JP2002516089A - 形質転換のための改良された方法および材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主細胞を形質転換し、かつ外因性RNAをその中に発現するように方向づけられた新規の方法および材料を、本明細書において開示する。特に、それによって外因性ポリヌクレオチドが細胞において発現され、検出可能な形質を与える、外因性ポリヌクレオチドに結合させた複製するウイルスセグメントを細胞に導入するために用いられるDNA送出プラットフォーム（DNA-launching platform）を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は以下の機関によって与えられた米国政府の支援の下で行われた：NIH
助成金番号：GM35072。米国政府は本発明において一定の権利を保有する。

【０００２】発明の背景 RNAウイルスは、標的とする細胞および組織の表現型および遺伝子型の形質転
換における貴重なツールであることが知られている。例えば、新規ウイルスRNA
発現ベクターについて開示している米国特許第5,500,360号を参照のこと。RNAウ
イルスのゲノムのRNAは、外因性RNAセグメントを含むように改変することができ
ること、および改変されたRNAを宿主細胞に導入して、その中で複製させ、それ
によって外因性RNAセグメントを発現することができることが示されている。

【０００３】 改変されたRNAウイルスを宿主細胞に接種する現行の方法は、特定の鎖のイン
ビトロ転写を行ってから、得られたRNA転写物を宿主細胞に導入することを含む
。現行の接種法に関する一つの問題は、RNAが急速に分解して、このため感染効
率が低くなることである。さらに、インビトロRNA転写物の調製は高価であり時
間を浪費する。

【０００４】 さらに、植物の形質転換および遺伝子工学の出現によって、危険な形質を環境
中にばらまく危険性を有する可能性に関して多くの懸念が持たれている。例えば
、農業的に重要な作物のストレス抵抗性および／除草剤抵抗性を増加させる遺伝
子は、例えば、花粉、機械的散布、または昆虫による散布によって、周辺のあま
り望ましくない損傷の少ない植物に、理論的に「漏れる」可能性がある。この現
象は新しい「超雑草（super weed）」種を生じる可能性があり、これは農業に大
混乱を引き起こしうる。既存のRNAウイルスに基づくベクターは、機械的手段お
よび／または昆虫によって非標的植物に広がりうる。そのような散布は、適当な
トランス作用因子を発現する標的植物に限って複製および／または運動すること
ができるベクターを用いることによって予防することができる。したがって、標
的細胞および組織の形質転換に関して、より安価で、しかもより効率的な方法は
なおも必要である。その上、遺伝子操作された形質が環境に望ましくないように
散布されることに関連した潜在的危険性を軽減する、新規形質転換方法が必要で
ある。

【０００５】発明の簡単な説明 本発明は、細胞にDNA送出プラットフォーム（DNA-launching platform）をト
ランスフェクトする段階を含む、宿主細胞を形質転換する改良された材料および
方法に関する。本発明の一つの局面は、それによってDNA送出プラットフォーム
を宿主細胞に導入することができ、その中でDNA送出プラットフォームが複製お
よび発現されるように、上記改良されたウイルスRNA分子を宿主細胞に有効に「
送出する（launching）」ことができる、DNA依存性RNAポリメラーゼ（pol）プロ
モーターの下流に、改変されたウイルスRNA分子をコードするDNA送出プラットフ
ォームに関する。本明細書において用いられる「改変されたウイルスRNA分子」
という用語は、その天然の状態から変化しているウイルスRNAを意味する。ウイ
ルスRNAの変化の例には、ウイルスRNAゲノムの一部の除去、外因性RNAの挿入ま
たは置換等が含まれるがこれらに限定されることはない。外因性RNAセグメント
は、それがRNA複製を妨害しないように、ウイルスRNA分子のある領域に存在しう
る。そのような操作の技術は何年も前から当業者に周知であった。好ましくは、
改変されたウイルスRNA分子は、改変されたウイルスRNA分子の3'末端近位に存在
するリボザイムをさらに含む。ウイルスセグメントは、トランス作用ウイルス複
製エレメントの存在下で、または非存在下で複製される能力を有してもよい。

【０００６】 本発明のもう一つの局面は、ウイルスRNA分子および外因性RNAセグメントをコ
ードするDNA送出プラットフォームを、該ウイルスRNAセグメントまたは該外因性
RNAセグメントの複製を妨害しない部位に導入する段階を含み、それによって、
外因性RNAセグメントが宿主細胞において検出可能な形質を付与する、宿主の遺
伝子型または表現型を改変する方法に関する。本発明は、多様な植物細胞に当て
はまる。

【０００７】 本発明のなおさらなる局面は、本発明のDNA送出プラットフォームが導入され
た細胞に関する。

【０００８】 本発明のさらにもう一つの局面は、DNA送出プラットフォームをトランスフェ
クトさせた細胞を含む植物に関する。

【０００９】 本発明の新規方法および材料は、本発明のDNA送出プラットフォームを利用す
ればRNA接種物の分解に対してより抵抗性となるため、かつそれぞれのDNA送出プ
ラットフォームが長期間にわたって多数のRNA転写物を産生するために、RNAウイ
ルスのより大きい接種効率を提供する。DNA送出プラットフォームは、所望のベ
クター構築物の遺伝的に安定な植物内貯蔵コピーを提供することから、該DNA送
出プラットフォームの持続的な転写によって、宿主細胞に所望の構築物が繰り返
し再接種されると思われる。これは、植物および動物RNAウイルスに基づくベク
ターからの幾つかの遺伝子の発現が阻害された、という遺伝子不安定性問題を解
消する役に立つ。さらに、本発明の接種方法は、インビトロRNA転写物を接種す
る場合より安価で、しかも効率がよい、大規模で用いられるバルクとして接種物
を生成する、はるかに単純な手段を提供する。

【００１０】配列の簡単な説明 配列番号：１ ：pB1LR2−部分ヌクレオチド配列はBMV 1a発現カセットを含む
。

【００１１】 配列番号：２ ：pB1LR3−部分ヌクレオチド配列はBMV 1a発現カセットを含む
。

【００１２】 配列番号：３ ：pB2LR4−部分ヌクレオチド配列はBMV 2a発現カセットを含む
。

【００１３】 配列番号：４ ：pB2LR5−部分ヌクレオチド配列はBMV 2a発現カセットを含む
。

【００１４】 配列番号：５ ：pB12LR6−部分ヌクレオチド配列はBMV 1aおよび2a発現カセ
ットを含む。

【００１５】 配列番号：６ ：pB12LR7−部分ヌクレオチド配列はBMV 1aおよび2a発現カセ
ットを含む。

【００１６】 配列番号：７ ：pB12LR8−部分ヌクレオチド配列はBMV 1aおよび2a発現カセ
ットを含む。

【００１７】 配列番号：８ ：pB12LR9−部分ヌクレオチド配列はBMV 1aおよび2a発現カセ
ットを含む。

【００１８】発明の詳細な説明 本発明の理解を容易にするために、本明細書を通じて特定の用語を本明細書に
おいて定義する。本明細書において用いられる「RNAウイルス」という用語は、
ウイルスのゲノムが二本鎖または一本鎖型のRNAであって、一本鎖が（＋）鎖ま
たは（−）鎖であるウイルスを意味する。

【００１９】 本明細書において用いられる「トランスフェクション」または「トランスフェ
クトされた」という用語は、機械的接種、エレクトロポレーション、アグロ感染
、パーティクル-ボンバードメント、マイクロインジェクション、または他の既
知の方法によって細胞に外来性DNAまたはRNAを導入することを意味する。

【００２０】 本明細書において用いられる「形質転換」または「形質転換した」とは、細胞
において永続的な遺伝的変化を引き起こす、細胞における外来性DNAまたはRNAの
安定な組み込みを意味する。したがって、当業者は、細胞のトランスフェクショ
ンがその細胞の形質転換を生じる可能性があると理解すると思われる。

【００２１】 本明細書において「送出された（launched）」とは、本明細書に記述するよう
にDNA送出プラットフォームから転写された、好ましくは複製されたポリヌクレ
オチドを意味する。

【００２２】 本明細書において用いられる「シス作用エレメント」という用語は、シスで存
在しなければならない、すなわちその鎖の複製に対する必要条件としてそれぞれ
のウイルス鎖の一部として存在しなければならない、RNAウイルスのRNAゲノムの
一部を示す。ウイルス複製は、シス作用エレメントと相互作用してRNA複製を行
う１つまたはそれ以上のトランス（拡散型）エレメントの存在に依存すると思わ
れる。トランス作用エレメントが複製に必要である場合、それらは提供され、改
変されたウイルスRNA上に存在する必要はなく、またはRNA上でコードされる必要
はないが、他の何らかの手段によって感染細胞内で利用できるようにしてもよい
。例えば、トランス作用の複製機能は、改変されたRNAと同時に細胞にトランス
フェクトされたウイルスゲノムの他の改変されていない、または改変された構成
要素によって提供してもよい。同じアプローチを運動蛋白質、コート蛋白質、お
よび他の機能を含む他のトランス作用機能のために用いることができる。標的細
胞もまた予め改変してもよく、例えば、細胞は染色体からトランス作用機能の構
成的発現を提供するように先に形質転換しておいてもよい。シス作用エレメント
は、RNA複製によって宿主細胞内で複製されるべきRNA分子上に存在しなければな
らないウイルスRNAの１つまたはそれ以上のセグメントで構成される。セグメン
トはウイルスRNA分子の5'および3'末端部分である可能性が最も高く、他の部分
および／またはウイルスオープンリーディングフレームも同様に含んでもよい。
したがって、シス作用エレメントは機能的な用語において定義される：必須のト
ランス作用エレメントを含むことが知られている細胞においてRNAの複製能を破
壊する如何なる改変も、シス作用エレメントにおける改変であると思われる。逆
に、複製を妨害することなく、そのような欠失または挿入に耐えることができる
配列領域における欠失または挿入のような如何なる改変も、シス作用エレメント
外での改変である。本明細書に示すように、当業者によって機能的な例であるこ
とが既知であり、容認されているBMVの例を用いて、そこからRNAウイルス分子の
実質的な部分を、複製を妨害することなく、欠失、挿入、または欠失と挿入の組
合せによって改変してもよい。

【００２３】 「外因性RNA」とは、外因性RNAセグメント源がRNAウイルスそのものとは異な
る、改変すべきウイルスRNAに挿入されるRNAのセグメントまたは構成要素を記述
するために用いられる用語である。RNA源は、他のウイルス、植物、動物、細菌
、ウイルスまたは真菌のような生物であってもよい。外因性RNAは化学合成したR
NAであってもよく、天然のRNAに由来してもよく、または上記の組合せであって
もよい。外因性RNAは、RNAセグメントによって提供されることが適当であって知
られている如何なる機能を提供してもよい。そのような機能には、宿主細胞によ
って翻訳されると、有用なまたは所望の形質を有するペプチドまたは蛋白質の合
成が起こる配列をコードするメッセンジャーRNAとして作用するRNAがコード機能
を含むが、これに限定されることはない；RNAセグメントは構造的、例えばリボ
ソームRNAにおいて構造的であってもよい；これは、例えば核内低分子RNA、また
はアンチセンスRNAに関して調節的であってもよい；または触媒的であってもよ
い。当業者は、外因性RNAが例えば、発現されると、細胞代謝の変化のような所
望の表現型特徴を発揮する、生化学経路において鍵酵素である蛋白質をコードし
てもよいと理解すると思われる。さらに、外因性RNAは、ジンクフィンガー、ウ
イングド-へリックス（winged helix）、およびロイシンジッパー蛋白質のよう
な、転写の調節に関係する蛋白質をコードしてもよい。特に興味深い機能は、ア
ンチセンスRNA、時に（−）鎖RNAと呼ばれるものによって提供されるが、これは
実際に相補的塩基対形成を通じて、標的細胞においてRNAに結合してその機能を
阻害することができる、標的細胞中に存在するもう一つのRNA配列と実際に相補
的な配列である。

【００２４】 「非ウイルス」という用語は、本明細書において、その改変が複製および発現
のために利用される、ウイルス内に通常含まれない如何なるRNAセグメントも意
味し、したがって、「外因性」という用語と同義に用いられる。したがって、改
変された種とは異なるウイルス種に由来する遺伝子は、本発明を記述する目的に
関して「非ウイルス」および「外因性」という用語の意味に含まれる。例えば、
用語としての非ウイルス遺伝子には、形質転換を行うために改変されたウイルス
とは区別することができるタイプの細菌ウイルス、動物ウイルス、または植物ウ
イルスに由来する遺伝子が含まれる。さらに、非ウイルス遺伝子は、如何なる原
核生物または真核生物に由来する構造遺伝子であってもよい。

【００２５】 一つの態様において、本発明は、ウイルスRNAを細胞に導入するためにDNA送出
プラットフォームを利用する、宿主細胞をトランスフェクトする新規方法に関す
る。本発明は、外因性RNA構成要素およびDNA依存性RNA polプロモーターに結合
したRNAウイルス構成要素を含む、改変されたウイルスRNA分子をコードするDNA
送出プラットフォームを用いるトランスフェクション法によって方向づけされる
。DNA依存性RNA polプロモーターは、好ましくは改変されたウイルスRNA分子の5
'転写開始部位の10ヌクレオチドまでの中に融合されるが、必ずしもその必要は
なく、より好ましくは5'転写開始部位の5ヌクレオチドまでの範囲内である。DNA
送出プラットフォームの発現によって、改変されたウイルスRNA分子の転写物が
生成され、次にこれは、複製因子の存在下でRNA複製を行うことができるが、こ
の複製因子は改変されたウイルスRNA中に存在しうる、および／または染色体か
らの発現を含む他の手段によってイントランスで供給されてもよく、または異な
る送出プラスミド上に供給されてもよい。改変されたウイルスRNAが複製される
場合、外因性RNAも同様に複製されうる。さらに、外因性RNAは細胞に発現させる
ことができ、それによって既定の表現型形質が得られる。好ましい態様において
、DNA送出プラットフォームはさらに、該RNA分子の3'末端に近位に存在する自己
切断性のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む。当業者に容易に明ら
かなように、既知のリボザイムを本発明に従って用いてもよい。好ましい態様に
おいて、リボザイムは3'領域で改変されたRNAウイルス分子を切断する。3'領域
は、3'末端の上流または下流の30ヌクレオチドまでで構成されることができ、好
ましくは3'末端の上流または下流の10ヌクレオチドまでで構成される。より好ま
しい態様において、リボザイムは改変されたRNAウイルス分子を3'末端で正確に
切断する。他の既知の調節配列、例えばプロモーターおよび／または終結配列も
また、DNA送出プラットフォームに置換してもよく、および／またはDNA送出プラ
ットフォーム上に含んでもよい。改変されたウイルスRNA分子配列の3'末端の近
位に、適した制限酵素部位を導入することができ、トランスフェクションの前に
、DNA分子を適当な制限酵素によって切断することができる。本明細書において
用いられるように、「DNA送出プラットフォーム（DNA-launching platform）」
という用語は、改変されたウイルスRNAセグメントをコードするセグメントを含
むコード領域を有し、かつさらに、細胞の中に輸送され、その後転写されること
ができる、環状または直鎖状のDNA分子を意味すると解釈される。

【００２６】 可能性がある調節配列は、ウイルス起源（CaMV 19Sおよび35S）のプロモータ
ーまたは、対応する終結／ポリA+配列を有するいわゆる「ハウスキーピング」遺
伝子（ユビキチン、アクチン、チューブリン）のような、発現に関して構成的で
あることが既に示されている任意のプロモーターを含むことができるが、これら
に限定されることはない。同様に、対応する終結／ポリA+配列を有する、植物脂
肪酸／脂質生合成遺伝子（ACP、アシルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ、
脂質転移蛋白質遺伝子）のプロモーター、または貯蔵蛋白質遺伝子（例えば、ゼ
イン、ナピン、クルシフェリン、コングリシニン、ファセオリン、もしくはレク
チン遺伝子）のプロモーターのような、種子および／または発生学的に特異的な
プロモーターを標的化発現に用いることができる。さらに、遺伝子は、遺伝子発
現が、光（rbcS-3A、cab-1）、熱（hsp遺伝子プロモーター）、または創傷（マ
ンノピン、HGPG）によって誘導されるように、誘導型プロモーターおよびその終
結配列の調節下に置くことができる。プロモーターは、本来の形で、または短縮
型のいずれかで用いてもよく、自身または異種の終結／ポリA+配列と対にしても
よいことは当業者に明らかである。

【００２７】 特に好ましい態様において、本発明は、以下の段階を含む、細胞の遺伝子型ま
たは表現型を改変する方法に対して方向付けされる：a）ウイルスRNAが、それに
よってコードされるRNA産物の複製を妨害することなく、そのような挿入に耐え
ることができる領域に配置された非ウイルスRNA構成要素をコードするDNAセグメ
ントを含むように改変されている、ウイルスRNAのcDNA分子、またはRNAウイルス
が多くの部分に分かれている場合にはRNA構成要素の少なくとも１つのcDNA分子
を形成する段階；b）改変されたcDNAをDNA送出プラットフォームにクローニング
する段階；およびc）適した宿主細胞に該DNA送出プラットフォームをトランスフ
ェクトする段階。最も好ましい態様において、本方法は、植物をトランス作用ウ
イルス複製因子および／または他のトランス作用因子によって予め形質転換する
段階をさらに含む。そのようなトランス作用因子は、ウイルス運動蛋白質、コー
ト蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ならびに他の構造的および非構造的遺伝子を
含んでもよい。トランス作用因子の安定な発現のほかに、トランス作用因子は異
なる発現プラスミド上に導入してもよく、またはRNA転写物から発現してもよい
。好ましい態様において、そのようなトランス作用因子は複製しない。適した宿
主細胞には、プロトプラスト、細胞懸濁液、または組織中もしくは生物全体の細
胞を含んでもよい。

【００２８】 本明細書のより広い開示の例として解釈される特定の態様において、RNAウイ
ルスセグメントは、スズメノチャヒキモザイクウイルス（BMV）に由来すること
ができ、それによってDNA送出プラットフォームはウイルスのRNA3セグメントを
コードするDNAを含む。スズメノチャヒキモザイクウイルス（BMV）は、動物およ
び植物のプラス鎖RNAウイルスのαウイルス様スーパーファミリーのメンバーで
あり、３つのRNAに分かれたゲノムを有する。RNA1およびRN2はそれぞれ、1aおよ
び2a蛋白質をコードし、これはゲノムRNA複製およびサブゲノムmRNA合成にとっ
て必要である（例えば、本明細書と矛盾しない程度に、参照として本明細書に組
み入れられる、米国特許第5,500,360号を参照のこと）。これらの蛋白質は、α
ウイルス様スーパーファミリーのメンバー全てにおいて保存されている３つのド
メインを含む。1a（109 kDa）はc-近位ヘリカーゼ様ドメインおよびRNAキャッピ
ングに関係するn-近位ドメインを含み、2a（94 kDa）は、中央ポリメラーゼ様ド
メインを含む。例えば、フレンチ＆アールクイスト（French and Ahlquist）（1
988）を参照のこと。1aおよび2aは互いに相互作用すると共に細胞因子と相互作
用して、感染した細胞の小胞体と会合した膜結合型ウイルスRNA複製複合体を形
成する。2.1 kbのRNAであるBMV RNA3は、天然の植物宿主においてBMV感染の伝搬
に関与しているがRNA複製に関しては重要でない、3a蛋白質（32 kDa）およびコ
ート蛋白質（20 kDa）をコードする。米国特許第5,500,360号を参照のこと。RNA
3ウイルスセグメントの3aまたはコート蛋白質遺伝子は、それによって複製エレ
メントを妨害しない外因性RNAに置換することができる。さらに、外因性RNAセグ
メントはさらなるサブゲノムプロモーターの下流に挿入することができる。なお
さらに、細胞または組織は、必要なシス作用構成要素を有する外来遺伝子を含む
DNA送出プラットフォームを、外来遺伝子が複製および／または発現されるよう
にトランスフェクトする、1a、2a、3a、およびコート蛋白質、またはその如何な
る組合せも発現するように予め形質転換することができる。

【００２９】 一つの態様において、1aおよび2a蛋白質を発現するようにトランスジェニック
的に操作されるように、宿主細胞をBMV1またはBMV2によって予め形質転換する。
好ましくは、BMV1およびBMV2の5'および3'末端は、それらが複製できないが、宿
主細胞の小胞体に会合したウイルスRNA複製複合体を形成するために1aおよび2a
を発現することができるように切除される。RNA3ウイルス複製セグメントと共に
、関心対象の外因性RNAを含むDNA送出プラットフォームのその後のトランスフェ
クションによって、環境へのウイルスRNAの漏出という望ましくない危険な散布
を防止しながら、該外因性RNAを発現させることができる。すなわち、植物は、
感染性BMV粒子を形成するためには３つのセグメント全てを有していなければな
らないため、機械または昆虫によるRNAウイルスベクターの散布による外来遺伝
子の環境への危険な逸出は回避される。当業者は、BMVの実施例において、DNA送
出プラットフォームがまた、RNA1またはRNA2のいずれかに由来しうることを容易
に認識すると思われる。例えば、1a蛋白質をコードする配列は、外因性RNAに置
換することができる；複製は1aの発現を必要とする（例えば、異なる発現プラス
ミド）。好ましい態様において、DNA送出プラットフォームはまた、リボザイム
がRNA3を3'末端で切断する、改変されたRNA3の3'末端に近位に存在するリボザイ
ムを含む。本明細書に含まれる開示に関して当業者には容易に明らかとなるよう
に、他の既知のウイルスに由来するウイルスセグメントおよび／またはサブウイ
ルス物質を、本発明のDNA送出プラットフォームを処方するために用いることが
できる。当業者は、BMVが本発明を実践するために適した多くのウイルスの単な
る代表的な一例に過ぎないことを認識すると思われる。本発明が基づく原理が、
無数のウイルスに広く適応可能であることは広く容認されている。他のそのよう
なウイルスの例には、アルファルファモザイクウイルス（AMV）、ムギ斑葉モザ
イクウイルス、ササゲモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、レオウイ
ルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、インフル
エンザウイルス、レトロウイルス、およびササゲクロロティックモットルウイル
ス（CCMV）、ならびにRNA中間体を通じて複製し、そこからcDNAコピーを得るこ
とができる、他の如何なるウイルスも含まれるがこれらに限定されることはない
。特に、他のウイルスをさらに特徴付けするれば、当業者は本明細書の開示を他
の適したウイルスにも応用可能であることを容易に認識すると思われる。

【００３０】 当業者は、外来遺伝子を細胞に導入する既知の方法を、本開示の開示に従って
用いることができることを容易に認識すると思われる。そのような方法には、機
械的接種、パーティクル-ボンバードメント、アグロ感染、エレクトロポレーシ
ョン、およびマイクロインジェクション、ならびにその他の既知の方法が含まれ
るが、これらに限定されることはない。

【００３１】 本発明の様々な局面は、形質転換およびトランスフェクト剤として選択したウ
イルスおよび挿入すべきRNAセグメントの特異的特性に応じて、必要に応じて改
変することができる。例えば、挿入された遺伝子は天然に存在する遺伝子である
必要はなく、改変してもよく、１つ以上のコードセグメントの複合体であっても
よく、または１つ以上の蛋白質をコードしてもよい。RNAはまた、改変されたRNA
分子の全長または他の特性を制御するために、挿入および欠失を組みあわせるこ
とによって改変してもよい。挿入された非ウイルス遺伝子はその起源が原核生物
または真核生物のいずれかであってもよい。導入された遺伝子はそれ自身の翻訳
開始シグナル、例えば、リボソーム結合部位および開始（AUG）コドンを含んで
もよく、またはこれは改変すべきウイルスRNAに既に存在する1つまたはそれ以上
のこれらの構成要素を利用するように挿入してもよい。当技術分野で周知の原理
に従って、挿入された配列の正確な翻訳を行うために、特定の構造的拘束が認め
られなければならない。例えば、外因性コードセグメントが内因性コードセグメ
ントと組みあわせることを意図する場合、挿入すべきコード配列はそのリーディ
ングフレーム相に、同じ翻訳方向に挿入しなければならない。

【００３２】 その移入によってレシピエント細胞の明白な表現型改変が引き起こされない、
特定の遺伝子が存在する可能性があることは、当業者によって理解されると思わ
れる。そのようなことは、例えば非ウイルス遺伝子の翻訳産物が宿主細胞に対し
て毒性であって、それを非機能的にするように分解または処理される場合、また
は形質転換された細胞上の検出可能な表現型を与えるための十分量を宿主細胞が
翻訳することができない構造的特徴を有する場合に起こる可能性がある。しかし
、本発明は移入されるRNAセグメントまたは遺伝子の何らかの特異的特性に依存
しない。したがって、レシピエント細胞または植物上に容易に観察される表現型
形質を与えることができないRNAセグメントまたは遺伝子が存在する可能性は、
本発明とは無関係であり、いずれにせよ、過度の実験を行うことなく当業者によ
って容易に認識されると思われる。

【００３３】 外因性RNAセグメントは、挿入が宿主細胞内でのRNAの複製にとって必須の配列
を妨害しない限り、ウイルスRNA、または多数に分かれたRNAウイルスのRNA構成
要素に対応するcDNA配列の如何なる都合のよい挿入部位に挿入してもよい。例え
ば、そのコート蛋白質が複製にとって必須でないウイルスの場合、外因性RNAセ
グメントは、通常コート蛋白質をコードする領域内に挿入してもよく、または領
域と置換してもよい。望ましい場合には、そのような変化が宿主細胞におけるRN
Aの複製能に有害な影響を及ぼさない限り、望ましくない宿主細胞応答に関与す
る領域を欠失、または不活化してもよい。多くの単一の構成要素および複数の要
素で構成されるRNAウイルスの場合、通常のRNA複製速度の低下は認容可能であり
、通常の感染において産生されたRNA量が形質転換細胞のリボソームを飽和する
ために十分以上であるために、場合によっては好ましい。

【００３４】 培養された植物細胞は、DNA送出プラットフォームから発現されたRNA構成要素
が複製可能であり、このように細胞分裂によって子孫細胞に分配されるようにな
るため、細胞が増殖および分裂するにつれて通常トランスフェクトされたままで
あると思われる。表現型が改変された細胞、組織、またはプロトプラストから再
生した植物はなおも表現型が改変されている。同様に、実生としてトランスフェ
クトされた植物も、生育のあいだトランスフェクトされたままである。トランス
フェクト構成要素を適用する最適なタイミングは、それが意図される結果によっ
て、および植物生育の様々な段階のあいだにトランスフェクト構成要素に対する
感受性の変化によって支配されると思われる。

【００３５】 多くの植物RNAウイルスは、１つの世代から次の世代へと種子によって伝達さ
れる。この特性は植物の遺伝子型形質転換を行うために利用することができる。
すなわち、種子媒介ウイルス感染が一つの世代から次の世代に伝達されるように
、改変されたRNAは一つの世代から次の世代へと伝達可能であり続ける。

【００３６】 以下は本発明を実践するための技法を説明する実施例である。これらの実施例
は制限的に解釈してはならない。百分率は全て重量百分率であり、溶媒混合比は
、特に明記していない限り全て容積である。

【００３７】実施例１−アグロバクテリウム（Agrobacterium）ベクターの構築 植物においてBMV 1aおよび2a蛋白質を発現するバイナリベクターを構築した。
pB101.2構築物（クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）から開始す
る。始めにEcoRIおよびSnaBIによって構築物を切断することによって、GUS遺伝
子を切除した。オーバーハング制限酵素断片末端をクレノウ断片およびdNTPによ
る処置によって塞いだ。制限酵素断片末端を再度ライゲーションしてpB101.2LR1
を作製した。

【００３８】 2a発現カセットをpBI101.2LR1に挿入した。まず、pBI101.2LR1をHind IIIによ
って切断して脱燐酸化した。次に、pB2PA17（ディナント（Dinant）ら、1993）
をHind IIIによって切断して、低融点アガロースゲルを用いて2aインサートを精
製した。制限酵素断片末端をライゲーションして、pB2LR4およびpB2LR5（図3cお
よび3d）を作製した。

【００３９】 1a発現カセットを、まずpBI101.2LR1をSnaBIによって切断することによってpB
I101.2LR1に挿入して、脱燐酸化した。pB1PA17（ディナント（Dinant）ら、1993
）をPsIで切断して、余分のヌクレオチドをT4 DNAポリメラーゼによって除去し
た。1aインサートは低融点アガロースゲルを用いて精製した。制限酵素断片末端
をライゲーションして、pB1LR2およびpB1LR3ベクターを作製した（図3aおよび3b
）。

【００４０】 1a発現カセットを、pB2LR4またはpB2LR5をSnaBIによって切断することによっ
てpB2LR2およびpB2LT5に挿入して、脱燐酸化した。pB1PA17（ディナント（Dinan
t）ら、1993）をPstIによって切断して、余分のヌクレオチドをT4 DNAポリメラ
ーゼによって除去した。1aインサートは低融点アガロースゲルを用いて精製し、
切断されたpB2LR4またはpB2LR5ベクターとライゲーションして、pB12LR6、pB12L
R7、pB12LR8、およびpB12LR9ベクターを作製した（図3e〜3h）。

【００４１】実施例２−BMVのwtRNA3に対するDNA送出プラットフォームおよび外来性配列を含
むRNA誘導体に対するDNA送出プラットフォームの構築 ベクターpRT101（テプファー（Topfer）ら、1987）をPpuMIで切断して、制限
酵素断片末端をクレノウ断片およびdNTPによって塞ぎ、BamHIで切断して脱燐酸
化した。ベクターpB3RQ39（イシカワ（Ishikawa）ら、1997）をSnaBIおよびBamH
Iによって切断した；B3断片を低融点アガロースゲルから単離した。切断されたp
RT101にこの断片をライゲーションして、それによってpB3LR10（図４）を作製し
た。pB3LR10誘導体であるpB3LR15（図４）は、pB3TP8からの対応する断片に置換
されているClaI-KpnI断片（ジャンダ（Janda）ら、1987）を有する。

【００４２】 pRT101についてPCRを実施してEcoRVおよびEcoRI断片を増幅した。PpuMI部位の
代わりにStuI部位を作製するために、PCRプロセスの際に１つのヌクレオチドの
欠失を行った。得られたPCR産物をEcoRVおよびEcoRIによって切断して、EcoRVお
よびEcoRIによって切断され、脱燐酸化されたpRT101に挿入して、pRT101LR11を
作製した。pRT101LR11をStuIおよびBamHIによって切断して脱燐酸化した。PB3RQ
39をSnaBIおよびBamHIによって切断して、B3断片を低融点アガロースゲルを用い
て単離した。次に、断片をpRT101LR11にライゲーションして、pB3LR12を作製し
た（図４）。

【００４３】 部分的に二本鎖のCaMV35Sプロモーターを有するBMVのwtRNA3によって、もう一
つのDNA送出プラットフォームを構築した；それによってpB3LR14およびpB3LR16
を作製した（図４）。

【００４４】 BMV RNA3コート蛋白質がGUSに置換されているDNA送出プラットフォームも同様
に構築した。pB3MI22（イシカワ（Ishikawa）ら、1997）をClaIおよびStuIによ
って切断して、B3GUSインサートを単離した。pB3LR10またはpB3LR14 DNA送出プ
ラットフォーム構築物をClaIおよびStuIによって切断して、脱燐酸化した。次に
、切断されたpB3LR10またはpB3LR14にB3GUS断片をライゲーションして、それに
よってpB3GUSLR17およびpB3GUSLR18 DNA送出プラットフォーム構築物を作製した
（図５）。

【００４５】 GUSがさらなるBMVサブゲノムプロモーターの下流にある、GUS遺伝子を挿入し
たBMV RNA3を有するDNA送出プラットフォームを構築した。pB3LR15構築物をAvaI
によって切断して、制限酵素断片末端をクレノウ断片およびdNTPによって塞いだ
。次に、構築物をClaIで切断して、脱燐酸化した。pB3MI22をClaIおよびStuIに
よって切断して、B3GUS断片を単離した。次に、単離されたB3GUS断片を、切断さ
れたpB3LR15構築物にライゲーションして、pB3GUSCPLR19の新規の構築物を作製
した（図５）。

【００４６】 さらなるササゲクロロティックモットルウイルス（CCMV）サブゲノムプロモー
ターの下流に挿入したCP遺伝子を有する、BMV RNA3に基づくDNA送出プラットフ
ォームを構築した。pB3GUSLR17構築物をStuIおよびKpnIによって切断して、脱燐
酸化した。pBC3AJ14（パチャ＆アールクイスト（Pacha and Ahlquist）、1991）
をNdeIによって切断し、末端を当技術分野で既知の方法で平滑にして、KpnIによ
って切断した。次に、コート蛋白質断片を単離した。切断されたpB3GUSLR17にコ
ート蛋白質断片をライゲーションして、pB3GUSCPLR22の新しい構築物を作製した
（図５）。

【００４７】 サブゲノムRNA4を有するDNA送出プラットフォームを構築した。pB4MK2（クロ
ール（M. Kroll）、私信）をSnaBIおよびBamHIによって切断して、RNA4断片を単
離した。pRT101LR11構築物をStuIおよびBamHIによって切断して、脱燐酸化した
。断片および切断されたpRT101LR11構築物をライゲーションしてpB4LR20を作製
した（図5a）。

【００４８】 BMVコート蛋白質がGFPに置換されたDNA送出プラットフォームを構築した。pEG
FP（クロンテック社、カリフォルニア州）をNotIによって切断して、クレノウ断
片およびdNTPによって塞ぎ、低融点アガロースゲルを用いてGFPインサートを単
離した。pB3LR15をSalIおよびStuIによって切断して、脱燐酸化した。次に、GFP
断片を、切断されたpB3LR15にライゲーションして、それによってpB3GFPLR48を
作製した（図6e）。

【００４９】 CPがさらなるCCMVサブゲノムプロモーターの下流である、GFP遺伝子を挿入し
たBMV RNA3を有するDNA送出プラットフォームを構築した。pBC3AJ14（パチャ＆
アールクイスト（Pacha and Ahlquist）、1991）をNdeIおよびEcoRIによって切
断して、末端を当技術分野で既知の方法によって平滑にした。次に、コート蛋白
質断片を単離して、脱燐酸化し、平滑にし、NoIおよびStuIで切断されたpEGFPに
ライゲーションして、pEGFPCPLR49を作製した。pEGFPCPLR49をKpnIによって切断
して、低融点アガロースゲルを用いてEGFPCP断片を単離した。PB3GFPLR48をKpnI
によって切断して脱燐酸化した。次に、EGFPCP断片を、切断されたpB3GFPLR48に
ライゲーションして、それによってpB3GFPCPLR50を作製した（図6a）。

【００５０】 GFP遺伝子がBMV 3aとの翻訳融合体として発現されるRNA転写ベクターを構築し
た。pB3TP10（パチャ＆アールクイスト（Pacha and Ahlquist）、1991）をBamHI
によって切断して、脱燐酸化した。PCRおよび以下のプライマーを用いてpEGFP（
クロンテック社、カリフォルニア州）からGFP断片を増幅した。 増幅産物をBamHIによって切断して、低融点アガロースゲルを用いて精製した。
切断されたpB3TP10にGFP断片をライゲーションして、pB3GFPLR47を作製した（図
6d）。pB3GFPLR47をEcoRIによって切断して、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写
した。

【００５１】 BMV RNA3 DNA送出プラットフォームを含むアグロバクテリウムベクターを構築
した。pBI101.2LR1をSmaIによって切断して脱燐酸化した。pB3LR15をPvuIIによ
って切断して、低融点アガロースゲルを用いてB3断片を精製した。次に、B3断片
をpBI101.2LR1にライゲーションして、それによってpB3LR42を作製した（図９）
。

【００５２】 BMV RNA3コート蛋白質をSHMV（サンヘンプ（Sunn hemp）モザイクウイルス）
コート蛋白質に置換し、およびGUS遺伝子をさらなるBMVサブゲノムプロモーター
の下流に挿入したDNA送出プラットフォームを構築した。pB3RS4（サシャー（Sac
her）ら、1988）をAvaIによって切断して、クレノウ断片およびdNTPによって平
滑末端にして、KpnIによって切断した。低融点アガロースゲルを用いて、SHMVコ
ート蛋白質断片を単離した。pB3GUSLR17をStuIおよびKpnIによって切断して、脱
燐酸化した。切断されたpB3GUSLR17にSHMVコート蛋白質断片をライゲーションし
て、それによってpBGUSCPLR24を作製した（図７）。

【００５３】 １つまたはそれ以上の外来遺伝子および必要なシス作用複製シグナルを含むDN
A送出プラットフォームのその他の順列は、本明細書の開示を見ることによって
容易に認識されると思われる。例えば、実施例５〜10を参照のこと。

【００５４】実施例３−DNA送出プラットフォームによるタバコ（N. tabacum）プロトプラス
トのトランスフェクション 培地： NT1培地（１リットル）は、ギブコ-BRL（MS塩、カタログ番号11118-031）、６
％KH₂PO₄ 3 mlおよび2,4D 0.2 μg/ml（最終濃度）によって作製した。pHはKOH
を用いて5.5〜5.7に調整して、得られた混合液をオートクレーブした。

【００５５】 NT1播種用培地（１リットル）をNT1培地およびマンニトール72.86 gから作製
して、pHを5.5〜5.7に調整して、得られた混合液をオートクレーブした。

【００５６】 洗浄液（１リットル）は、マンニトール72.86 gによって作製して、pHを5.5に
調整し、得られた混合液をオートクレーブした。

【００５７】 エレクトロポレーション緩衝液は、0.8％NaCl、0.02％KCl、0.02％KH₂PO₄、0.
11％Na₂HPO₄および0.4 Mマンニトールから作製した。pHを6.5に調整して、得ら
れた混合液をオートクレーブした。

【００５８】 酵素溶液は0.4 Mマンニトールおよび20 mM MESから作製した。pHを5.5に調整
して、得られた混合液をオートクレーブした。

【００５９】 増殖条件：細胞（タバコ（Nicotiana tabacum））をNT1培地中で室温で、一定
の振とう条件下（約200 rpm）で増殖させた。

【００６０】 消化のための用培養物の調製：１週間目の懸濁培養物約2〜3 mlを、新鮮なNT1
培地50 mlに継代して３日間培養した後、酵素消化した。培養物を一定の振とう
条件下で28℃に維持した。

【００６１】 酵素消化：以下を含む酵素消化液を調製した：１％セルリジン（カルビオケム
社（Calbiochem））および0.3％マセラーゼ（カルビオケム）の酵素溶液。pHを5
.5に調整して濾過滅菌した。

【００６２】 細胞を800 rpmで５分遠心した。上清を捨てた。洗浄溶液約40 mlを加えて、細
胞を再懸濁させて、800 rpmで５分間遠心した。次に、３倍容量の細胞を酵素消
化液に再懸濁させて、室温で60分インキュベートした。

【００６３】 洗浄：細胞を50 mlプラスチック管に移し、800 rpmで５分間遠心した。上清を
捨てた。細胞を洗浄液40 mlに再懸濁し、800 rpmで５分間遠心した。上清を捨て
た。細胞をエレクトロポレーション用緩衝液40 mlに再懸濁し、800 rpmで5分間
遠心した。上清を捨てた。細胞を4倍容量のエレクトロポレーション用緩衝液に
再懸濁させた。

【００６４】 エレクトロポレーション：RNAまたはDNA接種物を含む細胞１ mlをエレクトロ
ポレーションキュベットに移して、氷中で10分間放置した。次に細胞を混合して
、500μF、250 Vでエレクトロポレーションした。キュベットを氷中に10分間入
れた。細胞をNT1播種培地10 mlに移した。

【００６５】 試料のインキュベーションおよび収集：細胞を暗所、室温でインキュベートし
た。試料を接種から24〜48時間後に回収した。

【００６６】 RNA解析：RNA抽出、変性１％アガロースゲル電気泳動、およびノザンブロット
ハイブリダイゼーションは、ラソコバ＆ミラー（Rasochova and Miller）（1996
）において実施されたように、既知の方法によって実施した。各レーンに分光光
度法によって測定した等量（約５μg）の総RNAをローディングして、リボソーム
RNAをエチジウムブロマイド染色によって確認してからノザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験１回あたり、１×10⁶ cp
m/mlの放射活性プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を用いた。RNA3
の複製はsgRNA4の検出によって確認し、このように、発現プラスミドから発現さ
れたBMV RNA複製因子1aおよび2aが、インビトロ転写物として供給される（図11
）と共にDNA送出プラットフォームから送出された（図12）RNA3の効率的な複製
を支持することを示している。

【００６７】実施例４−トランスジェニックタバコ（N. tabacum）植物の作製 所望の分子を大腸菌において構築した後、分子を、凍結融解法を用いてアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移入した。
ベクターpB1LR2、pB2LR4、pB12LR6、およびpB12LR7は全て個別に用いた。適当な
ヘルパーTiプラスミドを含むアグロバクテリウムLBA 4404株をYEP培地5 ml中で2
8℃で一晩増殖させた。一晩の培養液2 mlを250 mlフラスコ中のYEP培地50 mlに
加えて、28℃で培養物がOD₅₀₀が0.5から1.0に増殖するまで強く振とうした（250
rpm）。培養物を氷中で冷却した。細胞懸濁液を４℃、3000 gで５分間遠心した
。上清を捨てた。細胞を氷冷20 mM CaCl₂溶液１ mlに再懸濁させた。0.1 mlアリ
コートを予め冷却したエッペンドルフチューブに移した。プラスミドDNA約１μg
を細胞に加えた。細胞を液体窒素中で凍結させた。試験管を37℃の水浴中で５分
間インキュベートすることによって、細胞を融解した。YEP培地１ mlをチューブ
に加えて、穏やかに振とうさせながら28℃で２〜４時間インキュベートして、細
菌に抗生物質抵抗性遺伝子を発現させた。試験管を30秒間遠心して、上清を捨て
た。細胞をYEP培地0.1 mlに再懸濁させ、選択抗生物質を含むYEP寒天プレートに
播種して、28℃でインキュベートした。形質転換したコロニーは２〜３日で出現
した。

【００６８】 約３週齢のタバコ（Nicotiana tabacum）、ウィスコンシン番号38のインビト
ロクローンコピーを、外植体源として用いた。葉の外植体をインビトロ培養にお
いて第二および第三の十分に成長させた葉から調製した。葉片を１cm×１cm平方
に切断して、TB1（2.0 mg/L 6-ベンジル-アミノプリン、および0.1 mg/L 1-ナフ
タレン酢酸を添加）培地上に、25℃で16時間照明条件下で24時間放置した。

【００６９】 予め選択したバイナリベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス
LBA 4404株を植物の形質転換に用いた。外植体を一晩増殖させたアグロバクテリ
ウム培養液〜10 ml中に30分入れた。葉の外植体の水分を濾紙で吸い取って、TB2
（1.0 mg/L 6-ベンジル-アミノプリン、および0.1 mg/L 1-ナフタレン酢酸を添
加）培地に、背軸面を下にして４日間放置した。次に、外植体を滅菌水で３回す
すいで、濾紙上で水分を吸い取り、100 mg/Lカナマイシンおよび400 mg/Lカルベ
ニシリンを含むTB2培地上で、背軸面を下にして、25℃、16時間照明条件下で再
生させた。外植体を、植物体に成長するまで10〜14日毎に100 mg/Lカナマイシン
および400 mg/Lカルベニシリンを含む新鮮なTB2培地に移した。植物体は典型的
に10〜14日で生育した。植物体をカルスから切断して、100 mg/Lカナマイシンお
よび400 mg/Lカルベニシリンを含むMST培地上に加え、発根を誘導した。発根し
た植物体を土壌に移した。

【００７０】 TB1（１リットル）にはMS塩4.30 g、ミオイノシトール100 mg、ニッチュ＆ニ
ッチュ（Nitsch and Nitsch）ビタミン1.0 ml、蔗糖30 g、BAP２ mg、NAA 0.10
mg、およびノーブルアガー８ gが含まれた。培地はpH 5.7に調整してオートクレ
ーブした。

【００７１】 TB2（１リットル）には、MS塩4.30 g、ミオイノシトール100 mg、ニッチュ＆
ニッチュビタミン1.0 ml、蔗糖30 g、BAP 1.0 mg、NAA 0.10 mg、およびノーブ
ルアガー８ gが含まれた。培地はpH 5.7に調整してオートクレーブした。

【００７２】 MST（１リットル）には、MS塩4.30 g、ニッチュ＆ニッチュビタミン1.0 ml、
蔗糖30 g、ミオイノシトール100 mgおよびディフコアガー8.5 gが含まれた。培
地はpH 5.7に調整して、オートクレーブした。

【００７３】 YEP（100 ml）には、バクトペプトン1.0 g、バクト酵母抽出物1.0 g、およびN
aCl 0.5 gが含まれた。培地はオートクレーブした。

【００７４】 RNA解析：総RNA抽出、変性1％アガロースゲル電気泳動およびノザンブロット
ハイブリダイゼーションは、ラソコバ＆ミラー（Rasochova and Miller）（1996
）において実施されたように、既知の方法によって実施した。各レーンに分光光
度法によって測定した等量（約５μg）の総RNAをローディングして、リボソーム
RNAをエチジウムブロマイド染色によって確認してから、ノザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験１回あたり、１×10⁶
cpm/ml放射活性プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を用いた。図13
aは、トランスジェニックタバコ（N. tabacum）においてBMV 1aおよび2a mRNAの
成功した発現を示す。

【００７５】実施例５−DNA送出プラットフォームによるトランスジェニックタバコ（N. taba
cum）植物のトランスフェクション パーティクル-ボンバードメントのためのマイクロキャリア（microcarrier）
へのDNAの沈着：（キッカート（Kikkert）、1993）。

【００７６】 マイクロキャリアの滅菌：金粒子80 mgを70％エタノール１ mlに再懸濁させて
、15分浸し、13,000×gで５分間遠心した。上清を注意深く除去して捨てた。粒
子を滅菌蒸留脱イオン水１ mlに再懸濁し、13,000×gで５分遠心した。上清を注
意深く除去して捨てた。さらに、粒子の水による洗浄を２回繰り返した。最後の
すすぎ後、粒子を滅菌50％グリセロール１ mlに再懸濁させた。

【００７７】 マイクロキャリアのDNAによるコーティング：以下を連続的かつ迅速に加えた
：DNA（１μg/μl）５μl、2.5 M CaCl₂ 50 μl、および0.1 Mスペルミジン20
μl。

【００７８】 混合物をボルテックスシェーカー上で室温で10分間インキュベートした。粒子
を13,000×gで５秒間遠心して沈降させた。上清を注意深く除去して捨てた。粒
子を70％エタノール140 μlに再懸濁させて、13,000×gで５秒間遠心した。上清
を除去して捨てた。粒子を100％エタノール140 μlに再懸濁させて、13,000 ×gで５秒間遠心した。上清を除去して捨てた。粒子を100％エタノール50 μlに
再懸濁させた。

【００７９】 インビトロで、30 g/L蔗糖を含むMS寒天固形培地上で増殖させたタバコ植物の
若葉に、PDS1000Heバイオリスティックガン（デュポン社）および1100 psiラプ
チャーディスク（バイオラッド社（Bio-Rad））を用いて、再懸濁させたDNAコー
ティング粒子の5μlアリコートをボンバードした。

【００８０】 RNA解析：総RNA抽出、変性１％アガロースゲル電気泳動およびノザンブロット
ハイブリダイゼーションは、ラソコバ＆ミラー（Rasochova and Miller）（1996
）において実施されたように、既知の方法によって実施した。各レーンに分光光
度法によって測定した等量（約５μg）の総RNAをローディングして、リボソーム
RNAをエチジウムブロマイド染色によって確認してから、ノザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験１回あたり、１×10⁶
cpm/ml放射活性プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を用いた。図14
aは、送出されたBMV RNA3がBMV複製因子1aおよび2aを発現するトランスジェニッ
ク植物において効率よく複製すること、送出されたRNA3がBMV 1aおよび／または
2aの非存在下では複製できないことを示している。

【００８１】実施例６−トランスジェニックニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthami
ana）植物の作製 所望の分子を大腸菌に構築した後、分子をアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスに導入した。ベクターpB1LR2、pB2LR4、pB12LR6、およびpB12LR7を全て個別
に用いた。適当なヘルパーTiプラスミドを含むアグロバクテリウムLBA 4404株を
YEP培地５ ml中で28℃で増殖させた。一晩の培養液2 mlを250 mlフラスコ中のYE
P培地50 mlに加えて、28℃で培養がOD₅₀₀が0.5から1.0に増殖するまで強く振と
うした（250 rpm）。培養物を氷中で冷却した。細胞懸濁液を４℃、3000 gで５
分間遠心した。上清を捨てた。細胞を氷冷20 mM CaCl₂溶液１ mlに再懸濁させた
。0.1 mlアリコートを予め冷却したエッペンドルフチューブに移した。プラスミ
ドDNA約１μgを細胞に加えた。細胞を液体窒素中で凍結させた。試験管を37℃の
水浴中で５分間インキュベートすることによって、細胞を融解した。YEP培地１
mlをチューブに加えて、穏やかに振とうさせながら28℃で２〜４時間インキュベ
ートして、細菌に抗生物質抵抗性遺伝子を発現させた。チューブを30秒間遠心し
て、上清を捨てた。細胞をYEP培地0.1 mlに再懸濁させた。選択抗生物質を含むY
EP寒天プレートに細胞を播種して、28℃でインキュベートした。形質転換したコ
ロニーは2〜3日で出現した。

【００８２】 約5〜7週齢のN. ベンタミアナ（N. benthamiana）のインビトロクローンコピ
ーを、外植体源として用いた。葉の外植体をインビトロ培養において第二および
第三の十分に成長させた葉から調製した。葉片を１cm×１cm平方に切断して、10
0×15 mmのプレートでMS104培地上に23℃で、16時間照明条件下で24時間放置し
た。

【００８３】 予め選択したバイナリベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス
LBA 4404株を植物の形質転換に用いた。一晩増殖させたアグロバクテリウム培養
液〜10 ml中に外植体を30分入れた。葉の外植体の水分を濾紙で吸い取って、MS1
04培地に、背軸面を下にして４日間放置した。次に、外植体を滅菌水で３回すす
いで、濾紙上で水分を吸い取り、300 mg/Lカナマイシンおよび400 mg/Lカルベニ
シリンを含むMS104培地上で再生させた。外植体を、植物体に成長するまで10〜1
4日毎に300 mg/Lカナマイシンおよび400 mg/Lカルベニシリンを含む新鮮なMS104
培地に移した。植物体は典型的に31〜50日で生育した。植物体をカルスから切断
して、300 mg/Lカナマイシンおよび400 mg/Lカルベニシリンを含むMST培地上に
置き、発根を誘導した。発根した植物体を土壌に移した。

【００８４】 MS104１リットル中には、MS塩混合物4.3 g、B5ビタミン溶液1.0 ml、蔗糖30 g
、BA 1.0 mg、NAA 0.1 mg、およびフィタガー8.0 gが含まれた。培地をpH 5.8に
調整してオートクレーブした。

【００８５】 YEP培地100 mlにはバクトペプトン1.0 g、およびバクト酵母抽出物1.0 g、NaC
l 0.5 gが含まれた。培地をオートクレーブした。

【００８６】 MST１リットル中には、MS塩混合物4.3 g、ニッチュ＆ニッチュビタミン1.0 ml
、蔗糖30 g、ミオイノシトール100 mg、およびフィタガー8.5 gが含まれた。培
地はpH 5.7に調整して、オートクレーブした。

【００８７】 RNA解析：総RNA抽出、変性１％アガロースゲル電気泳動およびノザンブロット
ハイブリダイゼーションは、ラソコバ＆ミラー（Rasochova and Miller）（1996
）において実施されたように、既知の方法によって実施した。各レーンに分光光
度法によって測定した等量（約５μg）の総RNAをローディングして、リボソーム
RNAをエチジウムブロマイド染色によって確認してから、ノザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験１回あたり、１×10⁶
cpm/ml放射活性プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を用いた。図13
bは、トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. benthamiana）におけるBMV 1aお
よび2a mRNAの成功した発現を示す。

【００８８】実施例７−トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. benthamiana）植物のトラ
ンスフェクション パーティクル-ボンバードメントのためのマイクロキャリアへのDNAの沈着：（
キッカート（Kikkert）、（1993）「バイオリスティックPDS 1000/He 装置（The
biolistic PDS 1000/He device）」、Plant Cell Tiss. And Org. Cult. 33：2
21〜226）。

【００８９】 マイクロキャリアの滅菌：金粒子80 mgを70％エタノール１ mlに再懸濁させて
、15分浸し、13,000×gで５分間遠心した。上清を注意深く除去して捨てた。粒
子を滅菌蒸留脱イオン水１ mlに最懸濁させて、13,000×gで５分遠心した。上清
を注意深く除去して捨てた。さらに、粒子の水による洗浄を２回繰り返した。最
後のすすぎ後、粒子を滅菌50％グリセロール１ mlに再懸濁させた。

【００９０】 マイクロキャリアのDNAによるコーティング：以下を連続的かつ迅速に加えた
：DNA（１μg/μl）５μl、2.5 M CaCl₂ 50 μl、および0.1 Mスペルミジン20
μl。

【００９１】 混合物をボルテックスシェーカー上で室温で10分間インキュベートした。粒子
を13,000×gで５秒間遠心して沈降させた。上清を注意深く除去して捨てた。粒
子を70％エタノール140 μlに再懸濁させて、13,000×gで５秒間遠心した。上清
を除去して捨てた。粒子を100％エタノール140 μlに再懸濁させて、13,000×g
で５秒間遠心した。上清を除去して捨てた。粒子を100％エタノール50 μlに再
懸濁させた。

【００９２】 インビトロで、30 g/L蔗糖を含むMS寒天固形培地上で増殖させたN. ベンタミ
アナ（N. bentamiana）植物の若葉にを、PDS1000Heバイオリスティックガン（デ
ュポン社）および1100 psiラプチャーディスク（バイオラッド社）を用いて、再
懸濁させたDNAコーティング粒子の５μlアリコートをボンバードした。

【００９３】 RNA解析：総RNA抽出、変性１％アガロースゲル電気泳動およびノザンブロット
ハイブリダイゼーションは、ラソコバ＆ミラー（Rasochova and Miller）（1996
）において実施されたように、既知の方法によって実施した。各レーンに分光光
度法によって測定した等量（約５μg）の総RNAをローディングして、リボソーム
RNAをエチジウムブロマイド染色によって確認してから、ノザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験１回あたり、１×10⁶
cpm/ml放射活性プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を用いた。送出
されたBMV RNA3は、BMV複製因子1aおよび2aを発現するトランスジェニックN. ベ
ンタミアナ（N. bentamiana）植物において効率よく複製すること（図14b）、そ
してBMV 1aおよび／または2aの非存在下では複製できないことを示した。

【００９４】実施例８−DNA送出プラットフォームを含むGUSによるトランスジェニック植物の
トランスフェクション トランスジェニックタバコ（N. tabacum）およびN. ベンタミアナ（N. bentam
iana）植物を上記の方法に従って作製した。植物に、実施例５および７に記載の
ようなパーティクル-ボンバードメントによって、GUS遺伝子（図5a）を含むDNA
送出プラットフォームをトランスフェクトした。植物を３〜５日間インキュベー
トして、１ mg/ml X-Gluc（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルグルクロニド）を
基質として0.1 M燐酸カリウム緩衝液、pH 7.0、50 μMフェロシアン化カリウム
、および2％Triton（登録商標）X-100中で用いてβ-グルクロニダーゼ（GUS）活
性に関してアッセイした。37℃で一晩インキュベートした後、送出されたRNA3誘
導体を複製し、サブゲノムRNA4からのGUSリポーター遺伝子を発現する細胞は青
色のスポットを生じた（図15）。送出されたRNA3誘導体は、BMV RNA複製因子1a
および2aの非存在下では複製せず、GUSリポーター遺伝子を発現しなかった（例
えば、野生型N. ベンタミアナ（N. bentamiana）および野生型タバコ（N. tabac
um））。

【００９５】実施例９−BMV 1a、2a、3a、およびCPを発現するトランスジェニック植物のトラ
ンスフェクション 植物をBMV 1a、2a、3aおよびCP遺伝子によって形質転換し、それによってそれ
らの遺伝子を上記植物において安定に発現させた。これは先に概要を述べた方法
によって行うことができる。必要な何らかの改変は、本明細書に含まれる開示に
照らして、当業者に容易に明らかとなると思われる。外来遺伝子およびRNAレプ
リコンを複製するために必要なBMVまたはCCMVシス作用複製シグナルを含む該RNA
レプリコンをコードするDNA送出プラットフォームを構築する（図10b）。該レプ
リコンに含まれる外来遺伝子は例えば、B. t.蛋白質をコードするバチルス・チ
ューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）ポリヌクレオチドを含みうる。
他の配列、例えば除草剤抵抗性をコードする配列、または植物において所望の特
性を有するペプチドまたは蛋白質をコードする如何なる既知の配列も含まれる。

【００９６】 または、植物はBMVコート蛋白質の代わりに、BMV 1a、2a、3aおよびTMVコート
蛋白質を発現するように形質転換することができる。次に、一つまたはそれ以上
の外来遺伝子、BMVまたはCCMVいずれかの必要なシス作用複製シグナル、およびT
MV集合起点（origin of assembly）を含むDNA送出プラットフォームを作製する
（図8a、8b、および10a）。TMVはカプシドに包むことができるRNAの大きさに厳
密な制限を与えない竿状ウイルスであることから、この送出プラットフォームは
明確な長所を有する。またはTMV運動蛋白質をBMV3aの代わりに用いることができ
る（図7c）。トバモ(tobamo)およびブロモウイルスとのハイブリッドは生存する
ことが示された（サシャー（Sacher）ら、1988；デジョン＆アールクイスト（De
Jong and Ahlquist）、1992）。

【００９７】 予め形質転換された遺伝子およびDNA送出プラットフォームに含まれる遺伝子
について他の順列および組合せは、本明細書における開示に照らして、当業者に
よって容易に認識されると思われる（例えば、図8c、10b、および10cを参照のこ
と）。

【００９８】 上記のように、CCMVサブゲノムプロモーターは所望のDNA送出プラットフォー
ムにおいてBMV配列に置換することができる。CCMVサブゲノムプロモーターの配
列は、BMVサブゲノムプロモーターの配列とは異なるため、外来遺伝子が失われ
る組換えの可能性は、これら２つの異なるプロモーターの組合せを有する構築物
でははるかに低い。

【００９９】 上記実施例において、トランス作用構成要素は、複製因子、細胞間運動に関与
する構成要素、または長距離の伝搬に必要な可能性があるコート蛋白質のような
構成要素、翻訳後プロセシングに関与するウイルスプロテアーゼ、または他の既
知のトランス作用機能を含んでもよいが、これらに限定されることはない。

【０１００】実施例１０−GUS含有DNA送出プラットフォームによるタバコ（N. tabacum）プロ
トプラストのトランスフェクション 上記の方法を用いて単離されたタバコ（N. tabacum）プロトプラストに、1aお
よび2a発現プラスミドの存在下および非存在下においてBMV RNA3誘導体のDNA送
出プラットフォームをエレクトロポレーションによって接種した。BMV RNA3誘導
体は、コート蛋白質ORFの代わりにGUS遺伝子を含み（図5a）（これらはコート蛋
白質発現プラスミドと共に、もしくは伴わずに接種した（図5b））、またはBMV
もしくはCCMVサブゲノムプロモーターに由来するさらなるサブゲノムRNAから翻
訳されたBMVCP遺伝子を有し（図5cおよび5d）、またはさらなるBMVサブゲノムRN
Aから翻訳されたSHMVコート蛋白質を有した（図7b）。プロトプラストは接種の2
4時間後に遠心（800 rpm、５分）によって回収した。化学発光GUSアッセイは、
製造元の指示に従って、GUS-ライト（登録商標）（トロピクス社（Tropix）、マ
サチューセッツ州）を用いて実施した。蛋白質濃度はバイオラッド蛋白質キット
（バイオラッドラボラトリーズ、ハーキュルズ、カリフォルニア州）を用いて測
定した。ルミノメーターによって測定したGUS値を、同じ総蛋白質濃度に調整し
た。図16aおよび16bは、トランス作用BMV複製因子1aおよび2aの存在下における
プロトプラストにおける成功したGUS発現を示す。

【０１０１】実施例１１−DNA送出プラットフォームを含むGFPによるタバコ（N. tabacum）プ
ロトプラストのトランスフェクション 上記方法を用いて単離したタバコ（N. tabacum）プロトプラストに、トランス
作用BMV複製因子1aおよび2aに関する発現プラスミド、およびBMVコート蛋白質OR
F（図6e）の代わりにGFP遺伝子を有するRNA3誘導体に対するDNA送出プラットフ
ォーム、さらなるサブゲノムRNAから翻訳されたCP遺伝子（図6a）、またはBMV 3
a ORF（図6d）との融合蛋白質として発現されたGFPを有するRNA転写物を、エレ
クトロポレーションによってトランスフェクトした。プロトプラストを24時間イ
ンキュベートして、蛍光顕微鏡を用いてGFP発現の有無を調べた。図18はプロト
プラストにおける成功したGFPの発現を示す。

【０１０２】実施例１２−GFPを含むBMV RNA3に基づくDNA送出プラットフォームによる（1a＋
2a）トランスジェニック植物のトランスフェクション N. ベンタミアナ（N. bethamiana）植物に、上記のようなパーティクル-ボン
バードメントを用いて、BMVコート蛋白質の代わりにGFP遺伝子を有するBMV RNA3
に関するDNA送出プラットフォームをトランスフェクトさせた（図6e）。GFP発現
は蛍光顕微鏡を用いて接種の24時間後に測定した。図17は（1a＋2a）トランスジ
ェニックN. ベンタミアナ（N. bethamiana）における成功したGFPの発現を示す
。

【０１０３】実施例１３−アグロバクテリウムを用いたBMV RNA3 DNA送出プラットフォームに
よる（1a＋2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. bethamiana）植物のト
ランスフェクション N. ベンタミアナ（N. bethamiana）植物に、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスを用いてBMV RNA3 DNA送出プラットフォームを接種した。所望の構築物（
pB3LR42）が大腸菌において得られた後、これを上記のように凍結融解法を用い
てA.ツメファシエンス（A. tumefaciens）株に導入した。アグロバクテリウムは
一定の振とう条件下で28℃で一晩増殖させた。N. ベンタミアナ（N. bethamiana
）の下部の葉１枚に針で数回穴を開けて、アグロバクテリウム培養液に浸した。
植物は16時間照明条件下で23℃で増殖させた。接種した葉は接種の14日後に回収
した。総RNA抽出およびノザンブロットハイブリダイゼーションは上記のように
実施した。図19は、接種した（1a＋2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（N
. bethamiana）において送出されたBMV RNA3の複製を示す。

【０１０４】実施例14−GUSおよびSHMVコート蛋白質を含むBMV RNA3に基づくDNA送出プラット
フォームによる（1a＋2a）トランスジェニック植物のトランスフェクション N. ベンタミアナ（N. bethamiana）植物に、上記のようなパーティクル-ボン
バードメントを用いて、BMVコート蛋白質がSHMVコート蛋白質（サンヘンプモザ
イクウイルス）に置換され、GUS遺伝子がさらなるBMVサブゲノムプロモーターの
下流に挿入されている、BMV RNA3のDNA送出プラットフォームをトランスフェク
トした（図7b）。GUS発現は、上記のような組織化学GUSアッセイ法によって決定
した。図20は、（1a＋2a）トランスジェニック植物における成功したGUS発現を
示す。

【０１０５】実施例15−送出されたBMV RNA3の運動 自家受粉した（1a＋2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. benthamian
a）BP14のF1子孫植物に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いてBMV R
NA3 DNA送出プラットフォームを接種した。実生を、カナマイシンを含むSmurf培
地上で発芽させた。植物は16時間照明条件下で23℃で増殖させた。所望の構築物
（pB3LR42）を大腸菌において得た後、これを上記のように凍結融解法を用いてA
.ツメファシエンスLBA 4404株に導入した。アグロバクテリウムは一定の振とう
条件下で28℃で一晩増殖させた。N. ベンタミアナ（N. bethamiana）の下部の葉
１枚に針で数回穴を開けて、アグロバクテリウム培養液に浸した。接種した中間
および上部の葉を接種の14日後に回収した。総RNA抽出およびノザンブロットハ
イブリダイゼーションは上記のように実施した。RNA3複製は調べた全ての葉にお
いて検出された（図21）。これは、（1a＋2a）トランスジェニック植物において
BMV RNA3が複製可能であり、細胞間運動が可能であり、および長距離を伝搬可能
であることを示している。

【０１０６】実施例16−（1a＋2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. bethamiana）か
らの子孫のBMV RNA3 DNA送出プラットフォームによるトランスフェクション 実施例13に記述のように、アグロバクテリウムを用いて、自家受粉した（1a＋
2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（BP14と命名する）に、BMV RNA3 DNA
送出プラットフォームを接種した。対照植物（非トランスジェニックN. ベンタ
ミアナ）には50 mM NaPO₄、pH 7.0および1％セライトからなる接種用緩衝液を用
いてBMV感染オオムギの汁を接種した。根の試料を接種の６週間後に回収した。R
NA抽出およびノザンブロット解析は上記のように実施した。図22は根においてBM
V RNA3が非常に高いレベルまで複製したことを示している。いくつかの（1a＋2a
）トランスジェニック植物（図22、レーン2、5、6、7、8、10）では、送出され
たRNA3の複製は、非トランスジェニックN. ベンタミアナ植物において野生型のB
MVの複製を大きく上回った（図22、レーン1）。このことは、この系がRNA、蛋白
質、ペプチドまたは他の化合物を根に輸送するために用いることができること、
および様々な活性、例えば根の寄生虫に対して向けられた活性に対してそのよう
な化合物を試験することができることを示している。例えば、抗線虫活性を有す
る蛋白質を、上記の戦略を用いてRNA3 DNA送出プラットフォームに挿入して、RN
A3が複製すると根に発現させることができる。そのような蛋白質は細胞質におい
て発現するように、または周辺の土壌に分泌されるように操作することができる
。

【０１０７】実施例17−オオムギ斑葉モザイクウイルス オオムギ斑葉モザイクウイルス（BSMV）は、３つに分かれたゲノムを有する（
RNAα、β、およびγ）。これらのゲノムRNAは5'末端にm7Gpppキャップおよび3'
末端にt-RNA様構造を有する（ジャクソン＆ハンター（Jackson and Hunter）、1
989）。

【０１０８】 BSMV RNA cDNAを含むBSMV RNAα、RNAβ、およびRNAγに対するDNA送出プラス
ミドは、5'末端でDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよび3'末端で自己切
断性リボザイムに、正確に融合することによって構築される。ポリアデニル化シ
グナルもまた含んでもよい。または、都合のよい制限酵素部位をウイルスcDNAの
3'末端に操作してもよい。外来遺伝子または配列は幾つかの方法で発現してもよ
い。例えば、BSMV RNAβに基づくDNA送出プラスミドは外来遺伝子、またはORFβ
aの代わりに発現される配列を含んでもよい。

【０１０９】 １つまたはそれ以上のトランス作用因子がDNA依存性RNAポリメラーゼプロモー
ターおよびターミネーターと融合したトランスジェニック植物を得る。そのよう
なトランス作用因子は、ウイルスRNAレプリカーゼの一部（ORFαaおよび／また
はγa）、または他のトランス作用因子を含んでもよい。トランス作用因子は植
物細胞において安定に発現され、または誘導型プロモーターを用いる場合には、
その発現を誘導してもよい。BSMV RNA複製に必要なシス作用配列はトランスジー
ンから切除する。または完全長のRNAαを染色体から発現させる。または種子伝
搬株からの、ND18のような5'非翻訳領域およびORFγbを含むORFγもまた発現さ
れる（エドワーズ（Edwards）、1995）。

【０１１０】 BSMV RNAβの5'末端に正確に融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター
、BSMV RNAβのライフサイクルにとって重要な、5'末端および3'末端のようなシ
ス作用エレメント、βaとβb ORFのあいだのシストロン間領域（ジョウ＆ジャク
ソン（Zhou and Jackson）、1996）、およびBSMV複製および運動にとって重要で
ないORFβa（コート蛋白質）の代わりに外来遺伝子または配列、を含むDNA送出
プラスミドを構築する。そのようなDNA送出プラスミドは、この領域が複製によ
って重要でないため内部ポリ（A）領域を欠損してもよく、改変されたウイルスR
NAの3'末端でリボザイムまたは都合のよい制限酵素部位を含んでもよい。または
、DNA送出プラスミドはORFγaおよび／またはγbが、３つの遺伝子ブロック遺伝
子（ORFβb、βc、およびβd）、または異種運動蛋白質（TMV 30K、RCNMV35K）
を含んでもよい、外来遺伝子または配列に置換されているRNAγから構築する。

【０１１１】実施例18−タバコモザイクウイルス タバコモザイクウイルス（TMV）は、一本鎖プラス鎖センスRNAゲノムを有する
。5'末端はm7Gpppキャップを有し、3'末端はt-RNA様構造を含む。

【０１１２】 5'末端でDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターと正確に融合し、3'末端で自
己切断リボザイムと融合したTMV cDNAを含むTMV RNAに基づくDNA送出プラスミド
を構築する。ポリアデニル化シグナルも同様に含んでもよい。または都合のよい
制限酵素部位を3'末端に操作してもよい。外来遺伝子は、（−）鎖上のさらなる
サブゲノムRNAプロモーターを含むことによって、さらなるサブゲノムRNAから発
現してもよい。

【０１１３】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターに融合した１つ
またはそれ以上のトランス作用因子を有するトランスジェニック植物を得る。そ
のような因子はウイルスレプリカーゼ（126K/183K）、運動蛋白質（30K）、また
はコート蛋白質を含んでもよい。TMV RNA複製にとって必要な少なくとも1つのシ
ス作用配列をトランスジーンから除去する。トランス作用因子を植物細胞に安定
に発現させ、または誘導型プロモーターを用いる場合はその発現を誘導してもよ
い。

【０１１４】 TMV cDNAの5'末端と正確に融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター、
5'および3'末端のようなTMVライフサイクルにとって重要なシス作用エレメント
、集合起点等、染色体から発現されたトランス作用因子の代わりに少なくとも１
つの外来遺伝子または配列、および3'末端でリボザイムまたは都合のよい制限酵
素部位を含む、DNA送出プラスミドを構築する。または、外来遺伝子配列をさら
なるサブゲノムRNAプロモーターから発現して、トランスジーンから発現された
トランス作用因子をコードする配列を、DNA送出プラスミドから欠失させること
ができる。好ましくは、ウイルスレプリカーゼ蛋白質をトランスジェニック植物
において発現する場合、DNA送出プラスミドはヌクレオチド3420〜4902位の欠失
を有し、これはトランスでの複製を阻害する領域であるように思われる（レワン
ドウスキ（Lewandowski）ら、1998）。

【０１１５】実施例19−ジャガイモウイルスX ジャガイモウイルスX（PVX）は一本鎖プラス鎖センスRNAゲノムを有する。5'
末端はm7Gpppを有し、3'末端はポリアデニル化されている。PVXの完全長のcDNA
クローンを構築して、感染性のRNA転写物を得た（ヘメンウェイ（Hemenway）ら
、1990）。

【０１１６】 5'末端でDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターと正確に融合するPVXcDNAを
含み、かつ3'末端でポリアデニル化部位を含むPVX RNAに基づくDNA送出プラスミ
ドを構築する。都合のよい制限酵素部位を3'末端に含んでもよい。外来遺伝子は
さらなるサブゲノムRNAから発現してもよい。

【０１１７】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターに融合した１つ
またはそれ以上のトランス作用因子を有するトランスジェニック植物を得る。そ
のような因子は、ウイルスRNAポリメラーゼ遺伝子（ORF１〜147K）、コート蛋白
質（ORF５〜21K）、または三重遺伝子ブロック（ORF２〜25K、ORF３〜12K、ORF
４〜８K）を含んでもよい。三重遺伝子ブロック遺伝子は個々に発現させること
ができる。またはそれらは、ORF２、３および４に対するプラス鎖センスサブゲ
ノムRNAをウイルスレプリカーゼによって転写することができるマイナス鎖セン
ス転写物として発現することができる。そのようなトランスジーンはORF2、3お
よび4の配列と融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターをマイナス鎖方
向に有し、転写された配列はサブゲノムRNAプロモーターを含むと思われる。PVX
RNA複製に必要な少なくとも１つのシス作用配列をトランスジーンから切除する
。トランス作用因子は植物細胞において安定に発現され、または誘導型プロモー
ターを用いる場合、その発現を誘導してもよい。

【０１１８】 PVXゲノムの5'末端と正確に融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター
、5'および3'末端のようなPVXライフサイクルにとって重要なシス作用エレメン
ト、集合起点等、染色体から発現されるトランス作用因子の代わりの少なくとも
１つの外来遺伝子または配列、およびポリアデニル化シグナルを含むDNA送出プ
ラスミドを構築する。または、外来遺伝子配列はさらなるサブゲノムRNAプロモ
ーターから発現することができ、トランスジェニックに発現されるトランス作用
因子をコードする配列は、DNA送出プラスミドから欠失させることができる。

【０１１９】 または、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター、ポリアデニル化部位、およ
びORF2（25K）が外来遺伝子または配列と置換されているPVX cDNA配列を有するD
NA送出プラスミドを構築する。または、ORF2を欠失させて外来遺伝子をさらなる
サブゲノムRNAプロモーターから発現させる。そのようなDNA送出プラスミドは、
タバコモザイクウイルス（TMV 30K）、トマトモザイクウイルス（ToMV 30K）、
またはムラサキツメクサ壊死モザイクウイルス（RCNMV 35K）のような、異種ウ
イルスからの運動蛋白質を発現するトランスジェニック植物に接種する。

【０１２０】実施例20−フロックハウス（Flok House）ウイルス フロックハウスウイルス（FHV）は、２つの一本鎖RNAからなるゲノムを有する
。RNA1はRNA複製に関与するプロテインAをコードし、sg RNA3から翻訳されるプ
ロテインBをコードし、RNA複製にとって重要でない。RNA2は、ビリオンカプシド
前駆体蛋白質αをコードする。FHVは、昆虫、植物、哺乳類、および酵母細胞（
セリング（Selling）ら、1990；プライス（Price）ら、1996）に感染する。

【０１２１】 その5'末端でDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターと正確に融合し、その3'
末端で自己切断リボザイムと融合するFHV RNA cDNAを含むFHV RNA1およびRNA2に
関してDNA送出プラスミドを構築する。ポリアデニル化シグナルもまた含んでも
よい。または、都合のよい制限酵素部位を3'末端に操作してもよい。外来遺伝子
または配列は幾つかの方法で発現してもよい。例えば、FHV RNA1に基づくDNA送
出プラスミドは、サブゲノムRNA3から発現される外来遺伝子または配列をORF B
置換として、またはORF Bとの翻訳融合体として含んでもよい。または、外来遺
伝子はさらなるsg RNAから発現してもよい。FHV RNA2に基づくDNA送出プラスミ
ドはポリ蛋白質αの一部として発現される外来遺伝子または配列を含んでもよい
。そのような構築物における外来遺伝子はポリ蛋白質切断に必要な配列を含んで
もよい。DNA送出プラスミドは、好ましくは、TMVの30KまたはRCNMVの35Kのよう
な異種植物ウイルスの運動蛋白質を発現すると思われる。または、DNA送出プラ
スミドはそのような運動蛋白質を発現するトランスジェニック植物に接種される
と思われる。

【０１２２】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターに融合した一つ
またはそれ以上のトランス作用因子を有するトランスジェニック植物を得る。そ
のような因子はプロテインAまたはカプシド蛋白質前駆体αを含んでもよく、好
ましくはTMVの30KまたはRCNMVの35Kのような、植物ウイルスからの運動蛋白質を
含むと思われる。トランス作用因子は、植物細胞に安定的に発現され、または誘
導型プロモーターを用いる場合にはその発現を誘導してもよい。トランスジェニ
ック発現されたトランス作用因子は、好ましくは5'および／または3'末端のよう
な、複製に必要な少なくとも1つのシス作用因子を欠損する。

【０１２３】 RNA1（またはRNA2）の5'末端に正確に融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロ
モーター、5'および3'末端のようなFHV RNA1（またはRNA2）複製に重要なシス作
用エレメント、少なくとも一つの外来遺伝子または配列、および3'末端に自己切
断リボザイムを含む、FHV RNA1またはFHV RNA2に基づくDNA送出プラスミドを構
築する。ポリアデニル化シグナルもまた含んでもよい。または、都合のよい制限
酵素部位を、DNA送出プラスミドの改変されたウイルスRNA配列の3'末端に操作し
てもよい。FHV RNA1に基づくDNA送出プラスミドは、ORF Aの代わりに外来遺伝子
または配列を含んでもよい。またはORF Aを欠失させて、および例えばORF B置換
としてまたはORF Bとの翻訳融合体として、サブゲノムRNA3から外来遺伝子を発
現してもよい。またはDNA送出プラスミドは２つの外因性RNA配列を含んでもよく
、一つはORF Aの代わりであり、もう一つはサブゲノムRNA3から発現される。FHV
RNA2に基づくDNA送出プラスミドは、ORFαの代わりに外来遺伝子もしくは配列
を含んでもよく、またはポリ蛋白質αの一部として発現してもよい。そのような
構築物における外来遺伝子は、ポリ蛋白質切断に必要な配列を含んでもよい。

【０１２４】実施例21−トマト斑点野生型ウイルス（Tomato Spotted Wild virus） トマト斑点野生型ウイルス（TSWV）は、３つに分かれた（RNA L、M、S）、マ
イナス鎖センスおよびアンチセンス（anbisence）の、一本鎖RNAウイルスである
。

【０１２５】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターと融合した、１
つまたはそれ以上のトランス作用因子を有するトランスジェニック植物を得る。
そのような因子には、推定TSWVポリメラーゼ遺伝子（ORF L）、ORF N、およびお
そらく他のトランス作用因子（NSmまたはNSs）が含まれる。TSWV RNA複製にとっ
て必要な、5'および／または3'末端のような少なくとも１つのシス作用配列をト
ランスジーンから切除する。トランス作用因子は植物細胞において安定的に発現
され、または誘導型プロモーターを用いる場合にはその発現を誘導してもよい。

【０１２６】 G1およびG2コード配列が少なくとも１つの外来遺伝子または配列に置換されて
いるTSWV RNA Mに基づくDNA送出プラスミドを構築する。そのようなDNA送出プラ
スミドはDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよび5'および3'末端で自己切
断型リボザイムに融合したTSWV RNA M cDNAを含む。または、Nコード領域が外来
遺伝子または配列に置換されているTSWV RNA Sに基づくDNA送出プラスミドを構
築する。

【０１２７】実施例22−オオムギマイルドモザイクウイルス オオムギマイルドモザイクウイルス（BaMMV）のゲノムは、２つのプラスセン
ス鎖、一本鎖の3'ポリアデニル化RNAからなる。RNA1はポチウイルスP3、6K1、CI
、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、およびカプシド蛋白質に関連する蛋白質をコー
ドする（カシワザキ（Kashiwazaki）ら、1990）。RNA2はP1およびP2蛋白質をコ
ードする（カシワザキ（Kashiwazaki）ら、1990）。P1蛋白質はポチウイルスHC-
Proに関連し、P2蛋白質は真菌の伝搬にとって重要である。P2蛋白質に欠損を含
む分離菌を得て（ティンペ＆クーネ（Timpe and Kuhne）、1995）、したがってP
2がウイルスRNA複製に重要でないことを示している。

【０１２８】 5'末端でDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよび3'末端にポリアデニル
化部位を正確に融合したBaMMV RNA cDNAを含むBaMMV RNA1およびRNA2に関するDN
A送出プラスミドを構築する。外来遺伝子または配列は幾つかの方法で発現して
もよい。例えば、BaMMV RNA2に基づくDNA送出プラスミドは、切断することがで
きるポリ蛋白質の一部として発現される外来遺伝子または配列を含んでもよく、
外来性蛋白質を放出することができる。

【０１２９】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターと融合した5'末
端および3'末端を欠損するBaMMV RNA1 cDNAを有するトランスジェニック植物を
得る。

【０１３０】 BaMMV（分離菌M）RNA2に基づくDNA送出プラスミドを構築する。そのようなプ
ラスミドはRNA2の5'末端に正確に融合したDNA依存性RNAポリメラーゼプロモータ
ー、5'および3'末端に存在するRNA2シス作用複製シグナル、P1 ORFおよびP2 ORF
の代わりの外来遺伝子、または切断することができるP1/P2ポリ蛋白質の一部と
して発現される外来遺伝子を含み、外来性蛋白質は放出することができる。

【０１３１】 本明細書において引用した全ての参考文献の内容は、それらが本発明の開示、
教示、および原理と矛盾しない範囲において、参照として本明細書に組み入れら
れる。

【０１３２】 本明細書に記述の実施例および態様は、説明する目的のために記載されたので
あって、それらに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、それらも
本出願の精神および範囲内に含まれると理解すべきである。

【０１３３】参考文献

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 宿主細胞における1aおよび2a蛋白質を産生する略図を示す。

【図２】 1aおよび／または2a BMV蛋白質を発現することができる発現カセ
ットを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換ベクターの例を示す
。

【図３】 宿主植物細胞を形質転換するために作製されたいくつかのアグロ
バクテリウムベクターを示す（黒い四角はT-DNA境界領域を示す）。

【図４】 BMV RNA3送出および複製の一般的メカニズムを示す。

【図５】 本明細書に含まれる開示に従って用いることができるDNA送出プ
ラットフォームを示す。BMVおよびCCMVの表示は、シス作用エレメントを示す。

【図６】 本明細書に含まれる開示に従って用いることができるDNA送出プ
ラットフォームを示す。

【図７】 本明細書に含まれる開示に従って用いることができるDNA送出プ
ラットフォームを示す。

【図８】 本明細書に含まれる開示に従って用いることができるDNA送出プ
ラットフォームを示す。

【図９】 DNA送出プラットフォームを植物細胞に輸送するためのアグロバ
クテリウムベクターを示す（白い三角はT-DNA境界領域を示す）。

【図１０】 本明細書に含まれる開示に従って用いることができるDNA送出
プラットフォームを示す。 図５〜１０の記号 35S＝CaMV35Sプロモーター t＝終結／ポリA＋配列 Rz＝リボザイム NOS＝NOSプロモーター OOA＝集合起点 FG＝外来遺伝子

【図１１】 BMV複製因子は、プロトプラストにおける有効なRNA3複製を支
持することを示す。

【図１２】 プロトプラストにおける送出されたBMV RNA3の効率的な複製を
示す。

【図１３】 タバコ（N. tabacum）およびN. ベンタミアナ（N. benthamian
a）におけるBMV 1aおよび2a mRNAのトランスジェニック発現を示す。

【図１４】 （1a＋2a）トランスジェニック植物における送出されたBMV RN
A3の効率的な複製を示す。

【図１５】 （1a＋2a）トランスジェニック植物における送出されたBMV RN
A3からの成功したGUS発現を示す。

【図１６】 プロトプラストにおける送出されたBMV RNA3からの成功したGU
S発現を示す。

【図１７】 （1a＋2a）トランスジェニック植物における送出されたBMV RN
A3からの成功したGFP発現を示す。

【図１８】 プロトプラストにおける送出されたBMV RNA3からの成功したGF
P発現を示す。

【図１９】 アグロバクテリウム接種を用いて、（1a＋2a）トランスジェニ
ックN. ベンタミアナ（N. benthamiana）における送出されたBMV RNA3の効率的
な複製を示す。

【図２０】 （1a＋2a）トランスジェニック植物における、SHMVコート蛋白
質を有する送出されたBMV RNA3からの成功したGUS発現を示す。

【図２１】 送出されたBMVが（1a＋2a）トランスジェニック植物において
複製すること、細胞間を移動すること、そして長距離に拡散することを示す。

【図２２】 （1a＋2a）トランスジェニックN. ベンタミアナ（N. benthami
ana）からの子孫へのBMV RNA3 DNA送出プラットフォームのトランスフェクショ
ン、および送出されたRNA3の根における局在を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ジャーマン トーマス エル アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 オラ ンデイル サンディ ロック ロード 1671 (72)発明者 アークゥイスト ポール ジー． アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 マデ ィソン ブラッフ ストリート 3106

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a）改変したウイルスRNA分子をコードするポリヌクレオチド
   分子と、 b）DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターとを含む、 DNA送出プラットフォーム（DNA-launching platform）。
2. 【請求項２】 少なくとも1つのシス作用エレメントをコードする配列をさ
   らに含む、請求項１記載のDNA送出プラットフォーム。
3. 【請求項３】 リボザイム配列をさらに含む、請求項１記載のDNA送出プラ
   ットフォーム。
4. 【請求項４】 終結配列をさらに含む、請求項１記載のDNA送出プラットフ
   ォーム。
5. 【請求項５】 制限酵素部位をさらに含む、請求項１記載のDNA送出プラッ
   トフォーム。
6. 【請求項６】 改変されたRNA分子が外因性RNAセグメントを含む、請求項１
   記載のDNA送出プラットフォーム。
7. 【請求項７】 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターが植物細胞において
   機能することができる、請求項１記載のDNA送出プラットフォーム。
8. 【請求項８】 以下の段階を含む、１つまたはそれ以上の細胞の遺伝子型ま
   たは表現型を改変する方法： a）改変されたウイルスRNAをコードするポリヌクレオチド分子を含むDNA送出プ
   ラットフォームを得る段階；および b）１つまたはそれ以上の細胞に該DNA送出プラットフォームをトランスフェクト
   し、該ポリヌクレオチド分子が転写されて、それによって複製可能なRNA転写物
   を製造する段階。
9. 【請求項９】 少なくとも1つのトランス作用因子をコードする、少なくと
   も1つのポリヌクレオチド分子を有する細胞を予め形質転換する段階をさらに含
   む、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 トランス作用因子を導入する段階をさらに含む、請求項８
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 トランス作用因子を導入する段階が、該トランス作用因子
    をコードするヌクレオチド配列を含む発現プラスミドの同時トランスフェクショ
    ンを含む、請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】 トランス作用因子を導入する段階が、該トランス作用因子
    をコードするRNA転写物の同時トランスフェクションを含む、請求項10記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 トランス作用因子が安定的に発現される、請求項10記載の
    方法。
14. 【請求項１４】 改変されたウイルスRNAが外因性RNAセグメントを含む、請
    求項８記載の方法。
15. 【請求項１５】 DNA送出プラットフォームがリボザイム配列を含む、請求
    項８記載の方法。
16. 【請求項１６】 DNA送出プラットフォームがプロモーターを含む、請求項
    ８記載の方法。
17. 【請求項１７】 DNA送出プラットフォームが終結配列を含む、請求項８記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 DNA送出プラットフォームが制限酵素部位を含む、請求項
    ８記載の方法。
19. 【請求項１９】 請求項８記載の方法によって製造され、改変された細胞。
20. 【請求項２０】 遺伝子型または表現型が改変された少なくとも1つの細胞
    を含む植物または植物組織を製造する方法であって、該植物または植物組織の細
    胞にDNA送出プラットフォームをトランスフェクトする段階を含み、該DNA送出プ
    ラットフォームが、ポリヌクレオチド分子を転写して複製可能なRNA転写物を産
    生するように、改変されたRNA分子をコードする該ポリヌクレオチドを含む方法
    。
21. 【請求項２１】 改変されたRNA分子が外因性RNAセグメントを含む、請求項
    20記載の方法。
22. 【請求項２２】 DNA送出プラットフォームがリボザイム配列を含む、請求
    項20記載の方法。
23. 【請求項２３】 DNA送出プラットフォームがプロモーターを含む、請求項2
    0記載の方法。
24. 【請求項２４】 DNA送出プラットフォームが終結配列を含む、請求項20記
    載の方法。
25. 【請求項２５】 DNA送出プラットフォームが制限酵素部位を含む、請求項2
    0記載の方法。
26. 【請求項２６】 請求項８記載の方法によって製造され、改変された少なく
    とも1つの細胞を得る段階、および該改変された細胞を、それによって植物がそ
    こから再生されるような条件下に置く段階を含む、遺伝子型または表現型が改変
    された植物を製造する方法。
27. 【請求項２７】 請求項26記載の方法によって製造された植物。
28. 【請求項２８】 請求項27記載の植物の子孫である植物。
29. 【請求項２９】 植物または植物組織が、少なくとも1つのトランス作用因
    子をコードするポリヌクレオチド分子で形質転換した1つまたはそれ以上の細胞
    を含み、該ポリヌクレオチド分子を発現する、請求項20記載の方法。
30. 【請求項３０】 改変されたウイルスRNA分子が、少なくとも1つのトランス
    作用因子をコードするポリヌクレオチド分子によって形質転換された、１つまた
    はそれ以上の細胞のみで複製することができる、請求項29記載の方法。