JP2011083287A - ナイセリア属のタンパク質のハイブリッド発現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】これらのアプローチは、典型的に発現レベル、精製の容易さ、発現の細胞内局在、および/または発現タンパク質の免疫学的特性に影響する。本発明は、2つの利点を提供する。第1に、それ自体では不安定またはほとんど発現され得ないタンパク質は、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって支援され得る。第2に商業生産が簡素化される(2つの別個に有用なタンパク質を生成するために、たった1つの発現および精製しか使用される必要がない)。したがって、本発明は、2つ以上の本発明のタンパク質の同時異種発現のための方法を提供し、この方法において、その2つ以上の本発明のタンパク質は融合される(すなわち、それらは、単一ポリペプチド鎖として翻訳される)。
【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質発現の分野に存在する。特に、Neisseria(例えば、N.gonorrhoeae、または好ましくはN.meningitidis)由来のタンパク質の異種発現に関する。
特許文献1〜4は、Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningitidis由来のタンパク質を開示する。これらのタンパク質は、N末端GST融合物またはC末端Hisタグ融合物のいずれかとして、E.coli中で発現される(すなわち、異種発現)ように、典型的に記載されるが、他の発現系(ネイティブのNeisseriaでの発現を含む)もまた開示される。
これらのタンパク質の異種発現のための代替的かつ改善されたアプローチを提供することが本発明の目的である。これらのアプローチは、典型的に発現レベル、精製の容易さ、発現の細胞内局在、および/または発現タンパク質の免疫学的特性に影響する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) 本発明の2以上のタンパク質の非相同的発現を同時に起こすための方法であって、ここで(a)本発明の2以上のタンパク質が融合される、方法。
(項目2) 項目1に記載の方法であって、前記2以上のタンパク質は、(a)919および287;(b)953および287;(c)287およびORF46.1;(d)ORF1およびORF46.1;(e)919およびORF46.1;(f)ORF46.1、287および919;(g)919および519;ならびに(h)ORF97および225である、方法。
(項目3) 287が、タンパク質(a)、(b)または(c)のC−末端にある、項目2に記載の方法。
(項目4) 前記発現が、E.coli宿主においてである、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(項目5) 項目1〜4のいずれかに記載の方法によって発現される、タンパク質。
(項目6) 式NH 2 −A−B−COOHのハイブリッドタンパク質であって、AおよびBが、異なるナイセリア属のタンパク質である、ハイブリッドタンパク質。
(項目7) AおよびBが、orf1、orf4、orf25、orf40、orf46、orf83、233、287、2921、564、687、741、907、919、953、961および983からそれぞれ選択される、項目6に記載のタンパク質。
(項目8) AおよびBが、ORF46.1、287、741、919、953、961および983からそれぞれ選択される、項目7に記載のタンパク質。
(項目9) 前記ORF46.1、287、741、919、953、961および983の少なくとも1つが、本質的に全長形態において使用される、項目8に記載のタンパク質。
(項目10) 前記ORF46.1、287、741、919、953、961および983の少なくとも1つが、欠失を有する、項目8または項目9に記載のタンパク質。
(項目11) Aおよび/またはBが、ポリ−グリシン欠失(‘ΔG’)を有する、項目10に記載のタンパク質。
(項目12) Aおよび/またはBが、ΔG−287、ΔGTbp2、ΔG741、またはΔG983である、項目11に記載のタンパク質。
(項目13) Aおよび/またはBが、短縮型タンパク質である、項目10に記載のタンパク質。
(項目14) Aおよび/またはBが、Δ1−287、Δ2−287、Δ3−287、またはΔ4−287である、項目13に記載のタンパク質。
(項目15) Aおよび/またはBのドメインが、欠失される、項目10に記載のタンパク質。
(項目16) Aおよび/またはBが、287B、287C、287BC、ORF461−433、ORF46433−608、ORF46、または961cである、項目15に記載のタンパク質。
(項目17) Aおよび/またはBが、(a)919および287;(b)953および287;(c)287およびORF46.1;(d)ORF1およびORF46.1;(e)919およびORF46.1;(f)ORF46.1および919;(g)919および519;または(h)ORF97および225である、項目6に記載のタンパク質。
(項目18) 前記タンパク質が、ΔG287−919、ΔG287−953、ΔG287−961、ΔG983−ORF46.1、ΔG983−741、ΔG983−961、ΔG983−961C、ΔG741−961、ΔG741−961C、ΔG741−983、ΔG741−ORF46.1、ORF46.1−741、ORF46.1−961、ORF46.1−961C、961−ORF46.1、961−741、961−983、961C−ORF46.1、961C−741、961C−983、961CL−ORF46.1、961CL−741または961CL−983である、項目17に記載のタンパク質。
(項目19) AまたはBが、287である、項目8に記載のタンパク質。
(項目20) Bが、287である、項目19に記載のタンパク質。
(項目21) Aが、ΔG−287である、項目19に記載のタンパク質。
(項目22) Bが、ORF46、919、953または961である、項目21に記載のタンパク質。
(項目23) 287が、株2996または株394/98由来である、項目19〜22のいずれか1項に記載のタンパク質。
(項目24) Aが、961である、項目8に記載のタンパク質。
(項目25) AおよびBが、同じ株由来である、項目6〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。
(項目26) AおよびBが、直接的に結合する、項目6〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。
(項目27) AおよびBが、リンカーペプチドを介して結合する、項目6〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。
(項目28) 前記リンカーペプチドが、ポリ−グリシンリンカーであり、ただし、Bが、ΔGタンパク質でない、項目27に記載のタンパク質。
本発明にしたがって、2つ以上(例えば、3,4,5,6、またはそれ以上)の本発明のタンパク質が、単一のハイブリッドタンパク質として発現される。非ナイセリア属融合パートナー(例えば、GSTまたはポリHis)が使用されないことが好ましい。
異種宿主を利用することが好ましい。その異種宿主は、原核生物であってもまたは真核生物であってもよい。その異種宿主は、適切なE.coliであるが、他の好ましい宿主としては、Bacillus subtilis、Vibrio cholerae、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria lactamica、Neisseria cinerea、Mycobacteria(例えば、M.tuberculosis)、酵母などが挙げられる。
上記の方法と同様に、本発明は、以下を提供する:(a)これらの方法に有用な核酸およびベクター、(b)上記ベクターを含む宿主細胞、(c)上記方法によって発現されたタンパク質または発現可能なタンパク質、(d)これらのタンパク質を含む組成物であり、例えばワクチン、または診断試薬または免疫原性の組成物として適切であり得る組成物、(e)医薬(例えば、ワクチン)または診断試薬としての使用のためのこれらの組成物(f)以下の(1)〜(3)の製造においてのこれらの組成物の使用:(1)ナイセリア属細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬、(2)ナイセリア属細菌の存在の検出またはナイセリア属細菌に対して惹起される抗体の存在の検出のための診断試薬、および/または(3)ナイセリア属細菌に対する抗体を惹起し得る試薬、および(g)患者の処置方法であって、これらの組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む方法。
本発明はまた、以下の実施例に示されるいずれかの配列を有するタンパク質または核酸を提供する。本発明はまた、これらに対する配列同一性を有するタンパク質および核酸も提供する。上記のように、「配列同一性」の程度は、好ましくは50%より大きい(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上)。
WO99/24578、WO99/36544、およびWO99/57280に開示される2166個のタンパク質配列は、本明細書において以下の配列番号により言及される:
(a)配列番号1〜4326の配列の1つ;または
(b)配列番号1〜4326の1つに対して配列同一性を有する配列;または
(c)配列番号1〜4326の1つのフラグメント。
「核酸」に対する言及が、DNAおよびRNAを含むこと、そしておよびこれらのアナログ(例えば、改変された骨格を含むもの)、およびペプチド核酸(PNA)なども含むことが理解される。
287における(Gly)6配列の欠失は、タンパク質発現に対して劇的な影響を有することが見出された。GGGGGGまでのN末端アミノ酸を欠くこのタンパク質は、「ΔG287」と呼ばれる。MC58株において、この基本配列(下線部のリーダーペプチド)は:
同じハイブリッドタンパク質を2996ではなくニュージーランド株394/98を用いて作製した:
C末端Hisタグを有するか、またはそのリーダーペプチドを有さないがC末端Hisタグを有する全長としての287の発現は、かなり低い発現レベルを示す。より良い発現は、N末端GST融合物を用いて達成される。N末端融合物のパートナーとしてGSTを用いる代替として、287を、タンパク質919(「919−287」)、タンパク質953(「953−287」)およびタンパク質ORF46.1(「ORF46.1−287」)のC末端に配置した。いずれ場合においても、リーダーペプチドを除去し、そしてハイブリッドは直接的なインフレーム融合物であった。
本発明のさらなるハイブリッドタンパク質を図面に示し、そしてそれらは以下に示す配列を有する。個々のタンパク質と比較した場合、これらは有益である:
(クローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチド設計)
目的の抗原をコードする遺伝子を、N.meningitidis B MC58のゲノム配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドを使用する、PCRによって増幅した。他に示されない限り、2996株由来のゲノムDNAを、PCR反応におけるテンプレートとして常に使用し、そしてその増幅したフラグメントを、発現ベクターのpET21b+(Novagen)にクローン化して、C末端Hisタグ化産物としてタンパク質を発現させるか、またはpET−24b+(Novagen)にクローン化して、「非タグ化」形態(例えば、ΔG 287K)のタンパク質を発現させた。
Tm1=4(G+C)+2(A+T) (テールを除外)
Tm2=64.9+0.41(%GC)−600/N (プライマー全体)。
N.meningitidis株 2996、MC58、394.98、1000およびBZ232(ならびに他の株)を、100mlのCG培地中に対数期まで増殖し、遠心分離によって収集し、そして5mlの緩衝液(20% w/vスクロース、50mM Tris−HCl、50mM EDTA、pH8)中に再懸濁した。氷上で10分間のインキュベーション後、この細菌を10mlの溶解溶液(50mMのNaCl、1% Na−Sarkosyl、50μg/ml プロテイナーゼK)を添加することによって溶解し、そしてこの懸濁液を、37℃で2時間インキュベートした。2回のフェノール抽出(pH8に平衡化した)および1回のCHCl3/イソアミルアルコール(24:1)抽出を行った。DNAを、0.3Mの酢酸ナトリウムおよび2容量のエタノールの添加によって沈殿させ、そして遠心分離によって収集した。このペレットを、70%(v/v)エタノールで一回洗浄し、そして4.0mlのTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)中に再溶解した。DNA濃度を、OD260の読み取りによって測定した。
この標準PCRプロトコルは以下の通りであった:2996、MC581000もしくはBZ232株由来の200ngのゲノムDNA、または組換えクローンの10ngのプラスミドDNA調製物を、40μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、400〜800μMのdNTP溶液、1×PCR緩衝液(1.5mM MgCl2を含む)、2.5ユニットのTaqI DNAポリメラーゼ(Perkin−Elmer AmpliTaQ、Boerhingher Mannhein ExpandTM Long Template)の存在下でテンプレートとして使用した。
増幅したフラグメントに対応する精製したDNAを、pET−21b+、pET−22b+またはpET−24b+へのクローニングに適切な制限酵素を用いて消化した。消化したフラグメントを、QIAquick PCR精製キットを(製造業者の指示に従って)使用して精製し、そして、H2Oまたは10mM Tris(pH8.5)のいずれかで溶出した。プラスミドベクターを適切なこれらの制限酵素を用いて消化し、1%アガロースゲルにロードし、そして消化したベクターに対応するバンドを、Qiagen QIAquick Gel Extraction Kitを用いて精製した。
予め消化および精製した、各遺伝子に対応するフラグメントを、pET21b+、pET22b+またはpET24b+中に連結した。3:1のモル比のフラグメント/ベクターを、T4 DNAリガーゼと共に、製造業者によって供給される連結緩衝液中で用いた。
各遺伝子を発現ベクター中にクローニングした後、組換えプラスミドを、組換えタンパク質の発現に適したE.coli株中に形質転換した。各構築物の1μlを使用して、E.coli BL21−DE3を、上記のように形質転換した。単一の組換えコロニーを、Amp(100μg/ml)を加えた2mlのLBに播種し、37℃で一晩でインキュベートし、次いで、100mlのフラスコ中でAmp(100μg/ml)を加えた20mlのLB中に1:30で希釈し、0.1と0.2との間のOD600を得た。このフラスコを、OD600が発現の誘導に適した対数増殖を示すまで(0.4〜0.8のOD)、回転型水浴振とう機中で30℃または37℃でインキュベートした。タンパク質発現を、1.0mM IPTGの添加によって誘導した。30℃または37℃での3時間のインキュベーションの後、OD600を測定し、そして発現を試験した。1.0mlの各サンプルを微量遠心機で遠心分離し、ペレットをPBS中で再懸濁し、そしてSDS−PAGEおよびクマシーブルー染色によって分析した。
287の種々の形態を、2996およびMC58株からクローン化した。それらは、C末端Hisタグ化融合物と共に構築され、そしてそれらは、成熟形態(アミノ酸18〜427)、欠失(Δ1、Δ2、Δ3およびΔ4)を伴う構築物ならびにBドメインまたはCドメインのいずれかから構成されるクローンを含んだ。His融合物として精製される各クローンについて、単一のコロニーをストリークし、そしてLB/Amp(100μg/ml)寒天プレート上で37℃にて一晩増殖させた。このプレートから単離されたコロニーを、20mlのLB/Amp(100μg/ml)液体培地中に播種し、そして攪拌しながら37℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、1.0LのLB/Amp(100μg/ml)液体培地中に1:30で希釈し、そしてOD550が0.6〜0.8に達するまで最適な温度(30〜37℃)で増殖させた。組換えタンパク質の発現をIPTGの添加(最終濃度1.0mM)によって誘導し、そして培養物をさらに3時間インキュベートした。細菌を、8000gで15分間、4℃で遠心分離することによって回収した。細菌のペレットを、(i)可溶性タンパク質のための冷却緩衝液A(300mM NaCl、50mM リン酸緩衝液、10mM イミダゾール、pH8.0)または(ii)不溶性タンパク質のための緩衝液B(10mM Tris−HCl、100mM リン酸緩衝液、pH8.8および必要に応じて8Mの尿素)のいずれかの7.5ml中に再懸濁した。可溶性形態において精製されたタンパク質には、287−His、Δ1、Δ2、Δ3およびΔ4287−His、Δ4287MC58−His、287c−Hisならびに287cMC58−Hisが含まれた。タンパク質287bMC58−Hisは、不溶性であり、従って精製した。細胞を、Branson sonifier 450を使用し、氷上で、30秒間、40Wでの4回の超音波処理により破砕し、そして4℃で30分間、13000×gで遠心分離した。不溶性タンパク質について、ペレットを2.0ml 緩衝液C(6M 塩酸グアニジン、100mM リン酸緩衝液、10mM Tris−His、pH7.5)中に再懸濁し、そしてダンス型ホモジナイザー中に10回通して処理した。このホモジネートを、13000gで30分間遠心分離し、そして上清を保持した。可溶性および不溶性調製物の両方についての上清を、150μlのNi2+−樹脂(適切なように、緩衝液Aまたは緩衝液Bのいずれかで予め平衡化した)と混合し、そして30分間穏やかに撹拌をしながら、室温でインキュベートした。この樹脂は、製造者プロトコルに従って調製された、Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)であった。このバッチ式調製物を、700gで5分間、4℃で遠心分離し、そして上清を破棄した。この樹脂を10mlの緩衝液Aまたは緩衝液Bを用いて10分間、2回洗浄し(バッチ式)、1mlの緩衝液AまたはB中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、(i)4℃で緩衝液Aを、または(ii)室温で緩衝液Bを用いて、フロースルーのOD280が0.02〜0.01に達するまで洗浄し続けた。この樹脂を、(i)冷却緩衝液C(300mM NaCl、50mM リン酸緩衝液、20mM イミダゾール、pH8.0)または(ii)緩衝液D(10mM Tris−HCl、100mM リン酸緩衝液、pH6.3および必要に応じて8Mの尿素)のいずれかで、フロースルーのOD280が0.02〜0.01に達するまでさらに洗浄した。このHis融合タンパク質を、(i)冷却溶出緩衝液A(300mM NaCl、50mM リン酸緩衝液、250mM イミダゾール、pH8.0)または(ii)溶出緩衝液B(10mM Tris−HCl、100mM リン酸緩衝液、pH4.5および必要に応じて8Mの尿素)のいずれかの700μlを添加することによって溶出し、そしてOD280が全ての組換えタンパク質が得られたことを示すまで、画分を回収した。各溶出画分の20μlのアリコートを、SDS−PAGEによって分析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて評価した。
287bMC8を可溶化するために変性が必要とされるので、免疫の前に再生工程を用いた。グリセロールを、上記で得られた変性した画分に添加し、10% v/vの最終濃度を得た。このタンパク質を透析緩衝液I(10% v/v グリセロール、0.5M アルギニン、50mM リン酸緩衝液、5.0mM 還元型グルタチオン、0.5mM 酸化型グルタチオン、2.0M 尿素、pH8.8)を使用して200μg/mlに希釈し、そして同じ緩衝液に対して、4℃で12〜14時間透析した。さらなる透析を、緩衝液II(10% v/v グリセロール、0.5M アルギニン、50mM リン酸緩衝液、5.0mM 還元型グルタチオン、0.5mM 酸化型グルタチオン、pH8.8)を用いて4℃で12〜14時間実行した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて推定した:
タンパク質(mg/ml)=(1.55×OD280)−(0.76×OD260)
(免疫化)
Balb/Cマウスを、0日目、21日目および35日目に抗原で免疫し、そして血清を、49日目に分析した。
無莢膜化Men M7および莢膜化株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして5%CO2で37℃において一晩インキュベーションした。細菌のコロニーを、滅菌ドラコン(dracon)スワブを使用してアガープレートから回収し、そして0.25%のグルコースを含むMueller−Hinton Broth(Difco)に播種した。細菌の増殖を30分毎に、OD620を追跡することによりモニターした。ODが0.4〜0.5の値に達するまで増殖させた。この培養物を、4000rpmで10分間遠心分離した。この上清を捨て、そして細菌を、PBSで2回洗浄し、0.025%のホルムアルデヒドを含むPBS中に懸濁し、そして37℃で1時間インキュベーションし、次いで攪拌しながら4℃で一晩インキュベーションした。100μlの細菌細胞を96ウェル Greinerプレートの各ウェルに添加し、そして4℃で一晩インキュベーションした。次いで、各ウェルを、PBT洗浄緩衝液(PBS中に0.1%のTween−20)で3回洗浄した。200μlの飽和緩衝液(水中に2.7%のポリビニルピロリドン10)を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを37℃で2時間インキュベーションした。ウェルを、PBTで3回洗浄した。200μlの希釈血清(希釈緩衝液:PBS中に1%のBSA、0.1%のTween−20、0.1%のNaN3)を、各ウェルに添加し、このプレートを37℃で2時間インキュベーションした。ウェルを、PBTで3回洗浄した。希釈緩衝液に1:2000に希釈した100μlのHRP結合化ウサギ抗マウス(Dako)血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、37℃で90分間インキュベーションした。ウェルをPBT緩衝液で3回洗浄した。HRPに対する100μlの基質緩衝液(25mlのクエン酸緩衝液pH5、10mgのO−フェニルジアミンおよび10μlのH2O2)を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、20分間室温で放置した。100μlの12.5%H2SO4を、各ウェルに添加し、OD490を追跡した。このELISA力価を、免疫前のレベルより上の0.4のOD490値を与えた血清の希釈として任意で計算された。このELISAを、0.4のOD490での血清の希釈が1:400より高い場合、陽性と見なした。
無莢膜化Men M7株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして5%CO2で37℃において一晩インキュベーションした。細菌コロニーを、滅菌ドラコンスワッブを使用してアガープレートから回収し、そして0.25%のグルコースを含むMueller−Hinton Broth(Difco)を各8ml含有する4つのチューブに播種した。細菌の増殖を30分毎に、OD620を追跡することによりモニターした。この細菌を、ODが0.35〜0.5の値に達するまで増殖させた。この培養物を、4000rpmで10分間遠心分離した。この上清を捨て、そしてこのペレットを、ブロッキング緩衝液(PBS中の1%BSA、0.4%のNaN3)に再懸濁し、そして4000rpmで5分間遠心した。細胞を0.05のOD620に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。100μlの細菌細胞を、Costar96ウェルプレートの各ウェルに添加した。(ブロッキング緩衝液中の)100μlの希釈血清(1:100、1:200、1:400)を、各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で2時間インキュベーションした。細胞を4000rpmで5分間遠心し、上清を吸引し、そして細胞を、各ウェルに200μl/ウェルのブロッキング緩衝液を添加することによって洗浄した。1:100に希釈された、100μlのR−フィコエリトリン結合化F(ab)2ヤギ抗マウスを、各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で1時間インキュベーションした。細胞を、4000rpmでの5分間の遠心分離によってスピンダウンし、そして200μl/ウェルのブロッキング緩衝液の添加によって洗浄した。この上清を、吸引し、そして細胞を、200μl/ウェルのPBS(0.25%のホルムアルデヒド)中で再懸濁した。サンプルをFACScanチューブに移して、そして読み取った。FACScan設定の条件(Laser Power 15mW)は、以下のとおりである:FL2オン;FSC−H閾値:92;FSC PMT電圧:E 01;SSC PMT:474;増幅利得 6.1:FL−2 PMT:586;補償値:0。
N.meningitidis株2996を、5%CO2で37℃においてチョコレートアガープレート上で一晩増殖した(凍結ストックから開始した)。コロニーを、回収しそして0.05から0.08のOD620に達するように0.25%のグルコースを含む7mlのMuller−Hinton brothへの播種に使用した。この培養物を、OD620が0.23〜0.24の値に達するまで攪拌しながら37℃で約1.5時間インキュベーションした。細菌を、105のCFU/mlの作用希釈において10mMのMgCl2、10mMのCaCl2および0.5%(w/v)のBSA(アッセイ緩衝液)を含む50mMのリン酸緩衝液pH7.2に希釈した。最終反応混合物の総量は、試験血清の段階2倍希釈の25μl、作用希釈における細菌の12.5μl、乳仔ウサギ補体の12.5μl(最終濃度25%)を有する50μlであった。
MenB株2996由来の精製タンパク質(500ng/レーン)、外膜小胞(5μg)および全細胞抽出物(25μg)を、12%SDS−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。この転写を、2時間、150mA、4℃で転写緩衝液(0.3% Trisベース、1.44% グリシン、20%(v/v)メタノール)中で行った。この膜を飽和緩衝液(PBS中の10% スキムミルク、0.1% Triton X100)中での4℃の一晩のインキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液(PBS中の3% スキムミルク、0.1% Triton X100)を用いて2回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に1:200に希釈したマウス血清とともに、2時間37℃でインキュベートした。この膜を2回洗浄し、そして1:2000希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識化抗マウスIgとともに90分間インキュベートした。この膜をPBS中の0.1% Triton X100を用いて2回洗浄し、そしてOpti−4CN基質キット(Bio−Rad)を用いて、発色させた。この反応を、水を添加して停止した。
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