025, Ct026, Ct030, Ct048, Ct063, Ct078, Ct080, Ct184, Ct521, Ct051, Ct089, Ct175, Ct443, Ct456, Ct511, Ct541, Ct583 y Ct603.

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J, de 8-12 semanas de edad, de Harlan Laboratories. Los animales se alojaron en condiciones ambientales estándar y tenían a su disposición comida estándar y agua ad libitum. El uso de ratones está guiado por las regulaciones estipuladas por el ministerio de justicia danés ((Lov om dyreforsøg, jvf lovbekendelser nr. 726 af 9. September 1993), y los comités de protección de animales. Una descripción detallada de los experimentos propuestos ha sido sometida a y aprobada por la junta de examen ético regional (2003/561786) mantenida por la solicitante.

Chlamydia muridarum

Se propagó C. muridarum en células HeLa 229 (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). Las células HeLa se dejaron crecer en medios completos (RPMI-1640 (Gibco BRL); Suero Bovino Fetal desactivado por calentamiento al 5% (Cambrex Biosciences); 1% v/v Hepes, 1% v/v L-glutamina, 1% v/v piruvato y 10 µg/ml de gentamicina. Monocapas subconfluentes de células HeLa 229 extendidas en matraces de 175 cm2 se pretrataron durante 15 minutos a la temperatura ambiente con 45 µg/ml de DEAE-dextrano en solución salina tamponada de Hanks (HBSS) y se infectaron a una MOI de 1 (es decir una unidad formadora de inclusiones (IFU) de C. muridarum por célula HeLa) en 3 ml de HBSS. Después de 2 h de incubación a 37ºC, se añadieron 50 ml de medios completos suplementados con 5% de glucosa y 1 µg/ml de cicloheximida, y las células infectadas se incubaron ulteriormente durante 42-44 horas en una incubadora humidificada que contenía 5% CO2. Después de confirmar al microscopio la presencia de inclusiones dentro de una cantidad apropiada de células diana, las monocapas se desalojaron de los matraces con un rascador de células y se centrifugaron 30 min a 35.000 g y 4ºC. Los pelets se resuspendieron en 5 ml de HBSS por matraz, se trataron por ultrasonidos en hielo a 2 x 1000 Joule y se centrifugaron a 500 g durante 15 min a 4ºC. Los sobrenadantes se recogieron y se guardaron en hielo. Los pelets se resuspendieron en 5 ml de HBSS y se trataron por ultrasonidos, después de lo cual se centrifugaron como en el último paso. Los sobrenadantes se agruparon y se centrifugaron durante 30 min a 30.000 g, a 4ºC y los pelets se resuspendieron en tampón SPG (sacarosa 250 mM; Na2HPO4 10 mM; ácido L-glutámico 5 mM). Después de una breve sonicación, la suspensión se estratificó suavemente sobre una solución de diatrizoato al 30% y se centrifugó a 40.000 g durante 30 min. Después de la centrifugación, los pelets se suspendieron en tampón SPG y se guardaron a -70ºC.

La infectividad de la preparación de C. muridarum se cuantificó por titulación en células McCoy seguido por enumeración de las inclusiones en un ensayo de inmunofluorescencia. De modo resumido, monocapas HeLa 229 al 90-95% de subconfluencia se centrifugaron durante una hora a 750 g a la temperatura ambiente con inóculo tratado seguido por incubación durante 2 horas a 35ºC. El inóculo se reemplazó por medio completo suplementado con 5% de glucosa y 1 µg/ml de cicloheximida, y se incubó ulteriormente durante 42-44 h a 37ºC. Para la tinción, las células se fijaron en etanol de 99% enfriado en hielo durante 15 min. Las células fijadas se incubaron con un anticuerpo BOMP policlonal de conejo anti-Chlamydia durante una hora, seguido por tinción secundaria con un anticuerpo de cerdo anti-Ig de conejo etiquetado con FITC. Las células se sometieron a contratinción con yodo-propidio. La inclusión de células positivas en 20 campos de alta potencia (40 x) se enumeró con un microscopio de fluorescencia a fin de cuantificar la infectividad del stock de C. muridarum (expresada en IFU/µl).

Infección de los ratones

Los ratones se infectaron por la ruta intravaginal por 105 a 107 IFU's (100-10.000 DI50). La infección se monitorizó el día 7 y el día 14 después de inoculación por obtención de frotis cervicovaginales seguida por tinción fluorescente y enumeración de las unidades infecciosas en el espécimen.

Inmunización

Los ratones se inmunizaron subcutáneamente (sc) tres veces con dos semanas de intervalo en la base de la cola. Las vacunas consistían en 1-5 µg de péptido (véase arriba) emulsionado en 250 µg de DDA y 100 µg de TDB. Como control negativo, se inyectaron DDA/TDB solos, sin péptido. Como control positivo, los ratones se infectaron intranasalmente durante 55-75 días con 105 IFU de C. muridarum. La infección nasal deja a los animales casi completamente protegidos, de modo comparable a la protección inducida por la infección vaginal.

Cultivos de linfocitos, anticuerpos de suero y evaluación del potencial de inmunoinducción

Para evaluación de la capacidad para inducir una respuesta inmune fuerte, se extirparon bazos 21 días después de la última inmunización y se obtuvieron linfocitos del bazo por frotamiento del tejido a través de una tela metálica para una suspensión de células simples, se lavaron una sola vez en RPMI-1640 a 800 g a la temperatura ambiente y se resuspendieron en medios de re-estimulación. (RPMI-1640, Gibco, 10% Suero Bovino Fetal desactivado por calentamiento, Biochrom AG, Berlín, Penicilina G 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, Hepes 10 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato 1 mM).

Las células aisladas se cultivaron por triplicado en placas de 96 pocillos con fondo redondo a razón de 2 x 105 células por pocillo en 200 µl de medio de reestimulación. Se añadieron los péptidos en concentraciones comprendidas entre 0,08 y 5 µg/ml, y se incubaron durante 72 h. Los controles negativos y positivos (medios o 5 µg/ml de ConA) se incluyeron en todos los experimentos en caso necesario. Después de reestimulación, se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó IFNγ por ensayo de inmunosorbente unido a enzima (Brandt, Elhay et al. 2000). Los candidatos de vacuna que proporcionaban niveles elevados de IFNγ crítico superiores a 2000 pg/µl eran: Ct015, Ct025, Ct026, Ct030, Ct048, Ct063, Ct078, Ct080, Ct184, Ct521, MOMP de C. muridarum natural, Ct051, Ct175, Cy443, Ct456 y Ct603, (Fig 16).

Al mismo tiempo, se extrajeron muestras de sangre del seno oftálmico y se preparó un suero. El suero se testó respecto a reactividad contra Chlamydia trachomatis SvD y cuerpos elementales de Chlamydia muridarum por análisis mediante transferencia Western (Theisen, Soe et al. 2004). De modo resumido, los cuerpos elementales purificados en gradiente de densidad se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 4-12% se sometieron a electrotransferencia sobre nitrocelulosa y se bloquearon en leche desnatada en un tampón Mesh. Las agrupaciones de sueros (4 animales para cada grupo de vacuna) se diluyeron en ratio 1:100 y se incubaron con la transferencia durante 1 hora, se lavaron y se incubaron ulteriormente con un anticuerpo secundario acoplado a fosfatasa alcalina durante una hora. Las reacciones se visualizaron por incubación con sustrato BCIP/NBT (Sigma). Las bandas se evaluaron como positivas cuando se observó que el tamaño estaba en concordancia con el tamaño teórico. Las positivas fueron: Ct015, Ct030, Ct048, Ct078, Ct184 y Ct521 (Fig 15).

El suero se testó por ELISA (Rosenkrands, Agger et al. 2005) respecto a reactividad contra la proteína recombinante utilizada para inmunización y contra cuerpos elementales de Chlamydia muridarum desactivados por calentamiento. De modo resumido, las placas se recubrieron con antígeno (0,5 µg/ml) en tampón de carbonato durante una noche, se bloquearon con BSA y se lavaron. Las placas se incubaron con muestras prediluidas durante 2 horas a la temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 hora. Las reacciones se visualizaron por incubación con sustrato TMB y la reacción se paró con ácido sulfúrico y se leyó a 450 nm. Los títulos para DO = 1,0 se calcularon después de aplicación de un ajuste de 4 parámetros de los datos (Fig. 14). Los antígenos ricos en IgG 1 eran: Ct015 y Ct030. Los antígenos ricos en IgG2b eran: Ct063, y Ct521 alto.

Evaluación de la eficacia protectora

Para evaluación de la eficacia de la vacuna, los ratones se enfrentaron 8-12 semanas después de la primera inmunización por infección intravaginal con 105 a 107 IFU's (100-10.000 DI50). La eficacia protectora de los candidatos de vacuna se monitorizó por evaluación patológica y por enumeración de las unidades infecciosas obtenidas por frotis cervicovaginales.

La carga bacteriana se determinó por frotis cervicovaginales obtenidos a los 7, 14 y/o 21 días después del enfrentamiento. Los frotis se sumergieron en 1 ml de tampón SPG a 4ºC hasta su preparación. El mismo día, los EB's de C. muridarum se desprendieron mecánicamente del frotis por agitación vorticial del espécimen durante 30 s a plena velocidad en presencia de perlas de vidrio de dimensiones milimétricas. El tampón se transfirió a tubos Eppendorf y se guardó a -80ºC hasta su análisis. Los EB's infecciosos se cuantificaron por enumeración de las inclusiones en células McCoy subconfluentes en un ensayo de inmunofluorescencia como se ha descrito arriba. (Figura 8). Los antígenos que inducían protección después de la enumeración de las IFU's de los frotis a PID7 son: Ct015, Ct025, Ct048, Ct184, Ct521, Ct443, Ct603 y MOMP de C. muridarum natural.

Para patología, se evaluaron macroscópicamente los tractos genitales enteros en cuanto a signos de patología aguda y crónica en PID 49. A partir de la evaluación patológica grosera se calculó un registro de hidrosalpinges. El registro se calcula como la ratio de hidrosalpinges referida al número total de tubos de Falopio en el grupo de vacunas individual (Figura 9). Los antígenos que inducen una protección satisfactoria a PID42 son Ct025, Ct063, Ct184 y Ct521.

Basándose en el material disponible, Ct184 y Ct521 son los antígenos que se comportan mejor en el modelo de enfrentamiento. Formulados en Lipovacc, los mismos inducen la patología mínima y la protección óptima contra Chlamydia vaginal.

Ejemplo 7: Cribado respecto a dianas de epítopes de células T específicos de C. trachomatis utilizando la biblioteca de expresión aleatoria del genoma total

Introducción

La biblioteca de expresión aleatoria del genoma total se utilizó para cribado directo respecto a dianas antigénicas específicas potenciales de C. trachomatis que estimulen la proliferación de células T en PBMCs de pacientes. Agrupaciones de bacterias que expresan fagos λgt11 seleccionados aleatoriamente que expresan polipéptidos recombinantes en fusión con β-galactosidasa en la bacteria hospedadora lisogénica Y1089r-(que facilita el crecimiento de fagos lisogénicos) se administran directamente a células PBMC de los pacientes. Después de la incubación, en el caso en que los PBMC's de los pacientes están activados, posiblemente a través de células T efectoras específicas debidas a la exposición al antígeno de C. trachomatis expresado bacterialmente, la mixtura se aclara respecto a crecimiento bacteriano ulterior por adición de antibióticos, y se incuba luego durante 2 a 4 días esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. La lectura puede ser proliferación de IFNγ y/o proliferación específica de células T.

En teoría, una genoteca de expresión aleatoria del genoma total que contiene secuencias génicas de C. trachomatis individuales expresadas aleatoriamente de 0,4-0,8 kb de tamaño abarca cualquier secuencia génica (en orientación correcta y en marco de lectura con la pareja de fusión, β-galactosidasa), en aproximadamente 1:10.000 clones lambda individuales. Así, el cribado de 10 a 20 agrupaciones cada una de las cuales contiene 500 a 1.000 clones bacterianos seleccionados aleatoriamente, abarca el genoma total de C. trachomatis. Datos publicados por Alderson et al (2000) han demostrado que una adición tan alta como 106 bacterias de control/pocillo que contienen una cantidad tan pequeña como 104 células T da como resultado un nivel bajo de IFNγ y proliferación inespecíficos. Una liberación significativa y específica de IFNγ, así como proliferación específica de células T se encontró por adición de una cantidad tan pequeña como 103 bacterias específicas de antígeno/pocillo que contenían una cantidad tan pequeña como 104 células T. Así pues, una agrupación con 106 bacterias que contengan 500 clones individuales diferentes añadida a 105 PBMC células/pocillo puede exponer la población de células T en cada pocillo a 2000 bacterias que expresan específicamente una fusión recombinante particular.

Materiales y métodos

Construcción del clon del fago λgt11 que expresa la fusión β-galactosidasa/CT521

Se construyó un λgt11-β-gal/CT521 para uso como control diana positivo de epítopes de células T. La secuencia de longitud total que codificaba CT521 se amplificó por PCR utilizando como molde DNA genómico de C. trachomatis serovar D y el cebador directo específico, TATAGAATTCATGTTAATGCCTAAACGAACAAAA-3', y el cebador inverso, 5'-TATAGAATTCTTATACCCTTTCCACACGCTTAACAAATTG-3', que contenían sitios EcoRI para clonación en el sitio de clonación EcoRI del vector de expresión λgt11 en marco con el marco de lectura abierto de β-galactosidasa. El constructo de fago recombinante clonado se verificó respecto a orientación y secuencia correctas por secuenciación directa de calvas de fago individuales (véase Ejemplo 3).

Preparación de la biblioteca de expresión aleatoria genómica completa de Chlamydia trachomatis como biblioteca lisogénica de λgt11

El stock bacteriano lisogénico de la biblioteca de expresión aleatoria genómica de C. trachomatis entera en Y1089rse construye esencialmente por el método descrito por Singh et al (1989).

Ejemplo 8

PBMC de 10 pacientes de Chlamydia y 5 controles se aislaron y cultivaron como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 1). Se establecieron cultivos de células en cultivos triplicados de 1,25 x 105 PBMCs y se estimularon con 5 µg de proteína. Se incluyeron como controles negativos (C) cultivos de células sin antígeno, y se utilizó PHA (2 µg/ml) como control mitogénico positivo (resultado no presentado). Se testaron los antígenos siguientes: CT043, CT008 CT016 CT025 CT026, CT048, CT098, CT110, CT125, CT155, CT003, CT005, CT023, CT027, CT028, CT032, CT035, CT078, CT082, CT093, CT111, CT123, CT126, CT133, CT175, CT184, CT002, CT009, CT015, CT061, CT063, CT068, CT071, CT080; CT089, CT141, CT509, CT803, CT004, CT030, CT038, CT040, CT052, CT053, CT067, CT511, CT583, CT603, CT681, CT265, CT323, CT322, CT342, CT357r, CT375, CT376, CT456, CT213, CT168, CT396, CT443, CT587, CT610, CT679, CT842, CT875, CT561, CT659, CT112, CT124, CT150, CT201, CT245, CT246, CT405, CT420, CT426, CT507, CT512, CT513, CT514, CT516, CT316, CT439, CT492, CT520, CT523, CT526, CT611, CT613, CT626, CT630, CT647, CT649, CT725, CT734, CT779, CT 801, CT833, CT835, CT836, CT845 y CT541 (Fig. 10).

Como se ve en la Figura 10, el grado de reconocimiento humano varía. Algunos son reconocidos intensa y frecuentemente -respondiendo más de 5 pacientes con un nivel de IFN-γ por encima de todos los controles. Éstos incluyen CT375, CT376, CT004, CT048, CT078, CT110, CT583, CT603, CT681, CT184, CT175, CT025, CT002, CT015, CT063, CT456, CT168, CT396, CT443, CT124, CT028, CT030, CT43, CT048, CT080, CT111, CT316,

CT322, CT342, CT375, CT492, CT512, CT520, CT521, CT523, CT541, CT611, CT613, CT630, CT649, CT734, CT801, CT803 (Figura 11) , en tanto que otros no son reconocidos en absoluto (ej. CT071, CT133, CT005).

Ejemplo 9

Test Mapia de dianas de anticuerpos -esencialmente como se describe en Lyashchenko et al. (2000). De modo resumido, los antígenos de los Ejemplos 2 y 3 se purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Los antígenos se extendieron sobre membrana de nitrocelulosa y se testaron respecto a reacción contra un panel de sueros de pacientes y sueros de control (20 de cada uno). Se utilizaron controles para definir el punto de corte visual. Los sueros de pacientes con una reacción clara en el corte visual se consideran como positivos y se clasifican desde 1 a 20 positivos.

Antígeno

Número de Positivos

Ct051

4

Ct080

0

Ct089

10

Ct110

18

Ct115

1

Ct118

6

Ct119

9

Ct125

8

Ct141

0

Ct155

0

Ct168

7

Ct174

0

Ct184

1

Ct283

1

Ct396

5

Ct443

19

Ct456

8

Ct541

9

Ct643

0

Ct681

19

Ct842

2

Ct874

4

10 Ejemplo 10: Estrategia de protección en ratones C3H/HeN Los antígenos examinados en este modelo son: CT521, TC0052 (proteína principal de la membrana externa de muridarum) y la combinación de las dos proteínas. Materiales y métodos 15 Animales Se obtuvieron ratones hembra C3H/HeN, de 8-12 semanas de edad, de Harlan Laboratory. Los animales se alojaron en condiciones ambiente estándar y tenían a su disposición comida estándar y agua and libitum.

Chlamydia muridarum Se propagó C. muridarum en células HeLa 229 y se recolectó como se describe en el Ejemplo 6. 20 Infección de los ratones

Los ratones se infectaron por la ruta intravaginal con 105 IFU's. La infección se monitorizó el día 7, el día 14 y el día 21 después de inoculación por obtención de frotis cervicovaginales seguida por tinción fluorescente y enumeración de las unidades infecciosas en el espécimen como se describe en el Ejemplo 6.

Inmunización

Los ratones se inmunizaron subcutáneamente (sc) tres veces con intervalo de dos semanas en la base de la cola. Las vacunas consistían en 5 µg rCT521, 5µg rTC0052 o la combinación (5 µg rCT521 + 5µg rTC0052) emulsionada en 250µg DDA y 100µg TDB. Como control negativo, se inyectó DDA/TDB solo, sin proteína.

Cultivos de linfocitos y evaluación del potencial inmunoinductor

Para evaluación de la capacidad para inducir una respuesta inmune fuerte, se extrajeron muestras de sangre del seno oftálmico 7 días después de la última inmunización, se reunieron en grupos (10 ratones) y los linfocitos de la sangre se purificaron en gradiente de densidad y se resuspendieron en medios de reestimulación (RPMI-1640, Gibco, 10% de suero de bovino fetal desactivado por calentamiento, Biochrom AG, Berlín, 100 U/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina, Hepes 10 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato 1 mM).

Las células aisladas se cultivaron por triplicado en placas de 96 pocillos con fondo redondo a razón de 2 x 105 células por pocillo en 200 µl de medio de reestimulación. Las proteínas se añadieron en concentraciones comprendidas entre 0,31 µg/ml y 10 µg/ml y se incubaron durante 72 h. Se incluyeron controles positivos y negativos (cualquier medio o 5 µg/ml de ConA). Después de la reestimulación, los sobrenadantes se cosecharon y se cuantificó IFN-γ por ensayo de inmunosorbente unido a enzima (Brandt et al., 2000) (Figura 12). La inmunización con rCT521 inducía una liberación intensa de IFN-γ en respuesta a la reestimulación con rCT521, y un mapeado de epítopes (péptidos descritos en el Ejemplo 1) de CT521 reveló que P4 (aa40-62) era el epítope dominante (Figura 12A). Análogamente, la inmunización con rTC0052 inducía también una liberación intensa de IFN-γ en respuesta a la proteína homóloga (Figura 12b). Es interesante que la mixtura de rCT521 y rTC0052 mejoraba muy eficazmente la respuesta a rCT521 comparada con la inmunización con rCT521 sola (Figura 12C).

Evaluación de la eficacia protectora

Para evaluación de la eficacia de las vacunas, se enfrentaron los ratones 10 semanas después de la primera inmunización por infección intravaginal con 105 IFU's. La eficacia protectora de los candidatos de vacuna se monitorizó por enumeración de las unidades infecciosas obtenidas por frotis cervicovaginales como se describe en el Ejemplo 6. Tanto rCT521 como rTC0052 inducían niveles elevados de protección, y la combinación de las dos proteínas tenía un efecto aditivo positivo sobre la protección (Figura 13). Los experimentos de protección con rCT521 se han repetido en los ratones C3H/HeN con resultados similares, y se han encontrado también niveles altos de protección después de inmunización con rCT521 en ratones F1 BALB/c x C57BL/6j (resultados no presentados).

Referencias

…

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Statens Serum Institut

<120> Antígenos de Chlamydia

<130> 15016pc1

<160> 308

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 1

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 2

<210> 3

<211> 144

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 3

<210> 4

<211> 432

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 4

<210> 5

<211> 138

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 5

<210> 6

<211> 414

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 6

<210> 7

<211> 429

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 7

<210> 8

<211> 1287

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 8

<210> 9

<211> 167

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 9

<210> 10

<211> 501

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 10

<210> 11

<211> 326

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 11

<210> 12

<211> 978

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 12

<210> 13

<211> 282

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 13

<210> 14

<211> 846

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 14

<210> 15

<211> 263

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 15

<210> 16

<211> 789

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 16

<210> 17

<211> 195

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 17

<210> 18

<211> 585

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 18

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 19

<210> 20

<211> 348

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 20

<210> 21

<211> 301

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 21

<210> 22

<211> 903

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 22

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 23

<210> 24

<211> 339

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 24

<210> 25

<211> 82

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 25

<210> 26

<211> 249

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 26

<210> 27

<211> 102

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 27

<210> 28

<211> 306

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 28

<210> 29

<211> 122

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 29

<210> 30

<211> 366

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 30

<210> 31

<211> 424

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 31

<210> 32

<211> 1272

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 32

<210> 33

<211> 359

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 33

<210> 34

<211> 1077

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 34

<210> 35

<211> 448

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 35

<210> 36

<211> 1344

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 36

<210> 37

<211> 287

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 37

<210> 38

<211> 861

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 38

<210> 39

<211> 560

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 39

<210> 40

<211> 1680

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 40

<210> 41

<211> 167

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 41

<210> 42

<211> 501

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 42

<210> 43

<211> 151

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 43

<210> 44

<211> 453

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 44

<210> 45

<211> 491

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 45

<210> 46

<211> 1473

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 46

<210> 47

<211> 363

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 47

<210> 48

<211> 1089

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 48

<210> 49

<211> 352

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 49

<210> 50

<211> 1056

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 50 <210> 51

<211> 550

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 51 <210> 52

<211> 1650

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 52

<210> 53

<211> 300

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 53 <210> 54

<211> 900

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 54

<210> 55

<211> 242

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 55

<210> 56

<211> 726

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 56

<210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 57

<210> 58

<211> 363

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 58

<210> 59

<211> 257

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 59

<210> 60

<211> 771

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 60

<210> 61

<211> 148

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 61 <210> 62

<211> 444

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 62

<210> 63

<211> 857

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 63

<210> 64

<211> 2571

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 64

<210> 65

<211> 1770

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 65

<210> 66

<211> 5310

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 66 <210> 67

<211> 878

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 67

<210> 68

<211> 2634

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 68 <210> 69

<211> 1005

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 69

<210> 70

<211> 3015

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 70 <210> 71

<211> 393

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 71 <210> 72

<211> 1179

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 72

<210> 73

<211> 164

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 73

<210> 74

<211> 492

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 74

<210> 75

<211> 150

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 75

<210> 76

<211> 450

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 76

<210> 77

<211> 129

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 77

<210> 78

<211> 387 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 78

<210> 79

<211> 267

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 79

<210> 80

<211> 801

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 80

<210> 81

<211> 52

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 81

<210> 82

<211> 156

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 82

<210> 83

<211> 529

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 83

<210> 84 <211> 1587

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 84

<210> 85

<211> 339

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 85

<210> 86

<211> 1020

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 86 <210> 87

<211> 160

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 87

<210> 88

<211> 480

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 88

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<211> 421

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 89

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

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<210> 91

<211> 313

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 91

<210> 92

<211> 939

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 92

<210> 93 <211> 100

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 93

<210> 94

<211> 300

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 94

<210> 95

<211> 148

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 95

<210> 96

<211> 444

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 96

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<211> 571

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 97 <210> 98

<211> 1713

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 98

<210> 99

<211> 90

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 99

<210> 100

<211> 273

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 100

<210> 101

<211> 695

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 101

<210> 102

<211> 2085

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 102 <210> 103

<211> 77

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 103

<210> 104

<211> 234

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 104

<210> 105

<211> 97

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 105

Leu

<210> 106

<211> 291

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 106

<210> 107

<211> 361

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 107

<210> 108

<211> 1083

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 108

<210> 109

<211> 458

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 109 <210> 110

<211> 1377

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 110

<210> 111

<211> 544

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 111 <210> 112

<211> 1632

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 112

<210> 113

<211> 273

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 113

<210> 114

<211> 819

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 114

<210> 115

<211> 243

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 115

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<211> 729

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 116

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<211> 553

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 117

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 118

<210> 119

<211> 163

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 119

<210> 120

<211> 489

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 120

<210> 121

<211> 660

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 121

<210> 122

<211> 1980

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 122 <210> 123

<211> 698

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 123 <210> 124

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 124 <210> 125

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 126

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<213> Chlamydia trachomatis

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 128

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<212> PRT

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<400> 129

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 131

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<212> DNA

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<211> 149

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 133

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 134

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 135

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 136

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<211> 101

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 137

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<211> 303

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 138

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 139

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<212> DNA

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<400> 140

<210> 141

<211> 141

<212> PRT

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<400> 141

<210> 142

<211> 423

<212> DNA

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<211> 110

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 143 <210> 144

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<212> DNA

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<400> 144

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<211> 73

<212> PRT

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<400> 145

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<211> 219

<212> DNA

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<400> 146

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<212> PRT

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<400> 147

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<211> 708

<212> DNA

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<211> 131

<212> PRT

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<400> 149

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<211> 393

<212> DNA

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<400> 150

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<212> PRT

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<400> 152

<210> 153

<211> 118 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 153

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<211> 354

<212> DNA

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<400> 154

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<211> 68

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 155

<210> 156

<211> 204

<212> DNA

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<211> 243

<212> PRT

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<400> 157

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<212> DNA

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<211> 79

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<400> 161

<210> 162

<211> 237

<212> DNA

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<400> 162

<210> 163

<211> 83

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 163

<210> 164

<211> 249

<212> DNA

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<400> 164

<210> 165

<211> 105

<212> PRT

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<400> 165

<210> 166

<211> 315

<212> DNA

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<400> 166

<210> 167

<211> 164

<212> PRT

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<400> 167

<210> 168

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<212> DNA

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<400> 168

<210> 169

<211> 110

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 169

<210> 170

<211> 330

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<210> 171

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<211> 23

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<400> 176

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<211> 23

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<400> 177

<210> 178

<211> 69

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<211> 23

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<211> 69

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<211> 23

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<210> 182

<211> 69

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<212> PRT

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<400> 183

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<400> 184

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<211> 106

<212> PRT

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<400> 185

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<212> DNA

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<400> 186

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<211> 159

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 187

<210> 188

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<212> DNA

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<400> 188

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<212> PRT

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<400> 189 <210> 190

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<212> DNA

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<400> 190 <210> 191

<211> 219

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 191

<210> 192

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<212> DNA

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<400> 192

<210> 193

<211> 242 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 193

<210> 194

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 194

<210> 195

<211> 260

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 195

<210> 196

<211> 783

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 196

<210> 197

<211> 483

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 197

<210> 198

<211> 1452

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 198

<210> 199

<211> 307

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 199

<210> 200

<211> 924

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 200

<210> 201 <211> 389

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 201

<210> 202

<211> 1170

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 202 <210> 203

<211> 148

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 203

<210> 204

<211> 447

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 204

<210> 205 <211> 249

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 205

<210> 206

<211> 750

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 206

<210> 207

<211> 246

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 207

<210> 208

<211> 741

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 208

<210> 209

<211> 254

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 209

<210> 210

<211> 765

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 210

<210> 211

<211> 271

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 211

<210> 212

<211> 816

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 212

<210> 213

<211> 601

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 213

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<211> 1806

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 214 <210> 215

<211> 416

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 215

<210> 216

<211> 1251

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

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<211> 616

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 217

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<211> 1851

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 218 <210> 219

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 220 <210> 221

<211> 250

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 221 <210> 222

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<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 222

<210> 223

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 223

<210> 224

<211> 4389

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 224 <210> 225

<211> 200

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 225 <210> 226

<211> 603

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 226

<210> 227

<211> 120

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 227

<210> 228

<211> 363 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 228

<210> 229

<211> 130

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 229

<210> 230

<211> 393

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 230

<210> 231

<211> 569

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 231

<210> 232

<211> 1710

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 232 <210> 233

<211> 334

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 233 <210> 234

<211> 1005

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 234

<210> 235

<211> 355

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 235

<210> 236

<211> 1068

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 236

<210> 237

<211> 490

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 237 <210> 238

<211> 1473

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 238

<210> 239

<211> 121

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 239

<210> 240

<211> 366

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 240

<210> 241

<211> 342

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 241

<210> 242

<211> 1029

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 242

<210> 243

<211> 382

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 243 <210> 244

<211> 1149

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 244

<210> 245

<211> 169

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 245

<210> 246

<211> 510

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 246

<210> 247

<211> 277

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 247

<210> 248

<211> 831

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 248

<210> 249

<211> 340

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 249

<210> 250

<211> 1020

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 250

<210> 251

<211> 328

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 251

<210> 252

<211> 984

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 252

<210> 253

<211> 199

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 253

<210> 254

<211> 597

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 254

<210> 255

<211> 107

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 255

<210> 256

<211> 321

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 256

<210> 257

<211> 369

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 257

<210> 258

<211> 1107

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 258

<210> 259

<211> 377

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 259 <210> 260

<211> 1131

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 260 <210> 261

<211> 165

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 261

<210> 262

<211> 495

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 262

<210> 263

<211> 123

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 263

<210> 264

<211> 369

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 264

<210> 265

<211> 183

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 265

<210> 266

<211> 549 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 266

<210> 267

<211> 180

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 267

<210> 268

<211> 540

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 268

<210> 269 <211> 130

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 269

<210> 270

<211> 390

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 270

<210> 271

<211> 123

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 271

<210> 272 <211> 369

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 272

<210> 273

<211> 202

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 273

<210> 274

<211> 606

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 274

<210> 275

<211> 72

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 275

<210> 276

<211> 216

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 276

<210> 277

<211> 111

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 277

<210> 278

<211> 333

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 278

<210> 279

<211> 111

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 279

<210> 280

<211> 333

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 280

<210> 281

<211> 243

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 281

<210> 282

<211> 729

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 282

<210> 283

<211> 450

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 283

<210> 284

<211> 1350

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 284

<210> 285

<211> 209

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 285

<210> 286

<211> 627

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 286

<210> 287

<211> 227

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 287

<210> 288

<211> 681

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 288

<210> 289

<211> 192

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 289

<210> 290

<211> 576

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 290

<210> 291 <211> 178

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 291

<210> 292

<211> 534

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 292

<210> 293

<211> 184

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 293

<210> 294

<211> 552

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 294

<210> 295

<211> 221

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 295

<210> 296

<211> 663

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 296

<210> 297

<211> 229

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 297

<210> 298

<211> 687

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 298

<210> 299

<211> 112

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 299

<210> 300

<211> 336

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 300

<210> 301

<211> 193

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 301

<210> 302

<211> 579 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 302

<210> 303

<211> 123

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 303

<210> 304

<211> 369

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 304

<210> 305

<211> 342

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 305

<210> 306

<211> 1026

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 306

<210> 307

<211> 92

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 307

<210> 308

<211> 276

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 308

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de un polipéptido sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

   (a)

   SEQ ID NO. 1, o

   (b)

   una porción inmunógena de la secuencia indicada en (a), o

   (c)

   una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y es al mismo tiempo inmunógena, o el ácido nucleico codificante de los polipéptidos indicados en (a), (b) o (c), para preparación de una composición farmacéutica para prevención o tratamiento de infecciones causadas por una bacteria de una especie de Chlamydia, en donde el polipéptido está fusionado a una pareja de fusión.

2. 2.

   Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido está lipidado a fin de permitir un efecto autoadyuvante del polipéptido.

3. 3.

   Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la pareja de fusión comprende

   (a)

   un polipéptido derivado de una especie de Chlamydia,o

   (b)

   al menos una porción inmunógena de cualquiera de tales polipéptidos indicados en (a).

4. 4.

   Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido indicado en (a) tiene la secuencia correspondiente siguiente: SEQ ID NO 2.

5. 5.

   Una composición farmacéutica para uso a fin de prevenir o tratar infecciones causadas por una bacteria de las especies Chlamydia, que comprende un polipéptido sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

   (a)

   SEQ ID NO. 1, o

   (b)

   una porción inmunógena de la secuencia indicada en (a); y/o

   (c)

   una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en (a) o (b) y que es al mismo tiempo inmunógena, o el ácido nucleico codificante de (a), (b) o (c), en donde el polipéptido está fusionado a una pareja de fusión.

6. 6.

   Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polipéptido está lipidado a fin de permitir un efecto auto-adyuvante del polipéptido.

7. 7.

   Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la pareja de fusión comprende

   (a)

   un polipéptido derivado de una especie de Chlamydia,o

   (b)

   al menos una porción inmunógena de cualquiera de tales polipéptidos indicados en (a), o el ácido nucleico que codifica los mismos.

8. 8.

   Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos indicados en (a) tiene la secuencia correspondiente siguiente: SEQ ID NO. 2.

9. 9.

   Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 5-8, que se encuentra en la forma de una vacuna.

10. 10.

    Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 para uso en la inmunización contra o el tratamiento de infecciones causadas por una bacteria de una especie de Chlamydia.

11. 11.

    Una vacuna para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la especie de Chlamydia es C. trachomatis.

12. 12.

    Un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

    (a)

    SEQ ID NO. 1, o

    (b)

    una porción inmunógena de la secuencia indicada en (a); y/o

    (c)

    una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en (a) o (b) y que es al mismo tiempo inmunógena en un inmunoensayo o un fragmento de fijación específico de dicho anticuerpo.

13. 13.

    Un método para diagnóstico de infección previa o en curso con una bacteria de una especie de Chlamydia, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra con un reactivo de diagnóstico a fin de detectar una reacción positiva, en donde dicho reactivo de diagnóstico comprende un polipéptido sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

    (a)

    SEQ ID NO. 1, o

    (b)

    una porción inmunógena de la secuencia indicada en (a), o

    (c)

    una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en (a) o (b) y que es al mismo tiempo inmunógena, o el ácido nucleico codificante de los polipéptidos indicados en (a), (b) o (c).

14. 14.

    Un método para diagnóstico de infección previa o en curso con una bacteria de una especie de Chlamydia, comprendiendo dicho método

    (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 a fin de detectar una reacción positiva en caso de infección.

15. 15.

    Un método in vitro de diagnóstico de una infección previa o en curso con una bacteria y una especie de Chlamydia en un individuo que comprende:

    (a)

    poner en contacto un reactivo de diagnóstico con un fluido corporal del individuo, en donde dicho reactivo de diagnóstico comprende un polipéptido sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

    (1)

    SEQ ID NO. 1, o

    (2)

    una porción inmunógena de la secuencia indicada en (1), o

    (3)

    una secuencia de aminoácidos análoga que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en (1) o (2) y que es al mismo tiempo inmunógena, o el ácido nucleico codificante de los polipéptidos indicados en (1), (2) o (3);

    (b)

    detectar la fijación de un anticuerpo a dicho polipéptido, siendo dicha fijación una indicación de que dicho individuo está infectado por una bacteria de una especie de Chlamydia.