MXPA00007261A - Proteina psaa lipidasa recombinante, metodos de preparacion y su uso - Google Patents
Proteina psaa lipidasa recombinante, metodos de preparacion y su usoInfo
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Abstract
La presente invención se relaciona con proteínas PsaA lipidadas recombinantes y constructos recombinantes a partir de los cuales se pueden expresar las proteínas PsaA lipidadas. La invención se relaciona además con proteínas PsaA lipidadas en las cuales la lipidación se lleva a cabo mediante el uso de una secuencia líder heteróloga derivada del gen ospA de Borrelia burgdorferi, secuencia líder la cual se une en el marco de lectura traduccional con el gen estructural para PsaA. La invención también proporciona métodos de preparación de proteínas PsaA lipidadas y el uso de tales proteínas en composiciones inmunológicas. También se proporcionan vacunas que comprernden proteínas PsaA lipidadas inmunogénicas y Métodos de uso de tales vacunas en la prevención y tratamiento de infección por S. Pneumoniae.
Description
PROTEÍNA PsaA LIPIDADA RECOMBINANTE . MÉTODOS DE
PREPARACIÓN Y SU USO
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El microorganismo Streptococcus pneumoniae es una causa importante de otitis media, meningitis, bacteremia y neumonía, y es la causa principal de infecciones mortales en ancianos y personas con condiciones médicas subyacentes, tales como enfermedades pulmonares, enfermedades hepáticas, alcoholismo, células falciformes, fugas de líquido cefalorraquídeo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA), y pacientes que experimentan terapia inmunosupresiva .
También es una causa principal de morbilidad en niños pequeños. Las infecciones neumocócicas provocan aproximadamente 40,000 muertes en los Estados Unidos cada año
(CDC, prevención de enfermedades neumocócicas, MMWR 1997; 46:1- 25). Las infecciones neumocócicas más graves involucran meningitis invasiva e infecciones por bacteremia, de las cuales existen 3,000 y 50,000 casos anualmente, de manera respectiva . Pese al uso de antibióticos y vacunas, la prevalencia de infecciones neumocócicas a disminuido poco durante los últimos 25 años; se reporta que la tasa de casos-mortalidad por bacteremia es de 15-20% en la población
REF: 121744 general, 30-40% en los ancianos y 36% en americanos negros quienes viven dentro de las ciudades. Las formas menos graves de enfermedades neumocócicas son neumonía, de las cuales existen 500,000 casos anualmente en los Estados Unidos, y otitis media en niños, de las cuales se estima que hay 7,000,000 de casos anualmente en los Estados Unidos, causados por S . pneumoniae . Las cepas de S. pneumoniae resistentes a medicamentos se vuelve cada vez más comunes en los Estados Unidos y en todo el mundo. En algunas áreas, hasta un 30% de aislados neumocócicos son resistentes a penicilina. El incremento en los neumococos resistentes a los antimicrobianos enfatiza más la necesidad de evitar infecciones neumocócicas. Los neumococos colonizan asintomáticamente el tracto respiratorio superior de individuos normales; la enfermedad con frecuencia resulta de la diseminación de microorganismos de la nasofaringe u otros tejidos durante fenómenos oportunistas. La incidencia de portación en los humanos varía con la edad y las circunstancias. Las tasas de portador en niños típicamente son mayores que los de los adultos. Los estudios han demostrado que 38 a 60% de niños en edad preescolar, 29 a 35% de niños en la escuela inicial y 9 a 25% de niños en primaria son portadores de neumococos. Entre los adultos, la tasa de portadores disminuye a 6% para aquellos sin niños en casa, y 18 a 29% para aquellos con niños en casa. No es sorpréndete que una tasa mayor de portadores en niños que en adultos sea paralelo a la incidencia de enfermedades neumocócicas en estas poblaciones. Un" objetivo atractivo para la vacunación estreptocócica es reducir los portadores en las poblaciones vacunadas y posteriormente reducir la incidencia de enfermedades neumocócicas. A habido discusión respecto a si la reducción en las tasas de portadores de neumocócicos por vacunación puede reducir la incidencia de la enfermedad en individuos no vacunados así como en individuos vacunados. Esta "inmunidad de manada" inducida por la vacunación contra los patógenos bacterianos respiratorios superiores se ha observado utilizando vacunas para el conjugado de Haemophilus influenzae tipo b (Takala, A.K. et al., J. Infect. Dis. 1991; 164: 982-986; Takala, A.K., et al., Pedriatr. Infect, Dis. J., 1993; 12: 593-599; Ward, J. , et al., Vaccines. S.A. Plotkin y E.A. Mortimer, eds., 1994, proporciona. 337-386; Murphy, T.V., et al., J. Pedriatr., 1993; 122; 517-523; y Mohle-Boetani, J.C., et al., Pedriatr. Infect. Dis. J. , 1993; 12: 589-593). Generalmente se acepta que la inmunidad a Streptococcus pneumoniae puede ser mediada por anticuerpos específicos contra la cápsula de polisacárido del neumococo. Sin embargo, los recién nacidos y niños pequeños no producen una respuesta inmune adecuada contra la mayor parte de los antígenos polisacáridos capsulares y pueden presentar infecciones repetidas que involucran el mismo serotipo capsular. Una solución para inmuniz'ar a los lactantes contra muchas de las bacterias encapsuladas es conjugar los antígenos polisacáridos capsulares a proteínas para volverlos inmunogénicos. Esta solución ha sido exitosa, por ejemplo, con Heamophil us infl uenzae b (véase la patente U.S. No. 4,496,538 para Gordon y patente U.S. No. 4,673,574 para Anderson). Sin embargo, existen más de 90 serotipos capsulares de S. pneumoniae, de las cuales 23 constituyen aproximadamente 85-90% de las enfermedades. Para que tenga éxito un conjugado de polisacárido-proteína neumocócica, los tipos capsulares responsables para la mayor parte de las infecciones neumocócicas deben volverse adecuadamente inmunogénicos. Esta solución puede ser difícil, debido a que los 23 polisacáridos incluidos en las vacunas actualmente disponibles no son inmunogénicos de manera óptima, incluso en adultos, incluso en adultos. La protección mediada por respuesta de anticuerpos polisacáridos anticapsulares se restringe al tipo de polisacárido. Los diferentes tipos de polisacáridos facilita de manera diferencial la virulencia en humanos y otras especies. Se han desarrollado vacunas neumocócicas al combinar 23 polisacáridos capsulares diferentes los cuales son representativos de los tipos prevalentes de enfermedades neumocócicas humanas. Estos 23 tipos de polisacáridos se han utilizado en una vacuna neumocócica patentada, desde 1983 (D.S. Fedson, M. Musher, Vaccines. S.A. Plotkin y J.E.A.
Montimer, eds., 1994, pp. 517-564). La vacuna de polisacáridos icosanotrivalente patentada a reportado eficacia de aproximadamente 60% para evitar bacteremia causada por pneumococci tipo vacuna en adultos saludables. Sin embargo, la eficacia de la vacuna ha sido puesta en duda, pues a veces se cuestiona la justificación del uso recomendado de la vacuna. Se ha especulado que la eficacia de esta vacuna es afectada negativamente al tener que combinar 23 antígenos diferentes. Al tener una gran cantidad de antígenos combinados en una sola formulación puede alterar negativamente la respuesta de anticuerpo a tipos individuales dentro de esta mezcla debido a la competencia antigénica. La eficacia también es afectada por el hecho de que los 23 serotipos abarcan todos los tipos serológicos asociados con infecciones humanas y transporte. Una solución alternativa para proteger a los niños, y también a los ancianos de infecciones neumocócicas sería identificar antígenos proteínicos que pueda inducir respuestas inmunes protectoras. Tales proteínas pueden servir como una vacuna por si mismas y se pueden utilizar junto con conjugados exitosos de polisacárido-proteína, o como portadores para polisacáridos. Russell et al., han descrito una proteína común a la especie, inmunogénica de S. pneumoniae denominada proteína A fimbrial neumocócica (J. Clin. Microbiol. 28: 2191-95 (1990)). Este antígeno proteínico de 37 kDa también se describe en la patente U.S. No. 5,422,427, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente en su totalidad como referencia. La proteína de 37 kDa, la cual se ha denominado previamente como la proteína A fimbral neumocócica recientemente ha sido denominada como proteína A de superficie neumocócica (PsaA) . Para los propósitos de la presente solicitud, las referencia hechas a PsaA, la proteína A de superficie neumocócica, la proteína A fimbral neumocócica o el antígeno de 37 kDa se comprenderá que se refieren a cierto antígeno proteínico de S. pneumoniae caracterizado por Russell et al., (1990) y descrito en la patente U.S. No. 5,422,427. Los estudios de análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal para PsaA demuestran que PsaA es común a la totalidad de los 23 serotipos de vacunas neumocócica (Russell et al., 1990). Se ha clonado y secuenciado el gen que codifica para PsaA (Sampson et al., (1994) "Cloning and nucleotide sequence analysis of PsaA, the Streptococcus pneumoniae gene encoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reported Streptococcus sp . Adhesin" Infect. Immun. 62:319-324). Desafortunadamente, la cepa a partir de la cual se clona el gen, R36A, es una cepa no encapsulado de baja virulencia, y los estudios subsecuentes han mostrado que no es representativa de los genes PsaA a partir de serotipos de cepas clínicamente importantes. Por ejemplo, los cebadores oligonucleotídicos basados en la secuencia publicada de PsaA a partir de R36A, son incapaces de amplificación directa por PCR del gen PsaA de la cepa D39, una cepa capsular virulenta tipo 2 (Berry y Patón, Infect. Immun. 64: 2555-62, 1996). Se ha clonado el gen PsaA a partir de la cepa encapsulada 6B, y es el sujeto de una solicitud de patente pendiente 08/222,179. Este gen es más representativo de cepas clínicamente importantes. Este gen se clonó inicialmente en pUC18 y posteriormente se insertó en un vector de expresión, pQE30 (Quiagen, CA) que contiene el promotor T5. Sin embargo, aunque las células huéspedes de E. coli transformadas con este constructo e inducidas con IPTG expresan PsaA recombinante, las células recombinantes son inestables y los rendimientos son bajos. Esta inestabilidad se puede deber a la toxicidad de las proteínas recombinantes lipidadas naturalmente en las células huéspedes de E. coli , lo que vuelve a tales sistemas de expresión de uso limitado en la preparación de cantidades suficientes de PsaA recombinante para uso en composiciones inmunológicas . Con el fin de establecer una infección, S. pneumoniae primero debe entrar al huésped a través de las superficies de la mucosa. El determinante principal de la inmunidad específica de las superficies mucosales es la IgA secretora (S-IgA) , la cual está fisiológica y funcionalmente separada de los componentes del sistema inmune circulatorio. Las respuestas de S-IgA mucosales se generan predominantemente por el sistema inmuno mucosal común (CMIS) [Mestecky, J. Clin. Immunol. (1987), 7:265-276], en la cual los inmunógenos son captados por estructuras linfopiteliales especializadas denominadas colectivamente como tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) . El término sistema inmune mucosal común se refiere al hecho de que la inmunización en cualquier sitio mucosal puede inducir una respuesta inmune en todos los demás sitios mucosales. Por lo tanto, una inmunización en el intestino puede inducir inmunidad mucosal en las vías aéreas superiores, y viceversa. Además, es importante hacer notar que la inmunización oral puede inducir una respuesta de IgG, específica de antígeno en el compartimiento sistémico, además de los anticuerpos IgA mucosales [Me Ghee, J.R., et al., (1993), Infect. Agents and Disease 2:55-73]. La mayor parte de los antígenos solubles no replicantes son pobres inmunógenos mucosales, especialmente por la vía peroral, debido probablemente a que las enzimas digestivas degradan tales antígenos y que tales antígenos tienen poco o nulo tropismo para el tejido linfoide asociado a intestinos (GALT) . Por lo tanto, un método para producir inmunógenos y vacunas mucosales efectivas así como composiciones inmunogénicas que " los contengan, sería deseable. Los antígenos proteínicos nativos tales como PsaA, o los fragmentos inmunogénicos de los mismos, estimulan una respuesta inmune cuando se administran a un huésped. Las proteínas recombinantes son candidatos de vacunas o composiciones inmunogénicas promisorias debido a que se pueden producir con alto rendimiento y pureza, y se pueden manipular para maximilar las actividades deseables y minimizar las indeseables. Sin embargo, debido a que son poco inmunogénicas, los métodos para mejorar la respuesta inmune para proteínas recombinantes son importantes en el desarrollo de vacunas o de composiciones inmunogénicas. Tales antígenos, especialmente cuando se producen recombinantemente, pueden inducir una respuesta más fuerte cuando se administran junto con un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que mejora la inmunogenicidad de un antígeno. Los adyuvantes pueden actuar al retener el antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto de almacén o acumulación, lo que facilita una liberación sostenida y lenta del antígeno a las células del sistema inmune. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmune, y pueden atraer células inmunes ai almacén de antígeno y estimular tales células para inducir una respuesta inmune.
Los agentes inmunoestimulantes o adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar la respuesta inmune del huésped a, por ejemplo, vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, normalmente son componentes de las bacterias destruidas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que típicamente no están unidos covalenteménte a los antígenos y se formulan para mejorar la respuesta inmune del huésped. El hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (denominados colectivamente de manera común como alumbre) se utilizan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. Actualmente, el alumbre es el único adyuvante autorizado para uso humano, aunque cientos de adyuvantes experimentales tales como la toxina B del cólera han sido probados. Sin embargo,- estos adyuvantes tienen deficiencias. Por ejemplo, aunque la toxina B de cólera no es tóxica en el sentido de causar cólera, generalmente no es fácil de administrar una toxina asociada con una enfermedad tan dañina como el cólera, especialmente si existe la posibilidad más remota de impureza menor. Además, se considera generalmente que, para que la toxina B del cólera funcione efectivamente como un adyuvante, debe tener cierta actividad de toxina de cólera . Por lo tanto, sería deseable mejorar la imunogenicidad de antígenos por métodos diferentes al uso de un adyuvante, especialmente en preparaciones monovalentes; y en preparaciones multivalentes, para tener la capacidad de utilizar tales medios para inmunogenicidad aumentada con un adyuvante, de manera que se obtenga una respuesta inmunológica incluso mayor. Un estimulador inmune muy promisorio es la porción lipídica de N-palmotoil-S- (2RS) -2, 3-bis- (palmitoiloxi) -propil cisteina, abreviada como Pam3Cys . Esta porción se ha encontrado en la parte aminoterminal de lipoproteínas bacterianas que son sintetizadas con una secuencia de señal que específica la unión del lípido y la separación por la peptidasa II de señal. Los péptidos sintéticos que en si mismos no son inmunogénicos, inducen una fuerte respuesta de anticuerpo cuando se acoplan covalentemente a Pam3Cys [Bessler, et-al., Research Immunology (1992) 143:548-552]. Además de una respuesta de anticuerpo, uno con frecuencia necesita inducir una respuesta inmune celular, particularmente linfocitos T citotóxicos (CTL) . Los péptidos sintéticos acoplados a Pam3Cys son inductores extremadamente potentes de CTL, pero hasta ahora no e ha reportado inducción de CTL por lipoproteínas recombinantes grandes. Como se describe en WO 90/04411, un análisis de la secuencia de ADN de la cepa B31 de B. Burgdorferi muestra que la proteína OspA es codifica por un marco de lectura abierta de 819 nucleótidos que comienzan en la posición 151 de la ADN y que terminan en la posición 970 de la secuencia de ADN (véase la figura 1 en la presente) . Los primeros 16 residuos aminoácidos de OspA constituyen una secuencia de señal hidrofóbica de OspA. El producto primario de traducción del gen de B . Burgdorferi de longitud completa contiene una secuencia de señal N-terminal hidrofóbica la cual es un sustrato para la unión de un diacil glicerol a la cadena lateral sulfhidrilo del residuo cisteina adyacente. Después de esta unión, se produce la separación por la peptidasa II de señal y la unión de un tercer ácido graso a la parte N-terminal. La porción lipídica completa se denomina Pam3Cys. Se ha demostrado que la lipidación de OspA es necesaria para inmunogenicidad, puesto que la lipoproteína OspA con una porción Pam3Cys N-terminal estimula una fuerte respuesta de anticuerpo, mientras que OspA que carece del lípido anexo no induce ningún anticuerpo detectable [Erdile et al., Infect. Immun . (1993), 61:81-90], La solicitud de patente internacional publicada WO 93/10238 describe la secuencia de ADN del gen PsaA de S . pneumoniae cepa (tipo 6B) y la proteína PsaA codificada por la misma, con un peso molecular de 37 kDa. Esta secuencia muestra que PsaA es una lipoproteína que utiliza una secuencia de señal similar a la utilizada para OspA. En base a los hallazgos respecto a OspA, uno puede esperar que la lipidación de PsaA recombinante pueda ser útil para mejorar su inmunogenicidad; pero, como se discute abajo, los solicitantes experimentaron dificultades para obtener una expresión detectable dé PsaA recombinante. La patente U.S. No. 4,624,926 para Inouye se relaciona con vectores de clonación plasmídicos, que incluyen una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido deseado unido con uno o más fragmentos funcionales derivados de un gen para lipoproteína de membrana exterior de una bacteria gram negativa. El polipéptido expresado por las células huéspedes de E. coli transformadas comprende el péptido señal de la lipoproteína, seguido por los primeros 8 residuos aminoácidos de la lipoproteína, los cuales a su vez son seguidos por la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada. El péptido señal se puede trasladar naturalmente a través de la membrana citoplástica y los primeros 8 aminoácidos de la lipoproteína y después se puede procesar adicionalmente y se inserta dentro de la membrana exterior de la célula de una manera análoga a la inserción normal de la lipoproteína dentro de la membrana exterior. No se ha demostrado inmunogenicidad de las proteínas expresadas. La solicitud de patente internacional publicada WO 91/09952 describe plásmidos para expresar proteínas lipidadas. Tales plásmidos involucran una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal de lipoproteína unido a los codones de uno de los tetrapéptidos de giro ß QANY o IERG, los cuales ha su vez se unen a la secuencia de ADN que codifica para la proteína deseada. Nuevamente, no se ha demostrado inmunogenicidad de las proteínas expresadas.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
Un objetivo de la invención es proporcionar una lipoproteína neumocócica recombinante en donde la lipidación de la misma sea a partir de la expresión de una primera secuencia de ácidos nucleico y la porción de proteína de la misma sea de la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico, y la primera y segunda secuencias no se presentan naturalmente juntas; especialmente tal lipoproteína en donde la primera secuencia -codifica para una secuencia líder de lipoproteína de Borrelia , preferiblemente una secuencia líder de OspA, y de manera más preferible en donde la segunda secuencia codifica para una porción de proteína que comprende PsaA, o un fragmento inmunogénico de la misma. Otro objetivo de la invención es proporcionar la expresión de genes y/o secuencias que codifican para tales lipoproteínas recombinantes, vectores de los mismos y métodos para llevar a cabo tal expresión. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar composiciones inmunogénicas, que incluyen vacunas, que contienen lipoprotéínas recombinantes y/o vectores de expresión para las mismas. Los documentos mencionados en esta descripción, que incluyen las solicitudes a las que se ha hecho referencia en lo anterior, proporcionan los ingredientes adicionales típicos para tales composiciones, de manera que no se requiere experimentación indebida por un experto en la técnica para formular una composición a partir de esta descripción. Tales composiciones de manera preferible deberán contener cierta cantidad de lipoproteína PsaA recombinante o vector que exprese en una cantidad suficiente para inducir una respuesta adecuada. Tal cantidad de lipoproteína recombinante o vector se puede basar en cantidades conocidas de antígenos administrados. Por ejemplo, si existe una cantidad conocida para administración de un antígeno que corresponde a la segunda secuencia expresada para la lipoproteína recombinante de la invención, la cantidad de lipoproteína PsaA recombinante se puede incrementar hasta aproximadamente aquélla cantidad conocida, y la cantidad de vector puede ser tal que se produzca una cantidad suficiente de unidades formadoras de colonia (ufe) de manera que resulte en una expresión in vivo de la lipoproteína recombinante en aproximadamente esa cantidad conocida. De igual manera, la cantidad de lipoproteína PsaA recombinante se puede basar en cantidades de antígeno administrado a animales en los ejemplos que siguen, y en los documentos mencionados en la presente, sin experimentación indebida. La presente invención también incluye, en otros aspectos, procedimientos para la producción de lipoproteínas de PsaA recombinantes, mediante ensamblado de un vector de expresión, la expresión de la lipoproteína PsaA recombinante a partir de un organismo huésped que contiene el vector de expresión, y opcionalmente aislar y/o purificar la lipoproteína PsaA recombinante expresada. El proceso de aislamiento y purificación también puede ser de manera que se obtenga lipoproteína PsaA recombinante libre de impurezas tales, como lipopolisacáridos y otras proteínas bacterianas. La presente invención incluye además composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, que contienen la lipoproteína PsaA recombinante así como métodos para inducir una respuesta inmunológica . La presente invención se relaciona con ingeniería genética para llevar a cabo la expresión de lipoproteínas neumocócicas a partir de vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican para las lipoproteínas. Más particularmente, la presente invención se relaciona con la expresión de una lipoproteína PsaA recombinante, en donde la lipidación de la misma es a partir de la expresión de una primera secuencia de ácido nucleico y la proteína de la misma es a partir de la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico, la primera y segunda secuencia de ácido nucleico, las cuales no se presentan de manera natural juntas, son contiguas. La invención se relaciona con la expresión de tales lipoproteínas, en donde la primera secuencia de ácido nucleico codifica para la secuencia líder de lipoproteína de Borrelia
(OspA) . La invención también se relaciona con proteínas PsaA lipidadas recombinantes expresadas utilizando la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia líder de OspA, métodos para elaborar y utilizar las mismas composiciones de la misma, y métodos para utilizar las composiciones. La invención se relaciona adicionalmente con secuencias de ácido nucleico que codifican para las lipoproteínas PsaA recombinantes, vectores que los contienen y/o que expresan las secuencias, métodos para expresar las lipoproteínas PsaA y métodos para elaborar • tales secuencias y vectores de ácido nucleico; composiciones que utilizan -las lipoproteínas PsaA, que incluyen composiciones inmunogénicas o de vacuna, tales composiciones preferiblemente tienen inmunogenicidad mejorada; y métodos para utilizar tales composiciones para inducir una respuesta inmunológica o protectora. A través de esta especificación, se hace referencia a diversos documentos de manera que describen más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece la invención. Cada uno de estos documentos se incorpora en la presente como referencia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DÉ LA INVENCIÓN
El procedimiento de la presente invención permite que se produzcan grandes cantidades de proteínas PsaA lipidadas inmunogénicas recombinantes puras, y porciones de las mismas, lo cual hasta ahora no ha sido posible. Las proteínas lipidadas formadas de manera recombinante proporcionadas en la presente son significativamente más inmunogénicas que sus análogos recombinantes no lipidados. En consecuencia, en una modalidad, la presente invención proporciona una molécula híbrida de ácido nucleico aislada, preferiblemente ADN, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de señal, preferiblemente de una proteína OspA de una especie de Borrelia, acoplada en una relación de marco de lectura abierta traduccional con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína PsaA madura, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo. La secuencia de señal de la proteína OspA de una cepa de Borrelia codificada por la primera secuencia de ácido nucleico preferiblemente es aquélla de una cepa de B. burgdorferi, de manera más preferible una cepa de B. burgdorferi que se selecciona de B31 , ACAl y las familias de cepas Ip90, o de otras cepas con secuencias de señal comparables.
El gen híbrido proporcionado en la presente se puede ensamblar en un vector de expresión, preferiblemente bajo el control de un promotor adecuado para expresión de la lipoproteína madura, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención el cual, en un organismo huésped adecuado, tal como E . coli , provoca la traducción inicial de una molécula quimérica que comprende la secuencia líder y la proteína PsaA en forma lipidada, seguido por separación de la molécula quimérica por la peptidasa II de señal y unida a las porciones lipidicas de la nueva parte terminal de la proteína
PsaA, por lo que la lipoproteína madura se expresa en el organismo huésped. La presente invención proporciona, por primera vez, una molécula híbrida de ácido nucleico la cual permite la producción de cantidades comercialmente útiles de proteína
PsaA lipidadas recombinantes o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos. Se prefieren los métodos recombinantes puesto que se desea un alto rendimiento. Las etapas básicas de la producción recombinante de PsaA lipidada incluyen:
construir un ADN sintético o semisintético que codifica para la lipoproteína PsaA heteróloga, b ) integrar el ADN en un vector de expresión de una manera adecuada para la expresión de lipoproteína PsaA, ya sea sola o como una proteína de fusión, c " ) transformar con el vector de expresión una célula huésped procariótica o eucariótica apropiada, ) cultivar la célula huésped transformada o transfectada, y e ) recuperar y purificar la lipoproteína PsaA producida recombinantemente . Para expresión recombinante, la secuencia que codifica para una lipoproteína PsaA puede ser completamente sintética, semisintética o el resultado de la modificación de un gen psaA nativo. Los genes sintéticos, 'cuya transcripción y traducción in vitro o in vivo resulta en la producción de polipéptidos similares a PsaA, se pueden construir por técnicas bien conocidas en el arte. Debido a la degeneración natural del código genético, los expertos en la técnica reconocerán que se pueden construir secuencias de ADN con número definido aunque determinable, las cuales codifican para las lipoproteínas PsaA. El gen que codifica para la lipoproteína PsaA se puede crear por metodología sintética. Tal metodología de construcción de genes sintéticos es bien conocida en la técnica. Brown, E.L. 'Belagaje, R.', Ryan, M.J., y Khorana, H.G. (1979) en Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y.,' Vol. 68, pgs, 109-151, la totalidad de las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Los segmentos de ADN que corresponden al gen psaA, o fragmentos de los mismos, se generan utilizando un aparato sintetizador de ADN convencional tal como un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Modelo 380A o 380B (disponible comercialmente de Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) . El gen psaA sintético se puede diseñar para que posea sitios de separación de endonucleasas de restricción en cualquier extremo del transcripto para facilitar el aislamiento y la integración en los plásmidos de expresión y amplificación. La elección de los sitios de restricción se elige de manera que oriente apropiadamente la codificación de secuencia para la • lipoproteína PsaA con secuencias de control para obtener una lectura en marco apropiada y la expresión de la lipoproteína PsaA. Se pueden incorporar diversos otros sitios de separación, dependiendo de los constructos recombinantes particulares utilizados y se pueden generar por técnicas reconocidas en el arte. La "reacción en cadena de polime-rasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la cual las cantidades de una pieza seleccionada previamente de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en la patente U.S. No. 4,683,195. Generalmente, la información de secuencia desde los extremos de la región de interés o que sobrepasa, se utiliza para diseñar cebadores oligonucleotídicos . Estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de la plantilla que se va a amplificar. Se puede utilizar PCR para amplificar secuencias específicas de ARN, secuencias específicas de ADN a partir de ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, bacteriófagos o secuencias plasmídicas, y similares. Véase en general Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). También se puede utilizar PCR para introducir convenientemente cualquier cambio de secuencia deseado en los genes de interés. Véase de manera general, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Bioloay, § 8.51 (John Wiley & Sons, 1995). La construcción de vectores adecuados que contengan secuencias deseadas de codificación y control utilizan técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se pueden separar, adaptar y volver a ligar en la forma deseada para producir los plásmidos requeridos. Para llevar a cabo la traducción de la secuencia de lipoproteína PsaA deseada, uno inserta la secuencia de ADN sometida a ingeniería que codifica para la lipoproteína PsaA de cualquiera de una plétora de vectores de expresión de ADN recombinantes apropiados mediante el uso de endonucleasas 'de restricción apropiadas. Una versión de síntesis de la secuencia codificante de ADN se diseña para poseer sitios de separación de endonucleasa de restricción en cualquier extremo del transcrito para facilitar el aislamiento de, y la integración en estos plásmidos de expresión y amplificación. La secuencia codificante se puede modificar fácilmente mediante el uso de lanzadores sintéticos para facilitar la incorporación de esta secuencia en los vectores de clonación deseados por técnicas bien conocidas en el arte. Las endonucleasas particulares utilizadas se determinarán por el patrón de separación de endonucleasa de restricción del vector de expresión parental que se va a utilizar. La elección de los sitios de restricción se elige de manera que orienten adecuadamente la secuencia codificante de ADN con secuencias de control para obtener la lectura apropiada en marco y la expresión de la lipoproteína PsaA. En general, los vectores plasmídicos que contienen secuencias promotoras y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped, son las que se utilizan con estos huéspedes. El vector habitualmente transporta un sitio de replicación así como secuencias marcadoras las cuales son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli , típicamente se transforma utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E.
coli (Bolívar, et al., Gene 2_: 95 "[1977]), pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y por lo tanto proporciona un medio fácil para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano también puede contener o se debe modificar para contener promotores y otros elementos de control comúnmente utilizados en la construcción de ADN recombinante. La secuencia de ADN que codifica para la lipoproteína PsaA debe colocarse de manera que esté en el marco de lectura apropiado con el promotor y el sitio de unión de ribosoma del vector de expresión, ambos los cuales son funcionales en la célula huésped en la cual se va a expresar la secuencia codificante de ADN para la lipoproteína PsaA. En la práctica preferida de la invención, la región promotora-operadora se coloca en la misma orientación secuencial con respecto al codón 'de inicio ATG de una secuencia de ADN que codifica para la lipoproteína PsaA conforme el promotor-operador ocupa con respecto al codón de inicio ATG del gen a partir del cual se deriva. Las regiones promotoras-operadoras sintéticas o modificadas tales como el promotor tac son bien conocidas en la técnica. Cuando se utilizan tales regiones promotoras-operadoras sintéticas o modificadas, se deben orientar con respecto al codón de inicio ATG de la secuencia de ADN que codifica para la lipoproteína PsaA, como es dirigida por sus creadores.
En general, las procariotás se utilizan para clonar secuencias de ADN en la construcción de vectores útiles en la invención. Por ejemplo, E. coli K12 cepa 294 (ATCC No. 31446) es particularmente útil. Otras cepas microbianas las cuales se pueden utilizar incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC No. 31537), E. coli W3110 (prototrófica, ATCC No. 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o Serra tia marcescans, y diversas especies de pseudomonas se pueden utilizar. Los promotores adecuados para uso con huéspedes procarióticos incluyen ß-lactamasa (vector pGX2907 [ATCC 39344] que contiene el replicón y el gen para ß-lactamasa) y sistemas promotores de lactosa (Chang et al., [1978] Nature, 275:615 y Goeddel et al., [1979] Nature 2-8_l:544), fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptofano (trp) (vector pATHl [ATCC 37695] se diseña para facilitar la expresión de un marco de lectura abierta como una proteína de fusión trpE bajo el control del promotor trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac (aislable del plásmido pDR540 ATCC-37282) . Sin embargo, otros promotores bacterianos funcionales, cuyas secuencias nucleotídicas generalmente se conocen, permiten a una persona habitualmente experta en la técnica ligarlos a ADN que codifica para polipéptidos similares a PspA utilizando enlazadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno unida operablemente a ADN que codifica para el polipéptido similar a PspA. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. Aunque la discusión anterior y los ejemplos que se proporcionan en la presente se refieren a la expresión procariótica, aquéllos que tengan habilidad en la técnica pueden apreciar fácilmente que las lipoproteínas PsaA recombinantes de la presente invención también se pueden producir recombinantemente en sistemas de expresión eucariótico capaces de llevar a cabo las modificaciones lipídicas postraduccionales necesarias. Las células huéspedes se pueden transformar con los vectores de expresión de esta invención y se pueden cultivar en medios nutritivos -convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son aquéllas utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para aquéllos habitualmente expertos en la técnica. Las técnicas para transformar células con los vectores mencionados antes son bien conocidas en el arte y se pueden encontrar en referencias generales tales como Maniatis, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York o Current Protocols in Molecular Biology (1989) y suplementos. Las lipoproteínas PsaA recombinantes de la presente invención se pueden elaborar ya sea por expresión directa o como una proteína de fusión que comprende la lipoproteína PsaA seguida por separación enzimática o química. Con frecuencia se observa en la producción de ciertos péptidos en sistemas recombinantes que la expresión como una proteína de fusión prolonga la duración de vida y/o incrementa el rendimiento del péptido deseado. Diversas peptidasas (por ejemplo tripsina), las cuales separan un polipéptido en sitios específicos o digieren los péptidos a partir de las partes terminales amino o carboxi (por ejemplo de aminopeptidasa) de la cadena peptídica son conocidos. Además, las sustancias químicas particulares (por ejemplo bromuro de cianógeno) separarán una cadena polipeptídica en sitios específicos. Los expertos en la técnica apreciarán que puede haber modificaciones necesarias en la secuencia de aminoácidos (y en la secuencia codificante sintética o semisintética si se utilizan medios recombinantes) para incorporar sitios de separación internos específicos de sitio. Véase, por ejemplo, Cárter P. Site Specific Proteolysis of Fusión Proteins, Ch. 13 en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes , American Chemical Soc., Washington, D.C. (1990).
Como se describe antes, "el gen híbrido se puede ensamblar en un vector de expresión bajo el control de un promotor adecuado para la expresión de la lipoproteína PsaA el cual, en un organismo huésped adecuado, tal como E. coli provoca la expresión de lipoproteína PsaA heteróloga del organismo huésped. La presente invención también proporciona lipoproteína PsaA recombinante expresada por un híbrido o gen quimérico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia líder o señal contigua a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una porción de proteína de la lipoproteína PsaA, y la primera y segunda secuencias no se presentan juntas de manera natural. La primera y segunda secuencias preferiblemente se acoplan en una relación de marco de lectura abierta. La primera y segunda secuencias pueden estar presentes en un gen; y el gen y/o la primera y segunda secuencias; pueden estar en un vector de expresión adecuado. El vector puede ser un ácido nucleico en forma de, por ejemplo, plásmidos, bacteriófagos y ADN integrado, en bacterias, de manera más preferible uno utilizado para la expresión, por ejemplo de E. coli , Ba cillus subtilis , Salmonella , Staphylococcus , Streptococcus, etc., o uno utilizado como un vector vivo, por ejemplo La ctobacill us , Mycoba cterium, Salmonel la , Streptbcoccus, etc. Cuando • se utiliza un huésped de expresión, se puede obtener la lipoproteína" PsaA recombinante al cosechar el producto expresado in vi tro, por ejemplo, al aislar la lipoproteína PsaA recombinante de un extracto bacteriano. El gen preferiblemente puede estar bajo el control, y por lo tanto puede estar unido operablemente a un promotor adecuado y el promotor puede ser endógeno al vector o se puede insertar en el vector con el gen. La invención proporciona además vectores que contienen el ácido nucleico que codifica para las lipoproteínas PsaA recombinante y métodos para obtener las lipoproteínas recombinantes, y métodos para preparar los vectores . Com se mencionó, las lipoproteínas PsaA recombinantes de la presente invención pueden tener inmunogenicidad aumentada. Por lo tanto, las modalidades adicionales de la invención proporcionan composiciones inmunogénicas o de vacuna para inducir una respuesta inmunológica, que comprende lipoproteína recombinante aislada, o un vector adecuado para expresión in vi vo del mismo, o ambos, en un portador adecuado, así como métodos para inducir una respuesta inmunológica o protectora, que comprende administrar a un huésped la lipoproteína PsaA recombinante aislada, el vector que expresa la lipoproteína PsaA recombinante, o una composición que contiene la lipoproteína recombinante o el vector, en una cantidad suficiente para inducir la respuesta. La presente invención proporciona una composición inmunogéníca, inmunológica o de vacuna que contiene polipéptidos recombinantes derivados de cepas neumocócicas y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una composición inmunológica que contiene lipoproteína PsaA induce una respuesta inmunológica-local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesita ser, protectora. Una composición inmunogénica que contiene la lipoproteína PsaA de igual manera induce una respuesta inmunológica local o sistémica la cual puede, pero no necesita ser, protectora. Una composición de vacuna induce una respuesta local o sistémica. En consecuencia, los términos "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" incluyen una "composición de vacuna" (pues los dos primeros términos pueden ser composiciones protectoras) . Por lo tanto, la invención también proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero huésped, que comprende administrar al huésped una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna, que comprende una lipoproteína PsaA recombinante y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La determinación de la "cantidad de antígeno de lipoproteína PsaA recombinante y de adyuvante adicional opcional en las composiciones de la invención y las preparaciones de las composiciones, puede ser de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas por aquéllos expertos en las técnicas farmacéuticas o veterinarias. En particular, la cantidad de antígeno y adyuvante en las composiciones de la invención en las dosificaciones administradas se determinan por técnicas bien conocidas por aquéllos expertos en las artes médicas o veterinarias tomando en consideración factores tales como el antígeno particular, el adyuvante (si está presente) , la edad, sexo, peso, especie y condición del animal o paciente particular, así como la vía de administración. Por ejemplo, las dosificaciones de antígeno de lipoproteína PsaA particulares para huéspedes adecuados en los cuales se desea una respuesta inmunológica, se pueden determinar fácilmente por aquéllos expertos en la técnica a partir de esta descripción, así como la cantidad de cualquier adyuvante típicamente administrado con el mismo. Por lo tanto, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad de antígeno y adyuvante opcional en las composiciones y que se administre en los métodos de la invención. Típicamente, un adyuvante se utiliza comúnmente como una solución de 0.001 a 50% en peso en solución salina amortiguada con fosfato, y el antígeno está presente en el orden de microgramos a miligramos, por ejemplo desde aproximadamente 0.0001 hasta aproximadamente 5% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.0001 hasta aproximadamente 1% en peso, y de manera más preferible 0.0001 a aproximadamente 0.05% en peso (véanse, por ejemplo los ejemplos abajo o en las solicitudes mencionadas aquí). Típicamente, sin embargo, el antígeno está presente en una cantidad en el orden de microgramos a miligramos, o de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 20% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10% en peso, y de manera mucho más preferible de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5% en peso. Por supuesto, para cualquier composición que se va a administrar a un animal o humano, incluyendo los componentes de la misma, y para cualquier método de administración particular, se prefiere determinar para el mismo: toxicidad, por ejemplo mediante la determinación de la dosis mortal (DL) y DL50 en un modelo animal adecuado, por ejemplo en roedores tales como ratones; y la dosificación de las composiciones, concentración de los componentes en la misma y sincronización de administración de la composición o composiciones, las cuales inducen una respuesta inmunológica adecuada, por ejemplo mediante titulaciones de suero y análisis del mismo para anticuerpos o antígenos, por ejemplo mediante análisis ELISA. Tales determinaciones no requieren experimentación indebida a partir del conocimiento de un experto en la técnica, y la descripción y los documentos mencionados aquí. Además, se puede determinar el tiempo para administraciones secuencias sin experimentación indebida. Los ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas por los orificios, por ejemplo vía oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, mucosal (por ejemplo perlingual, alveolar, gingival, olfatoria o en la mucosa respiratoria) etc., administraciones tales como suspensiones, jarabes y elíxires; y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo administración inyectable), tales como suspensiones o emulsiones estériles. Tales composiciones pueden estar en mezcla con un portador adecuado, diluyente o excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también pueden ser liofilizadas . Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores de pH, gelificantes o aditivos mejoradores de viscosidad, conservadores, agentes saborizantes, colores o similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Los textos estándar tal como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", décima séptima edición, 1985, incorporada en la presente como referencia, se puede consultar para preparar preparaciones adecua'das, sin experimentación indebida. Las composiciones de la invención se proporcionan convenientemente como preparaciones líquidas, por ejemplo soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones o composiciones viscosas las cuales pueden ser amortiguadas hasta el pH seleccionado. Si se prefiere la absorción en el tracto digestivo, las composiciones de la invención pueden estar en forma "sólida" de pildoras, tabletas, cápsulas, tabletas en forma de cápsulas y similares, que incluyen preparaciones "sólidas" las cuales son liberadas con el tiempo o las. cuales tienen un líquido de rellenado, por ejemplo líquido cubierto de gelatina, por lo que la gelatina se disuelve en el estómago para su suministro al intestino. Si se desea administración nasal o respiratoria (mucosal), las composiciones pueden estar en una forma y suministrarse por un surtidor de aspersión por opresión, un surtidor de bomba o un surtidor en aerosol. Los aerosoles habitualmente están bajo presión por medio de un hidrocarburo. Los surtidores de bomba preferiblemente pueden suministrar una dosis medida o una dosis que tenga un tamaño de partícula particular. Las composiciones de la invención pueden contener sabores y/o colores farmacéuticamente aceptables para volverlas más agradables, especialmente si se administran oralmente. Las composiciones viscosas pueden estar en forma de geles, lociones, ungüentos, 'cremas y similares, 'y típicamente contendrán una cantidad suficiente de un agente espesante de "manera que la viscosidad sea de aproximadamente 2500 a 6500 cps, aunque se pueden utilizar composiciones más viscosas, de hasta 10,000 cps. Las composiciones viscosas tienen una viscosidad preferiblemente de 2500 a 5000 cps, puesto que por encima de este intervalo se vuelven más difíciles de administrar. Sin embargo, por encima de este intervalo, las composiciones pueden aproximarse a formas sólidas o de gelatina las cuales después pueden administrarse fácilmente como una pildora y tragada para ingestión oral. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Adicionalmente, las composiciones líquidas son un poco más convenientes de administrar, especialmente por inyección u oralmente a animales, niños, particularmente niños pequeños y otros quienes pueden tener dificultades en tragar una pildora, tableta, cápsula o similar, o en situaciones de dosis múltiples. Por otra parte, las composiciones viscosas se pueden formular dentro de un intervalo apropiado de viscosidad para proporcionar períodos de contacto más prolongados con la mucosa, tal como el revestimiento del estómago o la mucosa nasal.
Evidentemente, la elección de los portadores adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular, por ejemplo forma de dosificación líquida (por ejemplo, si la composición se va a formular en una solución, una suspensión, gel u otra forma líquida) , o una forma de dosificación sólida (por ejemplo, si la composición se va a formular en una pildora, tableta, cápsula, tableta en forma de cápsula, forma de liberación en tiempo o forma rellenada líquida) . Las soluciones, suspensiones y geles normalmente contienen una cantidad mayor de agua (preferiblemente agua purificada) además del antígeno y el adyuvante opcional. También pueden estar presentes cantidades menores de otros ingredientes .tales como ajustadores de pH (por ejemplo una base tal como NaOH), emulsificantes ó agentes que mejoran la dispersión, agentes amortiguadores, conservadores, agentes humectantes, agentes formadores de gelificación (por ejemplo metilcelulosa), colores y/o sabores. Las composiciones pueden ser isotónicas, es decir, pueden tener la misma presión osmótica que la sangre y el fluido lagrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones de esta invención se puede llevar a cabo utilizando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol o sus solutos inorgánicos u orgánicos. Se prefiere cloruro de sodio particularmente para amortiguadores que contienen iones sodio. Se puede mantener la viscosidad de las composiciones al nivel seleccionado utilizando un agente espesante farmacéuticamente aceptable. Se prefiere metilcelulosa debido a que está disponible fácil y económicamente, y es fácil de trabajar con ella. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbómero y similares. La concentración preferida de espesante dependerá del agente seleccionado. El punto importante es utilizar una cantidad que obtenga la viscosidad seleccionada. Las composiciones viscosas normalmente se preparan a partir de soluciones mediante la adición de tales agentes espesantes. Se puede utilizar un conservador farmacéuticamente aceptable para incrementar la vida de anaquel de las composiciones. El alcohol bencílico puede ser adecuado, aunque también se pueden utilizar diversos conservadores que incluyen, por ejemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol o cloruro de benzalconio. Una concentración adecuada del conservador será de 0.02% a 2% en base en el peso total, aunque puede haber variación apreciable dependiendo del agente seleccionado.
Aquéllos expertos en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones se deben seleccionar para ser químicamente inertes con respecto al antígeno de lipoproteína PsaA y el adyuvante adicional opcional.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. DERIVACIÓN DE LA SECUENCIA QUE CODIFICA PARA PsaA
Se utilizan cebadores oligonucleotídicos diseñados específicamente en un procedimiento de PCR para amplificar la secuencia codificante psaA de S . pneumoniae tipo 6B. Los cebadores se basan en la secuencia psaA publicada. (Sampson et al., Infect. Immun. (1994) 62:319-329). El cebador DE09 (SEC. DE IDENT. NO: 1)- cubre 26 pares de bases en el extremo 5' del gen psaA, terminando en el sitio Sphl. El cebador DE11 (SEC. DE IDENT. NO: 2) abarca 26 pares de bases en el extremo 3' de la secuencia que codifica para PsaA y un sitio BamHI.
SEC. DE IDENT. NO: 1 5 ' GGGCATGCGCTAGCGGAAAAAAAGAT SEC. DE IDENT. NO: 2 3 ' GGGGATCCTTATTTTGCCAATCCTTC Los cebadores DE09 y DE11 se utilizan en una reacción por PCR utilizando una primera cadena de ADN como plantilla para amplificar un fragmento de 870 pares de bases. La amplificación por PCR se lleva a cabo en un ciclador térmico ADN (Perkin-Elmer Cetus) por 35 ciclos, con desnaturalización con 30 segundos a 94°C, seguido por una reacción de reasociación a 55°C durante 30 segundos con una extensión a 72 °C durante 2 minutos. El fragmento de PsaA amplificado por PCR se digiere con Sphl y BamHI, y se liga al plásmido pLFIOO (ATCC Acceso No. 69750) el cual dirige la inserción hacia el extremo 3', y en un marco de lectura transnacional con la secuencia de señal ospA y la cual ha sido digerida con las mismas enzimas y purificada por electroforesis en gel. La ligación del fragmento psaA amplificado por PCR que ha sido digerido con Sphl y BamHI dentro del plásmido pLFIOO digerido con las mismas enzimas, resulta en la generación del plásmido pOPsaAl. Se confirma la presencia del gen psaA de interés dentro de este recombinante por el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) y análisis de secuencia de ciclo, utilizando técnicas convencionales. La secuencia de PsaA lipidada recombinante se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 3. Los primeros 52 residuos se derivan de la secuencia de señal OspA de Borrel ia burdorferi : los residuos restantes se derivan de PsaA madura de S . pneum?niae tipo 6B (que carece de la secuencia de señal PsaA nativa) . Se preparan células de E. coli recombinantes estables que expresan rPsaA recombinante por transformación de células HMS174-DE3 competentes (Novagen Inc., Madison, WI) con pOPsaAl, utilizando técnicas de choque técnico estándar (Novagen) . La expresión de PsaA recombinante se confirma por análisis de inmunotransferencia con anticuerpos contra PsaA policlonales de conejo. Uno de los diversos recombinantes los cuales se expresan a altas concentraciones de PsaA recombinante se denomina HOPsaA.7.3 y se somete a análisis adicional. HopsAA se deposita ante la American Type Culture Collection (ATCC) del 20 de enero de 1998 y se le proporciona el número de acceso 209590. Una sola colonia de HOPsaA.7.3 recombinante (DE3,
F~ recA, hsdR) se hace crecer durante la noche (12-14 h) a 34°C en 25 mi de caldo Luria que contiene 0.8% de NaCI y 100 µg/ml de carbenicilina . Después, se mezclan 5 mi del cultivo en fase log temprana (~O.D. 600: 0.7) con 20 mi fresco del mismo caldo y se incuban con agitación vigorosa a 34°C durante 2-3 h. Después de la inducción de IPTG (0.4 mM) durante 4-5 h, las células inducidas se sedimentan por centrifugación @ 300 rpm/25 min, se resuspenden en tritón X114 2%/PBS 67 mM (7.5) y se permite que sedimenten durante la noche. Este proceso genera dos fracciones: una fase de detergente y una fase acuosa. Las proteínas de ambas fases 'se analizan por SDS-PAGE 12% se visualizan por tinción con plata. El análisis de transferencia Western también se realiza con anticuerpos contra PsaA para detectar rPsaA en estas fases. Estos experimentos indican que la fase de detergente contiene la mayor parte de los dos tipos de rPsaA con masas moleculares de 37 ka y 38 ka. No es raro que las proteínas lipidadas recombinantes aparezcan como un doblete en geles de SDS-PAGE. Ligeras variaciones en el grado de lipidación de estas proteínas recombinantes pueden resultar en diferencias más profundas en el peso molecular aparente observado en los geles de SDS-PAGE. Estas dos proteínas constituyen >50% de las proteínas totales presentes en la fase de detergente, como se muestra por la tinción con plata.
EJEMPLO 2. PURIFICACIÓN DE PsaA RECOMBINANTE
Para purificar cantidades suficientes de PsaA lipidado recombinante para uso en estudio de vacuna, se utiliza HOPsaA.7.3 recombinante estable para preparar 1,000 mi de cultivo con las siguientes modificaciones. Brevemente, se hace crecer una sola colonia recombinante durante la noche en 25 mi de caldo TerrificMR (GIBCO BRL) que contiene NaCl 0.8% y 100 µg/ml de carbenicilina . Se agregan 25 mi de cultivo de fase log temprana a 100 mi del mismo medio, y se continúa la incubación durante 8 h á 3 °C y después se induce con IPTG (0.4 mM) durante la noche (12-14 h) . Las células se cosechan y se resuspenden en 100 mi de tritón X-114 2% frío/amortiguador fosfato 67 M (pH 7.6). Después de la sonicación para llevar a cabo la lisis, las células Usadas se dividen durante la noche a 4°C. Posteriormente, el usado se aclara por centrifugación @ 10,000 rpm durante 25 min a 4°C y el sobrenadante transparente se incuba a 37°C durante 20-25 minutos para permitir que se produzca separación de fases. La fase de detergente se separa de la fase acuosa por centrifugación @ 2500 rpm durante 15 min a 25°C, y la solución viscosa (10-12 mi) se lava con 100 mi de PBS 67 mM frío (pH 7.6) tres veces. La fase altamente concentrada de tritón X-114MR (-8-10 mi) , la cual contiene PsaA recombinante, se resuspende en 100 mi de amortiguador de fosfato 10 mM frío (pH 6.5) y se dializa exhaustivamente contra el mismo amortiguador de fosfato 10 mM. La centrifugación del dializado @ 5000 rpm durante 20 min a 4°C proporciona una solución transparente y un sedimento visible. El sobrenadante transparente, muy enriquecido por PsaA recombinante, se diluye hasta -200 mi con amortiguador fosfato 10 mM (pH 6.5) y se carga directamente a un filtro de intercambio iónico D100 equilibrado con fosfato frío 10 mM (pH 6.5) que contiene tritón X-100 0.1% (velocidad de flujo 30-40 ml/h por gravedad) . Después de lavados extensivos del filtro con un total de 250 mi del mismo amortiguador de fosfato 10 mM (pH 6.5) /tritón X-100 0.1% (velocidad de flujo 50-60 ml/h) , el filtro después se eluye con 50 mi de amortiguador A (fosfato 100 mM/triton X100 0.1%, pH 6.5). Seguido por 50 mi de amortiguador B (fosfato 100 mM/triton X-100 0.1%/NaCI, 10 mM, pH 6.5). Se analizan fracciones de 10 mi de los eluatos resultantes por SDS-PAGE y se visualizan por tinción con nitrato de plata. El análisis de transferencia western también se realiza con anticuerpos contra PsaA para detectar PsaA recombinante. La fase de detergente contiene dos proteínas de PsaA recombinantes relacionadas estrechamente: (1) una fracción principal la cual co-migra con la proteína nativa de -37 kDa con las primeras tres fracciones de amortiguador A y (2) una proteína (-38 kDa) recombinante que migra lentamente eluida con las primeras dos fracciones del amortiguador B. Estas dos PsaA recombinantes constituyen >50% del total de las proteínas bacterianas las cuales se dividen en la fase de detergente, como se muestra por SDS-PAGE con tinción con nitrato de plata. Existen varias proteínas contaminantes menores de E. coli de peso molecular bajo que también se visualizan en todas las fracciones de tinción con nitrato de plata, y estas no se detectan por el análisis de transferencia Western. Utilizando el ensayo de Pierce BCA, se estima el contenido de proteína total de la fase de detergente en 10-12 mg/l de cultivo de E. coli ; la cantidad de PsaA recombinante purificada eluida con el amortiguador A es 700-750 µg/1 utilizando BSA como un estándar (Nota: concentración aproximada de la fase de detergente total de rPsaA es >2.5 mg/l de cultivo de E. coli ) .
EJEMPLO 3. INMUNOGENICIDAD DE PsaA LIPIDADA RECOMBINANTE
Se utiliza una fracción con alta concentración de sal de PsaA recombinante purificada (DP2) como inmunógeno a dos dosis con alumbre. Se administra a ratones Swiss Webster 5 µg de DP2 en el día 0 y se refuerza en el día 14 con la misma cantidad de rPsaA con alumbre. En el día 21, se sangra a los animales y se prueban los sueros para determinar anticuerpos contra PsaA por prueba de ELISA utilizando PsaA nativa purificada/rPsaA como la fase sólida. Todos los animales probados producen anticuerpos (título de =1.5 x 106) para PsaA. En otro experimento, se utiliza High Five y Sf9 que expresan PsaA recombinante como inmunógenos a dos niveles de dosis con y sin adyuvante (incompleto de Freund) . A ratones adultos Swiss Webster se les administran 20 µg ó 5 µg de PsaA purificado parcialmente en el día 0 y un refuerzo en el día 14 con la misma cantidad de PsaA sin adyuvante. En el día 21, se sangra a los animales y se realizan pruebas en el suero para determinar anticuerpo contra PsaA mediante ensayo de punteado (dot blot) utilizando células completas (serotipo 6B) purificado por PsaA nativa y recombinante, y también para los títulos de PsaA nativa. Todos los animales producen anticuerpos que dan reacción cruzada con las PsaA nativa y recombinante apropiada, con la excepción del anticuerpo para Sf9 que expresa PsaA, lo cual muestra reactividad cruzada limitada con PsaA expresada por H5. Los animales que no reciben adyuvante tienen un título de anticuerpo reducido (estudios para determinar el protocolo de iniciación más apropiado necesarios para realizarse) en comparación con aquéllos que reciben adyuvante. Se realiza un experimento de protección pasiva utilizando animales lactantes. Se administran 20 µl de suero control (sin inmunógeno) o de suero de animales inmunizados en 100 µl de PBS a ratones lactantes 24 horas antes de su exposición con el serotipo 6B (10xBD100) A la 24 horas posteriores a la exposición, 30% de los animales murieron en el grupo con protección Sf9. A las 48 horas posteriores a la exposición, 80% del grupo con suero control y 60% del grupo Sf9, así como 30% del grupo H5 murieron. En el día 10 posterior a la exposición, 100% del grupo Sf9 y el grupo control murieron, mientras que sólo 40% del grupo H5 habían muerto. También se investigó la capacidad de PsaA lipidada recombinante para conferir protección activa. Se inmunizaron ratones adultos y lactantes, con o' sin adyuvante (alumbre), utilizando PsaA recombinantes expresados ya sea por Sf9 o H5. A todos los ratones lactantes se les administró Sf9 que expresa el antígeno PsaA (con y sin alúmina) y murieron en las siguientes 24 horas posteriores a la inmunización (tal vez debido a toxicidad por tritón X-114), mientras que todos los adultos (inmunizados con Sf9 que expresa PsaA) sobrevivieron. Todos los animales fueron sometidos a refuerzo en el día 14 con inmunógeno únicamente. En el día 21, todos los animales se probaron para determinar la respuesta de anticuerpo mediante ensayo de punteado utilizando PsaA nativa y recombinante, todos resultaron ser positivos para el anticuerpo. En el mismo día, se expusieron con el tipo 6B de la cepa 700 ufe) . A las 24 y 48 horas posteriores a la exposición, todos los animales permanecían vivos. Un porcentaje de 80% de los animales control eran bacterémicos en el día 2, mientras que sólo 20% de los animales lactantes (inmunizados con H5-rPsaA) eran bacterémicos. Los datos de los adultos no son concluyentes .
LISTADO DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL
(i) Ades, Edwin W. Carlone, George M. De, Barun K. Huebner, Robert C. Sampson, Jacqueline S.
'(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína PsaA lipidada recombinante, métodos de preparación y uso
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Connaught Laboratories, Inc. (B) CALLE: Route 611, P.O. Box 187 (C) CIUDAD: Swiftwater (D) ESTADO: PA (E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 18370
(v) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B)" COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERANTE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25
(vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN:
(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Howe, Timothy R. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 39,228 (C). REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: TH-005
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 717-839-5027 (B) TELEFAX: 717-839-0619
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO:l
.i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1
GGGCATGCGC TAGCGGAAAA AAAGAT 26
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 2
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C). TIPO DE' HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2
GGGGATCCTT ATTTTGCCAA TCCTTC 26
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 921 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 3:
ATGAAAAAAT ATTTATTGGG AATAGGTCTA ATATTAGCCT TAATAGCATG CGCTAGCGGA 60
AAAAAAGATA CAACTTCTGG TCAAAAACTA AAAGTTGTTG CTACAAACTC AATCATCGCT 120
GATATTACTA AAAATATTGC TGGTGACAAA ATTGACCTTC ATAGTATCGT TCCGATTGGG 180
CAAGACCCAC ACGAATACGA ACCACTTCCT GAAGACGTTA AGAAAACTTC TGAGGCTGAT 240
TTGATTTTCT ATAACGGTAT CAACCTTGAA ACAGGTGGCA ATGCTTGGTT TACAAAATTG 300
GTAGAAAATG CCAAGAAAAC TGAAAACAAA GACTACTTCG CAGTCAGCGA CGGCGTTGAT 360
GTTATCTACC TTGAAGGTCA AAATGAAAAA GGAAAAGAAG ACCCACACGC TTGGCTTAAC 420
CTTGAAAACG GTATTATTTT TGCTAAAAAT ATCGCCAAAC AATTGAGCGC CAAAGACCCT 480
AACAATAAAG AATTCTATGA AAAAAATCTC AAAGAATATA CTGATAAGTT AGACAAACTT 540
GATAAAGAAA GTAAGGATAA ATTTAATAAG ATCCCTGCTG AAAAGAAACT CATTGTAACC 600
AGCGAAGGAG CATTCAAATA CTTCTCTAAA GCCTATGGTG TCCCAAGTGC CTACATCTGG 660
GAAATCAATA CTGAAGAAGA AGGAACTCCT GAACAAATCA AGACCTTGGT TGAAAAACTT 720
CGCCAAACAA AAGTTCCATC ACTCTTTGTA GAATCAAGTG TGGATGACCG TCCAATGAAA 780
ACTGTTTCTC AAGACACAAA CATCCCAATC TACGCACAAA TCTTTACTGA CTCTATCGCA 840
GAACAAGGTA AAGAAGGCGA CAGCTACTAC AGCATGATGA AATACAACCT TGACAAGATT 900 GCTGAAGGAT TGGCAAAATA A 921
1 2
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .
Claims (24)
1. Una molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal de una lipoproteína diferente de PsaA, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína PsaA madura, o un fragmento de la misma, en donde la secuencia de señal de la lipoproteína es contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico.
2. La molécula híbrida de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de señal es la secuencia de señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia .
3. La molécula híbrida de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se acoplan en una relación de marco de lectura abierta traduccional .
4. Un vector de expresión, caracterizado porque contiene la molécula híbrida de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, unida operativamente a un promotor para expresión de la proteína PsaA madura.
5. Un método para la preparación de proteína PsaA lipidada recombinante, método el cual está caracterizado porque comprende: introducir el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 4 en un organismo huésped; y llevar a cabo la expresión de la proteína PsaA madura a partir del organismo huésped.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el organismo huésped es E. coli .
1 . Un proceso para la producción de proteína PsaA lipidada recombinante, proceso el cual comprende: construir una molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal de una lipoproteína de Borrelia, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína PsaA madura, o un fragmento de la misma, en donde la secuencia de señal de la lipoproteína de Borrelia es contigua con la segunda secuencia de ácido nucleico; formar un vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico unida operativamente a un promotor para la expresión de la proteíha madura; introducir el vector de expresión en un organismo huésped; llevar a cabo la expresión de la proteína PsaA lipidada recombinante por el organismo huésped; lisar las células del organismo huésped; tratar las células usadas con un tensioactivo el cual solubiliza selectivamente la lipoproteína recombinante en preferencia a las proteínas bacterianas y otras proteínas y el cual es capaz de llevar a cabo la separación de fases de una fase de detergente bajo condiciones moderadas; llevar a cabo la separación de fases en una fase de detergente que contiene proteína PsaA lipidada recombinante solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas u otras proteínas y una fase sólida que contiene residuos celulares; separar y recuperar la fase de detergente de la fase sólida y de la fase acuosa; poner en contacto la fase de detergente - con una primera columna cromatográfica bajo condiciones las cuales resultan en la unión de proteína diferente a la proteína PsaA lipidada recombinante a la columna para proporcionar mediante flujo pasante que contiene proteína PsaA lipidada de la primera columna cromatográfica y recuperar el flujo pasante de la primera columna cromatográfica; poner en contacto el flujo pasante de la primera columna cromatográfica con una segunda columna cromatográfica bajo condiciones las cuales resultan en la unión de la proteína PsaA 'lipidada recombinante en preferencia a las proteínas contaminantes y lipopolisacáridos los cuales fluyen a través de la segunda columna cromatográfica; eluir la proteína PsaA lipidada recombinante de la segunda columna cromatográfica para proporcionar un eluyente sustancialmente libre de lipopolisacáridos y proteínas contaminantes; y recuperar el eluyente.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tensioactivo es MR TRITÓN X-114.
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el tratamiento de las células lisadas se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 10°C, la mezcla resultante se trata a temperatura moderadamente elevada de aproximadamente 35°C a aproximadamente 40°C para llevar a cabo la separación de la fase de detergente, y la fase de detergente se separa de la fase acuosa por centrifugación.
10. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la primera columna cromatográfica es una columna de intercambio iónico.
11. El proceso de ' conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la lisis de las células huéspedes se "lleva a cabo por congelamiento-recalentamiento.
12. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la lisis de las células huéspedes se lleva a cabo por sonicación.
13. Proteína PsaA lipidada, producida recombinantemente, aislada y purificada, caracterizada porque se produce por el proceso de conformidad con la reivindicación 7.
14. Proteína PsaA lipidada, producida recombinantemente, aislada y purificada, caracterizada porque tiene una pureza de por lo menos 80%' y está sustancialmente libre de proteínas contaminantes y lipopolisacáridos.
15. La proteína PsaA lipidada, producida recombinantemente, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína tiene una pureza de por lo menos 95%.
16. Una composición inmunológica, caracterizada porque comprende la proteína PsaA lipidada recombinante de conformidad con la reivindicación 15.
17. La composición inmunológica, de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
18. La composición inmunológica, de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el adyuvante es alumbre .
19. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un animal, el método está caracterizado porque comprende la etapa de administrar al animal la composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 16.
20. Un método para inmunizar a un huésped contra infección neumocócica, método el cual está caracterizado porque comprende administrar al huésped una cantidad inmunológicamente efectiva de PsaA lipidada, producida de manera recombinante.
21. El método de ' conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la administración se lleva a cabo" intranasalmente.
22. Una composición inmunogénica, para administración intranasal a un huésped susceptible de transportar neumococos, para inducir una respuesta inmunológica protectora contra la colonización con Streptococcus pneumoniae en la nasofarínge, daracterizada porque comprende una cantidad inmunizante de PsaA lipidada recombinante o un fragmento inmunogénico de la misma.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante es alumbre.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/017,782 | 1998-02-03 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA00007261A true MXPA00007261A (es) | 2002-07-25 |
Family
ID=
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