DE60126249T2

DE60126249T2 - Heterologe expression von neisseria-proteinen

Info

Publication number: DE60126249T2
Application number: DE60126249T
Authority: DE
Inventors: Maria Beatrice Arico; Maurizio Comanducci; Cesira Galeotti; Vega Masignani; Marzia Monica Guiliani; Mariagrazia Pizza
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: EP1947187A1; CN1800385B; ES2391153T3; JP2011101657A; US20040092711A1; CN1544462A; DK1790660T3; CN1201011C; DE60132978D1; CN100473663C; ES2360746T3; CA2875231A1; JP2013005816A; CN100334214C; CA2689666A1; RU2002125882A; AU2001239488B2; US9150898B2; CA2400562A1; EP1259627A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Proteinexpression. Speziell betrifft sie die heterologe Expression von Proteinen aus Neisseria (z.B. N. gonorrhoeae oder bevorzugt N. meningitidis).
STAND DER TECHNIK
Die internationalen Patentanmeldungen WO 99/24578 , WO 99/36544 , WO 99/57280 und WO 00/22430 offenbaren Proteine von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae. Diese Proteine werden üblicherweise als in E. coli exprimiert beschrieben (d.h. heterologe Expression), entweder als N-terminale GST-Fusionen oder als C-terminale His-Tag-Fusionen, obgleich auch andere Expressionssysteme, einschließlich der Expression in nativen Neisseria offenbart sind. FR-A-2720408 offenbart die heterologe Produktion eines N. meningitidis-Proteins, in dem mindestens eine Domäne deletiert worden ist.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, alternative und verbesserte Methoden für die heterologe Expression dieser Proteine bereitzustellen. Diese Methoden wirken sich typischerweise auf den Expressionsspiegel, die Einfachheit der Aufreinigung, die zelluläre Lokalisierung der Expression und/oder die immunologischen Eigenschaften des exprimierten Proteins aus.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Protein ,961', welches in WO 99/57280 offenbart ist. Die in WO 99/24578 , WO 99/36544 und WO 99/57280 verwendeten Konventionen der Benennung werden hierin verwendet (z.B. ,ORF4', ,ORF40', ,ORF40-1' etc. wie in WO 99/24578 und in WO 99/36544 verwendet; ,m919', ,g919' und ,a919' etc. wie in WO 99/527280 verwendet.
Das bevorzugte Protein der Erfindung '961' wird in N. meningitidis der Serogruppe B gefunden.
Das zur Verwendung gemäß der Erfindung bevorzugte Protein '961' stammt von dem N. meningitidis-Stamm 2996 der Serogruppe B oder vom Stamm 394/98 (einem Stamm aus Neuseeland). Sofern nicht anderweitig angegeben, sind die hierin erwähnten Proteine aus dem N. meningitidis-Stamm 2996. Es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht allgemein auf den Stamm beschränkt ist. Bezugnahmen auf ein bestimmtes Protein (z.B. ,287', ,919' etc.) können so aufgefasst werden, dass sie jenes Protein von einem beliebigen Stamm einschließen.
Auf Domänen basierende Expression
Bei dieser Methode einer heterologen Expression wird das Protein ,961' in Form von Domänen exprimiert. Dies kann in Verbindung mit Fusionssystemen (z.B. GST- oder His-Tag-Fusionen) verwendet werden.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur heterologen Expression des Proteins ,961' von N. meningitidis bereit, wobei

(a) das Protein 961 die Aminosäuresequenz '961' in Stamm MC58 hat:

(b) zumindest eine Domäne des Proteins deletiert wurde, wobei die Domänen von ,961' in Stamm MC58 folgendermaßen sind: (1) Aminosäuren 1 bis 23; (2) Aminosäuren 24 bis 268; (3) Aminosäuren 269 bis 307; und (4) Aminosäuren 308 bis 364,

Das Verfahren wird normalerweise die Schritte umfassen: Erlangen einer Nucleinsäure, die ein Protein codiert; Bearbeiten dieser Nucleinsäure, um mindestens eine Domäne aus dem Protein zu entfernen. Die so erhaltene Nucleinsäure kann in einen Expressionsvektor eingesetzt werden oder kann bereits Teil eines Expressionsvektors sein. In Fällen, in denen keine Fusionspartner verwendet werden, ist die erste Aminosäure des exprimierten Proteins diejenige einer Domäne des Proteins.
Ein Protein wird normalerweise in vermutete Domänen unterteilt, indem man es mit bekannten Sequenzen in Datenbanken abgleicht und dann Regionen des Proteins bestimmt, die voneinander unterschiedliche Anordnungsmuster zeigen.
Wenn man ein Protein in Domänen unterteilt hat, können diese (a) einzeln exprimiert werden, (b) aus dem Protein deletiert werden, z.B. Protein ABCD → ABD, ACD, BCD etc. oder (c) neu angeordnet werden, z.B. Protein ABC → ACB, CAB etc. Diese drei Strategien können, sofern gewünscht, mit Fusionspartnern kombiniert werden.
Die Domänen des Proteins ,961' sind in 12 dargestellt.
Hybridproteine
Das Protein ,961' kann Teil eines Hybrids von zwei oder mehreren (z.B. 3, 4, 5, 6 oder mehr) Neisseria-Proteinen sein, die als ein einziges Hybridprotein exprimiert werden. Es ist bevorzugt, dass kein Nicht-Neisseria-Fusionspartner (z.B. GST oder His-Tag) verwendet wird.
Dies bietet zwei Vorteile. Erstens, kann ein Protein, das alleine unstabil ist oder gering exprimiert wird, durch das Hinzufügen eines geeigneten Hybridpartners unterstützt werden, der dieses Problem überwindet. Zweitens wird die kommerzielle Herstellung vereinfacht – es muss nur eine Expression und Aufreinigung durchgeführt werden, um zwei für sich gesehen nützliche Proteine zu produzieren.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren für die gleichzeitige heterologe Expression von Protein 961 mit einem oder mehreren Neisseria-Proteinen bereit, in dem die Proteine fusioniert sind (d.h. sie werden als einzelne Polypeptidkette translatiert). Das Verfahren wird typischerweise die Schritte umfassen: Erlangen einer ersten Nucleinsäure, welche ein erstes erfindungsgemäßes Protein codiert; Erlangen einer zweiten Nucleinsäure, welche ein zweites erfindungsgemäßes Protein codiert; Ligieren der ersten und der zweiten Nucleinsäure. Die so erhaltene Nucleinsäure kann in einen Expressionsvektor eingesetzt werden oder kann bereits Teil eines Expressionsvektors sein.
Bevorzugt werden die ProteinBestandteile in einem Hybridprotein gemäß der Erfindung vom selben Stamm kommen.
Die fusionierten Proteine in dem Hybrid können direkt miteinander verbunden sein oder können über ein Linkerpeptid verknüpft sein, z.B. über einen Poly-Glycin-Linker (z.B. G_n, wobei n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr ist) oder über eine kurze Peptidsequenz, was die Clonierung erleichtert. Es ist offensichtlich bevorzugt, nicht ein ΔG-Protein mit dem C-Terminus eines Poly-Glycin-Linkers zu verknüpfen.
Den fusionierten Proteinen können native Leader-Peptide fehlen oder diese können die Leader-Peptidsequenz des N-terminalen Fusionspartners beinhalten.
Die mit „X" bezeichneten Hybride der Form NH₂-A-B-COOH in der folgenden Tabelle sind bevorzugt:

↓A B→ ORF46.1 287 741 919 953 961 983

ORF46.1 X

287 X

741 X

919 X

953 X

961 X X X X X X

983 X
Bevorzugte Proteine, die als Hybride mit dem Protein ,961' exprimiert werden sollen, sind somit ORF46.1, 287, 741, 919, 953 und 983. Diese können in ihrer im Wesentlichen Volllänge-Form verwendet werden oder man kann Poly-Glycin-Deletionsformen (ΔG) verwenden (z.B. ΔG-287, ΔGTgbp2, ΔG741, ΔG983 etc.) oder man kann verkürzte Formen verwenden (z.B. Δ1-287, Δ2-287 etc.) oder man kann Versionen verwenden, in denen Domänen deletiert wurden (z.B. 287B, 287C, 287BC, ORF46_1-433, ORF46_433-608, 961c etc.).
In Fällen, in denen 287 verwendet wird, geschieht dies bevorzugt am C-terminalen Ende eines Hybrids; wenn es am N-Terminus verwendet werden soll, ist es bevorzugt, eine ΔG-Form von 287 zu verwenden (z.B. als den N-Terminus eines Hybrids mit 961).
In Fällen, in denen 287 verwendet wird, stammt dies bevorzugt vom Stamm 2996 oder vom Stamm 394/98.
,961' ist bevorzugt am N-Terminus. In solchen Hybriden werden bevorzugt Domänen-Formen von 961 verwendet. Anordnungen von polymorphen Formen von ORF46, 287, 919 und 953 sind in WO 00/66741 offenbart. Jede beliebige dieser polymorphen Formen kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Heterologer Wirt
Während eine Expression des Proteins 961 oder eines Hybrids davon in dem nativen Wirt stattfinden kann (d.h. dem Organismus, in dem das Protein in der Natur exprimiert wird), verwendet die vorliegende Erfindung einen heterologen Wirt. Der heterologe Wirt kann eukaryontisch oder prokaryontisch sein. Bevorzugt handelt es sich dabei um E. coli, aber andere geeignete Wirte umfassen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (z.B. M. tuberculosis), Hefe etc.
Vektoren etc.
Ebenso wie die vorstehend beschriebenen Verfahren stellt die Erfindung (a) Nuclein säuren und Vektoren bereit, die für diese Verfahren nützlich sind, (b) Wirtszellen, welche diese Vektoren enthalten, (c) Proteine, welche durch die Verfahren exprimiert werden oder mit deren Hilfe exprimierbar sind, (d) Zusammensetzungen, welche diese Proteine umfassen, die zum Beispiel als Impfstoffe oder als diagnostische Reagenzien oder als immunogene Zusammensetzungen geeignet sein können, (e) diese Zusammensetzungen zur Verwendung als Medikamente (z.B. als Impfstoffe) oder als diagnostische Reagenzien, (f) die Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Herstellung (1) eines Medikaments zur Behandlung oder zur Vorbeugung einer auf Neisseria zurückzuführenden Infektion, (2) eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis des Vorhandenseins von Neisseria-Bakterien oder von Antikörpern, welche gegen Neisseria-Bakterien induziert worden sind und/oder (3) eines Reagenz, welches Antikörper gegen Neisseria-Bakterien induzieren kann und (g) ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge dieser Zusammensetzungen an den Patienten.
Sequenzen
Die Erfindung stellt auch ein Protein oder eine Nucleinsäure bereit, welche eine beliebige der in den folgenden Beispielen dargelegten Sequenzen aufweisen. Sie stellt auch Proteine und Nucleinsäuren bereit, die mit diesen Sequenz-identisch sind. Wie vorstehend beschrieben, ist der Grad der Sequenzidentität bevorzugt größer als 50% (z.B. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder mehr).
Darüber hinaus stellt die Erfindung Nucleinsäuren bereit, welche an die in den Beispielen offenbarten Nucleinsäuren hybridisieren können, bevorzugt unter Bedingungen hoher Stringenz (z.B. 65°C in einer 0,1 × SSC, 0,5% SDS-Lösung).
Die Erfindung verwendet auch Nucleinsäuren, die Proteine codieren, welche in der Erfindung verwendet werden.
Man sollte sich auch im Klaren darüber sein, dass die Erfindung Nucleinsäuren bereitstellt, die Sequenzen umfassen, welche komplementär zu denjenigen sind, die vorstehend beschrieben sind (z.B. für Antisense- oder Sonden-Zwecke).
Eine erfindungsgemäße Nucleinsäure kann natürlich auf viele Arten hergestellt werden (z.B. durch chemische Synthese, aus genomischen oder cDNA-Banken, aus dem Organismus selbst etc.) und kann verschiedene Formen annehmen (z.B. einzelsträngig, doppelsträngig, Vektoren, Sonden etc.).
Darüber hinaus schließt der Begriff „Nucleinsäure" DNA und RNA ein, und auch deren Analoga wie z.B. jene, die modifizierte Gerüste enthalten, und auch Peptidnucleinsäuren (PNA) etc.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
4 zeigt Expressionsdaten für das Protein 961.
12 zeigt Domänen des Proteins 961.
14 zeigt 26 erfindungsgemäße Hybridproteine.
ARTEN, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
Beispiel 5 – pSM214 und pET-24b-Vektoren
Das Protein 953 wurde mit seiner nativen Leader-Sequenz und ohne Fusionspartner von dem pET-Vektor und auch von pSM214 [Velati Bellini et al., J. Biotechnol. 18: 177-192 (1991)] exprimiert.
Die Sequenz 953 wurde als ein Volllänge-Gen in pSM214 cloniert, wobei der E. coli-Stamm MM294-1 als Wirt verwendet wurde. Um dies zu tun, wurde die gesamte Sequenz des 953-Gens (vom ATG bis zum Stopcodon) mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:

953L for/2 CCGGAATTCTTATGAAAAAAATCATCTTCGCCGC EcoRI

953L rev/2 GCCCAAGCTTTTATTGTTTGGCTGCCTCGATT HindIII

welche EcoRI- bzw. HindIII-Restriktionsstellen enthalten. Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und mit dem Vektor pSM214 ligiert, der mit denselben zwei Enzymen verdaut worden war. Das ligierte Plasmid wurde in E. coli MM294-1-Zellen transformiert (durch eine Inkubation in Eis für 65 Minuten bei 37°C) und die Bakterienzellen auf LB-Agar ausplattiert, welcher 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt.
Man ließ rekombinante Kolonien über Nacht bei 37°C in 4 ml LB-Nährmedium wachsen, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt; die Bakterienzellen wurden abzentrifugiert und Plasmid-DNA extrahiert und durch Restriktion mit EcoRI und HindIII analysiert. Um die Fähigkeit der rekombinanten Kolonien zu untersuchen, das Protein zu exprimieren, impfte man diese in LB-Nährmedium an, welches 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt und ließ sie für 16 Stunden bei 37°C wachsen. Die Bakterienzellen wurden abzentrifugiert und in PBS resuspendiert. Die Expression des Proteins wurde mittels SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Blau untersucht.
Die Expressionsspiegel von dem Plasmid pSM214 waren unerwartet hoch.
Die Oligos, die dazu verwendet wurden, ,961'-Sequenzen in die pSM214-Vektoren zu clonieren, waren wie folgt:
Diese Sequenzen wurden wie für 953L beschrieben bearbeitet, cloniert und exprimiert.
Für den Vektor pET-24 wurden die Sequenzen cloniert und die Proteine in pET-24 exprimiert, wie nachstehend für pET21 beschrieben. pET2 weist dieselbe Sequenz auf wie pET-21, jedoch mit der Kanamycin-Resistenz-Kassette an Stelle der Ampicillin-Kassette.
Die Oligonucleotide, die dazu verwendet wurden, Sequenzen in den Vektor pET-2b4 zu clonieren, waren wie folgt:

*Dieser Primer wurde als Rückwärts-Primer für alle 287-Formen eingesetzt.
^§Vorwärts-Primer, welche in Kombination mit dem Rückwärts-Primer ΔG278K verwendet werden.

Beispiel 9 – Protein 961
Das vollständige Protein 961 aus N. meningitidis (Serogruppe B, Stamm MC58) weist die folgende Sequenz auf:
Das Leader-Peptid ist unterstrichen.
Es wurden drei Methoden zur Expression von 961 verwendet:

1) 961 unter Verwendung einer GST-Fusion, gemäß WO 99/57280 (,GST961');
2) 961 mit seinem eigenen Leader-Peptid aber ohne irgendeinen Fusionspartner (,961L'); und
3) 961 ohne sein Leader-Peptid und ohne irgendeinen Fusionspartner (,961^untagged'), wobei das Leader-Peptid weggelassen wurde, indem der PCR-Primer am 5'-Ende so konstruiert wurde, dass er stromabwärts von der vorhergesagten Leader-Sequenz lag.

Alle drei Formen des Proteins wurden exprimiert. Das GST-Fusionsprotein konnte aufgereinigt werden und Antikörper gegen dieses bestätigten, dass 961 exponiert an der Oberfläche vorliegt (4). Das Protein wurde dazu verwendet, Mäuse zu immunisieren und die so erhaltenen Seren lieferten hervorragende Ergebnisse in dem Bakterizidie-Assay. 961L konnte ebenfalls aufgereinigt werden und ergab sehr hohe ELISA-Titer.
Das Protein 961 scheint in verschiedenen Phasen unterschiedlich zu sein. Des Weiteren findet man es nicht in allen Stämmen von N. meningitidis.
Beispiel 22 – Domänen in 961
Wie in Beispiel 9 vorstehend beschrieben war die GST-Fusion von 961 diejenige, die in E. coli am besten exprimiert wurde. Um die Expression zu verbessern, wurde das Protein in Domänen unterteilt (12).
Die Domänen von 961 wurden auf der Grundlage von YadA konstruiert (einem von Yersinia produzierten Adhäsin, von dem gezeigt worden ist, dass es ein auf der Bakterienoberfläche befindliches Adhäsin ist, welches Oligomere bildet, die eine Ausbuchtung der Oberfläche erzeugt [Hoiczyk et al., EMBO J. 19: 5989-99 (2000)], und bei diesen handelt es sich um: Leader-Peptid, Kopfdomäne, „Coiled coil"-Region (Stiel) und Membranverankerungsdomäne.

Diese Domänen wurden mit oder ohne das Leader-Peptid exprimiert und gegebenenfalls entweder an das C-terminale His-Tag oder an das N-terminale GST fusioniert. Clone von E. coli, die verschiedene Domänen von 961 exprimierten, wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot auf die Produktion und die Lokalisierung des exprimierten Proteins aus einer Übernachtkultur (O/N) oder nach 3 Stunden Induktion mit IPTG untersucht. Die Ergebnisse waren:

	Gesamtlysat (Western Blot)	Periplasma (Western Blot)	Überstand (Western Blot)	OMV SDS-PAGE
961 (o/n) 961 (IPTG)	– +/–	– –	– –
961-L (o/n) 961-L (IPTG)	+ +	– –	– –	+ +
961c-L (o/n) 961c-L (IPTG)	– +	– +	– +
961Δ₁-L (o/n) 961Δ₁-L (IPTG)	– +	– –	– –	+

Die Ergebnisse zeigen, dass in E. coli:

• 961-L hoch exprimiert und in der äußeren Membran lokalisiert ist. Durch Western Blot-Analyse sind zwei spezifische Banden nachgewiesen worden: eine bei ~ 45 kDa (das vorhergesagte Molekulargewicht) und eine bei 180 kDa, was darauf hinweist, dass 961-L Oligomere bilden kann. Außerdem sind diese Aggregate mehr in der Übernachtkultur (ohne IPTG-Induktion) exprimiert. OMV (Vesikel der äußeren Membran)-Präparate dieses Clons wurden dazu verwendet, um Mäuse zu immunisieren, und es wurde Serum gewonnen. Bei Verwendung einer Übernachtkultur (vorherrschend durch die oligomere Form) war das Serum bakterizid; die mit IPTG induzierte Kultur (vorherrschend monomer) war nicht bakterizid.
• 961Δ₁-L (mit einer partiellen Deletion in der Ankerregion) wird hoch exprimiert und ist auf der äußeren Membran lokalisiert, bildet jedoch keine Oligomere;
• 961c-L (ohne die Ankerregion) wird in löslicher Form hergestellt und in den Überstand exportiert.

Die Titer im ELISA und in dem Serum-Bakterizidie-Assay bei Verwendung der His-Fusionen waren wie folgt:

ELISA Bakterizidie

961a (aa 24-268) 24397 4096

961b (aa 269-405) 7763 64

961c-L 29770 8192

961c (2996) 30774 > 65536

961c (MC58) 33437 16384

961d 26069 > 65536
E. coli-Clone, die verschiedene Formen von 961 exprimierten (961, 961-L, 961D1-L und 961c-L), wurden eingesetzt um zu erforschen, ob es sich bei dem 961 um ein Adhäsin handelt (vgl. YadA). Es wurde ein Adhäsions-Assay durchgeführt, wobei (a) die menschlichen Epithelzellen und (b) E. coli-Clone entweder nach einer Übernachtkultur oder nach drei Stunden Induktion mit IPTG verwendet wurden. 961-L, welches man über Nacht hatte wachsen lassen (961Δ₁-L), und mit IPTG induziertes 961c-L (die Clone, welche Protein auf der Oberfläche exprimieren) adhärieren an menschliche Epithelzellen.
961c wurde ebenfalls in Hybridproteinen verwendet (siehe vorstehend). Da 961 und seine Domänenvarianten eine effiziente Expression steuern, sind sie ideal als der N-terminale Teil eines Hybridproteins geeignet.
Beispiel 23 – Weitere Hybride des Proteins 961
Weitere Hybridproteine der Erfindung sind nachstehend gezeigt (siehe auch 14). Diese sind im Vergleich zu den einzelnen Proteinen vorteilhaft:
Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung nur als Beispiel beschrieben worden ist und dass daran Änderungen vorgenommen werden können, während man innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung bleibt. Zum Beispiel ist die Verwendung von Proteinen aus anderen Stämmen vorgesehen [siehe z.B. WO 00/66741 für polymorphe Sequenzen für ORF4, ORF40, ORF46, 225, 235, 287, 519, 726, 919 und 953].
EXPERIMENTELLE DETAILS
Clonierungsstrategie und Konstruktion der Oligonucleotide
Gene, welche für das Antigen von Interesse codierten, wurden mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonucleotide verwendet wurden, die auf der Grundlage der genomischen Sequenz von N. meningitidis B MC58 konstruiert worden waren. Es wurde immer genomische DNA vom Stamm 2966 als Matrize für die PCR-Reaktionen verwendet, soweit nichts anderes angegeben ist, und die amplifizierten Fragmente wurden in den Expressionsvektor pET21b+ (Novagen) cloniert, um das Protein als C-terminal mit einem His-Tag versehenes Produkt zu exprimieren, oder in pET24b+ (Novagen), um das Protein in einer Form ohne Tag zu exprimieren (z.B. ΔG287K).
In den Fällen, in denen ein Protein ohne Fusionspartner und mit seinem eigenen Leader-Peptid (sofern vorhanden) exprimiert wurde, wurde eine Amplifikation des offene Leserahmens (ATG bis zu den Stopcodons) durchgeführt.
In den Fällen, in denen ein Protein in der Form ohne Tag exprimiert wurde, wurde das Leader-Peptid weggelassen, indem man die Amplifikations-Primer am 5'-Ende so konstruierte, dass sie stromabwärts von der vorhergesagten Leader-Sequenz lagen.
Die Schmelztemperatur der in der PCR verwendeten Primer war von der Anzahl und der Art der hybridisierenden Nucleotide in dem gesamten Primer abhängig und wurde mit Hilfe der folgenden Formeln bestimmt: Tm1 = 4 (G + C) + 2 (A + T) (ohne Schwanz) Tm2 = 64,9 + 0,41 (% GC) – 600/N (gesamter Primer)
Die Schmelztemperaturen der ausgewählten Oligonucleotide lagen üblicherweise bei 65-70°C für das gesamte Oligo und bei 50-60°C für die hybridisierende Region allein.
Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines Perkin Elmer 394 DNA/RNA-Synthesegeräts synthetisiert, in 2,0 ml NH₄OH von den Säulen eluiert und durch 5 Stunden Inkubation bei 56°C von den Schutzgruppen befreit. Die Oligos wurden durch Zugabe von 0,3 M Na-Acetat und 2 Volumina Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden abzentrifugiert und die Pellets in Wasser resuspendiert.
Zu den Oligonucleotiden, welche dazu verwendet wurden, die 961-Proteine und Hybride der Erfindung herzustellen, gehören:

*Dieser Primer wurde als Rückwärts-Primer für alle C-terminalen Fusionen von 287 mit dem His-Tag eingesetzt.
^§Vorwärts-Primer, welche in Kombination mit dem Rückwärts-Primer 287-His verwendet werden. Anm. – Alle PCR-Reaktionen verwenden Stamm 2996 sofern nicht anderweitig angegeben (z.B. Stamm MC58)

In allen Konstrukten, die mit einem ATG beginnen, welches nicht von einer einmal vorkommenden NheI-Stelle gefolgt wird, ist das ATG-Codon ein Teil der für die Clonierung verwendeten NheI-Stelle. Die Konstrukte, die unter Verwendung der NheI-Stelle als Clonierungsstelle am 5'-Ende hergestellt worden sind (z.B. alle diejenigen, welche 287 am N-Terminus enthalten), weisen zwei zusätzliche Codons (GCT AGC) auf, die an die codierende Sequenz des Antigens fusioniert sind.
Herstellung von chromosomalen DNA-Matrizen
Man ließ die N. meningitidis-Stämme 2996, MC58, 394.98, 1000 und BZ232 (und andere) in 100 ml GC-Medium bis zur exponentiellen Phase wachsen, erntete sie durch Zentrifugation und resuspendierte sie in 5 ml Puffer (20% w/v Saccharose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8). Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Bakterien durch Zugabe von 10 ml Lyse-Lösung (50 mM NaCl, 1% Na-Sarkosyl, 50 μg/ml Proteinase K) lysiert und die Suspension wurde für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurden zwei Phenolextraktionen (äquilibriert auf pH 8) und eine CHCl₃/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion durchgeführt. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol präzipitiert und mittels Zentrifugation aufgefangen. Das Pellet wurde einmal mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen und in 4,0 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) wieder gelöst. Die Konzentration der DNA wurde gemessen, indem die OD₂₆₀ abgelesen wurde.
PCR-Amplifikation
Das Standard-PCR-Protokoll war wie folgt: 200 ng genomische DNA aus dem Stamm 2996, MC58, 1000 oder BZ232 oder 10 ng einer Plasmid-DNA-Präparation von rekombinanten Clonen wurden als Matrize in Gegenwart von jeweils 40 μM von jedem Oligonucleotid-Primer, 400-800 μM dNTP-Lösung, 1 × PCR-Puffer (einschließlich 1,5 mM MgCl₂), 2,5 Einheiten TaqI-DNA-Polymerase (wobei Perkin-Elmer AmpliTaq, Boehringer Mannheim Expand^TM Long Template verwendet wurde) eingesetzt.
Nach einer einleitenden 3-minütigen Inkubation des gesamten Gemisches bei 95°C durchlief jede Probe eine zweistufige Amplifikation: die ersten 5 Zyklen wurden bei der Hybridisierungstemperatur durchgeführt, die den Restriktionsenzym-Schwanz des Primers ausschloss (T_m1). Daran schlossen sich 30 Zyklen an, die der Hybridisierungstemperatur entsprachen, welche für die Volllänge-Oligos berechnet worden waren (T_m2). Die Zeiten für die Elongation, welche bei 68°C oder 72°C durchgeführt wurde, variierten je nach Länge des zu amplifizierenden ORF. Im Fall von ORF1 wurde die Elongationszeit, ausgehend von 3 Minuten, in jedem Zyklus um 15 Sekunden verlängert. Die Zyklen wurden mit einem 10-minütigen Extensionsschritt bei 72°C abgeschlossen.
Die amplifizierte DNA wurde direkt auf ein 1% Agarosegel geladen. Das DNA-Fragment, das der Bande mit der korrekten Größe entsprach, wurde aus dem Gel aufgereinigt, wobei das Qiagen Gel Extraktion Kit gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet wurde.
Verdauung der PCR-Fragmente und der Clonierungsvektoren
Die aufgereinigte DNA, die dem amplifizierten Fragment entsprach, wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen für die Clonierung in pET-21b+, pET22b+ oder pET-24b+ verdaut. Die verdauten Fragmente wurden mit Hilfe des QlAquick PCR Purification Kits (gemäß den Vorschriften des Herstellers) aufgereinigt und entweder mit H₂O oder mit 10 mM Tris, pH 8,5 eluiert. Die Plasmidvektoren wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf ein 1,0% Agarosegel geladen, und die dem verdauten Vektor entsprechende Bande wurde aufgereinigt, wobei das Qiagen QlAquick Gel Extraction Kit verwendet wurde.
Clonierung
Die jedem Gen entsprechenden Gene, die zuvor verdaut und aufgereinigt worden waren, wurden in pET-21b+, pET22b+ oder pET-24b+ ligiert. Es wurde ein molares Verhältnis Fragment/Vektor von 3:1 eingesetzt, mit T4-DNA-Ligase in dem vom Hersteller gelieferten Ligierungspuffer.
Rekombinantes Plasmid wurde in kompetente E. coli DH5 oder HB101 transformiert, indem die Ligasereaktionslösung und die Bakterien für 40 Minuten auf Eis inkubiert wurden, dann für 3 Minuten bei 37°C.
Dies war gefolgt von der Zugabe von 800 μl LB-Nährlösung und Inkubation für 20 Minuten bei 37°C. Die Zellen wurden bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Microfuge abzentrifugiert, in ungefähr 200 μl des Überstands resuspendiert und auf LB-Ampicillin (100 mg/ml) – Agar ausplattiert.
Eine Durchmusterung auf rekombinante Clone wurde durchgeführt, indem man nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Kolonien über Nacht bei 37°C in 4,0 ml LB-Nährlösung + 100 μg/ml Ampicillin wachsen ließ. Man pelletierte die Zellen und extrahierte Plasmid-DNA unter Verwendung des Qiagen QlAprep Spin Miniprep Kits gemäß den Vorschriften des Herstellers. Ungefähr 1 μg von jedem einzelnen Miniprep wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und der Verdau parallel zu einem Molekulargewichtsmarker (1 kb DNA Ladder, GIBCO) auf ein 1-1,5% Agarosegel geladen (je nach der erwarteten Größe der Insertion). Positive Clone wurden auf der Grundlage der Größe der Insertion ausgewählt.
Expression
Nachdem jedes Gen in den Expressionsvektor cloniert worden war, wurden rekombinante Plasmide in E. coli-Stämme transformiert, die für eine Expression des rekombinanten Proteins geeignet sind. Es wurde 1 μl von jedem Konstrukt eingesetzt, um E. coli BL21-DE3 wie vorstehend beschrieben zu transformieren. Einzelne rekombinante Kolonien wurden in 2 ml LB+Amp (100 μg/ml) angeimpft, bei 37°C über Nacht inkubiert, danach 1:30 in 20 ml LB+Amp (100 μg/ml) in 100 ml-Kolben verdünnt, um eine OD₆₀₀ zwischen 0,1 und 0,2 zu ergeben. Die Kolben wurden bei 30°C oder 37°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert, bis die OD₆₀₀ ein exponentielles Wachstum anzeigte, welches für die Induktion der Expression geeignet ist (0,4-0,8 OD). Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1,0 mM IPTG induziert. Nach 3 Stunden Inkubation bei 30°C oder 37°C wurde die OD₆₀₀ gemessen und die Expression untersucht. 1,0 ml von jeder Probe wurden in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert, das Pellet in PBS resuspendiert und durch SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Blau analysiert.
Gateway – Clonierung und Expression
Mit GATE markierte Sequenzen wurden cloniert und exprimiert, wobei die GATEWAY Clonierungs-Technologie (Gibco-BRL) verwendet wurde. Clonierung via Rekombination (RC) basiert auf den Rekombinationsreaktionen, welche die Integration und die Excision von Phagen in das bzw. aus dem E. coli-Genom heraus vermitteln. Die Integration beinhaltet eine Rekombination der attP-Stelle der Phagen-DNA innerhalb der attB-Stelle, die in dem bakteriellen Genom liegt (BP-Reaktion). Die Excision rekombiniert die attL- und attR-Stellen zurück in die attP- und attB-Stellen (LR-Reaktion). Die Integrationsreaktion benötigt zwei Enzyme [das Phagenprotein Integrase (Int) und das bakterielle Protein Integrations-Wirtsfaktor (IHF)] (BP Clonase). Die Excisionsreaktion benötigt Int, IHF und ein weiteres Phagenenzym, Excisionase (Xis)(LR Clonase). Künstliche Derivate der 25 bp großen bakteriellen attB-Rekombinationsstelle, welche als B1 und B2 bezeichnet werden, wurden an das 5'-Ende der Primer hinzugefügt, die in den PCR-Reaktionen verwendet wurden, um Neisseria-ORFs zu amplifizieren. Die so erhaltenen Pro dukte wurden in einen „Donor-Vektor" BP cloniert, welcher komplementäre Derivate der Phagen-Rekombinationsstelle attP (P1 und P2) enthielt, wobei BP Clonase verwendet wurde. Die so erhaltenen „Eingangsclone" enthalten ORFs, die von Derivaten der attL-Stelle (L1 und L2) flankiert sind, und wurden in die Expressions-„Bestimmungsvektoren" subcloniert, welche Derivate der attL-kompatiblen attR-Stellen (R1 und R2) enthalten, wobei LR Clonase verwendet wird. Dies führte zu „Expressionsclonen", in denen die ORFs von B1 und B2 flankiert und im gleichen Leseraster mit den N-terminalen GST- oder His-Tags fusioniert sind.
Bei dem für die GATEWAY-Expression verwendeten E. coli-Stamm handelt es sich um BL21-SI. Zellen von diesem Stamm werden zur Expression der T7-RNA-Polymerase durch Wachstum in Medium induziert, das Salz enthält (0,3 M NaCl).
Beachten Sie, dass dieses System zu N-terminalen His-Tags führt.
Präparation von Membran-Proteinen
Fraktionen, die hauptsächlich entweder aus innerer, äußerer oder Gesamtmembran zusammengesetzt waren, wurden isoliert, um rekombinante Proteine zu gewinnen, die mit Leader-Sequenzen für die Membran-Lokalisierung exprimiert worden waren. Das Verfahren zur Präparation von Membran-Fraktionen, welche für rekombinante Proteine angereichert sind, wurde von Filip et al. [J. Bact. 115: 717-722 (1973)] und Davies et al. [J. Immunol. Meth. 143: 215-225 (1990)] angepasst. Man ließ einzelne Kolonien, die das Plasmid von Interesse beherbergten, über Nacht bei 37°C in 20 ml einer LB/Amp (100 μg/ml) – Flüssigkultur wachsen. Man verdünnte die Bakterien 1:30 in 1,0 l frisches Medium und ließ sie über Nacht entweder bei 30°C oder bei 37°C wachsen, bis die OD₅₅₀ 0,6-0,8 erreichte. Expression von rekombinantem Protein wurde mit IPTG in einer Endkonzentration von 1,0 mM induziert. Nach 3 Stunden Inkubation wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 8000 × g für 15 Minuten bei 4°C geerntet und in 20 ml 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5) und den „Complete" Protease-Hemmern (Boehringer Mannheim) resuspendiert. Alle nachfolgenden Arbeitsschritte wurden bei 4°C oder auf Eis durchgeführt.
Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung mit einem Branson Sonifier 450 aufgeschlossen und bei 5.000 × g für 20 Minuten abzentrifugiert, um nicht aufgebrochene Zellen und Einschlusskörper zu sedimentieren. Der Membranen und Zelltrümmer enthaltende Überstand wurde bei 50.000 × g abzentrifugiert (Beckman Ti50, 29.000 UpM), mit 20 mM Bis-Tris-propan (pH 6,5), 1,0 M NaCl, 10% (v/v) Glycerin gewaschen und nochmals für 75 Minuten bei 50.000 × g sedimentiert. Das Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 2,0% (v/v) Sarkosyl, „Complete" Protease-Hemmer (Endkonzentration 1,0 mM EDTA) resuspendiert und für 20 Minuten inkubiert um die innere Membran aufzulösen. Zelltrümmer wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 × g pelletiert und der Überstand für 75 Minuten bei 75.000 × g zentrifugiert (Beckman Ti50, 33.000 UpM). Man fand, dass die Proteine 008L und 519L im Überstand vorlagen, was auf eine Lokalisierung in der inneren Membran hindeutet. Für diese Proteine wurden sowohl Fraktionen der inneren Membran als auch der Gesamtmembran (wie vorstehend mit NaCl gewaschen) verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Äußere Membranvesikel, die aus dem 75.000 × g-Pellet gewonnen worden waren, wurden mit 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5), gewaschen und bei 75.000 × g für 75 Min oder über Nacht abzentrifugiert. Die OMV wurden schließlich in 500 μl 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 10% v/v Glycerin resuspendiert. Orf1L und Orf40L waren beide in der Fraktion der äußeren Membran lokalisiert und angereichert, welche dazu verwendet wurde, Mäuse zu immunisieren. Die Protein-Konzentration wurde mit Hilfe des Standard Bradford-Assays (Bio-Rad) bestimmt, während die Protein-Konzentration der Fraktion der inneren Membran mit dem DC-Protein-Assay (Bio-Rad) bestimmt wurde. Verschiedene Fraktionen aus dem Aufreinigungsverfahren wurden mit SDS-PAGE getestet.
Aufreinigung von mit einem His-Tag markierten Proteinen
Aus den Stämmen 2996 und MC58 wurden verschiedene Formen von 287 cloniert. Diese wurden mit einer Fusion eines His-Tag am C-Terminus konstruiert und umfassten eine reife Form (aa 18-427), Konstrukte mit Deletionen (Δ1, Δ2, Δ3 und Δ4) sowie Clone, die entweder aus B- oder C-Domänen zusammengesetzt waren. Für jeden Clon, der als eine His-Fusion aufgereinigt wurde, wurde eine einzelne Kolonie ausgestrichen und über Nacht bei 37°C auf einer LB/Amp (100 μg/ml) – Agarplatte wachsen gelassen. Eine vereinzelte Kolonie von dieser Platte wurde in 20 ml LB/Amp (100 μg/ml) – Flüssigmedium angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C wachsen gelassen. Die Übernachtkultur wurde 1:30 in 1,0 l LB/Amp (100 μg/ml)-Flüssigmedium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (30°C oder 37°C) wachsen gelassen, bis die OD₅₅₀ 0,6-0,8 erreichte. Die Expression von rekombinantem Protein wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1,0 mM) induziert und die Kultur für weitere 3 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 8.000 × g und 4°C geerntet. Das bakterielle Pellet wurde in 7,5 ml von entweder (i) kaltem Puffer A (300 mM NaCl, 50 ml Phosphatpuffer, 10 mM Imidazol, pH 8,0) für lösliche Proteine oder (ii) Puffer B (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,8 und gegebenenfalls 8 M Harnstoff) für unlösliche Proteine. Zu den Proteinen, die in einer löslichen Form aufgereinigt wurden, gehörten 287-His, Δ1, Δ2, Δ3 und Δ4287-His, Δ4287MC58-His, 287c-His und 287cMC58-His. Das Protein 287bMC58-His war unlöslich und wurde entsprechend aufgereinigt. Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung auf Eis, vier Mal 30 Sek. bei 40 W unter Verwendung eines Branson Sonifier 450 aufgeschlossen und bei 13.000 × g für 30 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Für unlösliche Proteine wurden die Pellets in 2,0 ml Puffer C (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Phosphatpuffer, 10 mM Tris-HCl, (pH 7,5) resuspendiert und mit 10 Durchgängen in einem Dounce-Homogenisator behandelt. Das Homogenat wurde bei 13.000 × g für 30 Minuten abzentrifugiert und der Überstand zurückbehalten. Die Überstände für sowohl lösliche als auch unlösliche Präparationen wurden mit 150 μl Ni²⁺-Harz (welches zuvor mit entweder Puffer A oder Puffer B, wie jeweils anwendbar, äquilibriert worden war) gemischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Bei dem Harz handelte es sich um Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), welche gemäß den Vorschriften des Herstellers vorbereitet worden war. Die im Batchverfahren bearbeitete Präparation wurde bei 700 × g für 5 Min. bei 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Harz wurde zwei Mal (in Batches) mit 10 ml Puffer A oder B für 10 Min. gewaschen, in 1,0 ml Puffer A oder B resuspendiert und auf eine Wegwerf-Säule geladen. Das Harz wurde weiter mit entweder (i) Puffer A bei 4°C oder (ii) Puffer B bei Raumtemperatur gewaschen, bis die OD₂₈₀ des Durchflusses 0,02-0,01 erreichte. Das Harz wurde weiter mit entweder (i) kaltem Puffer C (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 20 mM Imidazol, pH 8,0) oder (ii) Puffer D (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3 und gegebenenfalls 8 M Harnstoff) gewaschen, bis die OD₂₈₀ des Durchflusses 0,02-0,01 erreichte. Das His-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 700 μl von entweder (i) kaltem Elutionspuffer A (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 250 mM Imidazol, pH 8,0) oder (ii) Elutionspuffer B (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 4,5 und gegebenenfalls 8 M Harnstoff) eluiert und Fraktionen gesammelt, bis die OD₂₈₀ anzeigte, dass das gesamte rekombinante Protein aufgefangen worden war. 20 μl-Aliquots von jeder Elutionsfraktion wurden mittel SDS-PAGE analysiert. Protein-Konzentrationen wurden mit Hilfe des Bradford-Assays bestimmt.
Denaturierung denaturierter His-Fusionsproteine
Eine Denaturierung war erforderlich, um 287bMC58 zu solubilisieren, daher wurde ein Renaturierungsschritt vor der Immunisierung eingesetzt. Zu den vorstehend gewonnenen Fraktionen wurde Glycerin hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 10% v/v zu erreichen. Die Proteine wurden auf 200 μg/ml verdünnt, wobei Dialysepuffer I (10% v/v Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5,0 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 2,0 M Harnstoff, pH 8,8) verwendet wurde, und für 12-14 Stunden bei 4°C gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine weitere Dialyse wurde mit Puffer II (10% v/v Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5,0 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, pH 8,8) für 12-14 Stunden bei 4°C durchgeführt. Die Protein-Konzentration wurde mit Hilfe der folgenden Formel bestimmt: Protein (mg/ml) = (1,55 × OD280) – (0,76 × OD260)
Aminosäuresequenz-Analyse
Eine automatisierte Sequenzanalyse des N-Terminus von Proteinen wurde nach den Empfehlungen des Herstellers auf einem Beckman Sequenziergerät (LF 3000) durchgeführt, das mit einer Online-Phenylthiohydantoin-Aminosäuren-Analyseeinheit (System Gold) ausgestattet war.
Immunisierung
BALG/c-Mäuse wurden an den Tagen 0, 21 und 35 mit Antigenen immunisiert und die Seren am Tag 49 untersucht.
Serumanalyse – ELISA
Der nicht verkapselte MenB M7 und die verkapselten Stämme wurden auf Schokolade-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Bakterielle Kolonien wurden von den Agarplatten mit einem sterilen „Dracon"-Tupfer abgenommen und in Mueller-Hinton-Nährlösung (Difco) angeimpft, welche 0,25% Glucose enthielt. Das Wachstum der Bakterien wurde alle 30 Minuten überwacht, indem die OD₆₂₀ verfolgt wurde. Man ließ die Bakterien wachsen, bis die OD den Wert 0,4-0,5 erreichte. Die Kultur wurde für 10 Minuten bei 4.000 UpM abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterien wurden zwei Mal mit PBS gewaschen, in PBS resuspendiert, welches 0,025% Formaldehyd enthielt und für 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C ohne Schütteln inkubiert. 100 μl Bakterienzellen wurden zu jeder Vertiefung einer Greiner-Platte mit 96 Vertiefungen hinzugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden drei Mal mit PBT-Waschpuffer (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen. 200 μl Sättigungspuffer (2,7% Polyvinylpyrrolidon 10 in Wasser) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden drei Mal mit PBT gewaschen. 200 μl der verdünnten Seren (Verdünnungspuffer: 1% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% NaN₃ in PBS) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden drei Mal mit PBT gewaschen. 100 μl von HRP-konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-Serum (Dako), welches 1:2000 in Verdünnungspuffer verdünnt war, wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten wurden 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden drei Mal mit PBT gewaschen. 100 μl Substratpuffer für HRP (25 ml Citratpuffer, pH 5, 10 mg O-Phenyldiamin und 10 μl H₂O₂) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl 12,5% H₂SO₄ hinzugegeben und die OD₄₉₀ wurde verfolgt. Die ELISA-Titer wurden willkürlich als die Serumverdünnung berechnet, die einen OD₄₉₀-Wert von 0,4 über dem Spiegel der Präimmunseren ergab. Der ELISA wurde als positiv gewertet, wenn die Verdünnung von Seren mit einer OD₄₉₀ von 0,4 höher als 1:400 war.
Serumanalyse – FACS Scan Bakterien-Bindungsassay
Der nicht verkapselte MenB M7-Stamm wurde auf Schokolade-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Bakterielle Kolonien wurden mit einem sterilen Dracon-Tupfer von den Agarplatten abgenommen und in 4 Röhrchen angeimpft, die 8 ml Mueller-Hinton-Nährlösung (Difco) enthielten, welche 0,25% Glucose enthielt. Das Wachstum der Bakterien wurde alle 30 Minuten überwacht, indem die OD₆₂₀ verfolgt wurde. Man ließ die Bakterien wachsen, bis die OD den Wert 0,35-0,5 erreichte. Die Kultur wurde für 10 Minuten bei 4.000 UpM abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Blockierungspuffer (1% BSA in PBS, 0,4% NaN₃) resuspendiert und 5 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden in Blockierungspuffer resuspendiert, so dass sie eine OD₆₂₀ von 0,05 erreichten. 100 μl Bakterienzellen wurden zu jeder Vertiefung einer Costar-Platte mit 96 Vertiefungen hinzugegeben. 100 μl von verdünnten (1:100, 1:200, 1:400) Seren (in Blockierungspuffer) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden für 5 Minuten bei 4.000 UpM abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen durch Zugabe von 200 μl Blockierungspuffer in jede Vertiefung gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl von 1:100 verdünntem, mit R-Phycoerythrin konjugiertem Ziege-Anti-Maus-F(ab)₂ hinzugegeben und die Platten für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 4.000 UpM abzentrifugiert und durch Zugabe von 200 μl Blockierungspuffer/Vertiefung gewaschen. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 200 μl/Vertiefung von PBS, 0,25% Formaldehyd resuspendiert. Die Proben wurden in FACS-Röhrchen überführt und gemessen. Die Einstellungen für den FACScan (Laserleistung 15 mW) waren: FL2 an; FSC-H-Schwelle: 92; FSC PMT-Spannung: E 01; SSC PMT: 474; Amp. Verstärkung 6.1; FL-2 PMT: 586; Kompensationswert: 0.
Serumanalyse – Bakterizidie-Assay
Man ließ den N. meningitidis-Stamm 2996 über Nacht bei 37°C auf Schokolade-Agarplatten (ausgehend von einem eingefrorenen Vorrat) mit 5% CO₂ wachsen. Kolonien wurden abgenommen und dazu verwendet, 7 ml Mueller-Hinton-Nährlösung anzuimpfen, welche 0,25% Glucose enthielt, um eine OD₆₂₀ von 0,05-0,08 zu erreichen. Die Kultur wurde für ungefähr 1,5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert, bis die OD₆₂₀ einen Wert von 0,23-0,24 erreichte. Die Bakterien verdünnte man zu einer Arbeitskonzentration von 10⁵ CFU/ml in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, der 10 mM MgCl₂, 10 mM CaCl₂ und 0,5% (w/v) BSA enthielt (Assaypuffer). Das Gesamtvolumen des endgültigen Reaktionsgemisches war 50 μl mit 25 μl einer Verdünnungsreihe fortlaufender zweifacher Verdünnungen von Testserum, 12,5 μl Bakterien in der Arbeitsverdünnung, 12,5 μl Komplement von Kaninchen-Jungen (Endkonzentration 25%).
Die Kontrollen enthielten Bakterien, welche mit Komplement-Serum inkubiert worden waren, Immunseren, die mit Bakterien und mit Komplement inkubiert worden waren, das durch Erhitzen bei 56°C für 30 Minuten inaktiviert worden war. Unmittelbar nach der Zugabe des Kaninchen-Jungen-Komplements wurden 10 μl der Kontrollen auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausplattiert, wobei die Kippmethode angewandt wurde (Zeit 0). Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde für 1 Stunde bei 37°C unter kreisförmiger Bewegung inkubiert. 7 μl von jeder Probe wurden punktförmig auf Mueller-Hinton Agarplatten ausplattiert, wohingegen 10 μl der Kontrollen mit der Kippmethode auf Mueller-Hinton Agarplatten plattiert wurden (Zeit 1). Die Agarplatten wurden für 18 Stunden bei 37°C inkubiert und die der Zeit 0 und der Zeit 1 entsprechenden Kolonien wurden ausgezählt.
Serumanalyse – Western Blot
Aufgereinigte Proteine (500 ng/Spur), äußere Membranvesikel (5 μg) und Gesamt-Zellextrakte (25 μg), welche von dem MenB-Stamm 2996 abgeleitet waren, wurden auf ein 12,5% SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Der Transfer wurde für 2 Stunden bei 150 mA bei 4°C mit Transfer-Puffer (0,3% Tris-Base, 1,44% Glycin, 20% (v/v) Methanol) durchgeführt. Die Membran wurde durch eine Inkubation über Nacht bei 4°C in Sättigungspuffer (10% Magermilch, 0,1% Triton X-100 in PBS) abgesättigt. Die Membran wurde zwei Mal mit Waschpuffer (3% Magermilch, 0,1% Triton X-100) gewaschen und für 2 Stunden bei 37°C mit 1:200 in Waschpuffer verdünntem Maus-Serum inkubiert. Die Membran wurde zwei Mal gewaschen und für 90 Minuten mit einer 1:2000 Verdünnung von mit Meerrettichperoxidase markiertem Anti-Maus-Ig inkubiert. Die Membran wurde zwei Mal mit 0,1% Triton X-100 in PBS gewaschen und mit dem Opti-4CN Substratkit (Bio-Rad) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser gestoppt.
Die OMVs wurden wie folgt präpariert: man ließ den N. meningitidis-Stamm 2996 über Nacht bei 37°C mit 5% CO₂ auf 5 GC-Platten wachsen, erntete ihn mit einer Impföse und resuspendierte ihn in 10 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA. Eine Hitzeinaktivierung wurde für 45 Minuten bei 56°C durchgeführt und die Bakterien durch eine 5-minütige Ultraschallbehandlung auf Eis (50% Arbeitszyklus, 50% Leistung, Branson Sonifier 3 mm Mikrospitze) aufgebrochen. Nicht aufgebrochene Zellen wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 × g entfernt, der die gesamte Zellhüll-Fraktion enthaltende Überstand zurückgewonnen und weiter über Nacht bei 50.000 × g bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert. Das die Membranen enthaltende Pellet wurde in 2% Sarkosyl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA resuspendiert und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die inneren Membranen zu solubilisieren. Die Suspension wurde für 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen, der Überstand wurde weiter für 3 Stunden bei 50.000 × g zentrifugiert. Das Pellet, welches die äußeren Membranen enthielt, wurde in PBS gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem D.C. Bio-Rad Protein Assay (modifizierte Lowry-Methode) gemessen, wobei BSA als Standard verwendet wurde.
Gesamt-Zellextrakte wurden wie folgt präpariert: man ließ den N. meningitidis-Stamm 2996 über Nacht auf einer GC-Platte wachsen, erntete ihn mit einer Impföse und resuspendierte ihn in 1 ml 20 mM Tris-Hcl. Eine Hitzeinaktivierung wurde für 30 Minuten bei 56°C durchgeführt.
Untersuchungen der Domänen von 961
Präparation zellulärer Fraktionen: man stellte Gesamtlysat, Periplasma, Überstand und OMV von E. coli-Clonen her, die verschiedene Domänen von 961 exprimierten, indem man Bakterien von Übernachtkulturen oder nach 3 Stunden Induktion mit IPTG verwendete. In Kürze, das Periplasma wurde gewonnen, indem man Bakterien in 25% Saccharose und 50 mM Tris (pH 8) mit 100 μg/ml Polymyxin aufnahm. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Bakterien für 15 Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Der Kulturüberstand wurde mit 0,2 μm gefiltert und mit 50% TCA für 2 Stunden im Eis präzipitiert. Nach einer Zentrifugation (30 Min. bei 13.000 UpM) wurden die Pellets zwei Mal mit 70% Ethanol gespült und in PBS aufgenommen. Die OMV-Präparation wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Jede zelluläre Fraktion wurde in einer SDS-PAGE oder in einem Western Blot untersucht, wobei das gegen GST-961 hergestellte polyclonale Antiserum verwendet wurde.
Adhäsions-Assay: Chang Epithelzellen (Wong-Kilbourne-Derivat, Clon 1-5c-4, menschliche Bindehaut) wurden in DMEM (Gibco) gehalten, welches mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 15 mM L-Glutamin und Antibiotika ergänzt war.
Für den Adhärenz-Assay wurde eine subkonfluente Kultur von Chang-Epithelzellen mit PBS gespült und mit Trypsin-EDTA (Gibco) behandelt, um sie von dem Plastikträgermaterial freizusetzen. Die Zellen wurden dann in PBS aufgenommen, gezählt und in PBS auf 5 × 10⁵ Zellen/ml verdünnt.
Bakterien von Übernachtkulturen oder nach Induktion mit IPTG wurden pelletiert und zwei Mal mit PBS gewaschen, indem man sie für 5 Min. bei 13.000 abzentrifugierte. Ungefähr 2-3 × 10⁸ (cfu) wurden mit 0,5 mg/ml FITC (Sigma) für 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln in 1 ml Puffer inkubiert, der 50 mM NaHCO₃ und 100 mM NaCl, pH 8 enthielt. Mit FITC markierte Bakterien wurden 2-3 Mal gewaschen und in einer Konzentration von 1-1,5 × 10⁹/ml in PBS aufgenommen. 200 μl dieser Suspension (2-3 × 10⁸) wurden mit 200 μl (1 × 10⁵) Epithelzellen für 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 2.000 UpM für 5 Min. abzentrifugiert, um die nicht adhärenten Bakterien zu entfernen, in 200 μl PBS aufgenommen, in FACScan-Röhrchen überführt und gemessen. Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur heterologen Expression von N. meningitidis-Protein ,961', wobei: (a) Protein 961 die Aminosäuresequenz ,961' in Stamm MC58 hat:
und wobei (b) zumindest eine Domäne des Proteins deletiert wurde, wobei die Domänen von ,961' in Stamm MC58 folgendermaßen sind: (1) Aminosäuren 1 bis 23; (2) Aminosäuren 24 bis 268; (3) Aminosäuren 269 bis 307; und (4) Aminosäuren 308 bis 364, und wobei das ,961'-Protein in einer Wirtszelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei kein Fusionspartner zur Proteinexpression verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein eine C-terminale His-Markierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein eine N-terminale GST umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ,961' der N-terminale Teil eines Hybridproteins ist.
Protein, exprimiert durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.