JPH04121200A - 植物細胞におけるポリペプチドの製造法 - Google Patents
植物細胞におけるポリペプチドの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子工学的手法により、分節ゲノム型つイ
ルスブロムモサイクウイルス （ｂｒｏ＊ｅｓｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ 、以下ＢＭＶ
という）の増殖系を利用して植物細胞中において農業及
び医薬分野に有用な物質を生産する方法に関する。また
、本発明は、これらの方法に用いる植物形質転換用ベク
ター、組換えＲＮＡ転写ベクター及び形質転換植物細胞
に関する。
ルスブロムモサイクウイルス （ｂｒｏ＊ｅｓｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ 、以下ＢＭＶ
という）の増殖系を利用して植物細胞中において農業及
び医薬分野に有用な物質を生産する方法に関する。また
、本発明は、これらの方法に用いる植物形質転換用ベク
ター、組換えＲＮＡ転写ベクター及び形質転換植物細胞
に関する。
［従来の技術］
植物細胞に有用物質例えばポリペプチドを生産させる技
術として、ＴＩプラスミド形質転換系を用いて有益遺伝
子を植物に組み込み発現させる方法と植物ウィルスの増
殖系を利用した物質生産系が開発されつつある。しかし
ながら、これまで生産効率が低いことが問題点として指
摘されている。
術として、ＴＩプラスミド形質転換系を用いて有益遺伝
子を植物に組み込み発現させる方法と植物ウィルスの増
殖系を利用した物質生産系が開発されつつある。しかし
ながら、これまで生産効率が低いことが問題点として指
摘されている。
例えば、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）は宿主植物
中に最大２９／に９のウィルス粒子を生産するが、ＴＭ
Ｖ外被タンパクの遺伝子部分を目的物質の外来遺伝子に
置き換え宿主植物に接種した場合、目的物質の生産効率
は約１ ｍｙ／Ｋｓにすぎない（ＴａｋａｌａｔＳｔｌ
ら 、 （１９８７）ＥＭＢＯＪ 、 ６ ：
３０７−３１１）。効率が低下する原因として、ＴＭＶ
は１本ｗｉＲＮＡに４種類の遺伝子がオーバーラツプし
てコードされているため外来遺伝子の置き換えによって
ＴＭＶｌ製のＩＩｊＩＤ機構が彰饗を受けることによる
と考えられている。
中に最大２９／に９のウィルス粒子を生産するが、ＴＭ
Ｖ外被タンパクの遺伝子部分を目的物質の外来遺伝子に
置き換え宿主植物に接種した場合、目的物質の生産効率
は約１ ｍｙ／Ｋｓにすぎない（ＴａｋａｌａｔＳｔｌ
ら 、 （１９８７）ＥＭＢＯＪ 、 ６ ：
３０７−３１１）。効率が低下する原因として、ＴＭＶ
は１本ｗｉＲＮＡに４種類の遺伝子がオーバーラツプし
てコードされているため外来遺伝子の置き換えによって
ＴＭＶｌ製のＩＩｊＩＤ機構が彰饗を受けることによる
と考えられている。
一方、ＢＭＶは、ブロモウィルス群（ｂｒｏｍ。
ｖｉｒｕｓ ｏｒｏｕｐ ）に属し、イネ科に属する多
くの植物を宿主とする植物ウィルスである。ＢＭＶのゲ
ノムは３種のく＋）鎖の一本鎖ＲＮＡからなり、分子量
の大きいものから順にＲＮＡＩ、２及び３と呼ばれてい
る。さらに、ＢＭＷにはサブゲノムＲＮＡと呼ばれるＲ
ＮＡ４も存在する（第１図）。
くの植物を宿主とする植物ウィルスである。ＢＭＶのゲ
ノムは３種のく＋）鎖の一本鎖ＲＮＡからなり、分子量
の大きいものから順にＲＮＡＩ、２及び３と呼ばれてい
る。さらに、ＢＭＷにはサブゲノムＲＮＡと呼ばれるＲ
ＮＡ４も存在する（第１図）。
これらのＲＮＡは、直径的２ ｆ３ ｎｓの球状粒子中
にＲＮＡＩ及び２はそれぞれ単独で、ＲＮＡ３と４は共
に抱含されている（ Ｌａｎｅら、（１９７４）Ａｄｖ
、 Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ、 １９ ： １５１−２２０
）。
にＲＮＡＩ及び２はそれぞれ単独で、ＲＮＡ３と４は共
に抱含されている（ Ｌａｎｅら、（１９７４）Ａｄｖ
、 Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ、 １９ ： １５１−２２０
）。
ＢＭＶは感染植物細胞内における増殖量が多く、しかも
ゲノムが分割されているという特徴から、外被蛋白質遺
伝子への外来遺伝子の置き換えによってウィルス複製の
６１１１１１１機構が影響を受けにくいと考えられ、分
子生物学的物質生産の材料として研究されてきている。
ゲノムが分割されているという特徴から、外被蛋白質遺
伝子への外来遺伝子の置き換えによってウィルス複製の
６１１１１１１機構が影響を受けにくいと考えられ、分
子生物学的物質生産の材料として研究されてきている。
ＢＭＶ全ゲノムの塩基配列は解明されており（Ａｈｌｑ
ｕｉｓｔら、（１９８４）ＪＨｏｔ、 Ｂｉｏｌ、
１ ７ ２ コ ３６９−３８３） 、 ＲＮＡ
１は全長３２３４ＰＡ基で１８蛋白質（分子［１１０９
キロダルトン（ＫＤ））をコードし、ＲＮＡ２は全長２
８６５塩基で２ａ蛋白質（分子量９４ＫＤ）をコードし
ており、１ａ及び２ａ蛋白質は複製酵素のサブユニット
と考えられている。（＋）鎖のＢＭＶ ＲＮＡは植物
ＩＩＲ胞中で、この複製酵素によって、（＋）鎖から（
−）鎖が合成され、次に合成された（−）鎖を鋳型とし
て（＋）鎖が大優に合成されると考えられている。一方
、ＲＮＡ３は全長２１３４塩基で３ａ蛋白質（分子量３
４ＫＤ）及び外被蛋白質（分子量２０ＫＤ）の二つの遺
伝子産物をコードしているが、ＲＮＡ３から直接翻訳さ
れるのは５′側の３８蛋白質だけである。
ｕｉｓｔら、（１９８４）ＪＨｏｔ、 Ｂｉｏｌ、
１ ７ ２ コ ３６９−３８３） 、 ＲＮＡ
１は全長３２３４ＰＡ基で１８蛋白質（分子［１１０９
キロダルトン（ＫＤ））をコードし、ＲＮＡ２は全長２
８６５塩基で２ａ蛋白質（分子量９４ＫＤ）をコードし
ており、１ａ及び２ａ蛋白質は複製酵素のサブユニット
と考えられている。（＋）鎖のＢＭＶ ＲＮＡは植物
ＩＩＲ胞中で、この複製酵素によって、（＋）鎖から（
−）鎖が合成され、次に合成された（−）鎖を鋳型とし
て（＋）鎖が大優に合成されると考えられている。一方
、ＲＮＡ３は全長２１３４塩基で３ａ蛋白質（分子量３
４ＫＤ）及び外被蛋白質（分子量２０ＫＤ）の二つの遺
伝子産物をコードしているが、ＲＮＡ３から直接翻訳さ
れるのは５′側の３８蛋白質だけである。
ＲＮＡ４は全長８７６塩基でＲＮＡ３の外被蛋白質遺伝
子部分と同一の配列を持ち外被蛋白質のｍＲＮＡとなり
、ＲＮＡ４は宿主細胞中でＲＮＡ３から合成される（＾
旧ｑｕｉｓｔら、（１９８１）Ｊ。
子部分と同一の配列を持ち外被蛋白質のｍＲＮＡとなり
、ＲＮＡ４は宿主細胞中でＲＮＡ３から合成される（＾
旧ｑｕｉｓｔら、（１９８１）Ｊ。
Ｎｏｔ、 ８ｉｏ１． １５３；２３−３８）。その
機構は、ＲＮＡ３ （＋）鎖から（−）鎖が合成され、
この（−）鎖の内部からＲＮＡ４ （＋）鎖が合成され
ることによることが明らかになった（ Ｈｉ ｌ Ｉｅ
ｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６８−７
０＞。
機構は、ＲＮＡ３ （＋）鎖から（−）鎖が合成され、
この（−）鎖の内部からＲＮＡ４ （＋）鎖が合成され
ることによることが明らかになった（ Ｈｉ ｌ Ｉｅ
ｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６８−７
０＞。
Ａｈｌｑｕｉｓｔらは、ＲＮＡ３から外被蛋白質遺伝子
の大部分を取り除き、その部分にクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入し
た組換えＲＮＡ３をＲＮＡ１及び２とともにオオムギブ
ロトブラストに感染させ、高レベルのＣＡＴが発現する
ことに成功しているが、このベクター系では植物体での
発現には利用できなかった（ＡｈｌＱｕｉＳｔら、（１
９８６） ５ｃｉｅｎｃｅ １２３１．１２９４−１２
９７＞。本発明者は、さらに優れた生産方法を提供すべ
くＢＭＶ遺伝子を研究した結果本発明を完成した。
の大部分を取り除き、その部分にクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入し
た組換えＲＮＡ３をＲＮＡ１及び２とともにオオムギブ
ロトブラストに感染させ、高レベルのＣＡＴが発現する
ことに成功しているが、このベクター系では植物体での
発現には利用できなかった（ＡｈｌＱｕｉＳｔら、（１
９８６） ５ｃｉｅｎｃｅ １２３１．１２９４−１２
９７＞。本発明者は、さらに優れた生産方法を提供すべ
くＢＭＶ遺伝子を研究した結果本発明を完成した。
［発明の解決すべき課題］
上記のように、植物ウィルスを用いた物質生産において
高収率の系はいまだ開発されていない。
高収率の系はいまだ開発されていない。
ＢＭＶのベクター化の方法においても、ＢＭＶの各ゲノ
ムを植物ゲノムに導入し発現させた例はなく、外被蛋白
質遺伝子を外来遺伝子と置換した組換えＲＮＡ３とＲＮ
ＡＩ及び２を混合して植物プロトプラストに接種し、プ
ロトプラスト内で外来遺伝子を生産するものであり（第
１２図その１）、プロトプラストへのＲＮＡ感染効率が
低いこと並びに組換えウィルスＲＮＡが全身感染できな
いこともあり、個々の細胞における発現量が少ないとい
う問題点が存在する。さらに、ウィルスＲＮＡをインビ
トロ的に生産することは、生産効率及びコストという点
で産業化における大きな欠点である。従ッテ、ＢＭＶ
ＲＮＡをｃＤＮＡ化し、植物細胞中で発現できるよう
に改造し並びに外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子と置換し
た組換えＲＮＡ３を構築し、それらを例えばＴ１プラス
ミド等の植物細胞形質転換に用いられるベクターＤＮＡ
に組み込み、それらのＤＮＡで植物細胞を形質転換して
ＢＭＶ各ゲノムを発現させる等の遺伝子工学技術を用い
ることにより、ＢＭＶ各ゲノム及び外来遺伝子が全ての
細胞で大量に発現できるポリペプチド製造法の開発が持
ち望まれている（第１２図その２）。この場合、ウィル
スＲＮＡが大量に増殖すると植物に対して病徴を引き起
こし植物の生育に悪影響を及ぼすため、外来遺伝子以外
のウィルスＲＮＡの増殖は必ずしも必要でないと考えら
れることから、例えばＲＮＡＩ及び２の増殖能を欠如し
翻訳能のみを残し、その結果、１ａ及び２ａ蛋白質（Ｂ
ＭＶ ＲＮＡ複製酊素〉のみが翻訳されるように、ウ
ィルスゲノムを改造する方法も持ち望まれている。
ムを植物ゲノムに導入し発現させた例はなく、外被蛋白
質遺伝子を外来遺伝子と置換した組換えＲＮＡ３とＲＮ
ＡＩ及び２を混合して植物プロトプラストに接種し、プ
ロトプラスト内で外来遺伝子を生産するものであり（第
１２図その１）、プロトプラストへのＲＮＡ感染効率が
低いこと並びに組換えウィルスＲＮＡが全身感染できな
いこともあり、個々の細胞における発現量が少ないとい
う問題点が存在する。さらに、ウィルスＲＮＡをインビ
トロ的に生産することは、生産効率及びコストという点
で産業化における大きな欠点である。従ッテ、ＢＭＶ
ＲＮＡをｃＤＮＡ化し、植物細胞中で発現できるよう
に改造し並びに外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子と置換し
た組換えＲＮＡ３を構築し、それらを例えばＴ１プラス
ミド等の植物細胞形質転換に用いられるベクターＤＮＡ
に組み込み、それらのＤＮＡで植物細胞を形質転換して
ＢＭＶ各ゲノムを発現させる等の遺伝子工学技術を用い
ることにより、ＢＭＶ各ゲノム及び外来遺伝子が全ての
細胞で大量に発現できるポリペプチド製造法の開発が持
ち望まれている（第１２図その２）。この場合、ウィル
スＲＮＡが大量に増殖すると植物に対して病徴を引き起
こし植物の生育に悪影響を及ぼすため、外来遺伝子以外
のウィルスＲＮＡの増殖は必ずしも必要でないと考えら
れることから、例えばＲＮＡＩ及び２の増殖能を欠如し
翻訳能のみを残し、その結果、１ａ及び２ａ蛋白質（Ｂ
ＭＶ ＲＮＡ複製酊素〉のみが翻訳されるように、ウ
ィルスゲノムを改造する方法も持ち望まれている。
［課題を解決するための手段］
本発明は、ＢＭＶの植物細胞内の増殖系を利用してポリ
ペプチド等の有用物質を遺伝子工学的に植物において生
産する方法に関し、 （１） 植物ゲノムにＢＭｖのＲＮＡ１及び／又は２
のｃＤＮＡ及びＢＭＶ ＲＮＡ外被蛋白質遺伝子の全
部又は一部を所望のポリペプチドの構造遺伝子と組換え
た組換えＢＭＶ ＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入又は接種
することによって、所望のポリペプチドを発現すること
を特徴とするポリペプチドの製造法。
ペプチド等の有用物質を遺伝子工学的に植物において生
産する方法に関し、 （１） 植物ゲノムにＢＭｖのＲＮＡ１及び／又は２
のｃＤＮＡ及びＢＭＶ ＲＮＡ外被蛋白質遺伝子の全
部又は一部を所望のポリペプチドの構造遺伝子と組換え
た組換えＢＭＶ ＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入又は接種
することによって、所望のポリペプチドを発現すること
を特徴とするポリペプチドの製造法。
（２）植物ゲノムにＢＭＶのＲＮＡ１及び／又は２のｃ
ＤＮＡを導入することによって、１ａ及び又は２ａ蛋白
質を生産し、該植物細胞に組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を
接種することによって、ポリペプチドを発現することを
特徴とするポリペプチドの製造法。
ＤＮＡを導入することによって、１ａ及び又は２ａ蛋白
質を生産し、該植物細胞に組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を
接種することによって、ポリペプチドを発現することを
特徴とするポリペプチドの製造法。
（３） 上記ｃＤＮＡが、完全長ｃＤＮＡ若しくは３
′末端末非翻訳領域に欠失を持つｃＤＮＡである請求項
７又は２記載の製造法。
′末端末非翻訳領域に欠失を持つｃＤＮＡである請求項
７又は２記載の製造法。
（４） インビトロ的に機能的なプロモーターとＢ
Ｍ Ｖ （Ｄ ＲＮ Ａ ３ ｃ Ｄ Ｎ Ａ カラ
なルヘクターテあって、ＢＭＶ ＲＮＡａ外被蛋白質
遺伝子の全部または一部を所望のポリペプチドの構造遺
伝子と組換えた組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を生産する転
写ベクター （５１１！求項１又は２記載の製ｍａに使用するための
、植物細胞中で機能的なプロモーター及びターミネータ
−閤に、ＢＭＶ ＲＮＡＩ、２又は３のｃＤＮＡを導
入した植物形質転換用ベクター（６） 上記ｃＤＮＡ
が完全長ｃＤＮＡ若しくは３′末端末非翻訳領域に欠失
を持つｃＤＮＡである請求項５のベクター （７）請求項５又は６記載のベクターで形質転換された
植物細胞。
Ｍ Ｖ （Ｄ ＲＮ Ａ ３ ｃ Ｄ Ｎ Ａ カラ
なルヘクターテあって、ＢＭＶ ＲＮＡａ外被蛋白質
遺伝子の全部または一部を所望のポリペプチドの構造遺
伝子と組換えた組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を生産する転
写ベクター （５１１！求項１又は２記載の製ｍａに使用するための
、植物細胞中で機能的なプロモーター及びターミネータ
−閤に、ＢＭＶ ＲＮＡＩ、２又は３のｃＤＮＡを導
入した植物形質転換用ベクター（６） 上記ｃＤＮＡ
が完全長ｃＤＮＡ若しくは３′末端末非翻訳領域に欠失
を持つｃＤＮＡである請求項５のベクター （７）請求項５又は６記載のベクターで形質転換された
植物細胞。
に関する。
以下、詳細に説明する。
（１） ＢＭＶ
本発明において、利用されるＢＭＶは、米国のＡＴＣＣ
（＾５ｅｒｉｃａｎ Ｔｙρｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ＞にＡＴＣＣＮｎ６６として寄託され
ている。
（＾５ｅｒｉｃａｎ Ｔｙρｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ＞にＡＴＣＣＮｎ６６として寄託され
ている。
上記ＢＭＶのゲノムは、第１図に示したように４種類の
ＲＮＡに分かれている。
ＲＮＡに分かれている。
このＢＭＶ ＲＮＡのうち本発明において、植物ゲノ
ムに導入されるべく改造される部分は、第１図のＲＮＡ
Ｉ、２及び、又は、３であり、改造されたＲＮＡ３のう
ち所望のポリペプチドの構造遺伝子によって組換えられ
るのは３′末端側の外被蛋白質遺伝子部分である。
ムに導入されるべく改造される部分は、第１図のＲＮＡ
Ｉ、２及び、又は、３であり、改造されたＲＮＡ３のう
ち所望のポリペプチドの構造遺伝子によって組換えられ
るのは３′末端側の外被蛋白質遺伝子部分である。
ＢＭＶ ＲＮＡ、ＲＮＡ抽出法として公知の方法たと
えばグアニジン法、熱フェノール法、ラウリル１ｉｉｌ
ｌナトリウム（ＳＤＳ）フェノール法等を用いウィルス
粒子から抽出し、アガロースゲル電気泳動でＲＮＡ１．
２及び３を分画精！！ｉする。それぞれのＢＭＶ Ｒ
ＮＡの相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の構築は、常法の遺伝
子操作技術を利用して行なうことができる（Ａｈｌｑｕ
ｉｓｔら、（１９８４） 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、 １７２ ；３６９−３８３ ５ａｅｂｒｏｏｋ
ら、 （１９８９） ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ 、Ｃ３ＨＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、 ）本発明において、ＢＭＶ
ＲＮＡ１及び２のｃＤＮＡは、形質転換用ベクター
に組換えられ、植物細胞中でＲＮＡ１及び２、あるいは
１ａ及び２ａ蛋白質が生産される。ＢＭＶ ＲＮＡ３
のｃＤＮＡは、外被蛋白質部分が所望のポリペプチドの
構造遺伝子に旨き換えられ、形質転換用ベクターに組換
えられ、植物に接種するかあるいは植物ゲノムに導入さ
れる。
えばグアニジン法、熱フェノール法、ラウリル１ｉｉｌ
ｌナトリウム（ＳＤＳ）フェノール法等を用いウィルス
粒子から抽出し、アガロースゲル電気泳動でＲＮＡ１．
２及び３を分画精！！ｉする。それぞれのＢＭＶ Ｒ
ＮＡの相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の構築は、常法の遺伝
子操作技術を利用して行なうことができる（Ａｈｌｑｕ
ｉｓｔら、（１９８４） 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、 １７２ ；３６９−３８３ ５ａｅｂｒｏｏｋ
ら、 （１９８９） ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ 、Ｃ３ＨＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、 ）本発明において、ＢＭＶ
ＲＮＡ１及び２のｃＤＮＡは、形質転換用ベクター
に組換えられ、植物細胞中でＲＮＡ１及び２、あるいは
１ａ及び２ａ蛋白質が生産される。ＢＭＶ ＲＮＡ３
のｃＤＮＡは、外被蛋白質部分が所望のポリペプチドの
構造遺伝子に旨き換えられ、形質転換用ベクターに組換
えられ、植物に接種するかあるいは植物ゲノムに導入さ
れる。
所望のポリペプチドとしては、本発明の実施例に示すＧ
ＵＳ遺伝子に限定されず、ＴＭＶ等の植物ウィルスの外
被蛋白質遺伝子、ササゲトリブシンインヒビター遺伝子
の他にインターフェロン遺伝子等を挙げることができる
。
ＵＳ遺伝子に限定されず、ＴＭＶ等の植物ウィルスの外
被蛋白質遺伝子、ササゲトリブシンインヒビター遺伝子
の他にインターフェロン遺伝子等を挙げることができる
。
そのために使用される形質転換用ベクターとしては、第
２図に示した第−型（ｐＢＪｃＢＲベクター）及び第二
型（ｐＢ Ｉ ＣＢＭＲベクター）の２種類のベクター
である。２種類のベクターとも完全な１ａあるいは２ａ
ｌ訳領域を保持するが、第−型ベクターは、ＢＭＶ
ＲＮＡの５′末端及び３′末端の完全な非翻訳領域を保
持する。それに対して、第二型ベクターは、完全な５′
末端末非翻訳領域を持つが、３′末端末非翻訳領域に欠
失を持つ。ＢＭＶ ＲＮＡの５′末端末非翻訳領域は
、翻訳能及び（−）鎖から（＋）鎖の合成に必須であり
、３′末端末非翻訳領域は、（＋）鎖から（−）鎖の合
成に必須である。そのため、３′末端末非翻訳領域の欠
失は、（＋）鎖から（−）鎖の合成の欠失につながりウ
ィルスＲＮＡの増殖能を失わせることなるが、翻訳能に
影響を及ぼさない。
２図に示した第−型（ｐＢＪｃＢＲベクター）及び第二
型（ｐＢ Ｉ ＣＢＭＲベクター）の２種類のベクター
である。２種類のベクターとも完全な１ａあるいは２ａ
ｌ訳領域を保持するが、第−型ベクターは、ＢＭＶ
ＲＮＡの５′末端及び３′末端の完全な非翻訳領域を保
持する。それに対して、第二型ベクターは、完全な５′
末端末非翻訳領域を持つが、３′末端末非翻訳領域に欠
失を持つ。ＢＭＶ ＲＮＡの５′末端末非翻訳領域は
、翻訳能及び（−）鎖から（＋）鎖の合成に必須であり
、３′末端末非翻訳領域は、（＋）鎖から（−）鎖の合
成に必須である。そのため、３′末端末非翻訳領域の欠
失は、（＋）鎖から（−）鎖の合成の欠失につながりウ
ィルスＲＮＡの増殖能を失わせることなるが、翻訳能に
影響を及ぼさない。
第−型ベクターを用いて植物ゲノム内Ｇ、：ＢＭＶ
ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入した場合、導入細胞では
合成された転写物は野生型ウィルスＲＮＡと同じように
増殖し、また翻訳も行なわれる。一方、第二型ベクター
を用いて植物ゲノム内にＢＭＶＲＮＡの３′末端欠失ｃ
ＤＮＡを導入した場合、導入細胞では合成された転写物
は増殖しないが翻訳は行なわれ翻訳産物のみが生産され
る。ウィルスＲＮＡが大量に増殖すると植物に対して病
徴を引き起こし植物の生育に悪影響を及ぼすと考えられ
ることから、このような問題点を解決するためには第二
型ベクターを使用すれば良い。
ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入した場合、導入細胞では
合成された転写物は野生型ウィルスＲＮＡと同じように
増殖し、また翻訳も行なわれる。一方、第二型ベクター
を用いて植物ゲノム内にＢＭＶＲＮＡの３′末端欠失ｃ
ＤＮＡを導入した場合、導入細胞では合成された転写物
は増殖しないが翻訳は行なわれ翻訳産物のみが生産され
る。ウィルスＲＮＡが大量に増殖すると植物に対して病
徴を引き起こし植物の生育に悪影響を及ぼすと考えられ
ることから、このような問題点を解決するためには第二
型ベクターを使用すれば良い。
ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２、又は組換えＲＮＡ３のｃＤ
ＮＡは植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼによってＷｌ減されるプロモーター及びターミネー
タ−の間に導入されなければならない。このような植物
細胞中で機能的なプロモーター及びターミネータとして
は、カリフラワーモザイクウィルス（ｃａｕｌｉｆｌｏ
ｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ１以下ＣａＭＶ）３
５Ｓプロモーター及びＣａＭＶターミネータ−等で代表
される植物細胞中で機能的なターミネータ−等がある。
ＮＡは植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼによってＷｌ減されるプロモーター及びターミネー
タ−の間に導入されなければならない。このような植物
細胞中で機能的なプロモーター及びターミネータとして
は、カリフラワーモザイクウィルス（ｃａｕｌｉｆｌｏ
ｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ１以下ＣａＭＶ）３
５Ｓプロモーター及びＣａＭＶターミネータ−等で代表
される植物細胞中で機能的なターミネータ−等がある。
５′末端に余分な７塩基の塩基配列を持つ変異ＢＭＶ
ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎｄａら、
（１９８７）ＶｉｒｏｌｏｇＶｌ ５８ ： ２５９−
２６８）が明らかになっているため、植物細胞に導入し
たＢＭＶＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に翻訳能
力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点をＢＭＶ
ＲＮＡの５′末端と正確に一致させる必要がある。
ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎｄａら、
（１９８７）ＶｉｒｏｌｏｇＶｌ ５８ ： ２５９−
２６８）が明らかになっているため、植物細胞に導入し
たＢＭＶＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に翻訳能
力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点をＢＭＶ
ＲＮＡの５′末端と正確に一致させる必要がある。
ＣａＭＶの３５８プロモーターを用いた場合、転写開始
点のすぐ下流にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導
入するために、ＣａＭＶの３５８プロモーターの転写開
始点に部位特異的突然変異導入法によって平滑末端を生
じさすような制限酵素のＩｆ識部位（ＳｔｕＩ等）を導
入し、ＢＭＶＲＮＡのｃＤＮＡを平滑末端化した転写開
始点のすぐ下流に導入する。
点のすぐ下流にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導
入するために、ＣａＭＶの３５８プロモーターの転写開
始点に部位特異的突然変異導入法によって平滑末端を生
じさすような制限酵素のＩｆ識部位（ＳｔｕＩ等）を導
入し、ＢＭＶＲＮＡのｃＤＮＡを平滑末端化した転写開
始点のすぐ下流に導入する。
（３） 用ベクターによる形質転換体の
作製 アグロバクテリウム・ツメフ７シェンス（組皿坤μ！吐
ルｔｕ■＋Ｊａｃｉｅｎｓ ）を用いた植物形質転換法
としては、リーフディスク法（Ｈｏｒｓｃｈら、（１９
８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ ； １２２９−１２
３１）が最も一般に利用されるＴ１プラスミドにはｖｉ
ｒ領域があり、この領域の働きによって、Ｔｉプラスミ
ド中のＴ−ＮＤＡｉ域を虹ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓの宿
主細胞ゲノム中に導入できる（ ＨａＳｔｅｒら、 （
１９８４） Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ、３５ ；３８７−４１３＞。Ｔ１プラスミ
ドを用いた遺伝子導入法としては、坦在バイナリーベク
ター法が広く用いられている。これは、Ｔｉプラスミド
をＴ−ＤＮＡが欠失しｖｉｒ領域を持つ７ｉプラスミド
とＴ−ＤＮＡを含むバイナリ−ベクターに分割して用い
るものである。バイナリ−ベクターとはＡ、 ｔｕｓｅ
ｆａｃｉｅｎｓでも大Ｓ菌でも増殖できるベクターであ
る。それぞれのプロモーター、ＢＭＶ ｃＤＮＡ及び
ターミネータ−で構成されるＤＮＡは、バイナリ−ベク
ター中のＴ−ＤＮＡ領域に組み込まれ、形質転換用ベク
ターがｓＩ！される。このような形質転換用ベクターを
Ｔ−ＤＮＡが欠失しｖｉｒ領域を持つＴ１プラスミドを
保持するＡ ｔｕ■ｅ’ｆａｃｉｅｎｓｌ［９中に導入
し、該Ａ、 ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓを宿主植物に接種
すれば、ｖｉｒｊｉｌ域の働きによって、該組み合わせ
の構成カラ’Ｋ ルＤ Ｎ Ａ ヲ含ムＴ Ｄ Ｎ
Ａ ｆｆ４１ａ ヲＭ 主’７” ／ム中に導入しうる
。その他の公知の遺伝子導入法、すなわちプロトプラス
トへのエレクトロボーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎ ）法、リボゾーム融合、マイクロインジ
ェクション、植物組織へのパーティクルガン（ｐａｒｔ
ｉｃｌｅ ＱＬＩｎ）あるいはそれらに準じた方法等に
よっても、該組み合わせの構成からなるＤＮＡを植物細
胞に導入できる。
作製 アグロバクテリウム・ツメフ７シェンス（組皿坤μ！吐
ルｔｕ■＋Ｊａｃｉｅｎｓ ）を用いた植物形質転換法
としては、リーフディスク法（Ｈｏｒｓｃｈら、（１９
８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ ； １２２９−１２
３１）が最も一般に利用されるＴ１プラスミドにはｖｉ
ｒ領域があり、この領域の働きによって、Ｔｉプラスミ
ド中のＴ−ＮＤＡｉ域を虹ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓの宿
主細胞ゲノム中に導入できる（ ＨａＳｔｅｒら、 （
１９８４） Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ、３５ ；３８７−４１３＞。Ｔ１プラスミ
ドを用いた遺伝子導入法としては、坦在バイナリーベク
ター法が広く用いられている。これは、Ｔｉプラスミド
をＴ−ＤＮＡが欠失しｖｉｒ領域を持つ７ｉプラスミド
とＴ−ＤＮＡを含むバイナリ−ベクターに分割して用い
るものである。バイナリ−ベクターとはＡ、 ｔｕｓｅ
ｆａｃｉｅｎｓでも大Ｓ菌でも増殖できるベクターであ
る。それぞれのプロモーター、ＢＭＶ ｃＤＮＡ及び
ターミネータ−で構成されるＤＮＡは、バイナリ−ベク
ター中のＴ−ＤＮＡ領域に組み込まれ、形質転換用ベク
ターがｓＩ！される。このような形質転換用ベクターを
Ｔ−ＤＮＡが欠失しｖｉｒ領域を持つＴ１プラスミドを
保持するＡ ｔｕ■ｅ’ｆａｃｉｅｎｓｌ［９中に導入
し、該Ａ、 ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓを宿主植物に接種
すれば、ｖｉｒｊｉｌ域の働きによって、該組み合わせ
の構成カラ’Ｋ ルＤ Ｎ Ａ ヲ含ムＴ Ｄ Ｎ
Ａ ｆｆ４１ａ ヲＭ 主’７” ／ム中に導入しうる
。その他の公知の遺伝子導入法、すなわちプロトプラス
トへのエレクトロボーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎ ）法、リボゾーム融合、マイクロインジ
ェクション、植物組織へのパーティクルガン（ｐａｒｔ
ｉｃｌｅ ＱＬＩｎ）あるいはそれらに準じた方法等に
よっても、該組み合わせの構成からなるＤＮＡを植物細
胞に導入できる。
形質転換体の選抜には、カナマイシン、ハイグロマイシ
ン、ホスホトリシン等の薬剤を用いることが出来る。形
質転換体は、適宜の培地で培養してカルス形成、カルス
増殖、さらに必要に応じて不定胚分化または器官分化を
行ない、ついで植物ホルモンを添加した植物体再分化用
培地で植物体に再生させることができる。
ン、ホスホトリシン等の薬剤を用いることが出来る。形
質転換体は、適宜の培地で培養してカルス形成、カルス
増殖、さらに必要に応じて不定胚分化または器官分化を
行ない、ついで植物ホルモンを添加した植物体再分化用
培地で植物体に再生させることができる。
双子葉植物に本発明を使用する場合には、対象の植物は
、野菜、たとえばニンジン、レスタ、ジャガイモ、等：
他の収穫物、たとえばタバコ、ナタネ、ダイス、ベニバ
ナ、等を含む。単子葉植物に使用する場合には、＾、
ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓを用いた手法は利用できないが
、プロトプラストへのエレクトロボーレーション（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、リボゾーム融合、マ
イクロインジェクション、植物組織へのパーティクルガ
ン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｕｎ）を用い導入可能であり
、対象の植物は、穀類、たとえば小麦、大麦、トウモロ
コシ、イネである。
、野菜、たとえばニンジン、レスタ、ジャガイモ、等：
他の収穫物、たとえばタバコ、ナタネ、ダイス、ベニバ
ナ、等を含む。単子葉植物に使用する場合には、＾、
ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓを用いた手法は利用できないが
、プロトプラストへのエレクトロボーレーション（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、リボゾーム融合、マ
イクロインジェクション、植物組織へのパーティクルガ
ン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｕｎ）を用い導入可能であり
、対象の植物は、穀類、たとえば小麦、大麦、トウモロ
コシ、イネである。
第−型又は第二型ベクターを用いてＢＭＶＲＮＡＩ及び
２のｃＤＮＡを導入して形質転換細胞中では生物活性を
持つ１ａ及び２ａ蛋白質が全ての細胞で発現される。つ
まり、このような形質転換ａｒｍ中では、多粒子型ウィ
ルスの分節ゲノムをウィルスの制御機構から独立させ、
植物の転写及び翻訳機構に依存して発現させることがで
きる。
２のｃＤＮＡを導入して形質転換細胞中では生物活性を
持つ１ａ及び２ａ蛋白質が全ての細胞で発現される。つ
まり、このような形質転換ａｒｍ中では、多粒子型ウィ
ルスの分節ゲノムをウィルスの制御機構から独立させ、
植物の転写及び翻訳機構に依存して発現させることがで
きる。
（第１２図その２）。又、まずＲＮＡ１及び２のｃＤＮ
Ａを導入した形質転換細胞中に形質転換用ベクターを用
いて組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入する
か、もしくは組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３を接種すれば
、既に形質転換細胞中で生産されている１ａ及び２ａ蛋
白質の働きにより、組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３から組
換えＲＮＡ４又はＲＮＡ４が転写され、組換えＲＮＡ４
又はＲＮＡ４から植物の翻訳機構を利用して大鰻の所望
の生産すべきポリペプチド又は外被蛋白質を生産するこ
ともできる。
Ａを導入した形質転換細胞中に形質転換用ベクターを用
いて組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入する
か、もしくは組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３を接種すれば
、既に形質転換細胞中で生産されている１ａ及び２ａ蛋
白質の働きにより、組換えＲＮＡ３又はＲＮＡ３から組
換えＲＮＡ４又はＲＮＡ４が転写され、組換えＲＮＡ４
又はＲＮＡ４から植物の翻訳機構を利用して大鰻の所望
の生産すべきポリペプチド又は外被蛋白質を生産するこ
ともできる。
（４）組換えＢＭＶ ＲＮＡ３転写ベクターの構！
本発明において、所望の生産すべきポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、インビトロ的に転写産物を生産するた
めの転写ベクターに組換えられた後、該組換え転写ベク
ターにより、ＲＮＡとして生産しても良い。
ドするＤＮＡは、インビトロ的に転写産物を生産するた
めの転写ベクターに組換えられた後、該組換え転写ベク
ターにより、ＲＮＡとして生産しても良い。
ＢＭＶ ＲＮＡをインビトロ的に合成するには、ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼが不可欠である。
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼが不可欠である。
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼ等が市販されている。本発明では、ブロモ−タ
ー領域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかにな
っており並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ（ＤＬｌｎｎら、（１９８３）Ｊ、 Ｍｏ１． Ｖ
＋ｏ１． １６６ ： ４７７−５３５〉を用いたイン
ビトロＢＭＶ ＲＮＡ合成系を利用した。ウィルスＲ
ＮＡの５′末端の核酸の構造は、ウィルスＲＮＡの複製
や翻訳等において非常に壷要な機能を持っており、５′
末端に余分な塩基配列が付加されるとウィルスＲＮＡの
生物活性は激減することが報告されている（ Ｊａｎｄ
ａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏ（ｌＶｌ ５８ ：
２５９−２６２）。
ーゼ、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼ等が市販されている。本発明では、ブロモ−タ
ー領域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかにな
っており並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ（ＤＬｌｎｎら、（１９８３）Ｊ、 Ｍｏ１． Ｖ
＋ｏ１． １６６ ： ４７７−５３５〉を用いたイン
ビトロＢＭＶ ＲＮＡ合成系を利用した。ウィルスＲ
ＮＡの５′末端の核酸の構造は、ウィルスＲＮＡの複製
や翻訳等において非常に壷要な機能を持っており、５′
末端に余分な塩基配列が付加されるとウィルスＲＮＡの
生物活性は激減することが報告されている（ Ｊａｎｄ
ａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏ（ｌＶｌ ５８ ：
２５９−２６２）。
そのため、野生型と同一の５′末端の塩基配列を持つウ
ィルスＲＮＡをインごトロ的に合成するには、ｃＤＮＡ
の５′末端から正確に転写が開始されねばならない。従
って、転写開始点を平滑末端化し、ＢＭＶ ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｔ７プロモーターの
転写開始点に平滑末端を生じさせる制限酵素認識部位を
導入すれば良い。例えば、２種の３１塩基からなる合成
オリゴヌクレオチドｄ（ＣＴ＾ＧＡＴＧＣ＾ＴＡＴ＾Ｇ
ＴＧＡＧＴＣＧＴ＾丁ＴＡＡ丁丁ＴＡ ） 及びｄ
（＾ＧＣＴＴＡＡＡ丁ＴＡ＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
＾■＾ＴＧＣ＾■）の５′及び３′末端をリン酸化した
後アニーリングして、Ｔ７プロモーターのコンセンサス
配列の他に５′末端にＨｉｎｄ１１部位、３′末端にＸ
ｂａＩ部位を突出して持ち、さらに、転写開始点から（
＋４）の位置にＮ５ｉＩ部位を持つＴ７プロモーターを
合成し、このような合成Ｔ７プロモーターをＤＬＩＣ１
９のｌ−１ｉ ｎｄｎ［／Ｘｂａ工部位に導入し転写ベ
クターｐＵｃＴ （第３図）をＩＩ築する。ｐＬＩｃＴ
にＮｓｉ工切断およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行
ない、Ｔ７プロモーターの（＋１）位までの塩基を除去
しく−１）位の塩基対で平滑末端を形成させ、ＢＭＶ
ＲＮＡｃＤＮＡを含む５ｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩと、Ｎ
５ｉＪ切断及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後ＥＣ０Ｒ
Ｉ切断を行なったｐＬＩｃＴの大断片をライゲーション
し、ＢＭＶ ＲＮＡ３の転写ベクターｐＢＴＦ３が構
築される（第３図）。
ィルスＲＮＡをインごトロ的に合成するには、ｃＤＮＡ
の５′末端から正確に転写が開始されねばならない。従
って、転写開始点を平滑末端化し、ＢＭＶ ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｔ７プロモーターの
転写開始点に平滑末端を生じさせる制限酵素認識部位を
導入すれば良い。例えば、２種の３１塩基からなる合成
オリゴヌクレオチドｄ（ＣＴ＾ＧＡＴＧＣ＾ＴＡＴ＾Ｇ
ＴＧＡＧＴＣＧＴ＾丁ＴＡＡ丁丁ＴＡ ） 及びｄ
（＾ＧＣＴＴＡＡＡ丁ＴＡ＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
＾■＾ＴＧＣ＾■）の５′及び３′末端をリン酸化した
後アニーリングして、Ｔ７プロモーターのコンセンサス
配列の他に５′末端にＨｉｎｄ１１部位、３′末端にＸ
ｂａＩ部位を突出して持ち、さらに、転写開始点から（
＋４）の位置にＮ５ｉＩ部位を持つＴ７プロモーターを
合成し、このような合成Ｔ７プロモーターをＤＬＩＣ１
９のｌ−１ｉ ｎｄｎ［／Ｘｂａ工部位に導入し転写ベ
クターｐＵｃＴ （第３図）をＩＩ築する。ｐＬＩｃＴ
にＮｓｉ工切断およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行
ない、Ｔ７プロモーターの（＋１）位までの塩基を除去
しく−１）位の塩基対で平滑末端を形成させ、ＢＭＶ
ＲＮＡｃＤＮＡを含む５ｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩと、Ｎ
５ｉＪ切断及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後ＥＣ０Ｒ
Ｉ切断を行なったｐＬＩｃＴの大断片をライゲーション
し、ＢＭＶ ＲＮＡ３の転写ベクターｐＢＴＦ３が構
築される（第３図）。
組換えＢＭＶ ＲＮＡ３転写ベクターを構築するため
の材料としてはｐＢＴＦ３ベクターが利用される。ｐＢ
ＴＦ３ベクターは、第４図の制限酵素地図により特徴づ
けられるものである。すなわちｐＢＴＦ３ベクターは、
Ｔ７プロモーターとＢＭＶ ＲＮＡ３ ｃＤＮＡ及
び大ｍｍのべ’ｙｔｉ−であるｐＵＣベクターの遺伝子
とを含むベクターである。上記ベクターの外被蛋白質遺
伝子部分内にある５ｔｕＩ制限酵素切断部位にリンカ−
等を接合させることによって５ａｃＩ制限酵素切断部位
に置き換え、５ａＣＩ／５ａｃＩ断片（ＮＱＩ４７８−
１７８２）を取り除きセルフライゲーションによってｐ
ＢＴＦ３ （Ｓａｃ）ベクターを構築する。
の材料としてはｐＢＴＦ３ベクターが利用される。ｐＢ
ＴＦ３ベクターは、第４図の制限酵素地図により特徴づ
けられるものである。すなわちｐＢＴＦ３ベクターは、
Ｔ７プロモーターとＢＭＶ ＲＮＡ３ ｃＤＮＡ及
び大ｍｍのべ’ｙｔｉ−であるｐＵＣベクターの遺伝子
とを含むベクターである。上記ベクターの外被蛋白質遺
伝子部分内にある５ｔｕＩ制限酵素切断部位にリンカ−
等を接合させることによって５ａｃＩ制限酵素切断部位
に置き換え、５ａＣＩ／５ａｃＩ断片（ＮＱＩ４７８−
１７８２）を取り除きセルフライゲーションによってｐ
ＢＴＦ３ （Ｓａｃ）ベクターを構築する。
ｐＢＴＦ３ （Ｓａｃ）への外来ＤＮＡ断片の導入は、
ＡＴＧ翻訳開始コドンをその中に有する外来ＤＮＡ断片
を上記ベクターのＨｒｎｃｉ−８ａｃＩ部位に導入する
。Ｉ）ＢｒＦ３ （Ｓａｃ）ベクターＨｉ ｎｃｌ［−
８ａｃＩ部位に外来ＤＮＡを導入するには、翻訳開始コ
ドン側に＠ ｉ ｎｃｌｌ［と接合できる平滑末端を持
ちターミネータ−側に５ａＣＩ制限酵素切断部位を持つ
外来ＤＮＡ断片を接続すればよい。すなわち、上記のよ
うに両端を修飾した外来ＤＮＡ断片は、ｐＢＴＦ３（Ｓ
ａＣ）ベクターをＨｉ ｎｃ［，５ａｃＩで切断したも
のと接続すればよい。
ＡＴＧ翻訳開始コドンをその中に有する外来ＤＮＡ断片
を上記ベクターのＨｒｎｃｉ−８ａｃＩ部位に導入する
。Ｉ）ＢｒＦ３ （Ｓａｃ）ベクターＨｉ ｎｃｌ［−
８ａｃＩ部位に外来ＤＮＡを導入するには、翻訳開始コ
ドン側に＠ ｉ ｎｃｌｌ［と接合できる平滑末端を持
ちターミネータ−側に５ａＣＩ制限酵素切断部位を持つ
外来ＤＮＡ断片を接続すればよい。すなわち、上記のよ
うに両端を修飾した外来ＤＮＡ断片は、ｐＢＴＦ３（Ｓ
ａＣ）ベクターをＨｉ ｎｃ［，５ａｃＩで切断したも
のと接続すればよい。
転写産物の生産にあたっては、組換えｐＢＴＦ３ベクタ
ーをＥＣ０ＲＩで切断することによってリニアーなりＮ
Ａの形状にして鋳型として用い、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴ
Ｐ、ＧＴＰ、キャップアナログ（ｍ７Ｇｌ）ｐｐＧ）、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含むインごトロ転写システム
によって組換えＲＮＡを大量生産する。
ーをＥＣ０ＲＩで切断することによってリニアーなりＮ
Ａの形状にして鋳型として用い、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴ
Ｐ、ＧＴＰ、キャップアナログ（ｍ７Ｇｌ）ｐｐＧ）、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含むインごトロ転写システム
によって組換えＲＮＡを大量生産する。
植物形質転換用ベクターで形質転換された植物細胞中で
生産されている１ａ及び２ａ蛋白質の働きにより、組換
えＲＮＡ３からＲＮＡ４が転写され、導入されたＤＮＡ
断片にコードされたポリペプチドが植物の翻訳系によっ
て生産される。又、植物形質転換用ベクターで形質転換
された植物からＩｌ製されたプロトプラストに、インご
トロに生産された組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を接種する
こともできる。接種の方法としては、ポリカチオン沫、
ポリエチレングリコール法、エレクトロボーレション法
等の公知の方法が用いられる。
生産されている１ａ及び２ａ蛋白質の働きにより、組換
えＲＮＡ３からＲＮＡ４が転写され、導入されたＤＮＡ
断片にコードされたポリペプチドが植物の翻訳系によっ
て生産される。又、植物形質転換用ベクターで形質転換
された植物からＩｌ製されたプロトプラストに、インご
トロに生産された組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を接種する
こともできる。接種の方法としては、ポリカチオン沫、
ポリエチレングリコール法、エレクトロボーレション法
等の公知の方法が用いられる。
このような形質転換細胞中に組換えＲＮＡ３を接種すれ
ば、既に形質転換細胞中で生産されている１８及び２ａ
蛋白質の働きにより、組換えＲＮＡ３から組換えＲＮＡ
４が転写され、導入されたＤＮＡ断片にコードされたポ
リペプチドが植物の翻訳系によって生産される。ポリペ
プチドの生産は、例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子を
導入した場合、感染細胞内に大量のβ−グルクロニダー
ゼが生産されていることが、−殻内に使われる染色法等
を用いることによって確認することができる。［発明の
効果コ 本発明の方法は、ＢＭＶの分節ゲノムにコードされたウ
ィルスＲＮＡ複製酵素を植物体内に組み込み発現させ、
所望の遺伝子を植物体内で大量に１１製し、ポリペプチ
ドの効率的な生産を可能とし、産業上の価値は極めて、
大きいものである。本発明の方法テハ、外来ＤＮＡはＢ
ＭＶ ＲＮＡ３（７）外被蛋白質遺伝子と組換えられ
てから植物形質転換用ベクターに導入され植物ゲノムに
組み込まれ植物細胞内で組換えＲＮＡとして転写させる
か、又は、組換え転写ベクターに導入されインビトロ的
に合成されたＲＮＡとして植物に接種されるため、従来
のインビトロ的にすべてのＢＭＶ ＲＮＡを合成して
植物に接種するよりも、極めて効率的な利用法になる。
ば、既に形質転換細胞中で生産されている１８及び２ａ
蛋白質の働きにより、組換えＲＮＡ３から組換えＲＮＡ
４が転写され、導入されたＤＮＡ断片にコードされたポ
リペプチドが植物の翻訳系によって生産される。ポリペ
プチドの生産は、例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子を
導入した場合、感染細胞内に大量のβ−グルクロニダー
ゼが生産されていることが、−殻内に使われる染色法等
を用いることによって確認することができる。［発明の
効果コ 本発明の方法は、ＢＭＶの分節ゲノムにコードされたウ
ィルスＲＮＡ複製酵素を植物体内に組み込み発現させ、
所望の遺伝子を植物体内で大量に１１製し、ポリペプチ
ドの効率的な生産を可能とし、産業上の価値は極めて、
大きいものである。本発明の方法テハ、外来ＤＮＡはＢ
ＭＶ ＲＮＡ３（７）外被蛋白質遺伝子と組換えられ
てから植物形質転換用ベクターに導入され植物ゲノムに
組み込まれ植物細胞内で組換えＲＮＡとして転写させる
か、又は、組換え転写ベクターに導入されインビトロ的
に合成されたＲＮＡとして植物に接種されるため、従来
のインビトロ的にすべてのＢＭＶ ＲＮＡを合成して
植物に接種するよりも、極めて効率的な利用法になる。
組換えＲＮＡ３に導入される遺伝子としては、種々のも
のが考えられる。たとえば、ＴＭＶあるいはＣＭＶ等の
植物ウィルスの外被蛋白質遺伝子であればウィルス抵抗
性植物の育種につながり、ササゲトリブシンインヒビタ
遺伝子であればスペクトラムの広い害虫抵抗性植物の育
種につながる。また、農業上有用な蛋白質、機能性蛋白
質、医薬となる蛋白質例えばインターフェロン等、の遺
伝子が導入可能である。さらに、内在性ＲＮＡに相補的
なアンチセンスＲＮＡを組込み、植物ｌ９中でアンチセ
ンスＲＮＡを大儀に複製すれば、内在性ＲＮＡの翻訳を
抑制することができ、植物遺伝子の発現を調節すること
が可能である。
のが考えられる。たとえば、ＴＭＶあるいはＣＭＶ等の
植物ウィルスの外被蛋白質遺伝子であればウィルス抵抗
性植物の育種につながり、ササゲトリブシンインヒビタ
遺伝子であればスペクトラムの広い害虫抵抗性植物の育
種につながる。また、農業上有用な蛋白質、機能性蛋白
質、医薬となる蛋白質例えばインターフェロン等、の遺
伝子が導入可能である。さらに、内在性ＲＮＡに相補的
なアンチセンスＲＮＡを組込み、植物ｌ９中でアンチセ
ンスＲＮＡを大儀に複製すれば、内在性ＲＮＡの翻訳を
抑制することができ、植物遺伝子の発現を調節すること
が可能である。
［実施例］
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
が本発明はこれらに限定されるべきものではない。
が本発明はこれらに限定されるべきものではない。
実ｍ！１．ＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクター及び植物形質
転換用ベクターの構築 Ａ、ＢＭＶ ＲＮＡＩ、２及び；１）ｃＤＮＡの作製
ＢＭＶは、ＡＴＣＣＢＢ系統を用いた。ウィルス増殖に
はオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ 匹ｎ且旦り、 品種：五
畝四石）を用い、公知の分画遠心分ｍ沫（０ｋｕｎｏら
、（１９７８） Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｏｌ、 ３８
：４０９−４１８）によってウィルス粒子を純化し、純
化ＢＭＶを用いてベントナイト及びＳＤＳ存在下でフェ
ノール抽出を３−４回繰り返し、エチルエーテル処理、
エタノール沈澱を行ないＲＮＡを得た。
転換用ベクターの構築 Ａ、ＢＭＶ ＲＮＡＩ、２及び；１）ｃＤＮＡの作製
ＢＭＶは、ＡＴＣＣＢＢ系統を用いた。ウィルス増殖に
はオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ 匹ｎ且旦り、 品種：五
畝四石）を用い、公知の分画遠心分ｍ沫（０ｋｕｎｏら
、（１９７８） Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｏｌ、 ３８
：４０９−４１８）によってウィルス粒子を純化し、純
化ＢＭＶを用いてベントナイト及びＳＤＳ存在下でフェ
ノール抽出を３−４回繰り返し、エチルエーテル処理、
エタノール沈澱を行ないＲＮＡを得た。
得られたＲＮＡの溶液から、標準的な低融点アガロース
電気泳動を用いた分離法（５ａｓｂｒｏｏｋら、（１９
８９） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２
ｎｄ、 Ｃ３Ｈｔａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に
より、ＲＮＡ１．２及び３をそれぞれ得た。得られた各
ＲＮＡから、公知の方法（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９
８４）、Ｊ、Ｈｏ１Ｂｉｏ１．１７２：３８９−３８３
）によってＲＮＡ１．２および３の完全長ｃＤＮＡを調
製しｐＬＪＣベクターにクローニングしたものがそれぞ
れｐＢＢｌ、２および３である。ｐＢＢｌ、２および３
は、完全長ｃＤＮＡのＢＭＶ ＲＮＡ５’末端に相当
する部位に３ｎａ８１部位を持ち３′末端のすぐ下流に
ＥｃｏＲＩ部位を持っている。
電気泳動を用いた分離法（５ａｓｂｒｏｏｋら、（１９
８９） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２
ｎｄ、 Ｃ３Ｈｔａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に
より、ＲＮＡ１．２及び３をそれぞれ得た。得られた各
ＲＮＡから、公知の方法（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９
８４）、Ｊ、Ｈｏ１Ｂｉｏ１．１７２：３８９−３８３
）によってＲＮＡ１．２および３の完全長ｃＤＮＡを調
製しｐＬＪＣベクターにクローニングしたものがそれぞ
れｐＢＢｌ、２および３である。ｐＢＢｌ、２および３
は、完全長ｃＤＮＡのＢＭＶ ＲＮＡ５’末端に相当
する部位に３ｎａ８１部位を持ち３′末端のすぐ下流に
ＥｃｏＲＩ部位を持っている。
Ｂ、ＢＭＹ ＲＮＡ転写ベクターの構築と感染性ＲＮ
Ａのインヒト０合成 り−ＩＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクター（ｐＢＴＦｌ。
Ａのインヒト０合成 り−ＩＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクター（ｐＢＴＦｌ。
２及び３）の構築
ＢＭＶ ＲＮＡをインヒドロ的に合成するには、ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡボリメラーゼ不可欠である。
Ａ依存ＲＮＡボリメラーゼ不可欠である。
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼ等が市販されているが、本実験では、プロモー
ター領域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかに
なっており並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮ△ポリメ
ラーゼ（Ｄｕｎｎら、（１９６３）Ｊ、 Ｍｏ１． Ｖ
ｉｏｌ、 １６６：４７７−５３５）を用いたインビ
トロＢＭＶ ＲＮＡ合成系を使用した。
ーゼ、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼ等が市販されているが、本実験では、プロモー
ター領域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかに
なっており並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮ△ポリメ
ラーゼ（Ｄｕｎｎら、（１９６３）Ｊ、 Ｍｏ１． Ｖ
ｉｏｌ、 １６６：４７７−５３５）を用いたインビ
トロＢＭＶ ＲＮＡ合成系を使用した。
ウィルスＲＮＡの５′末端の核酸の構造は、ウィルスＲ
ＮＡの複製や翻訳等において非常に重要な機能を持って
おり、５′末端に余分な塩基配列が付加されるとウィル
スＲＮＡの生物活性は激減することが報告されている（
Ｊａｎｄａら、（１９８７）ＹｉｒｏｌＯＣＩＶｌ
５８ ： ２５９−２６２）。そのため、野生型と同一
の５′末端の塩基配列を持つウィルスＲＮＡをインビト
ロ的に合成するには、ｃＤＮＡの５′末端から正確に転
写が開始されねばならない。従って、転写開始点を平滑
末端化し、ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入す
るために、Ｔ７プロモーターの転写開始点に制限酵素認
識部位を導入することを試みた。
ＮＡの複製や翻訳等において非常に重要な機能を持って
おり、５′末端に余分な塩基配列が付加されるとウィル
スＲＮＡの生物活性は激減することが報告されている（
Ｊａｎｄａら、（１９８７）ＹｉｒｏｌＯＣＩＶｌ
５８ ： ２５９−２６２）。そのため、野生型と同一
の５′末端の塩基配列を持つウィルスＲＮＡをインビト
ロ的に合成するには、ｃＤＮＡの５′末端から正確に転
写が開始されねばならない。従って、転写開始点を平滑
末端化し、ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入す
るために、Ｔ７プロモーターの転写開始点に制限酵素認
識部位を導入することを試みた。
Ｂ−１−ＩＴ７プロモーターの合成
りＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社モデル３８１Ａ）社用デル３８１Ａ３１塩基からな
るオリゴヌクレオチドｄ （ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴ
ＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ＾ＴＴＴＡ ＞及びｄ
（ＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＾
Ｔ＾ＴＧＣＡＴ ）を合成した。合成終了後、常法に従
って高速液体クロマトグラフィーによって精製し、回収
したオリゴヌクレオチド溶液に １／ ２００容量の２
Ｎ ＨＣＪを加え中和した後、ＮＥＮＳＯＲＢ２０
（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）に添加して脱塩を行なった。
ｓ社モデル３８１Ａ）社用デル３８１Ａ３１塩基からな
るオリゴヌクレオチドｄ （ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴ
ＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ＾ＴＴＴＡ ＞及びｄ
（ＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＾
Ｔ＾ＴＧＣＡＴ ）を合成した。合成終了後、常法に従
って高速液体クロマトグラフィーによって精製し、回収
したオリゴヌクレオチド溶液に １／ ２００容量の２
Ｎ ＨＣＪを加え中和した後、ＮＥＮＳＯＲＢ２０
（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）に添加して脱塩を行なった。
まず、２〆のメタノール（高速液体り０マドグラフイー
用、ナカライデスク社製）、２ｄのＡ液（０，１μｌ−
リス−ＨＣ１，１０−ＭＴｒｉｅｔｔ＋ｙｌａｇｉｉｎ
ｅ （ＴＥＡ） 、１ｍＨＮａ２−ＥＤＴＡ） 、ｐ
Ｈ７，７）によってカラムの平衡化を行なった。次にサ
ンプルに１．４μ９／ｊＩｅの割り合いでＴＥＡを加え
たものをカラムに添加し吸着させた。６−９ａｌ！のＡ
液及び３Ｉｄのイオン交換水でカラムを洗浄した後、４
００μｌの５０％エタノール（特級、ナカライデスク社
製）により、オリゴヌクレオチドを溶出した。溶出した
オリゴヌクレオチド溶液をエバポレーターによって減圧
乾固し、イオン交換水に溶解し、１μｇ／ｌＩｌのオリ
ゴヌクレオチド溶液を調製した。
用、ナカライデスク社製）、２ｄのＡ液（０，１μｌ−
リス−ＨＣ１，１０−ＭＴｒｉｅｔｔ＋ｙｌａｇｉｉｎ
ｅ （ＴＥＡ） 、１ｍＨＮａ２−ＥＤＴＡ） 、ｐ
Ｈ７，７）によってカラムの平衡化を行なった。次にサ
ンプルに１．４μ９／ｊＩｅの割り合いでＴＥＡを加え
たものをカラムに添加し吸着させた。６−９ａｌ！のＡ
液及び３Ｉｄのイオン交換水でカラムを洗浄した後、４
００μｌの５０％エタノール（特級、ナカライデスク社
製）により、オリゴヌクレオチドを溶出した。溶出した
オリゴヌクレオチド溶液をエバポレーターによって減圧
乾固し、イオン交換水に溶解し、１μｇ／ｌＩｌのオリ
ゴヌクレオチド溶液を調製した。
これらの合成オリゴヌクレオブトの５′及び３′末端を
リン酸化した。すなわち、１μｌのオリゴヌクレオチド
（１μｇ／ａｔｅ） 、２０μオの１０ｎ ＡＴＰ、
２０μｊ！（７）１０Ｘキナーゼ溶液（５００霞Ｈトリ
ス−ＨｅｌｐＨ７，５，１００ｓＨＭＱＣｆ 、１０
０働Ｈジチオスレイトール（ＤＴ丁））、４μｌのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（４ｕｎｉｔ／ ＩＩ １
、宝酒造社製）及び１５５μｌのイオン交換水を含む反
応液を３７℃、１時間反応させ、オリゴヌクレオチドの
リン酸化を行なった。反応後、６５℃、１０分間の熱処
理によって酵素の不活性化を行なった。反応液にフェノ
ール処理２回、フェノール／クロロホルム処理１回、ク
ロロホルム処理１回及びエチルエーテル処理３回を行な
い、その後減圧下に３０−４０分間置き、反応液中に混
在するエチルエーテルを完全に除去した。
リン酸化した。すなわち、１μｌのオリゴヌクレオチド
（１μｇ／ａｔｅ） 、２０μオの１０ｎ ＡＴＰ、
２０μｊ！（７）１０Ｘキナーゼ溶液（５００霞Ｈトリ
ス−ＨｅｌｐＨ７，５，１００ｓＨＭＱＣｆ 、１０
０働Ｈジチオスレイトール（ＤＴ丁））、４μｌのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（４ｕｎｉｔ／ ＩＩ １
、宝酒造社製）及び１５５μｌのイオン交換水を含む反
応液を３７℃、１時間反応させ、オリゴヌクレオチドの
リン酸化を行なった。反応後、６５℃、１０分間の熱処
理によって酵素の不活性化を行なった。反応液にフェノ
ール処理２回、フェノール／クロロホルム処理１回、ク
ロロホルム処理１回及びエチルエーテル処理３回を行な
い、その後減圧下に３０−４０分間置き、反応液中に混
在するエチルエーテルを完全に除去した。
この反応液をＮＥＮＳＯＲ８２０カラムに添加し、上述
と同様の方法によってリン酸化オリゴヌクレオチドの精
製を行なった後、減圧乾固し５０ｎｇ／〆となるように
蒸留水に溶解し、以後の操作に供試した。
と同様の方法によってリン酸化オリゴヌクレオチドの精
製を行なった後、減圧乾固し５０ｎｇ／〆となるように
蒸留水に溶解し、以後の操作に供試した。
これらの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングしてＴ
７プロモーターを合成した。このプロモーター配列はＴ
７プロモーターのコンセンサス配列の他に５′末端にｔ
−１ｉ ｎ ｄ ｍ部位、３′末端にＸｂａＩ部位を突
出して持ち、さらに、転写開始点から（＋４）の位置に
Ｎ５ｉＩ部位を持つ。
７プロモーターを合成した。このプロモーター配列はＴ
７プロモーターのコンセンサス配列の他に５′末端にｔ
−１ｉ ｎ ｄ ｍ部位、３′末端にＸｂａＩ部位を突
出して持ち、さらに、転写開始点から（＋４）の位置に
Ｎ５ｉＩ部位を持つ。
ト１−２転写ベクターｐＬＩＣＴへのＢＭＶ ＲＮＡ
の完全長ｃＤＮＡの導入（第３図） 合成Ｔ７プロモーターをｐＬＩｃ１９の）ｌｉｎｄｌ［
［／ＸｂａＩ部位に導入し転写ベクターｐＬＩｃＴ（第
３図）を構築した。ｐＵｃＴにＮ５ｉＩおよびＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理を行ない、■アブロモーターの（＋
１）位までの塩基を除去しく−１）位の塩基対で平滑末
端を形成させることができる。ｐＢＢｌ、ｐＢＢ２．ｐ
ＢＢ３それぞれのＢＭＶ ＲＮＡ完全長ｃＮＤＡを含
む５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片と、Ｎ５ｉｌ切断及びＴ
４ＤＮＡポリメラーぜ処理後ＥｃｏＲＩ切断を行なった
ｐＵＣ王の大断片をライゲージコンし、ＢＭＶＲＮＡＩ
、２Ｊ５よび３（７）転写ベクターｐＢＴＦ１，２及び
３をそれぞれ構築した。
の完全長ｃＤＮＡの導入（第３図） 合成Ｔ７プロモーターをｐＬＩｃ１９の）ｌｉｎｄｌ［
［／ＸｂａＩ部位に導入し転写ベクターｐＬＩｃＴ（第
３図）を構築した。ｐＵｃＴにＮ５ｉＩおよびＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理を行ない、■アブロモーターの（＋
１）位までの塩基を除去しく−１）位の塩基対で平滑末
端を形成させることができる。ｐＢＢｌ、ｐＢＢ２．ｐ
ＢＢ３それぞれのＢＭＶ ＲＮＡ完全長ｃＮＤＡを含
む５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片と、Ｎ５ｉｌ切断及びＴ
４ＤＮＡポリメラーぜ処理後ＥｃｏＲＩ切断を行なった
ｐＵＣ王の大断片をライゲージコンし、ＢＭＶＲＮＡＩ
、２Ｊ５よび３（７）転写ベクターｐＢＴＦ１，２及び
３をそれぞれ構築した。
ト２感染性ＲＮＡのインビトロ合成
Ｔ７プロモーターの転写開始点のすぐ■流にＲＮＡ１．
２及び３のそれぞれの完全長ｃＤＮＡが導入され、さら
に、完全長ｃＤＮＡのすぐ下流にＥＣｏＲＩ部位が存在
する転写ベクターｐＢＴＦ１．２及び３のそれぞれのＤ
ＮＡを塩化セシウム遠心分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２
ｎｄＳＣ８ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）によ
ってｍ製した。それぞれの精製ＤＮＡ３μ９をＥＣ０Ｒ
Ｉで切断後、フェノール／クロロホルム処理を行ない、
２０μ９のｔＲＮＡをキャリアとして用いエタノール沈
澱した。得られた沈澱に１６．８μｌの蒸留水、１０μ
ｌの５×転写！ＩＩＩ液（２００ｅＭトリスーＨＣ１（
ｐＨ７，５） 、３０ｓＨＭ Ｑ Ｃ１、１０ｇ＋
Ｈ５ｐｅｒｓｉｄｉｎｅ、 ５ＱｉＨＮａＣ１）、５μ
ｌの１００ｍＨＤＴＴ、１．８μｌのＤ Ｎ ａ ｓ
ｅ ／ ＲＮ ａ ｓ ｅ ７１Ｊ−牛１ｆｉｌ清７
／Ｌ。
２及び３のそれぞれの完全長ｃＤＮＡが導入され、さら
に、完全長ｃＤＮＡのすぐ下流にＥＣｏＲＩ部位が存在
する転写ベクターｐＢＴＦ１．２及び３のそれぞれのＤ
ＮＡを塩化セシウム遠心分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２
ｎｄＳＣ８ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）によ
ってｍ製した。それぞれの精製ＤＮＡ３μ９をＥＣ０Ｒ
Ｉで切断後、フェノール／クロロホルム処理を行ない、
２０μ９のｔＲＮＡをキャリアとして用いエタノール沈
澱した。得られた沈澱に１６．８μｌの蒸留水、１０μ
ｌの５×転写！ＩＩＩ液（２００ｅＭトリスーＨＣ１（
ｐＨ７，５） 、３０ｓＨＭ Ｑ Ｃ１、１０ｇ＋
Ｈ５ｐｅｒｓｉｄｉｎｅ、 ５ＱｉＨＮａＣ１）、５μ
ｌの１００ｍＨＤＴＴ、１．８μｌのＤ Ｎ ａ ｓ
ｅ ／ ＲＮ ａ ｓ ｅ ７１Ｊ−牛１ｆｉｌ清７
／Ｌ。
ブミン（２，８■／ｄ１２．５μｌの
ＲＮａｓ ｉ ｎ （４０ｕｎｉｔ／ｄ） 、２．５μ
ｌの１０ｓＨＡＴＰ、 ２． ５ μ ｌ の １
０ｓＨＵＴＰ 、２．５μオの１０ｓＨＣＴＰ、０．
４μｌの１０■ＨＧＩ−Ｐおよび５μｌの５ｇ＋Ｈキャ
ップアナログ（ｍ７ＧｐＤＤＧ）を加え、軽く混ぜた後
、１μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で反
応させた。１時間後、さらに２μｌの１０１８ＧＴＰお
よび１μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃、
１時間反応させた。その後、１．３μオのＤＮａｓｅ
（１ｕｎｉｔ／ａｔりを加え、３７℃、１時間反応させ
、鋳型ＤＮＡを分解した。
ｌの１０ｓＨＡＴＰ、 ２． ５ μ ｌ の １
０ｓＨＵＴＰ 、２．５μオの１０ｓＨＣＴＰ、０．
４μｌの１０■ＨＧＩ−Ｐおよび５μｌの５ｇ＋Ｈキャ
ップアナログ（ｍ７ＧｐＤＤＧ）を加え、軽く混ぜた後
、１μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で反
応させた。１時間後、さらに２μｌの１０１８ＧＴＰお
よび１μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃、
１時間反応させた。その後、１．３μオのＤＮａｓｅ
（１ｕｎｉｔ／ａｔりを加え、３７℃、１時間反応させ
、鋳型ＤＮＡを分解した。
この反応液をフェノール／クロロホルム及びクロロホル
ムでそれぞれ１回ずつ処理し、２０μ９のｔＲＮＡをキ
ャリアとしてエタノール沈澱した後、１０μオの蒸留水
に懸濁した。
ムでそれぞれ１回ずつ処理し、２０μ９のｔＲＮＡをキ
ャリアとしてエタノール沈澱した後、１０μオの蒸留水
に懸濁した。
上述の方法でインビトロ合成したＢＭＶＲＮＡｌｌ、２
および３ｃＤＮＡのそれぞれの転写物を混合し、それに
等量のＺＸ接種緩衝液（１００１Ｎトリス−リン酸（ｐ
Ｈ８，０） 、５００■ＨＮａＣ］、１０ｓＨＥＤＴＡ
、１％（Ｗ／Ｖ）ベントナイト）を加え接種液とした。
および３ｃＤＮＡのそれぞれの転写物を混合し、それに
等量のＺＸ接種緩衝液（１００１Ｎトリス−リン酸（ｐ
Ｈ８，０） 、５００■ＨＮａＣ］、１０ｓＨＥＤＴＡ
、１％（Ｗ／Ｖ）ベントナイト）を加え接種液とした。
全身感染宿主であるオオムギ菓の上に軽くカーボランダ
ム（６００メツシユ）を振りかけ、５−１０μｌの接種
液滴を塗抹接種した。接種後、すぐに葉上のカーボラン
ダムを水道水で洗い流した。約２′Ｒ間、２５℃のグロ
ースチャンバー（８，０ＯＯＬｔｌＸ ’）で育成した
ところ、全身感染宿主を発現したため、転写ベクターｐ
ＢＴＦ１．２及び３の転写物は感染性のあることが確認
された。
ム（６００メツシユ）を振りかけ、５−１０μｌの接種
液滴を塗抹接種した。接種後、すぐに葉上のカーボラン
ダムを水道水で洗い流した。約２′Ｒ間、２５℃のグロ
ースチャンバー（８，０ＯＯＬｔｌＸ ’）で育成した
ところ、全身感染宿主を発現したため、転写ベクターｐ
ＢＴＦ１．２及び３の転写物は感染性のあることが確認
された。
Ｃ１植物形質転換用ベクターの構築
Ｃ−Ｉ ＣａＭＶ３５８プロモーターの転写開始点への
制限酵素認識部位の導入 植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター及びターミネータ−の間
にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入することを
試みた。プロモーターとしでは、転写量が多く、転写開
始点及びプロモーター領域の塩基配列が明らかにされて
いることを考慮して、ＣａＭＶの３５８プロモーターを
用いた。また、５′末端に余分な７塩基の塩基配列を持
つ変異ＢＭＶ ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（
Ｊａｎｄａら、（１９８７）Ｖ＋ｒｏｌＯｙ １５８
：２５９−２８２））が明らかになっているため、植物
細胞に導入したＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核
内転写物に増殖能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転
写開始点をＢＭＶ ＲＮＡの５′末端と正確に一致さ
せる必要がある。そこで、転写開始点のすぐ下流にＢＭ
Ｖ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｃａ
ＭＶの３５８プロモーターの転写開始点に部位特異的突
然変異導入法によって制限酵素の！！！識部位を導入し
た。
制限酵素認識部位の導入 植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター及びターミネータ−の間
にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入することを
試みた。プロモーターとしでは、転写量が多く、転写開
始点及びプロモーター領域の塩基配列が明らかにされて
いることを考慮して、ＣａＭＶの３５８プロモーターを
用いた。また、５′末端に余分な７塩基の塩基配列を持
つ変異ＢＭＶ ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（
Ｊａｎｄａら、（１９８７）Ｖ＋ｒｏｌＯｙ １５８
：２５９−２８２））が明らかになっているため、植物
細胞に導入したＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核
内転写物に増殖能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転
写開始点をＢＭＶ ＲＮＡの５′末端と正確に一致さ
せる必要がある。そこで、転写開始点のすぐ下流にＢＭ
Ｖ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｃａ
ＭＶの３５８プロモーターの転写開始点に部位特異的突
然変異導入法によって制限酵素の！！！識部位を導入し
た。
Ｃ−２部位特異的突然変異導入法（第５図）京都大学農
学部植物病理学研究室保存のＣａＭＶ ０Ｍ１８４１
株の３５３プロモーター領域（７０１６−７４３４）を
ｐＵＣｌ ８由来のポリリンカー配列及びＣａＭＶ
ＣＭ１８４１株の３５Ｓターミネータ−領Ｒ（７４３６
−７６０６）の直前に持つｐＣＡＭ３５を用いた。３５
３プロモーター領域の一本１［ＤＮＡをＩ製するために
、ｐＣＡＭ３５のＰＳｔＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をＤＵＣｌ
１８のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＣＡＭ
３５ＥＰを構築した。ＤＣＡＭ３５ＥＰで大腸菌ＭＶ１
１８４株を形質転換し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７
を利用して一本鎖ＤＮＡを調製した。
学部植物病理学研究室保存のＣａＭＶ ０Ｍ１８４１
株の３５３プロモーター領域（７０１６−７４３４）を
ｐＵＣｌ ８由来のポリリンカー配列及びＣａＭＶ
ＣＭ１８４１株の３５Ｓターミネータ−領Ｒ（７４３６
−７６０６）の直前に持つｐＣＡＭ３５を用いた。３５
３プロモーター領域の一本１［ＤＮＡをＩ製するために
、ｐＣＡＭ３５のＰＳｔＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をＤＵＣｌ
１８のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＣＡＭ
３５ＥＰを構築した。ＤＣＡＭ３５ＥＰで大腸菌ＭＶ１
１８４株を形質転換し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７
を利用して一本鎖ＤＮＡを調製した。
転写開始点に３ｔｕＩ部位を導入するために、調製した
一本鎖ＤＮＡの転写開始点に３個所のミスマツチを除い
ては相補的な２５塩基のオリゴヌクレオチドｄ （ＧＴ
ＡＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡ＾＾ＴＧＡＡ＾ＴＧＡＡＣ）を
Ｂ−１−１に述べた方法で合成及びＩ製した。１μｌの
一本鎖ＤＮＡ （２０μｇ／μｍ）、１μｌの合成オリ
ゴヌクレオチド（２μｇ／μｉ）、２０μｌの１０Ｘア
ニーリング！物液（２００■Ｈトリス−１−ＩＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、１００議ＨＭｇＣＪ 、５００１８
ＮａＣ，！、１０−ＨＤＴＴ）、１７８μｌの蒸留水を
１．５ｄ用エツペンチユーブに入れ、６２℃、１５分間
処理を行なった後、７分間室温で徐冷し、−本領ＤＮＡ
に合成オリゴヌクレオチドをアニールさせた。徐冷後、
４０１１１のにｌｅｎｏｗ１１ｉｉｉ液（１００ｍ）４
トＩＪス−Ｈｏｌ（ＤＨ７，５）、５０１８ ＭＱＣ
Ｊ 、５０ｍＨＤＴＴ）、２０μｌのｄＮＴＰ溶液（
ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＴＴＰそれぞれ２ｍ
Ｍ） 、１０ｕ１のに！ｅｎｏｗ Ｆｒａａｉｅｎｔ
（４ｕｎｉｔ／ ｍｅ ）及び１３０１１１の蒸留水
を加え、２２℃、５時間の酵素反応を行ない、合成オリ
ゴヌクレオチドをブライマーとして相補的なりＮＡ鎖を
合成した。反応後、フェノール処理及びフェノール／ク
ロロホルム処理、エチルエーテル処理後、エタノール沈
澱を行ない、二本鎖ＤＮＡの沈澱を得た。この二本鎖Ｄ
ＮＡをｐｖｕｌＩにより切断した後、フェノール／クロ
ロホルム処理、エタノール沈澱を行ない、得られた沈澱
に１．５μオのローディング緩衝液（０，８９Ｍトリス
−ホウ酸、２＊ＨＥＤＴＡ、０．２％（Ｗ／Ｖ）’）ブ
ロムフェノールブルー、０．２％（Ｗ／Ｖ）キシレンシ
アツール）及び４３２μｌのホルムアルデヒドを混合し
、９５℃、５ 分間の熱処理後、水中で急冷した。このサンプルを３．
５％ポリアクリルアミド７ＭＩＨ素ゲル（１５（：ＩＸ
ｌ ５ｃｍ、厚さ２＃ｌｌｌ、スロット幅１α）にロー
ドし、２００Ｖ、２時間電気泳動し、ブライマーによっ
て合成された一本鎖ＤＮＡを分離した。
一本鎖ＤＮＡの転写開始点に３個所のミスマツチを除い
ては相補的な２５塩基のオリゴヌクレオチドｄ （ＧＴ
ＡＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡ＾＾ＴＧＡＡ＾ＴＧＡＡＣ）を
Ｂ−１−１に述べた方法で合成及びＩ製した。１μｌの
一本鎖ＤＮＡ （２０μｇ／μｍ）、１μｌの合成オリ
ゴヌクレオチド（２μｇ／μｉ）、２０μｌの１０Ｘア
ニーリング！物液（２００■Ｈトリス−１−ＩＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、１００議ＨＭｇＣＪ 、５００１８
ＮａＣ，！、１０−ＨＤＴＴ）、１７８μｌの蒸留水を
１．５ｄ用エツペンチユーブに入れ、６２℃、１５分間
処理を行なった後、７分間室温で徐冷し、−本領ＤＮＡ
に合成オリゴヌクレオチドをアニールさせた。徐冷後、
４０１１１のにｌｅｎｏｗ１１ｉｉｉ液（１００ｍ）４
トＩＪス−Ｈｏｌ（ＤＨ７，５）、５０１８ ＭＱＣ
Ｊ 、５０ｍＨＤＴＴ）、２０μｌのｄＮＴＰ溶液（
ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＴＴＰそれぞれ２ｍ
Ｍ） 、１０ｕ１のに！ｅｎｏｗ Ｆｒａａｉｅｎｔ
（４ｕｎｉｔ／ ｍｅ ）及び１３０１１１の蒸留水
を加え、２２℃、５時間の酵素反応を行ない、合成オリ
ゴヌクレオチドをブライマーとして相補的なりＮＡ鎖を
合成した。反応後、フェノール処理及びフェノール／ク
ロロホルム処理、エチルエーテル処理後、エタノール沈
澱を行ない、二本鎖ＤＮＡの沈澱を得た。この二本鎖Ｄ
ＮＡをｐｖｕｌＩにより切断した後、フェノール／クロ
ロホルム処理、エタノール沈澱を行ない、得られた沈澱
に１．５μオのローディング緩衝液（０，８９Ｍトリス
−ホウ酸、２＊ＨＥＤＴＡ、０．２％（Ｗ／Ｖ）’）ブ
ロムフェノールブルー、０．２％（Ｗ／Ｖ）キシレンシ
アツール）及び４３２μｌのホルムアルデヒドを混合し
、９５℃、５ 分間の熱処理後、水中で急冷した。このサンプルを３．
５％ポリアクリルアミド７ＭＩＨ素ゲル（１５（：ＩＸ
ｌ ５ｃｍ、厚さ２＃ｌｌｌ、スロット幅１α）にロー
ドし、２００Ｖ、２時間電気泳動し、ブライマーによっ
て合成された一本鎖ＤＮＡを分離した。
エチジウムプロミド（０，５μｇ／ｄ）でゲルを染色し
た後、約３０ｅのイオン交換水で３回洗浄し、余分なエ
チジウムプロミドと尿素の除去を行なった。Ｕｖ照射下
で目的とするバンドを切出し、１ｄのシリンジ（テルモ
）を通してゲルを細片化した。細片化したゲルを７＃Ｉ
！の溶出緩衝液（５００ｓｋ！￥酸アンモニウム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍ１４ＥＤＴＡ、０．１％Ｓ
Ｏ８＞に入れ、３７℃で一夜放置した。５０００）ｌ、
３分間遠心分離した後、上澄にフェノール処理２回、フ
ェノール／クロロホルム処理１回、クロロホルム処理１
回およびエチルエーテル処′！１３回を行なった。この
液を２−ブタノールで４倍に濃縮した後、２倍量のエタ
ノール及び１０μｌのｔ ＲＮＡ （２回１ｇ／ｍｉり
を加え、エタノール沈澱によって一本鎖ＤＮＡの沈澱を
得、３０μｌの蒸留水に溶解した。５μオの回収した一
本鎖ＤＮＡ （０，２μｇ／μｌ）、１．５μｌのＭ１
３リバースブライマー（５０ｎｇ／μｊＳＭ１３ブライ
Ｖ−ＲＶ、宝酒造（株））、１μｌのアニーリング緩衝
液（１００■Ｈトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） 、１
００ｓＭＭａＣ１，５００ｍＭ ＮａＣ１＞、１．５
ｔ、ｔ１（７）ＴＥ１１衝液（１０ｓｌｌｔ−＋） ス
−ＨＣ１（ｐＨ８゜０）、１＊ＨＥＤＴＡ）及び１１１
！ （７） ＫｌｅｎｏｗＦｒａ（ｌｓｅｎｔ （４
ｕｎｉｔ／ １１１ ）を混合して二本鎖ＤＮＡ断片を
合成し、転写開始点に３ｔｕｉ部位を導入した。合成し
た３５８プロモーター領域の断片をＥＣ０ＲＩで切断し
たものをｔ）ＬＪＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に
導入し、改変シタ３５Ｓプロモーター領域を含むｐＣａ
Ｐ３５を構築した。ｐＣａＰ３５を３ｔｕ：［で切断す
ることによって転写開始点を平滑末端にすることができ
、ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを転写開始点のす
ぐ下流に導入することができる。
た後、約３０ｅのイオン交換水で３回洗浄し、余分なエ
チジウムプロミドと尿素の除去を行なった。Ｕｖ照射下
で目的とするバンドを切出し、１ｄのシリンジ（テルモ
）を通してゲルを細片化した。細片化したゲルを７＃Ｉ
！の溶出緩衝液（５００ｓｋ！￥酸アンモニウム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍ１４ＥＤＴＡ、０．１％Ｓ
Ｏ８＞に入れ、３７℃で一夜放置した。５０００）ｌ、
３分間遠心分離した後、上澄にフェノール処理２回、フ
ェノール／クロロホルム処理１回、クロロホルム処理１
回およびエチルエーテル処′！１３回を行なった。この
液を２−ブタノールで４倍に濃縮した後、２倍量のエタ
ノール及び１０μｌのｔ ＲＮＡ （２回１ｇ／ｍｉり
を加え、エタノール沈澱によって一本鎖ＤＮＡの沈澱を
得、３０μｌの蒸留水に溶解した。５μオの回収した一
本鎖ＤＮＡ （０，２μｇ／μｌ）、１．５μｌのＭ１
３リバースブライマー（５０ｎｇ／μｊＳＭ１３ブライ
Ｖ−ＲＶ、宝酒造（株））、１μｌのアニーリング緩衝
液（１００■Ｈトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） 、１
００ｓＭＭａＣ１，５００ｍＭ ＮａＣ１＞、１．５
ｔ、ｔ１（７）ＴＥ１１衝液（１０ｓｌｌｔ−＋） ス
−ＨＣ１（ｐＨ８゜０）、１＊ＨＥＤＴＡ）及び１１１
！ （７） ＫｌｅｎｏｗＦｒａ（ｌｓｅｎｔ （４
ｕｎｉｔ／ １１１ ）を混合して二本鎖ＤＮＡ断片を
合成し、転写開始点に３ｔｕｉ部位を導入した。合成し
た３５８プロモーター領域の断片をＥＣ０ＲＩで切断し
たものをｔ）ＬＪＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に
導入し、改変シタ３５Ｓプロモーター領域を含むｐＣａ
Ｐ３５を構築した。ｐＣａＰ３５を３ｔｕ：［で切断す
ることによって転写開始点を平滑末端にすることができ
、ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを転写開始点のす
ぐ下流に導入することができる。
Ｃ−３植物形質転換用ベクター（１）ＢＩＣＢＲシリー
ズ）の構築（第６図） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導
入し、導入細胞で合成された転写産物が野生型ウィルス
ＲＮＡのような翻訳及び増殖能を持つ形質転換植物作出
のためのベクターを構築した。
ズ）の構築（第６図） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導
入し、導入細胞で合成された転写産物が野生型ウィルス
ＲＮＡのような翻訳及び増殖能を持つ形質転換植物作出
のためのベクターを構築した。
植物形質転換用のアグロバクテリウム・バイナリ−ベク
ターｐＢ ＩＮ １９ （Ｂｅｖａｎら、（１９８４）
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２ ： ８７
１１−８７２１ ）のＥｃｏＲＩ／１−Ｉｉｎｄｌ［［
部位にＣａＭＶの３５８プロモーター ｐＵＣ１８由来
のポリリンカー部位およびＣａＭＶターミネータ−を導
入したプラスミドがｐＢＩｃ３５である。ｐＢＩｃ３５
をＥＣ０ＲＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によ
って平滑末端化し、Ｓａ１ニリンカーを付加し、その後
５ａｌＩで切断しセルフライゲーションを行ない、３５
８プロモーターを欠失したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）を構築し
た。次に、ＳｍａＩで切断したｐＢ ＩＣＴ （−Ｅ）
にさらにＥｃｏＲＩリンカ−を付加した後にセルフライ
ゲーションを行ない、ＳｍａＩ部位をＥＣｏＲＩ部位に
改変したｐＢｌｃＴＥを構築した。一方、ＣａＭＶの３
５８プロモーターの転写開始点に部位特異的突然変異導
入法によって３ｔｕＩ部位を導入した改変型３５８プロ
モーターを含むｐＣａｐ３５をＥＣ０ＲＩ切断後、丁４
ＤＮＡポリメラーゼ処理によって両端を平滑末端化し、
その両端に５ａｌＩリンカ−を付加し、３ａ１１および
ＢａｍＨ工によって切断することによって、改変３５８
プロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。
ターｐＢ ＩＮ １９ （Ｂｅｖａｎら、（１９８４）
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２ ： ８７
１１−８７２１ ）のＥｃｏＲＩ／１−Ｉｉｎｄｌ［［
部位にＣａＭＶの３５８プロモーター ｐＵＣ１８由来
のポリリンカー部位およびＣａＭＶターミネータ−を導
入したプラスミドがｐＢＩｃ３５である。ｐＢＩｃ３５
をＥＣ０ＲＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によ
って平滑末端化し、Ｓａ１ニリンカーを付加し、その後
５ａｌＩで切断しセルフライゲーションを行ない、３５
８プロモーターを欠失したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）を構築し
た。次に、ＳｍａＩで切断したｐＢ ＩＣＴ （−Ｅ）
にさらにＥｃｏＲＩリンカ−を付加した後にセルフライ
ゲーションを行ない、ＳｍａＩ部位をＥＣｏＲＩ部位に
改変したｐＢｌｃＴＥを構築した。一方、ＣａＭＶの３
５８プロモーターの転写開始点に部位特異的突然変異導
入法によって３ｔｕＩ部位を導入した改変型３５８プロ
モーターを含むｐＣａｐ３５をＥＣ０ＲＩ切断後、丁４
ＤＮＡポリメラーゼ処理によって両端を平滑末端化し、
その両端に５ａｌＩリンカ−を付加し、３ａ１１および
ＢａｍＨ工によって切断することによって、改変３５８
プロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。
この断片をｐＢＩＣＴＥのＳａ Ｉ Ｉ／ＢａｍＨＩ部
位に導入しｐＢＩｃＰ３５を構築した。
位に導入しｐＢＩｃＰ３５を構築した。
次に、ＢＭＶ ＲＮＡＩ、２１よ（Ｆ３（７）完全長
ｃＤＮＡ断片を含むｐＢＢｌ、ｐＢＢ２およびｐＢＢ３
の５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をそれぞれｐＢｌｃＰ３
５の５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換
用ベクターｐＢＩＣＢＲＩ、２及び３をそれぞれ構築し
た（第６図）。
ｃＤＮＡ断片を含むｐＢＢｌ、ｐＢＢ２およびｐＢＢ３
の５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をそれぞれｐＢｌｃＰ３
５の５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換
用ベクターｐＢＩＣＢＲＩ、２及び３をそれぞれ構築し
た（第６図）。
Ｃ−４植物形質転換用ベクターＮ）Ｂ Ｉ ＣＢＭＲシ
リーズ）の構築（第７図その１〜３） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの３′末端欠失ｃＤＮ
Ａを導入し、導入細胞で合成された転写産物が翻訳能は
持つが野生型ウィルスＲＮＡのような増殖能は持たない
形質転換体作出のためのベクターを構築した。
リーズ）の構築（第７図その１〜３） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの３′末端欠失ｃＤＮ
Ａを導入し、導入細胞で合成された転写産物が翻訳能は
持つが野生型ウィルスＲＮＡのような増殖能は持たない
形質転換体作出のためのベクターを構築した。
ＢＭＶ ＲＮＡＩの完全長ｃＤＮＡを含むｐＢＢｌを
ＸｈｏＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行ない、
両端を平滑末端化した後Ｅｃ。
ＸｈｏＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行ない、
両端を平滑末端化した後Ｅｃ。
ＲＩクリンカを付加し、ざらにＥｃｏＲＩ切断した後セ
ルフライゲーションを行なった＠その結果１ＲＮＡ１
ｃＤＮＡの３′末端末非翻訳領域のＸｈｏＩから下流
の約２００塩基の欠失を持つｐＢＢｌ （−３）を得た
。ｐＢＢｌ （−３）のＲＮＡＩ ｃＤＮＡを含む５
ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をＤＢＩＣＰ３５の５ｔｕＩ
／ＥＣ０ＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベクターｐ
ＢＩｃＢＭＲ１を構築した（第７図その１）。
ルフライゲーションを行なった＠その結果１ＲＮＡ１
ｃＤＮＡの３′末端末非翻訳領域のＸｈｏＩから下流
の約２００塩基の欠失を持つｐＢＢｌ （−３）を得た
。ｐＢＢｌ （−３）のＲＮＡＩ ｃＤＮＡを含む５
ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をＤＢＩＣＰ３５の５ｔｕＩ
／ＥＣ０ＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベクターｐ
ＢＩｃＢＭＲ１を構築した（第７図その１）。
ＢＭＶ ＲＮＡ２（７）完全長ｃＤＮＡを含むｐＢＢ
２をｐｓｔＩおよびＨｉ ｎｄｎ［切断後、ｃＤＮＡ断
片をｐＵＣｌ ８のＰｓ ｔ Ｉ／Ｈｉ ｎｄ■部位に
導入し、ＲＮＡ２の３′末端の非翻訳領域を欠失したｃ
ＤＮＡを含むｐＢＢ２ （−Ｈ）を得た。ｐＢＢ２ （
−Ｈ）をＨｉ ｎｄｌｕ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行ない。両端を平滑末端化した後ＥＣ０ＲＩリン
カ−を付加し、さらにＥＣ０ＲＩ切断した後セルフライ
ゲーションを行なった。
２をｐｓｔＩおよびＨｉ ｎｄｎ［切断後、ｃＤＮＡ断
片をｐＵＣｌ ８のＰｓ ｔ Ｉ／Ｈｉ ｎｄ■部位に
導入し、ＲＮＡ２の３′末端の非翻訳領域を欠失したｃ
ＤＮＡを含むｐＢＢ２ （−Ｈ）を得た。ｐＢＢ２ （
−Ｈ）をＨｉ ｎｄｌｕ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行ない。両端を平滑末端化した後ＥＣ０ＲＩリン
カ−を付加し、さらにＥＣ０ＲＩ切断した後セルフライ
ゲーションを行なった。
その結果、ＲＮＡ２の３′末端の非翻訳領域のＨｉｎｄ
ｌｌｌから下流約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ２ （
−３＞を得た。ｐＢＢ２ （−３）のＲＮＡ２ ｃＤ
ＮＡを含む５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をｐＢ（ＣＰ３
５の５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換
用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ２を構築した（第７図その２
）。
ｌｌｌから下流約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ２ （
−３＞を得た。ｐＢＢ２ （−３）のＲＮＡ２ ｃＤ
ＮＡを含む５ｎａＢＩ／ＥＣ０ＲＩ断片をｐＢ（ＣＰ３
５の５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換
用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ２を構築した（第７図その２
）。
ＢＭＶ ＲＮＡ３（７）完全長ｃＤＮＡを含むｐＢＢ
３をｐｓｔＩおよびＨｉ ｎ６ｍ切断後、ｃＤＮＡ断片
をｐｕｃｉｓのＰＳ ｔ Ｉ／日ｉｎｄ■部位に導入し
、ＲＮＡ３の３′末端の非翻訳領域を欠失したｃＤＮＡ
を含むｐＢ８３ （−Ｈ）を得た。１）ＢＢ３ （−Ｈ
）をＨｉｎｄｉ［切断機工４ＤＮＡポリメラーゼ処理を
行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ−を
付加し、ざらにＥＣ０ＲＩ切断した後セルフライゲーシ
ョンを行なった。
３をｐｓｔＩおよびＨｉ ｎ６ｍ切断後、ｃＤＮＡ断片
をｐｕｃｉｓのＰＳ ｔ Ｉ／日ｉｎｄ■部位に導入し
、ＲＮＡ３の３′末端の非翻訳領域を欠失したｃＤＮＡ
を含むｐＢ８３ （−Ｈ）を得た。１）ＢＢ３ （−Ｈ
）をＨｉｎｄｉ［切断機工４ＤＮＡポリメラーゼ処理を
行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ−を
付加し、ざらにＥＣ０ＲＩ切断した後セルフライゲーシ
ョンを行なった。
その結果、ＲＮＡ３の３′末端の非翻訳領域のＨｉｎｄ
ｍから下流約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ３ （−３
）を得た。ｐＢＢ３ （−３）のＲＮＡ３ ｃＤＮＡ
を含む５ｎａＢＩ／ＥｃｏＲ１断片をＤＢｔＣＰ３５の
５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベ
クターｐＢＩｃＢＭＲ３を構築したく第７図その３）。
ｍから下流約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ３ （−３
）を得た。ｐＢＢ３ （−３）のＲＮＡ３ ｃＤＮＡ
を含む５ｎａＢＩ／ＥｃｏＲ１断片をＤＢｔＣＰ３５の
５ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベ
クターｐＢＩｃＢＭＲ３を構築したく第７図その３）。
実施例２ 形質転換植物細胞内における導入されたＢＭ
Ｖ各ゲノムの発瑣 Ａ、＾、 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの植物形質転換
用ベクターの導入 １枚＋７）ＮＢ寒天培地（０，８％Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
Ｂｒｏｔｈ。
Ｖ各ゲノムの発瑣 Ａ、＾、 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの植物形質転換
用ベクターの導入 １枚＋７）ＮＢ寒天培地（０，８％Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
Ｂｒｏｔｈ。
１．５％ＢａＣｔＯＡＱａｒ）上に大腸菌ＤＨ５α株（
ｐＢｌｃＢＲもしくはｐＢ Ｉ ＣＢＭＲベクターを保
持する〉、大腸菌）１８１０１株（ヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３を保持する）及びＡｔｕｓｅｆａｃｉｅ
ｉｓ Ｌ Ｂ Ａ ４４０４株（Ｔ−ＤＮＡ領域を欠失
したＴ１プラスミドを保持する）をそれぞれ接種し、３
０℃、２日間培養した。培養後、殺菌した白金耳で３種
の細菌を混合し、さらに３０℃、２日間培養した。、５
０μｇ／〆のカナマイシンを含有するＡＢ寒天培地（第
１表）上に混合培養した細菌を画線し、３０℃、２日間
培養し、シングルコロニーを得た。このコロニーが形質
転換用ベクターを保持する＾、 ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｌ Ｂ Ａ ４４０４株である。
ｐＢｌｃＢＲもしくはｐＢ Ｉ ＣＢＭＲベクターを保
持する〉、大腸菌）１８１０１株（ヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３を保持する）及びＡｔｕｓｅｆａｃｉｅ
ｉｓ Ｌ Ｂ Ａ ４４０４株（Ｔ−ＤＮＡ領域を欠失
したＴ１プラスミドを保持する）をそれぞれ接種し、３
０℃、２日間培養した。培養後、殺菌した白金耳で３種
の細菌を混合し、さらに３０℃、２日間培養した。、５
０μｇ／〆のカナマイシンを含有するＡＢ寒天培地（第
１表）上に混合培養した細菌を画線し、３０℃、２日間
培養し、シングルコロニーを得た。このコロニーが形質
転換用ベクターを保持する＾、 ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｌ Ｂ Ａ ４４０４株である。
ＢタバコへのＡ、 ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓの接種及
び形質転換体の選抜 接種用タバ：］ （Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕ
ｍ ｃｖ、 ＰｅｔｉｔＨａｂａｎａ ＳＲ１）として
は、殺菌処理した種子由来の無菌植物を供試した。１．
５ｄ用エツベンチユーブに約１００μｌのタバコ種子を
入れ、１ａｄ！の７０％エタノールでタバコ種子を洗浄
した。次に、１、！Ｍの２０％アンチホルミンを加え４
分間おきに１秒間の攪はんを行ないながら、室温に２０
分間放置し、種子殺菌を行なった。殺菌後、殺菌水で３
−４回種子を洗浄し、ＬＳ１培地（第２表）を入れたプ
ラスチックシャーレ（西部（株）、径９０ ａｍ 、深
さ２０履）に播種し、２６℃、８．ＯＱ Ｑ ｌｕｘで
育成した。約１国に生長した幼植物をＬＳ８培地（第２
表）の入ったバイオボット（日本医科器械（株））に移
植し、体長約１０１：１１に生長したものをＡ、 ｔ
ｕｓｅｆａｃｉｅｎｓ接種に用いた。
び形質転換体の選抜 接種用タバ：］ （Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕ
ｍ ｃｖ、 ＰｅｔｉｔＨａｂａｎａ ＳＲ１）として
は、殺菌処理した種子由来の無菌植物を供試した。１．
５ｄ用エツベンチユーブに約１００μｌのタバコ種子を
入れ、１ａｄ！の７０％エタノールでタバコ種子を洗浄
した。次に、１、！Ｍの２０％アンチホルミンを加え４
分間おきに１秒間の攪はんを行ないながら、室温に２０
分間放置し、種子殺菌を行なった。殺菌後、殺菌水で３
−４回種子を洗浄し、ＬＳ１培地（第２表）を入れたプ
ラスチックシャーレ（西部（株）、径９０ ａｍ 、深
さ２０履）に播種し、２６℃、８．ＯＱ Ｑ ｌｕｘで
育成した。約１国に生長した幼植物をＬＳ８培地（第２
表）の入ったバイオボット（日本医科器械（株））に移
植し、体長約１０１：１１に生長したものをＡ、 ｔ
ｕｓｅｆａｃｉｅｎｓ接種に用いた。
形質転換用ベクターを保持する
Ａ、 ｔｕｌｅｆａｃｉｅｎｓを５０μ９／ｍｅのカ
ナマイシン含有ＡＢ液体培地で３０℃、２日間振とう培
養（１２０回転／分）した。これ以後の操作はすべて無
菌的に行なった。無菌培養したタバコの葉を１ｃ＊Ｘ１
ｃＩＩに切り抜き、上述のＡ、 ｔＵｌｆ！ｆａｃｉ
Ｅｉｎｓ培養液に１分間浸漬した。あらかじめ殺菌して
おいたベーパータオルの上にこの葉片を置き、過剰の細
菌液を除き、ＬＳ１培地（第２表）上に葉片の裏面を上
にして置いた。２６℃、４８時間から７２時間培養後、
Ａ、 ｔｕｌｅｆａｃｉｅｎｓを完全に除去するため
に、５００μｇ／ｄのカルベニシリンを含有するＬＳＩ
液体培地に移し、２６℃、７００１ｕｘで２日間培養し
た。培養後あらかじめ殺菌しておいたペーパータオルの
上にこの葉片を置き、ＬＳ１液体培地を除き、１５０μ
ｇ／−のカナマイシン及び１００μ９／ｄのカルベニシ
リンを含有するＬＳ４ｊ８地（第２表）に移し、２６℃
、８．０ＯＯｌｕｘで約２−３週間培養した。発芽した
５〜１，０履のシュートを殺菌したメスでカルスから切
り取り、１００μ９／ｄのカナマイシン及び１５０μｇ
／ｄのカルベニシリン含有ＭＳＲ培地（５２５μ９／Ｍ
１のナフタレン酢酸と１００μ９／−の６−ベンジルア
デニンを含み、寒天の代わりにＧｅ１ａｎ□ｔ１ｍを用
いたしＳプレート培地）に移した。、２遍間後、全身的
５ｃ１１に育成した幼植物を直径１２αの植木鉢に鉢土
げし、透明なプラスチックボックスで植物を覆い、数日
間馴化させた後、ブースチャンバー内で育成した。
ナマイシン含有ＡＢ液体培地で３０℃、２日間振とう培
養（１２０回転／分）した。これ以後の操作はすべて無
菌的に行なった。無菌培養したタバコの葉を１ｃ＊Ｘ１
ｃＩＩに切り抜き、上述のＡ、 ｔＵｌｆ！ｆａｃｉ
Ｅｉｎｓ培養液に１分間浸漬した。あらかじめ殺菌して
おいたベーパータオルの上にこの葉片を置き、過剰の細
菌液を除き、ＬＳ１培地（第２表）上に葉片の裏面を上
にして置いた。２６℃、４８時間から７２時間培養後、
Ａ、 ｔｕｌｅｆａｃｉｅｎｓを完全に除去するため
に、５００μｇ／ｄのカルベニシリンを含有するＬＳＩ
液体培地に移し、２６℃、７００１ｕｘで２日間培養し
た。培養後あらかじめ殺菌しておいたペーパータオルの
上にこの葉片を置き、ＬＳ１液体培地を除き、１５０μ
ｇ／−のカナマイシン及び１００μ９／ｄのカルベニシ
リンを含有するＬＳ４ｊ８地（第２表）に移し、２６℃
、８．０ＯＯｌｕｘで約２−３週間培養した。発芽した
５〜１，０履のシュートを殺菌したメスでカルスから切
り取り、１００μ９／ｄのカナマイシン及び１５０μｇ
／ｄのカルベニシリン含有ＭＳＲ培地（５２５μ９／Ｍ
１のナフタレン酢酸と１００μ９／−の６−ベンジルア
デニンを含み、寒天の代わりにＧｅ１ａｎ□ｔ１ｍを用
いたしＳプレート培地）に移した。、２遍間後、全身的
５ｃ１１に育成した幼植物を直径１２αの植木鉢に鉢土
げし、透明なプラスチックボックスで植物を覆い、数日
間馴化させた後、ブースチャンバー内で育成した。
形質転換用ベクターｐＢＩｃＢＲ１、
ｐＩＣＢＲ２およびｐＢ Ｉ ＣＢＲ３による力犬マイ
シン耐性形質転換タバコをそれぞれＢＲｌ。
シン耐性形質転換タバコをそれぞれＢＲｌ。
ＢＲ２およびＢＲ３、また、形質転換用ベクターｐＢＩ
ｃＢＭＲ１、ＤＢＩＣＢＭＲ２および０８１０８ＭＲ３
によるカナマイシン耐性形質転換タバコをそれぞれＢＭ
Ｒｌ、８ＭＲ２および８ＭＲ３と名付けた。
ｃＢＭＲ１、ＤＢＩＣＢＭＲ２および０８１０８ＭＲ３
によるカナマイシン耐性形質転換タバコをそれぞれＢＭ
Ｒｌ、８ＭＲ２および８ＭＲ３と名付けた。
Ｃ，タバコに導入したＢＭＶ各遺伝子産物の発現分析
カナマイシン耐性を示した形質転換植物の中で導入され
たＢＭＷの各遺伝子が発現しているかどうかを調べる方
法として、導入された１ａ遺伝子の発現の分析は、形質
転換タバコから調製したプロトプラストにＲＮＡ２およ
び３の混合物を接種することによって、また、２ａ遺伝
子の発現の分析はＲＮＡＩおよび３の混合物を接種する
ことによって行なった。ＲＮＡ１．２および３は、実施
例１Ｂの項で述べた方法によってｐＢＴＦｌ、２６よび
３からインごトロ的に合成した。
たＢＭＷの各遺伝子が発現しているかどうかを調べる方
法として、導入された１ａ遺伝子の発現の分析は、形質
転換タバコから調製したプロトプラストにＲＮＡ２およ
び３の混合物を接種することによって、また、２ａ遺伝
子の発現の分析はＲＮＡＩおよび３の混合物を接種する
ことによって行なった。ＲＮＡ１．２および３は、実施
例１Ｂの項で述べた方法によってｐＢＴＦｌ、２６よび
３からインごトロ的に合成した。
ウィルスＲＮＡＩＩ＠ＩＩ素である１ａ及び２ａ蛋白質
が発現している細胞中では、接種したＲＮＡ３から外被
蛋白質のｍＲＮＡであるＲＮＡ４が転写され、細胞内に
ＢＭＶの外被蛋白質が蓄積するものと考えられる。外被
蛋白質はＲＮＡ３から直接翻訳されることはなく、ＢＭ
Ｖの複製酵素によって（−）鎖ＲＮＡ３から転写された
ＲＮＡ４をとおして翻訳されると考えられており （Ｍｉｌｌｅｒら、 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ
３１３ ： ６６−７０） 、外被蛋白質の発現を検出
することによって、間接的に複製酵素あるいは同酵素の
サブユニットである１ａ及び２ａ蛋白質の発現の検出を
行なうことができる。そこで、杭ＢＭＶ抗体を用いたウ
ェスタンプロット法によって外被蛋白質の発現の分析を
行なった。
が発現している細胞中では、接種したＲＮＡ３から外被
蛋白質のｍＲＮＡであるＲＮＡ４が転写され、細胞内に
ＢＭＶの外被蛋白質が蓄積するものと考えられる。外被
蛋白質はＲＮＡ３から直接翻訳されることはなく、ＢＭ
Ｖの複製酵素によって（−）鎖ＲＮＡ３から転写された
ＲＮＡ４をとおして翻訳されると考えられており （Ｍｉｌｌｅｒら、 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ
３１３ ： ６６−７０） 、外被蛋白質の発現を検出
することによって、間接的に複製酵素あるいは同酵素の
サブユニットである１ａ及び２ａ蛋白質の発現の検出を
行なうことができる。そこで、杭ＢＭＶ抗体を用いたウ
ェスタンプロット法によって外被蛋白質の発現の分析を
行なった。
Ｃ−１プロトプラストの調製
プロトプラストのａ製には、葉長１５−２０ｃｍのタバ
コ第４−５葉を用いた。切り取ったタバコ葉の裏表皮を
剥離し、１００ＩＩＩコルベンに入れた１％セルラーゼ
オノズカＲ−１０（近畿ヤクルト）、０．０５％マセロ
ザイム（近畿ヤクルト）を含む０．５Ｍマンニトール液
（ＫＯＨでｐＨ５，６−５，，８に調製したもの）に浸
し、１５分毎にフルペンを軽く振り医ぜ、２６℃で２時
間処理した。得られたプロトプラスト懸濁液に含まれる
未分解組織を、４−６Ｍのガーゼで濾別し、５Ｃ）ｄ用
ガラス遠沈管に移し、１００Ｘ９．２分間の遠心分離に
よってプロトプラストを集め、さらに、０．５Ｍのマン
ニトール液による遠心洗浄を２回繰り返した。
コ第４−５葉を用いた。切り取ったタバコ葉の裏表皮を
剥離し、１００ＩＩＩコルベンに入れた１％セルラーゼ
オノズカＲ−１０（近畿ヤクルト）、０．０５％マセロ
ザイム（近畿ヤクルト）を含む０．５Ｍマンニトール液
（ＫＯＨでｐＨ５，６−５，，８に調製したもの）に浸
し、１５分毎にフルペンを軽く振り医ぜ、２６℃で２時
間処理した。得られたプロトプラスト懸濁液に含まれる
未分解組織を、４−６Ｍのガーゼで濾別し、５Ｃ）ｄ用
ガラス遠沈管に移し、１００Ｘ９．２分間の遠心分離に
よってプロトプラストを集め、さらに、０．５Ｍのマン
ニトール液による遠心洗浄を２回繰り返した。
Ｃ−２タバコプロトプラストへのＢＭＶ ＲＮＡの接
種 ０．５Ｍマンニトールに懸濁したプロトプラストを４−
６本の１０ａ！容ポリプロピレン製培養チユーブ（日永
製薬＃０６４８０）に移し、１００Ｘ９．２分間の遠心
分離でプロトプラストを集め、上清を除去した。プロト
プラストに２−１０μ９のＢＭＶ ＲＮＡ！＝１０μ
９１７）ｔＲＮＡｔ含むＴ液（０，５Ｍマンニトール、
４０ｍＨＣａＣｌ２）を０．７ｄ加えよく混和した後、
直ちにＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ４０００．０．５Ｍマ
ンニトール、４０１ＨＣａＣＪ２）を０．７−加え、上
下逆さまにしてゆるやかに混ぜ、氷上で３０分間低速振
とうした。その後、約８ｄのＴ液を加え上下逆さまにし
てゆるやかに混ぜ、氷上に３０分間静１した。１００Ｘ
９．２分間の遠心分離でプロトプラストを集めた後、Ｐ
ＥＧや未吸着のＲＮＡを除去するため旧ａｈ−ｐＨ１ｌ
ｉｏｈ−Ｃａ ”＠衝液（０，７Ｍ？ンニトール、５０
ｍＨＣａ Ｃｔ ２．５０−Ｈグリシン、ｐＨ８，５
）による遠心洗浄を３回繰返した。プロトプラストを３
−の０．７１培地 （０，２ｍＨＫＨ，、ＰＯ２、１１
８ＫＮＯ２，１−ＨＭ ｇ Ｓ Ｏ２、７Ｈ２０、１０
−ＮＣａＣ！ ’ ２Ｈ２０，０，１ａＭ Ｋｌ。
種 ０．５Ｍマンニトールに懸濁したプロトプラストを４−
６本の１０ａ！容ポリプロピレン製培養チユーブ（日永
製薬＃０６４８０）に移し、１００Ｘ９．２分間の遠心
分離でプロトプラストを集め、上清を除去した。プロト
プラストに２−１０μ９のＢＭＶ ＲＮＡ！＝１０μ
９１７）ｔＲＮＡｔ含むＴ液（０，５Ｍマンニトール、
４０ｍＨＣａＣｌ２）を０．７ｄ加えよく混和した後、
直ちにＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ４０００．０．５Ｍマ
ンニトール、４０１ＨＣａＣＪ２）を０．７−加え、上
下逆さまにしてゆるやかに混ぜ、氷上で３０分間低速振
とうした。その後、約８ｄのＴ液を加え上下逆さまにし
てゆるやかに混ぜ、氷上に３０分間静１した。１００Ｘ
９．２分間の遠心分離でプロトプラストを集めた後、Ｐ
ＥＧや未吸着のＲＮＡを除去するため旧ａｈ−ｐＨ１ｌ
ｉｏｈ−Ｃａ ”＠衝液（０，７Ｍ？ンニトール、５０
ｍＨＣａ Ｃｔ ２．５０−Ｈグリシン、ｐＨ８，５
）による遠心洗浄を３回繰返した。プロトプラストを３
−の０．７１培地 （０，２ｍＨＫＨ，、ＰＯ２、１１
８ＫＮＯ２，１−ＨＭ ｇ Ｓ Ｏ２、７Ｈ２０、１０
−ＮＣａＣ！ ’ ２Ｈ２０，０，１ａＭ Ｋｌ。
０．０１℃Ｍ Ｃｕ５Ｏ−５Ｈ２０，０，７Ｍマンニ
トール、２５００Ｌｌｎｉ（／ａｅ’？イコスタチン、
２００μ９７ｄクロラムフエニコール、ｐＨ５，５）に
懸濁し、２８℃、４８時圀培養した。
トール、２５００Ｌｌｎｉ（／ａｅ’？イコスタチン、
２００μ９７ｄクロラムフエニコール、ｐＨ５，５）に
懸濁し、２８℃、４８時圀培養した。
Ｃ−３抗体の１１１１とウェスタンプロット分析抗ＢＭ
ＶＩＭ１１１を硫酸アンモニウム法によって精製し、γ
−グロブリン画分を得た。タバコプロトプラストからア
セトンパウダーを調製し、これに上述の精製抗ＢＭＶ抗
体と反応させ、非特巽的に植物成分と結合する抗体を除
去した。ＢＭＶＲＮＡを接種したプロトプラストから抽
出した蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動した後、分離された蛋白質をＴｏｗｂｉｎらの方法（
Ｔｏｗｂｉｎら、 （１９７９） Ｐｒｏ、 Ｎａｔ
ｌ、 ＾ｃａｄ 。
ＶＩＭ１１１を硫酸アンモニウム法によって精製し、γ
−グロブリン画分を得た。タバコプロトプラストからア
セトンパウダーを調製し、これに上述の精製抗ＢＭＶ抗
体と反応させ、非特巽的に植物成分と結合する抗体を除
去した。ＢＭＶＲＮＡを接種したプロトプラストから抽
出した蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動した後、分離された蛋白質をＴｏｗｂｉｎらの方法（
Ｔｏｗｂｉｎら、 （１９７９） Ｐｒｏ、 Ｎａｔ
ｌ、 ＾ｃａｄ 。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６ ： ４３５０−４３５４）によっ
て電気的にメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ 、ミ
リボア社製）に転写した。転写後、−次抗体に精製抗Ｂ
ＭＶ抗体を１／４００に希釈したもの、二次抗体にアル
カリホスファターゼでラベルした抗ウサギＩ ｇＧ−ヤ
ギＩｏＧを用い、ＮＢＴ−ＢＣＩ Ｐを基質とした発色
反応によってＢＭＶ外被蛋白質の検出を行なった。
て電気的にメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ 、ミ
リボア社製）に転写した。転写後、−次抗体に精製抗Ｂ
ＭＶ抗体を１／４００に希釈したもの、二次抗体にアル
カリホスファターゼでラベルした抗ウサギＩ ｇＧ−ヤ
ギＩｏＧを用い、ＮＢＴ−ＢＣＩ Ｐを基質とした発色
反応によってＢＭＶ外被蛋白質の検出を行なった。
Ｃ−４ＢＲ１および２植物細胞における導入した遺伝子
産物の分析 ＢＲ１植物から焼成したプロトプラストにインビトＯで
合成したＲＮＡ２＋３、また、ポジティブコントロール
としてＲＮＡ１＋２＋３を接種した。接種４８時間後に
、ウェスタンプロット分析により、形質転換植物内で合
成された外被蛋白質の検出を行なった（第８図、ＢＲＩ
ゲル）。その結果、ＲＮＡ２＋３接種区でＲＮＡ１＋２
＋３接種区と同程度の外被蛋白質が検出された。ＲＮＡ
１を接種せずにＲＮＡ２＋３のみを接種した場合にも、
ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被蛋白質
がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲＩ植物
ではすべての細胞で完全な１ａ蛋白質が発現されている
と考えられた。
産物の分析 ＢＲ１植物から焼成したプロトプラストにインビトＯで
合成したＲＮＡ２＋３、また、ポジティブコントロール
としてＲＮＡ１＋２＋３を接種した。接種４８時間後に
、ウェスタンプロット分析により、形質転換植物内で合
成された外被蛋白質の検出を行なった（第８図、ＢＲＩ
ゲル）。その結果、ＲＮＡ２＋３接種区でＲＮＡ１＋２
＋３接種区と同程度の外被蛋白質が検出された。ＲＮＡ
１を接種せずにＲＮＡ２＋３のみを接種した場合にも、
ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被蛋白質
がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲＩ植物
ではすべての細胞で完全な１ａ蛋白質が発現されている
と考えられた。
ＢＲ２植物から調製したプロトプラストにインビトロで
合成したＲＮＡ１＋３を接種した場合にも、外被蛋白質
（２ａ蛋白質）が検出された（第９図、ＢＲ２ゲル）、
ＲＮＡ２を接種せずにＲＮＡ１＋３のみを接種した場合
にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被
蛋白質がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲ
２植物ではすべての細胞で完全な２ａ蛋白質が発現され
ていると考えられた。
合成したＲＮＡ１＋３を接種した場合にも、外被蛋白質
（２ａ蛋白質）が検出された（第９図、ＢＲ２ゲル）、
ＲＮＡ２を接種せずにＲＮＡ１＋３のみを接種した場合
にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被
蛋白質がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲ
２植物ではすべての細胞で完全な２ａ蛋白質が発現され
ていると考えられた。
Ｃ−５Ｃ−５Ｂおよび２植物細胞における導入した遺伝
子産物の分析 ＢＭＲＴ及び２タバコから調製したプロトプラストにイ
ンビトＯで合成したＲＮＡを接種した。
子産物の分析 ＢＭＲＴ及び２タバコから調製したプロトプラストにイ
ンビトＯで合成したＲＮＡを接種した。
接種４８時間後にプロトプラスト内に充満した外缶白質
をウェスタンプロット分析で検出した。その結果、３′
末端の非翻訳領域にのみ欠失をもつｐＢＩＣＢＭＲベク
ターを用いてＲＮＡ１のｃＤＮＡを導入したＢＭＲ１か
ら調製したプロトプラストにＲＮＡ２＋３を接種した場
合にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外
被蛋白質が検出され、また、８ＭＲ２にＲＮＡ１＋３を
接種した場合にも外被蛋白質が検出されたく第１０図、
ＢＭＲゲル〉。ＢＭＲＩもしくはＢＭＲ２では、植物ゲ
ノム中に導入されたＲＮＡ１もしくはＲＮＡ２のｃＤＮ
Ａの転写物は複製能力を持たないため、ウィルスの複製
に必要な１ａ蛋白質もしくは２ａ蛋白質の全てを植物ゲ
ノムからの転写および翻訳に依存されることができたこ
とを示している。また、分節ゲノムウィルスの各遺伝子
をウィルスの複雑な制御機構から独立させ、植物の転写
、翻訳機構に依存することができたことが明らかになっ
た。
をウェスタンプロット分析で検出した。その結果、３′
末端の非翻訳領域にのみ欠失をもつｐＢＩＣＢＭＲベク
ターを用いてＲＮＡ１のｃＤＮＡを導入したＢＭＲ１か
ら調製したプロトプラストにＲＮＡ２＋３を接種した場
合にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外
被蛋白質が検出され、また、８ＭＲ２にＲＮＡ１＋３を
接種した場合にも外被蛋白質が検出されたく第１０図、
ＢＭＲゲル〉。ＢＭＲＩもしくはＢＭＲ２では、植物ゲ
ノム中に導入されたＲＮＡ１もしくはＲＮＡ２のｃＤＮ
Ａの転写物は複製能力を持たないため、ウィルスの複製
に必要な１ａ蛋白質もしくは２ａ蛋白質の全てを植物ゲ
ノムからの転写および翻訳に依存されることができたこ
とを示している。また、分節ゲノムウィルスの各遺伝子
をウィルスの複雑な制御機構から独立させ、植物の転写
、翻訳機構に依存することができたことが明らかになっ
た。
実施例３ 形質転換タバコプロトプラストにおける外来
遺伝子産物の生産 Ａ９組換えＲＮＡ３転写ベクターｐＢＴＧＵｓの構築（
第４図） ＢＭＶ ＲＮＡ３の転写ベクターｐＢＴＦ３をＳｔｕ
■で切断後、平滑末端にＳａｃ Ｉリンカ−を付加し５
ｔｕＩ部位をＳａｃ Ｉ部位に改変後、３ａｃＩ切断及
びセルフライゲーションを行ない、ＤＢＴＦ３の５ａｃ
Ｉ／５ｔｕＩ断片（Ｎｆｌｌ ４７８−１７８２）を欠
失したｐ８ＴＦ３ （Ｓａｃ）を構築した。
遺伝子産物の生産 Ａ９組換えＲＮＡ３転写ベクターｐＢＴＧＵｓの構築（
第４図） ＢＭＶ ＲＮＡ３の転写ベクターｐＢＴＦ３をＳｔｕ
■で切断後、平滑末端にＳａｃ Ｉリンカ−を付加し５
ｔｕＩ部位をＳａｃ Ｉ部位に改変後、３ａｃＩ切断及
びセルフライゲーションを行ない、ＤＢＴＦ３の５ａｃ
Ｉ／５ｔｕＩ断片（Ｎｆｌｌ ４７８−１７８２）を欠
失したｐ８ＴＦ３ （Ｓａｃ）を構築した。
次に、Ｅ）ＢＴＦ３ （Ｓａｃ）（Ｄ外被蛋白質遺伝子
のＡＴＧ翻訳開始点から６塩基対で開裂する旦ｉ ｎｃ
ｌ［部位とＳａＣ工部位の間を外来遺伝子と組変えた転
写ベクターを構築することを試みた。
のＡＴＧ翻訳開始点から６塩基対で開裂する旦ｉ ｎｃ
ｌ［部位とＳａＣ工部位の間を外来遺伝子と組変えた転
写ベクターを構築することを試みた。
ＢＭＶを用いた物質生産のリポータ−遺伝子として、Ｇ
ＵＳ選伝子を用いた。ｐＢｌｌｏｌ （東洋紡（株）Ｋ
１０５０）のプロモーターを取り除いたＧＵＳ遺伝子を
もつＨｉ ｎｄｌｌＩ／ＥｃｏＲＩ断片、すなわちＧＵ
Ｓ遺伝子、ポリリンカー配列およびツバリン合成酵素（
ＮＯ８）ターミネータ−を含む断片を、ｐＵＣ１８の１
−（ｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲＩ部位に導入しｐＵｃＢｌ
ｌｏｌを構築した。Ｅ）ＵＣＢ Ｉ １０１から７種類
の５′末端を持つＧＵＳ遺伝子断片を切り出すことを試
みた。
ＵＳ選伝子を用いた。ｐＢｌｌｏｌ （東洋紡（株）Ｋ
１０５０）のプロモーターを取り除いたＧＵＳ遺伝子を
もつＨｉ ｎｄｌｌＩ／ＥｃｏＲＩ断片、すなわちＧＵ
Ｓ遺伝子、ポリリンカー配列およびツバリン合成酵素（
ＮＯ８）ターミネータ−を含む断片を、ｐＵＣ１８の１
−（ｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲＩ部位に導入しｐＵｃＢｌ
ｌｏｌを構築した。Ｅ）ＵＣＢ Ｉ １０１から７種類
の５′末端を持つＧＵＳ遺伝子断片を切り出すことを試
みた。
ポリリンカー配列中に切断部位をもつＨｉ ｎｃｉｍ、
５ｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、３ｍａ工
のそれぞれの制限酵素で切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行い平滑末端化した後５ａＣＩで切断し、ＧＵＳ
遺伝子を含むＨｉ ｎｄｌｌ［／５ａＣＩ、５ｐｈＩ／
５ａｃＩ、ＰＳｔＩ／５ａＣＩ、ＢａｍＨＩ／Ｓａｃ■
、尺亘ａＩ／比且工■、ＳｍａＩ／比互盃■のそれぞれ
の断片をＤＢＴＦ３ （Ｓａｃ）のＨｉＣＩ［／５ａｃ
Ｉ部位に導入し、ｐＢＴＧＵｓ （Ｈｄ）、（Ｓｈ）、
（Ｐｔ）、（Ｓ ｌ ）、（Ｘａ）、（Ｂｍ）および（
Ｓａ）のそれぞれの組換えＲＮＡ３転写ベクターを構築
した（第４図）。これらの組換えＲＮＡ３転写ベクター
を用いて実施例、Ｂ−１と同様の方法によりインビトロ
的に組換えＲＮＡ３を合成し、それぞれをｔＧＵｓ （
Ｈｄ）、ｔＧＬｌｓ （Ｓｈｅ、ｔＧＵｓ （Ｐｔ）、
ｔＧＵｓ（Ｓ ｌ ） 、ｔＧＬＩｓ （Ｘａ） 、ｔ
ＧＵｓ （Ｂｍ）およびｔＧＵＳ（Ｓａ）とした。
５ｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、３ｍａ工
のそれぞれの制限酵素で切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行い平滑末端化した後５ａＣＩで切断し、ＧＵＳ
遺伝子を含むＨｉ ｎｄｌｌ［／５ａＣＩ、５ｐｈＩ／
５ａｃＩ、ＰＳｔＩ／５ａＣＩ、ＢａｍＨＩ／Ｓａｃ■
、尺亘ａＩ／比且工■、ＳｍａＩ／比互盃■のそれぞれ
の断片をＤＢＴＦ３ （Ｓａｃ）のＨｉＣＩ［／５ａｃ
Ｉ部位に導入し、ｐＢＴＧＵｓ （Ｈｄ）、（Ｓｈ）、
（Ｐｔ）、（Ｓ ｌ ）、（Ｘａ）、（Ｂｍ）および（
Ｓａ）のそれぞれの組換えＲＮＡ３転写ベクターを構築
した（第４図）。これらの組換えＲＮＡ３転写ベクター
を用いて実施例、Ｂ−１と同様の方法によりインビトロ
的に組換えＲＮＡ３を合成し、それぞれをｔＧＵｓ （
Ｈｄ）、ｔＧＬｌｓ （Ｓｈｅ、ｔＧＵｓ （Ｐｔ）、
ｔＧＵｓ（Ｓ ｌ ） 、ｔＧＬＩｓ （Ｘａ） 、ｔ
ＧＵｓ （Ｂｍ）およびｔＧＵＳ（Ｓａ）とした。
Ｂ、ＢＲ２植物におけるＧＵＳ遺伝子の発現Ｂ−１ＧＬ
ＩＳ活性の分析 ＢＲ２植物から１ｕｌｌしたプロトプラストにインビト
ロ的に合成したＲＮＡ１およびＧＵＳ遺伝子を持つ組換
えＲＮＡ３ｔＧＬＩＳ （Ｈｄ）、ｔＧＵｓ （Ｓｈ）
、ｔＧＬＪｓ （Ｐｔ） 、ｔＧＵＢ（Ｓ Ｉ ）
、ｔＧＵｓ （Ｘａ） 、ｔＧＵｓ （Ｂｍ）およびｔ
ＧＵｓ （Ｓａ）のいずれかをそれぞれ接種した。ネガ
ティブコントロールとしてｔＧＬＪｓ（Ｈｄ）、ｔＧＵ
ｓ （Ｓｈ） 、ｔＧＵｓ （Ｐｔ）、ｔＧＵｓ （Ｓ
ｌ ） 、ｔＧＵｓ （Ｘａ） 、ｔＧＬＩｓ（Ｂｍ
）およびｔＧＵｓ （Ｓａ）のみをそれぞれ接種した。
ＩＳ活性の分析 ＢＲ２植物から１ｕｌｌしたプロトプラストにインビト
ロ的に合成したＲＮＡ１およびＧＵＳ遺伝子を持つ組換
えＲＮＡ３ｔＧＬＩＳ （Ｈｄ）、ｔＧＵｓ （Ｓｈ）
、ｔＧＬＪｓ （Ｐｔ） 、ｔＧＵＢ（Ｓ Ｉ ）
、ｔＧＵｓ （Ｘａ） 、ｔＧＵｓ （Ｂｍ）およびｔ
ＧＵｓ （Ｓａ）のいずれかをそれぞれ接種した。ネガ
ティブコントロールとしてｔＧＬＪｓ（Ｈｄ）、ｔＧＵ
ｓ （Ｓｈ） 、ｔＧＵｓ （Ｐｔ）、ｔＧＵｓ （Ｓ
ｌ ） 、ｔＧＵｓ （Ｘａ） 、ｔＧＬＩｓ（Ｂｍ
）およびｔＧＵｓ （Ｓａ）のみをそれぞれ接種した。
接種後４８時間培養したプロトプラストを１００Ｘ９．
２分間の遠心分離によって集めた。プロトプラストに１
８０μｌの溶解緩衝液（５０■Ｈリン酸緩衝液、ｐＨ７
，０，１０ｓＨＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ
１００．０．１％５ａｒｋｏｓｙｌ、１０−Ｈβ−メ
ルカプトエタノール）を加え懸濁後、１０秒間の超音波
処理を数回行ないプロトプラストを破壊した。得られた
懸濁液を１５，０００Ｘｇ、１０分間遠心分離し、約１
８０μオのＧＵＳ蛋白質の粗抽出液を得た。このうち４
５μｌにＧＵＳの基質として１１μｌの１０ｓＨＭＵＧ
（４−メチルランベリフェニルグルクロニド）を加え、
３７℃、２Ｗ＃閣反応を行なった後、２８μオのＩＭ
Ｎａ２ＣＯ２を加え反応を停止した。
２分間の遠心分離によって集めた。プロトプラストに１
８０μｌの溶解緩衝液（５０■Ｈリン酸緩衝液、ｐＨ７
，０，１０ｓＨＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ
１００．０．１％５ａｒｋｏｓｙｌ、１０−Ｈβ−メ
ルカプトエタノール）を加え懸濁後、１０秒間の超音波
処理を数回行ないプロトプラストを破壊した。得られた
懸濁液を１５，０００Ｘｇ、１０分間遠心分離し、約１
８０μオのＧＵＳ蛋白質の粗抽出液を得た。このうち４
５μｌにＧＵＳの基質として１１μｌの１０ｓＨＭＵＧ
（４−メチルランベリフェニルグルクロニド）を加え、
３７℃、２Ｗ＃閣反応を行なった後、２８μオのＩＭ
Ｎａ２ＣＯ２を加え反応を停止した。
反応液に３６５０■のＵ■を照射し、反応産物である４
−ＭＶ（４−メチルウンベルフエＯン）の発する蛍光を
検出した。
−ＭＶ（４−メチルウンベルフエＯン）の発する蛍光を
検出した。
その結果、ＧＵＳ遺伝子を持つ組換えＲＮＡ３にＲＮＡ
Ｉを加えて接種した全ての区でＧＬＩＳ遺伝子の発現が
確認され、その発現量はｔＧＵｓ（Ｓｈ）、（Ｓａ）、
（Ｐｔ）、（Ｈｄ）、（Ｘａ）、（Ｓｌ）、（Ｂｍ）の
順であった（第１１図、ＧＵＳ）。また、ＧＵＳ遺伝子
を持つ組換えＲＮＡ３のみを接種したいずれの区におい
てもＧＵＳ活性は認められなかった。
Ｉを加えて接種した全ての区でＧＬＩＳ遺伝子の発現が
確認され、その発現量はｔＧＵｓ（Ｓｈ）、（Ｓａ）、
（Ｐｔ）、（Ｈｄ）、（Ｘａ）、（Ｓｌ）、（Ｂｍ）の
順であった（第１１図、ＧＵＳ）。また、ＧＵＳ遺伝子
を持つ組換えＲＮＡ３のみを接種したいずれの区におい
てもＧＵＳ活性は認められなかった。
第１表 ＡＢ培地
溶液１ Ｋ２ＨＰＯ４１２ｔ
ＮａＨ２ＰＯ４４ｇ
溶液２ ＮＨ４Ｃｌ ４ＳＦＭＱＳ
０ ・７Ｈ２０１，２９ ＫＣｊ ０．６ｇＣａＣｌ２
０．６ｇ Ｆｅ５０ −７ＨＯ１ｏａｙ 溶液３ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０９
・それぞれ蒸留水に溶解し、２００−にする。溶液１．
２．３をそれぞれ５Ｉ１１とり、８５−のＩＩＩ水と１
．５ｇのＢａｃｔｏ−ａｇａｒを加えオートクＬ／−１
’７殺菌する。カナマシインを添加する場合は４５℃に
冷した後、５０μｇ／−になるように加える。
０ ・７Ｈ２０１，２９ ＫＣｊ ０．６ｇＣａＣｌ２
０．６ｇ Ｆｅ５０ −７ＨＯ１ｏａｙ 溶液３ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０９
・それぞれ蒸留水に溶解し、２００−にする。溶液１．
２．３をそれぞれ５Ｉ１１とり、８５−のＩＩＩ水と１
．５ｇのＢａｃｔｏ−ａｇａｒを加えオートクＬ／−１
’７殺菌する。カナマシインを添加する場合は４５℃に
冷した後、５０μｇ／−になるように加える。
ベトリｉ（直径９ａＩＩ） ３枚に分注する。
第２表
１％０−１１１０ＳｉｔＯＩ
Ｎａｐｈｔｈａｌ１３ｎｅ ａＣｅｔｉＣａｃｉｄ （
ＮＡＡ） ６−Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎａ （ＢＡＰ） ６−ＢｅｎＺＶｌａｄｅｎｉｎａ （ＢＡＰ） Ｓｔｏｃｋ １０ Ｈｙｏ−１ｎｏｓｉｔｏｌ１ｙｓ
ｉｎ Ｐｒｉｄｏｘｌｎ−ＨＣオ Ｎ１ｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｓｔｏｃｋ ８ Ｓｔｏｃｋ ９ Ｓｔｏｃｋ ７ ２．０ｇ ０．０４２ｇ ０．００４ｇ ０．１ｇ ２ｇ ０．０４９ ０．０１ｇ ０．０１ｇ 使用する。
ＮＡＡ） ６−Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎａ （ＢＡＰ） ６−ＢｅｎＺＶｌａｄｅｎｉｎａ （ＢＡＰ） Ｓｔｏｃｋ １０ Ｈｙｏ−１ｎｏｓｉｔｏｌ１ｙｓ
ｉｎ Ｐｒｉｄｏｘｌｎ−ＨＣオ Ｎ１ｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｓｔｏｃｋ ８ Ｓｔｏｃｋ ９ Ｓｔｏｃｋ ７ ２．０ｇ ０．０４２ｇ ０．００４ｇ ０．１ｇ ２ｇ ０．０４９ ０．０１ｇ ０．０１ｇ 使用する。
■ ５ｔｏｃｋ １．２．３．４．５．６を各１０ｄず
つ入れる。
つ入れる。
■ 下表に従ってホルモン５ｔｏｃｋを加える。
滅菌した抗生物質を添加する。
発芽用（ＬＳ４）
発振用（ＬＳ７）
幼植物用（ＬＳ８）
０、５ａ９
２．５ｄ
ｄ
１０〆
２０ｏＩｄとする。
第１図は、ＢＭＶの遺伝子発現様式である。
第２図は、ＢＭＶ各遺伝子のタバコ形質転換用ベクター
である。 第３図は、転写ベクターへのＢＭＶ ＲＮＡ完全長ｃ
ＤＮＡの導入とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインご
トロＢＭＶ ＲＮＡ合成を示す。 第４図は、組換えＲＮＡ３の転写ベクターの構築を示す
。 第５図は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターへの制限酵素部
位の導入法を示す。 第６図は、ＢＭＸ ＲＮＡ完全長ｃＤＮＡを導入した
形質転換用ベクターｐＢＩｃ ＢＲＩ〜３の構築を示
す。 第７図は、３′末端の非翻訳領域に欠失を持つＢＭＶ
ＲＮＡのｃＤＮＡを導入した形質転換用ベクターｐＢ
Ｌｃ ＢＭＲＩ、２及び３の構築を示す。 第８図は、ＢＲＩタバコ細胞内で蓄積したＢＭＶ外被蛋
白質のウェスタンプロット分析の結果を示す写真（電気
泳動〉。 第９図は、ＢＲ２タバコ細胞内で蓄積したＢＭＶ外被蛋
白質のウェスタンプロット分析の結果を示す写真（電気
泳動）。 第１０図は、ＢＭＲ１及び８ＭＲ２タバコ細胞内で蓄積
したＢＭＶ外被蛋白質のウェスタンプロットの分析を示
す写真（電気泳動）。 第１１図は、ＢＲ２タバコにおけるＧＬＩＳ遺伝子の発
現について蛍光法の結果を示す写真。 第１２図は、所望のポリペプチドの発現法を示す模式図
である。
である。 第３図は、転写ベクターへのＢＭＶ ＲＮＡ完全長ｃ
ＤＮＡの導入とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインご
トロＢＭＶ ＲＮＡ合成を示す。 第４図は、組換えＲＮＡ３の転写ベクターの構築を示す
。 第５図は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターへの制限酵素部
位の導入法を示す。 第６図は、ＢＭＸ ＲＮＡ完全長ｃＤＮＡを導入した
形質転換用ベクターｐＢＩｃ ＢＲＩ〜３の構築を示
す。 第７図は、３′末端の非翻訳領域に欠失を持つＢＭＶ
ＲＮＡのｃＤＮＡを導入した形質転換用ベクターｐＢ
Ｌｃ ＢＭＲＩ、２及び３の構築を示す。 第８図は、ＢＲＩタバコ細胞内で蓄積したＢＭＶ外被蛋
白質のウェスタンプロット分析の結果を示す写真（電気
泳動〉。 第９図は、ＢＲ２タバコ細胞内で蓄積したＢＭＶ外被蛋
白質のウェスタンプロット分析の結果を示す写真（電気
泳動）。 第１０図は、ＢＭＲ１及び８ＭＲ２タバコ細胞内で蓄積
したＢＭＶ外被蛋白質のウェスタンプロットの分析を示
す写真（電気泳動）。 第１１図は、ＢＲ２タバコにおけるＧＬＩＳ遺伝子の発
現について蛍光法の結果を示す写真。 第１２図は、所望のポリペプチドの発現法を示す模式図
である。
Claims (7)
- （１）植物ゲノムにＢＭＶのＲＮＡ１及び／又は２のｃ
ＤＮＡ及びＢＭＶ ＲＮＡ外被蛋白質遺伝子の全部又は
一部を所望のポリペプチドの構造遺伝子と組換えた組換
えＢＭＶ ＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入又は接種すること
によって、所望のポリペプチドを発現することを特徴と
するポリペプチドの製造法。 - （２）植物ゲノムにＢＭＶのＲＮＡ１及び／又は２のｃ
ＤＮＡを導入することによつて、１ａ及び又は２ａ蛋白
質を生産し、該植物細胞に組換えＢＭＶ ＲＮＡ３を接
種することによつて、ポリペプチドを発現することを特
徴とするポリペプチドの製造法。 - （３）上記ｃＤＮＡが、完全長ｃＤＮＡ若しくは３′末
端末非翻訳領域に欠失を持つｃＤＮＡである請求項１又
は２記載の製造法。 - （４）インビトロ的に機能的なプロモーターとＢＭＶの
ＲＮＡ３ ｃＤＮＡからなるベクターであって、ＢＭＶ
ＲＮＡ３外被蛋白質遺伝子の全部または一部を所望の
ポリペプチドの構造遺伝子と組換えた組換えＢＭＶ Ｒ
ＮＡ３を生産する転写ベクター。 - （５）請求項１又は２記載の製造法に使用するための、
植物細胞中で機能的なプロモーター及びターミネーター
に、ＢＭＶ ＲＮＡ１、２又は３のｃＤＮＡを導入した
植物形質転換用ベクター。 - （６）上記ｃＤＮＡが完全長ｃＤＮＡ若しくは３′末端
非翻訳領域に欠失を持つｃＤＮＡである請求項５のベク
ター。 - （７）請求項５又は６記載のベクターで形質転換された
植物細胞。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2238234A JPH04121200A (ja) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | 植物細胞におけるポリペプチドの製造法 |
| AU71951/91A AU636717B2 (en) | 1990-09-07 | 1991-02-28 | Process for production of exogenous gene or its product in plant cells |
| US07/663,164 US5824856A (en) | 1990-09-07 | 1991-03-01 | Process for production of exogenous gene or its product in plant cells |
| CA002037677A CA2037677C (en) | 1990-09-07 | 1991-03-06 | Process for production of exogenous gene or its product in plant cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2238234A JPH04121200A (ja) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | 植物細胞におけるポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04121200A true JPH04121200A (ja) | 1992-04-22 |
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