DE60132978T2

DE60132978T2 - Hybride expression von neisseria proteinen

Info

Publication number: DE60132978T2
Application number: DE60132978T
Authority: DE
Inventors: Maria Beatrice Arico; Maurizio Comanducci; Cesira Galeotti; Vega Masignani; Marzia Monica Giuliani; Mariagrazia Pizza
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: CA2744921A1; CY1113032T1; EP1947187B1; ATE387502T1; CN1800385A; ATE503837T1; JP2016128520A; RU2002125882A; RU2002125880A; US20140294885A1; JP4763210B2; HK1071147A1; DK1947187T5; JP2003525049A; EP2270030A2; HK1064120A1; CA2400570C; RU2304617C2; WO2001064920A3; DE60144353D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung ist aus dem Gebiet der Proteinexpression. Insbesondere betrifft sie die heterologe Expression von Proteinen aus Neisseria (z. B. N. gonorrhoeae oder bevorzugt N. meningitidis).
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Die internationalen Patentanmeldungen WO 99/24578 , WO 99/36544 , WO 99/57280 und WO 00/22430 offenbaren Proteine aus Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae. Diese Proteine werden typischerweise so beschrieben, dass sie in E. coli exprimiert werden (d. h. heterologe Expression) und zwar entweder als N-terminale GST-Fusionen oder als C-terminale His-Markierungssequenz-Fusionen, obwohl andere Expressionssysteme einschließlich der Expression in nativer Neisseria ebenfalls offenbart wurden.
Guilles et al., Biotecnologia aplicada, 1996, Band 13, Nr. 4, Seite 271–275 beschreiben ein Fusionsprotein aus dem P.1.15-Protein aus Neisseria mit dem P64K-Protein und dessen Expression in E. coli.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, alternative und verbesserte Ansätze für die heterologe Expression dieser Proteine bereitzustellen. Diese Ansätze werden typischerweise den Expressionsspiegel, die Einfachheit der Reinigung, die zelluläre Lokalisation der Expression und/oder die immunologischen Eigenschaften des exprimierten Proteins beeinflussen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung werden zwei Proteine aus Neisseria als ein einzelnes Hybridprotein exprimiert. Es wird bevorzugt, dass kein Fusionspartner (z. B. GST oder Poly-His) verwendet wird, der nicht aus Neisseria stammt.
Dadurch ergeben sich zwei Vorteile. Erstens kann ein Protein, das alleine unstabil sein kann oder schwach exprimiert wird, durch die Anfügung eines geeigneten Hybridpartners, der diese Probleme überwindet, unterstützt werden. Zweitens wird die kommerzielle Herstellung vereinfacht – es müssen nur eine Expression und eine Reinigung durchgeführt werden, um zwei getrennt nützliche Proteine herzustellen.
Daher stellt die Erfindung ein Hybridprotein der Formel NH₂-A-B-COOH bereit, wobei A das Protein ΔG287 aus Neisseria umfasst und B das Protein 953 aus Neisseria umfasst, und wobei die Aminosäuresequenz des Hybridproteins wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist oder eine Sequenz ist, die dazu eine Sequenzidentität von mehr als 70% aufweist.
Die Proteine stammen bevorzugt aus dem Stamm 2996 oder aus dem Stamm 394/98.
Die Proteinbestandteile (A und B) in einen Hybridprotein gemäß der Erfindung stammen bevorzugt aus dem gleichen Stamm.
Die fusionierten Proteine in dem Hybrid können direkt verbunden werden oder sie können über ein Linker-Peptid aneinander gefügt werden, wie z. B. über einen Poly-Glycin-Linker (d. h. G_n, wobei n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) oder über eine kurze Peptidsequenz, welche die Clonierung erleichtert. Es ist offensichtlich, dass bevorzugt wird, ein ΔG-Protein nicht mit dem C-Terminus eines Poly-Glycin-Linkers zu verbinden.
Den fusionierten Proteinen können die nativen Leader-Peptide fehlen oder sie können die Leader-Peptidsequenz des N-terminalen Fusionspartners enthalten.
Wirte
Es wird bevorzugt ein heterologer Wirt verwendet. Der heterologe Wirt kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bevorzugt handelt es sich um E. coli, aber andere geeignete Wirte umfassen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (z. B. M. tuberculosis), Hefe usw.
Sequenzen
Die Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das eine Sequenzidentität zu dem Protein der SEQ ID NO: 6 aufweist. Wie vorstehend beschrieben, ist der Grad der „Sequenzidentität" bevorzugt größer als 70% (z. B. 80%, 90%, 95%, 99% oder mehr).
Der Grad der „Sequenzidentität" wird bevorzugt nach dem Smith-Waterman-Homologie-Suchalgorithmus bestimmt, wie er in dem MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) ausgeführt wird, und zwar unter Verwendung einer affinen Lückensuche mit den Parametern gap open penalty (Strafe für offene Lücke) = 12 und gap extension penalty (Strafe für Erweiterung der Lücke) = 1. Ein Wert von 50% Identität zwischen zwei Proteinen wird typischerweise als Anzeichen für eine funktionelle Äquivalenz angesehen.
Die Proteine der Erfindung liegen in N. meningitidis Serogruppe B vor.
Die bevorzugten Proteine der Erfindung sind solche aus der Serogruppe B des N. meningitidis-Stammes 2996 (Petterson et al., Infect. Immun. 1993, 61(11): 4724–4733) oder des Stammes 394/98 (ein Stamm aus Neuseeland; Martin et al., JID, 1998, 177: 447–500). Sofern nicht anders ausgeführt, stammen die hierin erwähnten Proteine aus dem N. meningitidis-Stamm 2996. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Erfindung im Allgemeinen nicht auf bestimmte Stämme beschränkt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 bis 6 zeigen die hierin beschriebenen Hybridproteine.
VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Beispiel 1 – Hybride von ΔG287
Es wurde herausgefunden, dass die Deletion der (Gly)₆-Sequenz des Proteins 287 eine dramatische Auswirkung auf die Proteinexpression hat. Das Protein, dem die N-terminalen Aminosäuren bis zu GGGGGG fehlen, wird als „ΔG287" bezeichnet. Im Stamm MC58 ist die Grundsequenz (das Leader-Peptid ist unterstrichen):
ΔG287, mit oder ohne His-Markierungssequenz („ΔG287-His” beziehungsweise „ΔG287K"), wird im Vergleich zu „287-His" oder „287-^unmarkiert" in sehr guten Spiegeln exprimiert.
Auf Grundlage von Daten über die Variabilität der Gene wurden Varianten von ΔG287-His aus einer Reihe von MenB-Stämmen, insbesondere den Stämmen 2996, MC58, 1000 und BZ232, in E. coli exprimiert. Die Ergebnisse waren ebenfalls gut – jedes Protein ergab hohe ELISA-Titer und auch bakterizide Serum-Titer von > 8192. ΔG287K, das mit Hilfe des Vektors pET-24b exprimiert wurde, ergab ausgezeichnete Titer bei dem ELISA und dem Serum-Bakterizidie-Testansatz.
Die Deletion der Poly-Gly-Sequenz kann auch auf Tbp2 (NMB0460), 741 (NMB1870) und 983 (NMB1969) angewendet werden. Wenn diese ohne die Sequenzen, die ihre Leader-Peptide codieren, und ohne Poly-Gly (d. h. als „ΔG-Formen") in einem pET-Vector cloniert und in E. coli exprimiert wurden, wurde der gleiche Effekt beobachtet – die Expression bei den Clonen, die die Deletion des Poly-Gly-Bereiches enthielten, war gut, aber schwach oder nicht vorhanden, wenn die Glycin-Reste in dem exprimierten Protein vorhanden waren.
ΔG287 wurde direkt stomaufwärts von 919, 953, 961 (die Sequenzen werden nachstehend gezeigt) und dem ORF46.1 im Leseraster fusioniert:
Die bakterizide Wirksamkeit (homologer Stamm) der Antikörper, die gegen die Hybridproteine erzeugt wurden, wurde mit der von Antikörpern verglichen, die gegen einfache Gemische der Antigen-Bestandteile (unter Verwendung von 287-GST) erzeugt worden waren, und zwar für 919 und ORF46.1:

Gemisch mit 287 Hybrid mit ΔG287

919 32000 128000

ORF46.1 128 16000

Daten über die bakterizide Aktivität gegen heterologe MenB-Stämme und gegen die Serotypen A und C wurden ebenfalls erhalten:

	919		ORF46.1
Stamm	Gemisch	Hybrid	Gemisch	Hybrid
NGH38	1024	32000	-	16384
MC58	512	8192	-	512
BZ232	512	512	-	-
MenA (F6124)	512	32000	-	8192
MenC (C11)	> 2048	> 2048	-	-
MenC (BZ133)	> 4096	64000	-	8192

Die Hybridproteine mit ΔG287 am N-Terminus sind daher den einfachen Gemischen in immunologischer Hinsicht überlegen, wobei ΔG287-ORF46.1 besonders wirksam ist, sogar gegen heterologe Stämme. ΔG287-ORF46.1 K kann in pET-24b exprimiert werden.
Die gleichen Hybridproteine wurden unter Verwendung des Stammes 394/98 aus Neuseeland anstelle des Stammes 2996 hergestellt:
Beispiel 2 – Hybride von 287
Die Expression von 287 in Volllänge mit einer C-terminalen His-Markierungssequenz oder ohne sein Leader-Peptid, aber mit einer C-terminalen His-Markierungssequenz führt zu relativ niedrigen Expressionsspiegeln. Eine bessere Expression wird bei der Verwendung einer N-terminalen GST-Fusion erreicht. Als Alternative zur Verwendung von GST als N-terminalen Fusionspartner wurde 287 an den C-Terminus von Protein 919 („919-287"), von Protein 953 („953-287") und der Proteine des ORF46.1 („ORF46.1-287") platziert. In beiden Fällen wurden die Leader-Peptide deletiert und die Hybride waren direkte Fusionen im Leseraster.
Um das 953-287-Hybrid zu erzeugen, wurden die Leader-Peptide der beiden Proteine weggelassen, indem der Vorwärts-Primer stromabwärts des Leaders jeder Sequenz konstruiert wurde; die Sequenz des Stopp-Codons wurde in dem reversen Primer für 953 ausgelassen, aber in den reversen Primer für 287 mit eingeschlossen. Bei dem 953-Gen umfassten der 5'- und der 3'-Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden, eine NdeI- beziehungsweise eine BamHI-Restriktions-Schnittstelle, wohingegen für die Amplifikation des 287-Gens der 5'- und der 3'-Primer eine BamHI- beziehungsweise eine XhoI-Restriktions-Schnittstelle enthielten. Auf diese Weise konnte eine schrittweise und orientierte Clonierung der beiden Gene in pET-21b+ unter Verwendung von NdeI-BamHI (für die Clonierung des ersten Gens) und anschließend von BamHI-XhoI (für die Clonierung des zweiten Gens) erreicht werden.
Das 919-287-Hybrid wurde durch Clonierung der Sequenz, die den reifen Anteil von 287 codiert, in die XhoI-Schnittstelle am 3'-Ende des 919-His-Clons in pET21b+ erhalten. Die für die Amplifikation des 287-Gens verwendeten Primer wurden so konstruiert, dass sie eine SalI-Restriktions-Schnittstelle am 5'- und eine XhoI-Restriktions-Schnittstelle am 3'-Ende des PCR-Fragments enthielten. Da die kohäsiven Enden, die durch die Restriktionsenzyme SalI und XhoI erzeugt werden, kompatibel sind, konnte das mit SalI und XhoI verdaute 287-PCR-Produkt in den mit XhoI geschnittenen Clon pET21b-919 inseriert werden.
Das Hybrid ORF46.1-287 wurde auf ähnliche Weise erhalten.
Die bakterizide Wirksamkeit (homologer Stamm) der Antikörper, die gegen die Hybridproteine erzeugt wurden, wurde mit der von Antikörpern verglichen, die gegen einfache Gemische der Antigen-Bestandteile erzeugt worden waren:

Gemisch mit 287 Hybrid mit 287

919 32000 16000

953 8192 8192

ORF46.1 128 8192

Daten über die bakterizide Aktivität gegen heterologe MenB-Stämme und gegen die Serotypen A und C wurden für 919-287 und 953-287 ebenfalls erhalten:

	919		953		ORF46.1
Stamm	Gemisch	Hybrid	Gemisch	Hybrid	Gemisch	Hybrid
MC58	512	1024	512	1024	-	1024
NGH38	1024	2048	2048	4096	-	4096
BZ232	512	128	1024	16	-	-
MenA (F6124)	512	2048	2048	32	-	1024
MenC (C11)	> 2048	n. d.	> 2048	n. d.	-	n. d.
MenC (BZ133)	> 4096	> 8192	> 4096	< 16	-	2048

Hybride von ORF46.1 und 919 wurden ebenfalls konstruiert. Die besten Ergebnisse (vierfach höherer Titer) wurden mit 919 am N-Terminus erhalten.
Die Hybride 919-519His, ORF97-225His und 225-ORF97His wurden ebenfalls untersucht. Sie ergaben mittlere ELISA-Titer und bakterizide Antikörper-Antwortreaktionen.

Da Hybride aus zwei Proteinen A und B entweder in Form von NH₂-A-B-COOH oder in Form von NH₂-B-A-COOH vorliegen können, wurden die „reversen" Hybride mit 287 am N-Terminus ebenfalls hergestellt, aber unter Verwendung von ΔG287. Es wurde eine Reihe von Stämmen verwendet, einschließlich des homologen Stammes 2996. Als Adjuvanz wurde FCA verwendet:

	287 & 919		287 & 953		287 & ORF46.1
Stamm	ΔG287-919	919-287	ΔG287-953	953-287	ΔG287-46.1	46.1-287
2996	128000	16000	65536	8192	16384	8192
BZ232	256	128	128	< 4	< 4	< 4
1000	2048	< 4	< 4	< 4	< 4	< 4
MC58	8192	1024	16384	1024	512	128
NGH38	32000	2048	> 2048	4096	16384	4096
394/98	4096	32	256	128	128	16
MenA (F6124)	32000	2048	> 2048	32	8192	1024
MenC (BZ133)	64000	> 8192	> 8192	< 16	8192	2048

Wenn 287 am N-Terminus verwendet wird, werden im Allgemeinen bessere bakterizide Titer beobachtet.
Wenn ΔG287 mit dem Protein 961 fusioniert wird [NH₂-ΔG287-961-COOH – die Sequenz wurde vorstehend gezeigt], ist das so erhaltene Fusionsprotein unlöslich und muss vor der Reinigung denaturiert und renaturiert werden. Im Anschluss an die Renaturierung verblieben etwa 50% des Proteins in unlöslicher Form. Das lösliche und das unlösliche Protein wurden miteinander verglichen, und mit dem löslichen Protein wurden deutlich bessere Titer erhalten (FCA als Adjuvanz):

2996 BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133

Löslich 65536 128 4096 > 2048 > 2048 4096

Unlöslich 8192 < 4 < 4 16 n. b. n. b.
Andererseits konnten die Titer mit der unlöslichen Form jedoch verbessert werden, wenn Alaun als Adjuvanz verwendet wurde:

Unlöslich 32768 128 4096 > 2048 > 2048 2048
Bei den Hybridproteinen wurde ebenfalls 961c verwendet (vergleiche mit dem Vorstehenden). Da 961 und seine Domänen-Varianten eine effiziente Expression steuern, sind sie als N-terminaler Anteil eines Hybridproteins ideal geeignet.
Es ist verständlich, dass die Erfindung nur durch Beispiele beschrieben wird und dass Modifikationen vorgenommen werden können, während man im Rahmen der Erfindung bleibt. So wird zum Beispiel die Verwendung von Proteinen aus anderen Stämmen in Betracht gezogen [vergleiche z. B. mit WO 00/66741 hinsichtlich polymorpher Sequenzen für 287 und 953].
EXPERIMENTELLE EINZELHEITEN
Clonierungsstrategie und Konstruktion von Oligonucleotiden
Die Gene, welche die Antigene von Interesse codierten, wurden durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden amplifiziert, die auf der genomischen Sequenz von N. meningitidis B MC58 basierend konstruiert wurden. Sofern nicht anders spezifiziert, wurde immer die genomische DNA des Stammes 2996 als Matrize bei den PCR-Reaktionen verwendet, und die amplifizierten Fragmente wurden in dem Expressionsvektor pET21b+ (Novagen) cloniert, um das Protein als Produkt mit C-terminaler His-Markierungssequenz zu exprimieren, oder in pET-24b+ (Novagen) cloniert, um das Protein in „unmarkierter" Form zu exprimieren (z. B. ΔG287K).
Wenn ein Protein ohne einen Fusionspartner und mit seinem eigenen Leader-Peptid (sofern vorhanden) exprimiert wurde, wurde eine Amplifikation des offenen Leserasters (vom ATG- bis zum STOPP-Codon) durchgeführt.
Wenn ein Protein in „unmarkierter" Form exprimiert wurde, wurde das Leader-Peptid ausgelassen, indem der Amplifikations-Primer am 5'-Ende stromabwärts der vorhergesagten Leader-Sequenz konstruiert wurde.
Die Schmelztemperatur der Primer, die bei der PCR verwendet wurden, hängt von der Anzahl und der Art der hybridisierenden Nucleotide in dem vollständigen Primer ab, und wurde unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt: Tm1 = 4(G + C) + 2(A + T) (ohne zusätzliche Schwanz-Nucleotide) Tm2 = 64,9 + 0,41(% GC) – 600/N (vollständiger Primer)
Die Schmelztemperaturen der ausgewählten Oligonucleotide lagen in der Regel zwischen 65–70°C für ein vollständiges Oligo und zwischen 50–60°C für die hybridisierende Region alleine.
Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung des DNA/RNA-Synthesegeräts 394 von Perkin Elmer synthetisiert, mit 2,0 ml NH₄OH von der Säule eluiert und durch 5 Stunden Inkubation bei 56°C von Schutzgruppen befreit. Die Oligos wurden durch Zugabe von 0,3 M Na-Acetat und 2 Volumina Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die Sedimente wurden in Wasser resuspendiert.

NB – Bei allen PCR-Reaktionen wurde der Stamm 2996 verwendet, sofern nicht anders spezifiziert (z. B. Stamm MC58)

In allen Konstrukten, die mit einem ATG begannen, dem keine singuläre NheI-Schnittstelle folgte, ist das ATG-Codon Teil der NdeI-Schnittstelle, die für die Clonierung verwendet wurde. Konstrukte, die unter Verwendung von NheI als Clonierungsstelle am 5'-Ende hergestellt wurden (z. B. alle diejenigen, die 287 am N- Terminus enthalten), besitzen zwei zusätzliche Codons (GCT AGC), die mit der codierenden Sequenz des Antigens fusioniert waren.
Herstellung der chromosomalen DNA-Matrizen
Die N. meningitidis-Stämme 2996, MC58, 394.98, 1000 und BZ232 (und andere) wurden bis zur exponentiellen Wachstumsphase in 100 ml GC-Medium angezogen, durch Zentrifugation geerntet und in 5 ml Puffer (20% (Gew./Vol.) Saccharose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 8) resuspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Bakterien durch Zugabe von 10 ml Lyse-Lösung (50 mM NaCl, 1% Na-Sarkosyl, 50 μg/ml Proteinase K) lysiert und die Suspension wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden zwei Extraktionen mit Phenol (auf pH-Wert 8 äquilibriert) und eine Extraktion mit CHCl₃/Isoamylalkohol (24:1) durchgeführt. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol präzipitiert und durch Zentrifugation gesammelt. Das Sediment wurde einmal mit 70% (Vol./Vol.) Ethanol gewaschen und in 4,0 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) rückgelöst. Die DNA-Konzentration wurde durch Ablesung der OD₂₆₀ bestimmt.
PCR-Amplifikation
Das Standard-PCR-Protokoll war wie folgt: 200 ng genomischer DNA aus den Stämmen 2996, MC58, 1000 oder BZ232 oder 10 ng eines Plasmid-DNA-Präparats eines rekombinanten Clons wurden als Matrize in Gegenwart von 40 μM jedes Oligonucleotid-Primers, 400–800 μM dNTP-Lösung, 1 × PCR-Puffer (der 1,5 mM MgCl₂ enthielt), 2,5 Einheiten TaqI-DNA-Polymerase verwendet (unter Verwendung von Perkin-Elmer AmpliTaQ oder Boehringer Mannheim Expand^TM Long Template).
Nach einer ersten 3-minütigen Inkubation des gesamten Gemisches bei 95°C wurde jede Probe einer zweistufigen Amplifikation unterworfen: die ersten 5 Zyklen wurden unter Verwendung der Hybridisierungstemperatur durchgeführt, bei der der Restriktionsenzym-Schwanz des Primers ausgeschlossen war (T_m1). Daraufhin folgten 30 Zyklen bei der Hybridisierungstemperatur, die für die Volllängen-Oligos berechnet worden war (T_m2). Die Zeiten für die Verlängerung, die bei 68°C oder bei 72°C durchgeführt wurde, variierten entsprechend der Länge des ORFs, das amplifiziert werden sollte. Im Falle von ORF1 wurde mit einer Verlängerungszeit von 3 Minuten begonnen und diese jeden Zyklus um 15 Sekunden verlängert. Die Zyklen wurden mit einem Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72°C abgeschlossen.
Die amplifizierte DNA wurde direkt auf ein 1%-iges Agarosegel geladen. Das DNA-Fragment, welches der Bande mit der korrekten Größe entsprach, wurde aus dem Gel unter Verwendung des Gel-Extraktions-Kits von Qiagen nach den Angaben des Herstellers gereinigt.
Verdau der PCR-Fragmente und der Clonierungs-Vektoren
Die gereinigte DNA, die dem amplifizierten Fragment entsprach, wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen für die Clonierung in pET21b+, pET22b+ oder pET24b+ verdaut. Die verdauten Fragmente wurden unter Verwendung des QlAquick-PCR-Reinigungs-Kits (entsprechend den Angaben des Herstellers) gereinigt und entweder mit H₂O oder mit 10 mM Tris, pH-Wert 8,5 eluiert. Die Plasmid-Vektoren wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf ein 1,0%-iges Agarosegel geladen und die dem verdauten Vektor entsprechende Bande wurde unter Verwendung des QlAquick-Gel-Extraktions-Kits von Qiagen gereinigt.
Clonierung
Die jeweils einem Gen entsprechenden Fragmente, die zuvor verdaut und gereinigt worden waren, wurden in pET21b+, pET22b+ oder pET24b+ ligiert. Es wurde ein molares Verhältnis von 3:1 zwischen Fragment und Vektor verwendet sowie die T4-DNA-Ligase und der Ligierungs-Puffer, der durch den Hersteller mitgeliefert wurde.
Das rekombinante Plasmid wurde in die kompetenten E. coli-Stämme DH5 oder HB101 transformiert, dies erfolgte durch 40 Minuten Inkubation der Ligase-Reaktionslösung und der Bakterien auf Eis und anschließend für 3 Minuten bei 37°C. Dann wurden 800 μl LB-Nährmedium zugegeben und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Microfuge zentrifugiert, in etwa 200 μl des Überstandes resuspendiert und auf LB-Agar mit Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert.
Die Durchmusterung auf rekombinante Clone wurde durch die Anzucht zufällig ausgewählter Kolonien über Nacht bei 37°C in 4,0 ml LB-Nährmedium + 100 μg/ml Ampicillin durchgeführt. Die Zeilen wurden sedimentiert und die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QlAprep-Spin-Miniprep-Kits von Qiagen nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Etwa 1 μg jeder individuellen Minipräparation wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und das verdaute Material wurde auf ein 1–1,5%-iges Agarosegel (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der Insertion) parallel zu einem Molekulargewichtsmarker (1 kB-DNA-Leiter, GIBCO) aufgetragen. Die positiven Clone wurden anhand der Größe der Insertion ausgewählt.
Expression
Nachdem jedes Gen in einen Expressionsvektor cloniert worden war, wurden die rekombinanten Plasmide in E. coli-Stämme transformiert, die für die Expression des rekombinanten Proteins geeignet waren. Es wurde 1 μg jedes Konstrukts verwendet, um, wie vorstehend beschrieben, E. coli-BL21-DE3 zu transformieren. Einzelne rekombinante Kolonien wurden in 2 ml LB + Amp (100 μg/ml) angeimpft, bei 37°C über Nacht inkubiert und dann 1:30 in 20 ml LB + Amp (100 μg/ml) in 100 ml-Flaschen verdünnt, um eine OD₆₀₀ zwischen 0,1 und 0,2 zu erhalten. Die Flaschen wurden bei 30°C oder bei 37°C in einem Kreisel-Wasserbad-Schüttler inkubiert, bis die OD₆₀₀ die exponentielle Wachstumsphase anzeigte, die für die Induktion der Expression geeignet war (OD: 0,4–0,8). Die Expression des Proteins wurde durch Zugabe von 1,0 mM IPTG induziert. Nach 3 Stunden Inkubation bei 30°C oder bei 37°C wurde die OD₆₀₀ gemessen und die Expression untersucht. Es wurde 1,0 ml aus jeder Probe in einer Microfuge zentrifugiert und das Sediment wurde in PBS resuspendiert und durch SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Blau analysiert.
Reinigung der His-markierten Proteine
Es wurden verschiedene Formen von 287 aus den Stämmen 2996 und MC58 cloniert. Diese wurden mit einer His-Markierungs-Fusion am C-Terminus konstruiert und umfassten die reife Form (As 18-427), Konstrukte mit Deletionen (Δ1, Δ2, Δ3 und Δ4) und Clone, die entweder die B- oder die C-Domäne umfassten. Für jeden Clon, der als His-Fusion gereinigt wurde, wurde eine Einzelkolonie ausgestrichen und über Nacht bei 37°C auf einer LB/Amp-(100 μg/ml)Agarplatte angezogen. Eine von dieser Platte isolierte Kolonie wurde in 20 ml LB/Amp-(100 μg/ml)Flüssigmedium angeimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln angezogen. Diese Übernacht-Kultur wurde 1:30 in 1,0 l LB/Amp-(100 μg/ml)Flüssigmedium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (30 oder 37°C) angezogen, bis die OD₅₅₀ Werte zwischen 0,6–0,8 erreicht hatte. Die Expression des rekombinierten Proteins wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1,0 mM) induziert und die Kultur wurde weitere 3 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden durch 15 Min. Zentrifugation bei 8.000 × g und 4°C geerntet. Das Bakteriensediment wurde in 7,5 ml entweder (i) kaltem Puffer A (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat-Puffer, 10 mM Imidazol, pH-Wert 8,0) für lösliche Proteine oder (ii) Puffer B (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 8,8 und wahlweise 8 M Harnstoff) für unlösliche Proteine resuspendiert. Proteine, die in löslicher Form gereinigt wurden, umfassen 287-His, Δ1, Δ2, Δ3 und Δ4287-His, Δ4287MC58-His, 287c-His und 287cMC58-His. Das Protein 287bMC58-His war unlöslich und wurde entsprechend anders gereinigt. Die Zellen wurden durch viermalige Behandlung über 30 sec. bei 40 W mit Ultraschall auf Eis unter Verwendung des Branson-Ultraschallgeräts 450 aufgebrochen und 30 min bei 4°C mit 13.000 × g zentrifugiert. Bei unlöslichen Proteinen wurden die Sedimente in 2,0 ml Puffer C (6 M Guanidin-Hydrochlorid, 100 mM Phosphat-Puffer, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) resuspendiert und 10 Durchgänge mit einem Dounce-Homogenisator behandelt. Das Homogenat wurde 30 min bei 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde aufbewahrt. Die Überstände sowohl der löslichen als auch der unlöslichen Präparate wurden mit 150 μl Ni²⁺-Harz (das zuvor entweder mit Puffer A oder mit Puffer B je nach Bedarf äquilibriert worden war) gemischt und 30 min bei Zimmertemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Bei dem Harz handelte es sich um Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), das entsprechend dem Protokoll des Herstellers behandelt worden war. Das Batch-Präparat wurde 5 min bei 700 × g und 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Harz wurde 10 min zweimal (chargenweise) mit 10 ml Puffer A oder B gewaschen, dann in 1,0 ml Puffer A oder B resuspendiert und auf eine Einweg-Säule aufgetragen. Das Harz wurde mit entweder (i) Puffer A bei 4°C oder (ii) Puffer B bei Zimmertemperatur weiterhin gewaschen, bis die OD₂₈₀ des Durchlaufs Werte von 0,02–0,01 erreicht hatte. Anschließend wurde das Harz entweder mit (i) kaltem Puffer C (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat-Puffer, 20 mM Imidazol, pH-Wert 8,0) oder (ii) Puffer D (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 6,3 und wahlweise 8 M Harnstoff) weiter gewaschen, bis die OD₂₈₀ des Durchlaufs Werte von 0,02–0,01 erreicht hatte. Das His-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 700 μl entweder (i) kaltem Elutions-Puffer A (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat-Puffer, 250 mM Imidazol, pH-Wert 8,0) oder (ii) Elutions-Puffer B (10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 4,5 und wahlweise 8 M Harnstoff) eluiert, und es wurden Fraktionen gesammelt, bis die OD₂₈₀ anzeigte, dass das rekombinante Protein vollständig erhalten worden war. Ein Aliquot von 20 μl aus jeder eluierten Fraktion wurde mittels SDS-PAGE analysiert. Die Protein-Konzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Testansatzes abgeschätzt.
Renaturierung der denaturierten His-Fusionsproteine
Da für die Solubilisierung von 287bMC8 eine Denaturierung erforderlich war, wurde vor der Immunisierung ein Renaturierungsschritt durchgeführt. Den vorstehend erhaltenen denaturierten Fraktionen wurde Glycerin zugefügt, um eine Endkonzentration von 10% (Vol./Vol.) einzustellen. Die Proteine wurden unter Verwendung von Dialyse-Puffer I (10% (Vol./Vol.) Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphat-Puffer, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 2,0 M Harnstoff, pH-Wert 8,8) auf 200 μg/ml verdünnt und gegen den gleichen Puffer 12–14 Stunden bei 4°C dialysiert. Dann wurde 12–14 Stunden bei 4°C eine weitere Dialyse mit Puffer II (10% (Vol./Vol.) Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphat-Puffer, 50 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, pH-Wert 8,8) durchgeführt. Die Konzentration des Proteins wurde unter Verwendung der folgenden Formel abgeschätzt: Protein (mg/ml) = (1,55 × OD₂₈₀) – (0,76 × OD₂₆₀)
Immunisierung
Balb/C-Mäuse wurden mit den Antigenen an den Tagen 0, 21 und 35 immunisiert und die Seren wurden am Tag 49 analysiert.
Analyse der Seren – ELISA
Der keine Kapseln bildende Stamm MenB M7 und die Kapseln-bildenden Stämme wurden auf Schokolade-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden von den Agarplatten unter Verwendung von sterilen Dracon-Tupfern gesammelt und in Mueller-Hinton-Nährmedium (Difco), das 0,25% Glucose enthielt, angeimpft. Das Wachstum der Bakterien wurde alle 30 Minuten durch Ablesen der OD₆₂₀ überwacht. Die Bakterien wurden wachsen gelassen, bis die OD Werte zwischen 0,4–0,5 erreichte. Dann wurde die Kultur 10 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterien wurden zweimal mit PBS gewaschen, dann in PBS, das 0,025% Formaldehyd enthielt, resuspendiert und 1 Stunde bei 37°C und anschließend über Nacht bei 4°C unter Rühren inkubiert. Jeweils 100 μl der Bakterienzellen wurden den Vertiefungen einer Greiner-Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBT-Waschpuffer (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen. Es wurden 200 μl eines Sättigungspuffers (2,7% Polyvinylpyrrolidon 10 in Wasser) jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBT gewaschen. Anschließend wurden 200 μl eines verdünnten Serums (Verdünnungs-Puffer: 1% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% NaN₃ in PBS) jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. Dann wurden 100 μl eines mit HRP konjugierten anti-Maus-Serums aus Kaninchen (Dako), das 1:2000 mit Verdünnungspuffer verdünnt worden war, jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT-Puffer gewaschen. Es wurden 100 μl Substratpuffer für die HRP (25 ml Citratpuffer, pH-Wert 5, 10 mg O-Phenyldiamin und 10 μl H₂O₂) jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurden jeder Vertiefung 100 μl 12,5%-ige H₂SO₄ zugegeben und die OD₄₉₀ wurde aufgezeichnet. Die ELISA-Titer wurden willkürlich als die Verdünnung eines Serums berechnet, die einen OD₄₉₀-Wert von 0,4 über dem Spiegel des Präimmun-Serums ergab. Ein ELISA wurde als positiv bewertet, wenn die Verdünnung des Serums mit einem OD₄₉₀-Wert von 0,4 höher als 1:400 lag.
Analyse der Seren – FACS-Scan-Bakterien-Bindungs-Testansatz
Der keine Kapseln bildende Stamm MenB M7 wurde auf Schokolade-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden von den Agarplatten unter Verwendung von sterilen Dracon-Tupfern gesammelt und in 4 Röhrchen angeimpft, die jeweils 8 ml Mueller-Hinton-Nährmedium (Difco) enthielten, das 0,25% Glucose enthielt. Das Bakterienwachstum wurde alle 30 Minuten durch Ablesen der OD₆₂₀ überwacht. Die Bakterien wurden wachsen gelassen, bis die OD Werte zwischen 0,35–0,5 erreichte. Die Kultur wurde 10 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment wurde in Blockierungspuffer (1% BSA in PBS, 0,4% NaN₃) resuspendiert und 5 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden in Blockierungspuffer in einer OD₆₂₀ von 0,05 resuspendiert. Es wurden 100 μl Bakterienzellen jeder Vertiefung einer Costar-Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Dann wurden 100 μl verdünntes (1:100, 1:200, 1:400) Serum (in Blockierungspuffer) jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert, der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden durch Zugabe von 200 μl Blockierungspuffer pro Vertiefung in jeder Vertiefung gewaschen. Es wurden 100 μl R-Phycoerythrin, das mit dem F(ab)₂-Fragment eines Ziegen-anti-Maus-Antikörpers konjugiert und 1:100 verdünnt worden war, jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden durch 5 Minuten Zentrifugation bei 4.000 UpM sedimentiert und durch Zugabe von 200 μl Blockierungspuffer pro Vertiefung gewaschen. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden in 200 μl PBS, 0,25% Formaldehyd pro Vertiefung resuspendiert. Die Proben wurden in FACS- Scan-Röhrchen überführt und abgelesen. Die eingestellten Bedingungen für die FACS-Scan (Laser-Stärke 15 mW) waren: FL2 an; FSC-H-Schwellenwert: 92; FCS-PMT-Spannung: E 01; SSC-PMT: 474; Verstärkungsfaktor 6,1; FL-2-PMT: 586; Kompensations-Werte: 0.
Analyse der Seren – Testansatz auf Bakterizidie
Der N. meningitidis-Stamm 2996 wurde über Nacht bei 37°C auf Schokolade-Agarplatten unter 5% CO₂ angezogen (ausgehend von einer eingefrorenen Stammkultur). Die Kolonien wurden gesammelt und verwendet, um 7 ml Mueller-Hinton-Nährmedium (Difco), das 0,25% Glucose enthielt, in einer OD₆₂₀ von 0,05–0,08 anzuimpfen. Die Kultur wurde etwa 1,5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert, bis die OD₆₂₀ Werte zwischen 0,23–0,24 erreichte. Die Bakterien wurden mit 50 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,2, der 10 mM MgCl₂, 10 mM CaCl₂ und 0,5% (Gew./Vol.) BSA enthielt (Testansatz-Puffer), zu einer Arbeitskonzentration von 10⁵ KbE/ml verdünnt. Das Gesamtvolumen des abschließenden Reaktionsgemisches betrug 50 μl, wobei 25 μl eine serielle zweifache Verdünnung des Testserums, 12,5 μl Bakterien mit der Arbeitskonzentration und 12,5 μl Komplement aus Kaninchen-Jungtieren (Endkonzentration 25%) waren.
Die Kontrollen umfassten Bakterien, die mit Komplement-Serum inkubiert wurden, sowie Immunseren, die mit Bakterien und mit Komplement, das durch 30 Sek. Erhitzen auf 56°C inaktiviert worden war, inkubiert wurden. Sofort nach der Zugabe des Komplements aus Kaninchen-Jungtieren wurden 10 μl der Kontrollen auf Mueller-Hinton-Agarplatten unter Verwendung des Neigungs („tilt")-Verfahrens ausplattiert (Zeitpunkt 0). Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde 1 Stunde bei 37°C unter Rotieren inkubiert. Es wurden 7 μl jeder Probe auf Mueller-Hinton-Agarplatten in einem Tupfen ausplattiert, wohingegen 10 μl der Kontrollen auf Mueller-Hinton-Agarplatten unter Verwendung des Neigungs-Verfahrens ausplattiert wurden (Zeitpunkt 1). Die Agarplatten wurden 18 Stunden bei 37°C inkubiert und die Kolonien, die den Zeitpunkten 0 und 1 entsprachen, wurden ausgezählt.
Analyse der Seren – Western Blot-Analyse
Gereinigte Proteine (500 ng/Bahn), Vesikel der äußeren Membran (5 μg) und Gesamt-Zellextrakt (25 μg), die aus dem MenB-Stamm 2996 stammten, wurden auf ein 12%-iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen und auf eine Nitracellulose-Membran übertragen. Der Transfer wurde über 2 Stunden mit 150 mA bei 4°C unter Verwendung von Transfer-Puffer (0,3% Tris-Base, 1,44% Glycin, 20% (Vol./Vol.) Methanol) durchgeführt. Die Membran wurde über Nacht bei 4°C durch Inkubation in Absättigungs-Puffer (10% entrahmte Milch, 0,1% Triton X100 in PBS) abgesättigt. Dann wurde die Membran zweimal mit Waschpuffer (3% entrahmte Milch, 0,1% Triton X100 in PBS) gewaschen und 2 Stunden bei 37°C mit Maus-Serum inkubiert, das 1:200 mit Waschpuffer verdünnt worden war. Die Membran wurde zweimal gewaschen und 90 Minuten mit einer 1:2000-Verdünnung von ante-Maus-Ig inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert worden war. Die Membran wurde zweimal mit 0,1% Triton X100 in PBS gewaschen und mit dem Opti-4CN-Substrat-Kit (Bio-Rad) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser beendet.
Die OMVs („outer membrane vesicle", äußere Membranvesikel) wurden wie folgt hergestellt: der N. meningitidis-Stamm 2996 wurde über Nacht bei 37°C unter 5% CO₂ auf 5 GC-Platten angezogen, mit einer Öse geerntet und in 10 ml 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 2 mM EDTA resuspendiert. Es wurde eine Hitzeinaktivierung bei 56°C über 45 Minuten durchgeführt und die Bakterien wurden durch 5 Minuten Behandlung mit Ultraschall (50% Arbeitszyklus, 50% Leistung, 3 mm-Mikrospitze, Branson-Ultraschall-Gerät) auf Eis aufgebrochen. Die nicht aufgebrochenen Zellen wurden durch 10 Minuten Zentrifugation bei 5.000 × g entfernt, der Überstand, der die Gesamt-Zellhüll-Fraktion enthielt, wurde gewonnen und bei 50.000 × g und einer Temperatur von 4°C über Nacht erneut zentrifugiert. Das Sediment, welches die Membranen enthielt, wurde in 2% Sarkosyl, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 2 mM EDTA resuspendiert und 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, um die inneren Membranen zu solubilisieren. Die Suspension wurde 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen, und der Überstand wurde 3 Stunden bei 50.000 × g erneut zentrifugiert. Das Sediment, das die äußeren Membranen enthielt, wurde in PBS gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels des D.C.-Protein-Tests von BioRad (modifiziertes Lowry-Verfahren) unter Verwendung von BSA als Standard gemessen.
Die Gesamt-Zell-Extrakte wurden wie folgt hergestellt: der N. meningitidis-Stamm 2996 wurde über Nacht auf einer GC-Platte angezogen, mit einer Öse geerntet und in 1 ml 20 mM Tris-HCl resuspendiert. Es wurde 30 Minuten eine Hitzeinaktivierung bei 56°C durchgeführt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Hybrid-Protein der Formel NH₂-A-B-COOH, wobei A das Protein ΔG287 aus Neisseria umfasst und B das Protein 953 aus Neisseria umfasst, und wobei die Aminosäuresequenz des Hybrid-Proteins wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist oder eine Sequenz ist, die dazu eine Sequenzidentität von mehr 70% aufweist.
Protein nach Anspruch 1, wobei ΔG287 aus dem N.meningitidis-Stamm 2996 oder dem N.meningitidis-Stamm 394/98 ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei 953 aus dem N.meningitidis-Stamm 2996 oder dem N.meningitidis-Stamm 394/98 ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei A und B aus dem gleichen Stamm von N.meningitidis sind.
Protein nach Anspruch 1, umfassend die in SEQ ID NO: 6 genannte Aminosäuresequenz.