FR2739624A1 - Nouvelle sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables du deuxième domaine; et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb et (ii) en ce qu'elle possède une région charnière de type M982. Cette sous-unité Tbp2 ainsi que les fragments polypeptidiques qui en sont dérivés sont notamment utiles à des fins vaccinales, plus particulièrement en association avec des sous-unités Tbp2 de N. meningitidis déjà connues. L'invention fournit également des fragments d'ADN codant pour ces nouvelles Tbp2 et polypeptides dérivés.

Description

La présente invention a pour objet un nouveau variant de la sous-unité Tbp2 du récepteur transferrine de Neisseria meningitidis, son utilisation à titre de médicament, ainsi que le fragment d'ADN codant pour ce variant.

D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Les bactéries principalement responsables sont N. meningitidis et
Haemophilus influenzae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes.

On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N.

meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an.

L'espèce N. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes : A, B et C.

I1 existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à N. meningitidis sérogroupes A et C. Ces polysaccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.

Par contre, le polysaccharide de N. meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez lthomme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher un vaccin à l'encontre des méningites induites par N.

meningitidis notamment du sérogroupe B, autre qu'un vaccin à base de polysaccharide.

A cette fin, différentes protéines de la membrane externe de N. meningitidis ont déjà été proposées. Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine.

D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal. En ce qui concerne notamment N. meningitidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélevé qu'à partir de protéines humaines de transport du fer telles que la transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'homme (de l'ordre de 10-18 M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne.

Ainsi, N. meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance.

Le récepteur de la transferrine de la souche N. meningitidis B16B6 a été purifié par
Schryvers et al (WO 90/12591) à partir d'un extrait membranaire. Cette protéine telle que purifiée apparaît essentiellement constituée de 2 types de polypeptides : un polypeptide d'un poids moléculaire apparent élevé de 100 kD et un polypeptide d'un poids moléculaire apparent moindre d'environ 70 kD, telles que révélés après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

Le produit de la purification notamment mise en oeuvre par Schryvers est par définition arbitraire et pour les besoins de la présente demande de brevet, appelé récepteur de la transferrine humaine (RTH) et les polypeptides le constituant, des sous-unités. Dans la suite du texte, les sous-unités de poids moléculaire élevé et de poids moléculaire moindre sont respectivement appelées Tbpl et Tbp2.

Depuis les travaux pionniers de Schryvers et al, on a découvert qu'il existait en fait au moins 2 types de souches qui diffèrent par la constitution de leurs récepteurs de la transferrine respectifs. Ceci a été mis en évidence en étudiant des extraits de membrane externe de plusieurs dizaines de souches de N. meningitidis d'origines variées. Ces extraits membranaires ont tout d'abord été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis électrotransférés sur feuilles de nitrocellulose (Western Blot).

Ces feuilles de nitrocellulose ont été incubées:
a) en présence d'un ante sérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine
purifié à partir de la souche N. meningitidis B16B6, aussi appelée IM2394;
b) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine
purifié à partir de la souche N. meningitidis M982, aussi appelée IM2169 ; ou
c) en présence de la transferrine humaine conjuguée à la peroxydase.

En ce qui concerne a) et b), la reconnaissance des sous-unités du récepteur de la transferrine est révélée par addition d'un anticorps anti-immunoglobulines de lapin couplé à la peroxydase, puis par addition du substrat de cette enzyme.

Les tableaux I et II ci-dessous indiquent le profil de certaines souches représentatives tel qu'il apparaît sur gel de polyacrylamide à 7,5 % après électrophorèse en présence de
SDS ; les bandes sont caractérisées par leur poids moléculaires apparents exprimés en kilodaltons (kD):

<tb> <SEP> Souches
<tb> <SEP> 2394 <SEP> (B; <SEP> 2a; <SEP> P1.2:L2,3) <SEP> 2234 <SEP> (Y; <SEP> nd)
<tb> <SEP> Tableau <SEP> I <SEP> 2228 <SEP> (B; <SEP> nd) <SEP> 2154 <SEP> (C; <SEP> nd) <SEP> 550 <SEP> (C; <SEP> 2a:)
<tb> <SEP> 2170 <SEP> (B; <SEP> 2a:P1.1:L3) <SEP> 2448 <SEP> (B; <SEP> nd) <SEP> 179 <SEP> (C;<SEP> 2a:P <SEP> 1.2) <SEP>
<tb> Détection <SEP> avec <SEP> 93 <SEP> 93 <SEP> 99
<tb> l'antisérum
<tb> anti-récepteur <SEP> 2394 <SEP> 68 <SEP> 69 <SEP> 69
<tb> Détection <SEP> avec
<tb> l'antisérum <SEP> 93 <SEP> 93 <SEP> 99
<tb> anti-récepteur <SEP> 2169
<tb> Détection <SEP> avec <SEP> la
<tb> transferrine <SEP> 68 <SEP> 69 <SEP> 69
<tb> peroxydase
<tb>
N.B.:Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe, le sérotype, le sous-type et l'imrnunotype. Souches

Tableau <SEP> II <SEP> 2169 <SEP> 1000 <SEP> 1604 <SEP> 132 <SEP> 1001 <SEP> 876 <SEP> 1951 <SEP> 2449 <SEP> 86
<tb> (B:9:P1.9 <SEP> (B:nd) <SEP> (B:nd) <SEP> (C:15:P1.16) <SEP> (A:4:P1.9) <SEP> (B:19:P1.6) <SEP> (A:nd) <SEP> (B:nd) <SEP> (B:2b: :P1.2)
<tb> Détection <SEP> avec
<tb> l'antisérum <SEP> anti- <SEP> 96 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 96 <SEP> 94 <SEP> 94 <SEP> 93
<tb> récepteur <SEP> 2394
<tb> Détection <SEP> avec <SEP> 96 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 96 <SEP> 94 <SEP> 94 <SEP> 93
<tb> l'antisérum <SEP> antirécepteur <SEP> 2169 <SEP> 87 <SEP> 85 <SEP> 83 <SEP> 81 <SEP> 79 <SEP> 88 <SEP> 87 <SEP> 85 <SEP> 85
<tb> Détection <SEP> avec <SEP> la
<tb> transferrine <SEP> 87 <SEP> 85 <SEP> 83 <SEP> 81 <SEP> 79 <SEP> 88 <SEP> 87 <SEP> 85 <SEP> 85
<tb> peroxydase
<tb> N.B.. Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe, le sérotype, le sous-type et l'immunotype.

Les résultats répertoriés dans les 2 premières lignes des tableaux montrent qu'il existe 2 types de souches:
Le premier type (Tableau 1) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en
Western blot par l'antisérum anti-récepteur IM2394, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antisérum anti-récepteur In2169.

Le second type (Tableau H) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en
Western blot par l'antisérum anti-récepteur IM2169, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antisérum anti-récepteur IM2394.

En conséquence, il existe une diversité antigénique au niveau de la sous-unité de moindre poids moléculaire. Cette diversité est toutefois restreinte puisqu'elle se résout en 2 grands types, contrairement à ce qui est suggéré par Griffitus et al, FEMS Microbiol. Lett.

(1990)69:31.

Sur la base de ces observations, la demande WO 93/6861 distingue des souches de type M982 (IM2169) ou de type B16B6 (IM2394).

Outre les souches cités dans le tableau II, des souches de type M982 sont par exemples les souches S3032 (12, P 1.12.16), 6940 (19, P 1.6), M978 (8, P 1.1, 7), 2223 (B : nd), 1610 (B : nd), C708 (A : 4, P 1.7), M981 (B : 4), aussi appelée 891, et 2996 (B : 2b,
P 1.2). Le déposant a reçu, par envoi gracieux, les souches S3032, M978 et M981 du Dr. J.

Poolman (RIVM, Bilthoven, Pays-Bas), et la souche C708 du Dr. Achtman (Max Planck
Institute, Berlin, Allemagne).

La souche IM2154 (sérogroupe C) est citée à titre d'exemple comme étant de type
B16B6.

En vertu des précédentes constatations, on pouvait supposer qu'un vaccin efficace à l'encontre de toutes les infections à N. meningitidis pourrait être constitué de manière suffisante, de la sous-unité de haut poids moléculaire, quelle que soit la souche d'origine du récepteur, puisque cette dernière est reconnue par les 2 types d'antisérums. Toutefois, il semble que cela ne puisse être le cas dans la mesure où la sous-unité de haut poids moléculaire ne serait pas capable d'induire la production d'anticorps de type neutralisant.

Seule la plus petite des 2 sous-unités du récepteur (Tbp2) serait capable de remplir cette fonction.

En fait, la protéine Tbp2 plutôt que Tbpî, possède un certain nombre de caractéristiques qui en font un candidat vaccinal potentiel : une expression ubiquitaire, une accessibilité à la surface du germe, la capacité d'induire des anticorps neutralisants et une variabilité limitée puisque comme cela vient d'être exposé, deux groupes majeurs ont été identifiés à ce jour.

En vertu de cette découverte, on a déjà proposé des compositions pharmaceutiques contenant:
(i) le RTH d'au moins une souche de type B16B6 et le RTH d'au moins une
souche de type M982 (WO 93/6861); ou
(ii) la Tbp2 d'au moins une souche de type B16B6 et la Tbp2 d'au moins une
souche de type M982 (WO 93/7172).

Pour accéder à de grandes quantités de protéines en vue d'un développement à l'échelle industrielle, on a cloné les fragments d'ADN codant i. a. pour diverses Tbp2s. Les séquences en acides aminés des sous-unités Tbp2 des souches M982 et B16B6 ont été divulguées dans la demande de brevet EPA 586 266 (publiée le 9 Mars 1994) ainsi que les fragments d'ADN correspondants. Ces séquences sont reprises dans les SEQ ID NO 1 à 4 de la présente demande.

L'étude des sous-unités Tbp2 quelque soit la souche d'origine, a permis de mettre en évidence, trois domaines de structure principaux associés pour au moins l'un d'entre eux à des propriétés particulières. Par définition, les domaines de Tbp2 M982 et Tbp2 B16B6 ont été fixés comme le montre le tableau ci-après, en indiquant la position des acides aminés, bornes incluses des différents domaines, et par référence à la numérotation apparaissant dans les SEQIDNO 1 et 3.

<tb> # <SEP> <SEP> Tbp2 <SEP> M982 <SEP> Tbp2 <SEP> B16B6
<tb> Domaine <SEP> N-terminal
<tb> ou <SEP> premier <SEP> domaine <SEP> 1-345 <SEP> 1-32.5
<tb> Domaine <SEP> charnière
<tb> ou <SEP> deuxième <SEP> domaine <SEP> 346-543 <SEP> 326-442
<tb> Domaine <SEP> C-terminal
<tb> ou <SEP> troisième <SEP> domaine <SEP> 544-691 <SEP> 443-579
<tb>

Cette définition s'applique de même à toutes les Tbp2s de type M982 ou B16B6, après alignement d'une séquence type M982 ou B16B6 sur la séquence de référence, au maximum d'homologie. Ainsi, à titre d'exemple et par référence à la Figure 1, on indique la position des domaines de la sous-unité Tbp2 de la souche 8680 comme suit : premier domaine (1 - 334), deuxième domaine (335 - 530) et troisième domaine (531 - 677).

I1 est maintenant connu que le domaine N-terminal ou premier domaine comporte dans son intégralité le site de liaison à la transferrine et se trouve donc très vraisemblablement exposé vers l'extérieur. En conséquence le seul domaine N-terminal constitue un élément de choix à des fins i. a. vaccinales.

D'autre part, l'étude comparative des séquences Tbp2s M982 et B16B6 alignées au maximum d'homologie, a mis en évidence quatre portions hypervariables localisées au sein de la région charnière de Tbp2 M982 ; portions qui sont absentes dans la Tbp2 B16B6. Ces portions hypervariables se retrouvent chez toutes les Tbp2s de type M982 (Figure 2). Les souches de type B16B6 en sont dépourvues. Par la suite, on entend par "région charnière de type M982" une région charnière qui possède ces quatre portions hypervariables.

L'étude des séquences a permis de faire évoluer les définitions des types M982 et
B16B6, originellement fournies dans WO 93/6861. On convient maintenant de définir les types de souches sur la base de la présence ou l'absence des régions hypervariables et par conséquent sur la taille du gène tbp2: environ 2,1 kob pour tbp2 de type M982 et 1,8 kb pour tbp2 de type B16B6.

Par comparaison des séquences de diverses Tbp2s de type M982, on sait aussi que la région charnière présente une variabilité supérieure à celle des deux autres domaines. Dans la mesure où la région charnière ne semblait pas indispensable à la fonction de fixation de la transferrine humaine, on a postulé que le rôle de cette région est au moins en partie d'induire une variabilité-"écran" afin d'éviter la reconnaissance d'une souche par le système immunitaire d'un individu ayant connu ultérieurement une autre souche.

Dans cette hypothèse, la région charnière des souches de type M982 constitue un problème majeur dans la réalisation d'un vaccin. En effet si cette région est immunodominante, lors d'une immunisation, les anticorps induits seront dirigés majoritairement contre cette région et par conséquent la réponse immunitaire sera spécifique de la protéine Tbp2 de la souche homologue.

En tenant compte des observations et hypothèses évoquées ci-dessus, il déjà été proposé d'utiliser ia. à des fins vaccinales, non plus des Tbp2s de type M982 entières, mais des Tbp2s au moins délétées de leurs quatre portions hypervariables ou de façon alternative, délétées des deuxième et troisième domaines.

Une région essentielle pour l'induction d'une immunité à large spectre étant vraisemblablement le premier domaine, une composition pharmaceutique de choix est apparue comme pouvant être par exemple, au moins composée:
(i) d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de type M982 délétée au moins
partiellement du deuxième ou du troisième domaine e.g. d'un polypeptide
correspondant au premier domaine d'une Tbp2 de type M982 ; et
(ii) d'une Tbp2 de type B16B6 ou d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de
type B16B6, délétée au moins partiellement du deuxième ou du troisième
domaine e.g. d'un polypeptide correspondant au premier domaine d'une Tbp2
de type B16B6 (demande PCT n" de dépôt PCT/FR95/000701 ; référence est
faite aux définitions initiales des types de souches).

Par la suite, l'étude de l'immunodominance de la région charnière des Tbp2s de type
M982 a été poursuivie et complétée en analysant vis-à-vis d'un grand nombre de souches de type M982, la réactivité croisée des sérums obtenus à l'encontre: (i) de la protéine Tbp2 M982 entière (Tbp2 100%) 100%);
(ii) de la protéine Tbp2 M982 tronquée ne comportant que les 350 premiers acides
aminés N-terminaux (Tbp2 50%); et
(iii) de la protéine Tbp2 M982 délétée des quatre portions hypervariables (h 362
379 ; A 418444 ; A 465481; et A 500-520) de la région charnière (Tbp2
80%).

Pour ce faire, les protéines Tbp2s entières, tronquées et délétées ont été tout d'abord produites dans E. coli par voie recombinante. Pour ce qui concerne Tbp2 M982 entière, sa production est décrite dans EPA 586 266 (publiée le 9 mars 1994). Celles des deux autres
Tbp2s M982 sont reportées dans les Exemples 4 et 6 de la présente demande.

La préparation des sérums hyperimmuns ainsi que l'analyse de ces sérums, préliminaire à l'étude d'immunodominance, fait l'objet de l'Exemple 8 de la présente demande. L'étude de la réactivité croisée fait l'objet de plus de détails dans l'Exemple 9.

Cinquante quatre souches classées dans le type M982 soit par analyse des protéines de membrane externe en électrophorèse de SDS-Page suivie d'une immunorévélation, soit sur la base de la taille du gène tpb2 amplifié par PCR, ont été étudiées en dot blot (analyse sur germes entiers) pour leur réactivité croisée (voir l'Exemple 9). Ces souches ont été obtenues à titre gracieux auprès du Dr D.A. Caugant. Elles ont été isolées dans des régions du monde très diverses et à différentes périodes. Par conséquent, cette collection devrait être représentative. 14 souches ne sont pas reconnues par le sérum anti-Tbp2 M982 100%, tandis que seulement 4 échappent à la reconnaissance par le sérum anti-Tbp2 M982 80% et 1 par le sérum anti-Tbp2 M982 50%.

Ces résultats confirment l'hypothèse initiale selon laquelle une protéine Tbp2 délétée des portions hypervariables induit une réactivité croisée plus importante que celle observée avec une protéine entière. La réactivité croisée est encore améliorée dans le cas d'une protéine Tbp2 n'ayant conservé que le domaine de liaison à la transferrine, puisque seulement une souche parmi 54, n'est pas reconnue. L'immunogénicité d'une Tbp2 est influencée par la présence de la région charnière qui induit des anticorps spécifiques de la souche homologue. En supprimant au moins les quatre portions hypervariables, la réponse immune contre des épitopes situés en dehors de la région charnière, semble favorisée.

Seulement 4 souches parmi les 54 souches de type M982 n'ont pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 80%. Ce résultat peut s'expliquer notamment par le fait qu'au moins une de ces souches diffère très largement de la souche de référence M982. Par conséquent il apparaît nécessaire d'ajouter aux compositions pharmaceutiques déjà connues, au moins une troisième valence.

C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis ; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un ante sérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables de sa région charnière (Tbp2 M982 A 362 - 379 ; A 418 - 444 ; A 465 - 481; A 500 - 520); et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb et (ii) en ce qu'elle possède une région charnière de type M982.

La réactivité entre un sérum anti-Tbp2 80% et un sérum anti-Tbp2 50% peut aussi s'expliquer par le fait que dans la construction qui a servi à la production du sérum anti
Tbp2 80% certaines séquences variables demeurent alors que dans les protéines 50%, toutes ces séquences sont supprimées. En effet, seule une souche parmi les 54 souches de type M982 n'a pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 50%. Il s'agit de la souche 8680 B:15:P1.3, isolée au Chili lors de l'épidémie de 1987, et appartenant au groupe électrophorétique ET-5. Cette souche provient de la collection du Dr D.A. Caugant, WHO
Collaborating Centre for Reference and Research on Meningococci, National Institute of
Public Health, Oslo, Norway. La protéine Tbp2 issue de cette souche constitue donc tout particulièrement un candidat vaccinal de choix.

C'est pourquoi une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive de manière avantageuse d'une souche de N. meningitidis qui n'est pas reconnue en dot blot par un ante sérum obtenu à l'encontre d'un fragment de Tbp2 M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en positon 350 c'est-à-dire à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 substantiellement délétée des deuxième et troisième domaines.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive notamment d'une souche de N.

meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche M982 (antisérum anti-RTH M982) et par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche B1616 (antisérum anti-RTH B16B6). De tels antisérums ont été décrits dans la demande de brevet
WO 93/6861.

Par "sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de N. meningitidis" on entend bien évidemment une dérive dans son sens le plus général ; c'est-à-dire non limitée à un procédé physique, mais le fruit d'un processus intellectuel. Ainsi cette expression recouvre i.a. une
Tbp2 produite par voie recombinante e.g dans E. coli.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention comprend une séquence d'acides aminés dont le degré dthomologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 60 à 70%, avantageusement d'environ 65%. Selon un mode particulier, elle comprend une séquence d'acides aminés substantiellement telle que montrée dans 1'ID SEQ No. 5.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être sous forme dissociée de la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) de la souche de N. meningitidis dont est issue la Tbp2 ou bien en association avec cette Tbpl, formant ainsi un complexe Tbpl-Tbp2 considéré comme le récepteur de la transferrine humaine.

L'invention concerne également un polypeptide dérivé notamment par délétion d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention.

Il s'agit plus particulièrement d'un polypeptide ayant une séquence en acides aminés qui dérive de celle d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention dont le premier, deuxième et troisième domaines sont définis par alignement au maximum d'homologie, sur la séquence de la sous-unité Tbp2 de la souche de référence M982 ; notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite sous-unité Tbp2 selon l'invention, à condition que le premier et deuxième domaines ne soient pas simultanément et totalement délétés.

Par "séquence qui dérive d'une autre séquence" on entend bien évidemment une séquence issue par processus intellectuel de cette autre séquence.

Sous un autre aspect, il s'agit d'un polypeptide capable de se lier à la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale ou dans la région des quarante premiers acides aminés de la sous-unité Tbp2. L'extrémité C-terminale est définie comme étant la partie de Tbp2 correspondant aux deuxième et troisième domaines.

De manière plus particulière, un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acides aminés qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention:
(i) notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite
sous-unité Tbp2, sélectionné parmi les deuxième et troisième domaines ; de
préférence par délétion totale ou partielle du troisième domaine ou des
deuxième et troisième domaines
(ii) notamment par délétion totale des premier et troisième domaines, ou
(iii) notamment par délétion intégrale du troisième domaine et par délétion
partielle du premier domaine, optionellement par délétion partielle du
deuxième domaine.

D'une manière avantageuse, un polypeptide selon l'invention présente une délétion partielle, quasi totale ou totale du troisième domaine, de préférence totale. Dans ce cas là, le premier ainsi que le deuxième domaine peuvent être maintenus dans leur intégralité, partiellement ou totalement délétés; ceci indépendamment l'un de l'autre.

Sont possibles les combinaisons suivantes (sachant que les premier, deuxième et troisième domaines dans leur intégralité sont respectivement représentés par 1, 2 et 3, et que 0 et A signifient de manière respective, partiellement et totalement délété)
1,2, A3 ; 1, 02, A3 ; 1, A2, A3
01,2,53;01,02,53;01,52,53;
Au, 2, A3 ; Ai, 02, A3 ;
1,2,03; 1,02,03; l,A2,03;
01,2,03;01,02,03 ;01,A2,03;
Al, 2, 03 ;Al, 02, 03
Est aussi d'intérêt tout particulier, un polypeptide dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention par délétion partielle du deuxième domaine, qui comporte dans leur intégralité ou quasi intégralité le premier et troisième domaines ; soit la combinaison 1, 0 2, 3. (Par "domaine maintenu dans sa quasi-intégralité" on entend ici et dans la suite du texte, un domaine modifié en un très faible nombre de positions, environ 5 maximum.) Un polypeptide selon l'invention peut aussi répondre à la combinaison 01, 02, 3, la délétion partielle du premier domaine portant avantageusement sur tout ou partie de la région homologue de celle de Tbp2 M982, allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.

De manière avantageuse, lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte substantiellement sur une ou des régions du deuxième domaine qui sont les homologues des régions de la séquence M982 allant:
(i) de l'acide aminé en position 388 à l'acide aminé en position 396;
(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 476 ; et
(iii) de l'acide aminé en position 499 à l'acide aminé en position 521.

De manière alternative, une délétion partielle du deuxième domaine porte substantiellement sur une ou des portions hypervariables. Ces portions sont, après alignement au maximum dthomologie, les homologues des portions de la séquence M982 allant:
(i) de l'acide aminé en position 362 à l'acide aminé en position 379;
(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 444
(iii) de l'acide aminé en position 465 à l'acide aminé en position 481; et
(iv) de l'acide aminé en position 500 à l'acide aminé en position 520.

De préférence, la délétion partielle porte simultanément sur les quatre portions (i) à (iv) sus-décrites.

Lorsqu'un polypeptide selon 1 invention dérive notamment par délétion intégrale du troisième domaine et délétion quasi intégrale du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention et comporte l'intégralité du premier domaine ou dérive en outre par délétion de la partie N-terminale du premier domaine, la délétion quasi intégrale du deuxième domaine s'étend sur la région qui est l'homologue de la région du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 M982 allant de l'acide aminé dans l'une des positions 346 à 361 à l'acide aminé en position 543.

Lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du premier domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte avantageusement sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de la sousunité Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 281.

A titre d'exemple de ce qui précède, on cite une délétion d'intérêt portant sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de ladite sous-unité
Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.

Le degré d'homologie peut être aisément calculé en alignant les séquences de manière à obtenir le degré maximal d'homologie ; pour ce faire, il peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants, comme cela est illustré dans la
Figure 1. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions.

Il serait fastidieux de décrire des séquences homologues autrement que de manière générique, en raison du trop grand nombre de combinaisons. L'homme du métier connaît toutefois les règles générales qui permettent de remplacer un acide aminé par un autre sans abolir la fonction biologique ou immunologique d'une protéine.

A titre d'exemple préféré, on cite un polypeptide selon l'invention dont la séquence possède au moins 70-75%, de manière avantageuse au moins 80%, de préférence au moins 90%, de manière tout à fait préférée 100% d'homologie avec:
(i) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en
position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351,
avantageusement en position en position 334;
(ii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en
position 1 à l'acide aminé en position 677, délétée des régions 377-385, 407
465 et 488-508;
(iii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en
position 1 à l'acide aminé en position 677, délétée des portions 351-368,
407-433, 454470 et 489-508; ou avec
(iv) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en
position 335 à l'acide aminé en position 530.

Un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acide aminés qui comprend au moins 10, avantageusement au moins 20, de préférence au moins 50, de manière tout à fait préférée au moins 100 acides aminés.

Bien évidemment, un polypeptide selon l'invention peut aussi comprendre de manière additionnelle, une séquence d'acides aminés qui ne présente pas d'homologie avec les séquences des sous-unités Tbp2 selon l'invention.

D'une manière générale, une séquence additionnelle peut être celle de tout autre polypeptide à l'exclusion de Tbp2.

Par exemple, une séquence additionnelle peut être celle d'un peptide signal localisé en position N-terminale d'un polypeptide selon l'invention. Des exemples de séquence signal sont montrés dans les ID SEQ NO 1 à 4. D'autre part, on indique qu'une séquence signal hétérologue appropriée peut être une séquence signal retrouvée chez le précurseur d'une lipoprotéine.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être directement purifiée à partir de la souche native ou bien de manière avantageuse, obtenue par voie recombinante dans un système d'expression hétérologue ou homologue. Les polypeptides selon l'invention sont de préférence des produits recombinants. Afin de mettre en oeuvre une expression par voie recombinante, le fragment d'ADN codant pour la Tbp2 de la souche 8680 a été cloné et séquencé.

L'invention a donc aussi pour objet:
(i) un fragment d'ADN isolé codant pour une sous-unité Tbp2 ou un
polypeptide selon l'invention;
(ii) une cassette d'expression qui comprend au moins un fragment d'ADN selon
l'invention, placé sous le contrôle d'éléments capables d'assurer son
expression dans une cellule-hôte appropriée ; et
(iii) un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention, selon lequel on
cultive une cellule-hôte comportant une cassette d'expression selon
l'invention.

Dans la cassette d'expression, le fragment d'ADN selon l'invention peut être ou non associé à un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue ou non, au polypeptide codé par ledit fragment d'ADN, selon que l'on recherche ou non la sécrétion du polypeptide. De préférence, cette sécrétion sera recherchée.

Des éléments tels qu'un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue (région signal) ou un promoteur existent déjà en assez grand nombre et sont connus de l'homme du métier. Ses compétences générales lui permettront de choisir une région signal ou un promoteur particulier qui seront adaptés à la cellule-hôte dans laquelle il envisage l'expression.

Aux fins du procédé selon l'invention, la cellule-hôte peut être une cellule de mammifere, une bactérie ou une levure ; ces deux dernières étant préférées. Là aussi, le choix d'une lignée particulière est à la portée de l'homme du métier.

Enfin, I'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif, une sous-unité Tbp2 ou un polypeptide selon l'invention.

Une composition pharmaceutique selon l'invention est notamment utile pour induire une réponse immunitaire chez les humains à l'encontre de N meningitidis, entre autre un effet vaccinal de manière à protéger les humains contre des infections à N. meningitidis, en prévention ou en thérapie.

Une composition selon l'invention peut comprendre en outre: (i) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la
sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un
antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6;
ou (ii) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité
Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de
fractions membranaires par un ante sérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par
un ante sérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides
aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2 ; ou (iii) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la
sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un
antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6 ; ou (iv) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité
Tbp2 de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot
de fractions membranaires par un ante sérum anti-RTH M982 et est reconnue par un
antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés
localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.

Une composition selon l'invention comprend avantageusement au moins un, de préférence deux éléments additionnels choisis parmi les quatre énoncées ci-avant.

La sous-unité Tbp2 additionnelle de type M982 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la
Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 90 à 100 %. Il s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 M982.

La sous-unité Tbp2 additionnelle de type B16B6 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la
Tbp2 B16B6, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 3, est de 90 à 100 %. I1 s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 B16B6.

De préférence, le polypeptide additionnel (ii) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un ante sérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion substantielle des régions hypervariables du deuxième domaine de la sous-unité
Tbp2 ou par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité
Tbp2.

Avantageusement, ce polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la
Tbp2 M982, telle que montrée dans 1'ID SEQ No. 1, est de 90 à 100 %. De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui dérive de la Tbp2 M982.

De préférence, le polypeptide additionnel (iv) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH
B16B6, notamment par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2, de préférence des deuxième et troisième domaines.

Avantageusement, ce polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la
Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 3, est de 95 à 100 %. De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui dérive de la Tbp2 B16B6.

Selon un mode préféré, une composition selon l'invention comprend: (i) un polypeptide qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par
délétion partielle du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2, entre autre par
délétion substantielle des portions hypervariables du deuxième domaine de la sous
unité Tbp2; (ii) un polypeptide qui dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis
dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un
antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6,
notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion
substantielle des portions hypervariables du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2
; et (iii) une sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité
Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un ante sérum
anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe le ou les polypeptide(s) selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intra-musculaire ou par voie intra-veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.

Afin de déterminer l'objet de la présente invention, on précise que les souches de N.

meningitidis IM2394 (M982) et IM2169 (B16B6) sont publiquement disponibles auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris sous les numéros d'enregistrement respectifs LNP N 1511 et LNP
N 1520.

L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après et par référence aux Figures 1 à 5.

La Figure 1 présentent respectivement les alignements des séquences Tbp2 M982 et 8680, au maximum d'homologie selon le programme Kanehisa (Bisance CITI-2). Le degré d'homologie est de 65%.

La Figure 2 présente les alignements au maximum d'homologie des séquences des domaines charnières (deuxième domaine) de Tbp2 M982 (1), 6940 (2), 2223 (3), C708 (4),
M978 (5), 1610 (6), 867 (7), S3032 (8) et 981 (9). En italiques est donnée la numérotation de la séquence de Tbp2 M982, telle qu'elle apparaît dans ID SEQ NO 1. En gras apparaissent les séquences des portions hypervariables que l'on peut déléter selon un mode préféré. (C) indique la séquence consensus.

Les Figures 3 à 5 illustrent respectivement la construction des plasmides pTG5782, pTG5755 et pTG5783.

EXEMPLE 1: Purification du RTH de la souche de N meningitidis 8680
1A- Culture
Un congelat de la souche N. meningitidis 8680 est repris dans environ 1 ml de
bouillon Muller Hinton (BMH, Difco). La suspension bactérienne est ensuite étalée
sur le milieu solide Muller Hinton contenant du sang cuit (5 %).

Après 24 h d'incubation à 37"C dans une atmosphère contenant 10 % de CO2,
la nappe bactérienne est recueillie pour ensemencer 150 ml de BMH pH 7.2, répartis
en 3 erlens de 250ml. L'incubation est poursuivie pendant 3 h à 37"C sous agitation.

Chacune des 3 cultures ainsi réalisées permet d'ensemencer 400 ml de BMH pH 7,2
supplémenté avec 30 pm de Ethylènediamine - Di (O-Hydroxyphenyl - acetic acid
(EDDA, Sigma), qui est un agent chélatant du fer sous forme libre.

Après 16 h de culture à 37"C sous agitation, les cultures sont contrôlées pour
leur pureté par observation au microscope après une coloration de Gram. La
suspension est centrifugée, le culot contenant les germes est pesé et conservé à 20"C.

1B- Purification
La méthode de purification est essentiellement telle que décrite par Schryvers
et al (supra).

Le culot bactérien obtenu en 1A est décongelé, puis remis en suspension dans
200 ml de tampon Tris HC1 50 mM, pH 8.0 (tampon A). La suspension est
centrifugée pendant 20 min à 15 000 xg à 4"C. Le culot est récupéré, puis remis en
suspension dans du tampon A à la concentration finale de 150 g/l. Des fractions de
150 ml sont traitées pendant 8 min à 800 bars dans un lyseur de cellules travaillant
sous haute pression (Rannie, modèle 8.30H). Le lysat cellulaire ainsi obtenu est
centrifugé pendant 15 min à 4"C à 15 000 x g. Le surnageant est récupéré, puis
centrifugé pendant 75 min à 4"C à 200 000 x g.Après élimination du surnageant, le
culot est repris dans du tampon A et après dosage de protéines selon Lowry, la
concentration de la suspension est ajustée à 5 mg/ml.

A 1,4 ml de la suspension de membrane on ajoute 1,75 mg de transferrine humaine biotynylée selon le procédé décrit par Schryvers. La concentration finale de la fraction membranaire est de 4 mg/ml. Le mélange est incubé 1 heure à 37"C puis centrifugé à 100 000 xg pendant 75 min. à 4"C. Le culot de membranes est repris par le tampon A contenant du NaCI 0,1 M et incubé pendant 60 min. à température ambiante.

Après solubilisation, on ajoute à cette suspension un certain volume de N
Lauroyl Sarkosine à 30% (p/v) et d'EDTA 500 mM de façon que les concentrations finales en Sarkosyl et EDTA soient de 0,5% et 5 mM respectivement. Après une incubation de 15 min. à 37"C sous agitation, on ajoute 1 ml de résine streptavidineagarose (Pierce) préalablement lavée en tampon A. La suspension est incubée à 15 min. à température ambiante puis centrifugée à 1 000 x g pendant 10 min. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne et l'éluat est éliminé.

La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0 contenant NaC1 IM, EDTA 10 mM Sarkosyl 0,5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HC1 750 mM. Le récepteur de la transferrine est ensuite élué par le tampon B contenant de la guanidine
HC1 2M. L'éluat est collecté en fraction dont le volume correspond à IV, dans des tubes contenant IV de Tris HC1 50 mM pH 8.0, NaC1 IM. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV.

Les fractions correspondant au pic d'élution sont recueillies, dialysées contre du tampon phosphate 10 mM, pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % et lyophilisées Le lyophilisat est repris dans de l'eau à une concentration 10 fois supérieure. La solution est dialysée une seconde fois contre du tampon phosphate 50 mM pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % (tampon C) puis la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0.22 ,um.

Le contenu en protéines est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -700C.

EXEMPLE 2: Purification de la sous-unité Tbp2 de la souche de N. meningitidis 8680
par chromatographie hydrophobe
La culture de la souche N. meningitidis 8640, ainsi que les étapes de purification allant jusqu'à la préparation de la suspension membranaire sont effectuées dans des conditions identiques à celles décrites dans l'Exemple 1.

A un volume de la suspension de membranes, on ajoute un volume identique de Tris
HCI 50mM pH 8,0 contenant NaC1 2M, EDTA 20 mM, Sarkosyl 1 % (p/v). Le mélange est incubé 15 min à 37"C sous agitation douce. Puis un volume de cette suspension est mis en contact avec un volume identique de résine Sépharose 4B couplée à la transferrine humaine. Cette résine d'affinité a été couplée en greffant de la transferrine humaine (Sigma,
St Louis USA) à du Sépharose 4B-CNBr (Pharmacia) selon les recommandations du fabricant. La densité du ligand et de 5 mg transferrine/ml de résine. Le contact se fait en bain pendant 1 h à température ambiante sous agitation rotative douce. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne, l'éluat direct est éliminé.

La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCI 50 mM pH 8,0 contenant NaCI 1 M, EDTA 10 mM Sarkosyl 0,5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HC1 750 mM. Le récepteur de la transferrine est ensuite élué par le tampon Tris-HCI 50 mM pH 8,0 NaC1 1M EDTA lOmM
Sarkosyl 0,05 % et guanidine HC1 2M. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'élution sont réunies et la protéine est précipitée par addition de trois volumes d'éthanol refroidi.

Après une nuit d'incubation à + 4"C, la protéine est recueillie par centrifugation pendant une heure à 10.000 x g. Le précipité est repris par un certain volume de tampon phosphate 10 mM pH 7,0 contenant NaC1 0,5 M, guanidine-HC1 5 M (tampon D) de façon à ce que la concentration finale en protéine soit d'environ lmg/ml. La solution est mise en contact avec la résine de phényl-Sépharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le même tampon. L'incubation se fait en bain sous agitation rotative pendant 2 heures à température ambiante. Le gel est ensuite conditionné dans une colonne.

Dans ces conditions, la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) est recueillie dans l'éluat direct, tandis que la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) est fixée sur la résine. La colonne est rincée par trois volumes de tampon D puis par 5 volumes de tampon phosphate 10 mM pH 7,0. Tbp2 est éluée par le tampon phosphate 1 0mM pH 7,0 contenant 0,5 % de Sarkosyl. L'excès de Sarkosyl contenu dans le tampon d'élution de
Tbp2 est éliminé par précipitation à l'éthanol, la protéine est ensuite reprise dans le tampon phosphate 50 mM pH 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % (tampon C).

La solution est ensuite filtrée sur une membrane de porosité 0,22 llm. Le contenu en protéine est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -700C.

EXEMPLE 3: Clonage du fragment d'ADN codant pour Tbp2 8680
L'ADN est extrait par une méthode classique au phénol chloroforme. Pour une quantité de germes correspondant à 1 à 2 g de poids humide, le culot est repris par 25 ml de solution de lyse (glucose 50 mM, EDTA, 10 mM, Tris, 25 mM pH 8,0) supplémentée par 1 ml de protéinase K (Sigma) à 10 mg/ml. Le mélange est incubé 10 min à température ambiante, puis 0,5 ml de sarkosyl à 20% sont ajoutés. Ceci est suivi par une incubation de 10 min à 4"C. Après passage de la suspension à travers une aiguille de 18G, 1 ml de
RNAse A (Sigma) à 2 mg/ml est ajouté puis la suspension est incubée à 37"C pendant 90 min.A l'issue de cette étape, 1'ADN est extrait par addition de 0,5 volume de phénol
L'extraction se fait par agitation pendant 10 min, puis 0,5 volume de chloroforme-alcool isoamylique (24:1) sont ajoutés. Après centrifugation du mélange à 5000 tours/min, pendant 15 min le surnageant est prélevé et est de nouveau traité au phénol/chloroforme.

L'étape d'extraction au phénol/chloroforme est répétée jusqu'à éclaircissement de la phase aqueuse.

A l'issue de l'extraction, 1'ADN est précipité par 2 volumes d'éthanol absolu en présence d'acétate de sodium 0,3 M pH 7, puis rincé en éthanol à 70 %. L'ADN est repris dans 1 ml d'eau distillée, puis dosé au spectrophotomètre à 260 nm et à 280 nm. Une unité de DO 260 nm correspond à 50 ng d'ADN/pI. Les préparations d'ADN sont considérées comme satisfaisantes et utilisables si le rapport DO 260/DO 280 est compris entre 1,8 et 2.

A partir de 10 ng d'ADN génomique le gène tbp2 est amplifié Par PCR à l'aide des amorces suivantes:
- 5' Interl Bam: 5'-CCACGGATCCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC-3'
- 3' Met 2 Eco: 5'-CGCGGATCCTGCTATGGTG-3'
Le milieu réactionnel est comme suit 10 ng d'ADN génomique ; 0,5 pM d'amorces 5' et 3'; 200 I1M de dNTPs (Boehringer); 10 p1 de tampon PCR lOx (Biotaq) et 2,5 U de
Taq polymérase (Biotaq). Le volume réactionnel est ajusté à 100 Ill avec de l'eau distillée.

Les conditions d'amplification dans un appareil Trioblock (Biolabs) sont les suivantes dénaturation : 94 C, 1 min; hybridation : 58 C, 2 min ; élongation : 72 C, 3 min ; nombre de cycles : 25.

Le fragment d'ADN amplifié par PCR est soumis à une electrophorèse sur gel d'agarose préparatif 1% ("Electrophoresis grade", BRL) est préparé en tampon TAE (Tris acétate 0,04M, EDTA 0,002M pH 8,0). La bande amplifiée correspondant au gène tbp2 est découpée. L'ADN contenu dans l'agarose est purifié à l'aide d'un kit Geneclean (Bio 101).

L'ADN est ensuite digéré par EcoRI et BamHI pendant 2h à 37 C. L'ADN digéré est ensuite repurifié par extraction au phénol/chloroforme, précipité par 2 volumes d' éthanol, puis repris par 20 Cll de tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-Hcl, 1 mM EDTA pH 8,0).

Le vecteur pBSK (-) (Stratagène) est digéré par EcoRI et BamHI puis purifié comme décrit ci-avant pour l'insert EcoRl/BamHI.

L'insert EcoRl/BamHI et pBSK sont ligués en présence de ligase T4 (Boehringer) à 16 C pendant la nuit dans les conditions suivantes : vecteur 100 ng; insert 200-300 ng; tampon T4 ligase lOX (Boehringer) 1 p1; ligase 5U; eau qsp 10 p1.

E. coli XLl-Blue (recAl, endAl, gvrA96, thi-l, hsdR17, supE44, relAl, lac, (F' proAB, lacqZ#M15, TnlO (tetr)) est précultivées dans 10 ml de milieu SB (Difco) en présence de tétracycline à 10 g/ml pendant une nuit à 370C. 500 l de préculture sont utilisés pour ensemencer 11 de milieu SB. Lorsque la culture atteint la phase exponentielle (DO 600 nm = 0,8), les germes sont lavés trois fois en glycérol 10% en eau en diminuant les volumes de lavage de 500 ml à 120 ml. Le surnageant est éliminé après centrifugation à 2500 x g pendant 15 min à 4 C. Après le dernier lavage, les bactéries sont reprises dans 3 ml de glycérol 10%, 1 mM Hepes pH 7,5. Les germes sont aliquotés sous 100 l dans des tubes placés dans de l'azote liquide. Les bactéries electrocompétentes sont conservées pendant un mois à -70 C.

Cinq pI de la réaction de ligation sont utilisés pour transformer 100 Cll de bactéries E.coli XL-1 par électroporation dans des cuves de 2 mm d'épaisseur (Eurogentec) sous un voltage de 2500 volts. Après électroporation, les germes sont incubés 1 heure à 37"C puis 1/10 et 9/10 du volume de la préparation sont étalés sur des boites de milieu LB (Difco) plus ampicilline (100 pg/ml) supplémenté avec du X-gal (25 pg/ml) et de l'IPTG (25 pg/ml) permettant une sélection blanc/bleu des clones recombinants.

Les clones recombinants (blancs) sont analysés après mini-préparation de plasmide selon une méthode classique (Maniatis et al., 1989) par double digestion EcoRl, BamHI.

Les clones retenus sont ceux qui ont intégrés un fragment de 2,1 kb. Le sens d'intégration de l'insert est déterminé après digestion par HincII. L'ADN plasmidique des clones d'intérêt est préparé en quantité importante par une maxi-préparation en utilisant une méthode de purification sur colonne tip-250 ( Kit Quiagen).

L'ADN plasmidique purifié sur colonne (Quiagen) est séquencé en utilisant le kit
Sequenase (USB, version 2.0). Cette technique dérive de la méthode de séquençage décrite par Sanger (Sanger et al., 1977). Trois à cinq llg d'ADN sont utilisés par réaction de séquence. Les réactions de séquences sont chargées sur un gel d'acrylamide 6% en présence d'urée 8M. La séquence nucléotidique révélée et la séquence d'acides aminés déduite sont telles que montrées dans l'ID SEQ N" 5.

EXEMPLE 4: Polypeptide T/2169 (1, 02, A3 ; 1-350) dont la séquence telle que
montrée dans l'ID SEQ NO 1 (IM2169), de l'acide aminé en position 1 à
l'acide aminé en position 350.

4A- Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2169 (1-350)
Construction du vecteur pTG 5782.

A partir du plasmide pTG3721 décrit dans la demande EPA 586 266, on
introduit, par mutagenèse dirigée, un site de restriction HindIII en aval de la séquence
codant pour Tbp2, pour générer le plasmide pTG4704.

A partir du plasmide pTG372 1, on amplifie par PCR, à l'aide des amorces
OTG4915 et OTG4651, un fragment comportant la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB et du début de la séquence codant pour Tbp2 mature jusqu'au site
HaeII interne.

OTG4915 : AAACCCGGATCCGTTGCCAGCGCTGCCGT
HaeII
OTG4651 :
BspHI
TTTTTTCATG AGA TAT CTC GCA ACA TTC TTC TTA TCT CTG
Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Leu
CCC CTC TTA ATC ACC GCC CCC TGC CTC GGT CCC
Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly Cys Leu Gly ...

clivage du peptide signal
CCC CCC AGT TTC
Le fragment PCR est ensuite digéré par BspHI et HaeII et inséré simultanément avec le fragment HaeII-HindIII de pTG4704 qui comporte la partie 3' de la région codant pour Tbp2, dans le plasmide pTG3704 décrit dans la demande EPA 586 266, digéré par NcoI et HindIII, pour générer le plasmide pTG5768.

A partir de plasmide pTG3721, on amplifie par PCR, à l'aide des amorces
OTG4928 et OTG5011, un fragment comportant la séquence codant pour la partie Nterminale de Tbp2.

SphI
OTG4928 : GTG TTT TTC TTC AGT GCA TGC CTC GGT CCC
Val Phe Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly
Clivage du peptide
signal
OTG5011 : TGCGCAAGCTTACAGTTTGTCTTTGGTTTTCGCGCTGCCG
HindIII
Ce fragment PCR est digéré par SphI et HindIII, puis cloné dans le plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266 ; on génère ainsi le plasmide pTG5740.

Le fragment HaeII-HindIII de pTG5740 comportant la partie 3' de la séquence codant pour le domaine de liaison à la transferrine humaine (hTf) ( 3' de la région codant pour le premier domaine) est inséré dans le plasmide pTG3704 digéré par
BamHI et HindIII, simultanément avec le fragment BamHI-HaeII de pTG5768 comportant le promoteur araB, la séquence signal rlpB et le début de la séquence codante de Tbp2 ; on génère ainsi le plasmide pTG5782. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2 (1 - 350).

4B - Production et purification de T/2169 (1-350)
Une souche d'E. coli est transformée par pTG5782. Les transformants sont mis en culture à 37"C en milieu M9 + succinate 0,5% + arginine 5011g/ml + ampicilline100 yg/ml. En phase exponentielle, on ajoute 0,2% d'arabinose (inducteur). Après une heure d'induction, on prélève des cellules et des extraits sont préparés. Une analyse en Western Blot suivie d'une révélation par la hTF-peroxidase permet de détecter une bande majoritaire dont le P.M. correspond à celui attendu pour cette forme tronquée de Tbp2.

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié: 15. 04. 93)
T/2169 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 5 : Polypeptide T/2394 (1, 02, A3 ; 1-340) dont la séquence telle que
montrée dans l'ID SEQ NO 2 (IM2394), de l'acide aminé en position 1 à
l'acide aminé en position 340.

SA - Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2394 (1-340)
Construction du vecteur pTG 5755
A partir du plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266, on
amplifie par PCR, à l'aide des amorces OTG4873 et OTG4877, un fragment
comportant la région codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la
hTf. Ce fragment est ensuite digéré par MuI et HindIII.

OTG4873 : AAAAAGCATGCATAAAAACTACGCGTTACACCATTCAAGC
MluI OTG4877 :TATATAAGCTTACGTTGCAGGCCCTGCCGCGTTTTCCCC
HindIII
Le plasmide pTG4710 est digéré par MluI et HindIII. Le fragment M/uI-HindIII
comportant la partie 3' de la séquence codant pour Tbp2 est remplacé par le fragment
PCR codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la hTf. On génère
ainsi le plasmide pTG5707. On remplace ensuite dans le plasmide pTG5707, un
fragment BamHI-MluI comportant le promoteur araB et le début de la séquence
codant pour Tbp2, par un fragment BamHI-MluI de pTG4764 décrit dans la demande
EPA 586 266 qui comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de
sécrétion RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2.

On génère ainsi le plasmide pTG5755. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la
séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant
pour le domaine N-terminal de Tbp2 (1 - 340).

5B - Production et purification de T/2394 (1-340)
T/2394 (1-340) est produit et purifié tel que décrit dans l'Exemple 4B.

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié: 15. 04. 93)
T/2394 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par
conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 6: Polypeptide D4/2169 (1, 02, 3) dont la séquence est identique à celle
telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1, de l'acide aminé en position 1 à
l'acide aminé en position 691, délétée des régions 362-379, 418-444, 465
481 et 500-520.

Polypeptide D4/2169 (1, 02, 3) dont la séquence est identique à celle telle que montrée dans 1'ID SEQ NO 1, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691, délétée des régions 362-379, 418-444, 465-481 et 500-520.

6A - Préparation du fragment d'ADN codant pour D4/2169
1.1. Clonage du fragment d'ADN
Le fragment d'ADN codant pour la sous-unité Tbp2 de la souche de N.

meningitidis In2169 est amplifié par PCR (Polymerase chain reaction) à l'aide
d'amorces spécifiques complémentaires des régions 5' et 3', (respectivement A5'
et A3') sur 10 ng d'ADN génomique extrait d'une culture de bactéries de la
souche IM2169.

A5' : 5' CCCGAATTCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC 3'
A3' : 5' CCCGAATTCTGCTATGGTGCTGCCTGTG 3'
Un fragment d'ADN est ainsi obtenu et après digestion par EcoRI, il
compte 2150 nt. Ce fragment EcoRI est ensuite ligué aux extrémités EcoRI
déphosphorylées du phagemide pBluescriptSK(-) (Stratagene) pour donner le
phagemide recombinant pSK/2169tbp2.

1.2. Mise en oeuvre des délétions.

Le clone pSK/2169tbp2 contenant les séquences tbp2 de la souche M982 est délété par la technique de Kunkel, PNAS (1985) 82: 448.

En bref, la forme phagique du phagemide recombinant pSK/2169tbp2 est obtenue après sauvetage par le phage "helper" VC S M13 selon la technique décrite par Stratagene, fournisseur du vecteur de base, et utilisée pour infecter la souche bactérienne CJ236. Les mutations dut et ung portées par la souche CJ236 ont pour conséquence la synthèse de molécules d'ADN ayant incorporé le précurseur nucléotidique dUTP.

Les phages sont récoltés et l'ADN simple brin est extrait par un mélange phénol/chloroforme. Cet ADN est hybridé dans les conditions classiques, aux oligonucléotides suivants:
2169d1 : 5' CGCATCCAAAACCGTACCTGTGCTGCCTGA 3'
2169d2 : 5' TTTATCACTTTCCGGGGGCAGGAGCGGAAT 3'
2169d3 : 5' GTTGGAACAGCAGACAGCGGTTTGCGCCCC 3'
2169d4 : 5' GAACATACTTTGTTCGTTTTTGCGCGTCAA 3'
La réaction d'hybridation est poursuivie 30 min, en température décroissante à partir de 70"C jusqu'à 30"C.

Le second brin complémentaire est ensuite achevé par synthèse complète en présence des quatre desoxynucléotides, de la T4 DNA polymérase et de la
T4 DNA ligase, selon les conditions classiques.

La souche E. coli SURE (Stratagene) est transformée par 1'ADN ainsi obtenu. Dans cette souche, les molécules porteuses de dUTP, c'est-à-dire nonmutées, sont détruites.

Les phages obtenus sont analysés par les techniques classiques de préparation rapide d'ADN plasmidique et de digestion par les enzymes de restriction appropriées. La présence de la mutation recherchée est ensuite vérifiée par séquençage nucléotidique.

Le clone pSK2169&num;7, porteur des quatre mutations A 1203-1256, A 1371
1451, A 1512-1562, et A 1617-1679 est sélectionné.

6B - Construction du vecteur d'expression pTG5783
Le plasmide pTG5768 décrit précédemment est digéré par HpaI et XcmI. On
insère simultanément dans ce vecteur un fragment XcmI-XcmI de pTG5768 et le
fragment HpaI-XcmI du plasmide pSK/2169ed&num;7, pour générer le plasmide
pTG5783. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal
de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence tbp2 modifiée (délétions dl à d4).

6C - Préparation et purification de D4/2169.

D4/2169 est produit et purifié selon l'Exemple 4B.

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié: 15. 04. 93)
D4/2169 purifié s'est révélé capable d'induire des anticorps bactéricides et par
conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 7: Détermination du niveau d'expression des RTHs des souches de N.

meningitidis
Le taux d'expression de la protéine RTH par N. meningitidis est déterminé par la mesure de la capacité d'un nombre défini de germes à fixer la Tfll couplée à la peroxydase.

Une préculture de 18 heures à 37"C sur MHA sert à ensemenser un erlen
contenant 50 ml de MHB supplémenté avec 30 IlM d'EDDA. La densité optique est
mesurée à 600 nm au début de de la culture et après 5 heures de culture. on appelle
croissance, la différence de densité optique entre ces deux temps. L'expression du RTH
est mesurée après 5 heures de culture comme suit:
La densité bactérienne de la culture est calculée à partir de l'absorbance de la
suspension mesurée à 600 nm sachant qu'une unité d'absorbance correspond à 3.109
CFU/ml.

Un ml d'une culture bactérienne est centrifugé pendant 15 min à 2500 g puis le culot bactérien est repris par un volume de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 de façon à obtenir une suspension de 1.108 CFU/ml. Dans le même tampon une série de dilutions de raison 2 est effectuée à partir de cette suspension (1/2 à 1/2048). Cinquante pl de chacun de ces échantillons sont déposés dans chacun des puits d'un appareil de "dot-blot" (Biorad) fonctionnant sous vide et équipé d'une membrane de nitrocellulose 0,45 pm (Schleicher et Schull) préalablement imbibée de tampon. Après dépôt des échantillons la membrane est incubée pendant 1h à température ambiante en tampon bloquant (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 9g/l, lait écrémé 10 g/l).La membrane est ensuite incubée pendant 1h à 37"C sous agitation avec une solution de Tfh-peroxydase à 1 pg/ml en tampon bloquant.

Après trois lavages en tampon bloquant, la fixation de la Tfh-peroxydase est révélée par l'addition d'un substrat colorimétrique de la peroxydase, le 4-Chloro-l-Naphtol (4-C1-
N) à 0,01% dans de l'éthanol 1%.

Après 20 min d'incubation à température ambiante, le titre d'expression du RTH est déterminé: il correspond à l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration violette est encore visible. La lecture se fait soit visuellement soit en utilisant un densitomètre (Appareil Sebia-Preference).

EXEMPLE 8: Préparation et titrage des sérums hyperimmuns anti-Tbp2s recombinantes
(Tbp2M982 100 %, Tbp2 M982 80 % et Tbp2 M982 50 %), anti-RTH
M982 et anti-RTH B16B6
8A - Préparation des immunogènes
Une culture de la souche d'E. coli décrite dans l'Exemple 4B ci-avant ou
dans l'Exemple 6B ci-avant est lysée par passage dans un appareil de lyse (Rannie)
puis centrifugée. Le matériel insoluble est chargé sur un gel d'acrylamide 10% de 5
mm d'épaisseur (10 mg de protéines insolubles par gel) puis soumis à
electrophorèse. La protéine Tbp2 ainsi que les formes 80 et 50 % sont visualisées
par coloration au Bleu de Coomassie puis extraites du gel. En parallèle, on réalise
un témoin négatif correspondant à l'extraction d'une protéine d'E. coli de même
taille que la protéine Tbp2.

Les RTH M982 et B16B6 sont quant à eux purifiés comme décrit dans les
Exemples 1 et 2 de WO 93/6861.

8B - Préparation des antisérums
Des lapins néozélandais albinos recoivent par voie sous-cutanée multisite, 50 ug d'un des produits décrit ci-avant dans le présent exemple, en présence d'adjuvant complet de Freund. 21 jours et 42 jours après la première injection, les lapins recoivent à nouveau 50 ug du même produit mais ces fois-ci en présence d'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours après la dernière injection, le sérum de animaux est prélevé, puis décomplémenté pendant 30 min à 56"C et stérilisé par filtration sur membrane de porosité 0,22 pm (Millipore).

Lorsque l'immunogène mis en oeuvre est un RTH, le filtrat est par la suite épuisé par contact avec la souche initiale (M982 ou B 1 6B6) qui pour se faire, a été cultivée au préalable en présence de fer sous forme libre (dans ces conditions, la synthèse du récepteur de la transferrine est réprimée). Les modalités de contact sont comme suit : 10 ml du filtrat sont ajoutés à 1010 cfu (unités formant des colonies) d'une culture de la souche initiale. L'adsorption est poursuivie une nuit à 4"C, sous agitation. Les bactéries sont ensuite éliminées par centrifugation de 15 min à 2500 x g. Le surnageant est récupéré puis soumis à nouveau à 3 opérations d'adsorption successives comme précédemment décrit.Les sérums adsorbés sont filtrés sur une membrane de porosité 0,22 llm (Millipore) et conservés à -20 C.

Dans le cas des sérums dirigés contre des protéines Tbp2 recombinantes, I'adsorption s'effectue contre la souche d'E. coli qui a servi à produire les protéines recombinantes, cultivées pendant 5h en milieu LB (Difco) supplémenté en ampicilline à 100 pg/ml.

8C - Titrage de l'activité bactéricide des sérums
La capacité des sérums anti-RTH ou anti-Tbp2 à induire la lyse des différentes souches de N meningitidis est évaluée par un essai de bactéricidie.

Cette technique consiste à mettre en présence deux volumes des dilutions de raison 2 (1/4 à 1/2048) du sérum adsorbé et décomplémenté à titrer, un volume de complément de jeune lapin dilué au 1/1,5 et un volume de suspension bactérienne
contenant 70 germes issue d'une culture de 5h à 37"C en bouillon MHB pH 7,2,
EDDA 30 pM. Les réactifs sont mélangés les uns aux autres dans des cupules et
incubés pendant 30 min à 37"C sous agitation. La réaction de bactéricidie du
sérum vis à vis des germes est arrêtée par l'addition d'l ml de gélose constituée de
bouillon MH pH 7,2, de 20% de supplément G (Pasteur Diagnostic) et 15% d'agar
noble (Difco). Les cupules sont ensuite incubées pendant une nuit à 370C en
présence de 10% CO2.La lecture des résultats consiste à numérer les colonies
formées à partir des bactéries non lysées. Le titre est défini comme l'inverse de la
dernière dilution du sérum induisant la lyse de 50% des bactéries introduites
initialement.

8D - Caractérisation des sérums anti-Tbp2s M982 recombinantes
La spécificité de quatre sérums hyperimmuns dirigés respectivement contre une protéine Tbp2-100% (sérum 577), Tbp2-80% (580), Tbp2-50% (583) ou encore contre une protéine non-sens d'Escherichia coli (sérum témoin 582) est analysée soit par une méthode de "dot-blot" sur germes entiers, soit par la méthode de "western-blot" sur des protéines de membranes externes.

1.1. Analyse sur des germes entiers
La préparation des germes, leur dépôt sur membrane de nitrocellulose sont
identiques à ce qui a été décrit dans l'Exemple 9. M982 et B16B6 sont cultivées
en absence ou en présence d'agent chélatant.

Après l'étape de saturation en tampon bloquant, la membrane est incubée
avec un des différents sérums hyperimmuns à analyser (dilué en tampon
bloquant: dilutions allant de 1/500 à 1/10000) pendant 1 h à 37"C. La membrane
est ensuite lavée deux fois en tampon bloquant sous agitation forte puis, afin de
révéler le premier sérum, elle est de nouveau incubée avec un sérum de chèvre
anti IgG de lapin couplé à la peroxydase (Zymed) dilué au 1/1000 en tampon
bloquant. Pour augmenter la sensibilité de la détection du signal, le substrat de la
peroxydase utilisée est un substrat chimioluminescent (Kit ECL, Amersham)
utilisé selon les recommandations du fabriquant.

Les résultats que l'on obtient, indiquent que le sérum anti-protéine d'E. coli
(sérum 582) est un bon témoin négatif dans le sens ou il ne permet de détecter ni la souche M982, ni la souche B16B6 quelque soit les conditions de culture. Les trois autres sérums reconnaissent uniquement la souche M982 et à un niveau plus élevé quand elle est cultivée en présence d'EDDA ce qui correspond à une reconnaissance du RTH. En effet la souche M982 exprime le RTH à un niveau basal quand elle est cultivée en l'absence d'agent chélatant et ce niveau augmente en présence d'agent chélatant. Les résultats indiquent que les sérums anti-Tbp2 100% (577), anti-Tbp2 80% (580) et anti-Tbp2 50% (583) sont spécifiques du
RTH de la souche M982.

1.2. Analvse sur des protéines de membranes externes
La souche M982 est cultivée en milieu appauvri en fer. Cinq ml de la culture en phase exponentielle (environ 1.108 germes/ml) sont centrifugés à 1500 g pendant 15 min. Le culot est repris par 1,5 ml de Tris-HCl 125 mM, pH 8,0. La suspension est lysée par sonication (appareil Branson-Sonifer 450, sonde de 3 mm de diamètre) pendant 2 min. La lyse est poursuivie par addition de
Triton X100 à 1% final et incubation 30 min dans de la glace. La suspension est centrifugée à 8000 g pour éliminer les bactéries non lysées, puis le surnageant est centrifugé 30 min à 10000 g pour obtenir sous forme de culot les membranes externes.Le culot est repris en Tris-HCl 125 mM, pH 8,0, puis dosé en protéines par une microméthode (Kit Micro-BCA, Pierce) utilisée selon les recommandations du fabriquant.

Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS selon la méthode de Laemmli (Laemli, 1970). Le gel séparateur contient 12,5% d'acrylamide et le gel de concentration en contient 5 %. Les échantillons à analyser sont dilués au demi en tampon échantillon (0,125 M de tampon Tris à pH 6,8; 25 % de glycérol; 2,5 % de 2-Mercaptoethanol; 0,001 % de bleu de
Bromophénol) et hydrolysés à 1000C. Cinquante g de protéines sont déposés pour un grand gel et 1 pg pour les gels Phast (Pharmacia, réticulation 12,5%).

La migration est réalisée à un voltage constant 50 V pour des gels de 15x12 cm (appareil vertical Biorad) et de 250 V sur les gels Phast.

Après une étape de fixation de 30 min dans une solution d'acide acétique 10%, isopropanol 25%, les gels sont colorés au bleu de Coomassie (0,25 % bleu; 45% méthanol; 10% acide acétique). Les gels sont ensuite décolorés
progressivement dans des bains successifs de méthanol 20%, acide acétique
10%.

Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher
& Schull ; 0,45 pm) selon la méthode de Towbin (Towbin et al., 1979). Le
transfert se fait sous ampérage constant (1 mA/cm2) pendant 90 min pour un
grand gel et 1 heure pour un gel Phast. L'efficacité du transfert est révélée par
coloration au rouge Ponceau (Kodak). Après transfert, la nitrocellulose est
lavée en tampon bloquant (Tris-HC1 0,5 M pH 7,5 ; 1 % lait écrémé; 150 mM
NaCl) pendant 1 heure à température ambiante.

L'incubation avec l'antisérum dilué en tampon bloquant a lieu pendant
une heure à 37"C. Le premier sérum est révélé par un antisérum couplé à la
peroxydase (chèvre anti-lapin, Zymed) pendant une heure à 37"C. Le substrat
de la peroxydase est le 4-chlorol-naphtol à 1 % (coloration violette).

Les résultats obtenus indiquent que la protéine Tbp2 de la souche M982
est spécifiquement reconnue par les sérums anti-Tbp2 100%), anti-Tbp2 80% et
anti-Tbp2 50%. Aucune autre protéine de N meningitidis n'est reconnue par ces
sérums. Le sérum anti-protéine d'E. coli ne reconnaît pas la Tbp2 de la souche N.

meningitidis M982.

8E - Titrage des sérums anti-Tbp2 M982 recombinantes
Pour pouvoir comparer les sérums hyperimmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % adsorbés sur E. coli, il est nécessaire de connaître leur titre vis à vis de la souche homologue. C'est pourquoi un titrage en "dot-blot" sur des germes M982 cultivés en milieu appauvri en fer est réalisé en appliquant le protocole décrit en 9.D.2.

Une concentration identique de germes (1.108 germes/ml) est déposée sur des filtres de nitrocellulose qui sont ensuite révélés avec des dilutions de raison 2 des différents sérums à titrer. Les titres sont définis comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle un signal positif est observé. Avec une révélation colorimétrique les titres obtenus sont les suivants: 512 pour le sérum anti-Tbp2 100% (sérum 577); 256 pour le sérum anti-Tbp2 80% (sérum 580); 256 pour le sérum anti-Tbp2 50% (sérum 583)
Ceci indique que les trois sérums hyperirnmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % ont à
une raison 2 près le même titre vis à vis de la souche M982. De ce fait pour l'analyse
de leur réactivité croisée vis à vis de différentes souches type M982, ils peuvent être
utilisés à la même concentration.

EXEMPLE 9: Analyse de la réactivité croisée des sérums anti-Tbp2 M982
recombinantes
La determination du niveau de réactivité croisée vis à vis des souches de type M982 est mise en oeuvre par la méthode de dot blot comme décrit dans l'Exemple 8.

Après culture en milieu MHB + 30mM EDDA pendant 5 heures, des dilutions de raison 2 des différentes suspensions bactériennes sont déposées sur 5 filtres de nitrocellulose différents:
- un premier filtre est révélé avec de la transferrine humaine couplée à la
peroxydase (TGH) et permet de définir un titre de fixation de la TFH;
- le second est révélé avec un sérum anti-protéine d'E. coli (sérum utilisé au
1/2000e ; témoin négatif);
- le troisième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982
recombinante entière (100%);
- le quatrième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982
recombinante délétée des portion hypervariables de la région "charnière" (80%);
et
- le cinquième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982
recombinante correspond à la région 50% N-terminale. Les titres sont définis
comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration est visible.

Pour pouvoir quantifier la réactivité croisée de chacun des sérums avec chacune des souches, il est nécessaire de définir une valeur qui tienne compte de la variabilité du niveau d'expression du RTH parmi les souches analysées.

C'est pourquoi un index correspondant au titre sérique rapporté au titre d'expression de la transferrine est calculé. Cet index est la valeur retenue pour l'analyse car elle tient compte du niveau variable d'expression du RTH d'une souche à l'autre dans nos conditions de culture. Cependant cet index ne peut pas rendre compte d'une éventuelle différence d'affinité des RTH.

Pour information, on présente dans le tableau ci-dessous un récapitulatif des valeurs d'index obtenus pour les 54 souches.

<tb>

<SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souches <SEP> reconnues
<tb> Index <SEP> de <SEP> Anti-Tbp2 <SEP> 100% <SEP> Anti-Tbp2 <SEP> 80% <SEP> AntiTbp2 <SEP> 50%
<tb> <SEP> reconnaissance <SEP> sérum <SEP> 577 <SEP> sérum <SEP> 580 <SEP> sérum <SEP> 583
<tb> sérique
<tb> <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> <SEP> 0,016 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> <SEP> 0,031 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb> <SEP> 0,062 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 5
<tb> <SEP> 0,125 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 7
<tb> <SEP> 0,25 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 12
<tb> <SEP> 0,5 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 8
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 2
<tb> <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3
<tb>
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Pasteur Merieux serums et vaccins
(B) RUE: 58, avenue leclerc
(C) VILLE: Lyon
(E) PAYS:France
(F) CODE POSTAL: 69007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Fragments Tbp2 de N. meningitidis
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 29
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2230 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis
(B) SOUCHE: IM2169
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig~peptide
(B) EMPLACEMENT:60. .119
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat peptide
(B) EMPLACEMENT:120. .2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:60. .2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: miscfeature
(B) EMPLACEMENT:120. .1154
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc feature
(B) EMPLACEMENT:1155. .1748
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: miscfeature
(B) EMPLACEMENT:1749..2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc binding
(B) EMPLACEMENT:237..1169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATTTGTTAAA AATAAATAAA ATAATAATCC TTATCATTCT TTAATTGAAT TGGGTTTAT 59
ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 107
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gln Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
TTG TTG AGT GCC TGT CTG GGC GGC GGC GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT 155
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser
1 5 10
GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT 203
Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser
15 20 25
TCC GAA AAA CCG CAA GCC CAA AAA GAC CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCG 251
Ser Glu Lys Pro Gln Ala Gln Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala
30 35 40
ATG AGG TTG AAA CGG AGG AAT TGG TAT CCG GGG GCA GAA GAA AGC GAG 299
Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu
45 50 55 60
GTT AAA CTG AAC GAG AGT GAT TGG GAG GCG ACG GGA TTG CCG ACA AAA 347
Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys
65 70 75
CCC AAG GAA CTT CCT AAA CGG CAA AAA TCG GTT ATT GAA AAA GTA GAA 395
Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gln Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu
80 85 90
ACA GAC GGC GAC AGC GAT ATT TAT TCT TCC CCC TAT CTC ACA CCA TCA 443
Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser
95 100 105
AAC CAT CAA AAC GGC AGC GCT GGC AAC GGT GTA AAT CAA CCT AAA AAT 491
Asn His Gln Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gln Pro Lys Asn
110 115 120
CAG GCA ACA GGT CAC GAA AAT TTC CAA TAT GTT TAT TCC GGT TGG TTT 539 Gln Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gln Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140
TAT AAA CAT GCA GCG AGT GAA AAA GAT TTC AGT AAC AAA AAA ATT AAG 587
Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys
145 150 155
TCA GGC GAC GAT GGT TAT ATC TTC TAT CAC GGT GAA AAA CCT TCC CGA 635
Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg
160 165 170
CAA CTT CCT GCT TCT GGA AAA GTT ATC TAC AAA GGT GTG TGG CAT TTT 683 Gln Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe
175 180 185
GTA ACC GAT ACA AAA AAG GGT CAA GAT TTT CGT GAA ATT ATC CAG CCT 731
Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gln Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro
190 195 200
TCA AAA AAA CAA GGC GAC AGG TAT AGC GGA TTT TCT GGT GAT GGC AGC 779
Ser Lys Lys Gln Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220
GAA GAA TAT TCC AAC AAA AAC GAA TCC ACG CTG AAA GAT GAT CAC GAG 827
Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu
225 230 235
GGT TAT GGT TTT ACC TCG AAT TTA GAA GTG GAT TTC GGC AAT AAG AAA 875
Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys
240 245 250
TTG ACG GGT AAA TTA ATA CGC AAT AAT GCG AGC CTA AAT AAT AAT ACT 923
Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr
255 260 265
AAT AAT GAC AAA CAT ACC ACC CAA TAC TAC AGC CTT GAT GCA CAA ATA 971
Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gln Ile
270 275 280
ACA GGC AAC CGC TTC AAC GGC ACG GCA ACG GCA ACT GAC AAA AAA GAG 1019
Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300
AAT GAA ACC AAA CTA CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC 1067
Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser
305 310 315
GGC GGC TTT TTC GGC CCG CAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG 1115
Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gln Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu
320 325 330
AGC GAC GAT CAA AAA GTT GCC GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC AAA GAC 1163
Ser Asp Asp Gln Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ma Lys Thr Lys Asp
335 340 345
AAA CTG GAA AAT GGC GCG GCG GCT TCA GGC AGC ACA GGT GCG GCA GCA 1211
Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala
350 355 360
TCG GGC GGT GCG GCA GGC ACG TCG TCT GAA AAC AGT AAG CTG ACC ACG 1259
Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380
GTT TTG GAT GCG GTT GAA TTG ACA CTA AAC GAC AAG AAA ATC AAA AAT 1307
Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn
385 390 395
CTC GAC AAC TTC AGC AAT GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG 1355
Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met
400 405 410
ATT CCG CTC CTG CCC AAG GAT TCC GAA AGC GGG AAC ACT CAG GCA GAT 1403
Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gln Ala Asp
415 420 425
AAA GGT AAA AAC GGC GGA ACA GAA TTT ACC CGC AAA TTT GAA CAC ACG 1451
Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr
430 435 440
CCG GAA AGT GAT AAA AAA GAC GCC CAA GCA GGT ACG CAG ACG AAT GGG 1499
Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asn Gly 445 450 455 460
GCG CAA ACC GCT TCA AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA 1547
Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys
465 470 475
ACC TAT GAA GTC GAA GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC 1595
Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr
480 485 490
GGA ATG TTG ACG CGC AAA AAC AGC AAG TCC GCG ATG CAG GCA GGA GGA 1643
Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln Ala Gly Gly
495 500 505
AAC AGT AGT CAA GCT GAT GCT AAA ACG GAA CAA GTT GAA CAA AGT ATG 1691
Asn Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu Gln Ser Met
510 515 520
TTC CTC CAA GGC GAG CGT ACC GAT GAA AAA GAG ATT CCA ACC GAC CAA 1739
Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gln 525 530 535 540
AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC GGC ACA 1787
Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr
545 550 555
AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCT GAT AAA GAG GGC GGC AAC AGG GCG GAA 1835
Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu
560 565 570
TTT ACT GTG AAT TTT GCC GAT AAA AAA ATT ACC GGC AAG TTA ACC GCT 1883
Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala
575 580 585
GAA AAC AGG CAG GCG CAA ACC TTT ACC ATT GAG GGA ATG ATT CAG GGC 1931
Glu Asn Arg Gln Ala Gln Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gln Gly
590 595 600
AAC GGC TTT GAA GGT ACG GCG AAA ACT GCT GAG TCA GGT TTT GAT CTC 1979
Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620
GAT CAA AAA AAT ACC ACC CGC ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA GAT GCC 2027
Asp Gln Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala
625 630 635
AAG GTA AAG GGC GGT TTT TAC GGG CCT AAA GCC GAA GAG TTG GGC GGA 2075
Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly
640 645 650
TGG TTT GCC TAT CCG GGC GAT AAA CAA ACG GAA AAG GCA ACA GCT ACA 2123
Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gln Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr
655 660 665
TCC AGC GAT GGA AAT TCA GCA AGC AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG 2171
Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala
670 675 680
AAA CGC CAA CAG CCT GTG CAA TAAGCACGGT TGCCGAACAA TCAAGAATAA 2222
Lys Arg Gln Gln Pro Val Gln 685 690
GGCTTCAG 2230
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gln Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser
1 5 10
Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser
15 20 25
Ser Glu Lys Pro Gln Ala Gln Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala
30 35 40
Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu
45 50 55 60
Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys
65 70 75
Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gln Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu
80 85 90
Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser
95 100 105
Asn His Gln Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gln Pro Lys Asn
110 115 120 Gln Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gln Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140
Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys
145 150 155
Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg
160 165 170 Gln Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe
175 180 185
Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gln Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro
190 195 200
Ser Lys Lys Gln Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220
Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu
225 230 235
Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys
240 245 250
Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr
255 260 265
Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gln Ile
270 275 280
Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300
Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser
305 310 315
Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gln Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu
320 325 330
Ser Asp Asp Gln Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp
335 340 345
Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ma Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala
350 355 360
Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380
Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn
385 390 395
Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met
400 405 410
Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gln Ala Asp
415 420 425
Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr
430 435 440
Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asn Gly 445 450 455 460
Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys
465 470 475
Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr
480 485 490
Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln Ala Gly Gly
495 500 505
Asn Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu Gln Ser Met
510 515 520
Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gln 525 530 535 540
Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr
545 550 555
Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu
560 565 570
Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala
575 580 585
Glu Asn Arg Gln Ala Gln Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gln Gly
590 595 600
Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620
Asp Gln Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala
625 630 635
Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly
640 645 650
Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gln Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr
655 660 665
Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala
670 675 680
Lys Arg Gln Gln Pro Val Gln 685 690
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1808 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: IM2394
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig peptide
(B) EMPLACEMENT:1..60
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat~peptide
(B) EMPLACEMENT:61..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:61..1035
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc feature
(B) EMPLACEMENT:1036..1386
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:1387..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: miscbinding
(B) EMPLACEMENT:46..1050
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 48
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gln Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
TTG TTG AGT GCT TGT CTG GGT GGC GGC GGC AGT TTC GAT TTG GAC AGC 96
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser
1 5 10
GTG GAA ACC GTG CAA GAT ATG CAC TCC AAA CCT AAG TAT GAG GAT GAA 144
Val Glu Thr Val Gln Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu
15 20 25
AAA AGC CAG CCT GAA AGC CAA CAG GAT GTA TCG GAA AAC AGC GGC GCG 192
Lys Ser Gln Pro Glu Ser Gln Gln Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala
30 35 40
GCT TAT GGC TTT GCA GTA AAA CTA CCT CGC CGG AAT GCA CAT TTT AAT 240
Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn
45 50 55 60
CCT AAA TAT AAG GAA AAG CAC AAA CCA TTG GGT TCA ATG GAT TGG AAA 288
Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys
65 70 75
AAA CTG CAA AGA GGA GAA CCA AAT AGT TTT AGT GAG AGG GAT GAA TTG 336
Lys Leu Gln Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu
80 85 90
GAA AAA AAA CGG GGT AGT TCT GAA CTT ATT GAA TCA AAA TGG GAA GAT 384
Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp
95 100 105
GGG CAA AGT CGT GTA GTT GGT TAT ACA AAT TTC ACT TAT GTC CGT TCG 432
Gly Gln Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser
110 115 120
GGA TAT GTT TAC CTT AAT AAA AAT AAT ATT GAT ATT AAG AAT AAT ATA 480
Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140
GTT CTT TTT GGA CCT GAC GGA TAT CTT TAC TAT AAA GGG AAA GAA CCT 528
Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro
145 150 155
TCC AAG GAG CTG CCA TCG GAA AAG ATA ACT TAT AAA GGT ACT TGG GAT 576
Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp
160 165 170
TAT GTT ACT GAT GCT ATG GAA AAA CAA AGG TTT GAA GGA TTG GGT AGT 624
Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gln Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser
175 180 185
GCA GCA GGA GGA GAT AAA TCG GGG GCG TTG TCT GCA TTA GAA GAA GGG 672
Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly
190 195 200
GTA TTG CGT AAT CAG GCA GAG GCA TCA TCC GGT CAT ACC GAT TTT GGT 720
Val Leu Arg Asn Gln Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220
ATG ACT AGT GAG TTT GAG GTT GAT TTT TCT GAT AAA ACA ATA AAG GGC 768
Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly
225 230 235
ACA CTT TAT CGT AAC AAC CGT ATT ACT CAA AAT AAT AGT GAA AAC AAA 816
Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gln Asn Asn Ser Glu Asn Lys
240 245 250
CAA ATA AAA ACT ACG CGT TAC ACC ATT CAA GCA ACT CTT CAC GGC AAC 864 Gln île Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gln Ala Thr Leu His Gly Asn
255 260 265
CGT TTC AAA GGT AAG GCG TTG GCG GCA GAT AAA GGT GCA ACA AAT GGA 912
Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly
270 275 280
AGT CAT CCC TTT ATT TCC GAC TCC GAC AGT TTG GAA GGC GGA TTT TAC 960
Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300
GGG CCG AAA GGC GAG GAA CTT GCC GGT AAA TTC TTG AGC AAC GAC AAC 1008
Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn
305 310 315
AAA GTT GCA GCG GTG TTT GGT GCG AAG CAG AAA GAT AAG AAG GAT GGG 1056
Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gln Lys Asp Lys Lys Asp Gly
320 325 330
GAA AAC GCG GCA GGG CCT GCA ACG GAA ACC GTG ATA GAT GCA TAC CGT 1104
Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg
335 340 345
ATT ACC GGC GAG GAG TTT AAG AAA GAG CAA ATA GAC AGT TTT GGA GAT 1152
Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gln Ile Asp Ser Phe Gly Asp
350 355 360
GTG AAA AAG CTG CTG GTT GAC GGA GTG GAG CTT TCA CTG CTG CCG TCT 1200
Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380
GAG GGC AAT AAG GCG GCA TTT CAG CAC GAG ATT GAG CAA AAC GGC GTG 1248
Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gln His Glu Ile Glu Gln Asn Gly Val
385 390 395
AAG GCA ACG GTG TGT TGT TCC AAC TTG GAT TAC ATG AGT TTT GGG AAG 1296
Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys
400 405 410
CTG TCA AAA GAA AAT AAA GAC GAT ATG TTC CTG CAA GGT GTC CGC ACT 1344
Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gln Gly Val Arg Thr
415 420 425
CCA GTA TCC GAT GTG GCG GCA AGG ACG GAG GCA AAC GCC AAA TAT CGC 1392
Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg
430 435 440
GGT ACT TGG TAC GGA TAT ATT GCC AAC GGC ACA AGC TGG AGC GGC GAA 1440
Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460
GCC TCC AAT CAG GAA GGT GGT AAT AGG GCA GAG TTT GAC GTG GAT TTT 1488
Ala Ser Asn Gln Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
465 470 475
TCC ACT AAA AAA ATC AGT GGC ACA CTG ACG GCA AAA GAC CGT ACG TCT 1536
Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser
480 485 490
CCT GCG TTT ACT ATT ACT GCC ATG ATT AAG GAC AAC GGT TTT TCA GGT 1584
Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly
495 500 505
GTG GCG AAA ACC GGT GAA AAC GGC TTT GCG CTG GAT CCG CAA AAT ACC 1632
Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gln Asn Thr
510 515 520
GGA AAT TCC CAC TAT ACG CAT ATT GAA GCC ACT GTA TCC GGC GGT TTC 1680
Gly Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540
TAC GGC AAA AAC GCC ATC GAG ATG GGC GGA TCG TTC TCA TTT CCG GGA 1728
Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly
545 550 555
AAT GCA CCA GAG GGA AAA CAA GAA AAA GCA TCG GTG GTA TTC GGT GCG 1776
Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gln Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala
560 565 570
AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA TAAGCACGGC T 1808
Lys Arg Gln Gln Leu Val Gln
575
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 599 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gln Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser
1 5 10
Val Glu Thr Val Gln Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu
15 20 25
Lys Ser Gln Pro Glu Ser Gln Gln Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala
30 35 40
Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn
45 50 55 60
Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys
65 70 75
Lys Leu Gln Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu
80 85 90
Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp
95 100 105
Gly Gln Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser
110 115 120
Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140
Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro
145 150 155
Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp
160 165 170
Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gln Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser
175 180 185
Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly
190 195 200
Val Leu Arg Asn Gln Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220
Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly
225 230 235
Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gln Asn Asn Ser Glu Asn Lys
240 245 250 Gln Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gln Ala Thr Leu His Gly Asn
255 260 265
Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly
270 275 280
Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300
Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn
305 310 315
Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gln Lys Asp Lys Lys Asp Gly
320 325 330
Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg
335 340 345
Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gln Ile Asp Ser Phe Gly Asp
350 355 360
Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380
Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gln His Glu Ile Glu Gln Asn Gly Val
385 390 395
Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys
400 405 410
Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gln Gly Val Arg Thr
415 420 425
Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg
430 435 440
Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460
Ala Ser Asn Gln Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
465 470 475
Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser
480 485 490
Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly
495 500 505
Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gln Asn Thr
510 515 520
Gly Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540
Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly
545 550 555
Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gln Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala
560 565 570
Lys Arg Gln Gln Leu Val Gln
575
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2064 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis
(B) SOUCHE: 8680
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..2061
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig peptide
(B) EMPLACEMENT:1..30
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat peptide
(B) EMPLACEMENT:31..2061
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5:
ATG GTG CTG CCT GTG TTT TTG TCG AGT GCT TGT CTG GGC GGA GGC GGC 48
Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5
GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG 96
Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala
10 15 20
CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT TCC GAA AAG CCG AAA GCC CAA AAA GAC 144
Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gln Lys Asp
25 30 35
CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCA ATG CGC TTT AAG CGG AGG AAT TGG TAT 192 Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr
40 45 50
CAG AAG GCG AAT CCT AAA GAA GAT GAG ATA AAA CTC TCT GAA AAT GAT 240 Gln Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp
55 60 65 70
TGG GAA CAA ACG GAT AAT GGT GAT ATC AAA AAC CCT TCC AAA CAA AAA 288
Trp Glu Gln Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gln Lys
75 80 85
AAT ATT ATT AAT GCC TTA CCT GGA AAT AAT GGA GGA GCT ACA TTG CAA 336
Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gln
90 95 100
GAT TCC AGT CAA GAA AAT CAG GGT ATA TCT AAG GTT ACG GAC TAT CAC 384
Asp Ser Ser Gln Glu Asn Gln Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His
105 110 115
AAT TTC CAA TAC GTA TGG TCG GGG TTT TTT TAT AAA CAG ATT AAA AAT 432
Asn Phe Gln Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gln Ile Lys Asn
120 125 130
ACA ATT GAA AAA AAC GGT TCA TCT ATA ACC GCA GCC AGA AAC GGT CCT 480
Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150
GAC GGT TAT ATT TTT TAT AAA GGC AAA GAT CCC TCG AGA CAA CTC CCT 528
Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gln Leu Pro
155 160 165
GTA TTG GGA CAG GTT ACG TAT AAA GGG ACT TGG GAT TTC TTA ACT GAT 576
Val Leu Gly Gln Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp
170 175 180
GTG AAA ATA AAT CAG AAA TTT ATA GAT TTA GGG AAT ACT TCT ACG AAA 624
Val Lys Ile Asn Gln Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys
185 190 195
CCC GGC GAC CGA TAT AGT GCT TTT TCC GGG GAG TTG GAT TAT ATC GTC 672
Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val
200 205 210
AAT AAA GAT AGC GAT AAG AAA GAC GGG CAC GTA GCA AAG GGA TTA ACA 720
Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230
ACG GAA ATA ACG GTT GAT TTT GAG AAA AAA ACC CTC AAC GGA AAA TTA 768
Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu
235 240 245
ATT AAA AAC AAC AGT GTA AGC AAT AAT GAG TTC AAC GCT AAA TAC ACC 816
Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr
250 255 260
ACC CAA TAC TAT AGC CTT GAT GCG ACG CTT AGG GGA AAC CGC TTC AAC 864
Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn
265 270 275
GGC AAG GCA ACG GCA ACC GAC AAA CCT GGC ACT GGA GAA ACC AAA CAA 912
Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gln
280 285 290
CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC GGC GGC TTT TTC GGC 960
His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310
CCG AAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG AGC GAC GAT AAA AAA 1008
Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys
315 320 325
GTT GCG GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC CAA GAC AAA CCG GGA AAT GGC 1056
Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gln Asp Lys Pro Gly Asn Gly
330 335 340
GCG GCG GCT TCA GAC GGC GAG GTG CGG CAG CAT CAA ACG GTG CGG CAG 1104
Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gln His Gln Thr Val Arg Gln
345 350 355
CTA GAT GGC TCT GAA AAC GGT AAG CTG ACC ACG GTT TTG GAT GCG GTC 1152
Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
360 365 370
GAG CTG ACG CAC GGC GGC ACA GCA ATC AAA AAT CTC GAC AAC TTC AGC 1200
Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390
AAC GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG ATT CCG CTC CCT GCC 1248
Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala
395 400 405
GAG GCT TCC GAA AGT GGG AAC AAT CAA GCC AAT CAA GGT ACA AAT GGC 1296
Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gln Ala Asn Gln Gly Thr Asn Gly
410 415 420
GGA ACA GCC TTT ACC CGC AAA TTT GAC CAC ACG CCG AAA AGC GAT GAA 1344
Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu
425 430 435
AAA GAC ACC CAA GCA GGT ACG GCG GCG AAT GGC AAT CCA GCC GCT TCA 1392
Lys Asp Thr Gln Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser
440 445 450
AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA ACC TAT GAA GTC GAA 1440
Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470
GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC GGG TTG CTG ACG CGC 1488
Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg
475 480 485
AAA ACT GCC GGT AAC ACG GTG GGA AGC GGC AAC GGC AGC CCA ACC GCC 1536
Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala
490 495 500
GCC GCC CAA ACG GAC GCG CAG AGT ATG TTC TTA CAA GGC GAG CGC ACC 1584
Ala Ala Gln Thr Asp Ala Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr
505 510 515
GAT GAA AAA GAG ATT CCA AGC GAG CAA AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT 1632
Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gln Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser
520 525 530
TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC AGC ACA AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCC 1680
Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550
AAT GCA ACG AGT GGC AAC AAG GCG GAC TTT ACC GTG AAT TTT GGC GAG 1728
Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ma Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu
555 560 565
AAA AAA ATT ACC GGC ATG TTA ACC GCT GAA AAC AGG CAG GCG GCA ACC 1776
Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Ala Thr
570 575 580
TTT ACC ATT GAG GGA ACG ATT CAG GGC AAC GGT TTT TCC GGT ACG GCA 1824
Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gln Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala
585 590 595
AAA ACT GCT GAC TCA GGC TTT GAT CTC GAT CAA AGC AAT ACC ACC GGC 1872
Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gln Ser Asn Thr Thr Gly
600 605 610
ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA AAC GCC AAG GTG CAG GGC GGT TTT TAC 1920
Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gln Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630
GGG CCT AAA GCC GAA GAA ATG GGT GGA TGG TTT GCT TAT CCG GGC GAC 1968
Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp
635 640 645
AGT CAG ACG CAG CGG TCC GCT TCG GGG TCA GGC GCA TCA GCC GCC AAC 2016
Ser Gln Thr Gln Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ma Ser Ala Ala Asn
650 655 660
AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA 2061
Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Leu Val Gln
665 670 675
TAA 2064
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 687 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6:
Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5
Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala
10 15 20
Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gln Lys Asp
25 30 35 Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr
40 45 50 Gln Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp
55 60 65 70
Trp Glu Gln Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gln Lys
75 80 85
Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gln
90 95 100
Asp Ser Ser Gln Glu Asn Gln Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His
105 110 115
Asn Phe Gln Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gln Ile Lys Asn
120 125 130
Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150
Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gln Leu Pro
155 160 165
Val Leu Gly Gln Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp
170 175 180
Val Lys Ile Asn Gln Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys
185 190 195
Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val
200 205 210
Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230
Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu
235 240 245
Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr
250 255 260
Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn
265 270 275
Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gln
280 285 290
His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310
Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys
315 320 325
Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gln Asp Lys Pro Gly Asn Gly
330 335 340
Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gln His Gln Thr Val Arg Gln
345 350 355
Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
360 365 370
Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390
Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala
395 400 405
Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gln Ala Asn Gln Gly Thr Asn Gly
410 415 420
Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu
425 430 435
Lys Asp Thr Gln Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser
440 445 450
Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470
Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg
475 480 485
Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala
490 495 500
Ala Ala Gln Thr Asp Ala Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr
505 510 515
Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gln Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser
520 525 530
Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550
Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ala Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu
555 560 565
Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Ala Thr
570 575 580
Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gln Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala
585 590 595
Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gln Ser Asn Thr Thr Gly
600 605 610
Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gln Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630
Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp
635 640 645
Ser Gln Thr Gln Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Asn
650 655 660
Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Leu Val Gln
665 670 675
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME:N. meningitidis
(B) SOUCHE: IM2169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Thr Lys Asp Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys
20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys
35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ma Gln Leu Val Val Asp
50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Gln Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe
85 90 95
Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln
100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly
115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr
130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln
145 150 155 160
Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu
165 170 175
Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro
180 185 190
Thr Asp Gln Asn Val Val
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 6940
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8:
Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys
20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu
35 40 45
Val Gln Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp
50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn
65 70 75 80
Gln Ala Asn Gln Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe
85 90 95
Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln
100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly
115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr
130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln
145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu
165 170 175
Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro
180 185 190
Ser Glu Gln Asn Ile Val
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 2223
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 9:
Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys
20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu
35 40 45
Val Gln Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp
50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn
65 70 75 80
Gln Ala Asn Gln Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe
85 90 95
Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln
100 105 110
Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly
115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr
130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln
145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Gly
165 170 175
Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro
180 185 190
Ser Glu Gln Asn Ile Val
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: C708
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 10:
Thr Gln Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ala Arg Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gln Ser Ser Glu Asn Ser Lys
20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys
35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp
50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Lys Asn
65 70 75 80
Gln Ala Asn Gln Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe
85 90 95
Asn His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gln Ala Gly Thr Ala
100 105 110
Glu Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala Asn Gly
115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr
130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln
145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Gly
165 170 175
Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro
180 185 190
Asn Asp Gln Asn Val Val
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 211 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: M978
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 11:
Thr Gln Asp Lys Ala Ala Asn Gly Asn Thr Ala Ala Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn
20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp
35 40 45
Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val
50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly
65 70 75 80
Ser Asn Gln Ala Asp Lys Gly Lys Lys Gly Lys Asn Gly Lys Asn Gly
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Tyr Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp
100 105 110
Lys Asp Thr Lys Ala Gln Thr Gly Ala Ala Gly Ser Ser Gly Ala Gln
115 120 125
Thr Asp Leu Gly Lys Ala Asp Val Asn Gly Gly Lys Ala Glu Thr Lys
130 135 140
Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln Ala Gly Gly
165 170 175
Asn Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu Gln Ser Met
180 185 190
Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gln
195 200 205
Asn Val Val
210 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 200 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 1610
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Lys Arg Asp Lys Ala Glu Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn
20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Ser Gly Gly
35 40 45
Lys Glu Val Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val
50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly
65 70 75 80
Asn Thr Gln Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Lys Phe Thr Arg
85 90 95
Lys Phe Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Thr Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr
115 120 125
Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu
130 135 140
Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr
145 150 155 160
Gly Glu Gly Gly Asn Gly Ser Gln Thr Ala Ma Ala Gln Thr Ala Gln
165 170 175
Gly Ala Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu
180 185 190
Ile Pro Ser Glu Gln Asn Val Val
195 200 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 200 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 867
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 13:
Thr Lys Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Ma Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Gly Lys
20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys
35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Ser
50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Met Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly Asn Asn
65 70 75 80
Gln Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe
85 90 95
Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gln Ala Gly Thr Pro
100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Gly Thr Ala Gly Val Thr Gly Gly
115 120 125
Gln Ala Gly Lys Thr Tyr Ala Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Asp Asn Thr Val
145 150 155 160
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Ser Thr Ala Ala Ala Gln Thr Ala Gln Gly
165 170 175
Ala Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile
180 185 190
Pro Lys Glu Gln Gln Asp Ile Val
195 200 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: S3032
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 14:
Thr Lys Asp Lys Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ala Glu Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn
20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr His Gly Gly
35 40 45
Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val
50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Gln Asn Ser Thr Gly Lys
65 70 75 80
Asn Asn Gln Pro Asp Gln Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Ile Tyr
85 90 95
Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp Lys Asp Thr Lys Ala Gln
100 105 110
Thr Val Thr Gly Gly Thr Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala
115 120 125
Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu
130 135 140
Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr
145 150 155 160
Val Gly Ser Gly Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Ala Gln Thr Asp Ala
165 170 175
Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Asn Lys Ile Pro
180 185 190
Ser Glu Gln Asn Val Val
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 195 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 891
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 15:
Thr Lys Asp Lys Pro Gly Asn Gly Ala Arg Leu Gln Ala Ala Arg Cys
1 5 10 15
Gly Thr Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gln Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu
20 25 30
Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu Val
35 40 45
Gln Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly
50 55 60
Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gln
65 70 75 80
Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Glu Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu
85 90 95
His Thr Pro Glu Ser Asp Glu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Pro Ser
100 105 110
Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys
115 120 125
Thr Lys Thr Tyr Glu Val Asn Leu Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys
130 135 140
Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr Gly Glu Gly Gly
145 150 155 160
Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Gln Thr Ala Gln Gly Ala Gln Ser Met
165 170 175
Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gln
180 185 190
Asn Val Val
195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AAACCCGGAT CCGTTGCCAG CGCTGCCGT 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
TTTTTTCATG AGATATCTGG CAACATTGTT GTTATCTCTG GCGGTGTTAA TCACCGCCGG 60
GTGCCTGGGT GGCGGCGGCA GTTTC 85
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 18:
GTGTTTTTGT TGAGTGCATG CCTGGGTGGC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TGCGCAAGCT TACAGTTTGT CTTTGGTTTT CGCGCTGCCG 40
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 20: AAAAAGCATG CATAAAAACT ACGCGTTACA CCATTCAAGC 40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: TATATAAGCT TACGTTGCAG GCCCTGCCGC GTTTTCCCC 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 22:
CCCGAATTCT GCCGTCTGAA GCCTTATTC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: CCCGAATTCT GCTATGGTGC TGCCTGTG 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 24: CGCATCCAAA ACCGTACCTG TGCTGCCTGA 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
TTTATCACTT TCCGGGGGCA GGAGCGGAAT 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D > CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 26: GTTGGAACAG CAGACAGCGG TTTGCGCCCC 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: GAACATACTT TGTTCGTTTT TGCGCGTCAA 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28:
CCACGGATCC TGCCGTCTGA AGCCTTATTC 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
CGCGGATCCT GCTATGGTG 19

Claims (37)

1. en ce qu'elle possède une région charnière de type M982.

   caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb et (ii)

   - 379 ; A 418 - 444 ; A 465 - 481; A 500 - 520); et la sous-unité Tbp2 étant

   portions hypervariables du deuxième domaine (région charnière) (Tbp2 M982 A 362

   correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des

   reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide

   souche de N. meningitidis ; la souche étant caractérisée en ce qu elle n'est pas

   poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une

   Revendications 1. Une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre
2. 2. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 1, qui dérive d'une souche de N.

   position 350.

   d'un fragment de Tbp2 M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en

   meningitidis qui n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre
3. 3. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 1 ou 2, qui dérive d'une souche de N.

   souche B1616 (antisérum anti-RTH B16B6).

   (antisérum anti-RTH M982) et par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la

   membranaires par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche M982

   meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions
4. 4. Une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 3, qui comprend une

   séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés

   de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 60 à 70%.
5. 5. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 4, qui comprend une séquence d'acides

   aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 de la

   souche M982, telle que montrée dans 1'ID SEQ No. 1, est d'environ 65%.
6. 6. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 5, qui comprend une séquence d'acides

   aminés substantiellement telle que montrée dans l'ID SEQ No. 5.
7. 7. Une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications l à 6, en association avec la

   sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) de la souche de N. meningitidis dont est

   issue la Tbp2.
8. 8. Un polypeptide capable de se lier à la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité

   Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion d'un ou plusieurs

   acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale ou dans la région des

   quarante premiers acides aminés de la sous-unité Tbp2.
9. 9. Un polypeptide selon la revendication 8, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une

   des revendications 1 à 6, notamment par délétion partielle du deuxième domaine (ou

   région charnière) de la sous-unité Tbp2.
10. 10. Un polypeptide selon la revendication 9, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une

    des revendications 1 à 6, notamment par délétion partielle des régions du deuxième

    domaine qui sont les homologues des régions de la séquence M982 allant:

    (i) de l'acide aminé en position 388 à l'acide aminé en position396;

    (ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 476 ; et

    (iii) de l'acide aminé en position 499 à l'acide aminé en position 521.

    revendication 6, par délétion des régions 377-385, 407-465 et 488-508.
11. 11 Un polypeptide selon la revendication i 0, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon la
12. 12. Un polypeptide selon la revendication 9, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une

    des revendications 1 à 6, notamment par délétion substantielle des portions

    hypervariables du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous-unité Tbp2.
13. 13. Un polypeptide selon la revendication 12, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon

    l'une des revendications l à 6, par délétion substantielle des portions hypervariables

    du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous-unité Tbp2 et qui contient le

    premier et le troisième domaines de la sous-unité Tbp2.
14. 14. Un polypeptide selon la revendication 13, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon la

    revendication 6, par délétion des portions 351-368, 407-433, 454-470 et 489-508.
15. 15. Un polypeptide selon la revendication 8, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une

    des revendications 1 à 6, notamment par délétion substantielle du deuxième ou du

    troisième domaine de la sous-unité Tbp2.
16. 16. Un polypeptide selon la revendication 15, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon

    l'une des revendications l à 6, par délétion substantielle des deuxième et troisième

    domaines de la sous-unité Tbp2.
17. 17. Un polypeptide selon la revendication 16, qui correspond à l'extrémité N-terminale

    de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, allant de l'acide aminé dans l'une des

    positions 1 à 40, à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351.
18. 18. Un polypeptide selon la revendication 17, qui correspond à l'extrémité N-terminale

    de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, allant de l'acide aminé en position 1, à

    l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351.
19. 19. Une composition pharmaceutique qui comprend à titre de principe actif, une sous

    unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 7 ou un polypeptide selon l'une des

    revendications 8 à 18.
20. 20. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre une sous-unité

    Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité

    Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un ante sérum anti

    RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6.
21. 21. Une composition selon la revendication 20, dans laquelle la sous-unité Tbp2

    additionnelle comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie

    avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ

    No. 1, est de 90 à 100 %.
22. 22. Une composition selon la revendication 21, dans laquelle la sous-unité Tbp2

    additionnelle est la Tbp2 M982.
23. 23. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre un polypeptide

    capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 d'une souche

    de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions

    membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un

    ante sérum anti-RTH Bl6B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés

    localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.
24. 24. Une composition selon la revendication 23, dans laquelle le polypeptide dérive d'une

    sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en

    Western blot de fractions membranaires par un ante sérum anti-RTH M982 et n'est pas

    reconnue par un ante sérum anti-RTH Bl6B6, notamment par délétion substantielle

    des régions hypervariables du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous

    unité Tbp2.
25. 25. Une composition selon la revendication 23, dans laquelle le polypeptide dérive d'une

    sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en

    Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas

    reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion substantielle

    du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2.
26. 26. Une composition selon l'une des revendications 23 à 25, dans laquelle le polypeptide

    dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le

    degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que

    montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 90 à 100 %.
27. 27. Une composition selon la revendication 26, dans laquelle le polypeptide dérive de la

    Tbp2 M982.
28. 28. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre une sous-unité

    Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité

    Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum

    anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6.
29. 29. Une composition selon la revendication 28, dans laquelle la sous-unité Tbp2

    additionnelle comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie

    avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6, telle que montrée dans l'ID SEQ

    No. 2, est de 95 à 100 %.
30. 30. Une composition selon la revendication 29, dans laquelle la sous-unité Tbp2

    additionnelle est la Tbp2 B16B6.
31. 31. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre un polypeptide

    capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 de N.

    du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.

    anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés

    membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un ante sérum

    meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions
32. 32. Une composition selon la revendication 31, dans laquelle le polypeptide dérive d'une

    sous-unité Tbp2 de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en

    Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est

    reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion substantielle

    des deuxième et troisième domaines de la sous-unité Tbp2.
33. 33. Une composition selon l'une des revendications 30 à 32, dans laquelle le polypeptide

    dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le

    degré domologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6, telle que

    montrée dans l'ID SEQ No. 2, est de 95 à 100 %.
34. 34. Une composition selon la revendication 33, dans laquelle le polypeptide dérive de la

    Tbp2 B16B6.
35. 35. Une composition selon les revendications 20, 21, 22, 23, 24, 25,26 ou 27 et 28, 29,

    30, 31, 32,33 ou 34.
36. 36. Une composition selon la revendication 35, qui comprend:

    (i) un polypeptide selon l'une des revendications 9 à 14;

    (ii) un polypeptide tel que décrit dans la revendication 24 ou dans les revendications 24et26Ou27;et

    (iii) une sous-unité Tbp2 telle que décrite dans l'une des revendications 28 à 30.
37. 37. Un fragment d'ADN codant pour une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications

    1 à 6 ou pour un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 18.