【発明の詳細な説明】
ナイセリア・メニンジティディス・サブユニットＴＢＰ２
本発明は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎisseria meningitidis）のト
ランスフェリン受容体のＴbp２サブユニットの新規変異体、医薬としてのその使
用、ならびにこの変異体をコードしているＤＮＡフラグメントに関する。
概して言えば、髄膜炎は、ウイルス起源のものまたは細菌起源のもののいずれ
かである。主に原因となる細菌は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meni
ngitidis）およびヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈaemophilus influenzae）
であり、各々、細菌性髄膜炎のケースの約４０％および５０％に関係している。
フランスでは、１年につき約６００〜８００件のナイセリア・メニンジティデ
ィス（Ｎ．meningitidis）髄膜炎が記録される。アメリカ合衆国では、ケースの
数は、１年につき約２,５００〜３,０００件にのぼる。
ナイセリア．メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）種は、莢膜多糖の性質
にしたがって血清グループに細分化される。１２種類の血清グループが存在する
が、髄膜炎のケースの９０％は、３種類の血清グループ：Ａ、ＢおよびＣに起因
する。
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）血清グループＡおよび
Ｃによって生じる髄膜炎を予防する、莢膜多糖に基づく有効なワクチンが存在す
る。これらの多糖は、そのままでは、２歳の子供において免疫原性をほとんど示
さず、免疫記憶を誘発しない。しかしながら、これらの欠点は、これらの多糖を
担体タンパクにコンジュゲートさせることによって克服することができる。
対照的に、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）グループＢ
の該多糖は、コンジュゲートされた形態であるか否かに無関係に、ヒトにおいて
免疫原性をほとんど示さない。したがって、多糖を基剤とするワクチン以外の、
特に血清グループＢのナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）に
よって誘発された髄膜炎に対するワクチンを接種するのが非常に望ましいと思わ
れる。
このために、既に、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）の
外膜の種々のタンパクが提案されている。この点について、ヒトトランスフェリ
ンに対する膜受容体に対する特別な研究が行われた。
概して言えば、細菌の大多数は、該細菌の増殖のために鉄を必要とし、該細菌
は、この金属を獲得するために特異的な系を発生させた。特に、ヒトの厳密な病
原体であるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）に関しては、
鉄は、トランスフェリンおよびラクトフェリンなどのヒトの鉄輸送タンパクから
摂取されるだけである。というのは、遊離形の鉄の量は、ヒトにおいてごくわず
か（１０-18Ｍ程度）であり、いずれにせよ細菌を増殖させるのに不充分だから
である。
したがって、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）は、ヒト
トランスフェリンに対する受容体およびヒトラクトフェリンに対する受容体を有
しており、それにこれらの鉄キレート化タンパクを結合させることができ、次い
で、その増殖に必要とされる鉄を摂取することができる。
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株Ｂ１６Ｂ６のトラ
ンスフェリン受容体は、Schryvers et al．［WO 91/12591］によって膜抽出物か
ら精製された。この精製されたタンパクは、ＳＤＳの存在下でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の後に視覚化されたように、実質的には、２つのタイプのポリ
ペプチド：１００kＤの高い見かけの分子量を有するポリペプチドおよび約７０k
Ｄの低い見かけの分子量を有するポリペプチドからなっていると思われる。
特にＳchryversによって行われた精製の生成物は、恣意的な定義により、およ
び、本発明の目的のために、ヒトトランスフェリン受容体（ＨＴＲ）と称し、該
受容体を構成するポリペプチドをサブユニットと称する。本明細書では、以下、
高分子量のサブユニットおよび低分子量のサブユニットを、各々、Ｔbp１および
Ｔbp２と称する。
Ｓchryvers et al.の先駆的研究以来、実際に、それぞれのトランスフェリン
受容体の構成が異なる少なくとも２つのタイプの菌株があることが発見された。
これは、種々雑多な起源のナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis
）の数十種類の菌株の外膜抽出物を研究することによって明らかにされた。まず
、これらの膜抽出物をＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動に付
し、次いで、ニトロセルロース膜上に電気移動させた（ウェスタンブロット法）
。これらのニトロセルロース膜を以下の条件下でインキュベートした：
ａ）ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株Ｂ１６Ｂ６か
ら精製したトランスフェリン受容体に対して向けられるウサギ抗血清（ＩＭ２３
９４とも称される）の存在下；
ｂ）ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株Ｍ９８２から
精製したトランスフェリン受容体に対して向けられるウサギ抗血清（ＩＭ２１６
９とも称される）の存在下；または
ｃ）ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヒトトランスフェリンの存在下。
ａ）およびｂ）に関しては、トランスフェリン受容体サブユニットの認識は、
ペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ免疫グロブリン抗体を添加し、次いで、こ
の酵素に対する基質を添加することによって視覚化される。
下記第Ｉ表および第II表は、ＳＤＳの存在下での電気泳動の後、７.５％ポリ
アクリルアミドゲル上で見られるようないくつかの代表的な菌株のプロフィルを
示す；バンドは、キロダルトン（kＤ）で表した見かけの分子量によって特徴付
けられる：
表の最初の２行に示した結果は、２つのタイプの菌株があることを示す。
最初のタイプ（第Ｉ表）は、ウェスタンブロット法で、用いた実験条件下、両
方のサブユニットが抗ＩＭ２３９４受容体抗血清によって認識されるが、一方、
高分子量サブユニットだけが抗ＩＭ２１６９受容体抗血清によって認識される受
容体を有する菌株に対応する。
第２のタイプ（第II表）は、ウェスタンブロット法で、用いた実験条件下、両
方のサブユニットが抗ＩＭ２１６９受容体抗血清によって認識されるが、一方、
高分子量サブユニットだけが抗ＩＭ２３９４受容体抗血清によって認識される受
容体を有する菌株に対応する。
したがって、抗原性相違は、低分子量サブユニットに関して存在する。しかし
ながら、この相違は、Griffiths et al．［FEMS Microbiol．Lett．（1990）69:
31］によってなされた示唆に反して、２つの主要なタイプに分割するので、限
定される。
これらの観察結果に基づいて、出願WO 93/6861は、Ｍ９８２（ＩＭ２１６９）
タイプまたはＢ１６Ｂ６（ＩＭ２３９４）タイプの菌株を区別している。
第II表に記載した菌株に加えて、Ｍ９８２タイプ菌株は、例えば、菌株Ｓ３０
３２（１２,Ｐ１.１２.１６）、６９４０（１９,Ｐ１.６）、Ｍ９７８（８,Ｐ１
.１,７）、２２２３（Ｂ：ｎｄ）、１６１０（Ｂ：ｎｄ）、Ｃ７０８（Ａ：４,
Ｐ１.７）、８９１とも称されるＭ９８１（Ｂ：４）、および２９９６（Ｂ：２
ｂ,Ｐ１.２）である。本出願人は、ジェイ・プールマン（J．Poolman）博士（オ
ランダ国ビルソーベンのＲＩＶＭ）から菌株Ｓ３０３２、Ｍ９７８およびＭ９８
１を、アクトマン（Achtman）博士（ドイツ国ベルリンのマックス・プランク・
インスティチュート（Ｍax Ｐlanck Ｉnstitute））から菌株Ｃ７０８をフリー
ギフトとして受け取った。
菌株ＩＭ２１５４（血清グループＣ）は、Ｂ１６Ｂ６タイプのものである一例
として記載される。
前記発見に基づいて、高分子量サブユニットは、両方のタイプの抗血清によっ
て認識されるので、受容体の起源の菌株に関係なく、全てのナイセリア・メニン
ジティディス（Ｎ．meningitidis）感染に対して有効であるワクチンは、高分子
量サブユニットからなるのが適切であるという仮説が可能であった。しかしなが
ら、高分子量サブユニットは、中和タイプ抗体の生産を誘発することができない
と思われるので、事実はそうではあり得ないと思われる。２つの受容体サブユニ
ットのうち小さい方（Ｔbp２）のみがこの機能を行うことができると思われる。
前記のとおり２つの主要なグループがある程度まで同定されたので、実際、タ
ンパクＴbp２は、Ｔbp１よりもむしろ、それを可能なワクチン候補にする多くの
特性：遍在する発現、微生物の表面でのアクセシビリティ、中和抗体を誘発する
能力および制限された変異性を有する。
この発見により、
（ｉ）Ｂ１６Ｂ６タイプの少なくとも１つの菌株のＨＴＲおよびＭ９８２タイ
プの少なくとも１つの菌株のＨＴＲ（WO 93/6861）；または
（ii）Ｂ１６Ｂ６タイプの少なくとも１つの菌株のＴbp２またはＭ９８２タイ
プの少なくとも１つの菌株のＴbp２（WO 93/7172）
を含有する医薬組成物が既に開示されている。
工業的規模での開発のために多量のタンパクを得るために、種々のＴbp２をコ
ードしているＤＮＡフラグメントがクローンされた。菌株Ｍ９８２およびＢ１６
Ｂ６のＴbp２サブユニットのアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡフラグメント
は、特許出願EPA 586,266（１９９４年３月９日に公開された）に開示されてい
る。これらの配列は、本明細書の配列番号１〜４に記載されている。
Ｔbp２サブユニットの研究により、起源の菌株とは関係なく、少なくとも１つ
が特別な性質に関連している３つの主要な構造ドメインを明らかにすることがで
きた。定義により、Ｍ９８２ Ｔbp２およびＢ１６Ｂ６ Ｔbp２のドメインは、ア
ミノ酸の位置、含まれる種々のドメインの限界を示すことによって、ならびに配
列番号１および３に示されるナンバリングを引用して、下記表に示すように決め
られた。
この定義は、Ｍ９８２タイプ配列またはＢ１６Ｂ６タイプ配列と参照配列とを
最大のホモロジーに整列させた後、全てのＭ９８２タイプＴbp２またはＢ１６Ｂ
６タイプＴbp２に同様に適用される。したがって、一例として、および、図１を
参照して、以下のとおり、菌株８６８０のＴbp２サブユニットのドメインの位置
が示される：第１ドメイン（１−３３４）、第２ドメイン（３３５−５３０）お
よび第３ドメイン（５３１−６７７）。
現在、Ｎ末端ドメインまたは第１ドメインがトランスフェリン結合部位全体を
含有しており、したがって、おそらく外側を向いているということが知られてい
る。その結果、Ｎ末端ドメインだけがワクチン目的のための優れた成分を構成す
る。
さらにまた、最大ホモロジーに整列させたＭ９８２ Ｔbp２配列およびＢ１６
Ｂ６ Ｔbp２配列の比較研究により、Ｍ９８２ Ｔbp２のヒンジ部（前記表に示す
ように、ヒンジドメインとも称される）内に位置する４つの超可変部が明らかに
なった。これら超可変部は、Ｂ１６Ｂ６ Ｔbp２にはない。これらの超可変部は
、全てのＭ９８２タイプＴbp２に存在する（図２）。Ｂ１６Ｂ６タイプ菌株は、
それらがない。本明細書で、以下、「Ｍ９８２タイプヒンジ部」は、これらの４
つの超可変部を有するヒンジ部を意味する解される。
該配列の研究により、最初にWO 93/6861に開示されたＭ９８２タイプおよびＢ
１６Ｂ６タイプの定義を変えることができた。現在、超可変部の存在または不在
に基づいて、したがって、tbp２遺伝子のサイズに基づいて、菌株のタイプを定
義するという意見がある（Ｍ９８２タイプtbp２については約２.１kbおよびＢ１
６Ｂ６タイプtbp２については１.８kb）。
種々のＭ９８２タイプＴbp２の配列の比較により、ヒンジ部の変異性が他の２
つのドメインの変異性よりも大きいことも知られている。ヒンジ部は、ヒトトラ
ンスフェリン結合機能について不可欠のものであるとは思われなかったので、こ
の領域の役割は、少なくとも一部において、後に他の菌株と接触した個体の免疫
系による菌株の認識を回避するために、「スクリーン」タイプ変異性を誘発する
ことであると仮定された。
この仮説のもとに、Ｍ９８２タイプ菌株のヒンジ部は、ワクチンの調製におい
て大きな問題を構成する。実際、この領域が免疫優性である場合、免疫感作の間
に誘発された抗体は、この領域に支配的に向けられるであろうし、したがって、
免疫応答は、同種菌株のＴbp２タンパクに対して特異的であろう。
前記観察結果および仮説を考慮して、ワクチン目的のために、Ｍ９８２タイプ
Ｔbp２全体ではないが、少なくともそれらの４つの超可変部を欠失しているかま
たは第２ドメインおよび第３ドメインを欠失しているＴbp２を使用することが既
に提案されている。
広いスペクトル免疫性の誘発に欠くことのできない領域は、おそらく第１ドメ
インであり、特に優れている医薬組成物は、例えば少なくとも以下の成分からな
り得ると思われる：
（ｉ）少なくとも部分的に第２ドメインまたは第３ドメインを欠失しているＭ
９８２タイプＴbp２に対応するポリペプチド、例えば、Ｍ９８２タイプＴbp２の
第１ドメインに対応するポリペプチド；および
（ii）Ｂ１６Ｂ６タイプＴbp２または少なくとも部分的に第２ドメインもしく
は第３ドメインを欠失しているＢ１６Ｂ６タイプＴbp２に対応するポリペプチド
、例えば、Ｂ１６Ｂ６タイプＴbp２の第１ドメインに対応するポリペプチド（PC
T出願、出願番号PCT/FR95/000701；菌株のタイプの最初の定義を引用する）。
その後、Ｍ９８２タイプＴbp２のヒンジ部の免疫優性の研究は、続けられ、多
数のＭ９８２タイプ菌株に関して、
（ｉ）Ｍ９８２ Ｔbp２タンパク全体（１００％Ｔbp２）；
（ii）最初の３５０個のＮ末端アミノ酸だけを含有するトランケートされたＭ
９８２ Ｔbp２タンパク（５０％Ｔbp２）；および
（iii）ヒンジ部の４つの超可変部（Δ３６２−３７９；Δ４１８−４４４；
Δ４６５−４８１；およびΔ５００−５２０）を欠失しているＭ９８２ Ｔbp２
タンパク（８０％Ｔbp２）
に対して得られた血清の交差反応性を分析することによって完了した。
これを行うために、まず、組換え法によりイー・コリ（Ｅ．coli）中で、Ｔbp
２タンパク全体、トランケートされたＴbp２および欠失したＴbp２タンパクを生
産させた。Ｍ９８２ Ｔbp２全体に関しては、その生産は、EPA 586,266（1994年
3月9日に公開された）に開示されている。他の２つのＭ９８２ Ｔbp２の生産は
、本明細書の実施例４および６に記載する。
免疫優性の研究前に、高度免疫血清の調製およびこれらの血清の分析は、本明
細書の実施例８の課題である。交差反応性の研究は、実施例９にさらに詳しく記
載する。
ＳＤＳ−Ｐage電気泳動に続くイムノリベーリング（immunorevealing）による
外膜タンパクの分析よるか、または、ＰＣＲ増幅tbp２遺伝子のサイズに基づい
て、Ｍ９８２タイプにおいて分類した４４種類の菌株をそれらの交差反応性につ
いてドットブロット法（全微生物についての分析）によって研究した（実施例９
を参照）。これらの菌株は、ディ・エイ・コーガント（Ｄ．Ａ．Ｃaugant）博士
から無料で得た。それらは、世界の種々の地域から計画的な時間に単離された。
したがって、このコレクションは、代表的なものである。１４種類の菌株は、抗
１００％Ｍ９８２ Ｔbp２血清によって認識されないが、一方、４種類だけは、
抗８０％Ｍ９８２ Ｔbp２血清による認識から逃れ、１種類だけは、抗５０％Ｍ
９８２ Ｔbp２血清による認識から逃れる。
これらの結果から、超可変部を欠失しているＴbp２タンパクがタンパク全体に
ついて観察されたものよりも高い交差反応性を誘発するという最初の仮説が確認
される。５４種類のうち１種類の菌株だけが認識されないので、該交差反応性は
、トランスフェリン結合ドメインだけを保存したＴbp２タンパクの場合、再度、
増強される。Ｔbp２の免疫原性は、同種菌株に対して特異的な抗体を誘発するヒ
ンジ部の存在によって左右される。少なくとも、４つの超可変部を削除すること
によって、ヒンジ部の外側に位置するエピトープに対する免疫応答が促進される
と思われる。
Ｍ９８２タイプの５４種類の菌株のうち４種類の菌株だけは、抗８０％Ｔbp２
血清と反応しなかった。この結果は、特に、これらの菌株のうち少なくとも１種
類がＭ９８２参照菌株と非常に異なるという事実によって説明される。したがっ
て、既に知られている医薬組成物に少なくとも第３の価を付加することが必要で
あると思われる。
したがって、本発明は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis
）菌株のヒトトランスフェリン受容体（ＨＴＲ）の低分子量サブユニット（Ｔbp
２）である実質的に精製された形態のタンパクであって、該Ｔbp２サブユニット
がドットブロット法においてヒンジ部の超可変部（Ｍ９８２ Ｔbp２ Δ３６２−
３７９；Δ４１８−４４４；Δ４６５−４８１；Δ５００−５２０）を欠失して
いるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）Ｍ９８２菌株のＴbp
２（Ｍ
９８２ Ｔbp２）に対応するポリペプチドに対して得られた抗血清によって認識
されないことを特徴とし、（i）該Ｔbp２サブユニットが約２.１kbのＤＮＡフラ
グメントによってコードされていることを特徴とするタンパクに関する。
すなわち、本発明のＴbp２サブユニットは、（i）約２.１kbのＤＮＡフラグメ
ントによってコードされていることを特徴とするので、起源であるナイセリア・
メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株は、それ自体、そのゲノムが約２
.１KdのＴbp２サブユニットをコードしているオープンリーディングフレーム（
ＯＲＦ）からなることを特徴としている。
本発明のタンパクは、約２.１kbのＤＮＡフラグメントによってコードされて
いるので、前記したことを考慮して、このタンパクがＭ９８２タイプヒンジ部を
有することは、全く明らかである。
抗８０％Ｔbp２血清と抗５０％Ｔbp２血清との間の反応性は、抗８０％Ｔbp２
血清の生産に役立った構築物においていくつかの可変配列がそのままであるのに
対して、５０％タンパクにおいてこれらの配列の全てが削除されるという事実に
よっても説明される。実際、５４種類のＭ９８２タイプ菌株のうち１種類の菌株
だけは、抗５０％Ｔbp２血清と反応しなかった。それは、１９８７年の流行の間
にチリで単離され、ＥＴ−５電気泳動グループに属する、菌株８６８０ Ｂ：１
５：Ｐ１.３である。この菌株は、ノルウェー国オスロのナショナル・インステ
ィチュート・オブ・パブリック・ヘルス(Ｎational Ｉnstitute of Ｐublic Ｈe
alth)、ダブリュエイチオー・コラボレイティング・センター・フォー・リファ
レンス・アンド・リサーチ・オン・メニンゴコクシ（ＷＨＯ Ｃollaborating Ｃ
entre for Ｒeference and Ｒesearch on Ｍeningococci）、ディ・エイ・コー
ガント（Ｄ．Ａ．Ｃaugant）博士のコレクションから入手される。したがって、
この菌株から誘導されるＴbp２タンパクは、特に優れているワクチン候捕を構成
する。
したがって、本発明のＴbp２サブユニットは、ドットブロット法において、１
位のアミノ酸から３５０位のアミノ酸にわたるＭ９８２ Ｔbp２フラグメントに
対して、すなわち、実質的に第２ドメインおよび第３ドメインを欠失しているナ
イセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）Ｍ９８２菌株のＴbp２に対
応するポリペプチドに対して得られた抗血清によって認識されないナイセリア・
メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株から誘導されるのが好都合である
。
本発明のＴbp２サブユニットは、特に、Ｔbp２サブユニットが膜フラクション
のウェスタンブロット法においてＭ９８２菌株のＨＴＲに対して得られた抗血清
（抗Ｍ９８２ＨＴＲ抗血清）およびＢ１６Ｂ６菌株のＨＴＲに対して得られた抗
血清（抗Ｂ１６Ｂ６ＨＴＲ抗血清）によって認識されるナイセリア・メニンジテ
ィディス（Ｎ．meningitidis）菌株から誘導される。かかる抗血清は、特許出願
WO 93/6861に開示されている。
「ナイセリア．メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株から誘導される
Ｔbp２サブユニット」は、明らかに、最も一般的な意味で取られる誘導体；すな
わち、物理的なプロセスに限定されず、知的なプロセスの結果を意味すると解さ
れる。したがって、この表現は、イー・コリ（Ｅ．coli）などにおける組換え法
によって生産されたＴbp２を包含する。
本発明のＴbp２サブユニットは、配列番号１に示されるＭ９８２ Ｔbp２のア
ミノ酸配列とのホモロジー（同一性）の程度が６０〜７０％、好都合には約６５
％であるアミノ酸配列からなる。別の観点から、本発明のＴbp２サブユニットは
、１位のアミノ酸から６７７位のアミノ酸までの配列番号に示される８６８０
Ｔbp２のアミノ酸配列とのホモロジーの程度が８０〜１００％、好都合には、９
０〜１００％、好ましくは、９５〜１００％であるアミノ酸からなる。特定の具
体例によると、１位のアミノ酸残基で始まり、６７７位のアミノ酸残基で終わる
、実質的に配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。
本発明のＴbp２サブユニットは、Ｔbp２が誘導されるナイセリア・メニンジテ
ィディス（Ｎ．meningitidis）菌株の高分子量サブユニット（Ｔbp１）から分離
された形態であるか、または、このＴbp１と会合してヒトトランスフェリン受容
体であると思われるＴbp１−Ｔbp２複合体を形成していてもよい。分離された形
態であろうとＴbp１−Ｔbp２複合体の形態であろうと、本発明のＴbp２サブユニ
ットは、実質的に精製されている。すなわち、自然に存在する環境から分離され
て
いる。これは、とりわけ、特にヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．pylori）細胞質タ
ンパクおよび周縁細胞質タンパクを含まない調製物である。
本発明は、また、本発明のタンパクおよびこのタンパクの前駆体をコードして
いる単離されたＤＮＡフラグメントにも関する；後者は、本発明のタンパクと同
種または異種のシグナルペプチドからなる。本発明のタンパクをコードしている
ＤＮＡフラグメントは、３０位の核酸から２０６１位の核酸まで配列番号５に示
される。本発明のタンパクの前駆体をコードしているＤＮＡフラグメントは、１
位の核酸から２０６１位の核酸まで配列番号５に示される。
本発明のＤＮＡフラグメントは、また、高ストリンジェンシー条件下、配列番
号５に示されるＤＮＡフラグメントにハイブリダイズすることができることを条
件として、配列番号５に示される核酸配列以外の核酸配列からなる。
ハイブリダイゼーション法および高ストリンジェンシー条件の使用は、当業者
の能力の範囲内である。例えば、ハイブリダイゼーション法は、Ausubel et al.
，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Inc.，1994；
Silhavy et al.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Lab.，
1984：Davis et al.，A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial
Genetics，CSH Lab.，1980に開示されている。以下に示す一般的な方法につい
ては、２つの相補鎖が分離する融点（Ｔm）の臨界値を計算することができる式
において、ハイブリダイゼーション条件を最適化するために考慮されるべきであ
る重要なパラメーターが示される（Casey & Davidson，Nucl．Acid Res．(1977)
4: 1539）。この式は、以下のとおりである：Ｔm＝８１.５＋０.５×（％Ｇ＋Ｃ
）＋１.６ log（陽イオン濃度）−０.６×（％ホルムアミド）。高ストリンジェ
ンシー条件下、ハイブリダイゼーション温度は、計算した融点よりも低い約２０
〜２５℃である。例えば、高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ溶液（１Ｍ
ＮaＣl、０.１Ｍクエン酸ナトリウム、pＨ７.０）中、約５５〜６０℃で、４〜
１６時間、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションインキュ
ベーションを行うことによって得られる。
本発明は、（i）特に本発明のＴbp２サブユニットの欠失により誘導されるポ
リペプチドおよび（ii）かかるポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ
フラグメントにも関する。
これは、さらに詳しくは、第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインが
、Ｍ９８２参照菌株のＴbp２サブユニットの配列と最大ホモロジーに整列させる
ことによって、特に第１ドメインおよび第２ドメインが同時かつ完全には欠失し
ないことを条件として本発明のＴbp２サブユニットの少なくとも１つのドメイン
の全体的または部分的欠失によって定義される本発明のＴbp２サブユニットのア
ミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
「別の配列から誘導される配列」は、明らかに、知的プロセスによりこの他の
配列から生じる配列を意味すると解される。
他の観点から、本発明のＴbp２サブユニットから特にＴbp２サブユニットのＣ
末端側にあるかまたは最初の４０個のアミノ酸の領域にある１つ以上のアミノ酸
の欠失により誘導される、ヒトトランスフェリン結合能を有するポリペプチドで
ある。Ｃ末端は、第２ドメインおよび第３ドメインに対応するＴbp２部分である
と定義される。
さらに詳しくは、本発明のポリペプチドは、本発明のＴbp２サブユニットから
以下の欠失により誘導されるアミノ酸配列を有する：
（ｉ）特に、第２ドメインおよび第３ドメインから選択されるＴbp２サブユニ
ットの少なくとも１つのドメインの全体的または部分的欠失；好ましくは、第３
ドメインもしくは第２ドメインおよび第３ドメインの全体的または部分的欠失；
（ii）特に、第１ドメインおよび第３ドメインの全体的欠失、または
（iii）特に、第３ドメインの完全な欠失および第１ドメインの部分的欠失、
所望により、第２ドメインの部分的欠失。
好都合には、本発明のポリペプチドは、第３ドメインの部分的な、実質的に全
体的なまたは全体的な欠失、好ましくは全体的な欠失を有する。この場合、第１
ドメインおよび第２ドメインは、お互いに無関係に、完全に維持されるか、また
は、部分的もしくは全体的に欠失している。
以下の組合せが可能である（完全な第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ド
メインを各々１、２および３で表し、ＯおよびΔは、各々、部分的および全体的
に欠失していることを意味する）：
１，２，Δ３；１，Ｏ２，Δ３；１，Δ２，Δ３；
Ｏ１，２，Δ３；Ｏ２，Ｏ２，Δ３；Ｏ１，Δ２，Δ３；
Δ１，２，Δ３；Δ１，Ｏ２，Δ３；
１，２，Ｏ３；１，Ｏ２，Ｏ３；１，Δ２，Ｏ３；
Ｏ１，２，Ｏ３；Ｏ１，Ｏ２，Ｏ３；Ｏ１，Δ２，Ｏ３；
Δ１，２，Ｏ３；Δ１，Ｏ２，Ｏ３。
本発明のＴbp２サブユニットから第２ドメインの部分的欠失により誘導された
、完全なまたは実質的に完全な第１ドメインおよび第３ドメインを含有するポリ
ペプチドにも関心がある；すなわち、組合せ１，Ｏ２，３。（「実質的に完全に
維持されたドメイン」は、本明細書で、以後、約５以下の非常に少数の位置で修
飾されたドメインを意味すると解される）。本発明のポリペプチドは、組合せＯ
１，Ｏ２，３（第１ドメインの部分的な欠失が好都合には１位のアミノ酸から約
４０位のアミノ酸にわたるＭ９８２ Ｔbp２のものと相同の領域の全てまたは一
部に影響を及ぼす）に対応することもできる。。
好都合には、ポリペプチドが特に本発明のＴbp２サブユニットの第２ドメイン
の部分的な欠失により誘導される場合、この部分的欠失は、実質的には、以下の
範囲にわたるＭ９８２配列の領域の相同体である第２ドメインの１つ以上の領域
に影響を及ぼす：
（ｉ）３８８位のアミノ酸から３９６位のアミノ酸まで；
（ii）４１８位のアミノ酸から４７６位のアミノ酸まで；および
（iii）４９９位のアミノ酸から５２１位のアミノ酸まで。
別法としては、第２ドメインの部分的欠失は、実質的に、１つ以上の超可変部
に影響を及ぼす。これらの部分は、最大ホモロジーに整列させた後、以下の範囲
にわたるＭ９８２配列の部分の相同体である：
（ｉ）３６２位のアミノ酸から３７９位のアミノ酸まで；
（ii）４１８位のアミノ酸から４４４位のアミノ酸まで；
（iii）４６５位のアミノ酸から４８１位のアミノ酸まで；および
（iv）５００位のアミノ酸から５２０位のアミノ酸まで。
好ましくは、該部分的欠失は、実質的には、前記の４つの部分（i）〜（iv）
に影響を及ぼす。
本発明のポリペプチドが、特に本発明のＴbp２サブユニットの第３ドメインの
完全な欠失および第２ドメインの実質的に完全な欠失により誘導され、完全な第
１ドメインからなるか、または、さらに第１ドメインのＮ末端部分の欠失により
誘導される場合、第２ドメインの実質的に完全な欠失は、３４６〜３６１位のう
ちの１つの位置のアミノ酸から５４３位のアミノ酸にわたるＭ９８２ Ｔbp２サ
ブユニットの第２ドメインの領域の相同体である領域にわたる。
ポリペプチドが特に本発明のＴbp２サブユニットの第１ドメインの部分的欠失
により誘導される場合、この部分的欠失は、好都合には、１位のアミノ酸から２
８１位のアミノ酸にわたるＭ９８２タイプＴbp２サブユニットの第１ドメインの
領域の相同体である領域の全てまたは一部に影響を及ぼす。
前記の一例として、１位のアミノ酸から約４０位のアミノ酸にわたるＭ９８２
タイプＴbp２サブユニットの第１ドメインの領域の相同体である領域の全てまた
は一部に影響を及ぼす関心のある欠失が記載される。
ホモロジーの程度は、最大のホモロジーの程度を得るように配列を整列させる
ことにより容易に算出される；このために、図１に示すように、人為的に空白の
位置を導入することが必要である。最適な整列が達成されると、ホモロジーの程
度は、位置の合計数に対して、２つの配列のアミノ酸が同一であると判明する全
ての位置を合計することによって確立される。
非常に多くの組合せのために、一般的な手段における以外の相同性配列を記載
するのは、冗長である。しかしながら、当業者は、タンパクの生物学的機能また
は免疫学的機能を完全に破壊することなく、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置
き換えることができる一般的な規則を知っている。
好ましい一例として、配列が以下の配列との少なくとも７０〜７５％、好都合
には、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、絶対的に好ましくは
１００％のホモロジーを有する本発明のポリペプチドが記載される：
（ｉ）１位のアミノ酸から３３４〜３５１位のうちの１つの位置、好都合には
３３４位のアミノ酸までの、配列番号５に示される配列；
（ii）１位のアミノ酸から６７７位のアミノ酸までの、３７７〜３８５領域、
４０７〜４６５領域および４８８〜５０８領域を欠失している、配列番号５に示
される配列；
（iii）１位のアミノ酸から６７７位のアミノ酸までの、３５１〜３６８位、
４０７〜４３３位、４５４〜４７０位および４８９〜５０８位を欠失している、
配列番号５に示される配列、または
（iv）３３５位のアミノ酸から５３０位のアミノ酸までの、配列番号５に示さ
れる配列。
本発明のポリペプチドは、少なくとも１０個、好都合には少なくとも２０個、
好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸か
らなるアミノ酸配列を有する。
本発明のポリペプチドが、さらに、本発明のＴbp２サブユニットの配列とのホ
モロジーを示さないアミノ酸配列からなることも全く明らかである。
概して言えば、さらなる配列は、Ｔbp２を除く他のポリペプチドのものであっ
てもよい。
例えば、さらなる配列は、本発明のポリペプチドのＮ末端位置にあるシグナル
ペプチドのものであってよい。シグナル配列の例は、配列番号１〜４に示される
。さらにまた、適切な異種シグナル配列は、リポタンパクの前駆体にあるシグナ
ル配列であることが示される。
本発明のＴbp２サブユニットは、天然菌株から直接精製されるか、または、異
種もしくは同種の発現系において組換え法によって得られる。本発明のポリペプ
チドは、好ましくは、組換え産生物である。組換え法による発現を用いるために
は、菌株８６８０のＴbp２をコードしているＤＮＡフラグメントをクローン化し
、配列決定した。
本発明の課題は、また、以下のものでもある：
（ｉ）本発明のＴbp２サブユニットまたはポリペプチドをコードしている単離
されたＤＮＡフラグメント；
（ii）適切な宿主細胞における発現のために供給することができる成分の制御
下に置かれた、少なくとも１つの本発明のＤＮＡフラグメントからなる発現カセ
ット；
（iii）本発明の発現カセットを含有する宿主細胞を培養する、本発明のポリ
ペプチドの生産方法。
発現カセットにおいて、本発明のＤＮＡフラグメントは、ポリペプチドの分泌
が要求されるか否かに依存して、ＤＮＡフラグメントによってコードされている
ポリペプチドに対して異種であるかまたは異種ではないシグナルペプチドをコー
ドしているＤＮＡブロックと組み合わせるかまたは組み合わせない。好ましくは
、この分泌は、要求されるであろう。
異種シグナルペプチド（シグナル領域）またはプロモーターをコードしている
ＤＮＡブロックなどの成分は、既に、非常に多く存在しており、当業者に知られ
ている。該当業者の一般的な能力により、該当業者は、発現が考えられる宿主細
胞に適合するであろう特定のシグナル領域またはプロモーターを選択することが
できるであろう。
本発明の方法のために、宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌または酵母であって
よく、細菌または酵母が好ましい。ここでまた、特定の系の選択は、当業者の能
力の範囲内である。
最後に、本発明は、また、活性成分として、本発明のＴbp２サブユニットまた
はポリペプチドからなる医薬組成物にも関する。
本発明の医薬組成物は、特に、予防または治療において、ナイセリア・メニン
ジティディス（Ｎ．meningitidis）に対するヒトにおける免疫応答、とりわけナ
イセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）感染からヒトを防御するよ
うなワクチン効果を誘発するのに有用である。
本発明の組成物は、さらに、
（ｉ）Ｔbp２サブユニットが膜フラクションのウェスタンブロット法において
抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されるが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清によ
って認識されないナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株か
ら誘導されるさらなるＴbp２サブユニット、または
（ii）Ｔbp２が膜フラクションのウェスタンブロット法において抗Ｍ９８２Ｈ
ＴＲ抗血清によって認識されるが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清によって認識され
ないナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株のＴbp２サブユ
ニットから特にＴbp２サブユニットのＣ末端側にある１つ以上のアミノ酸の欠失
により誘導される、ヒトトランスフェリン結合能を有するポリペプチド、または
（iii）Ｔbp２サブユニットが膜フラクションのウェスタンブロット法におい
て抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されないが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清
によって認識されるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株
から誘導されるさらなるＴbp２サブユニット、または
（iv）Ｔbp２サブユニットが膜フラクションのウェスタンブロット法において
抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されないが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清に
よって認識されるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）のＴbp
２サブユニットから特にＴbp２サブユニットのＣ末端側にある１つ以上のアミノ
酸の欠失により誘導される、ヒトトランスフェリン結合能を有するポリペプチド
からなる。
本発明の組成物は、好都合には、上記４つの成分から選択される少なくとも１
つ、好ましくは２つのさらなる成分からなる。
Ｍ９８２タイプのさらなるＴbp２サブユニットは、好都合には、配列番号１に
示されるＭ９８２ Ｔbp２のアミノ酸配列とのホモロジーの程度が９０〜１００
％であるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｍ９８２ Ｔbp２サブユニットで
ある。
Ｂ１６Ｂ６タイプのさらなるＴbp２サブユニットは、好都合には、配列番号３
に示されるＢ１６Ｂ６ Ｔbp２のアミノ酸配列とのホモロジーの程度が９０〜１
００％であるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｂ１６Ｂ６ Ｔbp２サブユニ
ットである。
好ましくは、さらなるポリペプチド（ii）は、膜フラクションのウェスタンブ
ロット法において抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されるが抗Ｂ１６Ｂ６
ＨＴＲ抗血清によって認識されないナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meni
ngitidis）菌株のＴbp２サブユニットから特に第２ドメインの部分的な欠失によ
り、とりわけ、Ｔbp２サブユニットの第２ドメインの超可変部の実質的な欠失に
より、または、Ｔbp２サブユニットの第２ドメインまたは第３ドメインの実質的
な欠失により誘導される。
好都合には、このポリペプチドは、配列番号１に示されるＭ９８２ Ｔbp２の
アミノ酸配列とのホモロジーの程度が９０〜１００％であるアミノ酸配列からな
るＴbp２サブユニットから誘導される。好ましくは、Ｍ９８２ Ｔbp２から誘導
されるポリペプチドである。
好ましくは、さらなるポリペプチド（iv）は、膜フラクションのウェスタンブ
ロット法において抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されないが抗Ｂ１６Ｂ
６ ＨＴＲ抗血清によって認識されるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．men
ingitidis）菌株のＴbp２サブユニットから特にＴbp２サブユニットの第２ドメ
インまたは第３ドメインの、好ましくは第２ドメインおよび第３ドメインの実質
的な欠失により誘導される。
好都合には、このポリペプチドは、配列番号３に示されるＭ９８２ Ｔbp２の
アミノ酸配列とのホモロジーの程度が９５〜１００％であるアミノ酸配列からな
るＴbp２サブユニットから誘導される。好ましくは、Ｂ１６Ｂ６ Ｔbp２から誘
導されるポリペプチドである。
好ましい具体例によると、本発明の組成物は、
（ｉ）本発明のＴbp２サブユニットから特にＴbp２サブユニットの第２ドメイ
ンの部分的な欠失により、とりわけＴbp２サブユニットの第２ドメインの超可変
部の実質的な欠失により誘導されるポリペプチド；
（ii）Ｔbp２が膜フラクションのウェスタンブロット法において抗Ｍ９８２
ＨＴＲ抗血清によって認識されるが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清によって認識さ
れないナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）のＴbp２サブユニ
ットから特に第２ドメインの部分的な欠失により、とりわけＴbp２サブユニット
の第２ドメインの超可変部の実質的な欠失により誘導されるポリペプチド；およ
び
（iii）Ｔbp２サブユニットが膜フラクションのウェスタンブロット法におい
て抗Ｍ９８２ ＨＴＲ抗血清によって認識されないが抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清
によって認識されるナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株
から誘導されるＴbp２サブユニット
からなる。
本発明の医薬組成物は、慣用手段で調製される。特に、本発明のポリペプチド
は、製薬的見地から許容されるアジュバント、希釈剤またはビヒクルと合わせら
れる。本発明の組成物は、例えば注射用懸濁液剤の形態で、ワクチン分野におけ
る使用において慣用的な経路により、特に、皮下、筋肉内または静脈内投与され
る。該投与は、単投与で、または、ある時間間隔の後に１回もしくは数回繰り返
される投与で行うことができる。適切な投与量は、種々のパラメーター、例えば
、処置される個体または投与モードなどにより変化する。
本発明の課題を決定するためには、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．me
ningitidis）菌株ＩＭＰ２３９４（Ｍ９８２）およびＩＭ２１６９（Ｂ１６Ｂ６
）が、各々、登録番号ＬＮＰ Ｎ １５１１およびＬＮＰ Ｎ １５２０の下、パリ
75015 リュ・デュ・ドクトール・ルー２５番のコレクション・ナシオナル・ド
ゥ・クルチュール・デ・ミクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）アンスティテュ・パス
トウール（Ｃollection Ｎationale de Ｃulture des Ｍicroorganismes（ＣＮ
ＣＭ）Ｉnstitut Ｐasteur）から広く入手可能であることが指摘される。
本発明は、以下の実施例においておよび図１〜５を参照してさらに詳しく記載
する。
図１は、各々、カネヒサ（Ｋanehisa）プログラム（Ｂisance ＣＩＴＩ−２）
にしたがって最大ホモロジーでのＭ９８２ Ｔbp２配列および８６８０ Ｔbp２配
列の整列を示す。ホモロジーの程度は、６５％である。
図２は、Ｍ９８２（１）、６９４０（２）、２２２３（３）、Ｃ７０８（４）
、Ｍ９７８（５）、１６１０（６）、８６７（７）、Ｓ３０３２（８）および９
８１（９）Ｔbp２のヒンジドメイン（第２ドメイン）の配列の最大ホモロジーで
の整列を示す。配列番号１に示すように、Ｍ９８２ Ｔbp２配列の番号付けは、
イタリック体で示す。好ましい具体例により欠失させられる超可変部の配列は、
ボールド体で示す。（Ｃ）は、コンセンサス配列を示す。
図３〜５は、各々、プラスミドpＴＧ５７８２、pＴＧ５７５５およびpＴＧ５
７８３の構造を示す。
実施例１：ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）８６８０菌
株のＨＴＲの精製
１Ａ−培養
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）８６８０菌株の冷凍試
料をミュラー・ヒントン・ブロス（ＢＭＨ、ディフコ（Ｄifco））約１ml中に取
った。次いで、該細菌懸濁液を、加熱血液（cooked blood）（５％）を含有する
固体ミュラー・ヒントン培地上に散布する。
１０％ＣＯ2を含有する雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした後、
ＢＭＨ（pＨ７.２）１５０mlに接種するために、細菌層を回収し、２５０mlのエ
ーレンマイヤーフラスコ３個に分配した。３７℃で３時間、撹拌しつつインキュ
ベーションを続けた。このようにして調製した３つの培養物の各々は、遊離形の
鉄キレート化剤であるエチレンジアミン−ジ(Ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸)（Ｅ
ＤＤＡ、シグマ（Ｓigma））３０μmで補足したＢＭＨ（pＨ７.２）４００mlに
接種することができる。
３７℃で１６時間、撹拌しつつ培養した後、該培養物をグラム染色後に顕微鏡
下で観察することによってそれらの純度について検査する。該懸濁液を遠心分離
にかけ、微生物を含有するペレットを計量し、−２０℃で貯蔵する。
１Ｂ−精製
精製の方法は、実質的には、Schryvers et al．（前掲）によって開示された
方法である。
１Ａで得た細菌ペレットを解凍し、次いで、５０mＭトリスＨＣlバッファー（
pＨ８.０）（バッファーＡ）２００mlに再懸濁させる。該懸濁液を、４℃で、１
５,０００ｘｇで２０分間遠心分離にかける。該ペレットを回収し、次いで、バ
ッファーＡに最終濃度１５０ｇ／リットルで再懸濁させる。１５０mlのフラクシ
ョンを、高圧下で作動するセルライザー（cell lyser）（ラニー（Ｒannie）、
モデル８.３０Ｈ）中、８００バールで８分間処理する。このようにした得た細
胞溶解物を、１５,０００ｘｇで、４℃で１５分間遠心分離にかける。上清を回
収し、次いで、２００,０００ｘｇで、４℃で７５分間遠心分離にかける。上清
を除去した後、該ペレットをバッファーＡ中に取り、ローリー法にしたがってタ
ンパクを検査した後、懸濁液の濃度を５mg／mlに調節した。
Schryversにより開示された方法にしたがって膜懸濁液１.４mlにビオチニル化
したヒトトランスフェリン１.７５mgを添加する。膜フラクションの最終濃度は
、４mg／mlである。該混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃
で７５分間、１００,０００ｘｇで遠心分離にかける。膜ペレットを、０.１Ｍ
ＮaＣlを含有するバッファーＡ中に取り、室温で６０分間インキュベートする。
可溶化後、この懸濁液にある量の３０％（ｗ／ｖ）Ｎラウロイル・サルコシン
（Ｌauroyl Ｓarkosine）および５００mＭ ＥＤＴＡを添加して、サルコシル（
Ｓarkosyl）およびＥＤＴＡの最終濃度を各々０.５％および５mＭにする。３７
℃で１５分間、撹拌しつつインキュベートした後、予めバッファーＡで洗浄した
ストレプトアビジン−アガロース樹脂（ピアス（Ｐierce））１mlを添加した。
懸濁液を室温で１５分間インキュベートし、次いで、１０００ｘｇで１０分間遠
心分離にかける。次いで、該樹脂をカラム中で調整し、溶出液を除去する。
該樹脂を、１Ｍ ＮaＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ ０.５％サルコシル（Ｓarkosyl）
を含有する５０mＭトリス−ＨＣlバッファー（pＨ８.０）（バッファーＢ）の３
カラム容量倍で洗浄し、次いで、７５０mＭグアニジンＨＣlを含有するバッファ
ーＢの１カラム容量倍で洗浄する。次いで、トランスフェリン受容体を、２Ｍグ
アニジンＨＣlを含有するバッファーＢで溶離する。５０mMトリスＨＣl（pＨ８.
０）、１Ｍ ＮaＣlのＩＶを含有する管中に、容量がＩＶと一致するフラクショ
ンにおいて溶出液を回収する。溶出液の２８０nmでの光学密度をＵＶ検出器によ
りカラムの流出口で測定する。
溶離ピークに相当するフラクションを回収し、０.０５％サルコシルを含有す
る１０mＭリン酸塩バッファー（pＨ８.０）に対して透析し、凍結乾燥させた。
凍結乾燥生成物を１０倍高い濃度で水中に取る。該溶液を０.０５％サルコシル
を含有する５０mＭリン酸塩バッファー（pＨ８.０）（バッファーＣ）に対して
再度透析し、次いで、該溶液を０.２２μmの多孔性膜上で濾過する。
タンパク含有量を測定し、無菌条件下、バッファーＣの添加により、１mg／ml
に調節する。この調製物を−７０℃で貯蔵する。
実施例２：疎水性クロマトグラフィーによるナイセリア・メニンジティディス
（Ｎ．meningitidis）８６８０菌株のＴbp２サブユニットの精製
実施例１に記載と同一の条件下、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meni
ngitidis）８６４０菌株の培養ならびに膜懸濁液の調製までの精製工程を行う。
１容量倍の膜懸濁液に、同量の、２Ｍ ＮaＣl、２０mＭ ＥＤＴＡ、１％（ｗ
／ｖ）サルコシルを含有する５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.０）を添加する。該
混合物を、３７℃で１５分間、ゆっくりと撹拌しつつインキュベートする。次い
で、１容量倍のこの懸濁液を、ヒトトランスフェリンに結合された同量のセファ
ロース（Sepharose）４Ｂ樹脂と接触させる。このアフィニティ樹脂は、製造者
の推奨に従って、セファロース４Ｂ−ＣＮＢr（ファルマシア（Ｐharmacia））
にヒトトランスフェリン（アメリカ合衆国セントルイスのシグマ（Ｓigma））を
グラフトさせることによって結合された。リガンドの密度は、樹脂ml当たりトラ
ンスフェリン５mgである。室温で１時間、ゆっくりと回転式撹拌しつつ接触させ
る。次いで、該樹脂をカラム中で調整し、直接溶出液を除去する。
該樹脂を、１Ｍ ＮaＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ、０.５％サルコシルを含有する３
カラム容量倍の５０mＭトリス−ＨＣlバッファー（pＨ８.０）（バッファーＢ）
で洗浄し、次いで、７５０mＭグアニジンＨＣlを含有する１カラム容量倍のバッ
ファーＢで洗浄する。次いで、トランスフェリン受容体を５０mＭトリス−ＨＣl
バッファー（pＨ８.０）、１Ｍ ＮaＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ、０.０５％サルコシ
ルおよび２ＭグアニジンＨＣlで溶離する。ＵＶ検出器によりカラムの流出口で
溶出液の２８０nmでの光学密度を測定する。溶離ピークに相当するフラクション
を合わせ、３容量倍の冷エタノールの添加によりタンパクを沈殿させる。
＋４℃で一晩インキュベートした後、１０,０００ｘｇで１時間の遠心分離に
より該タンパクを回収する。沈殿物を、ある量の、０.５Ｍ ＮaＣl、５Ｍグアニ
ジンＨＣlを含有する１０mＭリン酸塩バッファー（pＨ７.０）（バッファーＤ）
と一緒にして、最終タンパク濃度を約１mg／mlにする。該溶液を、予め同一バッ
ファーで平衡化させたフェニル−セファロース樹脂（ファルマシア(Ｐharmacia)
）と接触させる。室温で２時間、回転式撹拌しつつ、浴中でインキュベーション
を行う。次いで、ゲルをカラム中で調整する。
これらの条件下、高分子量サブユニット（Ｔbp１）は、直接溶出液中で回収さ
れ、一方、低分子量サブユニット（Ｔbp２）は、樹脂に結合される。該カラムを
３容量倍のバッファーＤで洗浄し、次いで、５容量倍の１０mＭリン酸塩バッフ
ァー（pＨ７.０）で洗浄する。Ｔbp２を０.５％サルコシルを含有する１０mＭリ
ン酸塩バッファー（pＨ７.０）で溶離する。Ｔbp２溶離バッファー中に含有され
る過剰のサルコシルをエタノール沈殿法により除去し、次いで、タンパクを、０
.０５％サルコシルを含有する５０mＭリン酸塩バッファー（pＨ８.０）（バッフ
ァーＣ）中に取る。
次いで、該溶液を０.２２μmの多孔性膜上で濾過する。無菌条件下、タンパク
含有量を測定し、バッファーＣの添加により１mg／mlに調節する。この調製物を
−７０℃で貯蔵する。
実施例３：８６８０ Ｔbp２をコードしているＤＮＡフラグメントのクローン
化
慣用のフェノールクロロホルム法によりＤＮＡを抽出する。湿重量１〜２gに
相当する微生物の量について、該ペレットを、１０mg／mlのプロテイナーゼＫ（
シグマ（Ｓigma））１mlで補足した溶解溶液（５０mＭグルコース、１０mＭＥＤ
ＴＡ、２５mＭトリス（pＨ８.０））２５ml中に取る。該混合物を室温で１０分
間インキュベートし、次いで、２０％サルコシル０.５mlを添加する。この後、
４℃で１０分間インキュベートする。１８Ｇ針に該懸濁液を通した後、２mg／ml
のＲＮＡse Ａ（シグマ（Ｓigma））１mlを添加し、次いで、懸濁液を３７℃で
９０分間インキュベートする。この段階の最後に０.５容量倍のフェノールの添
加によりＤＮＡを抽出する。１０分間撹拌することにより該抽出を行い、次いで
、０.５容量倍のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を添加する
。５０００回転／分で１５分間、該混合物を遠心分離にかけた後、上清を回収し
、フェノール／クロロホルムで再度処理する。水性相が透明になるまで、フェノ
ール／クロロホルム抽出工程を繰り返す。
該抽出の最後に、０.３Ｍ酢酸ナトリウム（pＨ７）の存在下、２容量倍の無水
エタノールでＤＮＡを沈殿させ、次いで、７０％エタノールで洗浄する。該ＤＮ
Ａを蒸留水１ml中に取り、次いで、２６０nmおよび２８０nmで分光光学測定法で
アッセイする。１ ＯＤ ２６０nm単位は、ＤＮＡ ５０ng／μlに相当する。ＤＮ
Ａ沈殿物は、ＯＤ ２６０／ＯＤ ２８０比が１.８〜２である場合に申し分なく
かつ利用可能であると考えられる。
ゲノムＤＮＡ１０ngから、以下のプライマーによりＰＣＲによってtbp２遺伝
子を増幅させる：
５’Ｉnter１ Ｂam：5'-CCACGGATCCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC-3'
３’Ｍet ２ Ｅco：5'-CGCGGATCCTGCTATGGTG-3'。
反応媒質は、以下のとおりである：ゲノムＤＮＡ １０ng；５'および３'プラ
イマー０.５μＭ；dＮＴＰ（ベーリンガー（Ｂoehringer））２００μＭ；１０
ｘＰＣＲバッファー（バイオタク（Ｂiotaq））１０μｌおよびＴaqポリメラー
ゼ（バイオタク（Ｂiotaq））２.５Ｕ。蒸留水で反応容量を１００μlに調節す
る。トリオブロック（Ｔrioblock）装置（バイオラブズ（Ｂiolabs））における
増幅条件は、以下のとおりである：変性：９４℃、１分；アニーリング：５８℃
、２
分；伸長：７２℃、３分；サイクルの数：２５。
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントを、ＴＡＥバッファー（０.０
４Ｍトリス酢酸塩、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ（pＨ８.０））中で調製した１％分取
用アガロースゲル（「電気泳動用」、ＢＲＬ）上での電気泳動に付す。tbp２遺
伝子に相当する増幅バンドを切断する。アガロースに含有されるＤＮＡをジーン
クリーン（Ｇeneclean）キット（バイオ（Ｂio）１０１）により精製する。次い
で、３７℃で２時間、ＤＮＡをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化する。次いで、消
化されたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により再精製し、２容量倍のエ
タノールで沈殿させ、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー（１０mＭトリス−
ＨＣl、１mＭ ＥＤＴＡ（pＨ８.０））２０μl中に取る。
ベクターpＢＳＫ（−）（ストラータジーン（Ｓtratagene））をＥcoＲＩおよ
びＢamＨＩで消化し、次いで、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩインサートについて前記した
ように精製する。
以下の条件下、Ｔ４リガーゼ（ベーリンガー（Ｂoehringer））の存在下、１
６℃で一晩、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩインサートおよびpＢＳＫを連結させる：ベク
ター１００ng；インサート２００〜３００ng；１０Ｘ Ｔ４リガーゼバッファー
（ベーリンガー(Ｂoehringer)）１μl；リガーゼ５Ｕ；水を適量加えて１０μl
に調製。
イー・コリ（Ｅ．coli）ＸＬ１−Ｂlue（recＡ１、endＡ１、gyrＡ９６、thi
−１、hsdＲ１７、supＥ４４、relＡ１、lac、（Ｆ' proＡＢ、lacqＺδＭ１５
、Ｔn１０（tetr））を、１０μg／mlのテトラサイクリンの存在下、３７℃で一
晩、ＳＢ培地（ディフコ（Ｄifco））１０ml中で予備培養する。予備培養物５０
０μlを用いて、ＢＳ培地１リットルに接種する。該培養物が指数期に達した後
（ＯＤ ６００nm＝０．８）、微生物を水中１０％グリセロール中で、洗浄容量
を５００mlから１２０mlに減少させながら、３回洗浄する。４℃で１５分間、２
５００ｘｇで遠心分離にかけた後、上清を除去する。最後の洗浄後、細菌を３ml
の１０％グリセロール、１mＭヘペス（pＨ７.５）中に取る。該微生物を、液体
窒素中に置いた管の中で１００μlのアリコットにする。電気応答能のある
（electrocompetent）細菌を−７０℃で１カ月間貯蔵する。
連結反応溶液５μlを用いて、２５００ボルトの電圧下、厚さ２mmのキュベッ
ト（ユーロジェンテク（Ｅurogentec））中での電気穿孔法によりイー・コリ（
Ｅ．coli）ＸＬ−１細菌１００μlを形質転換する。電気穿孔法の後、微生物を
３７℃で１時間インキュベートし、次いで、調製物の容量の１／１０および９／
１０を、Ｘ−gal（２５μg／ml）およびＩＰＴＧ（２５μg／ml）で補足したＬ
Ｂ培地（ディフコ（Ｄifco））＋アンピシリン（１００μg／ml）のプレート上
に散布し、組換えクローンの白色／青色選択を可能にする。
ＥcoＲＩ・ＢamＨＩ二重消化によって、慣用的な方法（Maniatis et al.，198
9）に従ってプラスミドをミニ調製した後、組換えクローン（白色）を分析する
。選択されたクローンは、２.１kbフラグメントを組み込んだものである。該イ
ンサートの組込みの方向は、ＨincIIによる消化の後に決定される。チップ−２
５０カラム（キット・キアゲン（Ｋit Ｑuiagen））上での精製方法を用いて、
マキシ調製により、関心のあるクローンのプラスミドＤＮＡを多量に調製する。
カラム精製したプラスミドＤＮＡ（キアゲン（Ｑuiagen））を、シークェナー
ゼ（Ｓequenase）キット（ＵＳＢ、バージョン２.０）を用いて配列決定する。
この技術は、Sanger（Sanger et al.，1997）によって開示された配列決定法か
ら誘導される。シーケンス反応につきＤＮＡ３〜５μgを用いる。該シーケンス
反応を、８Ｍ尿素の存在下、６％アクリルアミドゲルに負荷する。明らかにされ
たヌクレオチド配列および導き出されたアミノ酸配列は、配列番号５に示される
ものである。
実施例４：１位のアミノ酸から３５０位のアミノ酸までの、配列番号１に示さ
れる配列（ＩＭ２１６９）を含むポリペプチドＴ／２１６９（１，Ｏ２，Δ３；
１−３５０）
４Ａ−Ｔ／２１６９（１−３５０）をコードしているＤＮＡフラグメントの調
製：ベクターpＴＧ５７８２の構築
出願EPA 586,266に開示されているプラスミドpＴＧ３７２１から、Ｔbp２をコ
ードしている配列の下流に部位特異性突然変異誘発によりＨindIII制限部位を導
入して、プラスミドpＴＧ４７０４を得る。
プラスミドpＴＧ３７２１から、ＲlpＢの分泌についてのシグナルをコードし
ている配列および内部ＨaeII部位までの成熟Ｔbp２をコードしている配列の始め
からなるフラグメントを、プライマーＯＴＧ４９１５およびＯＴＧ４６５１を用
いてＰＣＲによって増幅させる：
次いで、該ＰＣＲフラグメントをＢspＨＩおよびＨaeIIで消化し、Ｔbp２をコ
ードしている領域の３'部分からなるpＴＧ４７０４のＨaeII−ＨindIIIフラグメ
ントと一緒に同時に、ＮcoＩおよびＨindIIIで消化した出願EPA 586,266に開示
されているプラスミドpＴＧ３７０４中に挿入して、プラスミドpＴＧ５７６８を
得る。
プラスミドpＴＧ３７２１から、Ｔbp２のＮ末端をコードしている配列からな
るフラグメントを、プライマーＯＴＧ４９２８およびＯＴＧ５０１１を用いてＰ
ＣＲにより増幅させる。
このＰＣＲフラグメントをＳphＩおよびＨindIIIで消化し、次いで、出願EPA
586,266に開示されているプラスミドpＴＧ４７１０にクローン化する；かくして
、プラスミドｐＴＧ５７４０を得る。
pＴＧ５７４０のＨaeII−ＨindIIIフラグメントは、ヒトトランスフェリン結
合ドメイン（hＴf）をコードしている配列の３'部分（第１ドメインをコードし
ている領域の３'）からなり、araＢプロモーター、シグナル配列rlpＢおよびＴb
p２の暗号配列の始めからなるpＴＧ５７６８のＢamＨＩ−ＨaeIIフラグメントと
一緒に同時に、ＢamＨＩおよびＨindIIIで消化したプラスミドpＴＧ３７０４に
挿入する；かくして、プラスミドpＴＧ５７８２を得る。このベクターは、araＢ
プラスミド、Ｔbp２のＮ末端ドメイン（１−３５０）をコードしている配列に縮
合しているＲlpＢの分泌についてのシグナルをコードしている配列からなる。
４Ｂ−Ｔ／２１６９（１−３５０）の調製および精製
イー・コリ（Ｅ．coli）菌株をpＴＧ５７８２により形質転換させる。該形質
転換体を、Ｍ９培地＋スクシネート０.５％＋アルギニン５０μg／ml＋アンピシ
リン１００μg／ml中、３７℃で培養する。指数期において、アラビノース（誘
導物質）０.２％を添加する。１時間の誘導の後、細胞を回収し、抽出物を調製
する。ウェスタンブロット分析に次いでhＴＦ−ペルオキシダーゼにより明らか
にすることにより、ＭＷがＴbp２のこのトランケート化された形態について予想
されるものに相当する優勢なバンドを検出することができる。
WO93/6861（1993年4月15日公開）の実施例４に開示されている試験において、
精製したＴ／２１６９は、殺菌性抗体を誘導することができ、その結果、ワクチ
ン目的に有用であることが証明された。
実施例５：１位のアミノ酸から３４０位のアミノ酸までの、配列番号２に示さ
れる配列（ＩＭ２３９４）を含むポリペプチドＴ／２３９４（１，Ｏ２，Δ３；
１−３４０）
５Ａ−Ｔ／２３９４（１−３４０）をコードしているＤＮＡフラグメントの調
製：ベクターpＴＧ５７５５の構築
出願EPA 586,266に開示されているプラスミドpＴＧ４７１０から、hＴf結合ド
メインのＣ末端部分をコードしている領域からなるフラグメントをプライマーＯ
ＴＧ４８７３およびＯＴＧ４８７７を用いてＰＣＲにより増幅させる。次いで、
このフラグメントをＭluＩおよびＨindIIIで消化する。
プラスミドpＴＧ４７１０をＭluＩおよびＨindIIIで消化する。Ｔbp２をコー
ドしている配列の３'部分からなるＭluＩ−ＨindIIIフラグメントをhＴf結合ド
メインのＣ末端部分をコードしているＰＣＲフラグメントに代える。かくして、
プラスミドpＴＧ５７０７を得る。プラスミドpＴＧ５７０７において、araＢプ
ロモーターおよびＴbp２をコードしている配列の始めからなるＢamＨＩ−ＭluＩ
フラグメントを、araＢプロモーター、Ｔbp２のＮ末端ドメインをコードしてい
る配列に縮合したＲlpＢの分泌についてのシグナルをコードしている配列を含有
する出願EPA 586,266に開示されているpＴＧ４７６４のＢamＨＩ−ＭluＩフラグ
メントに代える。かくして、プラスミドpＴＧ５７５５を得る。このベクターは
、araＢプロモーターおよびＴbp２のＮ末端ドメイン（１−３４０）をコードし
ている配列に縮合しているＲlpＢの分泌についてのシグナルをコードしている配
列からなる。
５Ｂ−Ｔ／２３９４（１−３４０）の調製および精製
実施例４Ｂの記載にしたがって、Ｔ／２３９４（１−３４０）を生成し、精製
する。
WO93/6861（1993年4月15日公開）の実施例４に開示されている試験において、
精製したＴ／２３９４は、殺菌性抗体を誘導することができ、その結果、ワクチ
ン目的に有用であることが証明された。
実施例６：領域３６２−３７９、４１８−４４４、４６５−４８１および５０
０−５２０が欠失している、配列が１位のアミノ酸から６９１位のアミノ酸まで
の、配列番号１に示されるものと同一であるポリペプ
チドＤ４／２１６９（１，Ｏ２，３）
領域３６２−３７９、４１８−４４４、４６５−４８１および５００−５２０
が欠失している、配列が１位のアミノ酸から６９１位のアミノ酸までの、配列番
号１に示されるものと同一であるポリペプチドＤ４／２１６９（１，Ｏ２，３）
。
６Ａ−Ｄ４／２１６９をコードしているＤＮＡフラグメントの調製
１．１．ＤＮＡフラグメントのクローン化
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）ＩＭ２１６９菌株のＴ
bp２サブユニットをコードしているＤＮＡフラグメントを、該菌株ＩＭ２１６９
の細菌培養物から抽出したゲノムＤＮＡ１０ngについて、５'および３'領域に相
補的な特異的プライマー（各々、Ａ５'およびＡ３'）を用いてＰＣＲ（ポリメラ
ーゼ連作反応）により増幅させる。
かくして、ＤＮＡフラグメントを得、ＥcoＲＩによる消化の後、これは、２１
５０ntを有する。次いで、このＥcoＲＩフラグメントをファージミド（phagemid
）pＢluescriptＳＫ（−）（ストラータジーン（Ｓtratagene））の脱リン酸化
ＥcoＲＩエンドに連結させて、組換えファージミドpＳＫ／２１６９tbp２を得る
。
１．２．欠失を行う
菌株Ｍ９８２のtbp２配列を含有するクローンpＳＫ／２１６９tbp２をクンケ
ル（Ｋunkel）法（PNAS（1985）82：448）により欠失させる。
すなわち、親ベクターの供給者であるストラータジーン（Ｓtratagene）によ
って示された方法に従って、「ヘルパー」ファージＶＣＳ Ｍ１３によってレス
キューした後、組換えファージミドpＳＫ／２１６９tbp２のファージ形態を得、
これを用いて、細菌菌株ＣＪ２３６を感染させる。ＣＪ２３６菌株により行った
dutおよびung突然変異は、結果として、ヌクレオチド前駆体dＵＴＰを取り込ん
だＤＮＡ分子の合成を有する。
ファージを回収し、一本鎖ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合物で抽出す
る。このＤＮＡを慣用的な条件下で以下のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
させる：
ハイブリダイゼーション反応を、７０℃から３０℃に温度を低下させながら３
０分間続ける。
次いで、第２の相補鎖を、慣用的な条件下、４種類のデオキシヌクレオチド、
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、全合成によって
完成させる。
かくして得られたＤＮＡで菌株イー・コリ（Ｅ．coli）ＳＵＲＥ（ストラータ
ジーン（Ｓtratagene））を形質転換させる。この菌株において、dＵＴＰを有す
る、すなわち、突然変異されない分子は、破壊される。
得られたファージをプラスミドＤＮＡの迅速な調製および適切な制限酵素によ
る消化の慣用手段によって分析する。次いで、所望の突然変異の存在をヌクレオ
チド配列決定によって確かめる。
４つの突然変異Δ１２０３−１２５６、Δ１３７１−１４５１、Δ１５１２−
１５６２およびΔ１６１７−１６７９を有するクローンpＳＫ２１６９＃７を選
択する。
６Ｂ−発現ベクターpＴＧ５７８３の構築
前記プラスミドpＴＧ５７６８をＨpaＩおよびＸcmＩで消化する。pＴＧ５７６
８のＸcmＩ−ＸcmＩフラグメントおよびプラスミドpＳＫ／２１６９ed＃７のＨp
aＩ−ＸcmＩフラグメントを同時にこのベクターに挿入して、プラスミドpＴＧ５
７８３を得る。このベクターは、araＢプロモーターおよび修飾tbp２配列（欠失
ｄ１〜ｄ４）に縮合しているＲlpＢの分泌についてのシグナルをコードしている
配列からなる。
６Ｃ−Ｄ４／２１６９の調製および精製
実施例４Ｂに従って、Ｄ４／２１６９を調製および精製する。
WO93/6861（1993年4月15日公開）の実施例４に開示されている試験において、
精製したＤ４／２１６９は、殺菌性抗体を誘導することが可能であり、その結果
、ワクチン目的に有用であることが証明された。
実施例７：ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株のＨＴ
Ｒの発現のレベルの決定
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）によるＨＴＲタンパク
の発現のレベルを、所定の数の微生物の、ペルオキシダーゼに結合したhＴfを結
合することができる能力を測定することによって決定する。
３７℃で１８時間のＭＨＡ上での予備培養物を、３０μＭ ＥＤＤＡで補足し
たＭＨＢ ５０mlを含有するエーレンマイヤーフラスコに接種する。培養の開始
時および培養の５時間後に６００nmで光学密度を測定する；これらの２つの時間
の間の光学密度の差異を増殖という。培養の５時間後、ＨＴＲの発現を以下のと
おり測定する：
１吸光度単位が３×１０9ＣＦＵ／mlに相当することが知られている６００nm
で測定した懸濁液の吸光度から培養物の細菌密度を計算する。
細菌培養物１mlを２５００ｇで１５分間遠心分離にかけ、次いで、細菌ペレッ
トをある量の５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.０）中に取って、１×１０8ＣＦＵ
／mlの懸濁液を得る。同一バッファーにおいて、この懸濁液を用いて倍数連続希
釈を行う（１／２〜１／２０４８）。これらの試料の４０μlずつを、真空下で
操作される、予めバッファーに浸漬した０.４５μmニトロセルロース膜（シュラ
イヒャー・アンド・シュール（Ｓchleicher and Ｓchull））を装着した「ドッ
ト−ブロット」装置（バイオラッド（Ｂiorad））のウエルの各々にデポジット
する。試料をデポジットした後、膜をブロッキングバッファー（５０mＭトリス
−ＨＣl（pＨ８.０）、９g／リットルＮaＣl、１０g／リットルスキムミルク）
中、室温で１時間インキュベートする。次いで、該膜をブロッキングバッファー
中１μg／mlのhＴf−ペルオキシダーゼの溶液と一緒に、３７℃で１時間、撹拌
しつつインキュベートする。ブロッキングバッファー中で３回洗浄した後、hＴf
−ペルオキシダーゼの結合を１％エタノール中０.０１％の比色分析用ペルオキ
シターゼ基質４−クロロ−１−ナフトール（４−Ｃl−Ｎ）の添加によって明ら
かにする。
室温で２０分間インキュベートした後、ＨＴＲの発現についての価を測定する
；紫色がなおも認識できる最後の希釈の逆数に一致する。測定は、肉眼で、また
は、濃度計（セビィア−プレファレンス（Ｓebia−Ｐreference）装置）を用い
て行う。
実施例８：抗組換えＴbp２（Ｍ９８２ Ｔbp２ １００％、Ｍ９８２ Ｔbp２ ８
０％およびＭ９８２ Ｔbp２ ５０％）、抗Ｍ９８２ ＨＴＲおよび抗Ｂ１６Ｂ６
ＨＴＲ高度免疫血清の調製および価測定
８Ａ−免疫原の調製
前記実施例４Ｂまたは前記実施例６Ｂに記載したイー・コリ（Ｅ．coli）菌株
の培養物を溶解装置（ラニー（Ｒannie））に通すことによって溶解させ、次い
で、遠心分離にかける。不溶性物質を厚さ５mmの１０％アクリルアミドゲル上に
負荷し（ゲル当たり不溶性タンパク１０mg）、次いで、電気泳動にかける。Ｔbp
２タンパクならびに８０％および５０％形態をクーマシーブルー染色により可視
化し、次いで、ゲルから抽出する。同時に、Ｔbp２タンパクと同一のサイズのイ
ー・コリ（Ｅ．coli）タンパクの抽出に対応する負の対照を調製する。
Ｍ９８２およびＢ１６Ｂ６ ＨＴＲを、それらの一部について、WO93／6861の
実施例１および２に開示されているように精製する。
８Ｂ−抗血清の調製
ニュージーランド・アルビノ・ウサギ（Ｎew Ｚealand slbino rabbit）に、
フロイント完全アジュバントの存在下、本実施例において前記した生成物の１つ
の５０μgを多点（multisite）皮下投与する。最初の注射の２１日後および４２
日後、フロイント不完全アジュバントの存在下、同一生成物５０μgを該ウサギ
に投与する。最後の注射の１５日後、動物血清を回収し、次いで、５６℃で３０
分間、デコンプリメンタイズし、０.２２μmの多孔性膜（ミリポア(Ｍilipore)
）上で濾過することによって滅菌する。
用いた免疫原がＨＴＲである場合、次いで、濾液を、遊離形の鉄の存在下、前
記のように培養した初期菌株（Ｍ９８２またはＢ１６Ｂ６）と接触させることに
よって枯渇させる（これらの条件下では、トランスフェリン受容体の合成が抑制
される）。接触に関する詳細は、以下のとおりである：濾液１０mlを初期菌株の
培養物１０10cfu（コロニー形成単位）に添加する。撹拌しつつ、４℃で一晩、
吸着を続ける。次いで、２５００ｘｇで１５分間の遠心分離により、細菌を除去
する。上清を回収し、次いで、前記に従って吸着を３回連続して操作する。吸着
した血清を０.２２μmの多孔性膜（ミリポア（Ｍilipore））上で濾過し、−２
０℃で貯蔵する。
組換えＴbp２タンパクに対して向けられる血清の場合、組換えタンパクを生成
するのに供し、１００μg／mlのアンピシリンで補足したＬＢ培地（ディフコ（
Ｄifco））中で５時間培養したイー・コリ（Ｅ．coli）菌株に対して吸着を行う
。
８Ｃ−血清の殺菌活性価測定
殺菌活性の試験により、抗ＨＴＲまたは抗Ｔbp２血清の、種々のナイセリア・
メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）菌株の溶解を誘発する能力を評価する
。この方法は、価測定しようとする吸着されデコンプリメンタイズされた血清の
倍数希釈液（１／４〜１／２０４８）の２つを接触させることからなる：１つは
、１／１.５に希釈した若いウサギ補体であり、１つは、ＭＨＢブロス（pＨ７.
２）３０μＭ ＥＤＤＡ中、３７℃での５時間培養物から誘導した７０の微生物
を含有する細菌懸濁液である。コップ中、これらの試薬をお互いに混合させ、３
７℃で３０分間、撹拌しつつインキュベートする。ＭＨブロス（pＨ７.２）、２
０％Ｇ補足剤（パストゥール・ダイイグナスティク（Ｐateur Ｄiagnostic））
および１５％ノーブル寒天（ディフコ（Ｄifco））からなる寒天１mlの添加によ
り微生物に対する血清の殺菌活性の反応を停止させる。次いで、該コップを、１
０％ＣＯ2の存在下、３７℃で一晩インキュベートする。結果の測定は、非溶解
細菌から形成されるコロニーを計数することからなる。価は、最初に導入された
細菌の５０％の溶解を誘発する血清の最後の希釈の逆数として定義される。
８Ｄ−抗組換えＭ９８２ Ｔbp２血清の特徴付け
微生物全体についての「ドットブロット」法によるか、または、外膜タンパク
についての「ウェスタンブロット」法により、タンパクＴbp２−１００％（血清
５７７）、Ｔbp２−８０％（５８０）、Ｔbp２−５０％（５８３）に対して、ま
たは、エシェリキア・コリ（Ｅscherichia coli）ナンセンスタンパク（対照血
清５８２）に対して各々向けられる４種類の高度免疫血清の特異性を分析する。
１．１．微生物全体についての分析
微生物の調製、それらのニトロセルロース膜上のデポジションは、実施例９に
記載のものと同様である。キレート化剤の不在下または存在下、Ｍ９８２および
Ｂ１６Ｂ６を培養する。
ブロッキングバッファーで飽和させる工程の後、該膜を、分析しようとする種
々の高度免疫血清（ブロッキングバッファー中で希釈された：１／５００〜１／
１００００の範囲の希釈液）の１つと一緒に３７℃で１時間インキュベートする
。次いで、該膜をブロッキングバッファーで２回、強く撹拌しつつ洗浄し、次い
で、ブロッキングバッファー中で１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ（ザ
イムド（Ｚymed））に結合したヤギ抗ウサギＩgＧ血清と一緒に再度インキュベ
ートして、第１の血清を明らかにする。シグナルの検出の感度を増加させるため
に、用いたペルオキシダーゼ基質は、製造者の推奨に従って用いた化学発光性基
質（Ｋit ＥＣＬ、アマーシャム（Ａmersham））である。
得られる結果は、抗イー・コリ（Ｅ．coli）タンパク血清（血清５８２）がセ
ンスにおいて良好な負の対照であるか、または、培養条件と無関係にＭ９８２お
よびＢ１６Ｂ６菌株を検出することができないことを示す。他の３つの血清は、
ＥＤＤＡの存在下で培養すると、Ｍ９８２菌株だけを高レベルで認識し、これは
、ＨＴＲの認識と一致する。実際、Ｍ９８２菌株は、キレート化剤の不在下で培
養すると、基本レベルでＨＴＲを発現し、このレベルは、キレートの存在下では
増加する。この結果は、抗Ｔbp２ １００％（５７７）、抗Ｔbp２ ８０％（５８
０）および抗Ｔbp２ ５０％（５８３）血清がＭ９８２菌株のＨＴＲに対して特
異的であることを示す。
１．２．外膜タンパクについての分析
鉄を枯渇した培地中でＭ９８２菌株を培養する。指数期培養物５ml（微生物約
１.１０8／ml）を１５００ｇで１５分間遠心分離にかける。該ペレットを１２５
mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.０）１.５ml中に取る。懸濁液を、２分間の超音波処
理（ブランソン−ソニファー（Ｂranson−Ｓonifer）４５０装置、直径３mmのプ
ローブ）により溶解させる。トリトンＸ１００を最終濃度１％まで添加し、氷上
で３０分間インキュベートすることによって溶解を続ける。懸濁液を８０００ｇ
で遠心分離にかけて、非溶解細菌を除去し、次いで、上清を１００００ｇで３０
分間遠心分離にかけて、ペレット形の外膜を得る。該ペレットを１２５mＭトリ
ス−ＨＣl（pＨ８.０）中に取り、次いで、製造者の推奨に従って用いた測微法
（キット・マイクロ−ビーシーエー(Ｋit Ｍicro−ＢＣＡ)、ピアス(Ｐierce)）
によってタンパクについてアッセイする。
レムリ（Ｌaemmli）法（Ｌaemmli．1970）に従って、ＳＤＳの存在下、ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動を行う。分離ゲルは、アクリルアミド１２.５％
を含有し、スタッキングゲルは、アクリルアミド５％を含有する。分析しようと
する試料を、サンプルバッファー（０.１２５Ｍトリスバッファー（pＨ６.８）
；グリセロール２５％、２−メルカプトエタノール２.５％、ブロモフェノール
ブルー０.００１％）中で２分の１に希釈し、１００℃で加水分解する。大きな
ゲルについてはタンパク５０μgを、ファスト（Ｐhast）・ゲル（ファルマシア
（Ｐharmacia）、架橋度１２.５％）については１μgをデポジットする。１５×
１２cmゲルについて定常電圧５０Ｖで（バイオラッド・バーチカル（Ｂiorad ve
rtical）装置）、ファスト・ゲル上では２５０Ｖで移動を行う。
１０％酢酸、２５％イソプロパノールの溶液中で３０分間固定させる工程の後
、該ゲルをクーマシーブルー（０.２５％ブルー；４５％メタノール；１０％酢
酸）で染色する。次いで、該ゲルを２０％メタノール、１０％酢酸の逐次浴中で
徐々に脱色する。
タウビン法（Towbin et al.，1979）に従って、該タンパクをニトロセルロー
ス膜（シュライヒャー・アンド・シュール（Schleicher ＆ Schull；０.４５
μm）上に移す。大きなゲルについては９０分間、ファスト・ゲルについては１
時間、一定のアンペア数（１mＡ／cm2）で移動を行う。移動の効率は、ポンソー
レッド（Ｐonceau red）（コダック（Ｋodak））で染色することによって明らか
にする。移動後、室温で１時間、ブロッキングバッファー（０.５Ｍトリス−Ｈ
Ｃl（pＨ７.５）：１％スキムミルク；１５０mＭ ＮaＣl）中でニトロセルロー
スを洗浄する。
ブロッキングバッファー中で希釈した抗血清と一緒に３７℃で１時間インキュ
ベートする。第１の血清は、３７℃で１時間、ペルオキシダーゼに結合した抗血
清（ヤギ抗ウサギ、ザイムド（Ｚymed））によって明らかにされる。ペルオキシ
ダーゼ基質は、１％の４−クロロ−１−ナフトール（紫色）である。
得られた結果は、Ｍ９８２菌株由来のＴbp２タンパクが抗Ｔbp２ １００％抗
血清、抗Ｔbp２ ８０％抗血清および抗Ｔbp２ ５０％抗血清によって特異的に認
識されることを示す。他のナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis
）タンパクは、これらの血清によって認識されない。抗イー・コリ（Ｅ．coli）
タンパク血清は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）Ｍ９８
２菌株のＴbp２を認識しない。
８Ｅ−抗組換えＭ９８２ Ｔbp２血清の価測定
イー・コリ（Ｅ．coli）上に吸着された抗Ｔbp２ １００％、８０％および５
０％高度免疫血清と比較するためには、同種菌株に関する該血清の価を知ること
が必要である。したがって、鉄を枯渇した培地中で培養したＭ９８２微生物につ
いての「ドット−ブロット」価測定は、９.Ｄ.２に記載した方法を用いて行う。
同一濃度の微生物（微生物１×１０8個／ml）をニトロセルロースフィルター
上にデポジットし、次いで、価測定しようとする種々の血清の倍数希釈で明らか
にする。価は、正のシグナルが観察される最後の希釈の逆数として定義される。
比色測定を用いて得られた価は、以下のとおりである：抗Ｔbp２ １００％血清
（血清５７７）については５１２；抗Ｔbp２ ８０％血清（血清５８０）につい
ては２５６；抗Ｔbp２ ５０％血清（血清５８３）については２５６。
これは、３種類の抗Ｔbp２ １００％、８０％および５０％高度免疫血清がＭ
９８２菌株に関する同一価を２倍の範囲内で有することを示す。このために、こ
れらの血清の種々のＭ９８２タイプ菌株に対する交差反応性の分析のために、こ
れらの血清を同一濃度で用いる。
実施例９：抗組換えＭ９８２ Ｔbp２血清の交差反応性の分析
実施例８に記載のドットブロット法によって、Ｍ９８２タイプ菌株に対する交
差反応性のレベルの測定を行う。
ＭＨＢ培地＋３０mＭ ＥＤＤＡ中で５時間培養した後、種々の細菌懸濁液の倍
数希釈液を５種類のニトロセルロース上にデポジットする：
第１のフィルターは、ペルオキシダーゼに結合したヒトトランスフェリン（Ｈ
ＴＦ）について明らかにし、結合ＨＴＦについての価を定義することができる；
第２のフィルターは、抗イー・コリ（Ｅ．coli）タンパク血清について明らか
にする（１／２０００で用いた血清；負の対照）；
第３のフィルターは、全組換えＭ９８２ Ｔbp２タンパク（１００％）に対し
て向けられる血清について明らかにする；
第４のフィルターは、「ヒンジ」領域の超可変部が欠失している組換えＭ９８
２ Ｔbp２タンパク（８０％）に対して向けられる血清について明らかにする；
第５のフィルターは、Ｎ末端５０％領域に相当する組換えＭ９８２ Ｔbp２タ
ンパクに対して向けられる血清について明らかにする。価は、色を目視できる最
後の希釈の逆数として定義される。
各血清の各菌株との交差反応性を定量化するためには、分析された菌株の間で
のＨＴＲの発現のレベルでの変異性を考慮に入れる値を定義することが必要であ
る。
したがって、トランスフェリンの発現についての価によって表される血清価に
相当するインデックスを算出する。このインデックスは、本発明者らの培養条件
下で１つの菌株から別の菌株へのＨＴＲの発現の変化し得るレベルを考慮に入れ
るので、分析のために選択される値である。しかしながら、このインデックスは
、ＨＴＲのアフィニティの起こり得る差異について説明することはできない。
情報のために、５４の菌株について得られたインデックスの値の概要を下記表に
示す。
実施例１０：交差殺菌活性の研究
１０Ａ．抗ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）８６８０Ｈ
ＴＲ抗血清の調製
実施例１で得られた８６８０ ＨＴＲの調製物を免疫原として用いて、実施例
８Ｂに記載した方法に従って抗血清を調製する。
１０Ｂ．菌株の培養
ナイセリア．メニンジティディス（Ｎ．meningitidis）９２／０４、Ｍ８７１
、５０４／９１、８６８０、８７２６、ＢＺ８３、４４、５２および８７１０菌
株（骨髄炎菌レファレンスラボラトリー：ノルウェー国オスロのWHO-collaborat
ing center for reference and research on meningococci，NIPH、コーガント
（Caugant）博士から入手した、ＥＴ５電気泳動的グループ（ビー・モハメド−
ロックビ（B．Mohamed-Rokbi）、学位授与のためにフランス国リオンのクラウド
・バーナード・ユニバーシティ（Ｃlaude Ｂernard Ｕniversity）に1995年10月
10
日に提出された論文）の一部を形成する菌株）ならびにＭ９８２およびＢ１６Ｂ
６菌株を実施例１Ａの記載に従って培養する。
１０Ｃ．殺菌活性の試験
実施例８Ｃに記載した方法に従って、１０Ａで調製した抗血清の殺菌活性を１
０Ｂで培養した菌株に対して試験する。
結果を下記表に示す：
ＥＴ５電気泳動的グループの菌株に対して得られた殺菌価は、交差殺菌活性を
示す。他方、Ｂ１６Ｂ６およびＭ９８２菌株に対して得られたものは、交差殺菌
活性の不在を示す。
これらの結果は、本発明によって行われた提案、すなわち、抗Ｍ９８２ ＨＴ
Ｒおよび抗Ｂ１６Ｂ６ ＨＴＲ抗血清によるウェスタンブロット法における８６
８０菌株の認識に関して既に観察された結果を損なうことなく、８６８０タイプ
菌株から誘導されるＴbp２タンパクまたはＨＴＲを、（i）Ｍ９８２タイプ菌株
から誘導されるＴbp２またはＨＴＲおよび（ii）Ｂ１６Ｂ６タイプ菌株から誘導
されるＴbp２またはＨＴＲを含有するワクチン組成物に添加できることを支持す
る傾向にある。