JP5487463B2 - 非拡散植物ウイルスベクター - Google Patents
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Description
(1)キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有し、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
(2)キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムであって、上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有し、上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
(3)上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記(2)に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
(4)キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法であって、上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有し、上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
(5)上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記(4)に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
本発明は、キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とするものである。本発明において、キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子とは、ウイルスゲノムを隣接細胞に移行させるために、原形質連絡(高等植物の隣接細胞同士をつなげている細胞間橋)の排除分子量限界を拡大することのできる蛋白質(cell to cell movement protein)で、植物ウイルスゲノムにコードされる遺伝子として定義される。
(1)無秩序に宿主植物に感染し、意図せぬ組換えウイルスの拡散リスクを回避することができる非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
(2)ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能なため、意図せぬウイルスの拡散を回避できる新しい組換え植物のシステムを提供することができる。
(3)単独では、拡散、伝播できないが、細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を別に導入することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができる、非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
(4)野外等で使用しても、植物ウイルスベクターの拡散が起こらないため、植物ウイルスベクターの利用範囲が飛躍的に拡大する。
(5)本発明の植物ウイルスベクターを使用して組換え植物体を作出しても、ウイルスベクターの増殖、他の植物体への伝播は起きないことから、安全性を確保して、植物ウイルスベクターの利用を図ることが可能となる。
ベンタミアーナ(N.benthamiana)の育成を、以下の方法により行った。Jiffy−7(サカタのタネ)を吸水させた後、1ポットにつき2−3粒程度の種子を播種し、高温条件を保った。植物体の生育ステージをそろえるために、間引きを行い、植物体は、12時間明条件(8,000lux)、12時間暗条件で生育させ、気温28℃で育てた。その後は、植物体の成長に合わせて施肥した。
ClYVVベクターの増殖に用いるソラマメの育成には、培養土(三共)を用いた。4号鉢に土を入れ、十分に水を含ませ、種子を1粒播種した。出芽後、10日たった植物体を、接種に用いた。
接種には、播種後3−4週間ほど経過し、本葉が3−5枚展開したベンタミアーナ個体を使用した。接種源には、モザイクや縮葉などのウイルス病徴が見られる植物体の上葉の粗汁液、あるいは逆転写RNAを使用した。接種ステージに達した植物において、接種する葉全体にカーボランダム(Nacalai−メッシュ600−乾熱済み)を薄くふりかけた。ウイルス接種用粗汁液は、0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)1mlに、DIECA(N,Nジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム(Wako)、接種直前に添加)を終濃度10mMになるように加えて、接種源となる感染葉0.1gとともに、乳鉢で磨砕して調製した。
下記のSOB液体培地2mlに、大腸菌(Escherichia coli)JM109株(TaKaRa)を入れ、37℃で12〜14時間振盪培養した。SOB液体培地50mlに、前培養液を0.5ml接種し、37℃で約1時間半(OD550=0.4〜0.8)振盪培養した。氷上に10分間静置した後、チューブに移し、3500rpm、4℃、10分遠心した後、上清を捨て、氷冷した下記のTFB17mlで穏やかに懸濁した。
緩やかに溶かしたコンピテントセル100μlに、プラスミド1μl(ライゲーション反応液の場合5μl程度)を加え、氷上で30分間静置して混合した。42℃のウォーターバスに45秒間入れ、ヒートショックを行った後、直ちに氷冷し、大腸菌内に組換えプラスミドを導入した。下記の2YT液体培地を加え、37℃で30分間静置培養した。その後、37℃で1時間振盪培養を行った。このうち、100μlを、下記のLB−amp培地に広げた。
濃度50mg/mlアンピシリンストック2μlを加えた2YT液体培地2mlの中に、形質転換によって得られた大腸菌のコロニーを、滅菌済み爪楊枝で、拾い入れ、37℃で12〜14時間振盪培養した。この培養液を1.5mlチューブに入れ、10000rpmで3分間遠心した。アスピレーターで、上清を取り除き、下記のSolution−1を100μlずつ加え、チューブミキサーで完全に懸濁した。これに、下記にSolution−2を200μlずつ加え、転倒混和した。
25mM Tris(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(Wako)−HCl(pH8.0)、10mM EDTA(エチレンジアミン−N,N,N’,N’−テトラアセティックアシッド/同仁化学)、50mMグルコース(Wako)
0.2N NaOH(Wako)、1% SDS(ラウリル硫酸ナトリウム−Nacalai)
5M 酢酸カリウム溶液60ml、酢酸11.5ml、蒸留水28.5ml
20%PEG#6000(ポリエチレングリコール−Nacalai)、2.5M NaCl
1)制限酵素処理
各メーカーの制限酵素0.5μlと、その添付バッファーを使用し、10μlの反応系で、指定の温度下において、1時間以上静置した。
2)電気泳動
目的のDNAの長さに適した濃度のTBE(89mM Tris−base、89mMホウ酸(Wako)、2mM EDTA)アガロース(Gene pure(登録商標)LE AGAROSE−BM)ゲルを用い、TBEを泳動緩衝液として、泳動を行なった。泳動後、エチジウムブロマイド溶液(終濃度0.5μg/ml)で染色した。
サンプルDNA液に滅菌水を加え、100μlにし、50μlのTE飽和フェノール(ニッポンジーン)と、50μlのクロロホルム(Wako)を加え、チューブミキサーにかけて、1分撹拌して、タンパクを失活させた。14000rpmで、5分間遠心し、1.5mlチューブに水層だけを移した。
サンプルDNA液100μlに、3M酢酸ナトリウム(ニッポンジーン)10μl、100%エタノール250μlを加えて、撹拌して、14000rpmで、10分間遠心し、上清を取り除いた。500μlの80%エタノールを加え、14000rpmで、5分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。
ゲルからDNAを回収する場合、SeaKem(登録商標)GTC(登録商標)agarose(BMA)を使い、直接、EtBrを終濃度0.5μg/mlで入れたアガロースゲルを使用し、電気泳動を行った。目的のバンドを含むゲル片を切り出し、QIAEX(登録商標)II Gel Extraction kit 150(QIAGEN)でDNAを回収した。
アルカリ−SDS法で抽出した感染性クローン4μlを、run−off転写に用いる制限酵素で線状化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、得られたペレットを3.5μlの滅菌水に懸濁した。転写反応液を、以下のように混合した。
テンプレート溶液 3.5μl
50mM DTT 2μl
0.1% BSA 2μl
10×T7 RNA polymerase Buffer*11 2μl
2.5×Cap/NTP mix*12 8μl
RNase inhibitor*13 0.5μl
T7 RNA polymerase 2μl
*12・・・2.5×Cap/NTP mix(5mM m7 G(5’)ppp (5’) G RNA Capping Analog(Invitrogen)、3.8mM ATP、3.8mM CTP、3.8mM UTP、0.8mM GTP−Roche)
*13・・・Ribonuclease Inhibitor,recombinant,soln(Wako)
(フェノール−SDS法)
RNA抽出バッファー500μlと、TE飽和フェノール500μlで、試料0.1gを磨砕して、1.5mlチューブに移した。20秒ほど、ボルテックスミキサーにかけ、14000rpmで、5分間冷却遠心した。上清(水層)を別のチューブに移し、上清と等量のフェノールクロロホルム(1:1)を加え、ボルテックスミキサーにかけて、激しく撹拌した後、14000rpmで、5分間冷却遠心した。上清を別のチューブに移し、白いタンパクの層がなくなるまで繰り返し、フェノールクロロホルム抽出を行った。最後に、等量のクロロホルムでリンスした後、水層をとりわけ、1/10量の3M酢酸ナトリウム、3倍量の100%エタノールを加えた。
1)逆転写反応
以下に示す反応溶液を調製した。
RNase Free dH2 O*15 7.5μl
25mM MgCl2 *15 4μl
each 10mM dNTP Mixture*15 2μl
10×RNA PCR Buffer*15 2μl
RNase Inhibitor 0.5μl
3’プライマー 1μl
サンプルRNA 2μl
AMV Reverse Transcriptase XL(TaKaRa
)0.5μl
*15・・・RNA PCRTM kit(AMV)Ver.2.1(TaKaR
a)に添付
以下のようなPCRミックスを調製した。
滅菌水 8.4μl
25mM MgCl2 *16 2μl
10×LA PCRTM BufferII(Mg2+free)*16 2μl
each 10mM dNTP Mixture 2μl
5’プライマー 0.2μl
3’プライマー 0.2μl
*16・・・TaKaRa LA TaqTMに添付
プラスミドを鋳型に配列を確認する際には、アルカリ−SDS法で抽出したサンプル100ngをシークエンス反応に用いた。また、ダイレクトシークエンスの際には、ゲル片から回収した目的のDNA10ngを、シークエンス反応に用いた。テンプレートDNAに、プライマー1pmol、BigDye(登録商標)Terminator v1.1 Cycle sequencing kit(Applied Biosystems)を1.3μl、添付のバッファーを3.4μl加え、蒸留水で20μlとしたサンプルをシークエンス反応液とし、下の条件でPCRをかけた。
96℃ 10秒
50℃ 5秒
60℃ 4分 (96℃ 10秒 → 60℃ 4分:30サイクル)
10℃ ∞
ろ紙を2枚平滑な面を上にし、その上に葉を置き、更に、平滑な面が葉側になるように、2枚ろ紙を重ね、ハンマーで叩き、葉の内容物をろ紙にブロットした。ろ紙が乾燥してから、プラスチック容器中に2%TritonX−100を加えて、30分間室温で振とうして、クロロフィルなどの色素を落とし、その後、PBST−スキムミルク液(10mM NaPO4(pH7.2)、0.9% NaCl、0.1% Tween20、3%スキムミルク)を加えて、室温で30分間振とうすることで、ブロッキング処理を施した。
葉重量の5倍量のPBS(10mM NaPO4(pH7.2)、0.9% NaCl)で磨砕し、12000rpmで、5分間遠心し、上清を、別のチューブに分注して、下記の2×サンプルバッファーを、等量加えた。これを、5分間95℃で、変性した後、5分間、室温で放置したサンプルを、泳動に用いた。泳動には、コンパクトPAGE(アトー株式会社)を用いた。下記の10×ランニングバッファー10mlに、蒸留水を90ml加えたものを、泳動バッファーとして用いた。
3a遺伝子を欠くベクター(3a−Stop)を作出するために、pCY3の3aタンパク質の4番目のアミノ酸グルタミンをコードするCAAコドンを、終止コドンであるTAAコドンに置換した。図1に、導入のプロセスを示す。pCY3を鋳型として、Y3−T7−5Bmプライマーと3a−Stop−3プライマー、3a−Stop−5プライマーとY3−3Hindプライマーで、それぞれ、PCR反応を行った。
C2−H1ベクター(Planta vol.225 277−286,2007)のStuIサイトとMluI領域に、DHFRの配列を挿入した。図2に、C2−H1ベクターへの外来遺伝子(DHFR)の導入のプロセスを示す。PROTEIOS Plamid set(東洋紡)のpEU−DHFRを鋳型として、DHFR5プライマーと、DHFR−3Flgプライマーを用いて、PCRすることで、DHFRの3‘末端に、FLAGタグとMluIサイトを有するDHFR遺伝子が得られる。これを、MluIで処理し、C2−H1ベクターのStuIサイトとMluIサイトへ、クローニングした。
C2−H1ベクターのStuIサイトとMluI領域に、DxscFvの配列を挿入した。図3に、CMV−Y RNA2への外来遺伝子(DxscFv)の導入のプロセスを示す。pBE2113−DxscFvをテンプレートとして、PCRを行い、DxscFv ORFの5′にStuIサイトを、3′にMluIサイトを付加した。次に、C2−H1ベクターのStuI−MluI領域に、DxscFv断片をクローニングし、H1:DxscFvを構築した。
PVXベクター(Plant J vol.7 1045−1053,1995)のClaIサイトとSalIサイト領域に、CMV−Y由来の3aタンパク質配列を挿入した。pCY3を鋳型に、Y3a−5ClプライマーGCATCGATATGGCTTTCCAAGGTACCAGと、Y3a−3XhプライマーCCGCTCGAGCTAAAGACCGTTAACCACCTでPCRすることで、ClaIとXhoIサイトを有する3a遺伝子断片を得た。
植物発現用ベクターであるpBE2113(plant cell physiology vol.37 49−59, 1996)のXbaIサイトとSacI領域にCMV−Y3a由来の3aタンパク質配列を挿入した。図6に、pBE2113への細胞間移行タンパク質(3a)の導入のプロセスを示す。
上記で得た3a形質転換植物体のT1種子を、滅菌水で給水し、4日間4℃で低温処理を行った後、0.02%TritonX−100を添加した1.5%の次亜塩素酸ナトリウム溶液で、5分間、種子表面を滅菌した後、125mg/mlカナマイシンを含む1/2MS培地〔1%蔗糖、B5ビタミン、1%寒天を含む(pH5.7)〕に無菌播種を行い、22℃で7−10日間培養後、カナマイシン耐性を示す芽生えを選抜して、Jiffy−7に移植し、閉鎖系組換え温室の中で栽培した。
プラスミドH1:DxscFvを鋳型にin vitro転写し、pCY1、pCY3あるいは3a−StopのRNA転写産物とともに、野生型ベンタミアーナあるいは3aトランスジェニックベンタミアーナに接種し、接種5日後の接種葉及び13日後の接種葉及び上葉のDxscFv発現をウエスタンブロット法を用いて検出した。図7に、Y1/H1:DxscFv/Y3(RNA転写産物)、又はY1/H1:DxscFv/3a−stop(RNA転写産物)の接種における野生型ベンタミアーナ及び3a形質転換ベンタミアーナでのDxscFv検出結果を示す。
接種後5日目の接種葉及び13日目の接種葉及び上葉のDxscFvの発現を、ウエスタンブロット法で検出した結果、Y1/H1:DxscFv/3a−stop(RNA転写産物)を接種した3a形質転換体において、接種葉では、わずかに発現が認められ、上葉では、非常に高い発現量のDxscFvが検出された。
Claims (5)
- キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有し、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
- キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターの上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムであって、
上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有するベクターであり、
上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。 - 上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項2に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。
- キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法であって、
上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有するベクターであり、
上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。 - 上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項4に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
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