FI118591B - Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö - Google Patents

Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI118591B
FI118591B FI974423A FI974423A FI118591B FI 118591 B FI118591 B FI 118591B FI 974423 A FI974423 A FI 974423A FI 974423 A FI974423 A FI 974423A FI 118591 B FI118591 B FI 118591B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
antigen
lipoprotein
vaccine
use according
protein
Prior art date
Application number
FI974423A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI974423A0 (fi
FI974423A (fi
Inventor
Robert C Huebner
Bruno Guy
Robert S Becker
Maryann B Gray
Karen S Biscardi
Lorne F Erdile
Original Assignee
Connaught Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Connaught Lab filed Critical Connaught Lab
Publication of FI974423A0 publication Critical patent/FI974423A0/fi
Publication of FI974423A publication Critical patent/FI974423A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118591B publication Critical patent/FI118591B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/828—Bacterial vaccine for canidae or mustelidae, e.g. dogs, foxes, minks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1 118591
Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö Immunologiska kombinationssammansättningar och användning av dessa 5
Viittaus asiaan liittyviin patenttihakemuksiin Tämä hakemus on 7. kesäkuuta 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 08/476 656, osittainen jatkohakemus.
10
Ohessa viitataan, erityisesti yhdistelmä-DNA-teknisten Borrelia-pTOteimim suhteen, kulloinkin patenttihakemuksiin, joilla on seuraavat sarjanumerot: 07/973 338, jätetty 29. lokakuuta 1992; 07/373 455 (USSN 07/973 338:n sääntö 62 FWC), jätetty 17.
tammikuuta 1995; 07/888 765, jätetty 27. tammikuuta 1992; 08/211 891, jätetty 16.
15 lokakuuta 1992 (patentin PCT/US92/08697 kansallinen vaihe); sekä 07/779 048, jätetty 18. lokakuuta 1991. Ohessa viitataan, erityisesti pneumokokkiproteiinien ra- kennegeenien, näiden proteiinien epitooppialueiden sekä pneumokokkiproteiinien antamisen suhteen, kulloinkin patenttihakemuksiin, joilla on seuraavat sarjanumerot: : ’.· 656 773, jätetty 15. helmikuuta 1991; 835 698, jätetty 12. helmikuuta 1992; 072 065, • ♦ 20 jätetty 3. kesäkuuta 1993; 072 068, jätetty 3. kesäkuuta 1993; 214222, jätetty 17. ···: maaliskuuta 1994; 214 164, jätetty 17. maaliskuuta 1994; 247 491, jätetty 23. touko- kuuta 1994; 048 896, jätetty 20. huhtikuuta 1993; 246 636, jätetty 20. toukokuuta • · · *’ 1994; 08/458 399 (7. lokakuuta 1994jätetyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero « « « *** * on 246 636, osittainen jatkohakemus), jätetty 2. kesäkuuta 1995; 08/446 201, jätetty 25 19. toukokuuta 1995; 08/312 949, jätetty 30. syyskuuta 1994. Lipoproteiinien ilmen- • ♦ • ·· *... tämisen suhteen viitataan 7. kesäkuuta 1995 jätettyyn hakemukseen, jonka satjanu- • · • * T mero on 08/475 781. Edelleen, sellaisten koostumusten ja menetelmien, joiden avul- • · · • · · *·* la Borrelia burgdorferi-antigeenejä voidaan antaa limakalvon kautta, esimerkiksi * · ’·;·* suun kautta immunologisen vasteen stimuloimiseksi, suhteen viitataan Barbourin et 30 ai. patenttihakemukseen, jonka sarjanumero on 08/588 637, ja joka on jätetty saman- («« •.,. · aikaisesti oheisen hakemuksen kanssa (asiamiehen viitenumero 454312-2420).
2 118591
Kukin edellä mainittu hakemus sisällytetään oheen tällä viittauksella. Seuraavassa tekstissä on siteerattu lukuisia asiakirjoja, ja samoin kukin niistä sisällytetään oheen niihin viittaamalla.
5 Keksinnön ala
Esillä olevan keksinnön kohteena on vähintään yhtä antigeeniä käsittävän ensimmäisen koostumuksen ja antigeenistä lipoproteiinia käsittävän toisen koostumuksen käyttö immunologisen vasteen indusointiin isännässä, joka voi olla eläin tai ihminen, 10 tarkoitetun lääkkeen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa. Lisäksi keksinnön kohteena ovat rokotteet ja immunogeeniset koostumukset, joille on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 25 tunnusmerkkiosassa.
15 Keksinnön koskee edelleen sellaisia koostumuksia ja menetelmiä, joissa koostumus käsittää antigeeniä sekä apuaineeseen adsorboitua lipoproteiinia. Edullisemmin, tämä lipoproteiini on samoin antigeeninen tai immunogeeninen ja näin ollen koostumus voi olla yhdistelmäkoostumus, moniarvoinen koostumus tai seoskoostumus.
·· · : *.· Näin ollen keksintö koskee myös vähintään yhden antigeenin ja vähintään yhden • * m · · *. *: 20 lipoproteiinin samanaikaista antamista koostumuksessa, joka voi sisältää muitakin ···! aineosia kuten apuainetta.
···· ♦ · • * ;##|* Lipoproteiini voi olla luonnossa esiintyvä lipoproteiini tai yhdistelmä-DNA-tekninen • · · * * lipoproteiini. Yhdistelmä-DNA-tekninen lipoproteiini on voitu saada ilmentämällä 25 vektorin avulla lipoproteiinin lipidoitunutta osaa ja proteiiniosaa ajatellen homo- « · • ♦· *... logisia sekvenssejä eli tässä tapauksessa lipidoitumiseen johtava sekvenssi ja prote- • · 7 iinisekvenssi voivat esiintyä luonnossa yhdessä. Tällaisessa yhdistelmä-DNA- ·«♦ • ♦ · *·* ‘ teknisessä lipoproteiinissa lipoproteiinin lipidoituminen voi olla peräisin ensimmäi- • · ’♦··* sen nukleiinihapposekvenssin ilmentymisestä ja sen proteiini voi olla peräisin toisen 30 nukleiinihapposekvenssin ilmentymisestä, jotka ensimmäinen ja toinen nukkiini- ·*· happosekvenssi eivät esiinny luonnossa yhdessä, ja tällaiset sekvenssit voivat ilmen- 3 118591 tyä yhtenäiseksi lipoproteiiniksi. Näin ollen keksinnön kohteena ovat koostumukset, jotka liittyvät lipoproteiinien, yhdistelmä-DNA-tekniset lipoproteiinit mukaan lukien, antamiseen; ja nämä yhdistelmä-DNA-tekniset lipoproteiinit voivat olla luonnollisten proteiinien kaltaisia tai uusia hybridiproteiineja.
5
Esillä oleva keksintö koskee edelleen edellä mainittuja koostumuksia immunologisen vasteen tuottamiseksi, jolloin lipoproteiini on yhdistelmä-DNA-teknisesti ilmennetty, mainitun ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin ja toisen nukleiinihappo-sekvenssin ilmentymisestä peräisin oleva lipoproteiini, joka ensimmäinen nukleiini-10 happosekvenssi koodaa Äorre/ia-lipoproteiinin johtosekvenssiä; tämän yhdistelmä-DNA-teknisen lipidoituneen proteiinin ollessa edullisesti sellainen, että se on ilmennetty käyttäen OspA-johtosekvenssiä koodaavaa nukleiinihapposekvenssiä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa lipoproteiini voi olla OspA; ja näin ollen keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA-teknistä OspA:ta sekä sen käyttöä näissä koostu-15 muksissa.
Tässä hakemuksessa on siteerattu lukuisia julkaisuja. Nämä viitteet on kuvattu täydellisesti tämän kuvauksen lopussa välittömästi ennen patenttivaatimuksia tai julkai- • · · • *.· sun mainitsemisen yhteydessä.
• · • · » _ _ ·. ·: 20 * .. ·: Keksinnön tausta • · · * · · · ·· • · : ” Immunogeenisyyttä voidaan parantaa merkittävästi, jos antigeeniä annetaan yhdessä • # * ’ *' * apuaineen kanssa, jota apuainetta käytetään tavallisesti 0,001 -50-prosenttisena liuok- 25 sena fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Apuaineet parantavat antigee- • · • * · *... mn immunogeenisyyttä, mutta ne eivät ole välttämättä itse immunogeenisiä. Apuai- • · • · "* neet voivat vaikuttaa pitämällä antigeenin paikallisesti antamiskohdan läheisyydessä ··· • · · '·* * varantovaikutuksen tuottaen, mikä helpottaa antigeenin hidasta, pitkittynyttä vapau- ·** · *···* tumista immuunijäijestelmän soluihin. Apuaineet saattavat myös vetää im- 30 muunij äij estelmän soluja antigeenivarantoa kohden ja stimuloida näitä soluja tuotta-:...· maan immuunivasteita.
4 118591
Immuunijärjestelmää stimuloivia aineita eli apuaineita on käytetty useiden vuosien ajan parantamaan isännässä esimerkiksi rokotteiden tuottamaa immuunivastetta. Sisäiset apuaineet kuten esimerkiksi lipopolysakkaridit ovat normaalisti rokotteina käytettyjen tapettujen tai vaimennettujen bakteereiden komponentteja. Ulkoiset apu-5 aineet ovat immuunijäijestelmää muokkaavia aineita, jotka ovat tyypillisesti liittyneet antigeeneihin muulla tavalla kuin kovalenttisesti, ja joita on lisätty valmisteisiin isännän immuunivasteen parantamiseksi. Alumiinihydroksidia ja alumiinifosfaattia (joihin viitataan tavallisesti yhteisellä käsitteellä aluna) käytetään rutiininomaisesti apuaineina ihmis- ja eläinrokotteissa. Alunan kyky parantaa kurkkumätä- ja jäykkä-10 kouristustoksoidien tuottamaa vasta-ainevastetta tunnetaan hyvin, ja jokin aika sitten HBsAg-rokotteessa on alettu käyttää apuaineena alunaa.
Laaja joukko ulkoisia apuaineita voi saada aikaan voimakkaita immuunivasteita antigeeneille. Näitä ovat saponiinit, jotka on kompleksoitu kalvoproteiiniantigeeneihin 15 (immuunijärjestelmää stimuloivat kompleksit), pluroniset polymeerit yhdessä mineraaliöljyn kanssa, tapetut mykobakteerit mineraaliöljyssä, Freund:in täydellinen apuaine, bakteeriperäiset tuotteet kuten muramyylidipeptidi (MDP), lipopolysakkaridi (LPS) ja lipidi A, sekä liposomit. Sekä humoraalisen immuunivasteen (HIR) että so- · » luvälitteisen immuniteetin (CMI) tehokkaaksi indusoimiseksi immunogeenit emul- • · • * · '· " 20 goidaan edullisesti apuaineisiin.
• m ···· • · · *; * * Ihanteellisten apuaineiden toivottavia ominaisuuksia ovat jotkin tai kaikki seuraavis- • · • ·· * ta: • · · * (1) myrkyllisyyden puuttuminen; .. 25 (2) kyky stimuloida pitkäkestoinen immuunivaste;
• M
\.. (3) valmistuksen yksinkertaisuus ja stabiilisuus pitkiä aikoja varastoitaessa; e · (4) kyky tuottaa sekä CMI että HIR eri tavoin annetuille antigeeneille; • · · ';] * (5) synergia muiden apuaineiden kanssa; • · (6) kyky vuorovaikuttaa selektiivisesti antigeenin paljastavien solujen (antigen pre-30 senting cell; APC) populaatioiden kanssa; • · « · ··« 5 118591 (7) kyky tuottaa spesifisesti asianmukainen TrI- tai TH2-soluspesifinen immuunivaste; sekä (8) kyky nostaa selektiivisesti asianmukaisten vasta-aineisotyyppien (esimerkkinä IgA) pitoisuuksia antigeenejä vastaan.
5
Nimellä Lockhoff et ai. 8. elokuuta 1989 myönnettyä US-patenttia nro 4 855 283 vastaavassa julkaisussa, joka sisällytetään oheen siihen viittaamalla, esitetään, että glykolipidianalogit, mukaan lukien N-glykosyyliamidit, N-glykosyyliureat sekä N-glykosyylikarbamaatit, joista jokaisen sokerijäännöksessä on substituenttina amino-10 happo, toimivat immuunij äijestelmää muokkaavina aineina eli apuaineina. Näin ollen Lockhoff et ai. (US-patenttijulkaisu nro 4 855 283) ovat esittäneet, että sellaiset N-glykolipidianalogit, jotka ovat rakenteellisesti samankaltaisia luonnossa esiintyvien glykolipidien kanssa, esimerkkeinä glykosfingolipidit ja glykoglyserolipidit, kykenevät tuottamaan voimakkaan immuunivasteen sekä herpes simplex-15 virusrokotteessa että valevesikauhuvirusrokotteessa. Eräitä glykolipidejä on syntetisoitu pitkäketjuisista alkyyliamiineista ja rasvahapoista, jotka ovat liittyneet suoraan sokeriin anomeerisen hiiliatomin välityksellä, luonnossa esiintyvien lipidij äännösten toimintoj en j äljittelemiseksi.
·· * • · · • · • · • » » I · • · " 20 Nimellä Moloney myönnetyssä, yhtiölle Connaught Laboratories Limited siirretyssä ·» • · · • · · j US-patenttijulkaisussa nro 4 258 029, joka sisällytetään oheen siihen viittaamalla, on • · · esitetty, että oktadekyylityrosiinihydrokloridi (OTH) toimii apuaineena, kun se on • · 'ii(" kompleksoitu kurkkumätätoksoidiin sekä formaliinilla inaktivoituihin, tyyppiä I, II ja ♦ · · * m oleviin poliomyeliittiviruksiin perustuvaan rokotteeseen. Aromaattisten amino- „ 25 happojen oktodekyyliesterit, jotka on kompleksoitu yhdistelmä-DNA-tekniseen he- • *»· patitis B pinta-antigeeniin, paransivat isännän immuunivasteita hepatitis B-virusta *·* vastaan.
··· • · · • · · ··· · ’·;·* Artikkelin Bessler et ai, "Synthetic lipopeptides as novel adjuvants", teoksessa 44th 30 Forum In Immunology (1992), sivulta 548 alkaen, erityisesti sivuilla 548 - 590, ja • «t joka artikkeh sisällytetään oheen tällä viittauksella, kohteena on lipopeptidien käyttö , 118591 o apuaineina yhdessä antigeenin kanssa annettaessa. Näissä lipopeptideissä oli tyypillisesti P3C lipidoituneena osaria ja korkeintaan vain 5 aminohappoa, esimerkkeinä P3C-SG, P3C-SK4, P3C-SS, P3C-SSNA, P3C-SSNA. Tämä lipopeptidi oli kytketty tai lisätty vain tiettyihin antigeeneihin tai ei-immunogeenisiin proteiineihin, esimerk-5 keinä S. typhimurium-rokotetta täydentävä P3C-SSNA, suu- ja sorkkataudin VPl(135-154):hen kytketty P3C-SS, ei-immunogeeniseen hirudiiniproteiiniin kytketty P3C-SG-OSu, FITC:hen tai DNP:hen kytketty P3C-SK tai Streptomyces vene-zuelaesta peräisin olevaan metaboliittiin kytketty p3C-SG. Vaikka Besslerin esittämiä menettelytapoja apuaineen sekoittamiseksi ja konjugoimiseksi voidaankin käyt-10 tää esillä olevaa keksintöä toteutettaessa, niin Bessler ei ole kuitenkaan esittänyt eikä ehdottanut lipoproteiinin käyttöä vähintään yhden antigeenin kanssa koostumuksessa, erityisesti sellaisissa koostumuksissa, joissa myös lipoproteiini on antigeeninen, tai tämän keksinnön mukaisissa immunologisissa yhdistelmäkoostumuksissa ja menetelmissä.
15 Tähän liittyen, peptidin, erityisesti korkeintaan vain noin 5 aminohappoa käsittävän peptidin ja proteiinin välillä tehdään ero, samoin kuin ero tehdään mm. antigeenisen lipoproteiinin sekä ei-antigeenisen lipoproteiinin välillä. Peptidit eroavat immunolo- ·· · i ·' gisesti proteiineista siinä suhteessa, että suuri histokompatibiliteettikompleksi • · • · 1 *· “ 20 (MHC) voi paljastaa lyhyet peptidit suoraan, kun taas proteiineja on käsiteltävä en- ··· *··| nen niiden paljastamista T-soluille. Peptidi eroaa edelleen proteiinista siinä suhtees- ··1 ·;1· sa, että proteiini on riittävän suuri kyetäkseen muodostamaan toiminnallisia do- • · ‘1 meeneja (eli sillä on tertiäärirakenne), kun taas peptidi ei kykene tähän.
# « i • · · 25 Nardelli et ah [Vaccine (1994), 12(14): 1335 - 1339] on kytkenyt neliarvoisen mo- f ·· |... ninkertaisen, gp 120-sekvenssin sisältävän antigeenipeptidin lipidiryhmään ja antanut • · tuloksena olevaa synteettistä lipopeptidiä suun kautta hiirille. Todettiin, että sekä • « « * 11, 1 limakalvon IgA-vaste että systeeminen plasman IgG stimuloitu!vat j a soluvälitteinen « · * · 1 ’ immuniteetti kehittyi, mikä todettiin lymfokiinituotannosta j a spesifisen sytotoksisen \i.: 30 vasteen syntymisestä. Tässä käytettiin vain lyhyttä peptidiä, ei kokonaista lipoprote- ··· ·.. 1 iinia, eikä mainitussa julkaisussa esitetä tai ehdoteta millään tavalla sitä, että synteet- 7 118591 tistä lipopeptidiä voitaisiin käyttää apuaineina muiden proteiinien tauksessa. Itse asiassa tässä viitteessä johdatellaan pois lipoproteiinien, jotka ovat liukoisempia kuin lipopeptidit, käytöstä immunogeeneina; katso esim. sivu 1338, viimeinen rivi ("liukoiset proteiinit eivät ole immunogeeneja suun kautta annettuina").
5
Julkaisussa Croft et ai. [J. Immunol. (1991), 146(5): 793 - 796] E. coli:sta eristetyt yhdentyvät kalvoproteiinit (integral membrane proteins; imp) on kytketty kovalentti-sesti erilaisiin antigeeneihin, jolloin on saatu parantuneet immuunivasteet hiiriin ja kaneihin lihaksen sisäisesti injektoitaessa. Lipoproteiinin ja antigeenin kovalentti-10 seen kytkemiseen liittyy kuitenkin haittoja. Tärkeät epitoopit voivat vahingoittua ja kytkemismenettelyn hallitseminen on vaikeata ja siinä on usein käytettävä myrkyllisiä silloittavia aineita. Näin ollen olisi edullista saada aikaan sellainen menetelmä parannetun immunologisen vasteen indusoimiseksi, jossa menetelmässä antigeeniä ei tarvitse silloittaa proteiiniin. Lisäksi, kun antigeeniä CSP-OVA vain sekoitettu 15 eikä siis kytketty kovalenttisesti lipoproteiiniin TraT, niin tällöin saavutettiin vain vasta-ainevasteen pieni voimistuminen. Näin ollen Croft et ai. ovat vetäneet sen johtopäätöksen, ettei lipidi ole välttämätön apuainevaikutukselle, mikä on ristiriidassa esillä olevien keksijöiden tekemien yllättävien havaintojen kanssa.
• ·*· * · • · • · t · i ’· I* 20 US-patenttijulkaisun nro 4 439 425 kohteena ovat 2-10 aminohappoa käsittävät ·♦· **; lipopeptidit sekä niiden ennalta ehkäisevä antaminen suun tai peräsuolen kautta.
··· ·*·· *« • · • ··
Bessler et ai. ["Synthetic Lipopeptide Conjugates Constitute Efficient Novel hnmu- • · · nogens and Adjuvants in Parenteral and Oral Immunization" ("synteettiset lipopepti-;·. 25 dikonjugaatit ovat tehokkaita uusia immunogeeneja ja apuaineita ruuansulatuskana-
• M
,···, van ulkopuolisessa ja suun kautta tapahtuvassa immunisoinnissa) (Tiivistelmä), • Φ • · ·
Meeting on Molecular Approaches to the Control of Infectious Diseases, (syyskuu • · · I,. 13 - 17, 1995), Cold Spring Harbor Laboratory, (ei tunnettua tekniikkaa ajatellen pa- • · ”* tenttihakemusta USSN 08/476 656, joka on jätetty 7. kesäkuuta 1995)] on käsitellyt *.:·* 30 kuusi aminohappoa käsittävien, antigeeneihin kovalenttisesti kytkettyjen lipopepti- ··· • · • t ··« g 118591 dien antamista suun kautta. Näiden lipopeptidien ja antigeenien välisten konjugaatti-en todettiin indusoivan hapteenispesifisen immuunivasteen.
Schlecht et ai. [Zbl. Bakt. (1989)271:493-500] on käsitellyt Salmonella typhi-5 murium-rokotteita, joita on täydennetty synteettisesti valmistetuilla, viisi aminohappoa käsittävillä bakteerilipoproteiinin johdannaisilla. Näitä rokotteita annettiin kahtena vatsaontelon sisäisenä injektiona ja altistaminen tapahtui vatsaontelon sisäisesti määrätyn suuruisilla S. typhimurium-amoksilla. Kun täydennettyjen rokotteiden suojaavaa kykyä verrattiin täydentämättömiin rokotteisiin, niin todettiin, että 90 % S. 10 typhimurium-τοkotteesta voitiin korvata lipopeptidillä ilman suojaavan vaikutuksen havaittavaa heikkenemistä.
Olennainen määrä työtä on kohdistettu Lymen sairautta torjuvan rokotteen kehittämiseen. Kahta erilaista lähestymistapaa on käytetty rokotteen kehittämiseksi. Eräänä 15 lähestymistapana on käyttää rokotetta, joka koostuu kokonaisista inaktivoiduista spirokeeteista, kuten Johnson on kuvannut US-patenttijulkaisussa nro 4 721 617. Tämän kokonaisen inaktivoidun rokotteen on osoitettu suojaavan hamstereita altistusta vastaan, ja sille on myönnetty käyttölupa koirissa käyttöä varten.
·· 9 • 99 9 9 9 · • · * · · *· '· 20 Kokosoluvalmisteissa läsnä oleviin ristireaktiivisiin antigeeneihin kohdistuvista 9 99 9 epäilyistä johtuen ihmisrokotteen tutkimus keskittyy B. burgdorferm ilmentämien, *·« ···· ei-ristireaktiivisten suojaavien antigeenien tunnistamiseen ja kehittämiseen. Useita I i potentiaalisia antigeenejä on jo tunnistettu. Paljon työtä on kohdistettu B, burgdor- 9 9 9 9 9 9 * ferissa runsaimmin esiintyvään ulkopintaproteiiniin eli A-ulkopintaproteiiniin (outer .. 25 surface protein A; OspA), kuten on kuvattu julkaistussa PCT-patenttihakemuksessa • ·· WO 92/14488, joka on siirretty oheisen hakemuksen hakijalle. Tämän proteiinin • · T useiden muunnosten on osoitettu indusoivan suojaavan immuniteetin hiiren, hams- • I « • · * 4 * terin j a koiran altistustutkimuksissa. Ihmisissä toteutetut kliiniset kokeet ovat osoit- • f **·’ taneet, että OspA-valmisteet ovat turvallisia ja immunogeenisia ihmisissä [Keller et 9 30 ai., JAMA (1994) 271: 1764 - 1768]. Eräs valmiste, joka sisältää yhdistelmä-DNA-*...: teknistä lipidoitua OspA:ta edellä mainitussa patenttijulkaisussa WO 92/14488 ku- 9 118591 vatulla tavalla, läpikäy todellakin parhaillaan ΙΠ-vaiheen turvallisuus/tehokkuusko-keita ihmisessä.
Suurin osa Pohjois-Amerikasta peräisin olevan B. burgdorferin kliinisistä eristeistä 5 ilmentää OspA:ta, kun taas erilainen kuva on saatu tarkastelemalla Euroopasta peräisin olevia kliinisiä Borrelia-tristeitä. Euroopassa Lyme-sairautta aiheuttaa kolme Äorre/ia-genotyyppiä, jotka ovat B. burgdorferi, B, garinii sekä B. afzelli. Suurin piirtein puolessa eurooppalaisista eristeistä OspA ei ole runsaimmin esiintyvä ulko-pintaproteiini. Toinen C-ulkopintaproteiini (OspC) on näissä spirokeeteissa esiintyvä 10 huomattavin pinta-antigeeni. Itse asiassa alalla on tunnistettu lukuisia eurooppalaisia kliinisiä eristeitä, jotka eivät ilmennä OspA:ta. Gerbiilien ja hiirten immunisointi puhdistetulla yhdistelmä-DNA-teknisellä OspC:lla tuottaa suojaavan immuniteetin sellaisia B. burgdorferi-kantoja vastaan, jotka kannat ilmentävät homologista OspC-proteiinia [V. Preac-Mursic et ai, Infection (1992) 20: 342 - 349; W.S. Probert et 15 ai., Infection and Immunity (1994) 62: 1920 - 1926]. Tällä hetkellä OspC-proteiinia pidetään mahdollisena komponenttina toisen sukupolven Lyme-rokotevalmisteessa.
Yhdistelmä-DNA-tekniset proteiinit ovat rokotteen tai immunogeenisen koostumuk- ·· · : sen lupaavia kandidaatteja, koska niitä voidaan tuottaa suurena saantona ja hyvin • · t · ♦ *· *· 20 puhtaina ja niitä voidaan muokata toivottujen vaikutusten maksimoimiseksi ja epä- ··« ··» toivottujen vaikutusten minimoimiseksi. Koska ne voivat kuitenkin olla huonosti ··· **** immunogeenisia, niin menetelmät yhdistelmä-DNA-teknisten proteiinien tuottaman • » !t<" immuunivasteen tehostamiseksi ovat tärkeitä kehitettäessä rokotteita tai im- • · · * munogeenisia koostumuksia. Edelleen erittäin toivottavaa olisi, että tällaisia prote- .. 25 iineja voitaisiin antaa yhdessä muiden antigeenien kanssa.
• *·· • · • · ‘Γ Hyvin lupaava immunostimuloija on lipidiryhmä N-palmitoyyli-S-(2RS)-2,3-bis- • · « (palmitoyylioksi)propyylikysteiini, josta käytetään lyhennettä Pau^Cys. Tämä ryh- • · ' * * ·' mä esiintyy bakteerilipoproteiinien aminopäätteessä, j oihin lipoproteiineihin synteti- i.:. · 30 soitunut signaalisekvenssi määrittää lipidin kiinnittymisen j a pilkkoutumisen signaa- ··· lipeptidaasin Π vaikutuksesta. Sellaiset synteettiset peptidit, jotka eivät itsessään ole 10
It 8591 immunogeenisia, indusoivat voimakkaan vasta-ainevasteen, kun ne on kytketty ko-valenttisesti PamsCys-ryhmään [Bessler et ai., (1992)].
Usein vasta-ainevasteen lisäksi on välttämätöntä indusoida soluimmuunivaste, erityi-5 sesti sytotoksisia T-lymfosyytteja (CTL-soluja). PamjCys-ryhmään kytketyt synteettiset peptidit ovat äärimmäisen voimakkaita CTL-solujen indusoijia, mutta alalla ei ole vielä esitetty CTL-solujen indusoitumista suurten yhdistelmä-DNA-teknisten lipoproteiinien vaikutuksesta.
10 Nukleiinihapposekvenssi ja siihen koodautunut OspA.n aminohapposekvenssi tunnetaan useiden kliinisten B. burgdorferi-eristeiden tapauksessa ja ne on kuvattu esimerkiksi julkaistussa PCT-patenttihakemuksessa WO 90/04411 (Symbicom AB) B. burgdorferi B31-kannalle, sekä julkaisussa Johnson et ah, Infect Immun. 60: 1845-1853, kolmen, erilaista maantieteellistä alkuperää oleva B. burgdorferi-eristeen eli 15 eristeiden B31, ACA1 ja Ip90 asp^-operonien vertaamiseksi.
Kuten patenttijulkaisussa WO 90/04411 on kuvattu, B31-kannan tapauksessa DNA-sekvenssin analyysi osoittaa, että OspA on koodautunut 819 nukleotidista koostu- ·· * • · · • · * vaan avoimeen lukukehykseen, joka alkaa DNA-sekvenssin asemasta 1S1 ja päättyy • · • # · '· " 20 tämän DNA-sekvenssin asemaan 970 (katso julkaisussa oleva kuvio 1). OspA:n en- **« ***| simmäiset 16 aminohappojäännöstä muodostavat OspA:n hydrofobisen signaalise- *«· kvenssin. Täysipituisen B. burgdorferi -geenin ensisijainen luentatuote sisältää hyd- • · i *... rofobisen N-päätteen signaalisekvenssin, joka toimii substraattina diasyyliglyserolin * · · • · · kiinnittymisessä viereisen kysteiinijäännöksen sulfhydryylisivuketjuun. Tämän kiin- .. 25 nittymisen jälkeen tapahtuu pilkkoutuminen signaalipeptidaasi Π:η vaikutuksesta i *·· |(»( sekä kolmannen rasvahapon kiinnittyminen N-päätteeseen. Tästä täydellisestä lipidi- ryhmästä käytetään nimitystä PanuCys. Alalla on osoitettu, että OspA:n lipidoitumi- ♦ · ♦ *·]/ nen on välttämätöntä immunogeenisyydelle, koska N-päätteessä Pam3Cys-ryhmän • · *** käsittävä OspA-lipoproteiini tuotti voimakkaan vasta-ainevasteen, kun taas sellainen 30 OspA, josta kiinnittynyt lipidi puuttui, ei indusoinut lainkaan havaittavia vasta- ··· aineita [Erdile et ai, Infect. Immun., (1993), 61:81 — 90].
118591 π
Julkaistussa kansainvälisessä patenttihakemuksessa W0 91/09870 (Mikrogen Mole-kularbiologische Entwicklungs-GmbH) on kuvattu B. burgdorferi Pko-kannan ospC-geenin DNA-sekvenssi sekä tähän geeniin koodautunut OspC-proteiini (josta käytetään tässä viitteessä nimitystä pC), jonka molekyylipaino on 22 kDa. Tämä sekvenssi 5 paljastaa, että OspC on lipoproteiini, jonka käyttämä signaalisekvenssi on samankaltainen kuin OspA:ssa. Näiden OspA:han liittyvien havaintojen perusteella on odotettavaa, että yhdistelmä-DNA-teknisen OspC:n lipidointi on käyttökelpoinen tapa sen immunogeenisyyden parantamiseksi; mutta kuten edellä mainitussa julkaisussa USSN 08/475 781 on esitetty, hakijoiden oli vaikea päästä yhdistelmä-DNA-tek-10 nisen OspC:n ilmaistavaan ilmentymiseen. Yhdistelmä-DNA-teknisen OspCrn im-munogeenisyyden tehostaminen olisi hyödyllistä. Lisäksi edullista olisi, jos käytettävissä olisi moniarvoinen Lymen sairautta torjuva immunologinen koostumus, joka sisältäisi antigeenejä sekä pohjoisamerikkalaisia että eurooppalaisia Borrelia-eristeitä vastaan.
15
Streptococcus pneumoniae aiheuttaa maailmanlaajuisesti enemmän kohtalokkaita infektioita kuin lähes mikään muu patogeeni. Yhdysvalloissa S. pneumoniae aiheuttaa jokseenkin yhtä paljon kuolemantapauksia kuin immuunikato (AIDS). Yhdysval- J .* loissa useimmat kohtalokkaat pneumokokki-infektiot esiintyvät yli 65-vuotiaissa • · • · · *· *i 20 henkilöissä, joissa S. pneumoniae on ihmisestä toiseen tarttuvan keuhkotulehtuksen ··· • · ·: yleisin aiheuttaja. Kehittyneessä maailmassa useimmat pneumokokkikuolemat esiin-*!· ”·· tyvät iäkkäiden tai immuunivajauksesta kärsivien potilaiden, sirppisolusairaudesta kärsivät potilaat mukaan lukien, keskuudessa. Heikommin kehittyneillä alueilla maa- • · · • · m • ilmassa pneumokokki-infektio on eräs huomattavin syy alle 5-vuotiaiden lasten kuo- .. 25 lemaan. Koska pneumokokkien keskuudessa esiintyy yhä enemmän vastustuskykyä • **· lukuisille antibiooteille ja koska lääkehoito on liian kallista köyhissä maissa, niin • · y tämänhetkiset lähestymistavat pneumokokkisairauden torumiseksi ovat ongelmalli- • « · • · · • siä.
«M
* f
* I
• M • :.iV 30 Ihmisiä infektoivien pneumokokkien lähdevarasto säilyy pääasiassa siksi, että ole- ***** * ·.. * massa on ihmisiä, jotka kantavat pneumokokkia nenä-nielualueessaan. Pneumokokki 118591 12 siirtyy ihmiseen ensin aerosolien tai suoran kosketuksen välityksellä. Pneumokokki kolonisoituu ensin ylempiin ilmatiehyisiin ja se voi säilyä nenän limakalvolla viikkoja tai kuukausia. Jopa 50 prosentissa tai suuremmassa osuudessa nuoria lapsia tai iäkkäitä henkilöitä esiintyy kolonisoituneita pneumokokkeja. Useimmissa ta-5 pauksissa tämä kolonisoituminen ei aiheuta minkäänlaista näkyvää infektiota. Kuitenkin joissakin yksilöissä tämä organismi, jota yksilö kantaa nenä-nielu-alueessaan, voi aiheuttaa oireellista sivuontelotulehdusta tai välikorvainfektioita. Mikäli pneumokokkeja joutuu sisäänhengitettäessä keuhkoihin, erityisesti ruokahiukkasten tai liman kanssa, niin ne voivat aiheuttaa keuhkotulehduksen. Näissä kohdissa esiinty-10 vistä infektioista siirtyy yleensä joitakin pneumokokkeja vereen, jossa ne voivat joh taa verenmyrkytykseen (sepsis), erityisesti jos niitä erittyy jatkuvasti suuria määriä alkuperäisestä infektiokohdasta. Veressä olevat pneumokokit saattavat joutua aivoihin, joissa ne voivat aiheuttaa aivokalvontulehduksen (meningitis). Vaikka pneumokokin aiheuttama aivokalvontulehdus ei olekaan yhtä tavallinen kuin muut tämän 15 bakteerin aiheuttamat infektiot, niin se on kuitenkin sitäkin tuhoisampi; noin 10 % potilaista kuolee ja yli 50 %:ssa eloonjääneistä esiintyy elinikäisiä neurologisia jälkitiloja.
»« · * · · : ·* Iäkkäämmissä aikuisissa tämänhetkinen 23-arvoinen, kapselipolysakkaridiin perus-
• · S
*· ’·' 20 tuva rokote tehoaa noin 60-prosenttisesti sellaisten kantojen aiheuttamaa tunkeutu- «·· "'j vaa pneumokokkisairautta vastaan, joiden kantojen kapseli on rokotteeseen sisälly- ·*· "** tettyä tyyppiä. Tämä 23-arvoinen rokote ei ole tehokas alle 2-vuotiaissa lapsissa, • ·
• M
koska he eivät kykene kehittämään riittävää vastetta useimmille polysakkarideille.
• · t • · ·
Parannettujen rokotteiden, jotka kykenevät suojaamaan lapset ja aikuiset tunkeutu- ·· 25 viita pneumokokki-infektioilta, avulla voitaisiin heikentää tämän sairauden haitalli- : *·· ,···. simpia piirteitä.
• «
«M
··· • · « • « · S. pneumoniaan solupintaproteiini PspA on osoitettu virulentiksi tekijäksi sekä suo- • · • · jääväksi antigeeniksi. Julkaistussa kansainvälisessä patenttihakemuksessa • · t *·ί·* 30 W092/14488 on kuvattu S. pneumoniae Rxl:stä peräisin olevanpspA-geenin DNA- • · * · · * * sekvenssit j a Psp A:n katkenneen muodon geenitekninen tuottaminen, j a tässä julkai- 118591 13 sussa on osoitettu, että tällainen PspA:n katkennut muoto saa aikaan suojan hiirissä, jotka altistetaan eläville pneumokokeille.
Kun tavoitteena on ollut PspA:han perustuvan rokotteen tai immunogeenisen koos-5 tumuksen kehittäminen, niin PspA:ta on ilmennetty yhdistelmä-DNA-teknisesti E. colissn. Ollaan todettu, että PspA:n tehokasta ilmentämistä ajatellen on hyödyllistä katkaista Rxl-kannan kypsä PspA-molekyyli siten, että sen normaalista, 589 aminohapon muodostamasta pituudesta jää jäljelle 314 aminohappoa, eli aminohapot 1-314. PspA-molekyylin tämä alue sisältää suurimman osan PspA:n suoj aavista epi-10 toopeista, tai peräti ne kaikki. Kuitenkin hiirissä toteutetut immunogeenisyys- ja suo- jatutkimukset ovat osoittaneet, ettei PspA:n katkennut yhdistelmä-DNA-tekninen muoto ole immunogeenistä luonnontilassa olevissa hiirissä. Näin ollen olisi hyödyllistä saada parannetuksi yhdistelmä-DNA-teknisen PspA:n ja sen kappaleiden im-munogeenisyyttä. Lisäksi erittäin toivottavaa olisi voida käyttää pneumokokki-15 antigeeniä yhdistelmäkoostumuksessa tai moniarvoisessa koostumuksessa. Esimerkiksi influenssa on ongelmallinen infektio, erityisesti iäkkäissä ja nuorissa ihmisissä, samoin kuin keuhkotulehdus; ja vuosittaiset influenssa-aallot ovat tavallisia, erityisesti Pohjois-Amerikassa. Näin ollen olisi toivottavaa, että influenssa- ja pneumo- ·*·’· i ·* kokkiantigeenejä voitaisiin antaa yhdessä valmisteessa.
• · * ·· *·* 20 ···· Helicobacter pylori on se kierremäinen bakteeri, joka kolonisoituu selektiivisesti ··· ihmisen mahassa limaa erittäviin soluihin ja joka on ihmisessä esiintyvän, syövyttä- « « • ·· *... mättömän mahatulehduksen (gastritis) tavallisin aiheuttaja. Viimeaikaiset tutkimuk- e · · • · · set osoittavat, että H. pylori, jonka ureaasiaktiivisuus on suuri, on useimpien mahas-25 sa esiintyvien sulatushaavaumien (peptic ulcer) sekä monen mahasyövän aiheuttaja.
• ·· [*·., Monet tutkimukset ovat viitanneet siihen, että ureaasi, joka on ureA- ja ureB-geeni- t;> tuotteiden kompleksi, saattaa olla suojaava antigeeni. Tähän saakka ei olla kuiten- • · · *],* kaan osattu tuottaa riittävää limakalvon immuunivastetta ureaasille ilman koleratok- • · siinia tai muita samankaltaisia apuaineita.
\:V 30 «·· • · • · ··· 1Λ 118691 14
Antigeenit tai niiden immunogeeniset kappaleet tuottavat immuunivasteen, kun niitä annetaan isännälle. Tällaiset antigeenit, erityisesti yhdistelmä-DNA-teknisesti tuotettaessa, voivat tuottaa voimakkaamman vasteen, jos niitä annetaan yhdessä apuaineen kanssa. Tällä hetkellä aluna on ainoa apuaine, jonka käytölle ihmisessä on myönnet-5 ty lupa, vaikka parhaillaan testataankin satoja kokeellisia apuaineita, joista esimerkkinä mainittakoon koleratoksiini B. Näillä apuaineilla on kuitenkin puutteita. Esimerkiksi, vaikka koleratoksiini onkin hyvä apuaine, se on erittäin myrkyllistä. Toisaalta koleratoksiini B ei ole myrkyllistä, mutta sillä ei ole myöskään apuaineen kaltaista aktiivisuutta. Näin ollen olisi toivottavaa saada aikaan immunologisia koostu-10 muksia, jotka kykenevät aiheuttamaan voimakkaan vasteen ilman apuainetta.
Eräissä tapauksissa, kun lukuisia (kaksi tai useampia) antigeenejä annetaan samassa valmisteessa tai peräkkäin, esiintyy vaikutustehohäiriönä tunnettu ilmiö. Johtuen yksinkertaisesti siitä, että yksi tai useampi valmisteessa läsnä oleva antigeeni vuorovai-15 kutiaa isännän immunologisen järjestelmän kanssa, valmisteen toinen antigeeni tai muut antigeenit eivät kykene saamaan aikaan riittävää vastetta, eli ensiksi mainitut antigeenit (antigeenien) häiritsevät viimeksi mainitun antigeenin (antigeenien) vaiku-tustehoa. Näin ollen olisi toivottavaa saada aikaan sellaiset moniarvoiset immunolo- • · · : giset koostumukset, joiden tapauksessa ei esiinny tällaista vaikutustehohäiriöilmiötä; • · ·'.*·; 20 esimerkiksi, vaikka ohessa ei välttämättä halutakaan rajoittua mihinkään erityiseen teoriaan, koska toinen antigeeni on lipoproteiini ja sillä on näin ollen apuaineen kai- « * · * ···! täistä vaikutusta ensimmäiseen antigeeniin, ja kun se on läsnä yhdistelmäkoostu- ·· • ♦ • ’* muksessa apuaineen kanssa, niin tällöin päästään synergistiseen tehostavaan vaiku- • · · ’· * * tukseen (jolloin ensimmäinen antigeeni ei häiritse toista antigeeniä ja kääntäen).
25 * · *... Yleisemmin, toivottavaa olisi parantaa antigeenien immunogeenisyyttä muillakin • · • · menetelmillä kuin käyttämällä apuainetta, sekä kyetä käyttämään tällaista menetel- *44 • · « *·* * mää immunogeenisyyden parantamiseksi yhdessä apuaineen kanssa, jolloin päästäi- • · * · · · * siin vieläkin suurempaan immunologiseen vasteeseen.
: 30 • · · • · • · • · · 118591 15
Edellä mainitussa patenttijulkaisussa USSN 08/446 201 on esitetty, että tapettujen kokonaisten pneumokokkien, pneumokokkihajotteen tai eristetyn ja puhdistetun PspA:n sekä sen immunogeenisten kappaleiden antaminen limakalvon kautta, erityisesti yhdessä apuaineen kanssa annettaessa, saa aikaan eläimissä suojan pneu-5 mokokkien pesiytymistä sekä systeemistä infektiota vastaan. Nyt ollaan yllättäen todettu, että muiden antigeenien kuten ureaasin antaminen limakalvon kautta yhdessä lipoproteiinien kanssa johtaa systeemisen ja paikallisen vasteen kehittymiseen eläimissä apuainetta käyttämättä.
10 Oletetaan, ettei alalla ole tähän mennessä esitetty eikä ehdotettu seuraavia: immunologiset koostumukset, jotka käsittävät vähintään yhtä antigeeniä ja lipoproteiinia sekä valinnaisesti apuainetta, edullisemmin antigeeniä, antigeenistä lipoproteiinia ja valinnaisesti apuainetta, eikä menetelmiä näiden koostumusten antamiseksi moniarvoisena koostumuksena tai näiden komponenttien antamiseksi samanaikaisesti tai 15 peräkkäin, erityisesti sellaisia koostumuksia ja menetelmiä, joilla on parannetut im-munogeeniset ominaisuudet.
Keksinnön tavoitteet ja yhteenveto ·* · • · · • · • · • · t \ " 20 Keksinnön tavoitteena on saada aikaan immunologiset koostumukset sekä menetel- • · · ···: mät näiden koostumusten valmistamiseksi ja käyttämiseksi.
• · · ·· • · · " Keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan immunologiset koostumukset, joi- • · · den immunogeenisyys on tehostunut; tai koostumukset, joiden antaminen voimistaa ,, 25 immunologista vastetta.
• · • ·♦ ··♦ • · • ♦ *!* Keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan menetelmät immunologisen vasteen, ··· • · · *·* * edullisesti voimistuneen vasteen indusoimiseksi antamalla sopivalle isännälle tällai- «·* 1 • · * · · · * siä immunologisia koostumuksia.
: 30 ··· ^ ·<« • ♦ • ♦ ·*· ,, 1 185 91 ίο
Keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan immunologinen koostumus, joka käsittää vähintään yhtä antigeeniä käsittävää ensimmäistä koostumusta ja vähintään yhtä lipoproteiinia käsittävää toista koostumusta sekä valinnaisesti apuainetta, edullisesti sellaiset koostumukset, joissa lipoproteiini on antigeeninen.
5
Edelleen, keksinnön tavoitteena on lisäksi saada aikaan menetelmä immunologisen vasteen indusoimiseksi tai voimistamiseksi antamalla isännälle, joka on eläin tai ihminen, vähintään yhtä antigeeniä käsittävää ensimmäistä koostumusta ja vähintään yhtä lipoproteiinia käsittävää toista koostumusta sekä valinnaisesti apuainetta; ja 10 edullisemmin sellaiset menetelmät, joissa lipoproteiini on antigeeninen.
Yllättäen ollaan todettu, että vähintään yhtä lipoproteiinia käsittävän koostumuksen antaminen isännälle yhdessä vähintään yhtä antigeeniä käsittävän koostumuksen kanssa johtaa siihen, että isännässä kehittyy immunologinen vaste. Tämä immunolo-15 ginen vaste on yleensä parempi kuin vaste, joka saadaan antamalla pelkkää antigeeniä.
Lisäksi ollaan myös yllättäen todettu, että vähintään yhtä antigeeniä käsittävän en- ·* « : *.* simmäisen koostumuksen, vähintään yhtä lipoproteiinia käsittävän toisen koostu- • · • · » *. " 20 muksen ja valinnaisesti apuaineen antaminen isännälle joko samanaikaisesti tai pe- l«l ··! räkkäin (sopivan pituisen ajanjakson aikana siten, että sekä antigeeniä, apuainetta *»» • · · että lipoproteiinia on läsnä isännässä yhtä aikaa) johtaa siihen, että isännässä kehittyy • * ’ " immunologinen vaste tälle antigeenille. Tämä immunologinen vaste on yleensä pa- • · · * * rempi kuin vaste, joka saadaan antamalla pelkkää antigeeniä tai antamalla antigeeniä 25 ja apuainetta. Lipidoituneet proteiinit näyttävät stimuloivan immuunivastetta saman- • · • * · *... kaltaisella tavalla kuin apuaineena käytetty koleratoksiini B.
• · ··« «·· • · « *·] Edelleen, yllättäen ollaan lisäksi todettu, että tällä tavalla annettaessa itse lipoproteii- • · *·;·* ni voi olla immunogeeninen tai antigeeninen, esimerkiksi se voi olla antigeeni, ja 30 ettei tällöin päästä pelkästään siihen, että isännässä kehittyy immunologinen vaste * ♦ 9 '... · tälle antigeenille; vaan aikaan saadaan myös immunologinen vaste tälle antigeenisel- 17 118591 le lipoproteiinille. Tämä antigeenisen hpoproteiinin vaikutuksesta kehittynyt immunologinen vaste voi olla yhtä hyvä kuin tai parempi kuin se vaste, joka saadaan antamalla lipoproteiinia yksinään tai yhdessä apuaineen kanssa; ja antigeenin vaikutuksesta kehittynyt immunologinen vaste voi olla parempi kuin vaste, joka kehittyy an-5 nettaessa pelkkää antigeeniä tai antigeeniä j a apuainetta.
Tarkoitus on, että tekniikan nykytason mukaiset lipopeptidit jäävät ohessa käytetyn käsitteen 'lipoproteiini' ulkopuolelle; näin ollen lipoproteiini voi käsittää enemmän kuin 2-10 aminohappoa tai enemmän kuin 18-20 aminohappoa tai yli 24 amino-10 happoa tai 30 aminohappoa tai enemmän. Lipoproteiinit ovat suurehkoja molekyylejä, jotka pienentävät antigeenin määrää ja/tai antigeenin antamista alalla lipoproteiineihin kohdistuvista ennakkoluuloista huolimatta, esim. Vaccine (1994) 12(14): 1335,1338 palstan 1 viimeinen rivi, palstan 2 ensimmäiselle riville ["liukoiset proteiinit ... eivät ole immunogeenisia (suun kautta annettaessa)"]. Tekniikan nykytason 15 mukaisissa lipopeptideissä voi olla niiden pienestä koosta johtuen korkeintaan yksi epitooppi, kun taas esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoisissa lipoproteiineissa voi olla useampia kuin yksi epitooppi, esimerkiksi yksi B ja yksi T, tai ne voivat jopa olla itsessään antigeenisiä. Sen lisäksi, että lipopeptidit ovat lyhyempiä ja niiden mo- • · · t I « • · * lekyylipaino on pienempi kuin lipoproteiineilla, ja niiden syntetisoiminen on vaikea-» · » ** ” 20 ta, koska ne valmistetaan tavallisesti Memfield- tai muilla synteesimenetelmillä, ne ·· · ·’·; eroavat lipoproteiineista siinä suhteessa, että lipoproteiinit ovat suurempia, li- **» poproteiineja ei valmisteta yleensä Memfield-synteesimenetelmillä ja niitä voidaan • · • · · *... saada eristämällä luonnollisista lähteistä tai valmistamalla yhdistelmä-DNA- «Il tekniikoilla. Toisin sanoen tekniikan nykytason mukaiset lipopeptidit on valmistettu 25 synteettisesti, mikä rajoittaa niiden koon korkeintaan noin 30 aminohapoksi. Lipo- * ·· , · ·. # proteiinit ovat suurempia kuin lipopeptidit ja niillä on suurempi molekyylipaino kuin * lipopeptideillä, ja toisin kuin lipopeptidit, niitä ei valmisteta tavallisesti Memfield- • · · synteesimenetelmillä. Lipoproteiineja voidaan eristää luonnollisista lähteistä tai tuot- • · • φ ‘1' taa yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Edelleen, lipoproteiinit ovat liukoisempia kuin 30 lipopeptidit. Lisäksi, peptideillä ei ole kvatemääri- eikä tertiäärirakennetta, kun taas ·*** proteiineilla voi olla kvatemääri- ja/tai tertiäärirakenne. Sen perusteella, että proteii- 118591 18 nit kykenevät muodostamaan tertiäärirakenteen, ne kykenevät myös muodostamaan toiminnallisia domeeneja toisin kuin peptidit. Näin ollen tekniikan nykytason välisten "lipopeptidien" ja tässä keksinnössä käytettyjen "lipoproteiinien" välillä on lukuisia eroja.
5
Keksinnön mukaisia lipoproteiinivalmisteita voidaan antaa nenän kautta, mikä on edullista.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti ollaan myös todettu, että lipoproteiini, jota anne-10 taan esillä olevan keksinnön mukaisen antigeenin kanssa, on 500 kertaa voimakkaampi kuin lipopeptidin ja antigeenin antaminen.
Näin ollen esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan immunologinen koostumus, joka käsittää vähintään yhtä antigeeniä käsittävää ensimmäistä koostumusta ja vä-15 hintään yhtä lipoproteiinia käsittävää toista koostumusta. Tämä koostumus voi lisäksi käsittää valinnaisesti, ei kuitenkaan välttämättä, apuainetta. Lipoproteiini on edullisesti antigeeni. Tämä immunologinen koostumus voi olla rokote.
·· * t ’.· Esillä oleva keksintö käsittää edelleen menetelmän immunologisen vasteen indusoi- * · *· *: 20 miseksi isännässä, jossa menetelmässä annetaan edellä mainittua immunologista ···· koostumusta. Tämän menetelmän tavoitteena voi olla suojaavan vasteen indusoimi- »·· nen, esimerkiksi silloin kun immunologinen koostumus on rokote.
a · 9 ··* f · t * Esillä oleva keksintö käsittää edelleen menetelmän immunologisen vasteen indusoi- .. 25 miseksi siten, että siinä annetaan peräkkäin antigeeniä käsittävää ensimmäistä koos- • · • ·· "... tumusta sekä lipoproteiinia käsittävää toista koostumusta. Valinnaisesti joko ensim- • · *1" mäinen tai toinen koostumus tai sekä ensimmäinen että toinen koostumus voi(vat) ··% • ♦ · *·* edelleen käsittää apuainetta. Lipoproteiini on edullisesti antigeeni. Tämä peräkkäi- • · nen antaminen tulisi toteuttaa sopivan ajanjakson aikana siten, että sekä antigeeniä, ·.*.* 30 lipoproteiinia ja valinnaista apuainetta on läsnä yhtä aikaa isännässä; ja alan asian- φφφ tuntija kykenee määrittämään tällaisen ajanjakson tämän kuvauksen perusteella il- 118591 19 man tarpeetonta kokeilua, alan asiantuntijan hallitsemilla menetelmillä, joista voidaan mainita isäntäseerumien titraaminen sekä antigeenin tai vasta-aineen analysointi siitä esimerkiksi ELISA-määrityksellä. Antaminen voi tapahtua limakalvojen kautta, esimerkiksi mahan tai nenän sisäisesti.
5
Esillä oleva keksintö liittyy erityisesti menetelmiin immunologisen vasteen indusoi-miseksi isännässä, joiden menetelmien käsittämissä vaiheissa isännälle annetaan limakalvon kautta vähintään yhtä antigeeniä ja isännälle annetaan limakalvon kautta vähintään yhtä lipoproteiinia. Tämä antaminen voi tapahtua samanaikaisesti tai pe-10 räkkäin. Antigeeni voi olla bakteeriproteiini tai sen kappale, esimerkiksi ureaasi.
Keksinnön mukaisissa koostumuksissa ja menetelmissä tämä "antigeeni" voi olla mikä tahansa sellainen antigeeni, jolla toivotaan saatavan aikaan immunologinen vaste isännässä, eläimessä tai ihmisessä. Esimerkiksi, vaikka keksintöä ei välttämättä 15 halutakaan rajoittaa millään tavalla, tämä antigeeni voi olla: Äorre/za-antigeeni, esimerkiksi OspA, OspC, OspB, OspD; pneumokokkiantigeeni, esimerkiksi PspA; influenssa-antigeeni kuten HA; pertussis- eli hinkuyskäantigeeni kuten pertussis 69KD-polypeptidi; hepatitis-antigeeni, esim. hepatitis B-antigeeni kuten hepatitis B- ·*·* ' .* pinta-antigeeni; Helicobacter pylori -antigeeni kuten ureaasi; vesikauhuviruksen • · • · · ’· 20 antigeeni, esim. rabies G-antigeeni; flavivirusantigeeni, esim. japanilaisen aivotuleh- "·; dus (encephalitis) -viruksen, Dengue-viruksen tai keltakuumeviruksen antigeeni; ··· ***: vesirokkoviruksen antigeeni; kurkkumätäantigeeni; C. tetani -antigeeni, esim. te- • · · tanustoksoidi; sikotautiviruksen antigeeni; tuhkarokkoviruksen antigeeni; malaria- • f · • ♦ · * antigeeni; herpes-viruksen antigeeni kuten alfa-herpesviruksen, beeta-herpesviruksen .. 25 tai gamma-herpesviruksen antigeeni, esim. herpes-viruksen glykoproteiini, esimer- • ·♦ kiksi hevosen herpesviruksen antigeeni, esim. gp!3, gpl4, gD, gp63 tai gE, vale- • · ]·* vesikauhuviruksen antigeeni, esim. gp50, gpll, gpIIT, gpl, herpes simplex-viruksen • · · *·]/ antigeeni, esim. gC, gD, naudan herpes-viruksen antigeeni, esim. gl, kissan herpes- • · *··* viruksen antigeeni, esim. gB, Epstein-Barr -viruksen antigeeni, esim. gp220, gp340 30 tai gH, tai ihmisen sytomegaloviruksen antigeeni, esim. gB; ihmisen immuunikatovi- • · · *.·.* ruksen antigeeni, esim. gplöO tai gpl20; apinan immuunikatoviruksen antigeeni; 118591 20 naudan virusperäistä ripulia aiheuttavan viruksen antigeeni; hevosen influenssaviruksen antigeeni; kissan leukemiaviruksen antigeeni; koiran penikkatautiviruksen antigeeni, esim. HA- tai F-glykoproteiini; koiran adenoviruksen antigeeni, esim. koiran tyyppiä 2 olevan adenoviruksen antigeeni; koiran koronaviruksen antigeeni; koiran 5 parainfluenssa-antigeeni; koiran parvoviruksen antigeeni; Hantaan-viruksen antigeeni; linnun influenssaviruksen antigeeni, esim. nukleoproteiiniantigeeni; Newcastlen sairautta aiheuttavan viruksen antigeeni, esim. F, HN; Rous-liitännäisviruksen antigeeni, esim. RAV-l-kuoriantigeeni; tarttuvaa keuhkoputkentulehdusta aiheuttavan viruksen antigeeni, esim. matriisiantigeeni tai preplomeeriantigeeni; tarttuvaa lima-10 pussin tulehdusta aiheuttavan viruksen antigeeni; kolera-antigeeni; kasvaimeen liittyvä antigeeni; kissan immuunikatoviruksen antigeeni; suu- ja sorkkatautia aiheuttavan viruksen antigeeni; Marek:in sairautta aiheuttavan viruksen antigeeni; Staphylo-cocci-antigeeni; Streptococci-antigeeni; Haemophilus influenza-antigeeni, esim. ryhmän b polysakkaridi-proteiinikonjugaatit, papillomavirus; polioviruksen antigee-15 ni; vihurirokkoviruksen antigeeni; rokkoviruksen kuten isorokkoviruksen antigeeni, esim. vaksiinia; lavantautiviruksen antigeeni; valelavantautiviruksen (typhoid) antigeeni; tuberkuloosiviruksen antigeeni; HTLV-antigeeni; tai muu bakteeri-, virus- tai patogeeniantigeeni kuten bakteerin tai viruksen pinta-antigeeni tai kuoriproteiini.
*'»** • i • · • · • · « *· / 20 Antigeeni voi olla tunnettu antigeeni; se on voitu eristää bakteereista, viruksista tai ··· ***; patogeeneistä; tai se voi olla yhdistelmä-DNA-tekninen antigeeni, joka on saatu il-
Ml mentämällä sopiva, sitä koodaava nukleiinihappo sopivan vektorin avulla ja eristä- • *· *... mällä ja/tai puhdistamalla tämä yhdistelmä-DNA-tekninen antigeeni. Antigeenin • » t valinta riippuu luonnollisestikin toivotusta immunologisesta vasteesta sekä isännästä.
.. 25 • t • ·· ,···, Lipoproteiini voi olla mikä tahansa sellainen lipoproteiini, joka on fysiologisesti • ♦ ··· yhteensopiva isännän kanssa. Se on kaikkein edullisimmin bakteeriperäinen lipopro- * · * • · · , ;,, teum tai lipoproteiini, jossa on bakteeriperäinen lipidiryhmä.
• · • · ··» ^ · 30 Tämä lipoproteiini on edullisesti itse myös antigeeni. Näin ollen lipoproteiini on ***** *···' edullisesti patogeenin, esimerkiksi viruksen tai bakteerin ulkokalvon komponentti, 118591 21 edullisemmin lipoproteiini, jossa on uiko- tai ääriproteiini siten, että lipoproteiini voidaan uuttaa lievissä olosuhteissa tai detergentin avulla lipidiosan olennaisesti denaturoitumatta tai sitä menettämättä (siten, että epitoopit säilyvät). Keksintöä toteutettaessa voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa antigeenistä lipoproteiinia. Ja 5 tämä lipoproteiini voidaan eristää sopivasta fysiologisesta lähteestä tai organismista, esimerkiksi bakteereista; tai sitä voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-teknisesti. Niinpä esillä olevaa keksintöä toteutettaessa lipoproteiinina voidaan käyttää lipidoituneita Äo/re/m-antigeenejä, esimerkkinä yhdistelmä-DNA-tekninen OspA, sekä lipidoituneita OspA- ja Borrelia-fraktioita sisältäviä lipidoituneita proteiineja (jotka on eris-10 tetty lievissä olosuhteissa), jotka on kuvattu kappaleessa 'Viittauksen asiaan liittyviin hakemuksiin' mainituissa patenttihakemuksissa sekä patenttijulkaisussa WO 90/04411 (joka sisällytetään oheen tällä viittauksella). Selvää on, että tässä keksinnössä "antigeeni” ja "lipoproteiini" ovat erillisiä erilaisia aineosia (siten, että kun "lipoproteiini" on OspA, se ei ole samalla myös "antigeeni").
15 7. kesäkuuta 1995 jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka saijanumero on 08/475 781, ja joka sisällytetään oheen tällä viittauksella, on kuvattu yhdistelmä-DNA-tekniset lipoproteiinit, erityisesti antigeeniset yhdistelmä-DNA-tekniset lipo- M · i .; proteiinit, esimerkiksi ne, jotka on saatu ilmentämällä OspA:n johtosekvenssi prote- * · · *· *J 20 iinin lipidoimiseksi; ja näitä yhdistelmä-DNA-teknisiä lipoproteiineja voidaan käyt- •S· ··*! tää tätä keksintöä toteutettaessa. Mitä tulee yhdistelmä-DNA-teknisten proteiinien ··· ”·· ilmentämiseen, oletetaan, että alan asiantuntija tuntee erilaisia vektorijärjestelmiä, • · joita on saatavana tällaista ilmentämistä varten, esimerkkeinä bakteerit kuten E. coli • e · • · » * sekä bakteerivirukset ja muut vastaavat.
25 • * • ·· [·*·, Apuaine voi olla mikä tahansa sellainen kuljetin, joka tyypillisesti parantaa antigee- nin antigeenisyyttä, esim. mineraalisuspensio tai -geeli (esimerkiksi aluna, alumiini- * » · hydroksidi tai -fosfaatti), johon antigeenin on annettu adsorboitua; tai vesi-öljyssä- • » 7 emulsio, jossa antigeeniliuos on emulgoitu mineraaliöljyyn (esim. Freundin epätäy- 30 dellinen apuaine), ja johon on joskus sisällytetty tapettuja mykobakteereita (esim.
··· *··♦* Freundin täydellinen apuaine); tai koleratoksiini (joskus yhdessä koleratoksiini B:n 118591 22 kanssa, joka voi parantaa vaikutusta); tai mikä tahansa muu alalla tunnettu apuaine tai apuaineet, joita on tarkasteltu osassa Keksinnön taustaa'. Antigeeni ja/tai lipopro-teiini on voitu absorboida apuaineen pinnalle tai kytkeä apuaineeseen.
5 Tällä hetkellä edullisina pidetyt keksinnön suoritusmuodot käsittävät: alunaa apuaineena, jos apuainetta on läsnä; lipoproteiinina OspA-proteiinia tai yhdistelmä-DNA-teknistä OspA-johtaja/PspA-yhdistelmää, yhdistelmä-DNA-teknistä OspA-johta-ja/OspC-yhdistelmää, yhdistelmä-DNA-teknistä OspA-johtaja///. pylorin UreA-yh-distelmää tai yhdistelmä-DNA-teknistä OspA-johtaja/K pylorin UreB-yhdistelmää 10 (OspA-johtaja/PspA on yhdistelmä-DNA-tekninen lipoproteiini, jossa on OspA-joh-tosekvenssiä koodaavan nukleiinihapposekvenssin ilmentymisestä peräisin oleva lipidoitunut ryhmä sekä /^/^-nukleiinihapposekvenssin ilmentymisestä peräisin oleva proteiiniryhmä; OspA-johtaja/OspC on analoginen OspA-johtaja/PspA:n kanssa, paitsi että proteiiniosa on peräisin ospC-nukleiinihapposekvenssin ilmentymi-15 sestä, ja OspA-johtaja/UreA sekä OspA-johtaja/UreB ovat samoin analogisia OspA-johtaja/PspA:n kanssa, paitsi että proteiiniosa on peräisin ureA- tai «reÄ-nukleiini-happosekvenssin ilmentymisestä); sekä antigeeninä OspC-antigeeniä tai toista Bor-re/ia-antigeeniä tai influenssa-antigeeniä, esim. HA (joka on peräisin esimerkiksi • ·*· \ *[ influenssa A:sta, esimerkiksi Texas-kannasta), tai ureaasia. Erityisiä suoritusmuotoja • ♦ · *· 20 voivat olla koostumukset, jotka käsittävät (i) alunaa (apuaineena), OspA:ta (lipopro- ··· *·** teiinina) sekä toista Borrelia-mtigeemä kuten OspC:ta (antigeeninä); (ii) alunaa ··· (apuaineena), OspA:ta (antigeeninä) sekä OspA-johtaja/OspC-yhdistelmää (lipopro- • ·· teiinina); (iii) alunaa (apuaineena), OspA-johtaja/PspA-yhdistelmää (lipoproteiinina)
• · J
ja influenssa-antigeeniä, esim. influenssa A HA:ta (antigeeninä); (iv) OspA:ta (lipo- ;·. 25 proteiininä) ja H. pylori -antigeeniä, esim. ureaasia (antigeeninä).
• ·· ··· • · • · ·«·
Keksinnön muut tavoitteet ja suoritusmuodot kuvataan seuraavassa kuvauksessa tai • * · • · · l,, ovat ilmeisiä muunnoksia tämän kuvauksen perusteella.
• * • · ··· • · · ·».· 30 ··· : : ··· 23 1 1 8591
Piirustusten lyhyt kuvaus
Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viitataan liitteenä oleviin piirustuksiin, joissa: 5
Kuvio 1 esittää graafisesti hiirissä, jotka on immunisoitu OspC-valmisteilla joko yhdessä apuaineena toimineen, puhdistetun lipidoituneen OspA:n kanssa tai ilman sitä sekä yhdessä apuaineena toimineen alunan kanssa tai ilman sitä, kehittynyttä immuunivastetta niitattuna anti-OspC-ELISA-määrityksellä 63 vuorokautta im-10 munisoinnin jälkeen; ja
Kuvio 2 esittää graafisesti hiirissä, jotka on immunisoitu OspC-valmisteilla joko yhdessä apuaineena toimineen, puhdistetun lipidoituneen OspArn kanssa tai ilman sitä sekä yhdessä apuaineena toimineen alunan kanssa tai ilman sitä, kehittynyttä 15 immuunivastetta niitattuna anti-OspC-ELISA-määrityksellä 91 vuorokautta immunisoinnin jälkeen.
Kuvio 3 esittää graafisesti hiirissä, jotka on immunisoitu kahdesti nenän sisäisesti ·· · • · · ί .* joko lipidoituneella tai lipidoitumattomalla OspA:lla, kehittynyttä immuunivastetta • · • i · *· " 20 mitattuna anti-OspA-ELISA-määrityksellä 9 vuorokautta toisen immunisoinnin jäi- ··» ··*· keen.
··· ·*·· ·* * ·
Kuvio 4 esittää graafisesti hiirissä, jotka on immunisoitu kahdesti, sekä nenän sisäi- i » i • « f * sesti että mahan sisäisesti, joko pelkästään jack bean-pavun ureaasilla tai sekä ureaa- 25 silla ja OspA:lla, kehittynyttä immuunivastetta niitattuna anti-ureaasi-ELISA-määri- • ·· "... tyksellä 9 vuorokautta toisen immunisoinnin jälkeen.
• ♦ «·· ··· • · · *·] * Kuvio 5 esittää graafisesti hiirissä, jotka on immunisoitu kahdesti nenän sisäisesti i · *·;·* joko pelkällä jack bean-pavun ureaasilla tai yhdessä OspA:n tai koleratoksiinin kans- 30 sa, kehittynyttä immuunivastetta mitattuna anti-urea-ELISA-määrityksellä 9 vuoro-
IM
kautta toisen immunisoinnin jälkeen.
24 1 1 8591
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Kuten edellä on tarkasteltu, keksintö liittyy immunologisiin koostumuksiin ja menetelmiin niiden valmistamiseksi ja käyttämiseksi (esim. antamiseksi), näiden koostu-5 musten ollessa laajasti ottaen antigeeniä ja lipoproteiinia ja valinnaisesti apuainetta käsittäviä immunologisia koostumuksia; ja näiden menetelmien käsittäessä laajasti ottaen tällaisten koostumusten antamisen sopivalle isännälle siten, että antigeenin ja lipoproteiinin ja valinnaisen apuaineen antaminen tapahtuu samanaikaisesti, tai että näiden koostumusten komponenttien antaminen tapahtuu peräkkäin.
10
Nyt ollaan yllättäen todettu, että antigeenin, esimerkiksi bakteeriproteiinin tai sen kappaleen, sekä lipoproteiinin antaminen limakalvon kautta johtaa sekä paikallisen immuunivasteen että seerumi-immuunivasteen kehittymiseen. Ominaisimmuniteetin pääasiallinen determinantti limakalvopinnoilla on erittyvä IgA (S-IgA), joka erottuu 15 fysiologisesti ja toiminnallisesti kiertävän immuunijäijestelmän komponenteista. S-IgA-vasta-ainevasteita voidaan indusoida paikallisesti antamalla sopivia im-munogeeneja tiettyyn kohtaan limakalvolla. Limakalvon S-IgA-vasteet ovat kuitenkin pääasiassa limakalvon yleisen immuunijäij estelmän (common mucosal immune ·* t i system; CMIS) tuottamia [Mestecky, J. Clin. Immunol. (1987), 7:265 - 276], jossa • · • · · *· *5 20 jäijestelmässä erikoistuneet imu-epiteelirakenteet, joita kutsutaan yhteisesti lima- « · · kalvoon liittyväksi imukudokseksi (mucosa-associated lymphoid tissue; MALT), «S· ottavat vastaan immunogeeneja. Parhaiten tutkittuja immunologisia imu- • · *... ’ epiteelirakenteita ovat suolistoon liittyvät imukudokset (GALT) kuten suolen Peyer- • · · • · · t alueet. Nyt on kuitenkin selvää, että muita rakenteellisesti ja toiminnallisesti saman-.. 25 kaltaisia imukeräsiä esiintyy muillakin limakalvopinnoilla, hengityskanavan lima- 4 *♦ [...t kalvopinnat mukaan lukien [Croitury, K., et ai., teoksessa "Handbook of Mucosal • · ]·* Immunology" (toimittaja Bienenstock, J.) San Diego, CA: Academic Press, Inc.
?:.V (1994), 141 - 149].
: :
• M
30 Jäljempänä Esimerkeissä esitetyistä koetuloksista nähdään, että hiiret voidaan im- ·φ· t « *···* munisoida tehokkaasti tiputtamalla nenän sisään (i.n.) tai mahan sisään (i.g.) baktee- 118591 25 riperäisin proteiini-immunogeenej a yhdessä sellaisen lipoproteiinin kuten OspArn kanssa. Spesifistä IgA:ta ja IgG:tä erittäviä soluja indusoituu sylkirauhasissa ja mahassa (mahoja ei ole esitetty) ja spesifisiä IgA-vasta-aineita indusoituu sylkeen (ei esitetty). Samoin indusoituu voimakkaita kiertäviä immuunivasteita siten, että IgG-5 ja IgA-vasta-aineita on läsnä seerumissa. Näin ollen näyttää siltä, että immunisointi limakalvon kautta antigeeneillä yhdessä lipoproteimien kanssa on tehokas reitti limakalvojen yleisten vasteiden sekä kiertojäijestelmän vasta-ainevasteiden stimuloi-miseksi. Tällainen immunisointi voi olla sekä hoitavaa että ennalta ehkäisevää.
10 Antigeenin, lipoproteiinin ja valinnaisen apuaineen määrä keksinnön mukaisissa koostumuksissa sekä näistä koostumuksista tehdyissä valmisteissa voidaan määrittää standarditekniikoilla, jotka ovat hyvin tuttuja farmaseuttisten alojen tai eläinlääketieteen asiantuntijoille. Erityisesti, antigeenin, lipoproteiinin ja apuaineen määrä keksinnön mukaisissa koostumuksissa sekä annetuissa annoksissa määritetään teknii-15 koilla, jotka ovat hyvin tuttuja lääketieteen ja eläinlääketieteen*asiantuntijoille, ottaen huomioon sellaiset tekijät kuten kyseessä oleva erityinen antigeeni, lipoproteiini, apuaine, kyseessä olevan potilaan ikä, sukupuoli, paino, laji sekä tila ja antamistapa. Esimerkiksi edellä lueteltujen erityisten antigeenien annoskoot sen sopivan isännän, ·· t • · · • ·* johon immunologinen vaste halutaan tuottaa, tapauksessa ovat tuttuja alan asiantun-
• · S
*· *: 20 tijoille, samoin kuin tyypillisesti niiden kanssa annettava apuaineen määrä. Näin ··· ·*·; ollen alan asiantuntija kykenee määrittämään vaivattomasti koostumuksissa läsnä ··· “*· olevan antigeenin ja valinnaisen apuaineen määrät, jotka on tarkoitus antaa keksin- • « • ·· nön mukaisilla menetelmillä. Tyypillistä on, että apuainetta käytetään fosfaatilla • · · • · · puskuroituun suolaliuokseen tehtynä liuoksena, jonka pitoisuus on yleensä 0,001 -25 50 paino-%, ja antigeeniä on läsnä suuruusluokaltaan mikrogrammoja tai milligram-
• M
moja olevana määränä, esimerkiksi noin 0,0001 - 5 paino-%, edullisesti noin 0,0001 - 1 paino-%, kaikkein edullisimmin noin 0,0001 - 0,05 paino-% (katso esimerkiksi • I · alla olevat esimerkit).
• » • · ··» 30 Alan asiantuntija voi viitata erityisen antigeenin ja erityisen isännän tapauksessa ·*· • 4 '···* tunnettuun annoskokoon hänen määrittäessään koostumuksissa läsnäolevaa ja esillä 118591 26 olevan keksinnön mukaisilla menetelmillä annettavaa lipoproteiinin määrää (jos li-poproteiini on antigeeninen), esimerkkinä ohessa mainittujen asiakirjojen perusteella tunnetut OspA:n annoskoot, tai hän voi mitoittaa annoskoon tietyn isännän tapauksessa ohessa mainittujen asiakiijojen ja jäljempänä esitettyjen esimerkkien avulla 5 (ajatellen esimerkiksi yhdistelmiä OspA-johtaja/PspA, OspA-johtaja/OspC, OspA-johtaja/ureA sekä OspA-johtaja/ureB). Kuitenkin tyypillisesti, antigeeniä ja/tai yh-distelmä-DNA-teknistä lipoproteiinia on läsnä mikrogrammojen tai milligrammojen suuruusluokkaa olevana määränä tai noin 0,001 - 20 paino-%, edullisesti noin 0,01 -10 paino-% ja kaikkein edullisimmin noin 0,05 - 5 paino-% (katso esimerkiksi alla 10 olevat esimerkit).
Luonnollisestikin minkä tahansa eläimelle tai ihmiselle annettavan koostumuksen, sen komponentit mukaan lukien, sekä minkä tahansa sen antamiseen käytettävän menetelmän tapauksessa on edullista määrittää myrkyllisyys, esimerkiksi määrittä-15 mällä tappava annos (lethal dose; LD) sekä LDso-arvo sopivaa eläinmallia, esimerkiksi jyrsijään kuten hiireen perustuvaa mallia käyttäen, sekä koostumuksen (koostumusten) annoskoko, siinä läsnä olevien komponenttien pitoisuus ja koostumuksen (koostumusten) antamisen ajoitus siten, että saadaan kehittymään sopiva M i * · * # , ( ί ·* immunologinen vaste, esimerkkeinä seerumien titraammen ja vasta-aineiden tai an- • · • · · ’· 20 tigeenien analysoiminen niistä esimerkiksi ELISA-määrityksellä. Tällaiseen määrit-
• M
··· j tämiseen ei tarvita turhaa kokeilua, vaan alan asiantuntijan taidot, tämä julkaisu sekä ·»· ohessa mainitut asiakiqat ovat riittävät. Ja kuten edellä on tarkasteltu, peräkkäiseen • * antamiseen tarvittava aika voidaan varmistaa ilman epäasianmukaista kokeilua.
I · · • · · .. 25 Esimerkkeinä keksinnön mukaisista koostumuksista voidaan mainita nestemäiset • * valmisteet jonkin aukon, esimerkiksi suuhun tai suun kautta, nenän, peräaukon tai • · emättimen kautta, mahan sisäisesti, limakalvon kautta (esimerkiksi kielen, hammas- • · · kuopan, ikenen, hajuelinten tai hengityselinten limakalvojen) kautta tai muulla vas- S * *;** taavalla tavalla tapahtuvaa antamista varten, kuten suspensiot, siirapit tai eliksiirit; 30 sekä valmisteet ruuansulatuskanavan ulkopuolista, ihon alaista, ihon sisäistä, lihak-
• M
sen sisäistä tai laskimon sisäistä antamista varten (esimerkiksi antamalla injektiona) 118591 27 kuten steriilit suspensiot tai emulsiot. Tällaisiin koostumuksiin on voitu sekoittaa sopivaa kantajaa, laimenninta tai apuainetta kuten steriiliä vettä, fysiologista suolaliuosta, glukoosia tai vastaavaa. Nämä koostumukset on myös voitu lyofilisoida. Nämä koostumukset voivat sisältää myös lisäaineita kuten kostuttavia tai emulgoivia 5 aineita, pH-arvoa puskuroivia aineita, hyytelöittäviä tai viskositeettia parantavia lisäaineita, säilöntäaineita, flavoriaineita, väriaineita ja muita vastaavia, riippuen anta-misreitistä sekä toivotusta valmisteesta. Sopivien valmisteiden valmistamisen suhteen, tarpeettoman kokeilemisen välttämiseksi, viitataan standarditeksteihin, esimerkkinä teos "REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17. laitos, 10 1985.
Keksinnön mukaiset koostumukset ovat tarkoituksenmukaisesti nestemäisinä valmisteina, kuten isotonisina vesiliuoksina, -suspensioina, -emulsioina, tai viskooseina koostumuksina, jotka on voitu puskuroida valittuun pH-arvoon. Mikäli imeytyminen 15 ruuansulatuskanavassa on toivottavaa, niin keksinnön mukaiset koostumukset voivat olla "kiinteässä" muodossa pillereinä, tabletteina, kapseleina, kapletteinaja vastaavina, mukaan lukien sellaiset "kiinteät" valmisteet, joista vapautuminen tapahtuu ajan mittaan, tai joissa on nestemäinen täyte, esimerkkeinä gelatiinilla pinnoitettu neste, • · · : . * jolloin gelatiini liukenee mahassa vaikuttavan aineen viemiseksi suolistoon.
• · • · » *. ·: 20 ·*· •**i Mikäli antaminen nenän tai hengityselinten (limakalvojen) kautta on toivottavaa, ·«· niin tällöin koostumuksista voidaan valmistaa sisäänhengitettäviä sumutteita ja vas- # · ” taavia ja niitä voidaan annostella puristuksen vaikutuksesta sumua tuottavalla annos- • · · • · « * telulaitteella, pumpun käsiUävällä annostelulaitteella tai aerosolia tuottavalla annos- .. 25 telulaitteella. Aerosolit on tavallisesti paineistettu hiilivedyn avulla. Pumpun käsittä-
• M
\.. vät annostelulaitteet voivat edullisesti annostella tietyn suuruisen annoksen tai sellai- • · ]·] sen annoksen, jolla on tietty hiukkaskoko.
* · · · · · · * * ·;·’ Keksinnön tavoitteiden mukaiset koostumukset voivat sisältää kostuttavaa ainetta 30 limakalvon kuivumisen estämiseksi ja ärsytyksen välttämiseksi. Käyttökelpoisia ovat • · · *... * kaikki erilaiset, farmaseuttisesti hyväksyttävät kostuttavat aineet, joista voidaan mai- 118591 28 nita sorbitoli, propyleeniglykoli tai glyseroli. Samoin kuin paksuntimienkin tapauksessa, pitoisuus vaihtelee riippuen valitusta aineesta, vaikkei tällaisten aineiden läsnäolo tai puuttuminen eikä niiden pitoisuus olekaan tämän keksinnön olennainen piirre.
5
Imeytymistä limakalvon läpi, erityisesti nenäkalvon läpi voidaan parantaa käyttämällä farmaseuttisesti hyväksyttävää pinta-aktiivista ainetta. Näissä koostumuksissa tyypillisesti käyttökelpoisista pinta-aktiivisista aineista voidaan mainita sorbitolian-hydridien osittaisten rasvahappoestereiden polyoksietyleenijohdannaiset kuten 10 Tween 80, Polyoxynol 40 Stearate (polyoksinoli-stearaatti), Polyoxyethylene 50 Stearate (polyoksietyleenistearaatti) sekä Octoxynol (oktoksynoli). Tavanomainen pitoisuus on alueella 1 -10 % kokonaispainosta laskien.
Farmaseuttisesti hyväksyttävää säilöntäainetta voidaan käyttää parantamaan koostu-15 musten varastoitavuutta. Bentsyylialkoholi voi olla sopiva, vaikka käyttökelpoisia ovat myös monet muut erilaiset säilöntäaineet kuten esimerkiksi parabeenit, time-rosaali, klooributanoli tai bentsalkoniumkloridi. Säilöntäaineen sopiva pitoisuus voi olla alueella 0,02 - 3 % kokonaispainosta laskien, vaikka tämä pitoisuus voikin • * · : *.: vaihdella huomattavasti valitusta aineesta riippuen.
• · • * * *. *: 20 • · · ···'· Keksinnön mukaiset koostumukset voivat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä ·»· flavoriaineita ja/tai värejä niiden saamiseksi miellyttävämpään muotoon, erityisesti t ♦ · \ 4 *' mikäli niitä annetaan suun kautta. Viskoosit koostumukset voivat olla geeleinä, vesi- « · · *·' " nä, juoksevina voiteina, voiteina ja muina vastaavina, ja ne sisältävät tyypillisesti 25 riittävän määrän paksuntavaa ainetta siten, että viskositeetti on noin alueella 2500- * · • »t 6500 cps, vaikka käyttökelpoisia ovat viskoosimmatkin koostumukset, esimerkiksi • · ]·] sellaiset, joiden viskositeetti on jopa 10 000 cps. Viskoosien koostumusten vis- • · * * *·’ι* kositeetti on edullisesti alueella 2500 - 5000 cps, sillä tämän alueen yläpuolella nii- • · '**’ den antaminen muuttuu vaikeammaksi. Kuitenkin tämän viskositeettialueen yläpuo- 30 lella koostumukset saattavat muuttua kiinteiksi tai gelatiinimaisiksi, jolloin niiden ·φ· *...· antaminen on helppoa, esimerkiksi suun kautta nielaistavana pillerinä.
118591 29
Tavallisesti on helpompaa valmistaa nestemäisiä valmisteita kuin geelejä, muita viskooseja koostumuksia tai kiinteitä koostumuksia. Lisäksi nestemäisten koostumusten antaminen on jonkin verran vaivattomampaa, erityisesti injektiona tai suun kautta eläimille, lapsille, erityisesti pienille lapsille sekä muille sellaisille kohteille, joiden 5 saattaa olla vaikeata nielaista pilleri, tabletti, kapseli tai vastaava, tai monia annoksia annettaessa. Toisaalta viskooseista koostumuksista voidaan muodostaa valmiste, jonka viskositeetti on sopivalla alueella siten, että valmiste pysyy pitemmän ajanjakson ajan kosketuksessa limakalvon, esimerkiksi mahapeitteen tai nenän limakalvon kanssa.
10
On ilmeistä, että sopivien kantajien ja muiden lisäaineiden valinta riippuu erityisen annosmuodon, esimerkiksi nestemäisen annosmuodon täsmällisestä antamistavasta sekä luonteesta [esimerkiksi siitä, onko koostumuksesta tarkoitus muodostaa liuos, suspensio, geeli tai muu nestemäinen muoto tai kiinteä annosmuoto (esim. siitä, on-15 ko koostumuksesta tarkoitus valmistaa pilleri, tabletti, kapseli, kapletti, ajan mittaan vapauttava muoto tai nesteellä täytetty muoto)].
Liuokset, suspensiot ja geelit sisältävät tavallisesti suuren määrän vettä (edullisesti · · • · ♦ i ·* puhdistettua vettä) antigeenin, lipoproteiinin ja valinnaisen apuaineen lisäksi. Läsnä * · • · · *· " 20 voi myös olla pieniä määriä muita aineosia kuten pH-arvoa säätäviä aineita (esim.
• · · •••j emästä kuten NaOHrta), emulgoivia tai dispergoivia aineita, puskuroivia aineita,
• M
säilöntäaineita, kostuttavia aineita, hyytelöittäviä aineita (esim. metyyliselluloosaa), • · värejä ja/tai flavoreja. Koostumukset voivat olla isotonisia, eli niiden osmoottinen • · · • · · * paine voi olla sama kuin veressä ja kyynelnesteessä.
25 • · • · *... Tämän keksinnön mukaisten koostumusten toivottu isotonisuus voidaan toteuttaa • · · ‘ · | käyttäen natriumkloridia tai muita farmaseuttisesti hyväksyttäviä aineita kuten dekst- • · · ' roosia, boorihappoa, natriumtartraattia, propyleeniglykolia tai muita epäorgaanisia • · **"’ tai orgaanisia liukenevia aineita. Natriumkloridi on edullinen erityisesti puskureissa, 30 jotka sisältävät natriumioneja.
• · · • · • · • · · 30 1 1 8591
Koostumusten viskositeetti voidaan säilyttää toivotulla tasolla käyttäen farmaseuttisesti hyväksyttävää paksuntavaa ainetta. Metyyliselluloosa on edullinen, koska sitä on saatavana helposti ja taloudellisesti ja sen käsittely on vaivatonta. Muista sopivista paksuntavista aineista voidaan mainita esimerkiksi ksantaanikumi, karboksime-5 tyyliselluloosa, hydroksipropyyliselluloosa, karbomeeri ja vastaavat. Paksuntimen edullinen pitoisuus riippuu valitusta aineesta. Tärkeätä on käyttää sellaista määrää, jolla päästään valittuun viskositeettiin. Viskooseja koostumuksia valmistetaan tavallisesti liuoksista lisäämällä tällaisia paksuntavia aineita.
10 Farmaseuttisesti hyväksyttävää säilöntäainetta voidaan käyttää koostumusten säilyvyyden parantamisesi. Bentsyylialkoholi saattaa olla sopiva, vaikka käyttökelpoisia ovat myös monet muut säilöntäaineet kuten esimerkiksi parabeenit, timerosaali, klooributanoli tai bentsalkoniumkloiidi. Säilöntäaineen sopiva pitoisuus on alueella 0,02 - 2% kokonaispainosta laskien, vaikka tämä pitoisuus voikin vaihdella huo-15 mattavasti valitusta aineesta riippuen.
Alan asiantuntijalle on selvää, että koostumusten komponentit on valittava siten, että ne ovat kemiallisesti inerttejä antigeenin, lipoproteiinin ja valinnaisen apuaineen ***** .* suhteen. Tämä ei ole mikään ongelma kemiallisia ja farmaseuttisia aineita tuntevalle • · * · *· '*· 20 henkilölle, tai ongelmat voidaan välttää helposti tutustumalla standarditeoksiin tai « ·· · käyttämällä yksinkertaisia kokeita (jotka eivät vaadi epäasianmukaista kokeilua) • · · * * * * tästä kuvauksesta sekä siinä mainituista asiakirjoista.
• · * ♦♦ * ··· • · · • · * * Tämän keksinnön mukaiset, immunologisesti tehokkaat koostumukset valmistetaan .. 25 sekoittamalla aineosat yleisesti hyväksyttyjen menettelytapojen mukaisesti. Esimer- • *·· kiksi, valitut komponentit voidaan yksinkertaisesti sekoittaa sekoittimessa tai muussa • · standardilaitteessa väkevän seoksen tuottamiseksi, jonka seoksen pitoisuus ja visko- i · * ;|t' siteetti voidaan sitten asettaa lopulliseen arvoon lisäämällä vettä tai paksuntavaa ai- * * ***·’ netta sekä mahdollisesti puskuria pH-arvon säätämiseksi tai ylimääräistä liukenevaa * *·.:.· 30 ainetta tonisuuden säätämiseksi. pH-arvo voi olla yleensä noin 3 - 7,5. Koostumuk- • · · *..: siä voidaan antaa annoksina, lääketieteen ja eläinlääketieteen asiantuntijoiden hyvin 118591 31 tuntemilla tekniikoilla ottaen huomioon sellaiset tekijät kuten kyseessä olevan potilaan tai eläimen ikä, sukupuoli, paino ja tila sekä annettavan koostumuksen annos-muoto (esim. kiinteä tai nestemäinen). Alan asiantuntija voi määrittää ihmisille ja muille nisäkkäille sopivat annokset ilman tarpeetonta kokeilua tässä kuvauksessa, siinä 5 mainituissa asiakiijoissa sekä jäljempänä olevissa esimerkeissä (esimerkiksi hiiriin kohdistetuissa esimerkeissä) esitettyjen kokeiden perusteella j a käyttäen hyväksi sitä, mitä tiedetään ohessa mainituista antigeeneistä, lipoproteiineista j a apuaineista.
Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluu myös menetelmä immunologisen vasteen 10 indusoimiseksi isännässä, jossa menetelmässä antigeeniä ja lipoproteiinia annetaan yhdelle limakalvolle ja vaste voidaan todeta toiselta limakalvolta esimerkiksi siten, että antaminen tapahtuu nenän kautta ja vaste todetaan emättimessä. Keksinnön tämä piirre on erityisen käyttökelpoinen sukupuoliyhteyden välityksellä siirtyviä sairauksia hoidettaessa tai ehkäistäessä.
15
Sopivat menettelytavat ensimmäisen annoksen ja tehosteannosten antamiseksi tai peräkkäisten annosten antamiseksi voivat myös vaihdella ja ne voivat käsittää alustavan antamisen ja sitä seuraavat myöhemmät antamiset; alan asiantuntija kykenee ·· · : V kuitenkin selvittämään helposti, ilman tarpeetonta kokeilua, sopivan menettelytavan • · • · # *· " 20 tämän kuvauksen, siinä mainittujen asiakirjojen sekä jäljempänä olevien esimerkkien ··« ···· perusteella käyttäen hyväksi sitä, mitä ohessa mainituista antigeeneistä, lipoproteii- ··· neistaja apuaineista tiedetään.
• » • ♦· ··· • 1 2 3 · • · 1 * Seuraavien esimerkkien on tarkoitus havainnollistaa tätä keksintöä sitä millään taval- .. 25 la rajoittamatta.
• · • ·· ♦ · • · ··· ♦ ··1 • ♦ · • 1 · ··♦ « · • · ·»» ♦ · 2 • ♦ ♦ ··♦ 3 • · • · ··♦ 32 1 1 85 91
ESIMERKIT
Esimerkki 1
Ylybndi-ospA/pspA-gtenm sisältävän pET9a-ilmentämisvektorin muo-5 dostaminen
Erityisesti toteutettuja oligonukleotidialukkeita käytettiin PCR-reaktiossa mielenkiinnon kohteena ja S. pneumoniae-kannasta RX1 peräisin olevan pspA-geenin osan monistamiseksi (tässä tapauksessa aminohapot 1-314).
10 S'-pään alukkeella oli nukleotidisekvenssi: 5-GGG ACA GCA TGC GAA GAA TCT CCC GTA GCC AGT-3' (PspNl) (SEQIDNO. 1) 15 3'-pään alukkeella oli nukleotidisekvenssi: 5-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQIDNO. 2) ·· * • · · \ PCR-reaktio oli seuraava: 94 °C:ssa 30 sekuntia DNA:n denaturoimiseksi; 42 °C:ssa • · ·
• M
* .* 20 yhden minuutin ajan DNA:n kiinnittämiseksi; ja 72 °C:ssa yhden minuutin ajan DNA:n jatkamiseksi. Tällä tavalla meneteltiin 25 jakson ajan, mitä seurasi 5 ·*.’ minuutin jatkaminen 72 °C:ssa. Tällä tavalla menettelemällä aminohapon 315 koh- • ·· dalle saatiin pysäytyskodoni. PCR-tuote puhdistettiin käyttäen Gene Clean Π-menetelmää (BiolOl) ja pilkottiin entsyymeillä Sphl ja BamHI.
25 • ··
PlasmidipLFlOO valmistettiin seuraavasti.
··· ··· « « * ,···, Plasmidi pBluescript KS+ (Stratagene) pilkottiin Xbal- ja BamHI-entsyymeillä ja • · ·*· ·. ligatoitiin 900 bp:n suuruiseen Xbal-BamRl DNA-kappaleeseen, joka sisälsi B.
:;: !!! 30 burgdorferi ACAl-kannan ospA-geenin täydellisen koodaavan alueen, jolloin saatiin • · muodostetuksi lipoproteiinin fiiusiovektori pFLIOO. Tämä menettelytapa on esitetty 118591 33 kaavamaisesti 7. kesäkuuta 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 08/475 781, ja joka sisällytetään oheen tällä viittauksella, kuviossa 1.
Tämä vektori pFLIOO on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Col-5 lection, Rockville, Maryland, 2. helmikuuta 1995 talletusnumerolla 69750. Tämä talletus on tehty Budapestin sopimuksessa esitettyjen ehtojen mukaisesti.
Plasmidi pLFlOO pilkottiin entsyymeillä Sphl ja BamHI ja monistettu pspA-geem ligatoitiin tähän plasmidiin hybridi-oj/fc4-ps/^-geenin sisältävän plasmidin pLF321 10 muodostamiseksi. Hybridigeeni leikattiin plasmidista pLF321 pilkkomalla entsyymeillä Ndel ja BamHI ja se kloonattiin plasmidivektorissa pET9a Ndel- ja Bam-ΗΙ-kohtiin, jolloin os/^-/w/&4-hybridigeeni saatiin T7-promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tuloksena olevaa plasmidia kutsutaan nimellä pPA321-L. Tämä prosessi on esitetty kaavamaisesti 7. kesäkuuta 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka saijanu-15 mero on 08/475 781, jajoka sisällytetään oheen tällä viittauksella, kuviossa 9.
Esimerkki 2 ϊ * : *, \ Ps/Jv4-geenin sisältävän ilmentämisvektorin pET9a muodostaminen ί · · • :♦ 2o ·«·
Erityisesti toteutettuja oligonukleotidialukkeita käytettiin PCR-reaktiossa mielen- J*|‘ kiinnon kohteena ja S. pneumoniae-kaimasta RX1 peräisin olevan pspA-geenin osan : ’·· . · j · monistamiseksi (tässä tapauksessa aminohapot 1-314).
« · » 25 5'-pään alukkeella oli nukleotidisekvenssi: : ·· 5-GCT CCT GCA TAT GGA AGA ATC TCC CGT AGC C-3' (PspNL-2) !:.* (SEQIDNO.3) ♦ · · ··* • ♦ 7 3-pään alukkeella oli nukleotidisekvenssi: * \s.! 30 5-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) «·· (SEQIDNO.4) 34 118591 PCR-reaktio oli seuraava: 94°C:ssa 30 sekuntia DNA:n denaturoimiseksi; ja 72 °C:ssa yhden minuutin ajan DNA:n kiinnittämiseksi ja jatkamiseksi. Tällä tavalla meneteltiin 25 jakson ajan, mitä seurasi 5 minuutin jatkaminen 72 °C:ssa. Tällä ta-5 valla menettelemällä aminohapon 315 kohdalle saatiin pysäytyskodoni. PCR-tuote puhdistettiin käyttäen Gene Clean Π-menetelmää (BiolOl) ja pilkottiin entsyymeillä Ndel ja BamHI. Pilkottu PCR-tuote kloonattiin plasmidivektorissa pET9a Ndel- ja BamHI-kohtiin, jolloin pspA-geeni saatiin T7-promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tuloksena olevaa plasmidia kutsutaan nimellä pPA321-NL. Tämä prosessi on esitet-10 ty kaavamaisesti 7. kesäkuuta 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 08/475 781, ja joka sisällytetään oheen tällä viittauksella, kuviossa 10.
Esimerkki 3 15 Lipidoituneen PspA:n ilmentäminen ja puhdistus
Plasmidia pPA321-L käytettiin E. co/i-kannan BL21(DE3)pLyS transformoimiseksi.
.. , Tätä transformoitua E. colt a siirrostettiin LB-alustaan, joka sisälsi 30 pg/ml kana- • · · t · \ \ mysiinisulfaattia ja 25 pg/ml kloramfenokolia. Viljelmää kasvatettiin yön yli ravis- • *·· 20 telupullossa 37 °C:ssa.
t • •«e « *·* *·»·
Seuraavana aamuna 50 ml yön aikana saatua viljelmää siirrostettiin 1 litraan LB- • **
alustaa, joka sisälsi 30 pg/ml kanamysiinisulfaattia, ja viljelmää kasvatettiin raviste-lupullossa 37 °C:ssa arviolta 3-5 tunnin ajan, jolloin optinen tiheys OD aal-Γ·,, 25 lonpituudella 600 nm oli alueella 0,6 - 1,0. Viljelyalastaan lisättiin DPTG.tä 0,5 mM
olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi ja viljelmää kasvatettiin vielä kaksi tuntia φ 30 °C:ssa. Viljelmät otettiin talteen sentrifugoimalla 4 °C:ssa nopeudella 10 000 x g, .***; ja solukasaiuna otettiin talteen. Lipidoitunut PspA otettiin talteen tästä solu- »«· kasaumasta.
• » « • « · ··* _ _ .···. 30 • · ·Φ· 35 1 1 8591
Solukasauma suspendoitiin uudestaan PBS-liuokseen määränä 30 g märkää solutah-naa litraan PBS-liuosta. Tämä solususpensio pakastettiin ja sitä säilytettiin -20 °C:ssa. Solut sulatettiin huoneen lämpötilassa niiden hajottamiseksi. Tähän sulatettuun materiaaliin lisättiin DNaasi I:tä 1 pg/ml olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi 5 ja seosta inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin seurauksena oli materiaalin viskositeetin pieneneminen.
Sitten tämä materiaali jäähdytettiin jäähauteessa alle 10 °C:n lämpötilaan ja siihen lisättiin tuotteen Triton™ X-114 10-prosenttista varastoliuosta alueella 0,3 - 1 % 10 olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi. Seosta pidettiin jäissä 20 minuuttia. Sitten tämä jäähdytetty seos lämmitettiin 37 °C:n lämpötilaan ja pidettiin tässä lämpötilassa 10 minuuttia. Tällöin liuos muuttui hyvin sameaksi faasien erottuessa. Sitten seosta sentrifiigoitiin noin 20 eC:ssa 10 minuuttia nopeudella 12 000 x g, jolloin seos erottui alemmaksi detergenttifaasiksi, ylemmäksi kirkkaaksi vesifaasiksi ja kasaumaksi. 15 Lipidoitunut PspA oli läsnä detergenttifaasissa. Tämä detergenttifaasi erotettiin kahdesta muusta faasista, se laimennettiin suhteessa 1:10 puskurilla, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, pH 7,5, ja sitä säilytettiin -20 °C:ssa.
e* · • · * * · .·. · Q-Sepharose-pylväs valmistettiin siten, että pylvästilavuus on 1 ml laimennetun de- • »I • · 20 tergenttifaasin jokaista 5 ml:aa kohden. Pylväs pestiin 2 pylvään tilavuudella pusku- 9 »··
ria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3 % Triton™ X-100, 1 M
·*··
NaCl pH 4,0, ja sitten sitä tasapainotettiin 5-10 pylvään tilavuudella puskuria, jonka *.T: koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3 % Triton™ X-100, 10 mM NaCl pH
4,0. Laimennetun detergenttifaasimateriaalin pH säädettiin arvoon 4,0, jolloin tapah- • *·· 25 tui saostumista. Tämä materiaali johdettiin selluloosa-asetaattia olevan suodatusyk- sikön, jossa huokoskoko oli 0,2 μΜ, läpi saostuneen materiaalin poistamiseksi. Suo-:*·*: datettu ja laimennettu detergenttifaasi kaadettiin tähän Q-Sepharose-pylvääseen ja :***: läpivirtaama (joka sisälsi PA321-L:ää) otettiin talteen. Pylväs pestiin 1-2 pylvään , tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3 % Tri- • · · ·«· .*·*. 30 ton™ X-100, 10 mM NaCl pH 4,0, ja tämä läpivirtaama yhdistettiin aikaisempaan 118591 36 läpiviiranneeseen fraktioon. Näiden yhdistettyjen läpivirtausfraktioiden pH säädettiin arvoon 7,5. Sitoutunut materiaali, kontaminoivat E. co/i-proteiinit, eluoitiin Q-Sepharose-pylväästä 2 pylvään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3 % Triton™ X-100, 1 M NaCl pH 4,0. Tässä esimerkissä ku-5 vattu puhdistusmenetelmä on kuvattu kaavamaisesti 7. kesäkuuta 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 08/475 781, ja joka sisällytetään oheen tällä viittauksella, kuviossa 11.
Esimerkki 4 10
Lipidoitumattoman PspA:n ilmentäminen ja puhdistaminen
Plasmidia pPA321-NL käytettiin E. co/r-kannan BL21(DE3)pLyS transformoimi-seksi. Transformoitu E. coli siirrostettiin LB-alustaan, joka sisälsi 30 pg/ml kana-15 mysiinisulfaattia ja 25 pg/ml kloramfenikolia. Viljelmää kasvatettiin yön yli ravis-telupullossa 37 °C:ssa.
„ ( Seuraavana aamima 50 ml yön aikana syntynyttä viljelmää siirrettiin 1 litraan LB- • **· *. *, alustaa, joka sisälsi 30 pg/ml kanamysiinisulfaattia, ja viljelmää kasvatettiin raviste- • · ♦ * · · 20 lupullossa 37 °C:ssa arviolta 3-5 tunnin ajan, jolloin optinen tiheys OD aallonpituu- |.'t della 600 nm oh alueella 0,6 - 1,0. Viljelyalustaan lisättiin IPTG:tä 0,5 mM olevaksi ··*♦ :*. lopulliseksi pitoisuudeksi ja viljelmää kasvatettiin vielä kaksi tuntia 30 °C:ssa. Vil- • ** :*j*. jelmät otettiin talteen sentrifugoimalla 4°C:ssa nopeudella 10 000 x g, ja so- lukasauma otettiin talteen. Lipidoitumaton PspA otettiin talteen tästä solukasaumas-25 ta.
* ··· • ψ • · ·♦·
Solukasauma suspendoitiin uudestaan PBS-huokseen määränä 30 g märkää solutah- naa litraan PBS-liuosta, Solususpensio pakastettiin ja sitä säilytettiin -20 °C:ssa. So- , lut sulatettiin huoneen lämpötilassa niiden hajottamiseksi. Tähän sulatettuun materi- ♦ · · ,···, 30 aaliin lisättiin DNaasi I:tä 1 pg/ml olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi ja seosta inku- boitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin seurauksena oU materiaalin visko- 37 1 1 8591 siteetin pieneneminen. Seosta sentrifugoitiin 4 °C:n lämpötilassa nopeudella 10 000 x g, ja solujen supematantti säästettiin, joka supematantti sisälsi lipidoitumatonta PspA:ta. Kasauma pestiin PBS-liuoksella, se sentrifugoitiin 4°C:ssa nopeudella 10 000 x g ja solujen supematantti yhdistettiin aikaisemmin saatuun solujen supema-5 tanttiin.
MonoQ-pylväs (Pharmacia) valmistettiin siten, että pylvästilavuus on 1 ml solujen supematantin jokaista 2 ml:aa kohden. Pylväs pestiin 2 pylvään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 1 M NaCl pH 7,5, ja sitten sitä 10 tasapainotettiin 5-10 pylvään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl pH 7,5. Yhdistetyt solujen supematantit kaadettiin tähän Q-Sepharose-pylvääseen ja läpivirtaama otettiin talteen. Pylväs pestiin 2-5 pylvään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2mM EDTA, 10 mM NaCl pH 7,5, ja läpivirtaama yhdistettiin aikaisempaan läpivirtaamaan.
15
Sitoutuneiden proteiinien eluointi aloitettiin ensimmäisellä vaiheella, jossa pylväs pestiin 5-10 pylvään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl pH 7,5. Toisessa eluointivaiheessa pylväs pestiin 5-10 pyi- • · * \ ·] vään tilavuudella puskuria, jonka koostumus oli 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 200 • · # • ** 20 mM NaCl pH 7,5. Tämä fraktio sisälsi lipidoitumatonta PspAita. Jäljellä olevat si- ··#
**** toutuneet kontaminoivat proteiinit poistettiin puskurilla, jonka koostumus oli 50 mM
• i* !"· Tris ja 2 mM EDTA pH 7,5, joka sisälsi 300 mM - IM NaCl.
4 I» ··« · * • · f Tässä esimerkissä kuvattu puhdistusprosessi on esitetty kaavamaisesti 7. kesäkuuta ··. 25 1995 jätetyn patenttihakemuksen, jonka saqanumero on 08/475 781, ja joka si-
• M
. · * *, säilytetään oheen tällä viittauksella, kuviossa 12.
« • · 9 t « I • *·· • · • · ··· * • * * ♦ • * · *·· 1 • · • f
»M
» 11»'»I
Esimerkki 5
Yhdistelmä-DNA-teknisen lipidoituneen PspA:n immunogeenisyys 5 Esimerkin 3 mukaisesti valmistetun, puhdistetun yhdistelmä-DNA-teknisen lipidoituneen PspArn immunogeenisyys testattiin hiirissä ja sitä verrattiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistetun lipidoitumattoman PspA:n immunogeenisyyteen. Tätä tutkimusta varten CBA/N-hiiret immunisoitiin ihon alaisesti injektoimalla niiden niskaan 0,5 ml seuraavia valmisteita, joissa PspA-antigeenin pitoisuus oli seuraava: 10
Koostumus PsPA antigeeni- _ pitoisuus RX1 kannan natiivi PsPA molekyyli (natiivi RX1) 200 ng/ml
Ei-lipidoitunut rekombinantti PsPA (pPA-321-NL) yksinään 200ja 1000 ng/ml PBS:ssä
Ei-lipidoitunut rekombinantti PsPA (pPA-321-NL) adsorboi- 200ja 1000 ng/ml tuna alunaan*
Lipidoitunut rekombinantti PsPA (pPA0321 -NL) yksinään 200ja 1000 ng/ml PBS:ssä
Lipidoitunut rekombinantti PsPA (pPA-321 -NL) adsor- 200 j a 1000 ng/ml : **: boituna alunaan*
Aluna* 0 ng/ml ·;· PBS 0 ng/ml • « · «M» • * ·.. * Aluna oli hydrogeeliä, jonka pitoisuus oli 200 pg/ml • * · • · « φ · · «
Neljä hiirtä immunisoitiin vuorokausina 0 ja 21 kulloinkin valmisteiden kum-15 mailakin annoskoolla. Hiiristä otettiin sitten verta vuorokautena 35 ja ne altistettiin ··* S. pneumoniae A66-kannalle. Tämän altistuksen jälkeen sen ajanjakson, jonka aika-na hiiret pysyivät elossa, pituus vuorokausina merkittiin muistiin ja eloon jääneistä :1: hiiristä otettiin verta vuorokausina 36, 37, 42 ja 46. Näistä myöhemmistä verinäyt- . .·. teistä määritettiin S. pneumoniae:n pesäkkeitä muodostavien yksiköiden lukumäärä ♦ · · • · · .···. 20 (CFU)/ml. 35. vuorokautena otetuista seerumeista määritettiin ELISA-menetelmällä ·*·* 118591 39
PspA:ta vastaan vaikuttavat vasta-aineet. Kuolemaa edeltävät vuorokaudet altistettujen hiirten tapauksessa on esitetty seuraavassa taulukossa.
Immuunien ja ei-immuunien CBA/M hiirien eloonjääminen
Immunisointi Teho
Ryh- Antigeeni annos Alu- päiviä kuo- p-arvoai- Elävät: p-arvo mä na lemaan ka kuo- kuolleet eloonkaan jäämi nen* #1A pPA-321-L 1,0 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #1B PpA-321-L 0,2 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #2A pPA-321-L 1,0 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #2B pPA-321-L 0,2 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #3A pPA-321-NL 1,0 - 1,1,2,2 n.s. 0:4 n.s.
#3B pPA-321-NL 0,2 - 1,1,2,>15 n.s. 1:3 n.s.
#4A pPA-321-NL 1,0 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #4B pPA-321-NL 0,2 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #5 FL-Rxl 0,2 - 4x>14 0,01 4:0 0,01 #6 ei yhtään 0,0 - 1,1,3,6 n.s. 0:4 n.s.
#7 ei yhtään 0,0 - 1,1,1,>15 n.s. 1:3 n.s.
yhdistetyt 0,0 5x1,3,6, -- 1:7 ei yhtään >15 • ♦ · • · ♦ · • · 5 Huom: * tarkoittaa riippuvuutta yhdistämällä saaduista vertailuista; kuolemaan joh-tanut aika, yksiosaisella kahden näytteen arvojärjestystestillä; eloonjääminen yk-siosaisella Fisher Exact-testillä. Laskeminen on toteutettu käyttäen yhtä osaa (one ·· • » • " tail), koska emme ole todenneet koskaan anti-PspA-immuniteetin aiheuttavan joh- «#· ♦ · · *·* * donmukaisesti alttiutta.
10 • · • · CFU-lukumäärä hiirten veressä on esitetty alla olevassa taulukossa.
• · • · • · · ··· • · « * · · * f * · • · • · • · · » « « · • · · « · · « · · • · • · *·· 40 118591 -c o τ3 ^ "Ö Ζχ 73 1Μ g! , τ' Ό . , , _χ Ό . _χ d Ιβ H -a Ό Τ3 Ό 73 Τ3 Τ5 τ) -Ο „ ^ Τ3 73 " J5 JT ödddd.ddäO.. fi ό So *1 -ι 1 11
___ 1 I
ζθ w _. 73 τ3 ^ « _χ VI g VO VO Ό VO ^3. •d' V£» Ν£) ^ 1 Ό . 1 g ! f f f ΐ ->· 3 I $ I 3 5 ^ 11 10 » » ^ » Ό· ; t t t ζ»
V «VI ,, „ I J
see t—I !2 1?
I___ω> I P
%. t- ••at' Zx 73 ' « J? S a
Ό- 1>- ~ ^ S 15 ~ί ^ ^ ^ _1 R 1 I
8 £ ^ yi 51 ^ -d ^ IS1 ^ ^ ·λ ^ -d .SS VI m r1 VI CN JS & ^ S ! 8 j 5 3 d ϋ a--- •I «λ tt ^ 73 1 3 2 .Λ r t-~ _, r^ _r t3 ^ § o u « °i t- <N d ^ _ Λ w„ <n 73 ^ M « .§ .2, ~ 1s k k 1° - K d λ «r Λ1 J ~ -3 a ΐ °i d - - »: n 1 °i rf - ^ λ 5 .2 g .S j1 °i. r; vd d ^ ^ d «>. d d ft - II" g ~ - y zr Zr d £ d - ~ d i' ^ a J ί i < 1 ^ vi M ^ ^ ^ d s d s S !
I ^ <3 <3 Vl <3 yj 3 v. d j J I
** · S 3 Ϊ3 3 • 1 · »S a ti • ·1 g--- M ‘3 ^ • 1 Ji 3 I I I I I I I I I I I CU 12 fi ··· & < s? 'o « -: I---1 Λ 1 ·:· n a j ‘S' • 1 1 1 t/3 Η π Ctf :1. 2 Οβ OCNO<NO<NO<N <NOO O 1¾¾ ··1 g3.^HO^HO^O^HOOOO o 3 1§ g ··· S ^ J2 <i> • · · ö _. £5 ---I I 1 a Iri |fl •:’" & I s s :-: I i2äi<-l;^d's-e 2 ·β -ia • ^ ΛΡ,Ρ,Ρ,Οη Ph (Xl pH ωω ... ^^^^ρ,ρ,ρ,ρ.
• · · • 1 — » I .......... -11...1.1.11.. ^- C!: i <PQ<PQ<CQ<PQ^v0r-. u
>1 O
. .·. oi 3 • · · ~ · · • · • · • · 1 118591 41 Näistä tuloksista nähdään, ettei tämä yhdistelmä-DNA-tekninen proteiini tuottanut suojaa, kun sitä injektoitiin yksinään. Yhdistelmä-DNA-tekninen antigeeni, johon oli lisätty apuaineeksi alunaa ja/tai PAJVLcys-Iipidiä, oli immunogeeninen ja suojaava. Luonnollinen, täysipituinen PspA-antigeeni ei tarvinnut apuainetta tuottaakseen suo-5 jän. Nämä CFU-tulokset osoittavat, että immunisoimalla suojatuissa hiirissä altistamiseen käytetty S. pneumoniae hävisi verestä kahdessa vuorokaudessa.
35. vuorokautena otettujen seerumeiden ELISA-määritys osoitti, että suojan muodostuminen hiirissä S. pneumoniae-aitistasta vastaan ja mitattavien vasta-10 ainevasteiden indusoituminen korreloivat hyvin keskenään. Sellaisten hiirten, jotka oli immunisoitu suolaliuoksessa olevalla lipidoitumattomalla antigeenillä (pPA-321-NL) tai negatiivisilla vertailuilla, jotka eivät sisältäneet PspA-antigeeniä, seerumeissa ei todettu minkäänlaisia havaittavia vasta-ainevasteita (kuten alla olevasta taulukosta nähdään). Todettiin, että hyvät vasta-ainevasteet syntyivät luonnolliselle RX1 15 PspA-antigeenille sekä yhdistelmä-DNA-tekniselle PspA:lIe, kun se oli lipidoitunut PAMscys-lipidillä tai kun se oli adsorboitu alunaan.
»» · • « · • ♦ • · • i a a a • ·· • · M· »M· Φ * ♦ · ·»» • a • · • *· ·«» • « • · · • · • · • * · • · · • · · ··· • aa « · · • Φ * *·· • · • f • · · • · a • · · ··· M* • « • · • · · 42 1 18591 safssFcfssilsgsfgfililil
(N OO (SO —- O O ©O O O O O O O (N O O O O O
25 o" o o' o O ^ O Q, o' £ O O o' Q o' o; o 3; o o o o S-----------«i *7? ΙΛ V5 3 y-v /-—s y—v y-v ✓—v y—\ y—v y*v /•“s y*"N _£3 c- o iTiCN O <N «OO (N — O (N M (NO '-'fr *£> ?£ >0 Z? "T 3 ö O t~- ·— tno 000 00 00 00 oo(N -3· £> f" ;£ 22 g g S3 eSoO"!tOr|—I—ιΟΟΟΟΟΟΟΛ—I O (Λ o o o o on ^ S<^ 0^0 0^0^0^0^0 0^000,0^000003, S' 3 -ts ?2 en =3___________4> •3 s •S 0 K y—S y“V y^s y-'·*, ___ y^V y^V y—V y“*\ CÖ _ Co't— ^^ΟΟΟΟΟ^ΟΟίηιηιον-ιΟζ'ΟΟΟΟ Η S # 00 — o f' « -t (Λ (N — O - O O — O (N Ο VO O^ O O^ O O g t u* ®soso'so‘eo‘Soso'sososo£°s|
il___________I
-¾ g J
5¾ ‘S y^s y*\ ys y*s y'v s y-\ _ y^ x y“N ’"Q
•S So^^eooincNCNC^Tt^oor^eevjr^^csogiSSä n 1-1 3θΓ'ίΝΟ«Λ·^-^0Γ'ββ^Η(ΝΟΟΙ>.«βτίΟ(ΝΓ>ΟΟΟΟ rt y — 5(NO^H«f-M·^· — OOOÖCNO^-^ONOOOOOtn a g M o' O « ξΓ o' 3; o' 3; o" o o' 3; o' 0; o' o, o o, o' 0, O O, rf aa s S I-----------3
i i -S
fl ^OONoor-QcNoo^oo ^ S iSoO-^-i^rO-iTO-OOOO^O—<-'0000(NO'0-~'000 ^ .5 *3 S 3 ® 3 ® n. ^ "i ο.δ. °„ <= 3 - r\ 3 n ® ® <= o g
ä 3^ ®e~s^sososososos^s°soejj .s H -S
1 —-----------1 ··. · O. ^ιΛιίΝΓ'ΟΓηΐΛίΝΓΝΓΝι^ΟιΤιΓ'Ι— t^Or^'tOOffimO^ , : , Οοοοοιλ>όι--(Νοο(Ν(<->(Ν(^(Νοο— <noee— ο~<ο ^ ·· v Ooeoeoococ*ir^·— ooooeo^o—^roooooojg • · Λ o' o —Γ o —Γ o*1 —* o" o"1 O*1 O o O © —Γ o o cT o o" o" te • ·,· w O W O' iOW5iyW^i,Wiiy O iOW5^WW!te • o! . ------------« • · · c
• ΓΛ O
···· o , ·.§ ... S »S 3 ··» « 3 n «Ί 3. *1 3 ·Λ 3 3 o o ^ ·· <*ö£|0 o o o O O o o o =5 * * a xr 3 * V w rt .·:·. « ·.· · a :cd
. .2 S
a fi, a a „ aa a -S
! ··· I Is a g· 5 '« “ g g a '“ g s !***: "S o :T: • (S N CS - ^·§ !g e ·***· 9-¾^ f? ίί > λ o § £ f < < i i 3 3 3 3 I g *· ·§ ... w «· * kss: ^ • · · • · • · ··« 43 118591
Passiivisen kokeen avulla haluttiin määrittää, oliko suoja ainakin osittain anti-PspA-vasta-ainevasteiden välittämää. BALB/c-hiiret immunisoitiin 0,5 pg:lla yhdistelmä-DNA-teknistä lipidoitunutta PspA:ta yksinään tai alunaan absorboituna, tai alunaan adsorboitua, yhdistelmä-DNA-teknistä lipidoitumatonta PspA:ta vuorokausina 0 ja 5 21; ja eläimistä otettiin verta 35. vuorokautena. Antiseerumit laimennettiin suhteessa 1:3 tai 1:15 suolaliuoksella ja 0,1 ml laimennosta injektoitiin i.p. kahteen hiireen kunkin laimennoksen tapauksessa. Negatiivisena vertailuna käytettiin normaalin BALB/c-hiiren seerumin 1/3-laimennosta. Tämän jälkeen, yhden tunnin kuluttua passiivisesta immunisoinnista, eläimet altistettiin laskimon sisäisesti S. pneumoniae 10 WU2-kannalla (15 000 CFU). Anti-PspA-seerumeilla passiivisesti immunisoiduissa hiirissä oli kehittynyt suoja verrattuna niihin hiiriin, joille annettiin normaalin hiiren laimennettuja seerumeita, kuten seuraavasta taulukosta nähdään.
BALB/c:n passiivinen suojaus WU2 vastaan
Immunisoiva koostumus PspA annos Seerumin Päiviä kuolemaan
PspA antigeeni Aluna (pg/eläin) laimennus altistuksen jälkeen _____ _ _ ^ >? ____15__2,4 \\s pPA-321-L Kyllä 0,5 3 >7, >7 15 4. >7 * · ____ _ ..
*.:! pPA-321-NL Kyllä 0,5 3 2,4 15 >7, >7 **· _ II*5 Ei yhtään Ei 0 3 2,2 • ’*· 15 ··· • · i * ’ Esimerkki 6 ·· • · • ··
Yhdistelmä-PspA/flunssa-rokote « « ··« ··· • * · *·' * 20 Esimerkissä 3 kuvatulla tavalla valmistettua, puhdistettua yhdistelmä-DNA-teknistä • n * · * · · · ’ lipidoitunutta PspA:ta j a esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistettua lipidoitumaton- ta PspA:ta yhdistettiin A/Texas-kannasta peräisin olevaan jaettuun flunssa-anti-geeniin.
118591 44 Nämä yhdistelmät sekä pelkkä influenssa-antigeeni joko sekoitettiin suolaliuokseen tai ne adsorboitiin suolaliuoksessa olevaan alunaan. Mikäli alunaa lisättiin, sen määrä pidettiin vakiona arvossa 100 pg/injektio ja PspA:n arvo pidettiin vakiona arvossa 5 0,5 pg/injektio. Influenssa-antigeeni laimennettiin pitoisuuksiin 0,5, 0,1, 0,02 ja 0,004 pg/injektio. Kunkin valmisteen tapauksessa neljä BALB/c-hiirtä immunisoitiin vuorokausina Oja 21, ja niistä otettiin verta vuorokautena 35. Sitten määritettiin näistä immunisoiduista hiiristä otetun seerumin kyky inhiboida kanan punaisten verisolujen agglutinoituminen A/Texas HA-antigeenin vaikutuksesta. Tuloksena olleet 10 hemagglutinaation inhibitio(HAI)-tiitterit on esitetty seuraavassa taulukossa.
Yhdistelmä-DNA-teknisen PspA:n ja influenssa-antigeenin yhdistelmillä saadut HAI-tfitterit
Flu anti- PsPA anti- Aluna Flunssa HA HAI tiit- HAI tiit-geeni geeni adsorptio annos terin terin (pg/injektio) GMT GMT:n
_______STD
A/Texas - - 0,5 28,1 3 A/Texas - - 0,1 21,8 6,6 F\: A/Texas - - 0,02 22,8 5,2 Λ.· A/Texas__-__-__0,004__16J3,8 ·:. A/Texas - - 0,5 12,4 53 A/Texas - - 0,1 23,8 3,3 A/Texas - - 0,02 19,2 2,8 : *** A/Texas - - 0,004 11,9 3,7 ··· -- - - — - V : A/Texas pPA-321-L - 0,5 794,8 2,6 A/Texas pPA-321-L - 0,1 452,5 2,7 A/Texas pPA-321-L - 0,02 54,2 6,9 A/Texas pPA-321-L - 0,004 36,7 4,9 T* A/Texas pPA-321-L - 0,5 51,9 4 O*: A/Texas pPA-321-L - 0,1 27,1 5,1 A/Texas pPA-321-L - 0,02 19,2 3,3 A/Texas pPA-321-L - 0,004 15,4 3,4
e · · I * Iin· ^—^J
• · · ^^—I
M· ««· i...· 15 118591 45
Taulukko jatkuu
Flu anti- PsPA anti- Aluna Flunssa HA HAI txit- HAI tiit-geeni geeni adsorptio annos terin terin
(pg/injektio) GMT GMT:n ____STD
A/Texas pPA-321-NL - 55 174,5 2,7 A/Texas pPA-321-NL - 0,1 59,1 3,4 A/Texas pPA-321-NL - 0,02 19,2 5,1 A/Texas pPA-321-NL -__0,004__H8__3,1 A/Texas pPA-321-NL - 0,5 35,1 2,7 A/Texas pPA-321-NL - 0,1 23,8 3 A/Texas pPA-321-NL - 0,02 14,8 2,9 A/Texas pPA-321-NL__0,004__10^2__2,6
Ei yhtään Ei yhtään - 0 7,1 1,9
Esimerkki 7 5 Lipidoitumattoman OspC:n ilmentäminen ja puhdistaminen
Lipidoitumatonta OspC:ta koodaavan kromosomaalisen geenikappaleen sisältävän plasmidivektorin käsittäviä E. coli JM 109-transfonnantteja valmistettiin ja kasvatet- • a · i .* tiin tavalla, joka on kuvattu patenttijulkaisussa WO 91/09870. Viljelmät otettiin tai- a a aaa *· 10 teen, viljelyalustaa sentrifiigoitiin nopeudella 10 000 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa, su- aaa **· j pematantti hylättiin ja kasauma otettiin talteen.
a*· • ••a • a a · a · · Tämä solukasauma suspendoitiin ensin hajotuspuskuriin A, joka sisälsi 50 nM Tris- a · a HC1 pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 5 % glyserolia ja 0,4 mg/ml lysotsyymia, •*( 15 ja tätä suspensiota sekoitettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten tähän so- a aa .···. lususpensioon lisättiin tuotetta TRITON™ X-100 1 paino-% olevaksi pitoisuudeksi, a a aaa DNaasi I:tä lisättiin pitoisuudeksi 1 pg/ml ja suspensiota sekoitettiin huoneen lämpö- aaa aaa tilassa edelleen 20 minuuttia solujen hajottamiseksi. Sitten tähän solususpensioon a a *·* lisättiin natriumkloridia IM pitoisuudeksi ja suspensiota sekoitettiin jälleen 4 °C:n aaa **j*‘ 20 lämpötilassa edelleen 20 minuuttia. Sitten suspensiota sentrifiigoitiin nopeudella a a a a aaa 4« 118591 20 000 x g 30 minuuttia, tuloksena saatu supematantti erotettiin kasaumasta ja kasauma hylättiin.
Erotettua supematanttia dialysoitiin sellaista puskuria vastaan, jonka koostumus oli 5 50 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA. Sitten supematantti kaadettiin DEAE-Sepharose CL-6B-pylvääseen ja lipidoitumaton OspC otettiin talteen pylvään läpivirtaamasta. Tätä läpivirtaamaa dialysoitiin 0,1 M fosfaattipuskuria, pH 6,0, vastaan.
Sitten dialysoitu läpivirtaama sidottiin S-Sepharose-pikavirtauspylvääseen, jota oli 10 tasapainotettu 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 6,0. Puhdistettu lipidoitumaton OspC eluoitiin tämän jälkeen tästä S-Sepharose-pylväästä dialyysipuskurilla, johon oli lisätty 0,15 M NaCl.
Tämän hyvin puhtaan lipidoitumattoman OspC:n vesiliuos analysoitiin Coomassie-15 väsätyillä geeleillä. Tuotteen puhtaudeksi arvioitiin yli 80 %.
Esimerkki 8 ·1 9 • · · • ·1 Lipidoitumattomalla OspC:lla saadun vasteen voimistaminen lipidoituneella • 9 20 OspAdla • 99 9 ···· 9
«M
•(”! Esimerkissä 7 kuvatulla tavalla valmistetun ja puhdistetun, yhdistelmä-DNA- • · *... teknisen lipidoitumattoman OspCrn immunogeenisyys hiirissä testattiin yhdistettynä 9 9 9 • 99
puhdistettuun lipidoituneeseen OspA:han (valmistettu patenttijulkaisussa WO
.. 25 92/14488 esitetyllä tavalla) tai ilman sitä. Valmisteita annettiin joko yhdessä apu- • ·· aineena toimivan alunan kanssa tai ilman sitä. Tässä kokeessa testattu antigeeniannos • · *·1 oli 1 pg annosta kohden. Tässä tutkimuksessa 4-8 viikon ikäiset C3H/He-hiiret 999 9 9 9 *·)/ immunisoitiin vuorokautena Oja niille annettiin tehoste vuorokausina 21 ja 42.
• · ··· 9 9 • · 9 9 9 9 • 99 99 9 9 118591 47
Kolmesta edustavasta eläimestä otettiin verta vuorokausina 21,42,63 ja 91. ELISA-määritykset toteutettiin näillä seerumeilla käyttäen pinnoittavana antigeeninä puhdistettua, lipidoitumatonta OspC:ta.
5 Ainoat tässä tutkimuksessa syntyneet havaittavat OspC ELISA-vasteet saatiin OspC:ta ja alunaa sisältävällä valmisteella. Kuitenkin, kun lipidoitunutta OspAita sisällytettiin alunaan, OspC ELISA-vaste oli 20 kertaa suurempi vuorokautena 63 (kuten kuviosta 1 nähdään) ja S kertaa suurempi vuorokautena 91 (kuten kuviosta 2 nähdään). Minkäänlaista ilmeistä vaikutusta immuunivasteeseen ei todettu, kun lipi-10 doitunutta OspA:ta sisällytettiin valmisteeseen ilman alunaa.
Esimerkki 9
Ureaasin ja OspA:n yhdessä tuottaman vasteen analyysi sylkirauhasen EL1S-15 POT-määrityksellä
Hiiret (CH3/HeN; 4 - 5/ryhmä) immunisoitiin limakalvon kautta alla olevassa taulukossa esitetyillä antigeeneillä vuorokausina 0 ja 28. Proteiinit laimennettiin PBS- if · • · · i . * liuokseen 25 μ1:η lopulliseksi tilavuudeksi nenän sisäistä antamista varten ja 0,5 ml:n • · • · t *· " 20 lopulliseksi tilavuudeksi mahan sisäistä antamista varten. Hiiret tapettiin ELISPOT- ··· ··· j määrityksiä varten vuorokausina 15 -17 toisen immunisoinnin jälkeen.
··· e ··«« i» * ELISPOT-menettely on johdettu menettelystä, joka on kuvattu julkaisussa Mega et « · · * a/., J. Immunol, (1992), 148:2030 - 2039. Sylkirauhaset erotettiin välittömästi hiiren 25 tappamisen jälkeen ja ne laitettiin suureen tilavuuteen RPMI 1640-alustaa (Gibco).
• ·♦
Elimet leikeltiin pieniksi palasiksi (lxl mm) käyttäen automaattista kudosleikkuria • · ’·' (Mclllwain-kudosleikkuri, The Mickle Laboratory Engineering, Gilford, GB), ja • · · *·^* sitten niitä pilkottiin 2 ml:ssa RPMI 1640-alustaa, joka sisälsi 5 % sikiövasikan see- • · .'* rumia ja 1 mg/ml tyypin IV kollagenaasia (Sigma), 30 minuuttia 37 °C:ssa samalla 30 varovasti sekoittaen. Nämä pilkotut solut ja kappaleet johdettiin 70 μΜ suodattimen • ti • · *♦··* (Falcon) läpi ja pilkkominen toistettiin vielä kolme kertaa. Pilkotut solut yhdistettiin 48 1 1 8591 ja ne pestiin kahdesti suurella tilavuudella alustaa. Sitten yhdistettyjä soluja hajotettiin Gey:n liuoksella 4 minuuttia jäissä. Vielä kahden huuhtelun jälkeen solut sus-pendoitiin uudestaan 2 inkaan alustaa (+5 % sikiövasikan seerumia), laskettiin ja jaettiin 96-kuoppaisille nitroselluloosalevyille (MILLIPORE). Levyjä oli pinnoitettu 5 yön yli jackbean-pavun ureaasilla (20 pg/ml; Boehringer Mannheim) tai OspA:lla (10 pg/ml; Connaught) fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, 4 °C:ssa, ja sitten niitä oli kyllästetty täydellisellä alustalla 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Kuoppiin laitettiin kaksi soluista tehtyä viisinkertaista laimennosta (100 μΐ/kuoppa) neljänä rinnakkais-näytteenä kunkin laimennoksen ja kunkin isotyypin tapauksessa. Sen jälkeen, kun 10 soluja oli pidetty 4-16 tuntia 37°:ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % CO^ta, soluja hajotettiin 2x5 minuuttia PBS/Tween 20 (0,005 %) -puskurissa ja biotinyloituja anti-isotyyppi-vasta-aineita (Amersham) lisättiin kahdeksi tunniksi huoneen lämpötilassa (laimennos 1/1000). Kolmen PBS-Tween-huuhtelun jälkeen biotmyloitua streptavi-diini-peroksidaasi-kompleksia (Amersham) lisättiin 1 tunniksi (laimennos 1/500), ja 15 sitten täplät saatiin näkyviin 3,9-aminoetyylikafbatsolilla (SIGMA). Lun levyt olivat kuivuneet, täplät laskettiin kuvan leikkelymikroskoopilla (suurennos 16x tai 40x). Arvot ovat kunkin eläinryhmän tapauksessa laskettuja 4 kuopan keskiarvoja.
·· · • · · • · *. *, Kuten alla olevasta taulukosta nähdään, todettiin, että limakalvon kautta annettu lipi- • ♦ · • 9Φ 20 doitunut OspA-lipoproteiini, ilman lisättyä apuainetta, tuotti hyvin voimakkaat pai-kalliset IgG- ja IgA-vasteet, kun taas lipidoitumatan OspA ei tuottanut minkäänlaisia ·*’ havaittavia vasteita. Samoin todettiin, että OspA:lla on voimakas apuainevaikutus * ·· . ·: ·. ureaasilla saatuun paikalliseen vasteeseen.
• · « ·· • · • ·· m ··· • 9 • · ·*· * · · • » « e·· • · • ♦ ··» m • · # • · ♦ ·«· • · • · ··« 118591 49
Anti Ure Anti Osp täpliä/106 täpliä/106 solut solut
pg Jackbean Ure pg OspA annostelu- IgA IgG IgA IgG
reitti IL i.n. n.d. n.d. 583 345 1NL i.n. n.d. n.d. 4 2 20 - i.n. 11 0 n.d. n.d.
20 IL__Ln.__189 18 742 257 10__10L__ίη.__191 39 1237 174 20-CT 10 pg__-__Ln.__478 42 n.d. n.d.
20__-__i.n.,ig. 0 1 25 0 20__10L i.n.,i.g. 322 31 1919 177 i.n.« nenän sisäinen i.n., i.g. = nenän sisäinen & mahan sisäinen (esitetty annos annettiin kummallakin tavalla)
5 L = lipidoitunut OspA; NL - lipidoitumaton OspA
CT = koleratoksiini [10 pg CTB + 10 ng CTX/hiiri (PMSV)] • · n.d. = ei määritetty • ·· * · ··♦ * il. Esimerkki 10 ···· io • ·· ELISA-määritys seerumissa läsnä olevien, OspArta ja ureaasia vastaan vaikut-tavien vasta-aineiden mittaamiseksi · m m • mm m
Hiiret (CH3/HeN; 4 - 5/ryhmä) immunisoitiin limakalvon kautta esimerkissä 9 esite- .··*. 15 tyn taulukon mukaisilla antigeeneillä vuorokausina 0 ja 28. Proteiinit laimennettiin ♦ · · .···, PBS-liuokseen 25 μ1:η lopulliseksi tilavuudeksi nenän sisäistä antamista varten ja • · ·. 0,5 ml:n lopulliseksi tilavuudeksi mahan sisäistä antamista varten. Verta otettiin 9 • · < • · · 11 * vuorokautta toisen immunisoinnin j älkeen.
• · • · ··· 118591 50 ELISA-määritystä varten 96 laakeapohjaista kuoppaa käsittävät mikrotiitterilevyt (Dynatech) pinnoitettiin 100 μΐ/kuoppa liuoksia 1 pg/ml OSpA (Connaught) tai 2 pg/ml jackbean ureaasi (Boehringer Mannheim), laimennettuina 0,1M natriumkar-bonaattipuskurilla, pH 9,6. Levyjä pinnoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa.
5
Seuraavana päivänä levyt pestiin 4x PBS/0,05% Tween 20-puskurilla ja niitä salvattiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa PBS-liuoksella, joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia. Vielä toisen huuhtelun jälkeen jokaiseen kuoppaan laitettiin 100 μΐ PBS-liuosta, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:ta ja 0,1 % naudan seerumin al-10 bumiinia (PBS/T/B). Kussakin tyhmässä siihen kuuluvien hiirten seerumit yhdistettiin ja niistä tehtiin laimennossarja, ja levyjä inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Huuhtelun jälkeen lisättiin 2° vasta-aineena biotinyloitua vuohen anti-hiiri IgG-tai -IgA-vasta-ainetta (Amersham), laimennettuna suhteessa 1/5000 PBS/T/B-liuoksella, ja levyjä inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Levyt huuhdottiin 15 jälleen ja sitten niillä inkuboitiin 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa streptavidiinin ja piparjuuren peroksidaasin välistä konjugaattia (Amersham) laimennettuna suhteessa 1/2000 PBS/T/B-liuoksella. Viimeisen huuhtelun jälkeen lisättiin substraattia, OPD (Sigma), ja levyjä inkuboitiin 10-20 minuuttia. Lopuksi reaktio pysäytettiin • · · : .* lisäämällä 50 μΐ 2N HaSCVliuosta, ja levyt mitattiin aallonpituudella 490/650 nm ·** * *· " 20 Molecular Devices-levynlukulaitteen avulla. Kuvioissa 3,4 ja 5 esitetyistä tuloksista «*· ···; nähdään, että limakalvon kautta annettu lipidoitunut OspA indusoi hyvin voi- • · · makkaan seerumi-IgG-vasteen päin vastoin kuin lipidoitumaton OspA. Lisäksi lipi- • · *... doituneella OspA:lla oli voimakas apuainevaikutus seerumissa urean vaikutuksesta • · · • · · * kehittyneeseen IgG-vasteeseen.
25 • · • · · "... Vaikka esillä olevan keksinnön tietyt edulliset suoritusmuodot onkin nyt kuvattu • · II) yksityiskohtaisesti, niin selvää on kuitenkin, etteivät edellä olevan kuvauksen mit- • · · * ·) # * kään erityiset yksityiskohdat rajoita liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa määritel- • · *;·’ tyä keksintöä, sillä sen lukuisat ilmeiset muunnokset ovat mahdollisia sen hengestä 30 ja tavoitteista kuitenkaan poikkeamatta.
« · · • « • · • · ·

Claims (41)

51 1 1 8591
1. Vähintään yhtä antigeeniä käsittävän ensimmäisen koostumuksen ja antigeenistä lipoproteiinia käsittävän toisen koostumuksen käyttö immunologisen vasteen 5 indusointiin isännässä tarkoitetun lääkkeen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että antigeeninen lipoproteiini on hybridinukleiinihappomolekyylin ilmentymistuote, joka hybridimolekyyli käsittää lipoproteiinin signaalisekvenssiä koodaavan ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin ja kypsää, ensimmäisen nukleiinihapposek-venssin koodaamaan lipoproteiiniin nähden heterologista proteiinia tai sen osaa 10 koodaavan toisen nukleiinihapposekvenssin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeniä ja lipoproteiinia annetaan samanaikaisesti.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeenissä on bakteeriproteiinin epitooppeja.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeni on ureaa- ·· » • · ♦ ί .· si. • • · · *· *: 20
··« ···] 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeni on jokin Ml ;;** muu Borrelia-antigeem kuin Osp A. • » • M ··· • ♦ · • · I
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeni on OspC. 25
• · • · · ]··.( 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että lipoproteiini on *· * luonnollisesti lipidoitunut lipoproteiini. • · · • · · • M
• · *:*’ 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että lipoproteiini ei ole 30 luonnollisesti lipidoitunut lipoproteiini. ··· • · • · ··« 118591 52
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että signaalisekvenssi on erään Borrelia-lajin OspA-proteiinin signaalisekvenssi, ja että sekvenssit rajoittuvat toisiinsa.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että ensimmäinen nuk- leiinihapposekvenssi ja toinen nukleiinihapposekvenssi ovat kytkeytyneet toisiinsa siten, että muodostuu translaation mahdollistava avoin lukukehys.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kypsä prote-10 iini on erään Borrelia-lajin OspC-proteiini tai sen kappale.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kypsä proteiini on eräästä Borrelia burgdorferi -kannasta peräisin oleva OspC-proteiini.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tämä Borrelia burgdorferi -kanta on valittu kantojen B31, ACA1 ja Ip90 joukosta.
14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kypsä proteiini • · · :4 ·’ on PspA tai sen kappale. • · · *· " 20 • · * •*'j
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeni on in- ·· · fluenssa-antigeeni. • * • ·· M* • · · • · ♦
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeni on HA- ;·( 25 antigeeni. • M • · · • · • · • ·
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että lipoproteiini on *:!.* ospA. • · • I • · ·
18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeniä ja lipo- «·· • · ‘ · · · * proteiinia annetaan limakalvon kautta. 53 1 1 8591
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeniä ja lipoproteiinia annetaan nenän sisäisesti.
20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeniä ja lipoproteiinia annetaan mahan sisäisesti.
21. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antigeeniä ja lipoproteiinia annetaan sekä nenän sisäisesti että mahan sisäisesti. 10
22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että immunologinen vaste on hoitava.
23. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että immunologinen 15 vaste on ennalta ehkäisevä.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että koostumus käsittää edelleen apuainetta. ·1 · • ♦ · • · • · • · • 1 1 ’· " 20 25. Rokote tai immunogeeninen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus käsit- • · « ··· j tää tehokkaan määrän vähintään yhtä antigeeniä; ja tehokkaan määrän vähintään *·» ;;· yhtä antigeenistä lipoproteiinia, jolloin antigeeninen lipoproteiini on hybridinukle- • · iinihappomolekyylin ilmentymistuote, joka hybridimolekyyli käsittää lipoproteii- • · · I 4 · nin signaalisekvenssiä koodaavan ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin ja kyp- ..
25 sää, ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin koodaamaan lipoproteiiniin nähden • ·· | · ·. a heterologista proteiinia tai sen osaa koodaavan toisen nukleiinihapposekvenssin. * · ··· • · · • 1 · * · ·
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että • · • · ‘ l 1 antigeenissä on bakteeriproteiinin epitooppeja. 30 ♦ ··· 118591 54
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että antigeeni on ureaasi.
28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että 5 antigeeni on j okin muu Borrelia-antigeem kuin OspA.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että antigeeni on OspC.
30. Patenttivaatimuksen 25 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että lipoproteiini on luonnollisesti lipidoitunut lipoproteiini.
31. Patenttivaatimuksen 25 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että lipoproteiini ei ole luonnollisesti lipidoitunut lipoproteiini. 15
32. Patenttivaatimuksen 25 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että signaalisekvenssi on erään Borrelia-lajin OspA-proteiinin signaalisekvenssi, ja että sekvenssit rajoittuvat toisiinsa. • · · • · · « · • · • a *. ‘1 20
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että • · a ···! ensimmäinen nukleiinihapposekvenssi ja toinen nukleiinihapposekvenssi ovat • S* kytkeytyneet toisiinsa siten, että muodostuu translaation mahdollistava avoin lu- • · :i((" kukehys. • a e « · · .. 25
34. Patenttivaatimuksen 32 tai 33 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, • a • · · että kypsä proteiini on erään Borrelia-lajin OspC-proteiini tai sen kappale. • · • i« ··· • · t
*·* 35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että • 9 ·;*’ kypsä proteiini on eräästä Borrelia burgdorferi -kannasta peräisin oleva OspC- 30 proteiini. «·« • 9 118591 55
36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että tämä Borrelia burgdorferi -kanta on valittu kantojen B31, ACA1 ja Ip90 joukosta.
37. Patenttivaatimuksen 33 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että kypsä proteiini on PspA tai sen kappale.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että antigeeni on influenssa-antigeeni. 10
39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että antigeeni on HA-antigeeni.
40. Patenttivaatimuksen 25 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että 15 lipoproteiini on erään Borrelia-lajin OspA.
41. Jonkin patenttivaatimuksen 25 - 40 mukainen rokote tai koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen apuainetta. ·· · • · · « · * · • · • · · * ·· « · ·*· ··«· ·*· ··»· ·» • » • ·· ·· • · « • · · ·· • · * · · ··· • · • · • « · *·· • · · • · Φ ··» • Φ • · ··» • · · • · · ··· ··· • · • · ··· 56 118591
FI974423A 1995-06-07 1997-12-05 Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö FI118591B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/476,656 US6251405B1 (en) 1995-06-07 1995-06-07 Immunological combination compositions and methods
US47665695 1995-06-07
US08/588,621 US6379675B1 (en) 1995-06-07 1996-01-19 Immunological combination compositions and methods
US58862196 1996-01-19
US9608866 1996-06-05
PCT/US1996/008866 WO1996040290A1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Immunological combination compositions and methods

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI974423A0 FI974423A0 (fi) 1997-12-05
FI974423A FI974423A (fi) 1998-02-04
FI118591B true FI118591B (fi) 2008-01-15

Family

ID=23892726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI974423A FI118591B (fi) 1995-06-07 1997-12-05 Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö

Country Status (12)

Country Link
US (5) US6251405B1 (fi)
EP (1) EP0831937B1 (fi)
JP (1) JPH11510370A (fi)
AT (1) ATE249844T1 (fi)
AU (1) AU717890B2 (fi)
CA (1) CA2223041A1 (fi)
DE (1) DE69630033T2 (fi)
FI (1) FI118591B (fi)
IL (1) IL118579A (fi)
NO (1) NO975620L (fi)
WO (1) WO1996040290A1 (fi)
ZA (1) ZA964894B (fi)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7008625B2 (en) 1993-11-01 2006-03-07 Research Foundation Of The State University Of New York Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
ZA964896B (en) * 1995-06-07 1997-01-08 Connaught Lab Expression of lipoproteins
US6841161B1 (en) * 1997-05-14 2005-01-11 Galen (Chemicals) Limited Topical compositions
EP1015591A2 (en) * 1997-09-18 2000-07-05 Pasteur Mérieux Connaught Improved method of production of pneumococcal surface proteins
WO2000000218A1 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 Aventis Pasteur Immunisation a ciblage mucosal
EP2266604A3 (en) 1998-10-16 2011-05-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant systems and vaccines
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
DK1187629T3 (da) 1999-04-19 2005-01-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Adjuvanssammensætning omfattende saponin og et immunostimulerende oligonucleotid
EP1194559B1 (en) 1999-06-18 2006-09-20 Research Foundation Of State University Of New York Groups of borrelia burgdorferi that cause lyme disease in humans
CA2390747A1 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Institut Pasteur Systemic immune response induced by mucosal administration of lipid-tailed polypeptides without adjuvant
AU8640501A (en) * 2000-07-31 2002-02-13 Univ Yale Innate immune system-directed vaccines
US20030232055A1 (en) * 2000-07-31 2003-12-18 Ruslan Medzhitov Innate immune system-directed vaccines
EP1939294A1 (en) 2000-08-18 2008-07-02 Research Foundation Of State University Of New York Recombinant constructs of borrelia burgdorferi
ES2298249T3 (es) 2000-08-18 2008-05-16 Research Foundation Of State University Of New York Ospa modificada de borrelia burgdorferi.
US20030175287A1 (en) * 2001-01-03 2003-09-18 Yale University Innate immune system-directed vaccines
EP1411770A4 (en) 2001-07-05 2006-05-10 Chiron Corp POLYNUCLEOTIDES CODING FOR ANTIGENIC C-TYPE HIV POLYPEPTIDES, POLYPEPTIDES AND THEIR USE
US7923023B2 (en) * 2002-02-25 2011-04-12 Astech International LLC Method and composition for delivery of medicants to animals
US20080299140A1 (en) * 2002-05-24 2008-12-04 The Regents Of The University Of California, Immunogenic Composition and Peptide Sequences for Prevention and Treatment of an Hsv Condition
FR2846004B1 (fr) * 2002-10-16 2006-06-23 Maco Pharma Sa Composition pour culture de cellules notamment animales ou de tissus, comprenant du polyethylene glycol
US7795223B2 (en) * 2004-05-27 2010-09-14 Novozymes Biopharma Au Ltd. Treatment of inflammatory airway disease
JP2008509168A (ja) 2004-08-13 2008-03-27 マーシャル，バリー，ジェー． 細菌デリバリシステム
US8029777B2 (en) 2004-08-13 2011-10-04 Marshall Barry J Helicobacter system and uses thereof
US8420102B2 (en) 2006-03-07 2013-04-16 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin
US8426163B2 (en) * 2007-12-07 2013-04-23 National Health Research Institutes Production of lipidated proteins in E. coli
US8466259B2 (en) * 2007-12-07 2013-06-18 National Health Research Institutes Adjuvants
JP2011518338A (ja) 2008-04-22 2011-06-23 リサーチ ファンデーション オブ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク ボレリア・ブルグドルフェリ（ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のアレイ
US8287880B2 (en) 2009-06-02 2012-10-16 National Health Research Institutes Lipidated vaccine against dengue virus infection
CN102482327B (zh) * 2009-06-22 2014-10-29 财团法人卫生研究院 脂质化肿瘤相关抗原及其免疫治疗的组成物及方法
CA2773637A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
TW201221642A (en) 2010-11-15 2012-06-01 Nat Health Research Institutes Method of producing lipidated polypeptides
TWI507413B (zh) 2010-11-15 2015-11-11 Nat Health Research Institutes 脂質化多抗原表位疫苗
CA2823325C (en) 2010-12-29 2017-09-26 Oceanspar, Inc. Center spar fish pen
AU2014359292B2 (en) * 2013-12-03 2019-02-28 Swiss Tropical And Public Health Institute Proline-rich peptides protective against S. pneumoniae
EP3213076A1 (en) 2014-10-07 2017-09-06 The Research Foundation for The State University of New York Recombinant borrelia proteins and methods of use thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) * 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US4302386A (en) * 1978-08-25 1981-11-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
EP0014815A3 (de) 1978-12-20 1980-10-29 Ciba-Geigy Ag Peptidderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte sowie pharmazeutische Präparate mit einer dieser Verbindungen
US4258029A (en) 1979-04-23 1981-03-24 Connaught Laboratories Limited Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
US4455142A (en) 1980-07-07 1984-06-19 Alza Corporation Method of coadministering an antigen and an immunopotentiator
US4484923A (en) * 1982-03-25 1984-11-27 Alza Corporation Method for administering immunopotentiator
DE3521994A1 (de) 1985-06-20 1987-01-02 Bayer Ag N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
US4839293A (en) * 1986-02-24 1989-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA encoding streptavidin, streptavidin produced therefrom, fused polypeptides which include amino acid sequences present in streptavidin and uses thereof
US4721617A (en) 1986-08-14 1988-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Vaccine against lyme disease
EP0270295A3 (en) * 1986-12-03 1989-08-02 Connaught Laboratories Limited Conjugate vaccine
US4879213A (en) * 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US5098997A (en) * 1987-12-11 1992-03-24 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for Haemophilus influenzae
AU4338489A (en) 1988-09-20 1990-04-18 Marvin Murray Accelerated microdilution determination of bacteria susceptibility to antibiotics
ATE140461T1 (de) 1989-12-22 1996-08-15 Mikrogen Molekularbiol Entw Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff
CA2032914A1 (en) * 1989-12-26 1991-06-27 Peter C.K. Lau Use of bacterial lipoprotein amino terminus in fusion plasmids for in vivo expression of lipid modified polypeptides
ATE168132T1 (de) 1991-02-15 1998-07-15 Uab Research Foundation Strukturgen von pneumokokken-protein
ATE181572T1 (de) * 1991-08-15 1999-07-15 Smithkline Beecham Biolog Ospa proteine von borrelia burgdorferi untergruppen, dafür kodierende gene sowie impfstoffe
WO1993007897A1 (en) * 1991-10-21 1993-04-29 Medimmune, Inc. Bacterial expression vectors containing dna encoding secretion signals of lipoproteins
EP0540457A1 (en) * 1991-10-22 1993-05-05 Symbicom Ab Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
CA2105629A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-15 Robert S. Becker Potentiation of immunogenic response
AU5958594A (en) * 1992-12-24 1994-07-19 Med Immune, Inc. Method of protection against (streptococcus pneumoniae) with transformed mycobacteria
FR2708622B1 (fr) * 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.

Also Published As

Publication number Publication date
US7235243B2 (en) 2007-06-26
EP0831937B1 (en) 2003-09-17
NO975620L (no) 1998-02-04
ZA964894B (en) 1997-02-24
ATE249844T1 (de) 2003-10-15
IL118579A (en) 2007-12-03
FI974423A0 (fi) 1997-12-05
EP0831937A4 (en) 2001-09-19
NO975620D0 (no) 1997-12-04
CA2223041A1 (en) 1996-12-19
DE69630033T2 (de) 2004-04-01
IL118579A0 (en) 1996-10-16
WO1996040290A1 (en) 1996-12-19
JPH11510370A (ja) 1999-09-14
EP0831937A1 (en) 1998-04-01
AU717890B2 (en) 2000-04-06
US6379675B1 (en) 2002-04-30
US20080089911A1 (en) 2008-04-17
DE69630033D1 (de) 2003-10-23
US6984385B2 (en) 2006-01-10
US20060110408A1 (en) 2006-05-25
US6251405B1 (en) 2001-06-26
AU6151996A (en) 1996-12-30
FI974423A (fi) 1998-02-04
US20020131983A1 (en) 2002-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118591B (fi) Immunologiset yhdistelmäkoostumukset ja niiden käyttö
US7960535B2 (en) Recombinant lipidated PsaA protein, methods of preparation and use
KR100399258B1 (ko) 비독성경구용어쥬번트로써효과적인장독소돌연변이체
JP4091112B2 (ja) リポタンパク質の発現
US20050260225A1 (en) Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens
Medina et al. Fibronectin‐binding protein I of Streptococcus pyogenes is a promising adjuvant for antigens delivered by mucosal route
JP2003520765A (ja) ポルフィロモナス・ジンジヴァリスによる歯周炎の治療及び予防のための保護エピトープを含有する合成ペプチド
US20080175868A1 (en) Vaccine
US6538118B1 (en) Expression of lipoproteins
JP2003519089A (ja) 肺炎球菌表面型蛋白質配合ワクチン
JPH11240844A (ja) 肺炎球菌抗原の経口投与
JP2004529601A (ja) 組換えインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質
AU2003204215B2 (en) Recombinant Lipidated PsaA Protein, Methods of Preparation and Use
MXPA00007261A (en) RECOMBINANT LIPIDATED PsaA PROTEIN, METHODS OF PREPARATION AND USE

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118591

Country of ref document: FI