JP2002537842A

JP2002537842A - 外来の配列を発現するための多成分ｒｎａベクター系

Info

Publication number: JP2002537842A
Application number: JP2000603401A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ルワンドースキ，デニス; オー．ドーソン，ウィリアム; エイチ．ターペン，トーマス; ピー．ポーグ，グレゴリー
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-08
Publication date: 2002-11-12
Also published as: WO2000053780A3; NZ514055A; IL145221A0; KR20020013508A; US20020138873A1; EP1165811A2; WO2000053780A2; AU3618300A; BR0008766A; MXPA01009043A; CA2372306A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＲＮＡウィルス由来のＲＮＡレプリコンおよびヘルパーウィルスからなる多成分ＲＮＡベクター系を特徴とする。本発明はさらに、この多成分ＲＮＡベクター系を用いて植物中で外来のＲＮＡ、エフェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドを産生する方法を特徴とする。さらに本発明は、この多成分ＲＮＡベクター系を用いて外来のＲＮＡ、エフェクターＲＮＡ、タンパク質、およびペプチドの安定した全身性の生産を行なうための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する分野本発明は、広くはＲＮＡウィルスおよび植物遺伝学の分野に関する。より具体
的には本発明は、植物中において外来のＲＮＡ、エフェクターＲＮＡ、タンパク
質、またはペプチドを生産するために複製ＲＮＡを使用する方法に関する。

【０００２】発明の背景ＲＮＡウィルスは、その宿主にさまざまな植物および動物を含む感染性物質の
多種多様な系統群である。これらのゲノムは、ＤＮＡ中間体を形成することなく
複製し、ある宿主細胞から別の宿主細胞に移動するＲＮＡからなる。ＲＮＡウィ
ルスのゲノムは、１つまたは多数いずれかのＲＮＡセグメントから構成されてい
てもよい。ＲＮＡウィルスはさらに、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウィルスまた
は二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウィルスに分かれていてもよい。ｓｓＲＮＡウィ
ルスはさらに、プラス鎖、マイナス鎖、または両センスウィルスに分かれていて
もよい。プラス鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡは、裸のＲＮＡを感染性にする
メッセンジャーセンスである。

【０００３】多くの植物ウィルスは、プラス鎖ＲＮＡウィルスの系統群に属する。これらに
はタバコモザイクトバモウィルス（ＴＭＶ）、ブロムモザイクブロモウィルス（
ＢＭＶ）、カーネーションモザイクカーモウィルス（ＣａｒＭＶ）その他が含ま
れる。ＲＮＡ植物ウィルスは一般に、ウィルスの複製およびｍＲＮＡの合成に不
可欠なレプリカーゼ／ポリメラーゼ（非構造）タンパク質；細胞外継代のための
保護殻を提供するコートタンパク質；ウィルスの細胞から細胞への移動、全身性
の感染、および自己集合にとって必要なその他のタンパク質；など幾つかの普通
のタンパク質をコードする。

【０００４】幾つかのＲＮＡウィルス感染は二種類のＲＮＡの混合物、すなわち複製能欠損
ヘルパー依存性ＲＮＡおよび複製応答能のあるウィルスからなる。複製応答能の
あるウィルスは、複製能欠損ＲＮＡの複製のためのヘルパーウィルスとして働く
。本質的に３種類の複製能欠損ＲＮＡ、すなわちウィルスのゲノムＲＮＡ由来の
複製能欠損ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、およびサテライトウィルス
があり、これらは全てヘルパーウィルスの存在下においてのみ複製する。サテラ
イトＲＮＡおよびウィルスは、これらヘルパーウィルスとほとんど相同性のない
ゲノムを有する（Ｆｒａｎｃｋｉ，Ｒ．の論文、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．３９：１５１〜１７４（１９８５））。

【０００５】幾つかのｄＲＮＡは、これらヘルパーウィルスの複製にマイナスの影響をもち
、したがって欠陥干渉（ＤＩ）ＲＮＡと呼ばれる。ＤＩＲＮＡは、細胞培養にお
ける動物ウィルスの高力価の継代と最もよく関連している（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ
．の論文、「Ｖｉｒｏｇｙ」Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編
、第２版、１：１５１〜１６５，ＲａｖｅｗｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９９０））。ＤＩＲＮＡは、複製サイクルが加わるとともに、より複雑な構
造を獲得する可能性のある単純な欠失変異体として発生して、新たに進化するよ
うにみえる。ＤＩＲＮＡを産生するウィルスの例にはシンドビスウィルスおよび
コロナウィルスがある。天然に産出するＤＩＲＮＡは、トマト・ブッシイ・スタ
ントウィルス（ＴＢＳＶ）、カブ連葉ウィルス（ＴＣＶ）、およびシンビジウム
輪点ウィルスなどのトームブスウィルス（ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）科の一員で
ある幾つかの植物ウィルスと関連して発見された（Ｈｉｌｌｍａｎ等の論文、「
Ｃｅｌｌ」５１：４２７〜４３３（１９８７）；Ｌｉらの論文、「Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：９１７３〜９１７７（１９８９）；
Ｂｕｒｇｙａｎ等の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」７０：２３５〜２３９
（１９８９））。

【０００６】またｄＲＮＡは、クローバーイエローモザイクポテックスウィルス（Ｗｈｉｔ
ｅ等の論文、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」６６：３０６９〜３０７６（１９９２））お
よび柑橘トリステザクロステロウィルス（Ｙａｎｇ等の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．」７８：１７６５〜１７６９（１９９７））の感染と関連して発見さ
れた。サテライトＲＮＡ、サテライトウィルス、およびｄＲＮＡは、複製サイク
ルを完成するためにヘルパーウィルスにより与えられる必須機能を必要とする。
両サテライト類またはＤＩＲＮＡと特定のウィルス感染の連係は、ヘルパーウィ
ルスの病理学的効果を改良もしくは増大のいずれかにつながる可能性がある。

【０００７】両サテライト類およびＤＩＲＮＡは、しばしばヘルパーウィルス自身の複製を
犠牲にして増殖する。往々にして、継代が繰り返されるに従って感染細胞中の支
配的な病原性ＲＮＡは、検出可能な最少限のヘルパーウィルスＲＮＡを伴うサテ
ライトＲＮＡまたはＤＩＲＮＡのＲＮＡになる。幾人かの研究者は、形質転換し
た植物中でサテライトＲＮＡを発現させることによりこの特性を引き出してヘル
パーウィルスにより引き起こされる病に対する抵抗性を付与した（Ｇｅｒｌａｃ
ｈ等の論文、「Ｎａｔｕｒｅ」３２８：８０２〜８０５（１９８７）；Ｈａｒｒ
ｉｓｏｎ等の論文、「Ｎａｔｕｒｅ」３２８：７９９〜８０２（１９８７））。
しかしながらこの方法は、大部分の植物ウィルスがそれらと関連のある天然に産
出するサテライトＲＮＡまたはＤＩＲＮＡを持たないために、かつまたこれらＲ
ＮＡが往々にして予測できない形で病を一層悪化させる可能性があるために広く
適用できないことが分かった。これらの問題を回避するために、研究者たちは生
体外でポリオウィルスのゲノムからｄＲＮＡを構築した（Ｈａｇｉｎｏ−Ｙａｍ
ａｇｉｓｈｉ等の論文、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」６３：５３８６〜５３９２（１９
８９）およびＢＭＶ（Ｍａｒｓｈ等の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」７２：１７８７〜１７９２（１９９１）））。

【０００８】これらのウィルスの正常な自己複製ゲノムＲＮＡから内部配列を欠失させて、
或る必須の特性が欠けた状態にすることにより、これらのウィルスから得られる
ｄＲＮＡまたは「ＲＮＡレプリコン」を人工的に産生した。これらのＲＮＡはも
はや自己複製することはできず、必要なタンパク質は共接種したヘルパーウィル
スによりｉｎｔｒａｎｓで供給された。ＢＭＶの場合、ＲＮＡレプリコンは共
接種したヘルパーウィルスをヘルパーウィルスＲＮＡの蓄積の劇的な減少につな
がる複製機構の競合外におくことを可能にした（Ｍａｒｓｈ等の論文、「Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」７２：１７８７〜１７９２（１９９１））。この競合は、
ＲＮＡレプリコンから翻訳される可能性のある任意の欠陥タンパク質に左右され
ず、これらの小さなＲＮＡが大きなヘルパーＲＮＡに勝る固有の複製の利点が原
因となって生じた結果であった。ＲＮＡレプリコンが形質転換した植物中で発現
されると、これらの細胞はＢＭＶの感染に効果的に「抵抗」する（Ｍａｒｓｈ等
の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」７２：１７８７〜１７９２（１９９１）
）。

【０００９】完全長のウィルスのゲノムからのＲＮＡレプリコンの構築は自明なことではな
い。ウィルスのゲノム中に導入された多くの内部欠失は、自己複製または複製さ
れる能力のないＲＮＡにする。それにもかかわらず若干の非複製ウィルス由来の
ＲＮＡレプリコンの存在はまだ、共接種された野生型ウィルスの増殖にとって抑
制的である可能性がある（Ｍａｒｓｈ等の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」７２：２３６７〜２３７４（１９９１）；Ｐｏｇｕｅ等の論文、「Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ」１８８：７４２〜７５３（１９９２））。内部欠失は、必須タンパク質の
翻訳に悪影響を及ぼし、同じ遺伝子クラスター内の配列（ｃｉｓ作用配列）の機
能を弱体化させ、またはＲＮＡ配列を複製にとって抑制性の高次構造に並べる可
能性がある。

【００１０】いったん構築されると、ＲＮＡレプリコンの複製応答能は予測不能であり、植
物中のパッケージングおよび全身性の移動に対する応答能を含む未だ最適化され
ていない多くの別の必要機能が往々にして劣っている。ＲＮＡレプリコンのカプ
シド化され、ヘルパーウィルスとともに植物の全身に輸送される能力は、ＫＬ、
ＴＭＶ由来のＲＮＡレプリコン、およびＴＭＶについて実証されている（Ｒａｆ
ｆｏおよびＤａｗｓｏｎの論文、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」１８４：２７７〜２８９
（１９９１））。ＴＭＶの大きい部分の非構造コード化領域が欠失しているこの
ＲＮＡレプリコンは、ＴＭＶを共接種した場合、タバコ植物中で妥当なレベルま
で複製した。しかしながら全身性の組織から単離されると，ＫＬレプリコンはＲ
ＮＡの可変集団中で同定されている内部欠失の混合物によりさらに進化を受けた
。植物中のパッケージングおよび全身性の転送の抑制と結び付いた連続する複製
サイクルは、ＫＬレプリコンの急速な進化に圧力をかけているようにみえる。

【００１１】発明の概要本発明は、ヘルパーウィルスによりｉｎｔｒａｎｓで複製される１または複
数の複製応答能のあるヘルパーウィルスおよび１または複数のＲＮＡレプリコン
からなる多成分ＲＮＡベクター系を特徴とする。本発明はさらに、植物中におい
て多成分ＲＮＡベクター系を用いて、１または複数の外来のＲＮＡ、多数のエフ
ェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドを発現させる方法を特徴とする。
さらに本発明は、多成分ＲＮＡベクター系を用いて１または複数の外来のＲＮＡ
、多数のエフェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドを安定して全身に発
現させる方法を提供する。

【００１２】一態様においてＲＮＡレプリコンは、５′非翻訳領域（ＮＴＲ）；ＲＮＡウィ
ルスの非構造タンパク質の完全体または断片のオープンリーディングフレーム（
ＯＲＦ）と相同なＯＲＦ、ＲＮＡウィルスにとって非固有の配列；および３′Ｎ
ＴＲ、を含有するように設計することができる。ＲＮＡレプリコンの３′ＮＴＲ
は、ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲの源にとって固有のものでも非固有の
ものでもよい。加えてＲＮＡレプリコンの３′ＮＴＲは、２つ以上のヘルパーウ
ィルスの３′ＮＴＲのハイブリッドであってもよい。ＲＮＡレプリコンの５′Ｎ
ＴＲもまた、ヘルパーＲＮＡウィルスの５′ＮＴＲの源にとって固有のものでも
非固有のものでもよい。ＲＮＡレプリコンはこれに加えて、ヘルパーウィルスに
とって固有もしくは非固有の源由来のもの、１もしくは複数のパッケージングシ
グナル、内部開始部位、サブゲノムｍＲＮＡプロモーター配列、コートタンパク
質、または移動タンパク質のいずれかを含有してもよい。ＲＮＡレプリコンはま
た、非固有の配列の挿入を容易にするために適切な制限部位を含有してもよい。
好ましくはＲＮＡレプリコンの５′ＯＲＦは、ＲＮＡウィルスの非構造タンパク
質の完全体または断片と相同な配列をコードする。ＲＮＡレプリコンは、さまざ
まなＲＮＡ植物および動物のウィルスから得ることができる。加えてＲＮＡレプ
リコンは、２つ以上のウィルス源由来の固有の配列を含有するハイブリッドであ
ってもよい。

【００１３】第二の態様においてヘルパーウィルスＲＮＡは、ＲＮＡレプリコンをｉｎｔ
ｒａｎｓで複製するために、野生型ウィルスのＲＮＡ配列またはその修飾された
配列を含有させてヘルパーウィルスＲＮＡをより応答能のあるようにしてもよい
。加えてハイブリッドヘルパーＲＮＡウィルスを、２つ以上のＲＮＡウィルス源
由来の固有の配列を包含するように構築することもできる。好ましくは野生型タ
バコモザイクウィルスおよびその突然変異形態を本発明において用いることがで
きる。野生型ＲＮＡ植物ウィルスの修飾には、とりわけ抑制終止コドンの除去ま
たは突然変異、ＯＲＦの除去またはコートタンパク質への置換、３′ＮＴＲの置
換、あるいは１または複数のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターの使用を含むこと
ができる。コートタンパク質、３′ＮＴＲ、またはサブゲノムｍＲＮＡプロモー
ターをコードするものなど、挿入して野生型ヘルパーウィルスの修飾形にする配
列は非固有の源由来のものであってもよい。ヘルパーウィルスのその他の修飾に
は野生型の表現型への復帰、例えばセンスコドンの終止コドンへの復帰を最小限
に抑えるための抑制終止コドン中および／または近傍のＲＮＡ配列の修飾が含ま
れる。より好ましくは、本発明において抑制終止コドンを置換するＴＭＶの突然
変異を用いることができる。このようなＴＭＶ終止コドンの突然変異には、チロ
シン（ＴＭＶ１８３Ｙ）、フェニルアラニン（ＴＭＶ１８３Ｆ）、セリン（ＴＭ
Ｖ１８３Ｓ）などを含まれる。最も好ましくはＴＭＶ終止コドンの突然変異ＴＭ
Ｖ１８３Ｆが、ヘルパーウィルスとして働くためには特に有効である。ＲＮＡレ
プリコンに関して非相同性のヘルパーウィルスもまた、ＲＮＡレプリコンを複製
するために用いることができる。特にヘルパーウィルスとしてのオドントグロッ
サム（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ）輪点ウィルス（ＯＲＳＶ）は、さまざまな
ＴＭＶのＲＮＡレプリコンを複製することができる。ＲＮＡヘルパーウィルスは
また、さまざまなＲＮＡ動物のウィルス、とりわけポリオウィルス、アルファウ
ィルス、またはライノウィルスなどから得ることができる。

【００１４】ヘルパーウィルスは、多成分ベクター系中のＲＮＡレプリコンと相補的である
。ヘルパーウィルスは、ヘルパーウィルスの細胞から細胞への移動を妨げまたは
不能にする可能性のある１または複数の機能および構造タンパク質がゲノムから
除去されていてもよい。必要な機能性および構造タンパク質は、ＲＮＡレプリコ
ンによりｉｎｔｒａｎｓで供給することができる。これらの機能性および構造
タンパク質には、とりわけ移動タンパク質およびカプシド化タンパク質が含まれ
る。ヘルパーウィルスとレプリコンの間の相互関係もまた、修飾されたヘルパー
ウィルスが外来のＲＮＡを運ぶ可能性があるという点で、および／またはＲＮＡ
レプリコンの複製を容易にするという役割に加えて興味の対象の多数のエフェク
ターＲＮＡ、タンパク質、もしくはペプチドを産生することができるという点で
関係がある可能性がある。

【００１５】第三の態様において、ＲＮＡレプリコンおよび適切なヘルパーウィルスの植物
中への送達は、生体外で転写されたＲＮＡの接種、ウィルス粒子の接種、または
核ｃＤＮＡ由来の植物細胞の内部接種、あるいはこれら手順のいずれかの結果得
られる全身性の感染により行なうことができる。ベクター系の任意の成分をこれ
らの手順のいずれかにより送達することができる。全てのケースにおいて共感染
は、植物細胞における１もしくは複数の外来のＲＮＡ、エフェクターＲＮＡ、タ
ンパク質、またはペプチドの急速かつ全面的に広がる全身性の発現につながる可
能性がある。興味の対象のタンパク質遺伝子または配列を有するＲＮＡによる植
物の全身性の感染に続いて、感染した宿主を成長させて所望の産物を生産し、必
要ならば所望の産物を単離し精製する。感染した宿主の成長は従来の技術に従っ
て行なわれ，得られた産物の単離および精製も同様である。

【００１６】（発明の詳細な説明）本発明は、１または複数の適切なヘルパーウィルスにより複製される１または
複数のＲＮＡレプリコンからなる多成分ＲＮＡベクター系を特徴とする。本発明
はさらに、多成分ＲＮＡベクター系を用いて植物中で外来のＲＮＡ、多数のエフ
ェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドを発現させる方法を特徴とする。
さらに本発明は、多成分ＲＮＡベクター系を用いて外来のＲＮＡ、多数のエフェ
クターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドを安定して全身で生産させる方法を
提供する。

【００１７】一態様においてＲＮＡレプリコンは、５′ＮＴＲ、ＲＮＡウィルスの非構造タ
ンパク質の完全体または断片のＯＲＦと相同なＯＲＦ、ＲＮＡウィルスにとって
非固有の配列、および３′ＮＴＲを含有するように設計することができる。ＲＮ
Ａレプリコンの３′ＮＴＲは、ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲの源にとっ
て固有のものでも、非固有のものでもよい。加えてＲＮＡレプリコンの３′ＮＴ
Ｒは、２つ以上のヘルパーウィルスの３′ＮＴＲのハイブリッドであってもよい
。ＲＮＡレプリコンの５′ＮＴＲもまた、ヘルパーＲＮＡウィルスの５′ＮＴＲ
の源にとって固有のものでも、非固有のものでもよい。ＲＮＡレプリコンは、こ
れに加えてヘルパーウィルスにとって固有または非固有の源由来のもの、１また
は複数のパッケージングシグナル、内部開始部位、サブゲノムｍＲＮＡプロモー
ター配列、コートタンパク質、あるいは移動タンパク質のいずれかを含有するこ
とができる。ＲＮＡレプリコンはまた、非固有の配列の挿入を容易にするために
適切な制限部位を含有することができる。好ましくはＲＮＡレプリコンの５′Ｏ
ＲＦは、ＲＮＡウィルスの非構造タンパク質の完全体または断片と相同な配列を
コードする。

【００１８】ＲＮＡレプリコンは、とりわけポチウィルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、トバモ
ウィルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、ブロモウィルス（ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ
）、カーモウィルス（ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）、ポテックスウィルス（ｐｏｔｅ
ｘｖｉｒｕｓ）、クロステロウィルス（ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ホルデ
イウィルス（ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、コモウィルス（ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）
、アルファルファモザイクウィルス（ａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕ
ｓ）、またはバイモウィルス（ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ）など、さまざまなＲＮＡ植
物ウィルスに由来することができる。ＲＮＡレプリコンはまた、とりわけアルフ
ァウィルス、ポリオウィルス、またはライノウィルスなど、さまざまなＲＮＡ動
物ウィルスに由来することもできる。ＲＮＡレプリコンは単一のウィルス由来の
配列を含有してもよいが、２種類以上の系統群由来のウィルスを含む２種類以上
のウィルス由来の配列を含有することもできる。当業者ならば本発明を用いてこ
れらウィルスに基づきＲＮＡレプリコンを構築することができるはずである。

【００１９】好ましい態様においては、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）がＲＮＡレプリ
コン構築用の遺伝子骨格として使用される。ＴＭＶは２種類の非構造タンパク質
である、推定のレプリカーゼである１２６ｋＤａのタンパク質（ドメイン１およ
び２）および１８３ｋＤａのタンパク質（ドメイン１、２、および３）を産生す
る。タンパク質の発現およびＲＮＡの生産用のＴＭＶ由来のＲＮＡレプリコンは
少なくとも、５′末端から３′末端まで、ＴＭＶの５′ＮＴＲに固有の５′ＮＴ
Ｒ、ＴＭＶの非構造タンパク質の遺伝子部分と相同なＯＲＦ、ＴＭＶにとって固
有または非固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、非固有の配列、およびＴＭ
Ｖにとって固有または非固有の３′ＮＴＲを含有する。より好ましくはＴＭＶ由
来のＲＮＡレプリコンは、ＴＭＶの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、ＴＭ
Ｖ１２６ｋＤａの非構造タンパク質のドメイン１および２の完全体または断片を
コードするヌクレオチド配列、サブゲノムｍＲＮＡプロモーター；興味の対象の
ＲＮＡまたはタンパク質をコードする配列およびヘルパーウィルスにとって固有
または非固有の３′ＮＴＲを含有することができる。サブゲノムｍＲＮＡプロモ
ーターは、ＴＭＶにとって固有でも非固有でもよい。例えばＴＭＶコートタンパ
ク質のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターを利用することができる。３′ＮＴＲは
、ＴＭＶにとって固有でも非固有でもよい。例えばＲＮＡレプリコンの３′ＮＴ
Ｒは、野生型ＴＭＶの３′ＮＴＲ由来のものでも、別のトバモウィルス由来のも
のでもよい。

【００２０】これに加えてＴＭＶコートタンパク質のＯＲＦの完全体または断片をコードす
る配列もまた、ＴＭＶのＲＮＡレプリコンのゲノム中に含まれていてもよい。例
えばＴＭＶコートタンパク質の３′末端から約１００、２００、または３００個
のヌクレオチドを、興味の対象の外来の配列の末端と３′ＮＴＲとの間に挿入す
ることができる。生存可能なＲＮＡレプリコンの構造の場合、ゲノムＲＮＡ由来
の抑制性の領域は一般に除去される。ＴＭＶ由来のＲＮＡレプリコンにおいては
、これら抑制性の領域は、とりわけ３′末端からＴＭＶ１２６ｋＤａのタンパク
質の部分、移動タンパク質の部分、コートタンパク質の部分、またはＴＭＶ１８
３ｋＤａのタンパク質の読み飛ばし部分をコードする配列を包含し得る。

【００２１】第二の態様において、ヘルパーウィルスのＲＮＡは、ヘルパーウィルスのＲＮ
Ａの応答能をより大きくしてｉｎｔｒａｎｓでＲＮＡレプリコンを複製するよ
うに、野生型ウィルスのＲＮＡ配列またはその修飾された配列を含有してもよい
。ヘルパーＲＮＡ植物ウィルスは、とりわけポチウィルス、トバモウィルス、ブ
ロモウィルス、カーモウィルス、ポテックスウィルス、クロステロウィルス、ホ
ルデイウィルス、コモウィルス、アルファルファモザイクウィルス、またはバイ
モウィルスなどの多数の適切なＲＮＡ植物ウィルスから得ることができる。これ
に加えてハイブリッドヘルパーＲＮＡウィルスを、２つ以上のＲＮＡウィルス源
由来の固有配列を包含するように構築することもできる。好ましくは野生型タバ
コモザイクウィルスおよびその突然変異形態が本発明において用いられる。野生
型ＲＮＡ植物ウィルスの修飾には、とりわけ抑制終止コドンの除去または突然変
異、コートタンパク質のためのＯＲＦの除去または置換、３′ＮＴＲの置換、あ
るいは１または複数のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターの使用が含まれる。

【００２２】コートタンパク質、３′ＮＴＲ、またはサブゲノムｍＲＮＡプロモーターをコ
ード化するものなど、挿入して野生型ヘルパーウィルスの修飾形にする配列は、
非固有の源由来のものであってもよい。ヘルパーウィルスのその他の修飾には、
野生型表現型への復帰、例えばセンスコドンの終止コドンへの復帰を最小限に抑
えるために抑制終止コドン中および／または近傍のＲＮＡ配列を修飾することが
含まれる。抑制終止コドンのフランキング配列を修飾する例は、Ｓｋｕｚｅｓｋ
ｉ等の論文、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１８：３６５〜３７３（１９９１）
に見出すことができる。より好ましくは、抑制終止コドンを置換するＴＭＶの突
然変異を本発明において用いることができる。このようなＴＭＶ終止コドンの突
然変異には、チロシン（ＴＭＶ１８３Ｙ）、フェニルアラニン（ＴＭＶ１８３Ｆ
）、セリン（ＴＭＶ１８３Ｓ）などがある。最も好ましくは、ＴＭＶ終止コドン
の突然変異である、ＴＭＶ１８３Ｆがヘルパーウィルスとして働くためには特に
有効である。

【００２３】ＲＮＡレプリコンに関して非相同のヘルパーウィルスもまた、ＲＮＡレプリコ
ンを複製するために用いることができる。特にヘルパーウィルスとしてのＯｄｏ
ｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ輪点ウィルス（ＯＲＳＶ）は、さまざまなＴＭＶのＲＮＡ
レプリコンを複製することができる。ＲＮＡヘルパーウィルスはまた、さまざま
なＲＮＡ動物ウィルス、とりわけポリオウィルス、アルファウィルス、またはラ
イノウィルスなどから得ることもできる。ヘルパーウィルスは、多成分ベクター
系中のＲＮＡレプリコンと相補的である。ヘルパーウィルスは、ヘルパーウィル
スの細胞から細胞への移動を妨げまたは不能にする可能性のある１または複数の
機能および構造タンパク質がゲノムから除去されてもよい。必要な機能および構
造タンパク質は、ＲＮＡレプリコンによりｉｎｔｒａｎｓで供給することがで
きる。これらの機能性および構造タンパク質には、とりわけ移動タンパク質およ
びカプシド化タンパク質が含まれる。ヘルパーウィルスとレプリコンの間の相互
関係もまた、修飾ヘルパーウィルスが外来のＲＮＡを運ぶ可能性があるという点
で、および／またはＲＮＡレプリコンの複製を容易にする役割に加えて興味の対
象の多数のエフェクターＲＮＡ、タンパク質、もしくはペプチドを産生すること
ができるという点で関係がある可能性がある。

【００２４】第三の態様において、ＲＮＡレプリコンおよび適切なヘルパーウィルスの植物
中への送達は、生体外で転写されたＲＮＡの接種、多ウィルス粒子の接種、また
は核ｃＤＮＡ由来の植物細胞の内部接種、あるいはこれら手順のいずれかの結果
得られる全身性の感染により行なうことができる。ベクター系の任意の成分は、
これらの手順のいずれかにより送達することができる。全てのケースにおいて共
感染は、植物細胞において１または複数の外来ＲＮＡ、多エフェクターＲＮＡ、
タンパク質、あるいはペプチドの急速かつ全面的に広がる全身性の発現につなが
る可能性がある。興味の対象のＲＮＡおよびタンパク質の遺伝子または配列によ
る植物の全身性の感染は、所望の産物を生産するための感染した宿主の成長、お
よび必要ならば所望の産物の単離および精製がこれに続いてもよい。感染した宿
主の成長は従来の技術に従って行なわれ，得られた産物の単離および精製も同様
である。

【００２５】多成分ＲＮＡベクター系を用いて植物細胞中で生産された外来のＲＮＡ，エフ
ェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドは、植物中の適切な形質を改良す
るために使用することができる。植物細胞中の有用な表現型形質には、除草剤耐
性の改良；極端な暑さおよび寒さ、旱魃、塩分、または浸透圧のストレスに対す
る耐性の改良；有害生物（昆虫類、線虫類、もしくは蛛形類）または病気（真菌
性、細菌性、もしくはウィルス性）に対する耐性、酵素もしくは二次代謝産物の
生産、雄もしくは雌の繁殖不能性、矮小性、早熟性の改良；収率、成長力、ハイ
ブリッド強勢、栄養学的品質、風味、または加工特性の改良；麦芽製造用大麦に
おける根の成長の防止もしくは抑制；などがあるがこれには限定されない。タン
パク質またはペプチドの生産はまた業務用途に向けられ、そのような産物には酵
素、抗体、ホルモン、医薬、メラミン、ワクチン、色素、抗生物質などがある。
多成分ＲＮＡベクター系において検討された多遺伝子発現ベクターは特に、生合
成の経路において多数のステップを操作するための遺伝子、望ましくない植物遺
伝子の内因性の発現を抑制するアンチセンス配列、通常ならば「抑制された」植
物遺伝子により悪影響を受ける産物の遺伝子、または生体内で折りたたまれ完全
に集合する異種多量体タンパク質をコードする遺伝子を発現させるのに有効であ
る可能性がある。

【００２６】植物中で外来の配列を産生するための組換えＲＮＡレプリコンおよびヘルパー
ＲＮＡウィルスは、当業界でよく知られた技術を用いて構築される。好適な技術
が米国特許第５，３１６，９３１号、第５，８１１，６５３号、第５，８６６，
７８５号、第５，５８９，３６７号、および第５，８８９，１９０号に記載され
ており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

【００２７】本発明において開示された多成分ＲＮＡベクター系は、植物中でＲＮＡおよび
タンパク質を生産するために用いられている業務用に使用されるウィルスベース
のベクター系の改良を意味する。業務用に使用される系は、一般に非ウィルス配
列が挿入されている単一成分ベクターであり、得られる修飾されたウィルスは植
物の感染に用いられる。本発明における改良は、多種類のタンパク質またはＲＮ
Ａの生産を可能にし、また単一成分ベクター中では不安定なタンパク質のより安
定な生産を可能にする。特に本発明は、外来のタンパク質、ＲＮＡ、またはエフ
ェクターＲＮＡを植物細胞中で高レベルで増幅し、発現することができる安定な
多成分ＲＮＡベクター系を特徴とする。

【００２８】ＲＮＡおよびタンパク質発現用の多成分ＲＮＡベクター系の多くの面は、植物
細胞中での外来のＲＮＡおよびタンパク質の発現において柔軟性と安定性を与え
る点で有利である。第一に、多成分ＲＮＡベクター系中のＲＮＡレプリコンのサ
イズが小さいことは、本発明のＲＮＡレプリコンに、外来のＲＮＡまたはエフェ
クターＲＮＡのより大きな配列、あるいは存在する単一成分ベクターに比べてよ
り多くのタンパク質またはペプチドをコードする配列を収容できるようにさせる
可能性がある。また、より小さなＲＮＡレプリコン由来のウィルス粒子は、植物
を通って容易に拡散するのに役立つ可能性がある。これに加えて、より小さなサ
イズのレプリコンは、同じＲＮＡ中に多数のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターま
たは外来遺伝子のカセットを収容することができる。一般には、付加される外来
遺伝子配列の極めて長い配列、典型的には４ｋｂまでを含有するまでは、サイズ
の制約は本発明のＲＮＡレプリコンには該当しない。

【００２９】第二に、ＲＮＡレプリコンは植物中の「内部接種」により、例えば核遺伝子か
ら供給することができ、ヘルパーウィルスが感染させるに従ってそれぞれ個別の
細胞中で増幅されることになる。このような生産系の遺伝的安定性は、各細胞中
で感染が核転写から得られる新鮮なＲＮＡレプリコンを「再接種」される可能性
があるという理由で極めて高い可能性がある。第三に、ヘルパーウィルスとＲＮ
Ａレプリコンの間の相補関係もまた有利である。このようにして多成分ベクター
は相互に補完している。ＲＮＡレプリコンは、ヘルパーウィルスから取り除かれ
た１または複数の配列を運ぶことができ、それなしには或る細胞から別の細胞へ
のヘルパーウィルスの移動が妨げられか、または無力化する。これら配列の例は
、任意の動物ウィルスまたは植物ウィルスの移動タンパク質の配列、カプシド化
配列、およびその他の機能性および構造配列である。興味の対象の外来ＲＮＡ、
エフェクターＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドは、レプリコンまたはヘルパ
ーウィルスのいずれかの中に含有されていてもよい。また最後に、ＲＮＡレプリ
コン発現ベクターは、単一のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、あるいは相同性
で非固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターの組み合わせまたはサブゲノムｍＲ
ＮＡプロモーターと内部リボソーム開始部位の組み合わせを含む２つ以上サブゲ
ノムｍＲＮＡプロモーターとともに働くことができる。

【００３０】このような用語に対して本明細書中で与えられる範囲を含む明細書および特許
請求の範囲の明確な矛盾のない理解を提供するために下記の定義を与える。

【００３１】５′または３′ＮＴＲ：５′または３′末端のウィルスのゲノムの非翻訳領域
。一般にヌクレオチド２５個より長く、ヌクレオチド５００個より短い。

【００３２】ｃｉｓ作用性（ｃｉｓ依存性）：分子または複合体のそれ自身との相互作用、
あるいは遺伝子の産物とそれから発現された核酸との間の相互作用。

【００３３】コートタンパク質（カプシドタンパク質）：ウィルスの外側の構造タンパク質
。

【００３４】エフェクターＲＮＡ：遺伝子サイレンシングまたは遺伝子発現の調節などの宿
主中で変化を引き起こすように設計されたＲＮＡ。

【００３５】遺伝子：不連続の細胞産物を担っている不連続の核酸配列。

【００３６】ヘルパーウィルス：宿主の細胞に導入されたとき、それ自体およびＲＮＡレプ
リコンの複製を容易にするＲＮＡ配列の配置。

【００３７】相同性：お互いに機能的にほぼ等しいヌクレオチド配列。配列がほぼ相同な配
列の間のヌクレオチドの違いが、遺伝子産物またはそのような配列によりコード
されるＲＮＡの機能に影響を与える点で最小ということになる。

【００３８】宿主：ベクターまたはウィルスの核酸を複製することができ、かつウィルスベ
クターまたはウィルスの核酸を含有するウィルスにより感染することができる細
胞、組織、または生物体。この用語は必要な箇所で、原核および真核細胞、器官
、組織、生物体を含むことを意味している。

【００３９】感染：ウィルスがその核酸を宿主に移す、またはウィルスの核酸を宿主中に導
入する能力であり、そこでウィルスの核酸が複製され、ウィルスのタンパク質が
合成され、新しいウィルス粒子が組み立てられる。

【００４０】内部開始部位：リボソームが仲介するｍＲＮＡの翻訳をポリペプチドに向ける
任意の内部領域。

【００４１】移動タンパク質：植物中のＲＮＡレプリコンまたはウィルスの細胞から細胞へ
の移動にとって必要な非カプシドタンパク質。

【００４２】非固有（外来）：ウィルスまたは生物中に天然に産出しない任意の配列で、そ
の配列は非固有（外来）であるといわれる。

【００４３】オープンリーディングフレーム：終止コドンのない適切な長さのヌクレオチド
配列。

【００４４】パッケージングシグナル：カプシドまたはコートタンパク質の中にＲＮＡを囲
んで成熟ウィルス粒子を形成することを担うＲＮＡ配列。

【００４５】植物細胞：原形質体および細胞壁からなる植物の構造的、生理学的単位。

【００４６】植物組織：植物界または培養液中の任意の組織。この用語は、植物、植物細胞
、植物器官、原形質体、細胞培養の全体、または構造および機能単位に組織され
た植物細胞の任意の群を含むことを意味する。

【００４７】プロモーター：コード配列の転写開始に関係している、コード配列に隣接した
５′−フランキング、非コード配列。

【００４８】原形質体：細胞培養または完全な宿主に再生する潜在力を有する細胞壁のない
単離された細胞。

【００４９】ＲＮＡレプリコン：２つが宿主の同じ細胞中に存在するとき、適切なヘルパー
ウィルスの存在下で複製することができる１または複数の非固有配列の転写によ
り生ずるＲＮＡ配列の配置。ＲＮＡレプリコンは、効率的な複製および安定性の
ために複製起点に加えてこの配列を必要とする可能性がある。

【００５０】サブゲノムｍＲＮＡプロモーター：サイズが完全な長さのゲノムよりも小さい
ｍＲＮＡの合成に向かわせるプロモーター。

【００５１】トランス作用性：分子または複合体と、それ自身から独立したまたはそれから
発現した核酸から独立した別の分子との相互作用。

【００５２】ベクター：非固有配列を含有し、細胞間でＲＮＡセグメントを伝達する自己複
製ＲＮＡ分子。

【００５３】ウィルス粒子：ウィルスＲＮＡとウィルスコートタンパク質（またはカプシド
タンパク質）から構成される粒子。

【００５４】ウィルス：タンパク質中に封入された核酸から構成される感染性物質。

【００５５】実施例下記の実施例は、本発明をさらに例示するものである。これらの実施例は単に
本発明を例示することを意図したものであり、限定しているものと解釈すべきで
はない。実施例は、本発明の範囲内にある方法を用いて達成することができる興
味の対象のＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドの回収を特に例示することを意
図している。

【００５６】実施例１、ウィルスの複製に必要な非構造タンパク質の同定タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）は、ゲノムがヌクレオチド６３９５個の長
さのプラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスである。ゲノムＲＮＡは、短い５′ＮＴＲ、続
いてヌクレオチド４８４８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有
し、３４１７番ヌクレオチドのところにアンバー終止コドンを含んでいる。２つ
の非構造タンパク質がこのＯＲＦから発現する。１つ目は、ヌクレオチド結合お
よび推定上のヘリカーゼ活性を含有する１２６ｋＤａのタンパク質である。２つ
目は、その翻訳事象の約５〜１０％がアンバー終止コドンの翻訳読み飛ばしであ
る１８３ｋＤａのタンパク質である。１８３ｋＤａのタンパク質は、１２６ｋＤ
ａのタンパク質の機能性ドメインおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと相同
の新規なドメインを含有する。またＴＭＶ感染後、共通の３′末端を備えた少な
くとも２つのサブゲノムｍＲＮＡが産生される。これらは、３０ｋＤａの移動タ
ンパク質および１７．５ｋＤａのコートタンパク質をコードする。ＴＭＶゲノム
ＲＮＡの３′末端は、一連のシュードノット構造、続いてｔＲＮＡ様構造に折り
たたまれる。

【００５７】実験は、１２６ｋＤａおよび／または１８３ｋＤａタンパク質がＴＭＶの複製
にとって不可欠かどうかを試験するために行なわれた。標準の分子生物学的方法
を用いて感染性ＴＭＶのｃＤＮＡクローンにさまざまな突然変異を導入した。初
めに２つの非構造タンパク質のＴＭＶの複製に対する寄与を、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて生体外で野生型または突然変異体ｃＤＮＡを転写し、転写物をタ
バコ原形質体に接種することにより分析した。接種後いろいろな時間間隔で植物
細胞を収集した。その後ＲＮＡを抽出しノーザンブロット法により分析した。各
ウィルスで別々に感染した原形質体中のウィルスの複製を、突然変異体ウィルス
ＲＮＡに対応するプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡの蓄積を野生型ウィルスと比
較することにより観察した。

【００５８】ある実験において、抑制終止コドンをチロシンのコドンに変えてＴＭＶ突然変
異体であるＴＭＶ１８３Ｙを産生させた。タンパク質免疫ブロッティングによっ
て、このＴＭＶ突然変異体が１２６ｋＤａのタンパク質を蓄積することなく１８
３ｋＤａのタンパク質のみを産生したことを確認した。このＴＭＶ突然変異体は
植物細胞中の複製に対して生存能力があり、ＴＭＶの１８３ｋＤａのタンパク質
が機能性ウィルスのレプリカーゼであってＴＭＶウィルスの複写にとって不可欠
であることを示している。続く実施例は、１８３ｋＤａのタンパク質もまたトラ
ンス作用性で、ヘルパーウィルスとして働くために突然変異体ＴＭＶウィルスが
１８３ｋＤａのタンパク質のみを発現することを可能にすることを明らかにした
。別の実験では、抑制終止コドンをフェニルアラニンのコドンに変えて、別のＴ
ＭＶ突然変異体であるＴＭＶ１８３Ｆを生産した。ＴＭＶ１８３Ｆ突然変異体に
関する研究は、１８３ｋＤａのタンパク質がＲＮＡレプリコンの複製を可能にす
る点でトランス作用性であるＴＭＶ１８３Ｙ突然変異体と矛盾しがなかった。

【００５９】図２は、ヘルパーウィルスＴＭＶ１８３ＦおよびＲＮＡレプリコンＴＭＶ４２
０をニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ
）に共感染させて得られるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のウェスタ
ンブロット分析を示す。図３は、さまざまなＲＮＡレプリコンおよび野生型ＴＭ
Ｖをタバコ原形質体に共感染させて得られる、または単一成分ベクターをタバコ
原形質体に感染させることによって得られるＧＦＰ発現のウェスタンブロット分
析を示す。図４は、ＴＭＶ３′特異的プローブを用いて（左側）、またはＧＦＰ
特異的プローブを用いて（右側）ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａ
ｎａｔａｂａｃｕｍ）植物中にヘルパーウィルスとしてのＴＭＶ１８３Ｆを共
接種したＴＭＶ４２１ＲＮＡレプリコンのノーザンブロット分析を示す。

【００６０】また実験は、１２６ｋＤａのタンパク質がウィルスＲＮＡの複製にとって必要
ではないことを示す。これに加えて、さらなる実験は１２６ｋＤａのタンパク質
が全ウィルスの複製を増大させる役割を果たし、ｃｉｓ依存性の形で機能するこ
とを示している。

【００６１】実施例２、ＲＮＡレプリコンの最適配列配置の決定Ａ，内部欠失植物中で外来の配列を発現させる能力のあるＲＮＡレプリコンを構築するため
、ヘルパーウィルスとして野生型ＴＭＶを共接種したとき効率的に複製される内
部配列の欠けた適切なＲＮＡレプリコンを同定するためにＴＭＶゲノムの広範に
わたる欠失分析を行なった。標準の分子生物学的方法を用いてＴＭＶのｃＤＮＡ
クローン中でこれらの欠失突然変異を構築した。構築の成功に続いて、各突然変
異体のｃＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて生体外で転写され、タバコ
原形質体に野生型ＴＭＶのｃＤＮＡから得られた生体外転写物と共接種されるこ
とになる。植物細胞は、接種後いろいろな時間間隔で収集された。続いてＲＮＡ
を抽出し、ノーザンブロット法により分析した。ＴＭＶの複製を、内部欠失およ
び野生型ＴＭＶのＲＮＡを含んだ突然変異体ＲＮＡに対応するプラス鎖およびマ
イナス鎖ＲＮＡの蓄積を追跡することにより観察した。

【００６２】この欠失分析は、ＴＭＶゲノムの幾つかの領域をＲＮＡレプリコンの複製に影
響を与えずに除去することができることを明らかにした。そのＣ末端から１２６
ｋＤａのタンパク質の３分の２をコードする配列、全３０ｋＤａの移動タンパク
質、およびＴＭＶのコートタンパク質は複製にとってなくても済み、ＲＮＡレプ
リコンの複製を妨げずに除去することができた。１８３ｋＤａのタンパク質の読
み飛ばし部分をほぼコードする配列の除去は、原形質体中のＲＮＡレプリコンの
検出可能な蓄積にとって必要であった。思いがけず、読み飛ばしドメインをほぼ
コードする領域に加えて幾つかの追加の配列の除去は、ＲＮＡレプリコンのトラ
ンス複製を非常に増加させた。

【００６３】欠失分析はまた、ＲＮＡレプリコンがヘルパーウィルスの存在下で複製するた
めには幾つかの内部領域が必要であることを明らかにした。第一の領域は、不可
欠な最初の約２５６個のヌクレオチドと、ほぼ最適な配列長さがＲＮＡレプリコ
ン中に保持されるようにするＴＭＶゲノムの最初の約１３４２個のヌクレオチド
とを備えたゲノムの５′末端である。必要な５′ＮＴＲに加えてＲＮＡレプリコ
ンの複製はまた、３′ＮＹＲがＲＮＡレプリコン中に存在することを必要とする
。効率的なＲＮＡレプリコンの複製にとって必要な最後の特徴は、ＲＮＡレプリ
コンの５′部分に完全なリーディングフレームが存在することである。フレーム
シフト突然変異の導入は、ＲＮＡレプリコンが効率よく複製する能力に悪影響を
及ぼした。

【００６４】ＴＭＶに由来するさまざまな機能性ＲＮＡレプリコンの複製レベルの比較は、
ＲＮＡレプリコンＴＭＶ△Ｃｌａがほぼ最高の能力を与えることを明らかにした
（図１）。ＴＭＶ△ＣｌａはＴＭＶの５′末端から最初の１３４２個のヌクレオ
チドを含有し、この点からＴＭＶゲノムのヌクレオチド位置５６６５番までの配
列を欠いている。このＲＮＡレプリコンの３′末端は、ヌクレオチド５６６５番
からＲＮＡの３′末端（ヌクレオチド６３９５番）までの野生型ＴＭＶの末端に
つながっている。このＲＮＡは、しばしば野生型ＴＭＶヘルパーウィルスのゲノ
ムＲＮＡのものと似たレベルまで蓄積される。このＲＮＡレプリコンの一つのマ
イナス特性は、ＲＮＡレプリコン中に完全なサブゲノムｍＲＮＡプロモーター配
列を欠くことである。サブゲノムｍＲＮＡプロモーターの必須部分が、このＲＮ
Ａレプリコンの構造中には欠失していた。

【００６５】Ｂ、３′末端配列トバモウィルスの３′ＮＴＲは、シュードノット構造として記載されているよ
うな隣接配列と塩基対をなす少なくとも３つのＲＮＡステム・ループ領域で始ま
るｔＲＮＡによく似た活性をもつ精巧に折りたたまれたＲＮＡ構造を含んでいる
。この一組のシュードノットＲＮＡ構造の上流は、ＴＭＶコートタンパク質をコ
ードするＯＲＦである。

【００６６】ＴＭＶゲノムの３′末端の包括的な分析が、ウィルスｃＤＮＡ中の個々のＲＮ
Ａ構造要素の欠失に関して、あるいは非相同性のトバモウィルス由来のＲＮＡ要
素をウィルスｃＤＮＡに置換（ハイブリッドウィルス）することにより行なわれ
た。標準の分子生物学的方法を用いてＴＭＶのｃＤＮＡクローン中で突然変異体
を構築し、完全長さのＴＭＶ突然変異体の複製に対するこれら要素の各々の寄与
を分析した。構築の成功に続いて、１２６ｋＤａおよび１８３ｋＤａのタンパク
質の完全なＯＲＦを含有する突然変異体ｃＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを
用いて生体外で転写され、転写物はタバコ原形質体に接種されることになる。植
物細胞は接種後いろいろな時間間隔で収集された。続いてＲＮＡを抽出し、ノー
ザンブロット法により分析した。突然変異体ウィルスおよびハイブリッドウィル
スに対応したプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡの蓄積を野生型ウィルスのものと
比較することにより複製に与える効果を観察した。同一の３′ＮＴＲ置換物を含
有するハイブリッドＲＮＡレプリコンを構築し、生体外で転写し、タバコ原形質
体に野生型ＴＭＶヘルパーウィルスの生体外転写物と共接種した。植物細胞は接
種後いろいろな時間間隔で収集された。続いてＲＮＡを抽出し、ハイブリッドＲ
ＮＡレプリコンの複製をノーザンブロット法により分析した。ハイブリッドＲＮ
Ａレプリコンの複製を、ＲＮＡレプリコンのプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡの
蓄積を測定することにより、修飾されていないＴＭＶのＲＮＡレプリコンと比較
した。

【００６７】相同性のＴＭＶ３′ＮＴＲを含有する完全長さのウィルスＲＮＡおよびＲＮＡ
レプリコンを、非固有（非ＴＭＶ）の３′ＮＴＲを含有するＲＮＡよりも高レベ
ルまで蓄積した。これに加えて幾つかのＲＮＡレプリコンの複製は、全く非相同
性のヘルパーウィルスにより支援された。例えば、幾つかのＴＭＶ△Ｃｌａ由来
のＲＮＡレプリコンは、ＯＲＳＶなどの別の非相同性ヘルパーウィルスを共接種
したとき複製された。図５は、非相同ヘルパーウィルスＯＲＳＶによるＴＭＶベ
ースのＲＮＡレプリコンの複製のノーザンブロット分析を示す。３′ＮＴＲ内で
は、ｔＲＮＡ様の領域および単一の３′に隣接するシュードノット構造のみが複
製にとって必要である。幾つかのＲＮＡレプリコンの複製は、相同性およびハイ
ブリッドヘルパーウィルスにより、かつまた完全に非相同性のヘルパーウィルス
により広く支援されている可能性がある。

【００６８】実施例３、遺伝子骨格としてＴＭＶベースのＲＮＡレプリコンを用いた発現ベ
クターの開発実施例２で言及したように、野生型ＴＭＶの存在下で最も高い複製レベルを有
するＲＮＡレプリコンはＴＭＶ△Ｃｌａである。しかしながら、このｄＲＮＡは
、完全サブゲノムｍＲＮＡプロモーターの欠如およびゲノムＲＮＡからの翻訳を
妨げるベクター中の大量の５′配列により外来遺伝子の高レベルの発現ができな
くなる。

【００６９】ＴＭＶ△Ｃｌａを発現ベクターＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３０３に転換した
（図１参照）。まずプラスミドｐＴＭＶ△ＣｌａをＣｌａＩ制限酵素で消化し、
ＣｌａＩ部位の粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより満たし
た。次いでＤＮＡをＫｐｎＩ制限酵素で消化し、プラスミド骨格を含有する大き
な断片とＴＭＶゲノムの５′ヌクレオチド１３４３個とを単離した。ＴＭＶクロ
ーンｐＴＭＶ１５２由来のＴＭＶゲノムの３′の３分の１をＳａｌＩで消化した
。ＳａｌＩ粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで満たし、続いてＫｐｎＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化した。満たされたＳａｌＩ部位、続いてＴＭＶのヌクレ
オチド５４６０〜６３９５番からなるこの小さなＤＮＡ断片を、大きなｐＴＭＶ
△Ｃｌａ断片に結合してｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２を産出した（ヌクレオチド１
３４４〜５４５９番が欠失している）。次いでｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２をＣｌ
ａＩおよびＫｐｎＩで消化し、大きなＤＮＡ断片を単離した。ｐ３０ＢＧＦＰＣ
３Ｏ３由来のＣｌａＩ／ＫｐｎＩ断片を、ｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２の大きな断
片に結合した。得られたプラスミドｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３は、５
′末端から３′末端まで、野生型ＴＭＶ由来の５′のヌクレオチド１３４３個、
ＳａｌＩ制限酵素部位、完全なＴＭＶコートタンパク質サブゲノムｍＲＮＡプロ
モーター、ＰａｃＩ制限部位、３サイクルのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
、ＸｈｏＩ制限部位、およびＴＭＶ由来の３′ＮＴＲを含んでいる（図１）。

【００７０】ＲＮＡ転写物は、ＫｐｎＩで線状化したｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３
から転写され、タバコ原形質体に野生型ＴＭＶ転写物と共接種された。図６およ
び７のレーン１は、それぞれＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブおよびＧＦＰ特異
的プローブを用いて野生型ＴＭＶと共接種した原形質体中でＧＦＰを発現するＴ
ＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ベクターの複製のノーザンブロット分析を示す
。△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンを複製し、機能性ＲＮＡレプリ
コンベースのベクターが構築されていることを示すＧＦＰのサブゲノムｍＲＮＡ
を検出した。このＲＮＡレプリコンは、機能性サブゲノムｍＲＮＡプロモーター
、外来の配列を挿入するための制限部位、およびトランス供給したコートタンパ
ク質でカプシド化するための完全パッケージングシグナルが存在するため真正発
現ベクターである。

【００７１】実施例４、ＲＮＡレプリコンの複製を向上させるためのヘルパーウィルスの修
飾発現ツールとしてＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡを使用するには、
最大レベルの外来遺伝子の発現を確かなものにするために、このＲＮＡレプリコ
ンの複製を極大化しなければならない。幾つかの異なるＴＭＶゲノムのＴＭＶ△
Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンの複製を刺激する能力が分析された
。ＴＭＶおよびその他のトバモウィルスのｃＤＮＡクローンを用いてＴＭＶ変異
株を構築するために、標準の分子生物学的方法を使用した。構築の成功に続いて
、ヘルパーウィルスとして試験されるＴＭＶ変異株が７ＲＮＡポリメラーゼを用
いて生体外で転写され、転写物はＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３転写物とと
もにタバコ原形質体に共接種された。植物細胞は接種後いろいろな時間間隔で収
集された。続いてＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法により分析した。ＴＭＶ
変異株およびＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンの複製は、プ
ラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡの蓄積を比較することにより観察された。図６お
よび７は、それぞれＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブおよびＧＦＰ特異的プロー
ブを用いて異なるＴＭＶ由来のヘルパーウィルスと共接種された原形質体中でＧ
ＦＰを発現するＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ベクターの複製のノーザンブ
ロット分析を示す。

【００７２】ヘルパー機能に関して異なるＴＭＶ変異株をスクリーニングした結果、確立さ
れた一般原則は、ＴＭＶ変異株が独自に複製する能力が劣れば劣るほど、それが
優れたヘルパーウィルスであることを証明するということである。これは、ＲＮ
Ａレプリコンの複製がヘルパーウィルスの過剰な複製能力の結果として生ずるた
めである可能性がある。ヘルパーウィルスがそのレプリカーゼを効率的に利用す
る場合、より少ない合成機構がＲＮＡレプリコンを複製するために利用できる。
興味深いことにＴＭＶのＲＮＡレプリコンの存在は、ヘルパーウィルスのいずれ
の複製をも認めうるほどには減少または阻止しなかった。これはＢＭＶのＲＮＡ
レプリコンを用いた結果とは反対である（Ｐｏｇｕｅ等の論文、「Ｖｉｒｏｌ．
」１７８：１５２〜１６０（１９９０）；Ｍａｒｓｈ等の論文、「Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．」７２：２３６７〜２３７４（１９９１））。実験の結果は、コー
トタンパク質のＯＲＦ（Ｓ３−２８、図１）を欠き、ＯＲＳＶのＯＲＦで置換し
たＴＭＶコートタンパク質のＯＲＦ（ＴＭＶ−ＣＰＯ）を有するＴＭＶ変異株、
または二連のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターベクター（ＴＢ２−ＧＵＳ）は、
ＲＮＡレプリコンの複製の支援に関して野生型ＴＭＶよりも優れていることを示
した（図１，６、および７参照）。

【００７３】修飾した１８３ｋＤａのタンパク質のＯＲＦに対する抑制終止コドンを有する
ＴＭＶの突然変異体であるＴＭＶ１８３ＹおよびＴＭＶ１８３Ｆは、ＴＭＶ△Ｃ
ｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンを増幅することができた（図６および
７参照）。この結果は、１８３ｋＤａのタンパク質自身が複製だけでなく転写に
関してもｉｎｔｒａｎｓで機能することが可能なことを立証した。追加実験は
、ＴＭＶ１８３Ｆがヘルパーウィルスとして特に有効であることを示した。第一
に、ＴＭＶ１８３Ｆヘルパーウィルスは、続く実施例の中で明らかにされる多く
のｄＲＮＡベースのＲＮＡレプリコンを支援した。第二に、ＴＭＶ１８３Ｆウィ
ルスは単独でタバコ、すなわちニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖ
ｅｓｔｒｉｓ）中で細胞から細胞へ移動し、共接種したＲＮＡレプリコンの全身
性の感染に至る可能性がある。最後に、ＴＭＶ１８３Ｆヘルパーウィルスは、よ
り安定である。これは、ＴＭＶ１８３Ｙヘルパーウィルスと比較したｉｎｐｌ
ａｎｔａのウィルス感染の研究で明らかになった。

【００７４】実施例５、ＴＭＶヘルパーウィルスと共接種したＴＭＶ由来のＲＮＡレプリコ
ンを用いるＧＦＰリポータータンパク質発現用の多成分ＲＮＡベクター系まず、ＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンの植物細胞中で機
能性ＧＦＰリポーター遺伝子を発現する能力を、タバコ原形質体で検定した。タ
バコ原形質体にＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３に対応するＲＮＡ転写物を野
生型ＴＭＶと共接種した。原形質体を、蛍光顕微鏡法によりＧＦＰタンパク質の
蓄積を感染後いろいろな時間間隔で観察した。接種後２０〜２５時間の間にＵＶ
照射下で見た原形質体は、特有のグリーンの「鮮やかな」表現型、すなわちＧＦ
Ｐタンパク質の蓄積の特性を示した。グリーンの表現型の強度は、原形質体細胞
の長時間のインキュベーションの間に大きくなった。このような緑色は、健康な
原形質体または「模擬試験用」（水を接種した）の原形質体、あるいはヘルパー
ウィルス単独またはＲＮＡレプリコン単独のいずれかで感染させた原形質体を含
む負の制御においては観察されなかった。またＴＭＶ１８３Ｙ、ＴＭＶＣＰＯ、
Ｓ３−２８、およびＴＢ２−ＧＵＳを含む別のヘルパーウィルス構築物を複製し
、ＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンをトランス活性化して原
形質体中でＧＦＰタンパク質を発現することができ、それは発現系の強さを実証
する。感染した原形質体の１０〜３０％が顕著な緑色を発し、それはＧＦＰタン
パク質の蓄積がＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３の複製と続いて起こる転写、
およびＧＦＰタンパク質のＯＲＦをコードするサブゲノムｍＲＮＡの翻訳に依存
することを示した。ノーザンブロット分析の結果は、ＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／
Ｃ３Ｏ３ＲＮＡレプリコンのプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡの存在ならびにＧ
ＦＰタンパク質のＯＲＦ配列をコードするサブゲノムｍＲＮＡの蓄積を立証した
。

【００７５】実施例６、ＴＭＶヘルパーウィルスと共接種した別のＴＭＶ由来のＲＮＡレプ
リコンを用いるＧＦＰリポータータンパク質の発現用の多成分ＲＮＡベクター系ＴＭＶゲノム内の配列を欠失させてＲＮＡレプリコンを構築する途上において
実験は、１２６ｋＤａのタンパク質ＯＲＦの終止コドンの下流に向かって配列が
３′ＮＴＲまで欠失しているＲＮＡレプリコン（ＴＭＶ１４２）はそれ自身で複
製することはできないが、その複製は野生型ＴＭＶ、複数のＴＭＶ突然変異体、
およびその他の非相同性のヘルパーウィルスなど複製応答能のあるヘルパーウィ
ルスにより支援される可能性があることを示した。特にこのｄＲＮＡは、それら
自身では１２６ｋＤａのタンパク質のＯＲＦを発現することができないヘルパー
ウィルスによって、より効率的に複製された（ＴＭＶ１８３ＹおよびＴＭＶ１８
３Ｆ、実施例４を参照）。移動タンパク質および／またはコートタンパク質のＯ
ＲＦ由来の追加の配列を含有するＴＭＶ１４２ＲＮＡレプリコンに対する別の修
飾もまた構築され、原形質体中でＴＭＶ１４２と似たレベルまで複製された。こ
れは、コートタンパク質サブゲノムｍＲＮＡプロモーターおよび野生型ＴＭＶ由
来のコートタンパク質のＯＲＦを含有したｐＴＭＶ１４２／１５２の構築を含む
（図１参照）。このＲＮＡレプリコンは、３′ＮＴＲを削除するＸｈｏＩおよび
ＫｐｎＩ制限酵素でｐＴＭＶ１４２を消化することにより、またコートタンパク
質サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、コートタンパク質、およびｐＴＭＶ１５２
由来の３′ＮＴＲを含有するＳａｌＩ／ＫｐｎＩ断片をＴＭＶ１４２に結合する
ことにより構築された。このプラスミドは、さまざまなヘルパーウィルスにより
ｉｎｔｒａｎｓで複製されるＲＮＡレプリコンの起点になる。コートタンパク
質サブゲノムｍＲＮＡもまた、このＲＮＡレプリコンから発現することが分かっ
た。

【００７６】ＴＭＶ１４２／１５２ＲＮＡレプリコンのゲノム体制に基づいて外来の配列を
発現する発現ベクターを創出するために、まず実施例５のｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１
５２／Ｃ３Ｏ３と類似の中間ＧＦＰ発現用ＲＮＡレプリコン（ＴＭＶ４０９）を
構築した。プラスミドｐＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２を、ＣｌａＩおよびＢｓｉＷＩ
で消化した。プラスミド骨格、ＳａｌＩ部位までの５′ＴＭＶ配列、ＳａｌＩと
ＣｌａＩの間のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター配列、およびＢｓｉＷＩとＫｐ
ｎＩの間の３′ＮＴＲ配列を含有する大きな断片が保持された。ＣｌａＩとＰａ
ｃＩ部位の間のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターの残り、ＧＦＰタンパク質の野
生型ＯＲＦ、およびＢｓｉＷＩまでの３′ＮＴＲ配列を含有するｐＴＭＶ３０Ｂ
ＧＦＰ由来のＣｌａＩ／ＢｓｉＷＩ断片を、ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩで消化したｐ
ＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２に結合してｐＴＭＶ４０９を創出した。これは、適切な
ヘルパーウィルスを共感染させ、適切なヘルパーウィルスにより複製するとＧＦ
Ｐを発現することができるＲＮＡレプリコンをもたらした。サブゲノムｍＲＮＡ
プロモーターとＧＦＰタンパク質のＯＲＦとを非構造タンパク質のドメイン１お
よび２をコードするＲＮＡレプリコンに挿入するために、ｐＴＭＶ４０９をＳａ
ｌＩおよびＫｐｎＩで消化した。サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、ＧＦＰタン
パク質のＯＲＦ、および３′ＮＴＲを含有する得られた断片をＸｈｏＩ／Ｋｐｎ
Ｉで消化したｐＴＭＶ１４２に結合してｐＴＭＶ１４２を創出した。ＴＭＶ１４
２ＲＮＡレプリコンを、ＭＶ１４２の生体外ＲＮＡ転写物および適切なヘルパー
ウィルスを共接種したタバコ原形質体およびエヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔ
ｈａｍｉａｎａ）の葉の中で複製した。ＭＶ１４２は、５′末端から３′末端ま
で、ＴＭＶ由来の５′ＮＴＲ、完全ＴＭＶ１２６ｋＤａのタンパク質のＯＲＦ、
完全なＴＭＶコートタンパク質サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、ＰａｃＩ部位
、ＧＦＰタンパク質の野生型ＯＲＦ、ＸｈｏＩ部位、およびＴＭＶの３′ＮＴＲ
を含有する（図１参照）。これは、外来の配列を挿入するためのＰａｃＩおよび
ＸｈｏＩ制限酵素部位と、またヘルパーウィルスによりｉｎｔｒａｎｓで供給
されるコートタンパク質でカプシド化するための機能性パッケージングシグナル
とを特徴とする効果的な発現ベクターである。

【００７７】接種後のさまざまな時間に、適切なヘルパーウィルスおよびＲＮＡレプリコン
ＴＭＶ４１２を共接種した植物からＲＮＡおよびタンパク質の試料を取り出し、
ウィルスＲＮＡの蓄積およびＧＦＰタンパク質の蓄積を分析した。また試料は、
感染領域を可視化するためにＵＶ照射の下で分析された。ノーザンブロット分析
により、ヘルパーウィルスと葉組織由来のＧＦＰ発現ＴＭＶ４１２ＲＮＡレプリ
コンの両者の存在を確かめた。ＴＭＶ１８３Ｆを含む、それら自身の１２６ｋＤ
ａのタンパク質を発現しないヘルパーウィルスは、ＴＭＶ４１２ＲＮＡレプリコ
ンの複製を支援するための優れたヘルパーウィルスであることが確定した。ＧＦ
Ｐタンパク質の発現をエヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）およ
びエヌ・タバクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の共感染組織のウェスタン免疫ブロッ
ト分析により確かめた。別の修飾には、外来遺伝子挿入用のＸｈｏＩ部位と３′
ＮＴＲの間にＴＭＶコートタンパク質ＯＲＦ由来の追加の３′に隣接する配列を
挿入することが含まれる。これらの配列を包含すると、ＲＮＡレプリコンの蓄積
レベルを改良し、ＧＦＰの発現レベルを向上させることが確定した（続く実施例
を参照）。

【００７８】実施例７、ＴＭＶヘルパーウィルスを共接種したＴＭＶ４２０、ＴＭＶ４２１
、およびＴＭＶ４１１ＲＮＡレプリコンを用いるタンパク質の発現用の多成分Ｒ
ＮＡベクター系１８３ｋＤａタンパク質のドメイン１および２をコードする３つの追加のＲＮ
Ａレプリコン、ＴＭＶ４２０、ＴＭＶ４２１、およびＴＭＶ４１１を、実施例６
の方法に従って構築した。これら３つのＲＮＡレプリコンは、各々ＴＭＶコート
タンパク質のＯＲＦの部分の挿入物を含有していることを除けばＴＭＶ４２１Ｒ
ＮＡレプリコンのゲノム体制と類似している。ＴＭＶ４２０は、５′末端から３
′末端まで、５′ＮＴＲ、機能性１２６ｋＤａのタンパク質のＯＲＦ、完全なＴ
ＭＶコートタンパク質サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、ＰａｃＩ部位、ＧＦＰ
タンパク質のＯＲＦ、ＸｈｏＩ部位、３′末端からＴＭＶコートタンパク質のヌ
クレオチド１００個、および３′ＮＴＲを含有する（図１参照）。ＴＭＶ４２１
およびＴＭＶ４１１は、これらのＲＮＡレプリコンが３′末端からＴＭＶコート
タンパク質のヌクレオチドをそれぞれ２００および３００個含むことを除けばＴ
ＭＶ４２０と同一の構造を含有する（図１参照）。ＲＮＡレプリコンＴＭＶ４２
０、ＴＭＶ４２１、およびＴＭＶ４１１の複製を、ヘルパーウィルスＴＭＶ１８
３Ｆを共接種した場合のタバコ原形質体中およびエヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅ
ｎｔｈａｍｉａｎａ）およびエヌ・タバクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物の葉中
で確かめた。各ＲＮＡレプリコンの増幅の成功はノーザンブロット分析により実
証された。エヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）およびエヌ・タ
バクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の接種された葉中のＧＦＰタンパク質の発現は、
ＵＶ照射により視覚的に確定された。これに加えてｄＲＮＡベースの各ＲＮＡレ
プリコンＴＭＶ４２０もまた、ヘルパーウィルスＴＭＶ１８３Ｆを共接種するこ
とによりエヌ・シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）中で試験された。
ＴＭＶ４２０の複製はノーザンブロットハイブリッド形成により示された。エヌ
・シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）の接種された葉中のＧＦＰタン
パク質の発現もまた、ＵＶ照射およびウェスタン免疫ブロット分析により視覚的
に確定された。

【００７９】実施例８、ＴＭＶヘルパーウィルスを共接種したＲＮＡレプリコンを用いるＧ
ＦＰリポータータンパク質の全身性の発現ＴＭＶ４２０ＲＮＡレプリコンおよびヘルパーウィルスＴＭＶ１８３Ｆを共接
種されたエヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物は、ＴＭＶ１
８３ＦおよびＴＭＶ４２０ＲＮＡレプリコンによる植物細胞の全身性感染を示し
た。２０時間の培養に続いて、エヌ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎ
ａ）植物に、ＴＭＶ１８３ＦおよびＴＭＶ４２０の生体外転写物を共接種したタ
バコ原形質体のライゼイトから調製したウィルス粒子を接種した。接種後６から
７日でＧＦＰリポータータンパク質の蛍光が、長波ＵＶ照射により接種された葉
の中に検出可能になった。ＵＶ光の下でグリーンの蛍光を発する組織をさらに分
析してヘルパーウィルスＴＭＶ１８３ＦとＲＮＡレプリコンＴＭＶ４２０の両者
由来のゲノムＲＮＡの存在をノーザンブロッティングにより確かめた。ＧＦＰタ
ンパク質の発現はウェスタン免疫ブロット分析により確認された。ＴＭＶ１８３
ＦおよびＴＭＶ４２０を共接種された植物の上部の接種されていない徴候的な葉
の幾つかは、長波ＵＶ照射の下でグリーンの蛍光を発する領域を創り出した。た
だＴＭＶ１８３Ｆだけを接種された植物はＴＭＶ１８３ＦおよびＴＭＶ４２０を
共接種された植物と同一の全身性の徴候を示したが、ＴＭＶ１８３Ｆだけを接種
された植物は接種された葉または上部の全身性の感染による葉のどちらにおいて
もグリーンの蛍光を示さなかった。

【００８０】実施例９、ＴＭＶヘルパーウィルスを共接種したＲＮＡレプリコンを用いる多
数の外来配列の発現多数のＲＮＡまたはタンパク質を発現するためのウィルス性ベースの多成分ベ
クターの実施可能性を実証するために、タバコ原形質体にヘルパーウィルスとし
てＴＢ２−ＧＵＳおよびＲＮＡレプリコンとしてＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３
Ｏ３を共接種した。ＴＢ２−ＧＵＳは、細菌性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
遺伝子、続いてＯＲＳＶ由来の非固有の余分のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター
およびコートタンパク質を発現するＴＭＶベースの二連のサブゲノムｍＲＮＡプ
ロモーターである。２０および４０ｈｐｉで原形質体をＧＦＰおよびＧＵＳタン
パク質の同時発現について分析した。ＧＦＰの発現は、グリーンすなわちＧＦＰ
発現細胞を検出するために蛍光顕微鏡法の下で観察された。ＧＵＳの発現を検出
するために、ＧＦＰ発現について分析される細胞の平行分割量を、基質５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グルクロニドの存在下で３７℃でイ
ンキュベートした。ＴＢ２−ＧＵＳおよびＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３を
接種された原形質体由来の試料のみが、ＧＦＰとＧＵＳの両者の発現に対してプ
ラスであった。またＲＮＡ試料を２０ｈｐｉで採取し、ノーザンブロットハイブ
リッド形成により分析した。ノーザンブロッティングの結果、ヘルパーウィルス
ＴＢ２−ＧＵＳとＲＮＡレプリコンＴＭＶ△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３ゲノムＲ
ＮＡの両者が複製されることが明らかになった。さらにＧＦＰ特異的ハイブリッ
ド形成プローブは、ＧＦＰサブゲノムＲＮＡの存在を明らかにした。試料はさら
に、興味の対象の外来のＲＮＡまたはタンパク質がＲＮＡレプリコン中だけでな
くヘルパーウィルス中にも含まれる可能性があることを実証し、これは多成分Ｒ
ＮＡベクター系中での外来のＲＮＡまたはタンパク質の発現において、より優れ
た柔軟性および安定性を提供する。

【００８１】本発明は、本発明の好ましい態様の詳細に関して本特許出願の中で開示されて
いるが、変形形態が本発明の精神および添付の特許請求の範囲の範囲内で当業者
にはすぐに思い浮かぶはずであると考えられるので、この開示は限定する意味で
はなく例示を意図するものであると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】本出願に記載したさまざまなＴＭＶおよびハイブリッド構築物の略図である。
ＴＭＶ１２６ｋＤａ、１８３ｋＤａ、移動（ｍｐ）、およびコート（ｃｐ）タン
パク質のＯＲＦを示す。ＯＲＦＶの配列は斜線の枠で示す。野生型（ｇｆｐ）お
よび３サイクル（ｃ３ｇｆｐ）のグリーン蛍光タンパク質β−グルクロニダーゼ
（ｇｕｓ）のＯＲＦを示す。１２６ｋＤａＯＲＦから終止コドンへのチロシン（
Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）の置換を含んだ構築物を示す。ＴＭＶコート
タンパク質ＯＲＦの３′末端部分からの配列を黒の枠で示す。５′および３′Ｎ
ＴＲは実線で示す。コートタンパク質サブゲノムプロモーター（Ｐ）を示す。さ
らに図１は、発現を分析するためにウェスタンブロットを用いる場合に実験に使
用した幾つかの追加のレプリコンの線図を含む。構築は本出願に記載したものと
類似のものである。

【図１Ｂ】本出願に記載したさまざまなＴＭＶおよびハイブリッド構築物の略図である。
ＴＭＶ１２６ｋＤａ、１８３ｋＤａ、移動（ｍｐ）、およびコート（ｃｐ）タン
パク質のＯＲＦを示す。ＯＲＦＶの配列は斜線の枠で示す。野生型（ｇｆｐ）お
よび３サイクル（ｃ３ｇｆｐ）のグリーン蛍光タンパク質β−グルクロニダーゼ
（ｇｕｓ）のＯＲＦを示す。１２６ｋＤａＯＲＦから終止コドンへのチロシン（
Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）の置換を含んだ構築物を示す。ＴＭＶコート
タンパク質ＯＲＦの３′末端部分からの配列を黒の枠で示す。５′および３′Ｎ
ＴＲは実線で示す。コートタンパク質サブゲノムプロモーター（Ｐ）を示す。さ
らに図１は、発現を分析するためにウェスタンブロットを用いる場合に実験に使
用した幾つかの追加のレプリコンの線図を含む。構築は本出願に記載したものと
類似のものである。

【図１Ｃ】本出願に記載したさまざまなＴＭＶおよびハイブリッド構築物の略図である。
ＴＭＶ１２６ｋＤａ、１８３ｋＤａ、移動（ｍｐ）、およびコート（ｃｐ）タン
パク質のＯＲＦを示す。ＯＲＦＶの配列は斜線の枠で示す。野生型（ｇｆｐ）お
よび３サイクル（ｃ３ｇｆｐ）のグリーン蛍光タンパク質β−グルクロニダーゼ
（ｇｕｓ）のＯＲＦを示す。１２６ｋＤａＯＲＦから終止コドンへのチロシン（
Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）の置換を含んだ構築物を示す。ＴＭＶコート
タンパク質ＯＲＦの３′末端部分からの配列を黒の枠で示す。５′および３′Ｎ
ＴＲは実線で示す。コートタンパク質サブゲノムプロモーター（Ｐ）を示す。さ
らに図１は、発現を分析するためにウェスタンブロットを用いる場合に実験に使
用した幾つかの追加のレプリコンの線図を含む。構築は本出願に記載したものと
類似のものである。

【図２】ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）
の植物のＲＮＡレプリコンＴＭＶ４２０およびヘルパーウィルスＴＭＶ１８３Ｆ
による共感染から得られるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現のウェスタン
ブロット分析を示す図である。レーン番号 (ＧＦＰ) １精製したＧＦＰ（１５ｎｇ）＋＋＋２ＢｉｏＲａｄ高範囲ＭＷ標識３精製したＧＦＰ（１５ｎｇ）＋＋＋４ＢｉｏＲａｄ高範囲ＭＷ標識５ＴＭＶ１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、非接種（葉の上部）ｎｄ６ＴＭＶ１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、接種された葉＋＋７ＴＭＶ１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２０、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、非接種（葉の上部）ｎｄ８ＴＭＶ１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２０、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、接種された葉＋＋９ＴＭＶ１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、接種された葉＋＋１０Ｓｉｇｍａで予備染めしたＭＶ標識ｎｄ＝検出されない

【図３】外来の配列の発現用の単一成分ベクターおよび多成分ＲＮＡレプリコンベクタ
ー由来のタバコ原形質体中でのＧＦＰ発現のウェスタンブロットを示す図である
。レーン番号ＧＦＰ１精製したＧＦＰ（１５ｎｇ）＋＋＋２模擬（水接種）原形質体 − ３ＴＭＶ４２２（単一成分ベクター）（レーン４の１：５希釈）＋＋４ＴＭＶ４２２（単一成分ベクター）＋＋＋５ＴＭＶ００４＋ＴＭＶ４２０（ＲＮＡレプリコンベクター）ｎｄ６ＴＭＶ００４＋ＴＭＶ４１８（ＲＮＡレプリコンベクター）＋７ＴＭＶ００４＋ＴＭＶ４１６（ＲＮＡレプリコンベクター）＋８ＴＭＶ００４＋ＴＭＶ４１６（ＲＮＡレプリコンベクター）ｎｄ９ＴＭＶ００４ − １０Ｓｉｇｍａで予備染めしたＭＶ標識ｎｄ＝検出されない

【図４】左側は、ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブを用いてＮｉｃｏｔｉａｎａｔａ
ｂａｃｕｍの植物中にヘルパーウィルスＴＭＶ１８３Ｆと共接種したＴＭＶ４２
１ＲＮＡレプリコンの複製のノーザンブロット分析を示す図であり、また右側は
、ＧＦＰ特異的プローブを用いてＮ．ｔａｂａｃｕｍの植物中にヘルパーウィル
スＴＭＶ１８３Ｆと共接種したＴＭＶ４２１ＲＮＡレプリコンの複製のノーザン
ブロット分析を示す図である。左の図レーン番号ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブ１１８３Ｆ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）２１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）３１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）右の図レーン番号ＧＰＦ特異的プローブ１１８３Ｆ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）２１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）３１８３Ｆ＋ＴＭＶ４２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（接種された葉）

【図５】ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブを用いた非相同性ヘルパーウィルスＯｄｏｎ
ｔｏｇｌｏｓｓｕｍ輪点ウィルス（ＯＲＳＶ）によるＴＭＶベースのＲＮＡレプ
リコンの複製のノーザンブロット分析を示す図である。レーン番号ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブ１ＯＲＳＶｖＲＮＡ２ＯＲＳＶｖＲＮＡ＋ＴＭＶ４２０（ドメイン１および２ＲＮＡレプリコン＋ＧＦＰ）３ＯＲＳＶｖＲＮＡ＋ＴＭＶ４０８（ドメイン１ＲＮＡレプリコン＋ＧＦＰ）４ＯＲＳＶｖＲＮＡ＋△Ｃｌａ（ドメイン１ＲＮＡレプリコン）５ＯＲＳＶｖＲＮＡ＋△Ｃｌａ／１５２（完全なサブゲノムｍＲＮＡプロモーターを備えたドメイン１ＲＮＡレプリコン）６ＯＲＳＶｖＲＮＡ＋ＴＭＶ１４２／１５２（完全なサブゲノムｍＲＮＡプロモーターを備えたドメイン１および２ＲＮＡレプリコン）

【図６】ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブを用いて、野生型ＴＭＶおよびいろいろなＴ
ＭＶ由来のヘルパーウィルスを共接種した原形質体中でＧＦＰを発現するＲＮＡ
レプリコンベクターの複製のノーザンブロット分析を示す図である。レーン番号ＴＭＶ３′ＮＴＲ特異的プローブ１野生型ＴＭＶ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３２ＴＭＶ１８３Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３３ＴＭＶ１４１＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３４ＴＭＶ１４１Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３５ＴＭＶ１６３＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３６ＴＭＶ１６３Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３７ＴＭＶ１４１／１５０＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３８ＴＭＶ１４１／１５１＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３９ＴＭＶ１４１／１５２＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１０Ｓ３−２８＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１１ＴＭＶ−ＣＰＯ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１２ＴＢ２−ＧＵＳ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３

【図７】ＧＦＰ特異的プローブを用いて、野生型ＴＭＶおよびいろいろなＴＭＶ由来の
ヘルパーウィルスを共接種した原形質体中でＧＦＰを発現するＲＮＡレプリコン
ベクターの複製のノーザンブロット分析を示す図である。レーン番号ＧＦＰ特異的プローブ１野生型ＴＭＶ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３２ＴＭＶ１８３Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３３ＴＭＶ１４１＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３４ＴＭＶ１４１Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３５ＴＭＶ１６３＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３６ＴＭＶ１６３Ｙ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３７ＴＭＶ１４１／１５０＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３８ＴＭＶ１４１／１５１＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３９ＴＭＶ１４１／１５２＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１０Ｓ３−２８＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１１ＴＭＶ−ＣＰＯ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３１２ＴＢ２−ＧＵＳ＋△Ｃｌａ／１５２／Ｃ３Ｏ３

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月２９日（２００１．５．２９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ルワンドースキ，デニスジェイ．アメリカ合衆国，フロリダ 33823，オーバーンデール，ショアランドドライブ 2005 (72)発明者ドーソン，ウィリアムオー．アメリカ合衆国，フロリダ 33884，ウィンターヘイブン，オルセンロード 803 (72)発明者ターペン，トーマスエイチ．アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688，ベイカビル，ウッドクレストドライブ 319 (72)発明者ポーグ，グレゴリーピー．アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688，ベイカビル，トリリックコート 419 Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 AA20 BA32 CA04 CA11 DA01 FA02 GA11 HA01 4B065 AA89X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 BA10 CA01 DA86 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＲＮＡウィルス由来の１または複数のＲＮＡレプリコンであ
って、少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、（１）５′ＮＴＲ、（２）ＲＮＡウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその断片のオープ
ンリーディングフレームと相同のオープンリーディングフレーム、（３）前記ＲＮＡウィルスにとって非固有の少なくとも１つの配列、および（４）３′ＮＴＲを含む、ＲＮＡレプリコンと、１または複数のヘルパーＲＮＡウィルスであって、少なくとも１つのヘルパーウ
ィルスが前記ＲＮＡレプリコンの複製を行なう、ヘルパーＲＮＡウィルスとを含
む系。
【請求項２】前記ＲＮＡレプリコンの前記３′ＮＴＲが、少なくとも１つ
のヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有のものである、請求項１に
記載の系。
【請求項３】前記ＲＮＡレプリコンの前記３′ＮＴＲが、任意の前記ヘル
パーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有のものである、請求項１に記載
の系。
【請求項４】前記ＲＮＡレプリコンの前記３′ＮＴＲが、２つ以上の前記
ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲのハイブリッドである、請求項１に記載の
系。
【請求項５】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つのサブゲノ
ムｍＲＮＡプロモーターを含む、請求項１に記載の系。
【請求項６】前記サブゲノムｍＲＮＡプロモーターが少なくとも１つの前
記ＲＮＡウィルスにとって固有のものである、請求項５に記載の系。
【請求項７】前記固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーターが、少なくとも
１つの前記ＲＮＡウィルスのコートタンパク質のプロモーターである、請求項６
に記載の系。
【請求項８】前記サブゲノムｍＲＮＡプロモーターが、任意の前記ＲＮＡ
ウィルスにとって非固有のものである、請求項７に記載の系。
【請求項９】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つの前記ＲＮ
Ａウィルス由来の完全なコートタンパク質またはその断片のオープンリーディン
グフレームと相同なオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の系
。
【請求項１０】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、任意の前記ＲＮＡウィル
スにとって非固有のコートタンパク質を含む、請求項１に記載の系。
【請求項１１】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つの前記Ｒ
ＮＡウィルス由来の完全な移動タンパク質またはその断片のオープンリーディン
グフレームと相同なオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の系
。
【請求項１２】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、任意の前記ＲＮＡウィル
スにとって非固有の移動タンパク質を含む、請求項１に記載の系。
【請求項１３】さらに前記ＲＮＡレプリコンが集合の起点を含む、請求項
１に記載の系。
【請求項１４】さらに前記ＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つの内部リ
ボソーム開始部位を含む、請求項１に記載の系。
【請求項１５】少なくとも１つの前記ＲＮＡウィルスが、プラス鎖ｓｓＲ
ＮＡウィルスである、請求項１に記載の系。
【請求項１６】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、ポチウィルス、トバ
モウィルス、ブロモウィルス、カーモウィルス、ポテックスウィルス、クロステ
ロウィルス、バイモウィルス、およびホルデイウィルスからなる植物ウィルス群
から選択される、請求項１５に記載のプラス鎖ｓｓＲＮＡ。
【請求項１７】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、アルファウィルス、
ポリオウィルス、およびライノウィルスからなる動物ウィルス群から選択される
、請求項１５に記載のプラス鎖ｓｓＲＮＡ。
【請求項１８】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスがタバコモザイクウィル
スである、請求項１６に記載のプラス鎖ｓｓＲＮＡ。
【請求項１９】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）トバモウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記トバモウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその断片のオ
ープンリーディングフレームと相同なオープンリーディングフレーム、（３）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記トバモウィルスにとって非固有の配列、および（５）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項１に記載の系。
【請求項２０】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′末端でヌクレオチド約１３４０個まで相
同な配列、（２）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（３）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（４）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項１９に記載の系。
【請求項２１】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその
断片のオープンリーディングフレームと相同なオープンリーディングフレーム、（３）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（５）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項１９に記載の系。
【請求項２２】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（５）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項２１に記載の系。
【請求項２３】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約１００個まで相同な配列、および（６）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項２２に記載の系。
【請求項２４】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約２００個まで相同な配列、および（６）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項２２に記載の系。
【請求項２５】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約３００個まで相同な配列、および（６）少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって固有の
３′ＮＴＲを含む、請求項２２に記載の系。
【請求項２６】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）トバモウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記トバモウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその断片のオ
ープンリーディングフレームと相同なオープンリーディングフレーム、（３）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記トバモウィルスにとって非固有の配列、および（５）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項１に記載の系。
【請求項２７】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′末端でヌクレオチド約１３４０個まで相
同な配列、（２）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（３）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（４）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２６に記載の系。
【請求項２８】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその
断片のオープンリーディングフレームと相同なオープンリーディングフレーム、（３）サブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（５）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２６に記載の系。
【請求項２９】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターと相同のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、および（５）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２８に記載の系。
【請求項３０】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約１００個まで相同な配列、および（６）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２９に記載の系。
【請求項３１】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約２００個まで相同な配列、および（６）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２９に記載の系。
【請求項３２】前記ＲＮＡレプリコンが、（１）タバコモザイクウィルスの５′ＮＴＲにとって固有の５′ＮＴＲ、（２）前記タバコモザイクウィルスの完全な１２６ｋＤａ非構造タンパク質の
オープンリーディングフレーム、（３）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のためのサブゲノムｍ
ＲＮＡプロモーターにとって固有のサブゲノムｍＲＮＡプロモーター、（４）前記タバコモザイクウィルスにとって非固有の配列、（５）前記タバコモザイクウィルスのコートタンパク質のオープンリーディン
グフレームの３′末端からヌクレオチド約３００個まで相同な配列、および（６）任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスの３′ＮＴＲにとって非固有の３′
ＮＴＲを含む、請求項２９に記載の系。
【請求項３３】前記ヘルパーＲＮＡウィルスがプラス鎖ｓｓＲＮＡウィル
スに由来する、請求項１に記載の系。
【請求項３４】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、ポチウィルス、トバ
モウィルス、ブロモウィルス、カーモウィルス、ポテックスウィルス、クロステ
ロウィルス、バイモウィルス、およびホルデイウィルスからなる植物ウィルス群
から選択される、請求項３３に記載の系。
【請求項３５】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、アルファウィルス、
ポリオウィルス、およびライノウィルスからなる動物ウィルス群から選択される
、請求項３３に記載の系。
【請求項３６】少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスおよび少なくと
も１つのＲＮＡレプリコンが同じウィルス源に由来する、請求項１に記載の系。
【請求項３７】任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスが、任意の前記ＲＮＡ
レプリコンにとって非固有のものである、請求項１に記載の系。
【請求項３８】前記ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィ
ルスの野生型よりも効率よく前記ＲＮＡレプリコンの複製を行なうように修飾さ
れる、請求項１に記載の系。
【請求項３９】前記修飾されたヘルパーＲＮＡウィルスがプラス鎖ｓｓＲ
ＮＡウィルスに由来する、請求項３８に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィル
ス。
【請求項４０】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、ポチウィルス、トバ
モウィルス、ブロモウィルス、カーモウィルス、ポテックスウィルス、クロステ
ロウィルス、バイモウィルス、およびホルデイウィルスからなる植物ウィルス群
から選択される、請求項３９に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４１】前記プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスが、アルファウィルス、
ポリオウィルス、およびライノウィルスからなる動物ウィルス群から選択される
、請求項３９に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４２】修飾されたヘルパーＲＮＡウィルスがタバコモザイクウィ
ルスに由来する、請求項４０に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４３】修飾されたヘルパーＲＮＡウィルスがオドントグロッサム
（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ）輪点ウィルスに由来する、請求項４０に記載の
修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４４】ヘルパーＲＮＡウィルスがタバコモザイクウィルスの抑制
終止コドンで修飾される、請求項４２に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィル
ス。
【請求項４５】前記終止コドンが１または複数の翻訳可能なコドンへ突然
変異されている、請求項４４に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４６】前記翻訳可能なコドンが、チロシン、フェニルアラニン、
およびセリンをコードするコドンからなる群から選択される、請求項４５に記載
の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４７】前記終止コドンがコード配列から欠失している、請求項４
４に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４８】ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィルス
のコートタンパク質のオープンリーディングフレームを非固有のコートタンパク
質のオープンリーディングフレームで置換するように修飾される、請求項３８に
記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項４９】ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィルス
のコートタンパク質のオープンリーディングフレームを除去するように修飾され
る、請求項３８に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項５０】ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィルス
の移動タンパク質のオープンリーディングフレームを非固有の移動タンパク質の
オープンリーディングフレームで置換するように修飾される、請求項３８に記載
の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項５１】ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィルス
の移動タンパク質のオープンリーディングフレームを除去するように修飾される
、請求項３８に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項５２】ヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパーＲＮＡウィルス
にとって非固有の第二サブゲノムｍＲＮＡプロモーターを付加するように修飾さ
れる、請求項３８に記載の修飾されたヘルパーＲＮＡウィルス。
【請求項５３】少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスが、前記ヘルパ
ーＲＮＡウィルスにとって非固有の配列を含むように修飾される、請求項１に記
載の系。
【請求項５４】植物中でＲＮＡまたはタンパク質を生産する方法であって
、（ａ）ＲＮＡウィルスに由来する１または複数のＲＮＡレプリコンを入手するス
テップであって、少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、（１）５′ＮＴＲ、（２）ＲＮＡウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその断片のオープ
ンリーディングフレームにとって固有のオープンリーディングフレーム、（３）前記ＲＮＡウィルスにとって非固有の少なくとも１つの配列、および（４）３′ＮＴＲを含む、ステップと、（ｂ）１または複数のヘルパーウィルスを入手するステップであって、少なくと
も１つのヘルパーウィルスが前記ＲＮＡレプリコンの複製を行なう、ステップと
、（ｃ）前記１または複数のＲＮＡレプリコンおよび１または複数のヘルパーＲＮ
Ａウィルスを共接種するステップを含む、前記方法。
【請求項５５】植物中でＲＮＡまたはタンパク質を生産する方法であって
、（ａ）ＲＮＡウィルス由来の１または複数のＲＮＡレプリコンを入手するステッ
プであって、少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、（１）５′ＮＴＲ、（２）ＲＮＡウィルス由来の完全な非構造タンパク質またはその断片のオープ
ンリーディングフレームにとって固有のオープンリーディングフレーム、（３）前記ＲＮＡウィルスにとって非固有の少なくとも１つの配列、および（４）３′ＮＴＲを含む、ステップと、（ｂ）１または複数のヘルパーＲＮＡを入手するステップであって、少なくとも
１つのヘルパーＲＮＡウィルスが前記ＲＮＡレプリコンの複製を行ない、かつ少
なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスが任意の前記ヘルパーＲＮＡウィルスに
とって非固有の配列を含む、ステップと、（ｃ）前記１または複数のＲＮＡレプリコンおよび１または複数のヘルパーＲＮ
Ａウィルスを共接種するステップを含む、前記方法。
【請求項５６】少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが内部接種により送達
される、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】少なくとも１つのヘルパーＲＮＡウィルスが内部接種によ
り送達される、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５８】請求項５４または５５の方法に従って接種された宿主植物
。
【請求項５９】請求項５４または５５の方法に従って生産されたＲＮＡ産
物。
【請求項６０】請求項５４または５５の方法に従って生産された非固有の
タンパク質産物。
【請求項６１】請求項５４または５５の方法に従って生産された非固有の
ペプチド産物。
【請求項６２】請求項１の系を含む植物の宿主。