JP5411523B2 - リンゴ小球形潜在ウイルスベクターの効率的接種法とバラ科果樹内在性遺伝子の発現抑制方法 - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
(1)リンゴ果樹の内在性遺伝子を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルス(ALSV)を増殖宿主に接種し、
(2)増殖宿主よりRNAを単離し、
(3)発根直後のバラ科果樹実生の子葉に前記RNAを接種する、
を含むことを特徴とするバラ科果樹内在性遺伝子の発現抑制方法を提供する。
工程(1):リンゴ果樹の内在性遺伝子を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルス(ALSV)を増殖宿主(例えば、キノア)に接種する。
工程(2):増殖宿主よりRNAを単離する。
工程(3):発根直後のバラ科果樹実生の子葉に前記RNAを接種する。
1.材料および方法
(1)供試植物
Chenopodium quinoa(以下キノア)をALSVの増殖宿主として供試した。また、組換えALSVを接種するバラ科果樹としてリンゴを用いた。
(2)リンゴ遺伝子のクローニング
リンゴ由来のアクチン(Mdactin)遺伝子mRNA(GenBank Accession No. DQ822466)およびリンゴのルビスコ小サブユニット(MdrbcS)遺伝子mRNA(GenBank Accession No. L24497)の配列をもとに設計したプライマーを用いて、以下のようにリンゴ葉から抽出したRNAから各遺伝子の一部をPCRにより増幅後クローニングした。
Mdactin(+)[5’-tccttcgtcttgaccttgct-3’](配列番号1)と
Mdactin(−)[5’-acggaatctctcagctccaa-3’](配列番号2)、
MdrbcS遺伝子cDNAを増幅する
MdrbcS(+)[5’-gacgagaaagcagagagaga-3’](配列番号3)と
MdrbcS(−)[5’-cgatgatacggatgaaggat-3’](配列番号4)の組み合わせを用いた。
(3)ALSVベクターへの内在性遺伝子の導入とウイルス化
ALSV RNA2の感染性cDNAクローンであるpEALSR2L5R5に上記でクローニングした各遺伝子、すなわちMdactinおよびMdrbcS断片を以下の方法でそれぞれ組み込んだ。
(4) ウイルスの濃縮
組換えALSV(Mdactin-ALSVおよびMdrbcS-ALSV)の濃縮は以下の手順で行った。まず、組換えALSVをChenopodium quinoa(以下キノア)に接種後、7〜10日の接種葉と病徴の現れた上葉をサンプリングした。この感染葉100gに対し、300mlの抽出緩衝液 [0.1M Tris-HCl(pH7.8),0.1M NaCl,5mM MgCl2]と3mlのメルカプトエタノールを加えてワーリングブレンダーで磨砕した。磨砕液を2重ガーゼでろ過し、9,000rpmで10分間(4℃)遠心分離(日立RPR12-2ローター)した。得られた溶液に、ベントナイト溶液(40mg/ml)を攪拌しながら静かに加え、9,000rpmで10分間(4℃)遠心分離した。上清が透明な黄色になるまでこの作業を繰り返し清澄化した。次に、上清にポリエチレングリコールを8%になるように加え、氷中で1時間攪拌した。9,000rpmで10分間(4℃)遠心分離した後、沈殿を20mlの抽出緩衝液に溶解した。続いて10mlのクロロホルムを加えて15分間(4℃)攪拌した。9,000rpmで10分間(4℃)遠心分離(日立RPR16ローター)後、上清を45,000rpmで1.5時間(4℃)遠心分離(日立RP65ローター)した。沈殿に1mlの抽出緩衝液を加えて十分に懸濁した後、9,000rpmで10分間(4℃)遠心分離しこの上清を濃縮Mdactin-ALSVおよび濃縮MdrbcS-ALSVとした。
(5) RNAの抽出
濃縮Mdactin-ALSVおよび濃縮MdrbcS-ALSVからRNAを抽出し、マイクロキャリアの調製に用いた。濃縮組換えALSVからのRNAの抽出は以下の手順で行った。濃縮組換えALSV 50μlに滅菌水150μlを加え撹拌した後、水飽和フェノールとクロロホルムを100μlずつ加えてボルテックスミキサーで十分に攪拌した。14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離後、上清200μlを新しい1.5ml容チューブに移し、20μlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)、500μlの99%エタノールを加え、十分に撹拌した後、-80℃で15分間静置した。14,000rpmで15分間(4℃)遠心分離して得られた沈殿に70%エタノール1mlを加えて14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、15μlの滅菌水に懸濁した。分光光度計(ND-1000 v3.1.2)で得られた溶液を1μg/μlに調整し、これを濃縮ALSV RNA溶液とした。また、MdrbcS-ALSV感染キノア葉から全RNAを抽出した。まず、MdrbcS-ALSV感染キノア葉0.5gを完全に凍結し、乳棒と乳鉢を用いてパウダー状になるまで完全に破砕した。破砕後、植物体がとけないうちに、速やかに5mlのTri Reagent (シグマ)を乳鉢に加え、よくすり混ぜて完全に混和・懸濁した。懸濁液をチューブに移し取り、5分間室温で放置した後、1mlのクロロホルムを加え、30秒間激しく振り混ぜて、完全に混和・懸濁した。懸濁液を10分間室温で静置した後、14,000rpm、4℃で15分間遠心分離を行い、懸濁液を水層と有機溶媒層に分画した。水層(約2.5ml)を新しいチューブに移し取り、等量の2-プロパノールを加えて完全に転倒混和し、10分間室温で静置した後14,000rpm、4℃で10分間遠心分離を行い、全RNAを沈殿させた。上清を捨て、75%エタノールを加えてボルテックスミキサーで激しく攪拌することにより、全RNA沈殿を洗浄した。攪拌後、14,000rpm、4℃で5分間遠心分離を行い、全RNAを再び沈殿させた。上清をピペットマンで取り除いた後全RNAの沈殿を150μlのRNase free H2Oに溶解した。分光光度計(ND-1000 v3.1.2)で得られた溶液を3μg/μlに調整し、これを感染葉全RNA溶液とした。
(6)パーティクルガン接種(Biolistic PDS-1000/He Particle Delively System(Bio-Rad))
マイクロキャリア(RNA;3μg/金粒子;0.4mg/shot)の調製は以下の手順で行った。まず、1.5ml容チューブに金粒子(0.6μm)を2.4mg量り取り、滅菌水100μlを加えボルテックスミキサーで十分に混和した。超音波洗浄機にチューブを入れ、5分間ソニケーションした。ボルテックスミキサーにチューブをセットし撹拌しながら18μlの濃縮ALSV RNA溶液(1μg/μl)を静かに加えた。同様に、5M 酢酸アンモニウムを11.8μl、続いてイソプロパノールを259.6μl静かに加えた。しばらく撹拌した後、−20℃で1時間以上静置した。上清を取り除き金粒子の沈殿をボルテックスミキサーで一瞬撹拌した。金粒子の沈殿に1mlの100%エタノールを加え、沈殿を崩さないように静かに振盪し、その後上清を取り除いた。この作業を4回繰り返した後に60μlの100%エタノールに金粒子を懸濁した。懸濁液10μlをマイクロキャリアの中心に約1cmに塗り広げ十分乾燥させた後に、パーティクルガンを用いて植物への導入を行った。パーティクルガンを用いた接種試験には発根して間もないリンゴの種子4〜6個体を1試験区として供試した。根と胚軸は湿らせたキムワイプで覆い、約4℃で保存した(図1、上段)。種皮をメスで取り除きシャーレに同心円状に並べ、その子葉にヘリウム圧1100psiでBiolistic PDS-1000/He Particle Delively System(Bio-Rad)を用いて1試験区あたり4shot行った。
(7) パーティクルガン接種(Helios Gene Gun System(Bio-Rad))
マイクロキャリア(RNA;5μg/金粒子;0.25mg/shot)の調製は以下の手順で行った。まず、1.5ml容チューブに金粒子(1.0μm)を7.5 mg量り取り、滅菌水100μlを加えボルテックスミキサーで十分に混和した。超音波洗浄機にチューブを入れ、5分間ソニケーションした。ボルテックスミキサーにチューブをセットし撹拌しながら50μlの感染葉全RNA溶液(3μg/μl)を静かに加えた。同様に、5M 酢酸アンモニウムを15μl、続いてイソプロパノールを330μl静かに加えた。しばらく撹拌した後、−20℃で1時間以上静置した。上清を取り除き金粒子の沈殿をボルテックスミキサーで一瞬撹拌した。金粒子の沈殿に1mlの100%エタノールを加え、沈殿を崩さないように静かに振盪し、その後上清を取り除いた。この作業を4回繰り返した後に5ml容チューブに100%エタノールを用いて金粒子を移し取り、最終的に1800μlの100%エタノールに金粒子を懸濁し、ゴールドコートチューブの調製に使用した。チュービングプレップステーション(BIO-RAD)にゴールドコートチューブ(BIO-RAD)をセットし、純窒素ガスを20分間通してゴールドコートチューブの内部を完全に乾燥させた。続いて金粒子の懸濁液を、均一になるようゴールドコートチューブ内に充填し、5分間放置して金粒子をゴールドコートチューブに沈着させた後、上清の99.5%エタノールをゴールドコートチューブ内から取り除いた。続いてチュービングプレップステーションを回転させ、金粒子をゴールドコートチューブ内部に均一に拡散させながらゴールドコートチューブ内に純チッソガスを通し、金粒子を完全に乾燥させた。続いてゴールドコートチューブを、チューブカッター(BIO-RAD)を用いて30個に裁断し、パーティクルガンを用いて植物への導入を行った。発根して間もないリンゴ種子の種皮をメスで取り除き、その子葉に接種した。接種はヘリウム圧220psiでHelios Gene Gun System(Bio-Rad)を用いて1個体あたり4shot行った。
(8) 接種個体の育成
接種個体は湿度を保ち、遮光条件下で2〜3日静置した後に、徐々に外気に馴化させ、その後培養土に移植し、培養室(25℃、明期16時間-暗期8時間)で育成した(図1、中段、下段)。
2.結果
MdrbcS-ALSV感染個体では、接種後3週間程度で第3、4本葉あたりから葉の退緑症状が観察でき、さらにそれ以降の上位葉では葉の全面が退緑した(図2、中)。また、MdrbcS-ALSV感染個体は矮化し、3ヶ月程度を経過すると枯死しまう場合が多かった。
Claims (2)
- 以下の工程:
(1)リンゴの内在性遺伝子を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルス(ALSV)を増殖宿主に接種し、
(2)増殖宿主よりRNAを単離し、
(3)発根直後のリンゴ種子の種皮を取り除いて露出させた子葉にパーティクルガン法を用いて前記RNAを接種する、
を含むリンゴ内在性遺伝子の発現抑制方法。 - RNAが、増殖宿主より抽出・濃縮した組換えALSVから単離したRNA(濃縮ALSV RNA)、または増殖宿主の感染葉から抽出した全RNAである請求項1の方法。
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