JP4009663B2 - 植物ウイルスベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ＲＮＡウイルスベクターに関するものであり、更に詳しくは、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つキュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus, CMV) のＲＮＡ２分子を改変した新規植物ウイルスベクター、及び植物における遺伝子発現方法に関するものである。
本発明は、植物の遺伝子操作及び遺伝子発現方法の分野において、約１０００種類以上の植物を宿主として、これらの植物においてベクターとして利用することが可能であって、外来遺伝子を安定的に発現することができる新規植物ＲＮＡウイルスベクター、及び植物における新しい遺伝子発現方法を提供するものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物ＲＮＡウイルスベクターの研究は、感染植物における増殖能が非常に高いタバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus, TMV) とブロモモザイクウイルス(Bromo mosaic virus, BMV) の感染性クローンを用いて行われてきた。
そして、この分野では、ウイルス遺伝子の発現様式の違いなどから、今までに、いくつかの外来遺伝子の発現方式が開発されている。ここで、それらを紹介すると、例えば、ＴＭＶやポティウイルス属(Potyvirus) では、ウイルスCP遺伝子と外来遺伝子が融合したタンパク質を発現するベクターが開発されている（非特許文献１〜２参照）。また、ＴＭＶと近縁のウイルス(Odontoglossum ringspot virus)のサブゲノミックプロモーターを導入することにより、サブゲノムを介して外来遺伝子を発現させるベクターも開発されている（非特許文献３参照）。
【０００３】
ただ、これまでは、このようなウイルスベクターの開発には、主にＴＭＶやポティウイルス属に代表される、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。それは、棒状、ひも状のウイルスべクターは、球状ウイルスに比べ、挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点があるからである。一方、球状ウイルスであるＢＭＶにおける発現ベクターの系としては、１ａタンパク質、２ａタンパク質の複製酵素遺伝子を発現するタバコに、外来遺伝子をもつＲＮＡ３を接種するという方法が報告されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
また、ＣＭＶにおいても、ウイルスベクターについて、いくつかの研究がなされている。その一つは、complementation による４分節ＣＭＶベクターの開発である（非特許文献５参照）。ＣＭＶのＲＮＡ３にはＭＰとＣＰがコードされており、ウイルスの細胞間移行にはＭＰとＣＰの両方が必須である（非特許文献５参照）。そこで、これまでに、本発明者らは、ＲＮＡ３分子を改変し、ＭＰ領域をＧＦＰ遺伝子に置換したＲＮＡ３ＡとＣＰ遺伝子をもたないＲＮＡ３Ｂを構築し、complementation により細胞間移行するウイルスベクターを開発した。これを、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つＣＭＶとして、ベンタミアーナに接種したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ ｖｅｉｎでＧＦＰ蛍光が観察された。また、ＲＮＡ３Ｂで欠失させたＣＰ領域にマルチクローニングサイトを挿入し、そこに、ＧＵＳ（bacterial-β-glucuronidase）遺伝子やＢＹＭＶ(Bean yellow mosaic virus)のCP遺伝子を導入したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ ｖｅｉｎにおいてＧＵＳ活性やＢＹＭＶ−ＣＰが検出された。しかし、このＲＮＡ３Ａ、ＲＮＡ３Ｂが互いにｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＲＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを起こし、上葉では導入遺伝子の発現は見られなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
Sugiyama,Y.,Hamamoto,H.,Takemoto,S.,Watanabe,Y.and Okada,Y., Systemic production of foreign peptides on the particle surface of Tobacco mosaic virus, FEBS Letters 359,247-250 (1995)
【非特許文献２】
Fernandez-Fernandez,M.R.,Martinez-Torrecuadrada,J.L.,Casal,J.I.and Garcia,J.A., Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus, FEBS Letters 427,229-235 (1998)
【非特許文献３】
Donson et al., Systemic expression of a bacterial gene by a tabacco mosaic virus-based vector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7204-7208 (1991)
【非特許文献４】
Mori,M.,Kaido,M.,Okuno,T.and Furusawa,I., mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plants, FEBS Lett.336,171-174 (1993)
【非特許文献５】
Zhao,Y,,Hammond,J.Tousignant,M.E.and Hammond,R.W., Development and evaluation of a complementation-dependent gene delivery system based on Cucumber mosaic virus, Archives of Virology 145,2285-2295 (2000)
【非特許文献６】
Canto,T.,Prior,D.A.,Hellward K.H.,Oparka,K.J.,Palukaitis,P., Characterization of cucumber mosaic virus.IV.Movement protein and coat protein are both essential for cell-to-cell movement of cucumber mosaic virus, Virology 237,237-248 (1997)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来、ＣＭＶのウイルスベクターについては、いくつかの研究例があるが、現在までのＣＭＶベクターの開発では、ＲＮＡ３に外来遺伝子を導入する方法がとられており、いずれも、接種上葉での増殖が認められない等の問題があり、その改善が強く求められていた。このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、新たなウイルスベクターの開発を目的として、ＣＭＶのＲＮＡ２分子への外来遺伝子ＧＦＰの導入を試みた結果、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクターの開発に成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、接種植物体において全身感染を示し、安定的に外来遺伝子を発現する機能を有する新規ＣＭＶベクターを提供することを目的とするものである。
また、本発明は、約１０００種類以上の植物を宿主として、これらの植物におけるベクターとして好適に利用し得る新しい植物ウイルスベクターを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、導入された外来遺伝子を安定的に発現させることができるＣＭＶベクター、及び該ベクターを利用した新しい植物遺伝子発現方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus,
CMV) のＲＮＡ２分子の２ｂ領域の一部を欠失させ、この２ｂ領域の欠失部分に外来遺伝子導入サイトを挿入した植物ウイルスベクターであって、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦのＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたことを特徴とする、植物ウイルスベクター。
（２）２ｂ ＯＲＦの８番目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入したことを特徴とする、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（３）ｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に、ＳｔｕＩ−ｓｔｏｐ−ＭｌｕＩ−ＳｎａＢＩを含む領域を導入したことを特徴とする、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（４）前記（３）に記載の植物ウイルスベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域に、外来遺伝子を挿入したことを特徴とする遺伝子組み換え体。
（５）前記（４）に記載の遺伝子組み換え体を使用して外来遺伝子を植物に導入し、安定的に外来遺伝子を発現させることを特徴とする植物における遺伝子発現方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic
virus, CMV) のＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムのＲＮＡ２分子の２ｂ領域の一部を欠失させ、この２ｂの一部を欠失させた部分に外来遺伝子導入サイトを挿入した新規ＣＭＶベクターに係るものである。本発明の植物ウイルスベクターとしては、後記する実施例に詳細に示されるように、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ内のＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたプラスミド（ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕと命名）が例示される。そして、その作出方法としては、具体的には、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ直後の３′末端非翻訳領域を、後記する実施例に記載のプライマーＹ２ｂ−Ｓｔｕと３′末端のプライマーＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０でＰＣＲをかけ、ｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に、ＳｔｕＩ−ｓｔｏｐ−ＭｌｕＩ−ＳｎａＢＩを含む領域を導入する方法が例示される。
【０００９】
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２には、ウイルスの複数酵素複合体の一部である２のタンパク質とオーバーラップした形で２ｂタンパク質がコードされている。そのため、ＣＭＶ−Ｙ２ｂタンパク質の非発現ウイルスを作出するために、２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する。２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する際には、２ａタンパク質のアミノ酸置換が起こらないようにする必要がある。この条件をクリアーするために、例えば、２ｂ ＯＲＦの８塩基目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入する方法が例示される。
【００１０】
具体的には、ポイントミューテーションを導入する配列において、後記する実施例に記載のセンス及びアンチセンスのプライマーを作成し、それぞれ３′、５′のプライマーとともにＰＣＲをかけて増幅し、それぞれのバンドを切り出して混合し、それをテンプレートとして、例えば、後記する実施例に記載の５′及び３′のプライマーでＰＣＲをかけ、そのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＢｌｎＩで切断し、この断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ領域にクローニングする。ｐＵＣ１１９−ポイントミューテーションからＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域を切り出し、ｐＣＹ２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域に導入て、２ｂ ＯＲＦにストップコドンになる点変異を導入したｐＣＹ２−２ｂ ｓｔｏｐを構築する。
【００１１】
これらの方法により、ＣＭＶ−Ｙ２ｂタンパク質のＣ末端欠失ウイルスベクターであって、同タンパク質の非発現ウイルスベクターを作出することができる。この改変ベクターは、植物への接種試験を行った結果、後記する実施例に示されるように、全身感染を示したが、ＣＭＶ−Ｙワイルドタイプに比べて、病徴の進行は遅いことが確認された。本発明では、上記ＣＭＶ−Ｙ改変ウイルスベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域に外来遺伝子を導入し、これを植物体に感染させることで、植物において、外来遺伝子を安定的に発現させることができる。
【００１２】
本発明のＣＭＶベクターは、例えば、green fluorescent protein （ＧＦＰ）を組み込んだＰＣＹ２−ＧＦＰからのＲＮＡ転写産物接種第一代では安定的にＧＦＰを発現させることができる。おそらく、ＲＮＡ２分子に直接外来遺伝子を導入しているため、前記４分節ＣＭＶベクターでみられたような分節間でのintermolecular recombinationを起こさなかったことが、ベンタミアーナ上葉でＧＦＰ発現に成功した要因であると考えられる。ＣＭＶ−Ｙの代わりに、ＳＳＶ（Soybean stunt virus, ダイズ萎縮ウイルス−ＣＭＶの１系統）のＲＮＡを使用した場合においても、ベンタミアーナ上葉でＧＦＰの発現が見られたことから、ダイズへの応用も十分に期待される。
【００１３】
本発明のシステムにおいては、このテンプレートスイッチを起こさないために、例えば、ＧＦＰのアミノ酸を変えずに塩基を変えること、又はＣＭＶ−Ｙの３′末端の配列を他のＣＭＶ系統、例えば、ＳＳＶやＨＬ−ＣＭＶ（ユリ系統）の３′末端に改変することなどの工夫を付加することができる。本発明のベクターとしては、好適には、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２ ３０５１塩基において、２ｂの３′末端７１塩基を欠失させたｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ（２９８０塩基）が例示されるが、これに制限されるものではない。
【００１４】
以上のように、従来、ＲＮＡウイルスベクターの開発は、タバコモザイクウイルスに代表されるように、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。棒状、ひも状のウイルスベクターは、球状ウイルスに比べ挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点がある。一方、本発明で用いたような球状ウイルスでは、その粒子形態からウイルスベクターとしての利用が困難であり、僅かにcomplementation による４分節ＣＭＶベクターの開発やＲＮＡ３に外来遺伝子を導入する方法をとられてきたが、いずれも接種上葉での増殖が認められない等の問題があった。そこで、本発明では、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクターを開発した。ＣＭＶとしては、ＣＭＶ−Ｙ、ＣＭＶ−Ｏ、ＣＭＶ−Ｌ、ＳＳＶ、ｍ２−ＣＭＶに代表されるＣＭＶサブグループ１及び２に属するＣＭＶ分離株が利用可能である。
【００１５】
本発明では、当該ＣＭＶベクターに、例えば、外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を用い、宿主植物にNicotiana benthamiana を用いて機能特性を解析した結果、接種植物体において全身感染を示し、安定的にＧＦＰを発現させることが確認できたが、本発明は、これらに制限されるものではなく、例えば、トマト、タバコ、ホウレンソウ、ダイズ、キュウリ、ジャガイモ等の植物に代表される適宜の植物及び約１０００ｂｐ程度までの外来遺伝子に適用可能である。本発明は、約１０００種類以上の植物を宿主とし、これらの植物においてベクターとして利用可能で、安定的に外来遺伝子を発現することが可能な新規ＣＭＶベクターを提供するものとして有用である。また、このベクターは、ＲＮＡ２を改変したため、従来のＣＭＶでは観察されないサイレンシングを誘導することも可能であり、新規の特性を有するものとして有用である。
【００１６】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
（１）供試ウイルス
供試ウイルスとして、ＣＭＶの１系統のＣＭＶ−Ｙを使用し、北海道大学大学院農学研究科附属世代短縮温室（気温２０〜３０℃、札幌自然日長）において、ベンタミアーナ(Nicotiana benthamiana）、もしくはタバコ(N. tabacum)で継代した。
【００１７】
（２）供試植物の育成
ベンタミアーナ及びタバコの育成を、以下の方法により行った。
４号鉢に播種用土( タキイソイル（タキイ種苗）シャベル４杯、三共培養土（三共）４杯、黒土１杯）を入れ、その上に一握りのバーミキュライト（昭和バーミキュライト株式会社・オートクレーブ済）を乗せ、十分に水を含ませ、種子を４０粒程度播種した。ときどき、間引きをすることで植物体の生育ステージをそろえるようにして、北海道大学大学院農学研究科附属恒温恒湿温室（気温２８℃、日照時間１６時間）で育てた。２〜３ｃｍ程度に生育したところで、移植用土（タキイソイル２杯、三共培養土３杯、黒土１杯、腐葉土（札幌イセキ販売）１杯）に２本ずつ移植した。移植後１週間は新聞紙をかぶせ日光を遮り、その後は植物体の成長に合わせて施肥した。
【００１８】
（３）接種試験
ベンタミアーナやタバコは、移植後１〜２週間ほど経過し、本葉が３〜５枚展開した個体がウイルスに対しての感受性が高く、接種に最も適している。
接種源としては、モザイクや縮葉などのウイルス病徴が見られるベンタミアーナの上葉を用いた。接種ステージに達した植物において接種する葉全体にカーボランダム（Ｎａｃａｌａｉ−メッシュ６００−乾熱済み）を薄くふりかけた。下記の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）１ｍｌに、ＤＩＥＣＡ（Ｎ，Ｎジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）、接種直前に添加）を終濃度１０ｍＭになるように加えて接種源となる感染葉０．１ｇとともに乳鉢で磨砕した。指サックに磨砕粗汁液をつけ、葉の表面に軽くなでるように塗布した。接種後すぐ水をかけて葉面から粗汁液とカーボランダムを洗い流し、翌日まで新聞紙で覆いをして遮光した。
０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．１）は、０．２Ｍリン酸一ナトリウム溶液（Ｎａｃａｌａｉ）３３ｍｌ、０．２Ｍリン酸二ナトリウム溶液（Ｎａｃａｌａｉ）６７ｍｌを混合し、ｐＨ７．１に調製し、蒸留水でメスアップ、オートクレーブして２００ｍｌとした。
【００１９】
（４）コンピテントセルの調製
下記のＳＯＢ液体培地２ｍｌに大腸菌(Escherichia coli)ＪＭ１０９株(TaKaRa)を入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。ＳＯＢ液体培地５０ｍｌに前培養液を０．５ｍｌ接種し、３７℃で約１時間半（ＯＤ550 ＝０．４〜０．８）振盪培養した。氷上に１０分間静置した後ナルゲンチューブに移し、３５００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心した。上清を捨て、氷冷した下記のＴＦＢ１７ｍｌで穏やかに懸濁した。氷上で２０分間静置した後、再び３５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。上清を捨て、氷冷したＴＦＢ２ｍｌを加え、液面で沈殿を穏やかに懸濁した。氷上で３０分間静置した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド−Ｎａｃａｌａｉ）１５０μｌを一滴ずつゆっくり加え、再度氷上で１０分間静置した。先を切ったチップでエッペンドルフチューブに１００μｌずつ分注し、−８０℃で保存した。
【００２０】
ＳＯＢ液体培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０ｇ：ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｇ：１Ｍ ＮａＣｌ溶液１０ｍｌ、１Ｍ ＫＣｌ溶液２．５ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップし、１Ｌとした後、オートクレーブし、使用前に濾過滅菌した１Ｍ ＭｇＣｌ2 溶液（Ｎａｃａｌａｉ）と１Ｍ ＭｇＳＯ4 溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を１／１００量加えて調製した。
また、ＴＦＢ（形質転換緩衝液）は、３５ｍＭ酢酸カリウム（Ｎａｃａｌａｉ）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 （Ｗａｋｏ）、４５ｍＭ ＭｎＣｌ2 （Ｎａｃａｌａｉ）、１００ｍＭ ＲｂＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ）、１５％ ショ糖（Ｗａｋｏ）−酢酸（Ｗａｋｏ）の組成でｐＨ５．８に調整し、濾過滅菌して調製した。
【００２１】
（５）形質転換
緩やかに溶かしたコンピテントセル１００μｌにプラスミド１μｌ（ライゲーション反応液の場合５μｌ程度）を加え、氷上で３０分間静置して自然な拡散で混合させた。４２℃のウォーターバスに４５秒間入れ、すぐに氷冷し、大腸菌内にプラスミドを導入させた。下記の２ＹＴ液体培地０．９ｍｌをチューブの壁につたわらせながら加え、３７℃で３０分間静置培養した。その後、３７℃で３０分間振盪培養した。このうち１００μｌを下記のＬＢ−ａｍｐ培地に広げた。ブルーホワイトセレクションをする場合には、あらかじめ２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｗａｋｏ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎａｃａｌａｉ）で２％濃度に溶解）５０μｌ、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド溶液（Ｗａｋｏ）−濾過滅菌）１０μｌをＬＢ培地上に塗布した後、大腸菌培養液１００μｌを広げた。１２〜１６時間、３７℃のインキュベーターで逆向きに培養した。
【００２２】
２ＹＴ液体培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ、ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとし、オートクレーブして調製した。
また、ＬＢ−ａｍｐ培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、Ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）１５ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとした後、オートクレーブし、５０℃ぐらいに冷ましてから５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック（Ｗａｋｏ−濾過滅菌済み）を１／１０００量加え、固まる前に滅菌シャーレに分注して調製した。
【００２３】
（６）プラスミド抽出
濃度５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック２μｌを加えた２ＹＴ液体培地２ｍｌの中に、形質転換によって得られた大腸菌のコロニーを滅菌済み爪楊枝で拾い入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。この培養液を１．５ｍｌチューブに入れ、１００００ｒｐｍで１分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−１を２００μｌずつ加え、チューブミキサーで完全に懸濁した。これに、下記にＳｏｌｕｔｉｏｎ−２を２００μｌずつ加え、転倒混和した。次に、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−３を２００μｌずつ加え、再び転倒混和した。これを１４０００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心し、上清をとってチューブに移し、もう一度遠心（１４０００ｒｐｍ ５分間）にかけ、タンパクを完全に除去した。上清を移し、回収した上清と同量のイソプロピルアルコール（Ｗａｋｏ）を加え、転倒混和した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ）を５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨てた。ＲＮａｓｅＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で終濃度２μｇ／ｍｌに希釈して１００μｌずつ加え、軽くミキサーにかけ、３７℃で３０分間静置した。これに、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−４を６０μｌ加え、ボルテックスミキサーで撹拌して、氷上で４５分間静置した。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノールを５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ ５分間遠心した。上清を捨て、５〜１０分間減圧乾燥し、滅菌水３０μｌで懸濁した。このプラスミドサンプルは−３０℃で保存した。
【００２４】
ａ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−１：
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｗａｋｏ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセティックアシッド／同仁化学）、５０ｍＭグルコース（Ｗａｋｏ）
ｂ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−２：
０．２Ｎ ＮａＯＨ（Ｗａｋｏ）、１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム−Ｎａｃａｌａｉ）
ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−３：
５Ｍ 酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ
ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−４：
２０％ＰＥＧ＃６０００（ポリエチレングリコール−Ｎａｃａｌａｉ）、２．５Ｍ ＮａＣｌ
【００２５】
（７）基本的な遺伝子操作の方法
１）制限酵素処理
各メーカーの制限酵素０．５μｌとその添付バッファーを使用し、２０μｌの反応系で指定の温度下において１時間以上静置した。
２）電気泳動
目的のＤＮＡの長さに適した濃度のＴＢＥ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、８９ｍＭホウ酸（Ｗａｋｏ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）アガロース（Ｇｅｎｅ ｐｕｒｅ（登録商標）ＬＥ ＡＧＡＲＯＳＥ−ＢＭ）ゲルを用い、ＴＢＥを泳動緩衝液として泳動を行なった。泳動後、エチジウムブロマイド溶液（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で染色した。
【００２６】
３）フェノールクロロホルム抽出
サンプルＤＮＡ液に滅菌水を加え１００μｌにし、５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ニッポンジーン）と５０μｌのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を加え、チューブミキサーにかけて１〜２分撹拌してタンパクを失活させた。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、１．５ｍｌチューブに水層だけを移した。クロロホルムを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍ５分間遠心した。１．５ｍｌチューブに水層だけをとりわけた。
【００２７】
４）エタノール沈殿
サンプルＤＮＡ液１００μｌに３Ｍ酢酸ナトリウム（ニッポンジーン）１０μｌ、１００％エタノール３３０μｌ、エタチンメート（ニッポンジーン）１μｌを加えて撹拌して、１４０００ｒｐｍ１０分間遠心し、上清を取り除いた。５００μｌの８０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍ２〜３分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。
【００２８】
５）クローニング
ゲルからＤＮＡを回収する場合、ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＣ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）を使い、直接ＥｔＢｒを終濃度０．５μｇ／ｍｌで入れたアガロースゲルを使用し電気泳動を行った。目的のバンドを含むゲル片を切り出しＱＩＡＥＸ（登録商標）II Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ １５０（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ溶液をフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿した後、５μｌの滅菌水に懸濁した。ベクターとインサートのライゲーションには、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）を使用した。回収したＤＮＡ溶液と等量のＶｅｒ．２−Ｉ液を加えて懸濁した。１６℃で３０分間静置した後、ライゲーション反応液半量をＥ．ｃｏｌｉのコンピテントセルに形質転換した。
【００２９】
（８）感染性クローンのin vitro 転写
アルカリ−ＳＤＳ法で抽出した感染性クローン４μｌをｒｕｎ−ｏｆｆ転写に用いる制限酵素で線状化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、得られたペレットを９μｌの滅菌水に懸濁した。転写反応液を以下のように混合した。
【００３０】
（転写反応液）
テンプレート溶液 ９μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ ５μｌ
１０×Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ*11 ２μｌ
１０ｍＭ ｍ7 Ｇ（５’）ｐｐｐ （５’） Ｇ ＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２μｌ
２０×ＮＴＰ 混合液*12 １μｌ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ*13 ０．５μｌ
Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ
＊１１・・・Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付
＊１２・・・２０×ＮＴＰ（１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、０．１ｍＭ ＧＴＰ−Ｒｏｃｈｅ）
＊１３・・・Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｓｏｌｎ（Ｗａｋｏ）
【００３１】
３７℃で１時間静置した。Ｔ７ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌを転写反応液に再び加えて、更に３７℃で１時間静置した。すぐに接種しない場合、転写産物は−８０℃で保存した。転写産物（ＲＮＡ１・２・３）をそれぞれ１５μｌずつと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）３０μｌを混合した。ベンタミアーナ１本あたり１２．５μｌずつの転写接種液を、通常のウイルス接種と同様に、カーボランダムと指サックで接種した。
【００３２】
（９）ＲＮＡ抽出
（フェノール−ＳＤＳ法）
ＲＮＡ抽出バッファー５００μｌとＴＥ飽和フェノール５００μｌで試料（又はプロトプラスト）０．１ｇを磨砕して、１．５ｍｌチューブに移した。２０秒ほどボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清（水層）を別のチューブに移し、上清と等量のフェノールクロロホルム（１：１）を加え、ボルテックスミキサーにかけて激しく撹拌した後、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清を別のチューブに移し、白いタンパクの層がなくなるまでくりかえし、フェノールクロロホルム抽出を行った。最後に等量のクロロホルムでリンスした後、水層をとりわけ、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、３倍量の１００％エタノールを加えた。ボルテックスをかけ、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清を捨て、８０％エタノール５００μｌを加え、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。５〜１０分間減圧乾燥後、ＲＮＡ用滅菌水５０μｌ（プロトプラストの場合１０μｌ）で懸濁し、１４０００ｒｐｍで１分間ほど遠心した。沈殿があった場合は、上清だけを別のチューブに移しかえた。ＲＮＡ抽出バッファーは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ、１％ ＳＤＳの組成である。
【００３３】
（１０）ＲＴ−ＰＣＲ
１）逆転写反応
以下に示す反応溶液を調製した。
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2 Ｏ*15 ７．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 *15 ４μｌ
ｅａｃｈ １０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ*15 ２μｌ
１０×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ*15 ２μｌ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μｌ
３’プライマー １μｌ
サンプルＲＮＡ ２μｌ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＴａＫａＲａ） ０．５μｌ
＊１５・・・ＲＮＡ ＰＣＲTM ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ）に添付
これを、４５℃で１時間静置した。その後、逆転写酵素を不活性化するため、これを、５分間ボイルし、５分間急冷した。
【００３４】
２）ＰＣＲ反応
以下のようなＰＣＲミックスを調製した。
滅菌水 ６３．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 *16 ６μｌ
１０×ＬＡ ＰＣＲTM ＢｕｆｆｅｒII（Ｍｇ2+ｆｒｅｅ）*16 ８μｌ
５’プライマー １μｌ
３’プライマー １μｌ
＊１６・・・ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTMに添付
これに、逆転写反応液２０μｌを加え、更に、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTM０．５μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、目的の断片が増幅されているのを確認した。
【００３５】
（１１）シークエンス
アルカリ−ＳＤＳ法で抽出したサンプル１μｌに蒸留水１．５μｌを加え、テンプレートＤＮＡ溶液とした。Ｍ１３プライマー（ＩＲＤ８００ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ−Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）／ＩＲＤ８００，Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ／ＩＲＤ８００−日清紡）０．２５μｌにＡＣＧＴ各基質溶液(Thermo sequence fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP(amersham pharmacia))を加え、４種類のプライマー基質混合溶液とした。８連ＰＣＲチューブにテンプレートＤＮＡ溶液２．５μｌ、プライマー基質混合溶液１．２５μｌを分注し、下の条件でＰＣＲをかけた。
【００３６】
（ＰＣＲの条件）
９５℃ ５分 １サイクル
９５℃ ３０秒
５０℃ ３０秒 ３０サイクル
７０℃ １分
１０℃ ∞
【００３７】
ＰＣＲ反応後、２μｌのloading dye fluorescent samples-Stop solution (Amersham)を加えた。シークエンスゲル溶液を０．２μｍメンブレンでろ過した後、３０分程度脱気をした。ゲル溶液に４００μｌの１０％ＡＰＳ（ペルオキソニ硫酸アンモニウム（Ｎａｃａｌａｉ））と４０μｌのＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ））を加え、すぐにゲル板に流し込んだ。コームを差し、水平なところに置いた。３０分後、ゲル板の両端に水で濡らしたＪＫワイパー（クレシア）とともにラップで包み、５時間以上静置した。Ｌｉ−ｃｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにゲル板をセットし、１Ｌの１×ＴＢＥを所定の位置に注ぎ、１．８μｌのＰＣＲサンプルを各ウェルに注入した。２４時間程度泳動を行なった。
シークエンスゲル溶液は、尿素（Ｎａｃａｌａｉ）２５．２ｇ、１０×ＴＢＥ７．２ｍｌ、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（登録商標）ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＭＡ）４．８ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップして６０ｍｌとした。
【００３８】
（１２）ＧＦＰ蛍光の検出
感染して病徴をあらわしている接種葉及び上葉を、暗室内において実体顕微鏡下（ＳＺＸ−１２，ＯＬＹＭＰＵＳ）でＧＦＰ蛍光を検出した。
【００３９】
（１３）ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質のＣ末端欠失ウイルスの作出
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ直後の３’末端非翻訳領域を、下記のプライマーＹ２ｂ−Ｓｔｕと３’末端のプライマーのＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０でＰＣＲをかけ、ＰＣＲ産物のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域をｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に導入した。
（プライマー）
Ｙ２ｂ−Ｓｔｕ：CGAGGCCTGACGCGTGTACGTAAACCTCCCCTTCCGCATC
ＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０：CCATCGATTGGTCTCCTTTTGGAGGCC
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ内のＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたプラスミド（ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ）を作出した。図１に、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕの構築図を示す。
【００４０】
このｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎし、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３の転写産物とともに、ベンタミアーナ、タバコに接種試験を行なった。その結果を表１に示す。Ｙ１ Ｙ２ｂΔＳｔｕ Ｙ３は、ベンタミアーナでは上葉に激しいモザイクが見られたが、激しいモザイクを起こし、枯死するＣＭＶ−Ｙワイルドタイプに比べると病徴の進行は遅かった。また、タバコにおいても上葉にモザイク病徴が見られ、全身感染を示したが、ベンタミアーナと同様にＣＭＶ−Ｙに比べて病徴の進行は遅かった。
【００４１】
【表１】
【００４２】
（１４）ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質の非発現ウイルスの作出
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２には、ウイルスの複製酵素複合体の一部である２ａタンパク質とオーバーラップした形で２ｂタンパク質がコードされている。そのため、２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する際には、２ａタンパク質のアミノ酸置換が起こらないように考慮しなければならない。この条件をクリアするために、２ｂ ＯＲＦの８塩基目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入した。このポイントミューテーションは、２ａ ＯＲＦのアミノ酸置換を起こさない。図２に、ポイントミューテーションを導入するストラテジーを示す。
【００４３】
即ち、ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎを導入する配列において、下記のセンス及びアンチセンスのプライマーを作成し、それぞれ３’及び５’のプライマーとともにＰＣＲをかけてＦｒａｇｍｅｎｔＩ（ｌａｎｅ１）・ＩＩ（ｌａｎｅ２）を増幅した。それぞれのバンドを切り出して混合し、それをテンプレートとして５’及び３’のプライマー（ＣＹ２Ｔ７・ＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０）でＰＣＲをかけた（ｌａｎｅ３）。ｌａｎｅ３のＰＣＲ ＦｒａｇｍｅｎｔをＨｉｎｄＩＩＩとＢｌｎＩで切断する（ｌａｎｅ４）とｐＣＹ２（ｌａｎｅ５）と同位置に断片が見られた。このバンドを切り出し、ｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ領域にクローニングした。ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎが正確に導入されているかどうかをシークエンスして変異していることを確認した。ｐＵＣ１１９−ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎからＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域を切り出し、ｐＣＹ２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域に導入した。構築したｐＣＹ２−２ｂｓｔｏｐについてもｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎが正確に導入されていることをシークエンスして確認した。
【００４４】
（プライマー）
ＣＹ２Ｔ７：CCGGATCCATTAATACGACTCACTATAGTTTATTTACAAAGAGCG
２ｂ−５−ｓｔｏｐ：AGAAATATGGAATAGAACGTAGG
２ｂ−３−ｓｔｏｐ：CCTACGTTCTATTCCATATTTCT
ｐＣＹ１、ｐＣＹ３の転写産物とともに接種試験をしたところ、ベンタミアーナ、タバコにおいて全身感染を示したがワイルドタイプに比べ病徴の進行は遅かった（表１）。
【００４５】
（１５）ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２への外来遺伝子ＧＦＰの導入
ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質のＣ末端を欠失させたｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、別に転写したＹ１とＹ３を混合して接種した時には、ベンタミアーナ及びタバコに全身感染した。そこで、２ｂを欠失させた位置に外来ＤＮＡを組み込めるｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをウイルスベクターとすることを目的として、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域にＧＦＰの配列を挿入した。図３に、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２への外来遺伝子（ＧＦＰ）の導入のプロセスを示す。ｐＣ３−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＧＦＰ ＯＲＦの５′にＳｔｕＩサイトを、３′にＭｌｕＩサイトを付加した。次に、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕのＳｔｕＩ−ＭｌｕＩ領域にＧＦＰ断片をクローニングし、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ−ＧＦＰを構築した。このＧＦＰの配列を挿入したプラスミドｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ−ＧＦＰをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３のＲＮＡ転写産物とともにベンタミアーナ、タバコに接種し、接種２日後の接種葉及び５日後の上葉のＧＦＰ蛍光を観察した。図４に、Ｙ１Ｙ２−ＧＦＰＹ３（ＲＮＡ転写産物）のベンタミアーナ、タバコでのＧＦＰ蛍光の検出結果を示す。
【００４６】
（１６）結果
接種後２日目の接種葉及び５日目の上葉のＧＦＰ蛍光を観察した結果、接種葉ではウイルスの感染点にあたるところにＧＦＰ蛍光が見られ、上葉では病徴と同じように葉全体に非常に強いＧＦＰ蛍光が広がって見られた。
【００４７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクター等に係るものであり、本発明により、（１）新しい植物ＲＮＡウイルスベクターを提供できる、（２）該ベクターは、接種植物において全身感染を示し、安定的に外来遺伝子を発現させることができる、（３）また、このベクターは、約１０００種類以上の植物を宿主とし、これらの植物においてベクターとして利用可能である、（４）新しい植物遺伝子発現方法を提供できる、（５）この方法は、植物に外来遺伝子を導入し、これを安定して発現させる新しい植物遺伝子発現方法として有用である、（６）複製能が高く、ジーンサイレンシングによる遺伝子発現阻止に有効である、等の効果を奏する。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕの構築図を示す。
【図２】ｐＣＹ２−２ｂｓｔｏｐの構築を示す。
【図３】ＣＭＶ−ＹＲＮＡ２への外来遺伝子（ＧＦＰ）の導入を示す。
【図４】Ｙ１Ｙ２−ＧＦＰＹ３（ＲＮＡ転写産物）のベンタミアーナ、タバコでのＧＦＰ蛍光の検出を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ＲＮＡウイルスベクターに関するものであり、更に詳しくは、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つキュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus, CMV) のＲＮＡ２分子を改変した新規植物ウイルスベクター、及び植物における遺伝子発現方法に関するものである。
本発明は、植物の遺伝子操作及び遺伝子発現方法の分野において、約１０００種類以上の植物を宿主として、これらの植物においてベクターとして利用することが可能であって、外来遺伝子を安定的に発現することができる新規植物ＲＮＡウイルスベクター、及び植物における新しい遺伝子発現方法を提供するものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物ＲＮＡウイルスベクターの研究は、感染植物における増殖能が非常に高いタバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus, TMV) とブロモモザイクウイルス(Bromo mosaic virus, BMV) の感染性クローンを用いて行われてきた。
そして、この分野では、ウイルス遺伝子の発現様式の違いなどから、今までに、いくつかの外来遺伝子の発現方式が開発されている。ここで、それらを紹介すると、例えば、ＴＭＶやポティウイルス属(Potyvirus) では、ウイルスCP遺伝子と外来遺伝子が融合したタンパク質を発現するベクターが開発されている（非特許文献１〜２参照）。また、ＴＭＶと近縁のウイルス(Odontoglossum ringspot virus)のサブゲノミックプロモーターを導入することにより、サブゲノムを介して外来遺伝子を発現させるベクターも開発されている（非特許文献３参照）。
【０００３】
ただ、これまでは、このようなウイルスベクターの開発には、主にＴＭＶやポティウイルス属に代表される、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。それは、棒状、ひも状のウイルスべクターは、球状ウイルスに比べ、挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点があるからである。一方、球状ウイルスであるＢＭＶにおける発現ベクターの系としては、１ａタンパク質、２ａタンパク質の複製酵素遺伝子を発現するタバコに、外来遺伝子をもつＲＮＡ３を接種するという方法が報告されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
また、ＣＭＶにおいても、ウイルスベクターについて、いくつかの研究がなされている。その一つは、complementation による４分節ＣＭＶベクターの開発である（非特許文献５参照）。ＣＭＶのＲＮＡ３にはＭＰとＣＰがコードされており、ウイルスの細胞間移行にはＭＰとＣＰの両方が必須である（非特許文献５参照）。そこで、これまでに、本発明者らは、ＲＮＡ３分子を改変し、ＭＰ領域をＧＦＰ遺伝子に置換したＲＮＡ３ＡとＣＰ遺伝子をもたないＲＮＡ３Ｂを構築し、complementation により細胞間移行するウイルスベクターを開発した。これを、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つＣＭＶとして、ベンタミアーナに接種したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ ｖｅｉｎでＧＦＰ蛍光が観察された。また、ＲＮＡ３Ｂで欠失させたＣＰ領域にマルチクローニングサイトを挿入し、そこに、ＧＵＳ（bacterial-β-glucuronidase）遺伝子やＢＹＭＶ(Bean yellow mosaic virus)のCP遺伝子を導入したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ ｖｅｉｎにおいてＧＵＳ活性やＢＹＭＶ−ＣＰが検出された。しかし、このＲＮＡ３Ａ、ＲＮＡ３Ｂが互いにｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＲＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを起こし、上葉では導入遺伝子の発現は見られなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
Sugiyama,Y.,Hamamoto,H.,Takemoto,S.,Watanabe,Y.and Okada,Y., Systemic production of foreign peptides on the particle surface of Tobacco mosaic virus, FEBS Letters 359,247-250 (1995)
【非特許文献２】
Fernandez-Fernandez,M.R.,Martinez-Torrecuadrada,J.L.,Casal,J.I.and Garcia,J.A., Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus, FEBS Letters 427,229-235 (1998)
【非特許文献３】
Donson et al., Systemic expression of a bacterial gene by a tabacco mosaic virus-based vector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7204-7208 (1991)
【非特許文献４】
Mori,M.,Kaido,M.,Okuno,T.and Furusawa,I., mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plants, FEBS Lett.336,171-174 (1993)
【非特許文献５】
Zhao,Y,,Hammond,J.Tousignant,M.E.and Hammond,R.W., Development and evaluation of a complementation-dependent gene delivery system based on Cucumber mosaic virus, Archives of Virology 145,2285-2295 (2000)
【非特許文献６】
Canto,T.,Prior,D.A.,Hellward K.H.,Oparka,K.J.,Palukaitis,P., Characterization of cucumber mosaic virus.IV.Movement protein and coat protein are both essential for cell-to-cell movement of cucumber mosaic virus, Virology 237,237-248 (1997)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来、ＣＭＶのウイルスベクターについては、いくつかの研究例があるが、現在までのＣＭＶベクターの開発では、ＲＮＡ３に外来遺伝子を導入する方法がとられており、いずれも、接種上葉での増殖が認められない等の問題があり、その改善が強く求められていた。このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、新たなウイルスベクターの開発を目的として、ＣＭＶのＲＮＡ２分子への外来遺伝子ＧＦＰの導入を試みた結果、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクターの開発に成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、接種植物体において全身感染を示し、安定的に外来遺伝子を発現する機能を有する新規ＣＭＶベクターを提供することを目的とするものである。
また、本発明は、約１０００種類以上の植物を宿主として、これらの植物におけるベクターとして好適に利用し得る新しい植物ウイルスベクターを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、導入された外来遺伝子を安定的に発現させることができるＣＭＶベクター、及び該ベクターを利用した新しい植物遺伝子発現方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus,
CMV) のＲＮＡ２分子の２ｂ領域の一部を欠失させ、この２ｂ領域の欠失部分に外来遺伝子導入サイトを挿入した植物ウイルスベクターであって、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦのＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたことを特徴とする、植物ウイルスベクター。
（２）２ｂ ＯＲＦの８番目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入したことを特徴とする、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（３）ｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に、ＳｔｕＩ−ｓｔｏｐ−ＭｌｕＩ−ＳｎａＢＩを含む領域を導入したことを特徴とする、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（４）前記（３）に記載の植物ウイルスベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域に、外来遺伝子を挿入したことを特徴とする遺伝子組み換え体。
（５）前記（４）に記載の遺伝子組み換え体を使用して外来遺伝子を植物に導入し、安定的に外来遺伝子を発現させることを特徴とする植物における遺伝子発現方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic
virus, CMV) のＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムのＲＮＡ２分子の２ｂ領域の一部を欠失させ、この２ｂの一部を欠失させた部分に外来遺伝子導入サイトを挿入した新規ＣＭＶベクターに係るものである。本発明の植物ウイルスベクターとしては、後記する実施例に詳細に示されるように、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ内のＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたプラスミド（ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕと命名）が例示される。そして、その作出方法としては、具体的には、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ直後の３′末端非翻訳領域を、後記する実施例に記載のプライマーＹ２ｂ−Ｓｔｕと３′末端のプライマーＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０でＰＣＲをかけ、ｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に、ＳｔｕＩ−ｓｔｏｐ−ＭｌｕＩ−ＳｎａＢＩを含む領域を導入する方法が例示される。
【０００９】
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２には、ウイルスの複数酵素複合体の一部である２のタンパク質とオーバーラップした形で２ｂタンパク質がコードされている。そのため、ＣＭＶ−Ｙ２ｂタンパク質の非発現ウイルスを作出するために、２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する。２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する際には、２ａタンパク質のアミノ酸置換が起こらないようにする必要がある。この条件をクリアーするために、例えば、２ｂ ＯＲＦの８塩基目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入する方法が例示される。
【００１０】
具体的には、ポイントミューテーションを導入する配列において、後記する実施例に記載のセンス及びアンチセンスのプライマーを作成し、それぞれ３′、５′のプライマーとともにＰＣＲをかけて増幅し、それぞれのバンドを切り出して混合し、それをテンプレートとして、例えば、後記する実施例に記載の５′及び３′のプライマーでＰＣＲをかけ、そのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＢｌｎＩで切断し、この断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ領域にクローニングする。ｐＵＣ１１９−ポイントミューテーションからＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域を切り出し、ｐＣＹ２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域に導入て、２ｂ ＯＲＦにストップコドンになる点変異を導入したｐＣＹ２−２ｂ ｓｔｏｐを構築する。
【００１１】
これらの方法により、ＣＭＶ−Ｙ２ｂタンパク質のＣ末端欠失ウイルスベクターであって、同タンパク質の非発現ウイルスベクターを作出することができる。この改変ベクターは、植物への接種試験を行った結果、後記する実施例に示されるように、全身感染を示したが、ＣＭＶ−Ｙワイルドタイプに比べて、病徴の進行は遅いことが確認された。本発明では、上記ＣＭＶ−Ｙ改変ウイルスベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域に外来遺伝子を導入し、これを植物体に感染させることで、植物において、外来遺伝子を安定的に発現させることができる。
【００１２】
本発明のＣＭＶベクターは、例えば、green fluorescent protein （ＧＦＰ）を組み込んだＰＣＹ２−ＧＦＰからのＲＮＡ転写産物接種第一代では安定的にＧＦＰを発現させることができる。おそらく、ＲＮＡ２分子に直接外来遺伝子を導入しているため、前記４分節ＣＭＶベクターでみられたような分節間でのintermolecular recombinationを起こさなかったことが、ベンタミアーナ上葉でＧＦＰ発現に成功した要因であると考えられる。ＣＭＶ−Ｙの代わりに、ＳＳＶ（Soybean stunt virus, ダイズ萎縮ウイルス−ＣＭＶの１系統）のＲＮＡを使用した場合においても、ベンタミアーナ上葉でＧＦＰの発現が見られたことから、ダイズへの応用も十分に期待される。
【００１３】
本発明のシステムにおいては、このテンプレートスイッチを起こさないために、例えば、ＧＦＰのアミノ酸を変えずに塩基を変えること、又はＣＭＶ−Ｙの３′末端の配列を他のＣＭＶ系統、例えば、ＳＳＶやＨＬ−ＣＭＶ（ユリ系統）の３′末端に改変することなどの工夫を付加することができる。本発明のベクターとしては、好適には、例えば、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２ ３０５１塩基において、２ｂの３′末端７１塩基を欠失させたｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ（２９８０塩基）が例示されるが、これに制限されるものではない。
【００１４】
以上のように、従来、ＲＮＡウイルスベクターの開発は、タバコモザイクウイルスに代表されるように、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。棒状、ひも状のウイルスベクターは、球状ウイルスに比べ挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点がある。一方、本発明で用いたような球状ウイルスでは、その粒子形態からウイルスベクターとしての利用が困難であり、僅かにcomplementation による４分節ＣＭＶベクターの開発やＲＮＡ３に外来遺伝子を導入する方法をとられてきたが、いずれも接種上葉での増殖が認められない等の問題があった。そこで、本発明では、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクターを開発した。ＣＭＶとしては、ＣＭＶ−Ｙ、ＣＭＶ−Ｏ、ＣＭＶ−Ｌ、ＳＳＶ、ｍ２−ＣＭＶに代表されるＣＭＶサブグループ１及び２に属するＣＭＶ分離株が利用可能である。
【００１５】
本発明では、当該ＣＭＶベクターに、例えば、外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を用い、宿主植物にNicotiana benthamiana を用いて機能特性を解析した結果、接種植物体において全身感染を示し、安定的にＧＦＰを発現させることが確認できたが、本発明は、これらに制限されるものではなく、例えば、トマト、タバコ、ホウレンソウ、ダイズ、キュウリ、ジャガイモ等の植物に代表される適宜の植物及び約１０００ｂｐ程度までの外来遺伝子に適用可能である。本発明は、約１０００種類以上の植物を宿主とし、これらの植物においてベクターとして利用可能で、安定的に外来遺伝子を発現することが可能な新規ＣＭＶベクターを提供するものとして有用である。また、このベクターは、ＲＮＡ２を改変したため、従来のＣＭＶでは観察されないサイレンシングを誘導することも可能であり、新規の特性を有するものとして有用である。
【００１６】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
（１）供試ウイルス
供試ウイルスとして、ＣＭＶの１系統のＣＭＶ−Ｙを使用し、北海道大学大学院農学研究科附属世代短縮温室（気温２０〜３０℃、札幌自然日長）において、ベンタミアーナ(Nicotiana benthamiana）、もしくはタバコ(N. tabacum)で継代した。
【００１７】
（２）供試植物の育成
ベンタミアーナ及びタバコの育成を、以下の方法により行った。
４号鉢に播種用土( タキイソイル（タキイ種苗）シャベル４杯、三共培養土（三共）４杯、黒土１杯）を入れ、その上に一握りのバーミキュライト（昭和バーミキュライト株式会社・オートクレーブ済）を乗せ、十分に水を含ませ、種子を４０粒程度播種した。ときどき、間引きをすることで植物体の生育ステージをそろえるようにして、北海道大学大学院農学研究科附属恒温恒湿温室（気温２８℃、日照時間１６時間）で育てた。２〜３ｃｍ程度に生育したところで、移植用土（タキイソイル２杯、三共培養土３杯、黒土１杯、腐葉土（札幌イセキ販売）１杯）に２本ずつ移植した。移植後１週間は新聞紙をかぶせ日光を遮り、その後は植物体の成長に合わせて施肥した。
【００１８】
（３）接種試験
ベンタミアーナやタバコは、移植後１〜２週間ほど経過し、本葉が３〜５枚展開した個体がウイルスに対しての感受性が高く、接種に最も適している。
接種源としては、モザイクや縮葉などのウイルス病徴が見られるベンタミアーナの上葉を用いた。接種ステージに達した植物において接種する葉全体にカーボランダム（Ｎａｃａｌａｉ−メッシュ６００−乾熱済み）を薄くふりかけた。下記の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）１ｍｌに、ＤＩＥＣＡ（Ｎ，Ｎジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）、接種直前に添加）を終濃度１０ｍＭになるように加えて接種源となる感染葉０．１ｇとともに乳鉢で磨砕した。指サックに磨砕粗汁液をつけ、葉の表面に軽くなでるように塗布した。接種後すぐ水をかけて葉面から粗汁液とカーボランダムを洗い流し、翌日まで新聞紙で覆いをして遮光した。
０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．１）は、０．２Ｍリン酸一ナトリウム溶液（Ｎａｃａｌａｉ）３３ｍｌ、０．２Ｍリン酸二ナトリウム溶液（Ｎａｃａｌａｉ）６７ｍｌを混合し、ｐＨ７．１に調製し、蒸留水でメスアップ、オートクレーブして２００ｍｌとした。
【００１９】
（４）コンピテントセルの調製
下記のＳＯＢ液体培地２ｍｌに大腸菌(Escherichia coli)ＪＭ１０９株(TaKaRa)を入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。ＳＯＢ液体培地５０ｍｌに前培養液を０．５ｍｌ接種し、３７℃で約１時間半（ＯＤ550 ＝０．４〜０．８）振盪培養した。氷上に１０分間静置した後ナルゲンチューブに移し、３５００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心した。上清を捨て、氷冷した下記のＴＦＢ１７ｍｌで穏やかに懸濁した。氷上で２０分間静置した後、再び３５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。上清を捨て、氷冷したＴＦＢ２ｍｌを加え、液面で沈殿を穏やかに懸濁した。氷上で３０分間静置した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド−Ｎａｃａｌａｉ）１５０μｌを一滴ずつゆっくり加え、再度氷上で１０分間静置した。先を切ったチップでエッペンドルフチューブに１００μｌずつ分注し、−８０℃で保存した。
【００２０】
ＳＯＢ液体培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０ｇ：ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｇ：１Ｍ ＮａＣｌ溶液１０ｍｌ、１Ｍ ＫＣｌ溶液２．５ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップし、１Ｌとした後、オートクレーブし、使用前に濾過滅菌した１Ｍ ＭｇＣｌ2 溶液（Ｎａｃａｌａｉ）と１Ｍ ＭｇＳＯ4 溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を１／１００量加えて調製した。
また、ＴＦＢ（形質転換緩衝液）は、３５ｍＭ酢酸カリウム（Ｎａｃａｌａｉ）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 （Ｗａｋｏ）、４５ｍＭ ＭｎＣｌ2 （Ｎａｃａｌａｉ）、１００ｍＭ ＲｂＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ）、１５％ ショ糖（Ｗａｋｏ）−酢酸（Ｗａｋｏ）の組成でｐＨ５．８に調整し、濾過滅菌して調製した。
【００２１】
（５）形質転換
緩やかに溶かしたコンピテントセル１００μｌにプラスミド１μｌ（ライゲーション反応液の場合５μｌ程度）を加え、氷上で３０分間静置して自然な拡散で混合させた。４２℃のウォーターバスに４５秒間入れ、すぐに氷冷し、大腸菌内にプラスミドを導入させた。下記の２ＹＴ液体培地０．９ｍｌをチューブの壁につたわらせながら加え、３７℃で３０分間静置培養した。その後、３７℃で３０分間振盪培養した。このうち１００μｌを下記のＬＢ−ａｍｐ培地に広げた。ブルーホワイトセレクションをする場合には、あらかじめ２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｗａｋｏ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎａｃａｌａｉ）で２％濃度に溶解）５０μｌ、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド溶液（Ｗａｋｏ）−濾過滅菌）１０μｌをＬＢ培地上に塗布した後、大腸菌培養液１００μｌを広げた。１２〜１６時間、３７℃のインキュベーターで逆向きに培養した。
【００２２】
２ＹＴ液体培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ、ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとし、オートクレーブして調製した。
また、ＬＢ−ａｍｐ培地は、ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、Ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）１５ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとした後、オートクレーブし、５０℃ぐらいに冷ましてから５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック（Ｗａｋｏ−濾過滅菌済み）を１／１０００量加え、固まる前に滅菌シャーレに分注して調製した。
【００２３】
（６）プラスミド抽出
濃度５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック２μｌを加えた２ＹＴ液体培地２ｍｌの中に、形質転換によって得られた大腸菌のコロニーを滅菌済み爪楊枝で拾い入れ、３７℃で１２〜１４時間振盪培養した。この培養液を１．５ｍｌチューブに入れ、１００００ｒｐｍで１分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−１を２００μｌずつ加え、チューブミキサーで完全に懸濁した。これに、下記にＳｏｌｕｔｉｏｎ−２を２００μｌずつ加え、転倒混和した。次に、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−３を２００μｌずつ加え、再び転倒混和した。これを１４０００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心し、上清をとってチューブに移し、もう一度遠心（１４０００ｒｐｍ ５分間）にかけ、タンパクを完全に除去した。上清を移し、回収した上清と同量のイソプロピルアルコール（Ｗａｋｏ）を加え、転倒混和した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ）を５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨てた。ＲＮａｓｅＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で終濃度２μｇ／ｍｌに希釈して１００μｌずつ加え、軽くミキサーにかけ、３７℃で３０分間静置した。これに、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ−４を６０μｌ加え、ボルテックスミキサーで撹拌して、氷上で４５分間静置した。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノールを５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ ５分間遠心した。上清を捨て、５〜１０分間減圧乾燥し、滅菌水３０μｌで懸濁した。このプラスミドサンプルは−３０℃で保存した。
【００２４】
ａ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−１：
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｗａｋｏ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセティックアシッド／同仁化学）、５０ｍＭグルコース（Ｗａｋｏ）
ｂ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−２：
０．２Ｎ ＮａＯＨ（Ｗａｋｏ）、１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム−Ｎａｃａｌａｉ）
ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−３：
５Ｍ 酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ
ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−４：
２０％ＰＥＧ＃６０００（ポリエチレングリコール−Ｎａｃａｌａｉ）、２．５Ｍ ＮａＣｌ
【００２５】
（７）基本的な遺伝子操作の方法
１）制限酵素処理
各メーカーの制限酵素０．５μｌとその添付バッファーを使用し、２０μｌの反応系で指定の温度下において１時間以上静置した。
２）電気泳動
目的のＤＮＡの長さに適した濃度のＴＢＥ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、８９ｍＭホウ酸（Ｗａｋｏ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）アガロース（Ｇｅｎｅ ｐｕｒｅ（登録商標）ＬＥ ＡＧＡＲＯＳＥ−ＢＭ）ゲルを用い、ＴＢＥを泳動緩衝液として泳動を行なった。泳動後、エチジウムブロマイド溶液（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で染色した。
【００２６】
３）フェノールクロロホルム抽出
サンプルＤＮＡ液に滅菌水を加え１００μｌにし、５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ニッポンジーン）と５０μｌのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を加え、チューブミキサーにかけて１〜２分撹拌してタンパクを失活させた。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、１．５ｍｌチューブに水層だけを移した。クロロホルムを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍ５分間遠心した。１．５ｍｌチューブに水層だけをとりわけた。
【００２７】
４）エタノール沈殿
サンプルＤＮＡ液１００μｌに３Ｍ酢酸ナトリウム（ニッポンジーン）１０μｌ、１００％エタノール３３０μｌ、エタチンメート（ニッポンジーン）１μｌを加えて撹拌して、１４０００ｒｐｍ１０分間遠心し、上清を取り除いた。５００μｌの８０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍ２〜３分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。
【００２８】
５）クローニング
ゲルからＤＮＡを回収する場合、ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＣ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）を使い、直接ＥｔＢｒを終濃度０．５μｇ／ｍｌで入れたアガロースゲルを使用し電気泳動を行った。目的のバンドを含むゲル片を切り出しＱＩＡＥＸ（登録商標）II Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ １５０（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ溶液をフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿した後、５μｌの滅菌水に懸濁した。ベクターとインサートのライゲーションには、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）を使用した。回収したＤＮＡ溶液と等量のＶｅｒ．２−Ｉ液を加えて懸濁した。１６℃で３０分間静置した後、ライゲーション反応液半量をＥ．ｃｏｌｉのコンピテントセルに形質転換した。
【００２９】
（８）感染性クローンのin vitro 転写
アルカリ−ＳＤＳ法で抽出した感染性クローン４μｌをｒｕｎ−ｏｆｆ転写に用いる制限酵素で線状化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、得られたペレットを９μｌの滅菌水に懸濁した。転写反応液を以下のように混合した。
【００３０】
（転写反応液）
テンプレート溶液 ９μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ ５μｌ
１０×Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ*11 ２μｌ
１０ｍＭ ｍ7 Ｇ（５’）ｐｐｐ （５’） Ｇ ＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２μｌ
２０×ＮＴＰ 混合液*12 １μｌ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ*13 ０．５μｌ
Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ
＊１１・・・Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付
＊１２・・・２０×ＮＴＰ（１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、０．１ｍＭ ＧＴＰ−Ｒｏｃｈｅ）
＊１３・・・Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｓｏｌｎ（Ｗａｋｏ）
【００３１】
３７℃で１時間静置した。Ｔ７ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌを転写反応液に再び加えて、更に３７℃で１時間静置した。すぐに接種しない場合、転写産物は−８０℃で保存した。転写産物（ＲＮＡ１・２・３）をそれぞれ１５μｌずつと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）３０μｌを混合した。ベンタミアーナ１本あたり１２．５μｌずつの転写接種液を、通常のウイルス接種と同様に、カーボランダムと指サックで接種した。
【００３２】
（９）ＲＮＡ抽出
（フェノール−ＳＤＳ法）
ＲＮＡ抽出バッファー５００μｌとＴＥ飽和フェノール５００μｌで試料（又はプロトプラスト）０．１ｇを磨砕して、１．５ｍｌチューブに移した。２０秒ほどボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清（水層）を別のチューブに移し、上清と等量のフェノールクロロホルム（１：１）を加え、ボルテックスミキサーにかけて激しく撹拌した後、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清を別のチューブに移し、白いタンパクの層がなくなるまでくりかえし、フェノールクロロホルム抽出を行った。最後に等量のクロロホルムでリンスした後、水層をとりわけ、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、３倍量の１００％エタノールを加えた。ボルテックスをかけ、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。上清を捨て、８０％エタノール５００μｌを加え、１４０００ｒｐｍで５分間冷却遠心した。５〜１０分間減圧乾燥後、ＲＮＡ用滅菌水５０μｌ（プロトプラストの場合１０μｌ）で懸濁し、１４０００ｒｐｍで１分間ほど遠心した。沈殿があった場合は、上清だけを別のチューブに移しかえた。ＲＮＡ抽出バッファーは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ、１％ ＳＤＳの組成である。
【００３３】
（１０）ＲＴ−ＰＣＲ
１）逆転写反応
以下に示す反応溶液を調製した。
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2 Ｏ*15 ７．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 *15 ４μｌ
ｅａｃｈ １０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ*15 ２μｌ
１０×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ*15 ２μｌ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μｌ
３’プライマー １μｌ
サンプルＲＮＡ ２μｌ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＴａＫａＲａ） ０．５μｌ
＊１５・・・ＲＮＡ ＰＣＲTM ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ）に添付
これを、４５℃で１時間静置した。その後、逆転写酵素を不活性化するため、これを、５分間ボイルし、５分間急冷した。
【００３４】
２）ＰＣＲ反応
以下のようなＰＣＲミックスを調製した。
滅菌水 ６３．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 *16 ６μｌ
１０×ＬＡ ＰＣＲTM ＢｕｆｆｅｒII（Ｍｇ2+ｆｒｅｅ）*16 ８μｌ
５’プライマー １μｌ
３’プライマー １μｌ
＊１６・・・ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTMに添付
これに、逆転写反応液２０μｌを加え、更に、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTM０．５μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、目的の断片が増幅されているのを確認した。
【００３５】
（１１）シークエンス
アルカリ−ＳＤＳ法で抽出したサンプル１μｌに蒸留水１．５μｌを加え、テンプレートＤＮＡ溶液とした。Ｍ１３プライマー（ＩＲＤ８００ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ−Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）／ＩＲＤ８００，Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ／ＩＲＤ８００−日清紡）０．２５μｌにＡＣＧＴ各基質溶液(Thermo sequence fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP(amersham pharmacia))を加え、４種類のプライマー基質混合溶液とした。８連ＰＣＲチューブにテンプレートＤＮＡ溶液２．５μｌ、プライマー基質混合溶液１．２５μｌを分注し、下の条件でＰＣＲをかけた。
【００３６】
（ＰＣＲの条件）
９５℃ ５分 １サイクル
９５℃ ３０秒
５０℃ ３０秒 ３０サイクル
７０℃ １分
１０℃ ∞
【００３７】
ＰＣＲ反応後、２μｌのloading dye fluorescent samples-Stop solution (Amersham)を加えた。シークエンスゲル溶液を０．２μｍメンブレンでろ過した後、３０分程度脱気をした。ゲル溶液に４００μｌの１０％ＡＰＳ（ペルオキソニ硫酸アンモニウム（Ｎａｃａｌａｉ））と４０μｌのＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ））を加え、すぐにゲル板に流し込んだ。コームを差し、水平なところに置いた。３０分後、ゲル板の両端に水で濡らしたＪＫワイパー（クレシア）とともにラップで包み、５時間以上静置した。Ｌｉ−ｃｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにゲル板をセットし、１Ｌの１×ＴＢＥを所定の位置に注ぎ、１．８μｌのＰＣＲサンプルを各ウェルに注入した。２４時間程度泳動を行なった。
シークエンスゲル溶液は、尿素（Ｎａｃａｌａｉ）２５．２ｇ、１０×ＴＢＥ７．２ｍｌ、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（登録商標）ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＭＡ）４．８ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップして６０ｍｌとした。
【００３８】
（１２）ＧＦＰ蛍光の検出
感染して病徴をあらわしている接種葉及び上葉を、暗室内において実体顕微鏡下（ＳＺＸ−１２，ＯＬＹＭＰＵＳ）でＧＦＰ蛍光を検出した。
【００３９】
（１３）ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質のＣ末端欠失ウイルスの作出
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ直後の３’末端非翻訳領域を、下記のプライマーＹ２ｂ−Ｓｔｕと３’末端のプライマーのＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０でＰＣＲをかけ、ＰＣＲ産物のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域をｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に導入した。
（プライマー）
Ｙ２ｂ−Ｓｔｕ：CGAGGCCTGACGCGTGTACGTAAACCTCCCCTTCCGCATC
ＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０：CCATCGATTGGTCTCCTTTTGGAGGCC
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦ内のＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたプラスミド（ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ）を作出した。図１に、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕの構築図を示す。
【００４０】
このｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎし、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３の転写産物とともに、ベンタミアーナ、タバコに接種試験を行なった。その結果を表１に示す。Ｙ１ Ｙ２ｂΔＳｔｕ Ｙ３は、ベンタミアーナでは上葉に激しいモザイクが見られたが、激しいモザイクを起こし、枯死するＣＭＶ−Ｙワイルドタイプに比べると病徴の進行は遅かった。また、タバコにおいても上葉にモザイク病徴が見られ、全身感染を示したが、ベンタミアーナと同様にＣＭＶ−Ｙに比べて病徴の進行は遅かった。
【００４１】
【表１】
【００４２】
（１４）ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質の非発現ウイルスの作出
ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２には、ウイルスの複製酵素複合体の一部である２ａタンパク質とオーバーラップした形で２ｂタンパク質がコードされている。そのため、２ｂタンパク質のＯＲＦにストップコドンを導入する際には、２ａタンパク質のアミノ酸置換が起こらないように考慮しなければならない。この条件をクリアするために、２ｂ ＯＲＦの８塩基目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入した。このポイントミューテーションは、２ａ ＯＲＦのアミノ酸置換を起こさない。図２に、ポイントミューテーションを導入するストラテジーを示す。
【００４３】
即ち、ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎを導入する配列において、下記のセンス及びアンチセンスのプライマーを作成し、それぞれ３’及び５’のプライマーとともにＰＣＲをかけてＦｒａｇｍｅｎｔＩ（ｌａｎｅ１）・ＩＩ（ｌａｎｅ２）を増幅した。それぞれのバンドを切り出して混合し、それをテンプレートとして５’及び３’のプライマー（ＣＹ２Ｔ７・ＣＭＶ−ＤＥＴ−３−３４０）でＰＣＲをかけた（ｌａｎｅ３）。ｌａｎｅ３のＰＣＲ ＦｒａｇｍｅｎｔをＨｉｎｄＩＩＩとＢｌｎＩで切断する（ｌａｎｅ４）とｐＣＹ２（ｌａｎｅ５）と同位置に断片が見られた。このバンドを切り出し、ｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ領域にクローニングした。ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎが正確に導入されているかどうかをシークエンスして変異していることを確認した。ｐＵＣ１１９−ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎからＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域を切り出し、ｐＣＹ２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩ領域に導入した。構築したｐＣＹ２−２ｂｓｔｏｐについてもｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎが正確に導入されていることをシークエンスして確認した。
【００４４】
（プライマー）
ＣＹ２Ｔ７：CCGGATCCATTAATACGACTCACTATAGTTTATTTACAAAGAGCG
２ｂ−５−ｓｔｏｐ：AGAAATATGGAATAGAACGTAGG
２ｂ−３−ｓｔｏｐ：CCTACGTTCTATTCCATATTTCT
ｐＣＹ１、ｐＣＹ３の転写産物とともに接種試験をしたところ、ベンタミアーナ、タバコにおいて全身感染を示したがワイルドタイプに比べ病徴の進行は遅かった（表１）。
【００４５】
（１５）ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２への外来遺伝子ＧＦＰの導入
ＣＭＶ−Ｙ ２ｂタンパク質のＣ末端を欠失させたｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、別に転写したＹ１とＹ３を混合して接種した時には、ベンタミアーナ及びタバコに全身感染した。そこで、２ｂを欠失させた位置に外来ＤＮＡを組み込めるｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕをウイルスベクターとすることを目的として、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域にＧＦＰの配列を挿入した。図３に、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２への外来遺伝子（ＧＦＰ）の導入のプロセスを示す。ｐＣ３−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＧＦＰ ＯＲＦの５′にＳｔｕＩサイトを、３′にＭｌｕＩサイトを付加した。次に、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕのＳｔｕＩ−ＭｌｕＩ領域にＧＦＰ断片をクローニングし、ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ−ＧＦＰを構築した。このＧＦＰの配列を挿入したプラスミドｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕ−ＧＦＰをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３のＲＮＡ転写産物とともにベンタミアーナ、タバコに接種し、接種２日後の接種葉及び５日後の上葉のＧＦＰ蛍光を観察した。図４に、Ｙ１Ｙ２−ＧＦＰＹ３（ＲＮＡ転写産物）のベンタミアーナ、タバコでのＧＦＰ蛍光の検出結果を示す。
【００４６】
（１６）結果
接種後２日目の接種葉及び５日目の上葉のＧＦＰ蛍光を観察した結果、接種葉ではウイルスの感染点にあたるところにＧＦＰ蛍光が見られ、上葉では病徴と同じように葉全体に非常に強いＧＦＰ蛍光が広がって見られた。
【００４７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、ＣＭＶのＲＮＡ２分子を改変した新規のＣＭＶベクター等に係るものであり、本発明により、（１）新しい植物ＲＮＡウイルスベクターを提供できる、（２）該ベクターは、接種植物において全身感染を示し、安定的に外来遺伝子を発現させることができる、（３）また、このベクターは、約１０００種類以上の植物を宿主とし、これらの植物においてベクターとして利用可能である、（４）新しい植物遺伝子発現方法を提供できる、（５）この方法は、植物に外来遺伝子を導入し、これを安定して発現させる新しい植物遺伝子発現方法として有用である、（６）複製能が高く、ジーンサイレンシングによる遺伝子発現阻止に有効である、等の効果を奏する。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＹ２−２ｂΔＳｔｕの構築図を示す。
【図２】ｐＣＹ２−２ｂｓｔｏｐの構築を示す。
【図３】ＣＭＶ−ＹＲＮＡ２への外来遺伝子（ＧＦＰ）の導入を示す。
【図４】Ｙ１Ｙ２−ＧＦＰＹ３（ＲＮＡ転写産物）のベンタミアーナ、タバコでのＧＦＰ蛍光の検出を示す。
Claims (5)
- キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic
virus, CMV) のＲＮＡ２分子の２ｂ領域の一部を欠失させ、この２ｂ領域の欠失部分に外来遺伝子導入サイトを挿入した植物ウイルスベクターであって、ＣＭＶ−Ｙ ＲＮＡ２の感染性クローンであるｐＣＹ２の２ｂ ＯＲＦのＳｔｕＩサイトからストップコドンまでの領域を欠失させたことを特徴とする、植物ウイルスベクター。 - ２ｂ ＯＲＦの８番目のＵ（ウラシル）をＡ（アデニン）に変えるポイントミューテーションを導入したことを特徴とする、請求項１に記載の植物ウイルスベクター。
- ｐＣＹ２のＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩ領域に、ＳｔｕＩ−ｓｔｏｐ−ＭｌｕＩ−ＳｎａＢＩを含む領域を導入したことを特徴とする、請求項１に記載の植物ウイルスベクター。
- 請求項３に記載の植物ウイルスベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイト領域に、外来遺伝子を挿入したことを特徴とする遺伝子組み換え体。
- 請求項４に記載の遺伝子組み換え体を使用して外来遺伝子を植物に導入し、安定的に外来遺伝子を発現させることを特徴とする植物における遺伝子発現方法。
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