CN1373805A - 脑膜炎球菌的抗原性肽 - Google Patents

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Abstract

WO99/36544公开了大量的来自脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质。本发明涉及这些蛋白质的含有至少一个抗原决定簇的片段。还公开了含有这些片段的同源序列和蛋白质。

Description

脑膜炎球菌的抗原性肽
在本文中提及的所有文件都全部通过引用纳入本文。尤其是国际专利申请WO99/36544的内容全部引入本文。
发明领域
本发明涉及来自细菌—脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的抗原性肽序列。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是不能动的、对人有致病性的革兰氏阴性双球菌。
根据该菌的荚膜多糖，已经鉴定出12种脑膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是南撒哈拉-非洲地区流行病中最常见的病原体。B型和C型血清型菌是导致美国以及大多数发达国家内大多数病例的原因。W135和Y型血清型菌是导致美国和发达国家的其余病例的原因。
目前使用的脑膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135组成的四价多糖疫苗。然而脑膜炎球菌B(menB)仍是一个问题。不能采用多糖方法，因为menB荚膜多糖是一种α(2-8)-相连的N-乙酰神经氨酸的聚合物，它也存在于哺乳动物组织中。一种menB疫苗方法是采用外膜蛋白(OMP)的混合物。为了克服抗原变异性，已经构建了含有高达9种不同膜孔蛋白的多价疫苗(例如，Poolman JT(1992)Infect.Agents Dis.4：13-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是这些方法均不能克服抗原变异性(例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)Vaccine 14(1)：49-53)。
本发明
本发明提供了在国际专利申请WO99/36544中所公开的蛋白质的片段，其中所述片段含有至少一个抗原决定簇。
因此，如果在WO99/36544中公开的任一特定蛋白质序列的长度为x个氨基酸(见表II)，那么本发明提供了该蛋白质的至多含x-1个氨基酸的片段。该片段可以比其更短(例如x-2，x-3，x-4，...)，并且宜为100个氨基酸或更少(例如90个氨基酸，80个氨基酸等)。该片段可以短至3个氨基酸，但宜为更长(如高达6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、75、或100个氨基酸)。
优选的片段含有表I中所公开的脑膜炎球菌肽序列，或其亚序列。片段可以比表I中所给出的片段更长，例如当表I中的片段是从蛋白质的氨基酸残基p至残基q，那么本发明还涉及从残基(p-1)、(p-2)或(p-3)至残基(q+1)、(q+2)或(q+3)的片段。
本发明还提供了与这些片段同源(即有序列相同性)的多肽。根据具体的序列，序列相同性的程度宜大于50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。这些同源的多肽包括片段的突变体和等位基因变体。两个序列之间的相同性宜用Smith-Waterman同源性搜寻算法确定，如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中，采用参数“缺口罚分(gap open penalty)”为12，“缺口延伸罚分(gap extension penalty)”为1进行缺口仿射搜索。
本发明还提供了含有一种或多种上述片段的蛋白质。
本发明的附加条件是：在其范围内不包括含有WO99/36544中所公开的45个蛋白质序列中任一个蛋白质序列的蛋白质(即WO99/36544中偶数SEQ ID 2，4，6，8，10，...，888，890，892)。
当然，本发明的蛋白质可以用多种方法制备(例如，重组表达、从细胞培养物中纯化、化学合成等)，并可采用各种形式(例如天然的、C末端和/或N末端融合形式等)。它们宜制成基本上纯净的形式(即基本上不含其它奈瑟球菌或宿主细胞蛋白)。短的蛋白质优选用化学肽合成法生产。
另一方面，本发明提供了识别本发明片段的抗体，附加条件是本发明在其范围内不包括识别WO99/36544中45个完整蛋白质序列之一的抗体。抗体可以是多克隆的，或更佳地是单克隆的，并且可以用任何合适方式产生。
本发明还提供了含有被这些抗体识别的肽序列的蛋白质。当然，这些肽序列包括WO99/36544中脑膜炎球菌蛋白质的片段，但还包括结合于免疫球蛋白时模拟脑膜炎球菌肽抗原性结构的肽。
另一方面，本发明提供了编码本发明所述片段和蛋白质的核酸，附加条件是本发明在其范围内不包括编码WO99/36544中45个中任一个蛋白质序列的核酸。
此外，本发明提供了一类核酸，所述核酸含有与这些序列同源(即有序列相同性)的序列。此外，本发明还提供了可杂交于这些序列(较佳地在“高度严紧”条件下杂交(如65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液中))的核酸。
还应理解，本发明提供了一类核酸，所述核酸含有与上述序列互补的序列(例如用于反义或探测目的)。
当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从基因组或cDNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针等)。此外，术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。
另一方面，本发明提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体)以及用这些载体转化的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了含有本发明蛋白质、抗体和/或核酸的组合物。这些组合物适合作为例如疫苗、诊断试剂或免疫原性组合物。
本发明还提供了用作药剂(例如作为疫苗或免疫原性组合物)，或作为诊断试剂的本发明的核酸、蛋白质或抗体。本发明还提供了本发明的核酸、蛋白质或抗体在生产下列物质中的应用：(i)用于治疗或预防奈瑟球菌属细菌感染的药剂；(ii)用于检测奈瑟球菌属细菌或检测抗奈瑟球菌属细菌抗体是否存在的诊断试剂；和/或(iii)用于产生抗奈瑟球菌属细菌的抗体的试剂。所述的奈瑟球菌属细菌可以是任何物种或菌株(例如淋病奈瑟球菌)，但优选脑膜炎奈瑟球菌，尤其是菌株A或菌株B。
本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明的核酸、蛋白质和/或抗体。
另一方面，本发明提供了各种方法。
提供了一种生产本发明的蛋白的方法，该方法包括步骤：在诱导蛋白表达的条件下，培育本发明的宿主细胞。
提供了一种生产本发明蛋白质或核酸的方法，其中用化学法部分或全部地合成所述蛋白或核苷酸。
提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤：(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。
提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合物。
下面是可用于实施本发明(例如为了免疫或诊断目的而使用所公开的序列)的标准技术和程序的综述。该综述不是对本发明的限制，相反它只是给出了一些可以使用但并非必需的例子。
综述
除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有全面的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验手册》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编.1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(1984)；《酶学方法》系列丛书(Academic Press，Inc.)，尤其是154和155卷；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker编(1987)，《细胞和分子生物学的免疫化学方法》(Academic Press，London)；Scopes，(1987)《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编1986)。
在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作参考。
定义
当组合物中总X+Y重量的至少85％是X时，则称含有X的组合物“基本上没有Y”。较佳的，X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更佳至少约95％或者甚至99％(重量)。
术语“包含”指“含有”和“由......构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X+Y。
术语“抗原决定簇”包括B细胞表位和T细胞表位。
术语“异源”指在自然界中发现不在一起的两种生物学组分。此组分可以是宿主细胞、基因、或调控区如启动子。尽管异源组分在自然界中发现不在一起，但是它们能一起起作用，例如当与某基因异源的一种启动子与该基因操作性相连时。另一个例子是脑膜炎球菌序列与小鼠宿主细胞异源。另一例子是来自相同或不同蛋白质的两个表位，已经以自然界没有的排列方式组装在一个蛋白质中。
“复制起点”是启动和调节多核苷酸(例如表达载体)复制的一种多核苷酸序列。复制起点可作为细胞内多核苷酸复制的自主性单位，能在其自身的控制下进行复制。复制起点是载体在特定宿主细胞中复制所需要的。有了某一复制起点，表达载体就能在细胞中合适蛋白的存在下高拷贝数的复制。复制起点的例子是在酵母中有效的自主复制序列；以及在COS-7细胞中有效的病毒性T-抗原。
表达系统
脑膜炎球菌属细菌的核苷酸序列可在各种不同的表达系统中表达；例如与哺乳动物细胞、杆状病毒、植物、细菌和酵母一起使用的那些系统。
i.哺乳动物系统
哺乳动物表达系统是本领域中已知的。哺乳动物启动子是能结合哺乳动物RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有一个转录起始区，其通常邻近编码序列的5′端，还具有一个TATA盒，其通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对(bp)处。认为TATA盒指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子还含有一个上游启动子元件，其通常位于TATA盒上游100至200bp内。该上游启动子元件决定了转录启动的速度，并可在两个方向之一上起作用[Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳动物细胞中的表达”《分子克隆：实验手册》，第2版]。
哺乳动物病毒基因通常是高表达的，具有广泛的宿主范围；因此，编码哺乳动物病毒基因的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒启动子。另外，从非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的启动子序列。表达可以是组成型的或受调控的(诱导型)，取决于启动子能否在激素反应性细胞中用促糖皮质激素诱导。
增强元件(增强子)的存在，联合上述启动子元件通常会提高表达水平。增强子是这样一种调控性DNA序列，当其与同源或异源启动子相连，合成在正常的RNA起始位点开始时，它能刺激转录提高1000倍。当增强子位于转录起始位点的上游或下游，处于正常或翻转方向，或距离启动子1000个核苷酸以上的距离时，它均具有活性[Maniatis等人(1987)Science 236：1237；Alberts等人(1989)《细胞分子生物学》，第2版]。从病毒衍生获得的增强子元件可能是特别有用的，因为它们通常具有较宽的宿主范围。例子包括SV40早期基因增强子[Dijkema等人(1985)EMBO J.4：761]以及衍生自Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子[Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79：6777]以及来自人巨细胞病毒的增强子/启动子[Boshart等人(1985)Cell 41：521]。另外，一些增强子仅仅在诱导物(例如激素或金属离子)的存在下是可调节的并具有活性[Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2：215；Maniatis等人(1987)Science 236：1237]。
DNA分子可在哺乳动物细胞中胞内表达。启动子序列可以和DNA分子直接相连，在这种情况下，重组蛋白的N端第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育来从蛋白上切下此N端。
另外，外来蛋白也可从细胞中分泌到生长培养基中，方法是产生嵌合的DNA分子，该DNA分子编码的融合蛋白包括一前导序列片段，该片段在哺乳动物细胞中提供了外源蛋白的分泌。较佳的，在前导序列片段和外源基因之间可以有能在体内或体外断裂的加工位点。前导序列片段通常编码一种信号肽，该信号肽由引导蛋白分泌出细胞的疏水性氨基酸组成。腺病毒三联前导序列是哺乳动物细胞中分泌外来蛋白的一个前导序列的例子。
通常，哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3′的调控区域，因此它和启动子元件一起连接在编码序列的侧面。成熟mRNA的3′端由定点的转录后断裂和聚腺苷酸化形成[Birnstiel等人(1985)Cell 41：349；Proudfoot和Whitelaw(1988)″真核RNA的终端和3′端加工″《转录和剪接》(B.D.Hames和D.M.Glover编)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14：105]。这些序列指导mRNA的转录，mRNA能被翻译成该DNA编码的多肽。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括从SV40衍生的那些[Sambrook等人(1989)“克隆基因在培养的哺乳动物细胞中的表达”《分子克隆实验指南》]。
通常，上述组件，包括启动子、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列被一起放在表达构建物中。如果需要，表达构建物中还包括增强子、具有功能性剪接供体和受体位点的内含子以及前导序列。表达构建物通常以复制子形式维持，例如是能在宿主(如哺乳动物细胞或细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。哺乳动物复制系统包括从动物病毒衍生的那些系统，其需要反式作用因子来进行复制。例如，含有乳多空病毒复制系统的质粒，如SV40[Gluzman(1981)Cell 23：175]或多瘤病毒，在合适的病毒T抗原存在下复制出极高的拷贝数。哺乳动物复制子的其它例子包括衍生自牛乳头瘤病毒和EB病毒的复制子。另外，复制子可以有两个复制系统，从而使其能维持在例如哺乳动物细胞中进行表达并能在原核宿主中克隆和扩增。这些哺乳动物细菌穿梭载体的例子包括pMT2[Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9：946]和pHEBO[Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074]。
所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包裹在脂质体中以及将DNA直接显微注射到胞核中。
可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞系是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。
ii.杆状病毒系统
也可将编码蛋白质的多核苷酸插入合适的昆虫表达载体中，并与该载体中的控制元件操作性相连。载体构建采用本领域已知的技术。总地来说，表达系统的组分包括一种转移载体，通常是细菌质粒，其含有杆状病毒基因组片段以及便于插入待表达异源基因的限制性位点；野生型杆状病毒，其序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源(这使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。
将编码蛋白质的DNA序列插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，使载体和病毒基因组重组。表达包装的重组病毒，鉴定并纯化重组噬斑。杆状病毒/昆虫细胞表达系统材料及其方法，除别的以外，可以试剂盒形式购自Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)。这些技术通常是本领域技术人员所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)(后称“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。
在将编码蛋白质的DNA序列插入杆状病毒基因组之前，通常将上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列装配在中间置换型构建物(转移载体)中。该构建物可含有单个基因以及操作性相连的调控元件；多个基因，每个基因有其自己的一套操作性相连调控元件；或是由同一组调控元件调控的多个基因。中间置换型构建物通常保持在一个复制子中，例如能在宿主(如细菌)内稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子将具有一个复制系统，从而使其能保持在合适的宿主中进行克隆和扩增。
目前，用来将外源基因导入AcNPV的最常用的转移载体是pAc373。还可设计本领域技术人员已知的其它许多载体。这些载体例如包括，pVL985(其将多角体蛋白的起始密码子从ATG变为ATT，在ATT下游32个碱基对处引入一个BamHI克隆位点；见Luckow和Summers，Virology(1989)17：31)。
质粒通常还含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人(1988)Ann.Rev.Microbiol.，42：177)以及用来在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点。
杆状病毒转移载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能结合杆状病毒RNA聚合酶并启动下游(5′到3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，该区通常邻近编码序列的5′端。该转录起始区通常包括一个RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。杆状病毒转移载体还可能具有称为增强子的第二区，如果该区域存在，它通常远离结构基因。表达可以是调控型或组成型的。
在病毒感染周期晚期大量转录的结构基因提供了特别有用的启动子序列。例子包括从编码病毒多角体蛋白的基因衍生获得的序列，Friesen等人(1986)“杆状病毒基因表达的调控”《杆状病毒分子生物学》(Walter Doerfler编辑)；EPO公开号127 839和155 476；以及编码p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.69：765。
编码合适的信号序列的DNA可以衍生自分泌的昆虫或杆状病毒蛋白的基因(如杆状病毒多角体蛋白基因)(Carbonell等人，(1988)Gene，73：409)。另外，由于哺乳动物细胞翻译后修饰的信号(如信号肽断裂、蛋白水解断裂和磷酸化)看来可被昆虫细胞识别，且分泌和胞核积累所需的信号看来在无脊椎动物细胞和脊椎动物细胞之间是保守的，因此也可用非昆虫来源的前导序列来提供昆虫中的分泌，这些前导序列例如是从编码人α-干扰素(Maeda等人(1985)，Nature 315：592)、人胃泌素释放的肽(Lebacq-Verheyden等人(1988)，Molec.Cell.Biol.8：3129)、人IL-2(Smith等人(1985)PNAS，USA，82：8404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58：273)和人葡糖脑苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，7：99)的基因衍生获得的。
重组多肽或聚蛋白可以在胞内表达，或如果它用合适的调控序列表达，它可被分泌。非融合的外源蛋白的良好胞内表达理想的通常需要具有短前导序列的异源基因在ATG起始信号前有合适的翻译起始信号。如果需要，可通过和溴化氰体外培育来从成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。
另外，可通过产生嵌合的DNA分子将非天然分泌的重组聚蛋白或蛋白从昆虫细胞中分泌出来，该嵌合的DNA分子所编码的融合蛋白包含一前导序列片段，该片段提供了昆虫中分泌外源蛋白的作用。该前导序列片段通常编码一种信号肽，该信号肽包含的疏水性氨基酸引导蛋白质转移到内质网中。
在插入了编码该蛋白表达产物前体的DNA序列和/或基因后，用转移载体的异源DNA和野生型杆状病毒的基因组DNA共同转化(通常是共转染)昆虫细胞宿主。此构建物的启动子和转录终止序列通常包含2-5kb的杆状病毒基因组片段。将异源DNA引入杆状病毒中所需位点内的方法是本领域所知的。(见Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通过同源双交换重组来插入一个基因如多角体蛋白基因中；插入还可以是插入工程改造入所需杆状病毒基因内的限制性酶切位点中。Miller等人(1989)，Bioessays 4：91。当DNA序列被克隆在表达载体多角体蛋白基因位置中时，其5′和3′均侧接了多角体蛋白特异性序列，并位于多角体蛋白启动子的下游。
随后将新形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中。发生同源重组的频率很低(在约1％和5％之间)；因此，共转染后产生的大多数病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一种方法来鉴别重组病毒。该表达系统的一个优点是肉眼筛选能区分重组病毒。在病毒感染后期，天然病毒产生的多角体蛋白在受其感染细胞的胞核中产生的水平非常高。累积的多角体蛋白形成的包涵体还含有包埋颗粒。这些包涵体的大小为15微米，它们具有高度的折光性，从而使它们呈现明亮的发光外观，在光学显微镜下很容易观察。感染了重组病毒的细胞缺少包涵体。为了区分重组病毒和野生型病毒，用本领域已知的技术将转染上清接种到单层昆虫细胞上形成噬斑。即，在光学显微镜下筛选存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重组病毒)包涵体的噬斑。“当代微生物学方法”第2卷(Ausubel等人编辑)，16.8(增补10，1990)；Summers和Smith，同上；Miller等人(1989)。
已经开发出感染进入几种昆虫细胞的重组杆状病毒表达载体。例如，已经开发出用于感染以下昆虫细胞的重组杆状病毒：埃及伊蚊、苜蓿丫纹夜蛾、家蚕、黑尾果蝇、草地夜蛾和粉纹夜蛾(WO 89/046699；Carbonell等人(1985)J.Virol.56：153；Wright(1986)Nature 321：718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156；综述见Fraser等人(1989)InVitro Cell.Dev.Biol.25：225)。
可以购得细胞和细胞培养基用于在杆状病毒/表达系统中直接表达和融合表达异源多肽；细胞培养技术是本领域技术人员通常所知的。例如见Summers和Smith，同上。
然后，经修饰的昆虫细胞可以生长在合适的营养培养基中，该培养基能稳定地保持该质粒于修饰的昆虫宿主中。当表达产物的基因处于可诱导的控制下时，可以使宿主生长至高密度，并诱导表达。另外，当表达是组成型表达时，产物将被连续表达到培养基中，营养性培养基必需不断循环，取出感兴趣的产物同时补充消耗的营养物。产物可用以下这些技术来纯化：例如层析，如HPLC、亲和层析、离子交换层析等；电泳；密度梯度离心；溶剂抽提等。产物可按需作进一步纯化，以基本上除去所有也分泌到培养基中或由昆虫细胞裂解而产生的昆虫蛋白，以提供一种至少基本上不含宿主碎片如蛋白质、脂质和多糖的产物。
为了进行蛋白质表达，将从转化子衍生获得的重组宿主细胞培育在允许重组蛋白的编码序列表达的条件下。这些条件将随所选定的宿主细胞而变。然而，本领域技术人员容易根据本领域已知的知识来确定该条件。
iii.植物系统
本领域已知有许多植物细胞培养系统和全植物遗传表达系统。典型的植物细胞基因表达系统包括在以下专利中描述的那些，例如：US 5,693,506；US 5,659,122；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 30：3861-3863(1991)中描述了在植物细胞培养物中遗传表达的其它例子。除上述参考文献外，关于植物蛋白信号肽的描述还可在下列文献中找到：Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.209：33-40(1987)；Chandler等人，PlantMolecular Biology 3：407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.260：3731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55：353-356(1987)；Whittier等人，Nucleic Acids Research15：2515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 3：3-14(1989)；Yu等人，Gene122：247-253(1992)。关于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸诱导分泌的酶调节植物基因表达的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，《植物生理学进展》，MalcolmB.Wilkins编辑，1984Pitman Publishing Limited，London，21-52页中找到。描述其它调节代谢的基因的参考文献参见：Sheen，Plant Cell，2：1027-1038(1990)；Maas等人，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)9：3447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.).84：1337-1339(1987)。
通常，利用本领域已知的技术，将所需的多核苷酸序列插入一表达盒中，该表达盒含有为在植物中操作而设计的基因调控元件。将该表达盒插入所需的表达载体中，表达盒的上游和下游有适合在植物宿主中表达的伴随序列。这些伴随序列可来自质粒或病毒，并为载体提供所需的性能，以允许载体将DNA从起初的克隆宿主(如细菌)中移动到所需植物宿主中。基础的细菌/植物载体构建物最好能提供宽的宿主范围原核复制起点；原核可选择标记；以及，对于农杆菌转化而言，宜提供TDNA序列用于农杆菌介导的转移至植物染色体。当异源基因不易检测时，该构建物最好还具有一个适用于确定植物细胞是否已经转化的可选择标记基因。关于合适标记(例如对于禾草类家族成员)的综述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)：165-185中找到。
还建议采用适合将异源序列整合到植物基因组中的序列。这些序列可能包括用于同源重组的转座子序列以及允许将异源表达盒随机插入植物基因组中的Ti序列。合适的原核可选择标记包括抗生素(如氨苄青霉素或四环素)抗性标记。编码其它功能的其它DNA序列也可存在于载体中，这是本领域所知的。
本发明的核酸分子可包括在一个表达盒中来表达感兴趣的蛋白质。通常只要一个表达盒，但是两个或多个表达盒也是可行的。除了编码异源蛋白的序列外，重组表达盒还含有下列元件：启动子区域、植物5′非翻译序列、起始密码子(根据结构基因原来是否具有而定)、以及转录和翻译终止序列。表达盒5′和3′端的独特限制性酶位点能使表达盒方便地插入预先存在的载体中。
异源编码序列可以用于任何与本发明有关的蛋白。编码感兴趣的蛋白的序列将编码出一个信号肽，该信号肽能适当地加工和转运蛋白质，并且通常缺少可能会导致本发明的所需蛋白与膜结合的序列。由于对于大部分来说，转录起始区将针对发芽期间表达和转运的基因，采用提供转运的信号肽，也可提供转运感兴趣的蛋白质。通过这种方式，感兴趣的蛋白将从表达该蛋白的细胞中转运出来，并能被有效地收获。通常，种子中的分泌是通过糊粉或小盾体上皮层进入种子的胚乳。尽管不需要使蛋白从产生该蛋白的细胞中分泌出来，但是这种分泌有利于重组蛋白的分离和纯化。
由于所需基因产物的最终表达将在真核细胞中进行，因此需要确定克隆的基因部分是否含有作为内含子被宿主剪接体机制加工的序列。如果是这样，需要对“内含子”区进行定点诱变，以防止一部分遗传信息作为错误的内含子密码而丧失，Reed和Maniatis，Cell 41：95-105，1985。
可用微量移液管以机械方式转移重组DNA，将载体直接显微注射到植物细胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202：179-185。还可用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。导入核酸片段的另一种方法是用小颗粒进行高速弹道贯穿，在这些小珠或颗粒的基质中或表面上带有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185：330-336提出用颗粒轰击大麦胚乳以产生转基因大麦。还有一种导入方法是使原生质体和其它实体(微细胞(minicell)、细胞、溶酶体或其它可融合的脂质表面体)融合，Fraley等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。
载体也可通过电穿孔导入植物细胞中。(Fromm等人，PNAS USA 82：5824，1958)。在该技术中，在含有基因构建物的质粒存在下电穿孔植物原生质体。高电场强度的电脉冲使生物膜可逆地被通透，从而允许导入质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并形成植物愈伤组织。
能分离出原生质体并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本发明进行转化，从而回收得到含有转基因的全植物。已经知道实际上可以从培育的细胞或组织再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果实和其它树、豆科植物和蔬菜的所有主要种类。一些合适的植物包括，例如，草莓属、莲花属、苜蓿属、驴食豆属、三叶草属、胡卢巴属、豇豆属、柑橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、鼠耳芥属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、龙骨角属、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属(Salpiglossis)、香瓜属、Browaalia、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属和曼陀罗属各种类。
再生方式随各种植物而有所不同，但是通常是首先提供含有异源基因拷贝的转化的原生质体悬液。形成愈伤组织，从愈伤组织中诱生出枝条，随后是根。另外，从原生质体悬液可以诱生形成胚胎。这些胚胎象天然的胚胎那样发芽形成植物。培养基通常含有各种氨基酸和激素，如植物生长素和细胞分裂素。尤其是对于玉米和苜蓿属来说，在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝条和根通常同时发育。有效的再生取决于培养基、基因型以及培养史。如果控制了这三个变量，那么再生能完全再现和重复。
在一些植物细胞培养系统中，本发明所需的蛋白可能被排泄出来，或者蛋白可从全植物中提取出来。当本发明所需的蛋白被分泌到培养基中后，就可进行收集。或者，可以用机械方式破碎胚以及无胚-半种子或其它植物组织，以释放出分泌到细胞和组织之间的蛋白。将该混合物悬于缓冲液中，以收回可溶性蛋白。然后用常规的蛋白分离和纯化方法纯化重组蛋白。用常规方法调节时间、温度、pH、氧和体积等参数，以优化异源蛋白的表达和回收。
iv.细菌系统
细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，其通常位于编码序列的5′端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。细菌启动子可能还有第二个功能区域称为操纵子，它可能与毗邻的RNA合成开始的RNA聚合酶结合位点重叠。该操纵子允许(可诱导)对转录的负调节，因为基因阻遏蛋白可能结合操纵子并因而抑制特定基因的转录。在负调节元件(如操纵子)不存在时，可能发生组成型表达。另外，正调节可通过基因激活蛋白结合序列来实现，如果有的话，该结合序列通常邻近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因激活蛋白的例子是分解代谢物激活剂蛋白(CAP)，它帮助启动大肠杆菌(E.coli)中的lac操纵子的转录[Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，表达的调控可能是正作用或负作用，从而增强或减弱转录。
编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人(1977)Nature 198：1056]和麦芽糖)代谢酶的启动子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))[Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.8：4057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]的启动子序列。β-内酰胺酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″干扰素的克隆和其它错误″《干扰素3》(I.Gresser编辑)]，λ嗜菌体PL[Shimatake等人(1981)Nature 292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。
另外，非天然存在的合成的启动子也可象细菌启动子一样起作用。例如，一种细菌或嗜菌体启动子的转录激活序列可以和另一种细菌或嗜菌体启动子的操纵子序列连接在一起，形成合成的杂交启动子[美国专利4,551,433]。例如，tac启动子是杂合的trp-lac启动子，它由trp启动子以及受lac阻遏蛋白调节的lac操纵子序列组成[Amann等人(1983)Gene 25：167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21]。另外，细菌启动子可包括非细菌来源但能结合细菌RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。天然存在的非细菌来源的启动子还能和相容的RNA聚合酶偶联在一起，从而在原核细胞中高水平地表达某些基因。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统就是一种偶联的启动子系统[Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189：113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：1074]。另外，杂合的启动子还可由嗜菌体启动子以及大肠杆菌操纵子区域组成(EP-A-0267 851)。
除了有功能的启动子序列外，有效的核糖体结合位点对于外来基因在原核细胞中的表达也是有用的。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密码子(ATG)以及在起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人(1975)Nature 254：34]。认为SD序列是通过SD序列和大肠杆菌16SrRNA的3′端之间碱基配对来促进mRNA与核糖体结合的[Steitz等人(1979)″信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列《生物学调节和发育：基因表达》(编者R.F.Goldberger)]。为了表达具有弱的核糖体结合位点的原核基因和真核基因[Sambrook等人(1989)″克隆基因在大肠杆菌中的表达″《分子克隆实验手册》]。
DNA分子可以在胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育或通过和细菌甲硫氨酸N-端肽酶体内或体外培育，将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下(EPO-A-0219 237)。
融合蛋白为直接表达提供了另一种方法。通常，将编码内源细菌蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5′端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，λ噬菌体细胞基因可以和外源基因的5′端相连并在细菌中表达。所得融合蛋白宜保留一个酶(因子Xa)加工位点，以便将噬菌体蛋白与外源基因切开[Nagai等人(1984)Nature 309：810]。融合蛋白也可用lacZ[Jia等人(1987)Gene 60：197]，trpE[Allen等人(1987)J.Biotechnol.5：93；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.135：11]以及Chey[EP-A-0324 647]基因的序列组成。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码一可切割的位点。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白[Miller等人(1989)Bio/Technology 7：698]。
另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白分泌出细胞，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个信号肽序列片段，该序列片段能使细菌中的外源蛋白分泌出来[美国专利4,336,336]。信号序列片段通常编码一个信号肽，该信号肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出细胞。蛋白质被分泌到生长培养基(革兰阳性菌)中或细胞内膜和外膜之间的周质间隙内(革兰阴性菌)。在编码的信号肽片段和外源基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。
编码合适信号序列的DNA可以从分泌性细菌蛋白的基因衍生获得，这些基因例如是大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等人(1983)，《基因表达的实验操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.3：2437]以及大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)[Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：7212]。另一个例子是，可采用各种芽孢杆菌菌株的α淀粉酶基因的信号序列将异源蛋白分泌出枯草芽孢杆菌[Palva等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0244 042]。
通常，细菌所识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3′的调控区，它和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列通常包括约50个核苷酸的DNA序列，该序列能形成帮助终止转录的茎环结构。例子包括衍生自具有强启动子的基因(如大肠杆菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的转录终止序列。
上述组件，包括启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列通常一起被放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式维持，例如能在宿主(如细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。复制子具有一个复制系统，从而允许其维持在原核宿主中或进行表达或进行克隆和扩增。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。
另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入细菌基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与细菌染色体同源，从而允许该载体整合。整合看来是载体和细菌染色体中的同源DNA之间重组的结果。例如，用不同芽孢杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合到芽孢杆菌染色体中(EP-A-0127 328)。整合载体还可包含噬菌体或转座子序列。
通常，染色体外构建物以及整合的表达构建物可含有可选择的标记，以便选择已经转化的菌株。可选择标记可在细菌宿主中表达，其包括赋予细菌对药物(如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素)抗性的基因[Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469]。可选择标记还可包括生物合成性基因，如在组氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途径中的那些基因。
另外，上述某些组件可以一起放在转化载体中。转化载体通常包含一个可选择标记，如上所述，该载体以复制子形式维持或发展成一个整合载体。
已经开发出了用于转化到许多细菌中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出了用于下列细菌的表达载体：枯草芽孢杆菌[Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036 259和063 953；WO84/04541]，大肠杆菌[Shimatake等人，(1981)Nature 292：128；Amann等人，(1985)Gene40：183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0036 776、136 829和136 907]，酪链球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]；浅青紫链球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]，浅青紫链霉菌[美国专利4,745,056]。
将外源DNA导入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用氯化钙或其它试剂(如二价阳离子和二甲亚砜)处理对细菌进行转化。DNA还可通过电穿孔方法导入细菌细胞。转化程序通常因待转化的细菌种类而不同。[参见，例如使用杆菌：Masson等人，(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：5582；EP-A-0036 259和063 953；WO 84/04541；使用弯曲杆菌：Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：856；和Wang等人，(1990)J.Bacteriol.172：949；使用埃希氏大肠杆菌：Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69：2110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.16：6127；Kushner(1978)″用ColE1-衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法″Genetic Engineering：Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia编辑)；Mandel等人，(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949：318；使用乳酸杆菌：Chassy等人，(1987)FEMS Microbiol.Lett.44：173；使用假单胞菌：Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem 170：38；使用葡萄球菌：Augustin等人，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203；使用链球菌：Barany等人，(1980)J.Bacteriol.144：698；Harlander(1987)″用电穿孔转化链球菌产乳酸微生物″Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III编辑)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412]。
v.酵母表达
酵母表达系统也是本领域技术人员所知的。酵母启动子是能结合酵母RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，它通常位于编码序列的5′端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点(″TATA″盒)以及一个转录起始位点。酵母启动子可能还有第二个功能区域称为上游激活序列(UAS)，如果存在的话，它通常远离结构基因。UAS能调节表达(可诱导)。在UAS不存在时，发生组成型表达。表达的调控可能是正作用或负作用的，从而增强或减弱转录。
酵母是一种发酵生物体，具有活泼的代谢途径，因此编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括醇脱氢酶(ADH)(EP-A-0284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的启动子序列[Myanohara等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：1]。
另外，非天然存在的合成的启动子也可象酵母启动子一样起作用。例如，一种酵母启动子的UAS序列可以和另一种酵母启动子的转录激活区连接在一起，形成合成的杂合启动子。这种杂合启动子的例子包括与GAP转录激活区相连的ADH调控序列(美国专利No.4,876,197和4,880,734)。杂合启动子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列组成的启动子与糖酵解酶基因如GAP或PyK的转录激活区的组合(EP-A-0164 556)。另外，酵母启动子可包括非酵母来源但能结合酵母RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。这些启动子的例子包括，尤其是，[Cohen等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：1078；Henikoff等人，(1981)Nature 283：835；Hollenberg等人，(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：119；Hollenberg等人，(1979)″细菌抗生素抗性基因在酿酒酵母中的表达″Plasmids of Medical，Environmentaland Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler编辑)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11：163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2：109]。
DNA分子可以在酵母菌胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，重组蛋白N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下。
象在哺乳动物、杆状病毒以及细菌表达系统中一样，融合蛋白为酵母表达系统提供了另一种方法。通常，将编码内源酵母蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5′端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5′端相连并在酵母中表达。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码可切割的位点。例如参见EP-A-0196 056。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。因此，通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。
另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白从细胞分泌到生长培养基中，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个前导序列片段，该前导序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出来。较佳的，在编码的前导片段和外来基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。该前导序列片段通常编码了含有疏水性氨基酸的信号肽，其引导蛋白从细胞分泌出来。
编码合适信号序列的DNA可以从分泌性酵母蛋白的基因衍生获得，这些基因例如有酵母转化酶基因(EP-A-0012 873；JPO 62：096,086)以及A-因子基因(美国专利4,588,684)。另外，非酵母来源的前导序列(如干扰素前导序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060 057)。
较佳的一类分泌前导序列采用了酵母α-因子基因的片段，其含有″pre″信号序列和″pro″区。可采用的α因子片段的类型包括全长pre-pro α因子前导序列(约83个氨基酸残基)以及截短的α-因子前导序列(通常约25至50个氨基酸残基)(美国专利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324 274)。采用α-因子前导片段提供分泌作用的其它前导序列包括杂合的α-因子前导序列，其由第一个酵母的pre序列以及第二个酵母α因子的pro区域组成(例如见WO 89/02463)。
通常，酵母识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3′的调控区，其和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列和其它酵母识别的终止序列的例子是编码糖酵解酶的那些转录终止序列。
上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要时)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列，通常被一起放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或细菌)中稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子可能具有两个复制系统，从而允许其能维持在例如酵母中进行表达，并能维持在原核宿主进行克隆和扩增。这些酵母-细菌穿梭载体的例子包括YEp24[Botstein等人(1979)Gene 8：17-24]，pCL/1[Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4642-4646]和YRp17[Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158：157]。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。例如参见Brake等人，同上。
另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入酵母基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与酵母染色体同源，从而允许该载体整合，最好含有两个同源序列侧接该表达构建物。整合看来是载体和酵母染色体中同源DNA之间重组的结果[Orr-Weaver等人(1983)Methods in Enzymol.101：228-245]。通过选择合适的同源序列插入载体中，可将整合载体导入酵母中某一特定的基因座。见Orr-Weaver等人，同上。可以整合入一个或多个表达构建物，这可能会影响重组蛋白产生的水平[Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：6750]。载体中的染色体序列可以载体中的单个片段形式存在(从而导致整个载体的整合)，或是与染色体中的相邻片段同源的两个片段，这两个片段在载体中侧接在表达构建物两侧，从而可导致仅表达构建物的稳定性整合。
通常，染色体外构建物以及整合的表达可建物均含有可选择的标记，以便选择已经转化的酵母菌株。可选择标记可包括能在酵母宿主中表达的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，这些基因分别赋予酵母细胞对衣霉素以及G418的抗性。另外，合适的可选择标记还可能为酵母在毒性化合物(如金属)存在下提供生长能力。例如，CUP1的存在使酵母能在铜离子存在下生长[Butt等人，(1987)Microbiol，Rev.51：351]。
另外，上述某些组件可以一起放在转化载体中。转化载体通常包含一个可选择标记，如上所述，该载体以复制子形式维持或发展成一个整合载体。
已经开发出了用于转化入许多酵母中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出用于下列酵母菌的表达载体和将外源DNA导入酵母宿主的方法：白色念珠菌[Kurtz，等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：142]，麦芽糖念珠菌[Kunze，等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141]，多形汉逊酵母[Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302]，脆壁克鲁维酵母[Das，等人，(1984)J.Bacteriol.158：1165]，乳酸克鲁维酵母[De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154：737；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8：135]，季也蒙毕赤酵母[Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141]，巴斯德毕赤酵母[Cregg，等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3376；美国专利No.4,837,148和4,929,555]，酿酒酵母[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153：163]，栗酒裂植酵母[Beach和Nurse(1981)Nature 300：706]，以及解脂酵母(Yarrowia lipolytica)[Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10：380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.10：49]。
将外源DNA导入酵母宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用碱阳离子处理转化原生质球或完整酵母细胞。转化程序通常因待转化的酵母种类而不同。例如参见，[Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：142；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141；念珠菌]；[Gleeson等人，(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302；汉逊酵母]；[Das等人，(1984)J.Bacteriol.158：1165；De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154：1165；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8：135；克鲁维酵母]；[Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3376；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141；美国专利No.4,837,148和4,929,555；毕赤酵母]；[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153：163酿酒酵母]；[Beach和Nurse(1981)Nature 300：706；裂殖酵母]；[Davidow等人，(1985)Curr.Genet.10：39；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.10：49；Yarrowia]。
抗体
本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽。“抗体结合位点”是一个三维结合空间，其内表面形状和电荷分布与抗原表位的特征互补，从而使抗体与抗原结合。“抗体”例如包括，脊椎动物抗体、杂合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、经修饰的抗体、单价抗体、Fab蛋白以及单结构域抗体。
针对本发明蛋白的抗体可用于亲和层析、免疫试验以及区别/鉴定脑膜炎球菌蛋白。
针对本发明蛋白的多克隆和单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行：将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如Freund氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。每次注射50-200微克的剂量就足够了。2-6周后用盐水(较佳的是用Freund氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体，从本发明的目的来看，认为其与体内免疫等效。将免疫后的动物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育该血液1小时，然后4℃培育2-18小时，获得多克隆抗血清。离心(例如1000g 10分钟)回收血清。家兔每次取血可获得约20-50毫升。
用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256：495-96]或其改进方法制得单克隆抗体。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。然而，并非是对动物取血然后抽提血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分离成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后对所得B细胞或所有解离的脾细胞进行诱导，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。
如果需要，抗体(无论是多克隆还是单克隆抗体)可用常规技术来标记。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。“特异性结合配偶”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原以及对其有特异性的单克隆抗体。其它特异性结合配偶包括生物素和亲和素或链亲和素，IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。应理解，上述内容并非要将各种标记分成不同的类，因为同一标记可在几种不同的模型中起作用。例如，125I可作为放射活性标记，或作为密电子试剂。HRP可作为酶或单抗的抗原。另外，一种物质可以和各种标记组合以获得所需的效果。例如，在实施本发明中，单抗和亲和素也需要标记，因此，可以用生物素标记单抗，并用标记了125I的亲和素检测其存在，或用标记HRP的抗生物素单抗检测其存在。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以应认作等价物属于本发明的范围。
药物组合物
药物组合物可包含本发明的多肽、抗体或核酸。该药物组合物将包含治疗有效量的本发明的多肽、抗体或多核苷酸。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少，例如导致体温降低。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA构建物。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗体、多肽、基因或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可能是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。
本文可用的药学上可接受的盐例如有：无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
输药方法
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。
直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服和肺给药、栓剂和透皮或经皮肤施用(参见例如WO98/20734)、用针、基因枪或手持喷雾器(hypospray)。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
疫苗
本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方(有或没有其它特异性的免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59TM(WO 90/14837；第10章疫苗设计：亚基和佐剂方法，Powell和Newman编，Plenum Press，1995)，其含有5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文)，虽然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亚微米级颗粒；(b)SAF，其含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(见下文)，微量流化成亚微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鲨烯、0.2％吐温80以及取自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐剂，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；以及(6)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。Alum和MF59TM是较佳的。
如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
免疫原性组合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
通常，可将免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
用作疫苗的免疫原性组合物，包含免疫学有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
常规方法是从肠胃外途径通过注射给予免疫原性组合物，例如皮下、肌内或透皮给药(例如WO98/20734)。适合其它给药方式的其它配方包括口服和肺制剂、栓剂和透皮应用。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，可以采用DNA疫苗接种[例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9：271-283；Donnelly等人(1997)AnnuRev.Immunol 15：617-648；见下文]。
基因输送载体
用于输送构建物的基因治疗载体可以局部或全身性给予，其中所述构建物包括本发明治疗剂的编码序列，将其输送至哺乳动物以便在哺乳动物体内表达。这些构建物可利用体内或活体外方式中的病毒或非病毒载体方法。这些编码序列的表达可用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导。编码序列的体内表达可以是组成型的或受调控的。
本发明包括能表达所涉及的核酸序列的基因输送运载体。基因输送运载体宜为病毒载体，更佳的是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或甲病毒载体。病毒载体还可以是星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒的病毒载体。通常参见Jolly(1994)Cancer GeneTherapy 1：51-64；Kimura(1994)Human Gene Therapy 5：845-852；Connelly(1995)HumanGene Therapy 6：185-193；以及Kaplitt(1994)Nature Genetics 6：148-153。
逆转录病毒载体是本领域中熟知的并且我们认为任何逆转录病毒基因治疗载体都可用于本发明，它们包括B、C和D型逆转录病毒、异嗜性逆转录病毒(例如NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(见O′Neill(1985)J.Virol.53：160)广嗜性逆转录病毒如MCF和MCF-MLV(见Kelly(1983)J.Virol 45：291)、泡沫病毒和慢病毒。见《RNA肿瘤病毒》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。
逆转录病毒基因治疗载体的诸部分可从不同逆转录病毒衍生获得。例如，逆转录载体LTR可以从小鼠肉瘤病毒衍生获得，tRNA结合位点可以从Rous肉瘤病毒衍生获得，包装信号从小鼠白血病病毒获得，第二链的合成起点从禽类白血病病毒获得。
可将这些重组逆转录病毒载体导入合适的包装细胞系，用来产生转导感受态逆转录病毒载体颗粒(见美国专利5,591,624)。通过将嵌合性整合酶掺入逆转录病毒颗粒，构建逆转录病毒载体，以便将其定点整合到宿主细胞DNA中(见WO96/37626)。较佳的重组病毒载体是复制缺陷型重组病毒。
适合与上述逆转录病毒载体一起使用的包装细胞系是本领域熟知的，很容易制得(见WO95/30763和WO92/05266)，并能用来产生能生产重组载体颗粒的生产型细胞系(也称为载体细胞系或“VCL”)。包装细胞系宜从人亲代细胞(如HT1080细胞)或貂亲代细胞系制取，以便消除人血清的灭活作用。
用来构建逆转录病毒基因治疗载体的较佳的逆转录病毒，包括禽类白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂细胞灶诱导病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒和Rous肉瘤病毒。特别佳的鼠白血病病毒包括4070A和1504A(Hartley和Rowe(1976)J Virol 19：19-25)，Abelson(ATCC No.VR-999)，Friend(ATCC No.VR-245)，Graffi，Gross(ATCC Nol VR-590)，Kirsten，Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)以及莫洛尼鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)。这些逆转录病毒可以从保藏机构或保藏中心如Rockville，Maryland的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，或用常用的技术从已知来源分离获得。
可用于本发明的典型的已知逆转录病毒基因治疗载体包括在以下专利申请中描述的那些载体：GB2200651，EP0415731，EP0345242，EP0334301，WO89/02468；WO89/05349，WO89/09271，WO90/02806，WO90/07936，WO94/03622，WO93/25698，WO93/25234，WO93/11230，WO93/10218，WO91/02805，WO91/02825，WO95/07994，US 5,219,740，US 4,405,712，US 4,861,719，US 4,980,289，US 4,777,127，US 5,591,624.另见Vile(1993)Cancer Res 53：3860-3864；Vile(1993)Cancer Res 53：962-967；Ram(1993)Cancer Res 53(1993)83-88；Takamiya(1992)J Neurosci Res 33：493-503；Baba(1993)J Neurosurg 79：729-735；Mann(1983)Cell 33：153；Cane(1984)Proc Natl Acad Sci81：6349；以及Miller(1990)Human Gene Therapy 1。
人腺病毒基因治疗载体也是本领域中已知的，并可用于本发明。例如参见Berkner(1988)Biotechniques 6：616和Rosenfeld(1991)Science 252：431，以及WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282。用于本发明的典型的已知的腺病毒基因治疗载体包括在上述文献以及下述专利中描述的那些例子：WO94/12649，WO93/03769，WO93/19191，WO94/28938，WO95/11984，WO95/00655，WO95/27071，WO95/29993，WO95/34671，WO96/05320，WO94/08026，WO94/11506，WO93/06223，WO94/24299，WO95/14102，WO95/24297，WO95/02697，WO94/28152，WO94/24299，WO95/09241，WO95/25807，WO95/05835，WO94/18922和WO95/09654。另外，可以采用Curiel(1992)Hum.GeneTher.3：147-154中描述的给予和已杀死腺病毒相连的DNA的方法。本发明的基因输递载体还包括腺病毒相关病毒(AAV)载体。用于本发明的这种载体的主要且较佳的例子是Srivastava，WO93/09239中公开的AAV-2为基础的载体。最佳的AAV载体包含两个AAV反向末端重复序列，其中通过替换核苷酸对天然D-序列进行修饰，使至少5-18个天然的核苷酸(较佳的至少10-18个天然核苷酸，最佳的10个天然核苷酸)被保留下来，而D-序列其余的核苷酸缺失或用非天然核苷酸取代。AAV反向末端重复序列的天然D-序列是每个AAV反向末端重复序列中不参与HP形成的20个串联核苷酸的序列(即每一端有一个序列)。非天然的替换核苷酸可以是天然D-序列该位置中所见核苷酸以外的任何核苷酸。其它可采用的典型AAV载体是pWP-19、pWN-1，两者均公开在Nahreini(1993)Gene 124：257-262中。这样的AAV载体的另一个例子是psub201(见Samulski(1987)J.Virol.61：3096)。另一个典型的AAV载体是Double-D ITR载体。Double-D ITR载体的构建方案公开在美国专利5,478,745中。还有其它的载体是公开在Carter的美国专利4,797,368和Muzyczka的美国专利5,139,941、Chartejee的美国专利5,474,935和Kotin的WO94/288157中的载体。可用于本发明的另一个AAV载体例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增强子和白蛋白启动子，并且主要指导肝内表达。其结构和构建方案公开在Su(1996)Human Gene Therapy 7：463-470中。其它的AAV基因治疗载体在美国专利5,354,678，5,173,414，5,139,941，5,252,479中有所描述。
本发明的基因治疗载体还包括疱疹载体。主要且较佳的例子是含有编码胸苷激酶多肽的序列的单纯疱疹病毒载体，如公开在US5,288,641和EP0176170(Roizman)中的那些。其它典型的单纯疱疹病毒载体包括WO95/04139中公开的HFEM/ICP6-LacZ(Wistar Institute)、Geller(1988)Science 241：1667-1669以及WO90/09441和WO92/07945中公开的pHSVlac、Fink(1992)Human Gene Therapy 3：11-19中描述的HSVUs3∷pgC-lacZ、EP 0453242(Breakefield)中描述的HSV 7134、2 RH 105和GAL4以及保藏于ATCC、保藏号为ATCC VR-977和ATCC VR-260的那些病毒。
还考虑到甲病毒基因基因治疗载体也可用于本发明。较佳的甲病毒载体是新培斯病毒载体。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、以及在美国专利5,091,309，5,217,879以及WO92/10578中描述的那些。更具体地说，可以采用1995年3月15日提交的美国申请08/405,627、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US 5,091,309和US 5,217,879中描述的那些甲病毒载体。这些甲病毒可以从保藏机构或保藏中心如Rockville，Maryland的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，或用常用的技术从已知来源分离获得。较佳的是，采用细胞毒性降低的甲病毒载体(见USSN 08/679640)。
DNA载体系统，如真核分层的(layered)表达系统也可用于表达本发明的核酸。关于真核分层的表达系统详见WO95/07994。较佳的，本发明的真核分层表达系统宜从甲病毒载体衍生获得，更佳的从新培斯病毒载体衍生获得。
适用于本发明的其它病毒载体包括：从脊髓灰质炎病毒衍生的载体，例如ATCCVR-58以及在Evans，Nature 339(1989)385和Sabin(1973)J.Biol.Standardization 1：115中描述的那些；鼻病毒，例如ATCC VR-1110以及在Arnold(1990)J.Cell Biochem L401中描述的那些；痘病毒，如金黄色痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCCVR-2010，以及在Fisher-Hoch(1989)Proc Natl Acad Sci 86：317；Flexner(1989)Ann NYAcad Sci 569：86，Flexner(1990)Vaccine 8：17；US 4,603,112，US 4,769,330以及WO89/01973中描述的那些；SV40病毒，例如ATCC VR-305以及在Mulligan(1979)Nature 277：108和Madzak(1992)J Gen Virol 73：1533中描述的那些；流感病毒，例如ATCC VR-797以及用例如US 5,166,057和Enami(1990)Proc Natl Acad Sci 87：3802-3805；Enami和Palese(1991)J Virol 65：2711-2713；Luytjes(1989)Cell 59：110中所述的反基因技术制得的重组流感病毒(另见McMichael(1983)NEJ Med 309：13，Yap(1978)Nature 273：238以及Nature(1979)277：108)；EP-0386882和Buchschacher(1992)J.Virol.66：2731中描述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，例如ATCC VR-67和VR-1247，以及EP-0440219中描述的那些；奥拉病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如ATCCVR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCC VR-922；屈曲病毒，例如ATCCVR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCC VR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCC VR-1245；Tonate病毒，例如ATCC VR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCCVR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O′Nyong病毒，东部脑炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部脑炎病毒，例如ATCC VR-70，ATCC VR-1251，ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠状病毒，例如ATCC VR-740和在Hamre(1966)Proc Soc Exp Biol Med 121：190中描述的那些。
将本发明的组合物输送至细胞内并不局限于上述病毒载体。还可采用其它输送方法和介质，例如核酸表达载体、与已被杀死的腺病毒相连或不相连的单独的聚阳离子凝缩的DNA(例如参见1994年12月30日美国申请No.08/366,787和Curiel(1992)HumGene Ther 3：147-154)、配体连接的DNA(例如参见Wu(1989)J.Biol.Chem.264：16985-16987)、真核细胞输送载体细胞(例如参见1994年5月9日提交的美国申请No.08/240,030以及美国申请No.08/404,796)、光聚合水凝胶材料的沉淀、手提式基因转移颗粒枪(如美国专利5,149,655所述)、电离辐射(如US5,206,152和WO92/11033所述)、核电荷中和/或与细胞膜融合。其它方法在Philip(1994)Mol Cell Biol 14：2411-2418以及Woffendin(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：1581-1585中有所描述。
可以采用颗粒介导的基因转移，例如参见美国申请No.60/023,867。简言之，可将序列插入含有控制高水平表达的常规序列的常规载体中，然后和合成性基因转移分子一起培育，这些基因转移分子例如是聚合性DNA-结合阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)，其与细胞寻靶配体(如脱唾液酸血清类粘蛋白(如Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432所述)、胰岛素(如Hucked(1990)Biochem Pharmacol 40：253-263所述)、半乳糖(如Plank(1992)Bioconjugate Chem 3：533-539所述)、乳糖或运铁蛋白)相连。
裸DNA也可用于转化宿主细胞。典型的裸DNA导入方法在WO 90/11902和US5,580,859中有所描述。用可生物降解的乳胶珠可以改善摄取效果。在对珠粒的胞吞作用开始后，DNA包被的乳胶珠粒被有效地运输到细胞中。通过处理珠粒以提高其疏水性可进一步改进该方法，从而促进核内体的破坏和将DNA释放到细胞质中。
可作为基因输送运载体的脂质体在US 5,422,120，WO95/13796，WO94/23697，WO91/14445和EP-524,968中有所描述。如USSN 60/023,867中所描述的，在非病毒输送时，可将编码多肽的核酸序列插入含有控制高水平表达的常规序列的常规载体中，然后和合成性基因转移分子一起培育，这些基因转移分子例如是聚合性DNA-结合阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)，其与细胞寻靶配体(如脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或运铁蛋白)相连。其它输送系统包括采用脂质体来包裹DNA，该DNA所含基因在各种组织特异性或活性普遍存在的启动子控制下。适用的其它非病毒输送系统包括机械输送系统，如Woffendin等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24)：11581-11585中描述的方法。另外，这类编码序列和表达产物可以通过光聚合的水凝胶材料的沉淀来输送。可用来输送编码序列的其它基因输送常规方法例如包括，用手提式基因转移颗粒枪(如美国专利5,149,655所述)；用电离辐射来激活转移的基因(如US 5,206,152和WO92/11033所述)。
典型的脂质体和聚阳离子基因输送载体在下列文献中有所描述：US 5,422,120和4,762,915；WO 95/13796；WO94/23697；WO91/14445；EP-0524968；Stryer，Biochemistry，236-240页(1975)W.H.Freeman，San Francisco；Szoka(1980)BiochemBiophys Acta 600：1；Bayer(1979)Biochem Biophys Acta 550：464；Rivnay(1987)MethEnzymol 149：119；Wang(1987)Proc Natl Acad Sci 84：7851；Plant(1989)Anal Biochem176：420。
多核苷酸组合物可包含治疗有效量的基因治疗运载体，其定义如上所述。出于本发明的目的，有效的剂量是给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA构建物。
输送方法
一旦配制后，本发明的多核苷酸组合物可以以下三种方式给予：(1)直接给予对象；(2)活体外输送给对象衍生的细胞；或(3)体外表达重组蛋白。待处理的对象可以是哺乳动物或鸟类。另外，也可对人进行治疗。
直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。该组合物也可输送至病损部位。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂和透皮或经皮肤应用(例如见WO98/20734)、用针、基因枪或手持喷雾器(hypospray)。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
活体外输送以及将转化的细胞重新植入对象体内的方法是本领域所熟知的，在例如WO93/14778中有所描述。用于活体外应用的细胞例子包括例如干细胞、尤其是造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞或肿瘤细胞。
通常，对于活体外和体外应用，核酸的输送可通过以下步骤来实现，例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包裹在脂质体中以及将DNA直接显微注射到胞核中，所有这些均是本领域所熟知的。
多核苷酸和多肽药物组合物
除了上述的药学上可接受的载体和盐外，多核苷酸和多肽组合物中还可采用下列附加试剂。
A.多肽
一个例子是多肽，其包括但不局限于：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)；运铁蛋白；脱唾液酸糖蛋白；抗体；抗体片段；铁蛋白；白介素；干扰素；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子和促红细胞生成素。还可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用来自其它侵袭性生物的蛋白，例如疟原虫恶性疟疾的环孢子蛋白的17个氨基酸的肽(称为RII)。
B.激素，维生素等
其它可包括的种类例如是：激素、类固醇、雄激素、雌激素、甲状腺激素或维生素、叶酸。
C.聚亚烷基、多糖等
另外，聚(亚烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽组合在一起。在一个较佳的实施方案中，聚(亚烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入单糖、二糖或多糖。在此方面的一个较佳实施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脱乙酰壳多糖和聚交酯-聚乙醇酸内酯共聚物。
D.脂质和脂质体
所需的多核苷酸或多肽还可在输送给对象或对象衍生的细胞之前包裹在脂质中或包裹在脂质体中。
脂质包裹通常用能稳定结合或捕获并保留核酸的脂质体来实现。浓缩的多核苷酸与脂质制剂之比可以不同，但是通常在约1∶1(毫克DNA∶微摩尔脂质)之间，或脂质更多。关于脂质体作为输送核酸的载体的综述参见Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101：512-527。
用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷)、阴离子(带负电荷)和中性制剂。阳离子脂质体已经显示出能以有功能的形式介导质粒DNA的胞内输送(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081)；和纯化的转录因子的胞内输送(Debs(1990)J.Biol.Chem.265：10189-10192)。
阳离子脂质体很容易购得。例如，N[1-2，3-二油烯基氧)丙基]-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体可以以Lipofectin的商标从GIBCO BRL，Grand Island，NY购得。(另见Felgner，同上)。其它商品脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它阳离子脂质体可用本领域熟知的方法从易购得的材料制得。例如参见，Szoka(1978)PNAS USA 75：4194-4198；WO90/11092关于DOTAP(1，2-二(油酰基氧)-3-(三甲基铵溶)丙烷)脂质体合成的描述。
同样，阴离子和中性脂质体也是容易获得的，例如购自Avanti PolarLipids(Birmingham，AL)，或容易用易购得的材料制得。这种材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。这些材料还能以合适比例与DOTMA和DOTAP原料混合。用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。
脂质体可包含多层脂质体(MLV)，小的单层脂质体(SUV)、或大的单层脂质体(LUV)。各种脂质体-核酸复合物可用本领域已知的方法制得。例如参见Straubinger(1983)Meth.Immunol.101：5 12-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394：483；Wilson(1979)Cell17：77)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443：629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：145；Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)255：10431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215：166。
E.脂蛋白
另外，脂蛋白也可加入待输送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括：乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。还可采用这些蛋白的突变体、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修饰物，例如乙酰化的LDL。这些脂蛋白能使多核苷酸的输送指向表达脂蛋白受体的细胞。较佳的，如果待输送的多核苷酸中加入了脂蛋白，则组合物中不加入其它寻靶的配体。
天然存在的脂蛋白包含脂质和蛋白部分。蛋白部分称为脱辅基蛋白。目前，已经分离并鉴定出了脱辅基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有两个含有几种蛋白，用罗马数字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。
脂蛋白可包含多个脱辅基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，随着时间的推移，这些脂蛋白失去A，得到C和E脱辅基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脱辅基蛋白，LDL包含脱辅基蛋白B；HDL包含脱辅基蛋白A、C和E。
这些脱辅基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文献中有所描述：Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54：699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151：162；Chen(1986)J BiolChem 261：12918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 77：2465；and Utermann(1984)Hum Genet 65：232。
脂蛋白含有各种脂质，包括甘油三酯、胆固醇(游离的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂质的组成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。关于天然存在的脂蛋白的脂质含量更详细的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。选择脂质的组成，以使脱辅基蛋白的构型有利于受体结合活性。还可选择脂质的组成，以促进与多核苷酸结合分子中的疏水性相互作用和结合。
天然存在的脂蛋白可以用诸如超离心方法从血清中分离出来。这些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.Bio Chem.255：5454-5460以及Mahey(1979)J Clin.Invest64：743-750中有所描述。脂蛋白还可在体外产生，或通过在所需宿主细胞中表达脱辅基蛋白基因的重组方法产生。例如参见Atkinson(1986)Annu Rev Biophys Chem 15：403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30：443。脂蛋白也可购自商业供应商，如Biomedical Techniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。关于脂蛋白的进一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。
F.聚阳离子试剂
聚阳离子试剂可以与或不与脂蛋白一起包括在含所需待输送多核苷酸/多肽的组合物中。
聚阳离子试剂通常在生理性相关的pH下表现出净的正电荷，并能中和核酸的电荷，而有助于输送至所需位置。这些试剂具有体外、活体外和体内的用途。聚阳离子试剂可用来将核酸通过肌内或皮下等输送至活的对象。
下面是用作聚阳离子试剂的多肽例子：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸和鱼精蛋白。其它例子包括组蛋白、鱼精蛋白、人血清白蛋白、DNA结合蛋白、非组蛋白染色体蛋白、DNA病毒的外壳蛋白，如(X174，转录因子还含有结合DNA的结构域，因此可用作核酸凝聚剂。简言之，转录因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有结合DNA序列的基本结构域。
聚阳离子有机试剂包括：精胺、亚精胺和腐胺。
从上面的清单可以推出聚阳离子试剂的尺寸和物理性能，以构建其它多肽聚阳离子试剂或产生合成的聚阳离子试剂。
有用的合成聚阳离子试剂例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是与多核苷酸/多肽组合时形成聚阳离子复合物的单体。
免疫诊断试验
本发明的脑膜炎球菌抗原可用于免疫试验来检测抗体水平(或相反，可用抗脑膜炎球菌抗体来检测抗原水平)。根据明确的免疫试验，可以开发重组抗原，以代替侵入性诊断方法。可检测生物学样品(例如包括血液或血清样品)中的抗脑膜炎球菌蛋白的抗体。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。免疫试验的方案可采取例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数试验涉及采用有标记的抗体或多肽；该标记例如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。
将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。
核酸杂交
“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt′s试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。见Sambrook等人[同上]第2卷，第9章，9.47至9.57页。
“严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值低大约120至200℃。温度和盐浓度常可通过初步实验中凭经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook等人第9.50页。
在进行例如Southern印迹时，要考虑的参数是(1)待印迹的DNA的复杂性以及(2)探针与受检测序列之间的同源性。对于高度复杂的真核基因组中的单拷贝基因，待研究片段的总量可以在10的一个数量级范围内变化，质粒为0.1至1微克，或将噬菌体消化至10-9至10-8克。对于复杂性较低的多核苷酸，可以采用实际上更短的印迹、杂交以及接触时间，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探针。例如，从1微克酵母DNA开始，用仅仅1小时的接触时间，印迹2小时，然后和108cpm/μg的探针杂交4-8小时，就可以检测单拷贝酵母基因。对于单拷贝哺乳动物基因而言，一种保守的方法是从10微克DNA开始，印迹过夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用108cpm/μg以上的探针杂交过夜，导致接触时间约为24小时。
有几个因素可能会影响探针与感兴趣片段之间的DNA-DNA杂交物的解链温度(Tm)，因而影响杂交和洗涤的合适条件。在许多情况下，探针并非与待测片段100％同源。其它常常遇到的变量包括杂交序列的长度和G+C总含量，以及杂交缓冲液的离子强度和甲酰胺含量。所有这些因素的作用可近似表示成一个方程式：
    Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4[％(G+C)]-0.6(％甲酰胺)-600/n-1.5(％错配)
其中Ci是盐浓度(单价离子)，n是杂交物碱基对的长度(对Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方法稍作了修改)。
在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度，而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严谨性也随盐浓度的降低而升高。
通常，在50％甲酰胺存在下的方便的杂交温度是：对于靶片段同源性达95％至100％的探针而言，是42℃；对于同源性为90％至95％的探针，为37℃；对于同源性为85％和90％的探针，为32℃。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和调节温度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交和洗涤条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨性下洗涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂交和/或洗涤严谨性。
核酸探针试验
采用本发明的核酸探针的方法(如PCR、分支DNA探针试验或印迹技术)能确定cDNA或mRNA的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双链复合物，则称探针与本发明的序列“杂交”。
核酸探针将与本发明的脑膜炎球菌核苷酸序列(包括有义和反义链)杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列，但是天然的脑膜炎球菌序列是较佳的，因为它是实际存在于细胞中的序列。mRNA代表一种编码序列，因此探针应与该编码序列互补；单链cDNA与mRNA互补，因此cDNA探针应与非编码序列互补。
探针序列无需和脑膜炎球菌序列(或其互补体)相同，序列以及长度的一些差异能增加试验的灵敏度，如果核酸探针能和靶核苷酸形成能被检测的双链体的话。另外，核酸探针可包括其它核苷酸，以使形成的双链体稳定。其它脑膜炎球菌序列也是有帮助的，可作为检测形成的双链体的标记。例如，非互补的核苷酸序列可以和探针的5′端相连，探针序列的其余部分与脑膜炎球菌序列互补。或者，可将非互补的碱基或较长的序列散布到探针中，只要探针序列与脑膜炎球菌序列有足够的互补性以便与其杂交从而形成能被检测的双链体。
探针的确切长度和序列将取决于杂交条件，如温度、盐浓度等。例如，对于诊断应用，根据分析物序列的复杂程度，核酸探针通常含有至少10-20个核苷酸，较佳的15-25个，更佳的至少30个核苷酸，但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度，以便和模板形成足够稳定的杂交复合物。
探针可用合成方法产生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)103：3185]的方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：7461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。
可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用来增加体内半衰期，改变RNA亲和力，增加核酸酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 6：12-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14：376-387]；还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey(1997)TIBTECH 15：224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH11：384-386]。
另外，聚合酶链反应(PCR)是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155：335-350]；美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。这些序列通常侧接所需的脑膜炎球菌序列。
利用最初的靶核酸作为模板，热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚合酶产生临界量的靶核酸后，它们可用较传统的方法(如Southern印迹)来检测。当采用Southern印迹方法时，标记的探针将与脑膜炎球菌序列(如其互补序列)杂交。
另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人[同上]描述的传统印迹技术来检测。用凝胶电泳可纯化并分离利用聚合酶从mRNA产生的mRNA或cDNA。然后，将凝胶上的核酸印迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触，然后洗涤除去所有未杂交的探针。然后，检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。
优选片段的例子
对WO99/36544中所公开的蛋白质序列进行计算机分析，预测在全长蛋白质中的抗原性肽片段。在该分析中使用了3种算法：
●两亲性(AMPHI)，该程序用于预测T细胞表位[Gao等人(1989)J.Immunol.
143：3007；roberts等人(1996)AIDS Res Hum Retrovir 12：593；Quakyi等人
(1992)Scand J Immunol suppl.11：9]，并且可从DNASTAR，Inc(1228 South Park
Street，Madison，Wisconsin 53715，USA)的Protean软件包中获得。
●  抗原性指数(ANTIGENIC INDEX)，由Jameson & Wolf(1988)“抗原性指数：
    一种新的预测抗原决定簇的算法”，CABIOS，4：181：186所公开。
●  亲水性(HYDROPHILICITY)，由Hopp & Woods(1981)“根据氨基酸序列预
    测蛋白质的抗原决定簇”，PNAS USA，78：3824-3828。
表I预测了WO99/36544中所公开的蛋白质的优选片段。这3种算法常鉴别出相同的片段(例如，ORF38-1中从残基37-42的片段和从残基143-146的片段两者被鉴别出二次)。这类多重鉴别出的片段是特别优选的。这些算法还常常鉴别出重迭的片段(例如对于ORF40-1，两亲性算法鉴别出残基161-165，而亲水性算法鉴别出残基163-175)。本发明明明白白地包括这些重迭片段组合所形成的片段(例如，对于ORF40-1，从残基161-175的片段)。还鉴别出被一个氨基酸所隔开的片段(例如ORF40-1中，抗原性指数算法鉴别出423-426和428-438)。本发明还包括横跨了这种“相邻”片段的两个极值的片段(如ORF40-1的423-438)。
表I-在WO99/36544中所公开的蛋白质的1769种片段
关键词：本申请的片段#1是WO99/36544中公开的ORF38-1的氨基酸6-14。本申请的片段#2是WO99/36544中公开的ORF38-1的氨基酸57-59，依此类推。
片段编号   WO99/36544 ORF   算  法   氨  基  酸
 1.     38-1 两亲性 6-14
 2.     38-1 两亲性 57-59
 3.     38-1 两亲性 67-76
 4.     38-1 两亲性 92-100
 5.     38-1 两亲性 127-137
 6.     38-1 两亲性 149-166
 7.     38-1 两亲性 210-215
 8.     38-1 两亲性 231-236
 9.     38-1 两亲性 270-272
 10.     38-1 两亲性 303-320
 11.     38-1 抗原性指数 16-34
 12.     38-1 抗原性指数 37-42
 13.     38-1 抗原性指数 46-64
 14.     38-1 抗原性指数 72-91
 15.     38-1 抗原性指数 94-112
 16.     38-1 抗原性指数 114-117
 17.     38-1 抗原性指数 124-136
 18.     38-1 抗原性指数 143-146
 19.     38-1 抗原性指数 148-160
 20.     38-1 抗原性指数 167-195
 21.     38-1 抗原性指数 201-216
 22.     38-1 抗原性指数 218-240
 23.     38-1 抗原性指数 244-252
 24.     38-1 抗原性指数 257-278
 25.     38-1 抗原性指数 282-290
 26.     38-1 抗原性指数 308-314
 27.     38-1 亲水性 21-34
 28.     38-1 亲水性 37-42
 29.     38-1 亲水性 47-55
 30.     38-1 亲水性 57-61
 31.     38-1 亲水性 72-74
 32.     38-1 亲水性 76-78
 33.     38-1 亲水性 82-91
 34.     38-1 亲水性 94-101
 35.     38-1 亲水性 108-112
 36.     38-1 亲水性 126-136
 37.     38-1 亲水性 143-146
 38.     38-1 亲水性 148-160
 39.     38-1 亲水性 167-195
 40.     38-1 亲水性 221-223
 41.     38-1 亲水性 226-236
 42.     38-1 亲水性 244-250
 43.     38-1 亲水性 257-274
 44.     38-1 亲水性 282-286
 45.     38-1 亲水性 311-314
 46.     38a 两亲性 6-14
 47.     38a 两亲性 57-59
 48.     38a 两亲性 67-76
 49.     38a 两亲性 92-100
 50.     38a 两亲性 127-137
 51.     38a 两亲性 149-166
 52.     38a 两亲性 210-215
 53.     38a 两亲性 223-225
 54.     38a 两亲性 231-236
 55.     38a 两亲性 270-272
 56.     38a 两亲性 303-320
 57.     38a 抗原性指数 16-34
 58.     38a 抗原性指数 37-42
 59.     38a 抗原性指数 46-64
 60.     38a 抗原性指数 72-91
 61.     38a 抗原性指数 94-112
 62.     38a 抗原性指数 114-117
 63.     38a 抗原性指数 124-136
 64.     38a 抗原性指数 143-146
 65.     38a 抗原性指数 148-160
 66.     38a 抗原性指数 165-195
 67.     38a 抗原性指数 201-216
 68.     38a 抗原性指数 218-240
 69.     38a 抗原性指数 244-252
 70.     38a 抗原性指数 257-278
 71.     38a 抗原性指数 282-290
 72.     38a 抗原性指数 308-314
 73.     38a 亲水性 21-34
 74.     38a 亲水性 37-42
 75.     38a 亲水性 47-55
 76.     38a 亲水性 57-61
 77.     38a 亲水性 72-74
 78.     38a 亲水性 76-78
 79.     38a 亲水性 82-91
 80.     38a 亲水性 94-101
 81.     38a 亲水性 108-112
 82.     38a 亲水性 126-136
 83.     38a 亲水性 143-146
 84.     38a 亲水性 148-160
 85.     38a 亲水性 165-195
 86.     38a 亲水性 221-223
 87.     38a 亲水性 226-236
 88.     38a 亲水性 244-250
 89.     38a 亲水性 257-273
 90.     38a 亲水性 282-286
 91.     38a 亲水性 311-314
 92.     39-1 两亲性 6-13
 93.     39-1 两亲性 21-24
 94.     39-1 两亲性 37-40
 95.     39-1 两亲性 60-75
 96.     39-1 两亲性 118-122
 97.     39-1 两亲性 134-139
 98.     39-1 两亲性 165-183
 99.     39-1 两亲性 192-195
 100.     39-1 两亲性 233-241
 101.     39-1 两亲性 247-267
 102.     39-1 两亲性 273-275
 103.     39-1 两亲性 299-308
 104.     39-1 两亲性 310-319
 105.     39-1 两亲性 322-330
 106.     39-1 两亲性 338-347
 107.     39-1 两亲性 358-364
 108.     39-1 两亲性 366-368
 109.     39-1 两亲性 376-378
 110.     39-1 两亲性 385-392
 111.     39-1 两亲性 413-416
 112.     39-1 两亲性 421-424
 113.     39-1 两亲性 429-438
 114.     39-1 两亲性 445-454
 115.     39-1 两亲性 456-458
 116.     39-1 两亲性 498-500
 117.     39-1 两亲性 512-519
 118.     39-1 两亲性 576-587
 119.     39-1 两亲性 589-600
 120.     39-1 两亲性 650-652
 121.     39-1 两亲性 670-674
 122.     39-1 抗原性指数 26-32
 123.     39-1 抗原性指数 35-45
 124.     39-1 抗原性指数 54-69
 125.     39-1 抗原性指数 79-84
 126.     39-1 抗原性指数 88-96
 127.     39-1 抗原性指数 105-110
 128.     39-1 抗原性指数 117-124
 129.     39-1 抗原性指数 152-154
 130.     39-1 抗原性指数 190-192
 131.     39-1 抗原性指数 222-231
 132.     39-1 抗原性指数 246-265
 133.     39-1 抗原性指数 292-295
 134.     39-1 抗原性指数 318-335
 135.     39-1 抗原性指数 353-362
 136.     39-1 抗原性指数 370-372
 137.     39-1 抗原性指数 402-404
 138.     39-1 抗原性指数 406-408
 139.     39-1 抗原性指数 419-421
 140.     39-1 抗原性指数 446-449
 141.     39-1 抗原性指数 453-460
 142.     39-1 抗原性指数 465-469
 143.     39-1 抗原性指数 476-487
 144.     39-1 抗原性指数 491-499
 145.     39-1 抗原性指数 505-514
 146.     39-1 抗原性指数 522-536
 147.     39-1 抗原性指数 557-567
 148.     39-1 抗原性指数 569-575
 149.     39-1 抗原性指数 577-580
 150.     39-1 抗原性指数 593-599
 151.     39-1 抗原性指数 603-619
 152.     39-1 抗原性指数 626-628
 153.     39-1 抗原性指数 634-637
 154.     39-1 抗原性指数 639-647
 155.     39-1 抗原性指数 655-658
 156.     39-1 抗原性指数 672-674
 157.     39-1 抗原性指数 677-686
 158.     39-1 抗原性指数 688-691
 159.     39-1 抗原性指数 693-699
 160.     39-1 抗原性指数 707-710
 161.     39-1 亲水性 28-32
 162.     39-1 亲水性 38-44
 163.     39-1 亲水性 54-69
 164.     39-1 亲水性 80-83
 165.     39-1 亲水性 89-96
 166.     39-1 亲水性 117-119
 167.     39-1 亲水性 121-123
 168.     39-1 亲水性 152-154
 169.     39-1 亲水性 224-231
 170.     39-1 亲水性 247-265
 171.     39-1 亲水性 318-332
 172.     39-1 亲水性 357-361
 173.     39-1 亲水性 402-404
 174.     39-1 亲水性 406-408
 175.     39-1 亲水性 446-449
 176.     39-1 亲水性 454-459
 177.     39-1 亲水性 465-469
 178.     39-1 亲水性 476-487
 179.     39-1 亲水性 491-499
 180.     39-1 亲水性 506-514
 181.     39-1 亲水性 525-535
 182.     39-1 亲水性 560-567
 183.     39-1 亲水性 573-575
 184.     39-1 亲水性 577-580
 185.     39-1 亲水性 594-596
 186.     39-1 亲水性 605-607
 187.     39-1 亲水性 611-619
 188.     39-1 亲水性 634-637
 189.     39-1 亲水性 639-647
 190.     39-1 亲水性 672-674
 191.     39-1 亲水性 677-686
 192.     39-1 亲水性 688-690
 193.     39-1 亲水性 693-695
 194.     39a 两亲性 6-13
 195.     39a 两亲性 21-24
 196.     39a 两亲性 37-40
 197.     39a 两亲性 60-75
 198.     39a 两亲性 118-122
 199.     39a 两亲性 134-139
 200.     39a 两亲性 165-183
 201.     39a 两亲性 192-195
 202.     39a 两亲性 233-241
 203.     39a 两亲性 247-267
 204.     39a 两亲性 273-275
 205.     39a 两亲性 299-308
 206.     39a 两亲性 310-319
 207.     39a 两亲性 322-330
 208.     39a 两亲性 338-347
 209.     39a 两亲性 358-364
 210.     39a 两亲性 366-368
 211.     39a 两亲性 376-378
 212.     39a 两亲性 385-392
 213.     39a 两亲性 413-416
 214.     39a 两亲性 421-424
 215.     39a 两亲性 429-438
 216.     39a 两亲性 445-454
 217.     39a 两亲性 456-458
 218.     39a 两亲性 498-500
 219.     39a 两亲性 512-520
 220.     39a 两亲性 576-587
 221.     39a 两亲性 589-600
 222.     39a 两亲性 650-652
 223.     39a 两亲性 670-674
 224.     39a 抗原性指数 26-32
 225.     39a 抗原性指数 35-45
 226.     39a 抗原性指数 54-69
 227.     39a 抗原性指数 79-84
 228.     39a 抗原性指数 89-96
 229.     39a 抗原性指数 103-110
 230.     39a 抗原性指数 117-124
 231.     39a 抗原性指数 152-154
 232.     39a 抗原性指数 190-192
 233.     39a 抗原性指数 222-231
 234.     39a 抗原性指数 246-265
 235.     39a 抗原性指数 292-295
 236.     39a 抗原性指数 318-335
 237.     39a 抗原性指数 353-362
 238.     39a 抗原性指数 370-372
 239.     39a 抗原性指数 402-404
 240.     39a 抗原性指数 406-408
 241.     39a 抗原性指数 419-421
 242.     39a 抗原性指数 446-449
 243.     39a 抗原性指数 453-460
 244.     39a 抗原性指数 465-469
 245.     39a 抗原性指数 476-487
 246.     39a 抗原性指数 491-499
 247.     39a 抗原性指数 505-514
 248.     39a 抗原性指数 529-535
 249.     39a 抗原性指数 557-567
 250.     39a 抗原性指数 569-575
 251.     39a 抗原性指数 577-580
 252.     39a 抗原性指数 593-599
 253.     39a 抗原性指数 603-619
 254.     39a 抗原性指数 626-628
 255.     39a 抗原性指数 634-637
 256.     39a 抗原性指数 639-647
 257.     39a 抗原性指数 655-658
 258.     39a 抗原性指数 672-674
 259.     39a 抗原性指数 677-686
 260.     39a 抗原性指数 688-691
 261.     39a 抗原性指数 693-699
 262.     39a 抗原性指数 707-710
 263.     39a 亲水性 28-32
 264.     39a 亲水性 38-44
 265.     39a 亲水性 54-69
 266.     39a 亲水性 80-83
 267.     39a 亲水性 89-95
 268.     39a 亲水性 105-108
 269.     39a 亲水性 117-119
 270.     39a 亲水性 121-123
 271.     39a 亲水性 152-154
 272.     39a 亲水性 224-231
 273.     39a 亲水性 247-265
 274.     39a 亲水性 318-332
 275.     39a 亲水性 357-361
 276.     39a 亲水性 402-404
 277.     39a 亲水性 406-408
 278.     39a 亲水性 446-449
 279.     39a 亲水性 454-459
 280.     39a 亲水性 465-469
 281.     39a 亲水性 476-487
 282.     39a 亲水性 491-499
 283.     39a 亲水性 506-514
 284.     39a 亲水性 529-535
 285.     39a 亲水性 560-567
 286.     39a 亲水性 573-575
 287.     39a 亲水性 577-580
 288.     39a 亲水性 594-596
 289.     39a 亲水性 605-607
 290.     39a 亲水性 611-619
 291.     39a 亲水性 634-637
 292.     39a 亲水性 639-647
 293.     39a 亲水性 672-674
 294.     39a 亲水性 677-686
 295.     39a 亲水性 688-690
 296.     39a 亲水性 693-695
 297.     40-1 两亲性 6-14
 298.     40-1 两亲性 16-19
 299.     40-1 两亲性 22-27
 300.     40-1 两亲性 30-33
 301.     40-1 两亲性 41-44
 302.     40-1 两亲性 62-68
 303.     40-1 两亲性 129-139
 304.     40-1 两亲性 161-165
 305.     40-1 两亲性 181-191
 306.     40-1 两亲性 199-202
 307.     40-1 两亲性 215-220
 308.     40-1 两亲性 237-249
 309.     40-1 两亲性 298-302
 310.     40-1 两亲性 313-318
 311.     40-1 两亲性 335-342
 312.     40-1 两亲性 376-383
 313.     40-1 两亲性 399-402
 314.     40-1 两亲性 426-428
 315.     40-1 两亲性 430-433
 316.     40-1 两亲性 435-437
 317.     40-1 两亲性 479-482
 318.     40-1 两亲性 491-511
 319.     40-1 两亲性 523-525
 320.     40-1 两亲性 560-563
 321.     40-1 抗原性指数 21-32
 322.     40-1 抗原性指数 49-61
 323.     40-1 抗原性指数 64-66
 324.     40-1 抗原性指数 74-92
 325.     40-1 抗原性指数 98-123
 326.     40-1 抗原性指数 129-135
 327.     40-1 抗原性指数 138-176
 328.     40-1 抗原性指数 193-195
 329.     40-1 抗原性指数 199-219
 330.     40-1 抗原性指数 226-240
 331.     40-1 抗原性指数 242-245
 332.     40-1 抗原性指数 251-257
 333.     40-1 抗原性指数 261-276
 334.     40-1 抗原性指数 279-306
 335.     40-1 抗原性指数 308-346
 336.     40-1 抗原性指数 352-367
 337.     40-1 抗原性指数 375-378
 338.     40-1 抗原性指数 384-406
 339.     40-1 抗原性指数 408-420
 340.     40-1 抗原性指数 423-426
 341.     40-1 抗原性指数 428-438
 342.     40-1 抗原性指数 453-459
 343.     40-1 抗原性指数 462-481
 344.     40-1 抗原性指数 485-494
 345.     40-1 抗原性指数 506-518
 346.     40-1 抗原性指数 535-539
 347.     40-1 抗原性指数 544-552
 348.     40-1 抗原性指数 559-566
 349.     40-1 抗原性指数 571-582
 350.     40-1 亲水性 21-32
 351.     40-1 亲水性 51-61
 352.     40-1 亲水性 64-66
 353.     40-1 亲水性 75-92
 354.     40-1 亲水性 100-122
 355.     40-1 亲水性 129-135
 356.     40-1 亲水性 140-145
 357.     40-1 亲水性 149-152
 358.     40-1 亲水性 157-161
 359.     40-1 亲水性 163-175
 360.     40-1 亲水性 199-201
 361.     40-1 亲水性 203-219
 362.     40-1 亲水性 227-240
 363.     40-1 亲水性 251-257
 364.     40-1 亲水性 261-276
 365.     40-1 亲水性 279-306
 366.     40-1 亲水性 308-318
 367.     40-1 亲水性 320-328
 368.     40-1 亲水性 334-341
 369.     40-1 亲水性 354-356
 370.     40-1 亲水性 359-366
 371.     40-1 亲水性 392-398
 372.     40-1 亲水性 400-405
 373.     40-1 亲水性 410-420
 374.     40-1 亲水性 429-438
 375.     40-1 亲水性 463-467
 376.     40-1 亲水性 471-480
 377.     40-1 亲水性 487-493
 378.     40-1 亲水性 506-518
 379.     40-1 亲水性 547-552
 380.     40-1 亲水性 575-579
 381.     40a 两亲性 6-10
 382.     40a 两亲性 19-27
 383.     40a 两亲性 30-33
 384.     40a 两亲性 41-44
 385.     40a 两亲性 61-72
 386.     40a 两亲性 78-81
 387.     40a 两亲性 92-94
 388.     40a 两亲性 128-130
 389.     40a 两亲性 132-134
 390.     40a 两亲性 161-165
 391.     40a 两亲性 181-193
 392.     40a 两亲性 197-199
 393.     40a 两亲性 204-211
 394.     40a 两亲性 213-218
 395.     40a 两亲性 227-229
 396.     40a 两亲性 237-249
 397.     40a 两亲性 298-302
 398.     40a 两亲性 313-318
 399.     40a 两亲性 335-342
 400.     40a 两亲性 376-383
 401.     40a 两亲性 399-402
 402.     40a 两亲性 426-428
 403.     40a 两亲性 435-437
 404.     40a 两亲性 475-483
 405.     40a 两亲性 492-512
 406.     40a 两亲性 524-526
 407.     40a 两亲性 561-564
 408.     40a 抗原性指数 21-34
 409.     40a 抗原性指数 50-64
 410.     40a 抗原性指数 75-83
 411.     40a 抗原性指数 88-97
 412.     40a 抗原性指数 105-122
 413.     40a 抗原性指数 129-134
 414.     40a 抗原性指数 140-176
 415.     40a 抗原性指数 190-207
 416.     40a 抗原性指数 211-217
 417.     40a 抗原性指数 224-240
 418.     40a 抗原性指数 242-245
 419.     40a 抗原性指数 250-255
 420.     40a 抗原性指数 260-276
 421.     40a 抗原性指数 279-306
 422.     40a 抗原性指数 308-346
 423.     40a 抗原性指数 352-367
 424.     40a 抗原性指数 375-378
 425.     40a 抗原性指数 384-406
 426.     40a 抗原性指数 408-420
 427.     40a 抗原性指数 423-438
 428.     40a 抗原性指数 453-468
 429.     40a 抗原性指数 471-481
 430.     40a 抗原性指数 487-493
 431.     40a 抗原性指数 507-519
 432.     40a 抗原性指数 536-540
 433.     40a 抗原性指数 545-553
 434.     40a 抗原性指数 560-567
 435.     40a 抗原性指数 572-583
 436.     40a 亲水性 21-34
 437.     40a 亲水性 50-64
 438.     40a 亲水性 75-83
 439.     40a 亲水性 88-96
 440.     40a 亲水性 105-121
 441.     40a 亲水性 129-134
 442.     40a 亲水性 140-145
 443.     40a 亲水性 148-155
 444.     40a 亲水性 157-161
 445.     40a 亲水性 163-175
 446.     40a 亲水性 196-202
 447.     40a 亲水性 211-217
 448.     40a 亲水性 225-230
 449.     40a 亲水性 232-240
 450.     40a 亲水性 253-255
 451.     40a 亲水性 261-276
 452.     40a 亲水性 279-306
 453.     40a 亲水性 308-318
 454.     40a 亲水性 320-328
 455.     40a 亲水性 334-341
 456.     40a 亲水性 354-356
 457.     40a 亲水性 359-366
 458.     40a 亲水性 392-398
 459.     40a 亲水性 400-405
 460.     40a 亲水性 410-420
 461.     40a 亲水性 428-438
 462.     40a 亲水性 462-468
 463.     40a 亲水性 472-481
 464.     40a 亲水性 489-493
 465.     40a 亲水性 507-519
 466.     40a 亲水性 548-553
 467.     40a 亲水性 576-580
 468.     41-1 两亲性 30-36
 469.     41-1 两亲性 93-98
 470.     41-1 两亲性 111-122
 471.     41-1 两亲性 126-129
 472.     41-1 两亲性 136-143
 473.     41-1 两亲性 145-150
 474.     41-1 两亲性 156-158
 475.     41-1 两亲性 186-195
 476.     41-1 两亲性 201-208
 477.     41-1 两亲性 213-223
 478.     41-1 两亲性 236-247
 479.     41-1 两亲性 250-255
 480.     41-1 两亲性 273-282
 481.     41-1 两亲性 303-309
 482.     41-1 两亲性 311-314
 483.     41-1 两亲性 329-338
 484.     41-1 两亲性 344-362
 485.     41-1 两亲性 372-377
 486.     41-1 两亲性 385-392
 487.     41-1 两亲性 409-412
 488.     41-1 两亲性 419-426
 489.     41-1 两亲性 458-463
 490.     41-1 两亲性 470-474
 491.     41-1 两亲性 486-489
 492.     41-1 两亲性 512-518
 493.     41-1 两亲性 527-551
 494.     41-1 两亲性 564-579
 495.     41-1 两亲性 593-597
 496.     41-1 抗原性指数 13-22
 497.     41-1 抗原性指数 30-38
 498.     41-1 抗原性指数 43-55
 499.     41-1 抗原性指数 73-75
 500.     41-1 抗原性指数 87-89
 501.     41-1 抗原性指数 105-112
 502.     41-1 抗原性指数 114-124
 503.     41-1 抗原性指数 136-141
 504.     41-1 抗原性指数 147-153
 505.     41-1 抗原性指数 163-166
 506.     41-1 抗原性指数 174-184
 507.     41-1 抗原性指数 195-207
 508.     41-1 抗原性指数 226-236
 509.     41-1 抗原性指数 244-246
 510.     41-1 抗原性指数 249-265
 511.     41-1 抗原性指数 281-287
 512.     41-1 抗原性指数 294-313
 513.     41-1 抗原性指数 317-342
 514.     41-1 抗原性指数 350-375
 515.     41-1 抗原性指数 379-386
 516.     41-1 抗原性指数 390-396
 517.     41-1 抗原性指数 413-422
 518.     41-1 抗原性指数 425-430
 519.     41-1 抗原性指数 436-440
 520.     41-1 抗原性指数 446-465
 521.     41-1 抗原性指数 468-495
 522.     41-1 抗原性指数 498-518
 523.     41-1 抗原性指数 520-522
 524.     41-1 抗原性指数 525-542
 525.     41-1 抗原性指数 547-558
 526.     41-1 抗原性指数 565-590
 527.     41-1 抗原性指数 595-602
 528.     41-1 抗原性指数 608-619
 529.     41-1 亲水性 14-21
 530.     41-1 亲水性 30-33
 531.     41-1 亲水性 45-55
 532.     41-1 亲水性 87-89
 533.     41-1 亲水性 106-111
 534.     41-1 亲水性 114-120
 535.     41-1 亲水性 122-124
 536.     41-1 亲水性 136-141
 537.     41-1 亲水性 148-150
 538.     41-1 亲水性 177-184
 539.     41-1 亲水性 195-207
 540.     41-1 亲水性 226-234
 541.     41-1 亲水性 249-265
 542.     41-1 亲水性 285-287
 543.     41-1 亲水性 294-297
 544.     41-1 亲水性 299-313
 545.     41-1 亲水性 317-321
 546.     41-1 亲水性 323-342
 547.     41-1 亲水性 350-371
 548.     41-1 亲水性 379-386
 549.     41-1 亲水性 417-422
 550.     41-1 亲水性 425-427
 551.     41-1 亲水性 447-449
 552.     41-1 亲水性 459-462
 553.     41-1 亲水性 468-475
 554.     41-1 亲水性 479-482
 555.     41-1 亲水性 484-491
 556.     41-1 亲水性 499-518
 557.     41-1 亲水性 520-522
 558.     41-1 亲水性 526-542
 559.     41-1 亲水性 550-558
 560.     41-1 亲水性 568-590
 561.     41-1 亲水性 595-598
 562.     41-1 亲水性 617-619
 563.     41a 两亲性 6-12
 564.     41a 两亲性 32-34
 565.     41a 两亲性 69-74
 566.     41a 两亲性 86-98
 567.     41a 两亲性 111-119
 568.     41a 两亲性 121-126
 569.     41a 两亲性 132-134
 570.     41a 两亲性 155-160
 571.     41a 两亲性 162-171
 572.     41a 两亲性 177-184
 573.     41a 两亲性 189-199
 574.     41a 两亲性 212-223
 575.     41a 两亲性 226-231
 576.     41a 两亲性 249-258
 577.     41a 两亲性 287-290
 578.     41a 两亲性 305-314
 579.     41a 两亲性 320-338
 580.     41a 两亲性 348-353
 581.     41a 两亲性 361-368
 582.     41a 两亲性 385-388
 583.     41a 两亲性 395-402
 584.     41a 两亲性 434-439
 585.     41a 两亲性 446-450
 586.     41a 两亲性 462-467
 587.     41a 两亲性 470-475
 588.     41a 两亲性 488-494
 589.     41a 两亲性 503-525
 590.     41a 两亲性 540-555
 591.     41a 两亲性 569-573
 592.     41a 两亲性 578-594
 593.     41a 抗原性指数 10-13
 594.     41a 抗原性指数 19-31
 595.     41a 抗原性指数 48-50
 596.     41a 抗原性指数 63-65
 597.     41a 抗原性指数 82-101
 598.     41a 抗原性指数 112-117
 599.     41a 抗原性指数 123-129
 600.     41a 抗原性指数 139-142
 601.     41a 抗原性指数 150-160
 602.     41a 抗原性指数 171-183
 603.     41a 抗原性指数 202-212
 604.     41a 抗原性指数 220-222
 605.     41a 抗原性指数 225-241
 606.     41a 抗原性指数 257-263
 607.     41a 抗原性指数 270-289
 608.     41a 抗原性指数 293-318
 609.     41a 抗原性指数 326-351
 610.     41a 抗原性指数 355-362
 611.     41a 抗原性指数 366-372
 612.     41a 抗原性指数 389-398
 613.     41a 抗原性指数 401-406
 614.     41a 抗原性指数 412-416
 615.     41a 抗原性指数 422-441
 616.     41a 抗原性指数 444-446
 617.     41a 抗原性指数 451-471
 618.     41a 抗原性指数 475-494
 619.     41a 抗原性指数 496-498
 620.     41a 抗原性指数 501-518
 621.     41a 抗原性指数 523-534
 622.     41a 抗原性指数 540-566
 623.     41a 抗原性指数 571-578
 624.     41a 抗原性指数 582-595
 625.     41a 亲水性 21-31
 626.     41a 亲水性 63-65
 627.     41a 亲水性 83-96
 628.     41a 亲水性 98-100
 629.     41a 亲水性 112-117
 630.     41a 亲水性 124-126
 631.     41a 亲水性 153-160
 632.     41a 亲水性 171-183
 633.     41a 亲水性 202-210
 634.     41a 亲水性 220-222
 635.     41a 亲水性 225-241
 636.     41a 亲水性 261-263
 637.     41a 亲水性 270-273
 638.     41a 亲水性 275-289
 639.     41a 亲水性 293-297
 640.     41a 亲水性 299-318
 641.     41a 亲水性 326-347
 642.     41a 亲水性 355-362
 643.     41a 亲水性 393-398
 644.     41a 亲水性 401-403
 645.     41a 亲水性 423-425
 646.     41a 亲水性 435-438
 647.     41a 亲水性 454-458
 648.     41a 亲水性 460-471
 649.     41a 亲水性 475-494
 650.     41a 亲水性 496-498
 651.     41a 亲水性 502-518
 652.     41a 亲水性 527-534
 653.     41a 亲水性 544-566
 654.     41a 亲水性 571-574
 655.     41a 亲水性 593-595
 656.     44-1 两亲性 57-60
 657.     44-1 两亲性 76-79
 658.     44-1 抗原性指数 22-34
 659.     44-1 抗原性指数 38-46
 660.     44-1 抗原性指数 50-55
 661.     44-1 抗原性指数 64-70
 662.     44-1 抗原性指数 72-80
 663.     44-1 抗原性指数 83-89
 664.     44-1 抗原性指数 96-106
 665.     44-1 抗原性指数 110-124
 666.     44-1 亲水性 22-34
 667.     44-1 亲水性 40-46
 668.     44-1 亲水性 64-69
 669.     44-1 亲水性 73-80
 670.     44-1 亲水性 84-89
 671.     44-1 亲水性 97-106
 672.     44-1 亲水性 120-124
 673.     44a 两亲性 57-60
 674.     44a 两亲性 76-79
 675.     44a 抗原性指数 23-34
 676.     44a 抗原性指数 38-46
 677.     44a 抗原性指数 50-55
 678.     44a 抗原性指数 64-70
 679.     44a 抗原性指数 72-80
 680.     44a 抗原性指数 83-89
 681.     44a 抗原性指数 96-106
 682.     44a 抗原性指数 110-124
 683.     44a 亲水性 28-34
 684.     44a 亲水性 40-46
 685.     44a 亲水性 64-69
 686.     44a 亲水性 73-80
 687.     44a 亲水性 84-89
 688.     44a 亲水性 97-106
 689.     44a 亲水性 120-124
 690.     49-1 两亲性 16-21
 691.     49-1 两亲性 44-48
 692.     49-1 两亲性 56-61
 693.     49-1 两亲性 92-97
 694.     49-1 两亲性 118-127
 695.     49-1 两亲性 130-149
 696.     49-1 两亲性 156-178
 697.     49-1 两亲性 235-240
 698.     49-1 两亲性 253-264
 699.     49-1 两亲性 268-271
 700.     49-1 两亲性 278-285
 701.     49-1 两亲性 287-292
 702.     49-1 两亲性 298-300
 703.     49-1 两亲性 328-337
 704.     49-1 两亲性 343-350
 705.     49-1 两亲性 355-365
 706.     49-1 两亲性 378-389
 707.     49-1 两亲性 422-424
 708.     49-1 两亲性 442-450
 709.     49-1 两亲性 464-481
 710.     49-1 两亲性 486-496
 711.     49-1 两亲性 514-521
 712.     49-1 两亲性 548-551
 713.     49-1 两亲性 553-557
  714.     49-1 两亲性 562-568
  715.     49-1 两亲性 573-575
  716.     49-1 两亲性 588-590
  717.     49-1 两亲性 603-605
  718.     49-1 两亲性 614-618
  719.     49-1 抗原性指数 15-21
  720.     49-1 抗原性指数 26-43
  721.     49-1 抗原性指数 50-59
  722.     49-1 抗原性指数 61-75
  723.     49-1 抗原性指数 79-87
  724.     49-1 抗原性指数 98-108
  725.     49-1 抗原性指数 110-120
  726.     49-1 抗原性指数 122-139
  727.     49-1 抗原性指数 147-164
  728.     49-1 抗原性指数 171-179
  729.     49-1 抗原性指数 185-197
  730.     49-1 抗原性指数 214-216
  731.     49-1 抗原性指数 229-231
  732.     49-1 抗原性指数 248-266
  733.     49-1 抗原性指数 278-283
  734.     49-1 抗原性指数 289-295
  735.     49-1 抗原性指数 316-326
  736.     49-1 抗原性指数 337-349
  737.     49-1 抗原性指数 368-378
  738.     49-1 抗原性指数 386-388
  739.     49-1 抗原性指数 390-410
  740.     49-1 抗原性指数 412-414
  741.     49-1 抗原性指数 423-429
  742.     49-1 抗原性指数 438-454
  743.     49-1 抗原性指数 462-475
  744.     49-1 抗原性指数 482-500
  745.     49-1 抗原性指数 503-509
  746.     49-1 抗原性指数 521-528
  747.     49-1 抗原性指数 540-562
  748.     49-1 抗原性指数 572-579
  749.     49-1 抗原性指数 590-606
  750.     49-1 抗原性指数 610-612
  751.     49-1 抗原性指数 617-619
  752.     49-1 抗原性指数 626-634
  753.     49-1 抗原性指数 637-640
  754.     49-1 亲水性 18-21
  755.     49-1 亲水性 26-29
  756.     49-1 亲水性 31-43
  757.     49-1 亲水性 51-57
  758.     49-1 亲水性 64-68
  759.     49-1 亲水性 79-87
  760.     49-1 亲水性 98-107
  761.     49-1 亲水性 122-125
  762.     49-1 亲水性 147-164
  763.     49-1 亲水性 172-175
  764.     49-1 亲水性 187-197
  765.     49-1 亲水性 229-231
  766.     49-1 亲水性 256-262
  767.     49-1 亲水性 264-266
  768.     49-1 亲水性 278-283
  769.     49-1 亲水性 290-292
  770.     49-1 亲水性 319-326
  771.     49-1 亲水性 337-349
  772.     49-1 亲水性 368-376
  773.     49-1 亲水性 386-388
  774.     49-1 亲水性 390-410
  775.     49-1 亲水性 412-414
  776.     49-1 亲水性 423-429
  777.     49-1 亲水性 441-451
  778.     49-1 亲水性 466-472
  779.     49-1 亲水性 484-490
  780.     49-1 亲水性 492-494
  781.     49-1 亲水性 496-498
  782.     49-1 亲水性 522-528
  783.     49-1 亲水性 543-562
  784.     49-1 亲水性 591-606
  785.     49-1 亲水性 617-619
  786.     49-1 亲水性 626-632
  787.     49-1 亲水性 637-640
  788.     49a 两亲性 55-61
  789.     49a 两亲性 92-97
  790.     49a 两亲性 118-127
  791.     49a 两亲性 129-135
  792.     49a 两亲性 137-145
  793.     49a 两亲性 156-178
  794.     49a 两亲性 198-200
  795.     49a 两亲性 235-240
  796.     49a 两亲性 252-264
  797.     49a 两亲性 277-285
  798.     49a 两亲性 287-292
  799.     49a 两亲性 298-300
  800.     49a 两亲性 321-326
  801.     49a 两亲性 328-337
  802.     49a 两亲性 343-350
  803.     49a 两亲性 355-365
 804.     49a 两亲性 378-389
 805.     49a 两亲性 392-397
 806.     49a 两亲性 415-424
 807.     49a 两亲性 453-456
 808.     49a 两亲性 471-480
 809.     49a 两亲性 486-504
 810.     49a 两亲性 514-519
 811.     49a 两亲性 527-534
 812.     49a 两亲性 551-554
 813.     49a 两亲性 561-568
 814.     49a 两亲性 600-605
 815.     49a 两亲性 612-616
 816.     49a 两亲性 628-633
 817.     49a 两亲性 636-641
 818.     49a 两亲性 654-660
 819.     49a 两亲性 669-691
 820.     49a 两亲性 706-721
 821.     49a 两亲性 735-739
 822.     49a 两亲性 744-760
 823.     49a 抗原性指数 4-23
 824.     49a 抗原性指数 27-43
 825.     49a 抗原性指数 51-62
 826.     49a 抗原性指数 64-68
 827.     49a 抗原性指数 72-75
 828.     49a 抗原性指数 79-87
 829.     49a 抗原性指数 98-108
 830.     49a 抗原性指数 110-120
 831.     49a 抗原性指数 124-139
 832.     49a 抗原性指数 147-164
 833.     49a 抗原性指数 176-179
 834.     49a 抗原性指数 185-197
 835.     49a 抗原性指数 214-216
 836.     49a 抗原性指数 229-231
 837.     49a 抗原性指数 248-267
 838.     49a 抗原性指数 278-283
 839.     49a 抗原性指数 289-295
 840.     49a 抗原性指数 305-308
 841.     49a 抗原性指数 316-326
 842.     49a 抗原性指数 337-349
 843.     49a 抗原性指数 368-378
 844.     49a 抗原性指数 386-388
 845.     49a 抗原性指数 391-407
 846.     49a 抗原性指数 423-429
 847.     49a 抗原性指数 436-455
 848.     49a 抗原性指数 459-484
  849.     49a 抗原性指数 492-517
  850.     49a 抗原性指数 521-528
  851.     49a 抗原性指数 532-539
  852.     49a 抗原性指数 555-564
  853.     49a 抗原性指数 567-572
  854.     49a 抗原性指数 578-582
  855.     49a 抗原性指数 588-607
  856.     49a 抗原性指数 610-612
  857.     49a 抗原性指数 617-637
  858.     49a 抗原性指数 641-660
  859.     49a 抗原性指数 662-664
  860.     49a 抗原性指数 667-684
  861.     49a 抗原性指数 689-700
  862.     49a 抗原性指数 706-732
  863.     49a 抗原性指数 737-744
  864.     49a 抗原性指数 748-761
  865.     49a 亲水性 4-23
  866.     49a 亲水性 31-43
  867.     49a 亲水性 51-53
  868.     49a 亲水性 55-57
  869.     49a 亲水性 64-68
  870.     49a 亲水性 79-87
  871.     49a 亲水性 98-106
  872.     49a 亲水性 114-120
  873.     49a 亲水性 130-139
  874.     49a 亲水性 147-164
  875.     49a 亲水性 187-197
  876.     49a 亲水性 229-231
  877.     49a 亲水性 249-262
  878.     49a 亲水性 264-266
  879.     49a 亲水性 278-283
  880.     49a 亲水性 290-292
  881.     49a 亲水性 319-326
  882.     49a 亲水性 337-349
  883.     49a 亲水性 368-376
  884.     49a 亲水性 386-388
  885.     49a 亲水性 391-407
  886.     49a 亲水性 427-429
  887.     49a 亲水性 436-439
  888.     49a 亲水性 441-455
  889.     49a 亲水性 459-463
  890.     49a 亲水性 465-484
  891.     49a 亲水性 492-513
  892.     49a 亲水性 521-528
  893.     49a 亲水性 559-564
  894.     49a 亲水性   567-569
  895.     49a 亲水性   589-591
  896.     49a 亲水性   601-604
  897.     49a 亲水性   620-624
  898.     49a 亲水性   626-637
  899.     49a 亲水性   641-660
  900.     49a 亲水性   662-664
  901.     49a 亲水性   668-684
  902.     49a 亲水性   693-700
  903.     49a 亲水性   710-732
  904.     49a 亲水性   737-740
  905.     49a 亲水性   759-761
  906.     51-1 两亲性   15-21
  907.     51-1 两亲性   40-54
  908.     51-1 两亲性   75-86
  909.     51-1 两亲性   108-110
  910.     51-1 两亲性   112-124
  911.     51-1 两亲性   141-148
  912.     51-1 两亲性   184-189
  913.     51-1 两亲性   211-216
  914.     51-1 抗原性指数   58-65
  915.     51-1 抗原性指数   123-127
  916.     51-1 抗原性指数   132-137
  917.     51-1 抗原性指数   149-153
  918.     51-1 抗原性指数   165-177
  919.     51-1 抗原性指数   198-204
  920.     51-1 抗原性指数   222-231
  921.     51-1 亲水性   60-65
  922.     51-1 亲水性   123-127
  923.     51-1 亲水性   132-135
  924.     51-1 亲水性   165-174
  925.     51-1 亲水性   200-203
  926.     51-1 亲水性   222-227
  927.     51a 两亲性   15-21
  928.     51a 两亲性   40-54
  929.     51a 两亲性   75-86
  930.     51a 两亲性   108-110
  931.     51a 两亲性   112-124
  932.     51a 两亲性   141-148
  933.     51a 两亲性   184-189
  934.     51a 两亲性   211-216
  935.     51a 亲水性   60-65
  936.     51a 亲水性   123-127
  937.     51a 亲水性   132-135
  938.     51a 亲水性   165-174
 939.     51a 亲水性 200-203
 940.     51a 亲水性 222-227
 941.     52-1 两亲性 48-50
 942.     52-1 两亲性 64-73
 943.     52-1 抗原性指数 19-26
 944.     52-1 抗原性指数 30-35
 945.     52-1 抗原性指数 42-52
 946.     52-1 抗原性指数 57-86
 947.     52-1 亲水性 22-26
 948.     52-1 亲水性 30-35
 949.     52-1 亲水性 42-52
 950.     52-1 亲水性 57-71
 951.     52-1 亲水性 78-86
 952.     69-1 两亲性 25-27
 953.     69-1 两亲性 46-66
 954.     69-1 抗原性指数 32-41
 955.     69-1 抗原性指数 43-45
 956.     69-1 抗原性指数 71-78
 957.     69-1 亲水性 32-38
 958.     69-1 亲水性 71-78
 959.     69a 两亲性 25-27
 960.     69a 两亲性 46-66
 961.     69a 抗原性指数 32-41
 962.     69a 抗原性指数 43-46
 963.     69a 抗原性指数 71-78
 964.     69a 亲水性 32-38
 965.     69a 亲水性 71-78
 966.     77-1 两亲性 12-16
 967.     77-1 两亲性 23-33
 968.     77-1 两亲性 35-42
 969.     77-1 两亲性 51-57
 970.     77-1 两亲性 67-70
 971.     77-1 两亲性 73-79
 972.     77-1 两亲性 122-124
 973.     77-1 两亲性 130-134
 974.     77-1 两亲性 165-178
 975.     77-1 两亲性 191-211
 976.     77-1 抗原性指数 22-31
 977.     77-1 抗原性指数 34-44
 978.     77-1 抗原性指数 80-94
 979.     77-1 抗原性指数 101-104
 980.     77-1 抗原性指数 155-158
 981.     77-1 抗原性指数 167-181
 982.     77-1 亲水性 22-28
 983.     77-1 亲水性 38-44
 984.     77-1 亲水性 80-92
 985.     77-1 亲水性 171-178
 986.     77a 两亲性 8-15
 987.     77a 两亲性 24-30
 988.     77a 两亲性 40-43
 989.     77a 两亲性 46-52
 990.     77a 两亲性 95-97
 991.     77a 两亲性 103-107
 992.     77a 两亲性 114-125
 993.     77a 两亲性 144-15l
 994.     77a 两亲性 154-156
 995.     77a 两亲性 166-184
 996.     77a 抗原性指数 7-17
 997.     77a 抗原性指数 53-67
 998.     77a 抗原性指数 74-77
 999.     77a 抗原性指数 128-131
 1000.     77a 抗原性指数 140-154
 1001.     77a 亲水性 11-17
 1002.     77a 亲水性 53-65
 l003.     77a 亲水性 141-151
 1004.     81-1 两亲性 30-40
 1005.     81-1 两亲性 54-56
 1006.     81-1 两亲性 60-63
 1007.     81-1 两亲性 76-93
 1008.     81-1 两亲性 96-101
 1009.     81-1 两亲性 104-406
 1010.     81-l 两亲性 18-126
 1011.     81-1 两亲性 90-255
 1012.     81-1 两亲性 230-233
 1013.     81-1 两亲性 239-242
 1014.     81-1 两亲性 256-258
 1015.     81-1 两亲性 264-284
 1016.     81-1 两亲性 290-297
 1017.     81-1 两亲性 317-326
 1018.     81-1 两亲性 388-396
 1019.     81-1 两亲性 403-414
 1020.     81-1 两亲性 458-463
 1021.     81-1 两亲性 476-480
 1022.     81-1 抗原性指数 1-4
 1023.     81-1 抗原性指数 35-38
 1024.     81-1 抗原性指数 86-89
 1025.     81-1 抗原性指数 95-98
 1026.     81-1 抗原性指数 100-103
 1027.     81-1 抗原性指数 128-136
 1028.     81-1 抗原性指数 154-174
  1029.     81-1 抗原性指数 197-211
  1030.     81-1 抗原性指数 220-226
  1031.     81-1 抗原性指数 232-240
  1032.     81-1 抗原性指数 244-249
  1033.     81-1 抗原性指数 251-253
  1034.     81-1 抗原性指数 255-258
  1035.     81-1 抗原性指数 276-290
  1036.     81-1 抗原性指数 292-301
  1037.     81-1 抗原性指数 307-312
  1038.     81-1 抗原性指数 318-323
  1039.     81-1 抗原性指数 334-345
  1040.     81-1 抗原性指数 352-358
  1041.     81-1 抗原性指数 364-372
  1042.     81-1 抗原性指数 376-384
  1043.     81-1 抗原性指数 387-401
  1044.     81-1 抗原性指数 409-417
  1045.     81-1 抗原性指数 423-444
  1046.     81-1 抗原性指数 452-459
  1047.     81-1 抗原性指数 486-488
  1048.     81-1 抗原性指数 490-499
  1049.     81-1 抗原性指数 507-520
  1050.     81-1 亲水性 1-4
  1051.     81-1 亲水性 35-38
  1052.     81-1 亲水性 95-98
  1053.     81-1 亲水性 128-136
  1054.     81-1 亲水性 154-164
  1055.     81-1 亲水性 166-172
  1056.     81-1 亲水性 202-209
  1057.     81-1 亲水性 220-226
  1058.     81-1 亲水性 234-238
  1059.     81-1 亲水性 245-249
  1060.     81-1 亲水性 251-253
  1061.     81-1 亲水性 284-287
  1062.     81-1 亲水性 292-299
  1063.     81-1 亲水性 307-312
  1064.     81-1 亲水性 321-323
  1065.     81-1 亲水性 338-345
  1066.     81-1 亲水性 366-368
  1067.     81-1 亲水性 378-384
  1068.     81-1 亲水性 387-401
  1069.     81-1 亲水性 409-415
  1070.     81-1 亲水性 453-459
  1071.     81-1 亲水性 493-499
  1072.     81-1 亲水性 507-509
  1073.     81-1 亲水性 512-518
  1074.     82a 两亲性 36-40
  1075.     82a 两亲性 95-111
  1076.     82a 两亲性 117-132
  1077.     82a 两亲性 135-137
  1078.     82a 两亲性 160-174
  1079.     82a 两亲性 183-187
  1080.     82a 抗原性指数 2-8
  1081.     82a 抗原性指数 56-60
  1082.     82a 抗原性指数 90-97
  1083.     82a 抗原性指数 104-111
  1084.     82a 抗原性指数 114-137
  1085.     82a 抗原性指数 141-151
  1086.     82a 抗原性指数 170-175
  1087.     82a 抗原性指数 180-188
  1088.     82a 抗原性指数 194-201
  1089.     82a 抗原性指数 206-209
  1090.     82a 抗原性指数 216-218
  1091.     82a 亲水性 2-8
  1092.     82a 亲水性 56-60
  1093.     82a 亲水性 90-97
  1094.     82a 亲水性 105-108
  1095.     82a 亲水性 120-128
  1096.     82a 亲水性 130-134
  1097.     82a 亲水性 141-151
  1098.     82a 亲水性 170-175
  1099.     82a 亲水性 186-188
  1100.     82a 亲水性 195-201
  1101.     82a 亲水性 206-209
  1102.     112-1 两亲性 6-8
  1103.     112-1 两亲性 12-34
  1104.     112-1 两亲性 45-53
  1105.     112-1 两亲性 63-65
  1106.     112-1 两亲性 70-82
  1107.     112-1 两亲性 84-86
  1108.     112-1 两亲性 107-109
  1109.     112-1 两亲性 116-123
  1110.     112-1 两亲性 183-186
  1111.     112-1 两亲性 244-246
  1112.     112-1 两亲性 248-258
  1113.     112-1 两亲性 280-282
  1114.     112-1 两亲性 302-313
  1115.     112-1 抗原性指数 35-44
  1116.     112-1 抗原性指数 57-61
  1117.     112-1 抗原性指数 81-84
  1118.     112-1 抗原性指数 91-98
  1119.     112-1 抗原性指数 125-133
  1120.     112-1 抗原性指数 140-147
  1121.     112-1 抗原性指数 149-159
  1122.     112-1 抗原性指数 161-165
  1123.     112-1 抗原性指数 174-190
  1124.     112-1 抗原性指数 192-200
  1125.     112-1 抗原性指数 202-216
  1126.     112-1 抗原性指数 218-224
  1127.     112-1 抗原性指数 228-232
  1128.     112-1 抗原性指数 239-244
  1129.     112-1 抗原性指数 255-263
  1130.     112-1 抗原性指数 290-300
  1131.     112-1 亲水性 38-40
  1132.     112-1 亲水性 57-61
  1133.     112-1 亲水性 92-98
  1134.     112-1 亲水性 125-133
  1135.     112-1 亲水性 141-143
  1136.     112-1 亲水性 150-159
  1137.     112-1 亲水性 161-164
  1138.     112-1 亲水性 175-190
  1139.     112-1 亲水性 203-216
  1140.     112-1 亲水性 218-224
  1141.     112-1 亲水性 228-232
  1142.     112-1 亲水性 239-244
  1143.     112-1 亲水性 259-261
  1144.     112-1 亲水性 293-297
  1145.     112a 两亲性 6-8
  1146.     112a 两亲性 12-34
  1147.     112a 两亲性 47-54
  1148.     112a 两亲性 63-65
  1149.     112a 两亲性 69-72
  1150.     112a 两亲性 84-86
  1151.     112a 两亲性 89-91
  1152.     112a 两亲性 107-109
  1153.     112a 两亲性 116-123
  1154.     112a 两亲性 183-186
  1155.     112a 两亲性 244-246
  1156.     112a 两亲性 248-258
  1157.     112a 两亲性 280-282
  1158.     112a 两亲性 302-310
  1159.     112a 两亲性 321-336
  1160.     112a 抗原性指数 35-44
  1161.     112a 抗原性指数 57-61
  1162.     112a 抗原性指数 81-84
  1163.     112a 抗原性指数 91-98
 1164.     112a 抗原性指数 125-133
 1165.     112a 抗原性指数 140-147
 1166.     112a 抗原性指数 150-158
 1167.     112a 抗原性指数 161-164
 1168.     112a 抗原性指数 174-190
 1169.     112a 抗原性指数 194-200
 1170.     112a 抗原性指数 202-216
 1171.     112a 抗原性指数 218-220
 1172.     112a 抗原性指数 222-224
 1173.     112a 抗原性指数 228-232
 1174.     112a 抗原性指数 239-244
 1175.     112a 抗原性指数 256-263
 1176.     112a 抗原性指数 290-301
 1177.     112a 抗原性指数 351-356
 1178.     112a 亲水性 38-40
 1179.     112a 亲水性 57-61
 1180.     112a 亲水性 93-98
 1181.     112a 亲水性 125-133
 1182.     112a 亲水性 141-143
 1183.     112a 亲水性 150-155
 1184.     112a 亲水性 161-164
 1185.     112a 亲水性 175-190
 1186.     112a 亲水性 203-216
 1187.     112a 亲水性 218-220
 1188.     112a 亲水性 222-224
 1189.     112a 亲水性 228-232
 1190.     112a 亲水性 239-244
 1191.     112a 亲水性 259-261
 1192.     112a 亲水性 293-297
 1193.     112a 亲水性 351-356
 1194.     114-1 两亲性 45-54
 1195.     114-1 两亲性 154-160
 1196.     114-1 两亲性 182-190
 1197.     114-1 两亲性 224-226
 1198.     114-1 两亲性 229-233
 1199.     114-1 两亲性 285-287
 1200.     114-1 两亲性 303-310
 1201.     114-1 两亲性 321-332
 1202.     114-1 两亲性 392-398
 1203.     114-1 两亲性 413-416
 1204.     114-1 两亲性 450-452
 1205.     114-1 两亲性 477-487
 1206.     114-1 两亲性 506-509
 1207.     114-1 两亲性 525-529
 1208.     114-1 两亲性 565-567
  1209.     114-1 两亲性 614-621
  1210.     114-1 两亲性 631-635
  1211.     114-1 两亲性 770-774
  1212.     114-1 两亲性 810-813
  1213.     114-1 两亲性 847-849
  1214.     114-1 两亲性 851-853
  1215.     114-1 两亲性 875-879
  1216.     114-1 两亲性 951-956
  1217.     114-1 两亲性 975-980
  1218.     114-1 两亲性 1034-1036
  1219.     114-1 两亲性 1048-1051
  1220.     114-1 两亲性 1073-1081
  1221.     114-1 两亲性 1086-1090
  1222.     114-1 两亲性 1095-1102
  1223.     114-1 两亲性 1111-1115
  1224.     114-1 两亲性 1163-1167
  1225.     114-1 两亲性 1242-1245
  1226.     114-1 两亲性 1275-1281
  1227.     114-1 两亲性 1312-1317
  1228.     114-1 两亲性 1338-1347
  1229.     114-1 两亲性 1349-1355
  1230.     114-1 两亲性 1357-1360
  1231.     114-1 两亲性 1362-1365
  1232.     114-1 两亲性 1376-1398
  1233.     114-1 两亲性 1418-1421
  1234.     114-1 两亲性 1425-1429
  1235.     114-1 两亲性 1468-1473
  1236.     114-1 两亲性 1476-1485
  1237.     114-1 两亲性 1495-1515
  1238.     114-1 两亲性 1518-1526
  1239.     114-1 两亲性 1546-1555
  1240.     114-1 两亲性 1557-1559
  1241.     114-1 两亲性 1580-1583
  1242.     114-1 两亲性 1585-1597
  1243.     114-1 两亲性 1604-1606
  1244.     114-1 两亲性 1613-1624
  1245.     114-1 两亲性 1626-1630
  1246.     114-1 两亲性 1638-1644
  1247.     114-1 两亲性 1655-1660
  1248.     114-1 两亲性 1662-1664
  1249.     114-1 两亲性 1672-1674
  1250.     114-1 两亲性 1677-1679
  1251.     114-1 两亲性 1691-1694
  1252.     114-1 两亲性 1713-1716
  1253.     114-1 两亲性 1719-1729
 1254.     114-1 两亲性 1735-1738
 1255.     114-1 两亲性 1753-1757
 1256.     114-1 两亲性 1772-1778
 1257.     114-1 两亲性 1790-1792
 1258.     114-1 两亲性 1817-1826
 1259.     114-1 两亲性 1828-1832
 1260.     114-1 两亲性 1840-1851
 1261.     114-1 两亲性 1854-1856
 1262.     114-1 两亲性 1871-1881
 1263.     114-1 两亲性 1883-1896
 1264.     114-1 两亲性 1922-1927
 1265.     114-1 两亲性 1934-1946
 1266.     114-1 两亲性 1950-1955
 1267.     114-1 两亲性 1957-1964
 1268.     114-1 抗原性指数 1-6
 1269.     114-1 抗原性指数 10-16
 1270.     114-1 抗原性指数 23-37
 1271.     114-1 抗原性指数 41-55
 1272.     114-1 抗原性指数 75-85
 1273.     114-1 抗原性指数 91-97
 1274.     114-1 抗原性指数 102-140
 1275.     114-1 抗原性指数 147-156
 1276.     114-1 抗原性指数 161-168
 1277.     114-1 抗原性指数 172-174
 1278.     114-1 抗原性指数 181-189
 1279.     114-1 抗原性指数 196-203
 1280.     114-1 抗原性指数 208-213
 1281.     114-1 抗原性指数 220-229
 1282.     114-1 抗原性指数 242-248
 1283.     114-1 抗原性指数 251-266
 1284.     114-1 抗原性指数 268-276
 1285.     114-1 抗原性指数 295-307
 1286.     114-1 抗原性指数 309-312
 1287.     114-1 抗原性指数 318-340
 1288.     114-1 抗原性指数 345-351
 1289.     114-1 抗原性指数 357-366
 1290.     114-1 抗原性指数 371-381
 1291.     114-1 抗原性指数 385-392
 1292.     114-1 抗原性指数 404-417
 1293.     114-1 抗原性指数 419-432
 1294.     114-1 抗原性指数 440-456
 1295.     114-1 抗原性指数 464-468
 1296.     114-1 抗原性指数 473-480
 1297.     114-1 抗原性指数 482-488
 1298.     114-1 抗原性指数 496-511
  1299.     114-1 抗原性指数 515-530
  1300.     114-1 抗原性指数 535-549
  1301.     114-1 抗原性指数 555-560
  1302.     114-1 抗原性指数 564-582
  1303.     114-1 抗原性指数 588-596
  1304.     114-1 抗原性指数 602-615
  1305.     114-1 抗原性指数 617-620
  1306.     114-1 抗原性指数 622-624
  1307.     114-1 抗原性指数 628-632
  1308.     114-1 抗原性指数 637-640
  1309.     114-1 抗原性指数 647-654
  1310.     114-1 抗原性指数 660-666
  1311.     114-1 抗原性指数 668-688
  1312.     114-1 抗原性指数 696-725
  1313.     114-1 抗原性指数 730-733
  1314.     114-1 抗原性指数 738-755
  1315.     114-1 抗原性指数 760-766
  1316.     114-1 抗原性指数 779-783
  1317.     114-1 抗原性指数 786-799
  1318.     114-1 抗原性指数 807-809
  1319.     114-1 抗原性指数 811-819
  1320.     114-1 抗原性指数 831-839
  1321.     114-1 抗原性指数 845-857
  1322.     114-1 抗原性指数 860-862
  1323.     114-1 抗原性指数 864-868
  1324.     114-1 抗原性指数 872-879
  1325.     114-1 抗原性指数 883-891
  1326.     114-1 抗原性指数 893-903
  1327.     114-1 抗原性指数 908-916
  1328.     114-1 抗原性指数 919-936
  1329.     114-1 抗原性指数 941-947
  1330.     114-1 抗原性指数 950-956
  1331.     114-1 抗原性指数 959-976
  1332.     114-1 抗原性指数 979-991
  1333.     114-1 抗原性指数 993-1000
  1334.     114-1 抗原性指数 1007-1022
  1335.     114-1 抗原性指数 1041-1053
  1336.     114-1 抗原性指数 1062-1068
  1337.     114-1 抗原性指数 1075-1108
  1338.     114-1 抗原性指数 1115-1121
  1339.     114-1 抗原性指数 1126-1145
  1340.     114-1 抗原性指数 1148-1152
  1341.     114-1 抗原性指数 1156-1178
  1342.     114-1 抗原性指数 1195-1206
  1343.     114-1 抗原性指数 1208-1212
  1344.     114-1 抗原性指数   1217-1243
  1345.     114-1 抗原性指数   1246-1263
  1346.     114-1 抗原性指数   1271-1282
  1347.     114-1 抗原性指数   1284-1288
  1348.     114-1 抗原性指数   1292-1295
  1349.     114-1 抗原性指数   1299-1307
  1350.     114-1 抗原性指数   1318-1328
  1351.     114-1 抗原性指数   1330-1340
  1352.     114-1 抗原性指数   1344-1359
  1353.     114-1 抗原性指数   1367-1384
  1354.     114-1 抗原性指数   1395-1399
  1355.     114-1 抗原性指数   1405-1417
  1356.     114-1 抗原性指数   1445-1449
  1357.     114-1 抗原性指数   1491-1510
  1358.     114-1 抗原性指数   1526-1529
  1359.     114-1 抗原性指数   1532-1548
  1360.     114-1 抗原性指数   1552-1556
  1361.     114-1 抗原性指数   1560-1562
  1362.     114-1 抗原性指数   1573-1583
  1363.     114-1 抗原性指数   1594-1611
  1364.     114-1 抗原性指数   1627-1635
  1365.     114-1 抗原性指数   1643-1645
  1366.     114-1 抗原性指数   1647-1665
  1367.     114-1 抗原性指数   1680-1686
  1368.     114-1 抗原性指数   1700-1722
  1369.     114-1 抗原性指数   1724-1726
  1370.     114-1 抗原性指数   1739-1746
  1371.     114-1 抗原性指数   1752-1757
  1372.     114-1 抗原性指数   1780-1783
  1373.     114-1 抗原性指数   1791-1795
  1374.     114-1 抗原性指数   1804-1808
  1375.     114-1 抗原性指数   1829-1835
  1376.     114-1 抗原性指数   1841-1859
  1377.     114-1 抗原性指数   1867-1886
  1378.     114-1 抗原性指数   1897-1903
  1379.     114-1 抗原性指数   1908-1912
  1380.     114-1 抗原性指数   1917-1922
  1381.     114-1 抗原性指数   1926-1934
  1382.     114-1 抗原性指数   1938-1945
  1383.     114-1 抗原性指数   1947-1957
  1384.     114-1 抗原性指数   1961-1968
  1385.     114-1 抗原性指数   1974-1978
  1386.     114-1 亲水性   4-6
  1387.     114-1 亲水性   12-15
  1388.     114-1 亲水性   23-34
 1389.     114-1   亲水性 43-55
 1390.     114-1   亲水性 76-85
 1391.     114-1   亲水性 104-110
 1392.     114-1   亲水性 118-123
 1393.     114-1   亲水性 127-132
 1394.     114-1   亲水性 147-154
 1395.     114-1   亲水性 163-167
 1396.     114-1   亲水性 185-187
 1397.     114-1   亲水性 197-203
 1398.     114-1   亲水性 208-211
 1399.     114-1   亲水性 221-227
 1400.     114-1   亲水性 243-245
 1401.     114-1   亲水性 253-261
 1402.     114-1   亲水性 263-266
 1403.     114-1   亲水性 270-272
 1404.     114-1   亲水性 295-301
 1405.     114-1   亲水性 309-312
 1406.     114-1   亲水性 320-328
 1407.     114-1   亲水性 332-337
 1408.     114-1   亲水性 345-351
 1409.     114-1   亲水性 360-366
 1410.     114-1   亲水性 371-378
 1411.     114-1   亲水性 387-392
 1412.     114-1   亲水性 404-415
 1413.     114-1   亲水性 419-432
 1414.     114-1   亲水性 441-450
 1415.     114-1   亲水性 452-456
 1416.     114-1   亲水性 473-480
 1417.     114-1   亲水性 482-485
 1418.     114-1   亲水性 496-500
 1419.     114-1   亲水性 504-509
 1420.     114-1   亲水性 515-520
 1421.     114-1   亲水性 536-549
 1422.     114-1   亲水性 555-560
 1423.     114-1   亲水性 565-568
 1424.     114-1   亲水性 570-579
 1425.     114-1   亲水性 589-594
 1426.     114-1   亲水性 602-604
 1427.     114-1   亲水性 609-615
 1428.     114-1   亲水性 617-620
 1429.     114-1   亲水性 660-666
 1430.     114-1   亲水性 668-680
 1431.     114-1   亲水性 684-686
 1432.     114-1   亲水性 699-708
 1433.     114-1   亲水性 715-725
 1434.     114-1   亲水性 730-733
 1435.     114-1   亲水性 738-744
 1436.     114-1   亲水性 746-754
 1437.     114-1   亲水性 760-766
 1438.     114-1   亲水性 789-793
 1439.     114-1   亲水性 816-818
 1440.     114-1   亲水性 831-836
 1441.     114-1   亲水性 845-857
 1442.     114-1   亲水性 860-862
 1443.     114-1   亲水性 864-866
 1444.     114-1   亲水性 873-879
 1445.     114-1   亲水性 883-885
 1446.     114-1   亲水性 887-889
 1447.     114-1   亲水性 896-899
 1448.     114-1   亲水性 908-916
 1449.     114-1   亲水性 919-932
 1450.     114-1   亲水性 941-947
 1451.     114-1   亲水性 962-975
 1452.     114-1   亲水性 979-989
 1453.     114-1   亲水性 993-1000
 1454.     114-1   亲水性 1007-1022
 1455.     114-1   亲水性 1041-1043
 1456.     114-1   亲水性 1045-1053
 1457.     114-1   亲水性 1062-1068
 1458.     114-1   亲水性 1075-1078
 1459.     114-1   亲水性 1080-1087
 1460.     114-1   亲水性 1089-1104
 1461.     114-1   亲水性 1115-1121
 1462.     114-1   亲水性 1126-1141
 1463.     114-1   亲水性 1143-1145
 1464.     114-1   亲水性 1148-1151
 1465.     114-1   亲水性 1157-1178
 1466.     114-1   亲水性 1197-1203
 1467.     114-1   亲水性 1217-1243
 1468.     114-1   亲水性 1246-1263
 1469.     114-1   亲水性 1271-1273
 1470.     114-1   亲水性 1275-1277
 1471.     114-1   亲水性 1284-1288
 1472.     114-1   亲水性 1299-1307
 1473.     114-1   亲水性 1318-1326
 1474.     114-1   亲水性 1334-1340
 1475.     114-1   亲水性 1350-1355
 1476.     114-1   亲水性 1357-1359
 1477.     114-1   亲水性 1367-1384
 1478.     114-1   亲水性 1407-1417
 1479.     114-1   亲水性 1491-1510
 1480.     114-1   亲水性 1534-1540
 1481.     114-1   亲水性 1576-1583
 1482.     114-1   亲水性 1595-1607
 1483.     114-1   亲水性 1629-1635
 1484.     114-1   亲水性 1643-1645
 1485.     114-1   亲水性 1649-1665
 1486.     114-1   亲水性 1682-1686
 1487.     114-1   亲水性 1704-1722
 1488.     114-1   亲水性 1724-1726
 1489.     114-1   亲水性 1740-1746
 1490.     114-1   亲水性 1804-1806
 1491.     114-1   亲水性 1829-1835
 1492.     114-1   亲水性 1842-1855
 1493.     114-1   亲水性 1876-1879
 1494.     114-1   亲水性 1898-1900
 1495.     114-1   亲水性 1910-1912
 1496.     114-1   亲水性 1920-1922
 1497.     114-1   亲水性 1928-1930
 1498.     114-1   亲水性 1938-1940
 1499.     114-1   亲水性 1948-1954
 1500.     114-1   亲水性 1962-1967
 1501.     114a   两亲性 45-54
 1502.     114a   两亲性 154-160
 1503.     114a   两亲性 182-190
 1504.     114a   两亲性 224-226
 1505.     114a   两亲性 229-233
 1506.     114a   两亲性 285-287
 1507.     1 14a   两亲性 303-310
 1508.     114a   两亲性 321-332
 1509.     114a   两亲性 348-350
 1510.     114a   两亲性 392-398
 1511.     114a   两亲性 414-416
 1512.     114a   两亲性 478-486
 1513.     114a   两亲性 506-509
 1514.     114a   两亲性 525-529
 1515.     114a   两亲性 565-567
 1516.     114a   两亲性 614-621
 1517.     114a   两亲性 631-635
 1518.     114a   两亲性 770-774
 1519.     114a   两亲性 811-813
 1520.     114a   两亲性 847-849
 1521.     114a   两亲性 851-853
 1522.     114a   两亲性 875-879
 1523.     114a   两亲性 951-959
 1524.     114a 两亲性 975-981
 1525.     114a 两亲性 1034-1036
 1526.     114a 两亲性 1048-1051
 1527.     114a 两亲性 1073-1081
 1528.     114a 两亲性 1086-1090
 1529.     114a 两亲性 1095-1102
 1530.     114a 两亲性 1111-1115
 1531.     114a 两亲性 1163-1166
 1532.     114a 两亲性 1275-1281
 1533.     114a 两亲性 1312-1317
 1534.     114a 两亲性 1338-1347
 1535.     114a 两亲性 1349-1355
 1536.     114a 两亲性 1357-1365
 1537.     114a 两亲性 1376-1398
 1538.     114a 两亲性 1418-1420
 1539.     114a 两亲性 1455-1460
 1540.     114a 两亲性 1472-1484
 1541.     114a 两亲性 1497-1505
 1542.     114a 两亲性 1507-1512
 1543.     114a 抗原性指数 1-6
 1544.     114a 抗原性指数 10-16
 1545.     114a 抗原性指数 23-37
 1546.     114a 抗原性指数 41-55
 1547.     114a 抗原性指数 75-85
 1548.     114a 抗原性指数 91-97
 1549.     114a 抗原性指数 102-137
 1550.     114a 抗原性指数 147-156
 1551.     114a 抗原性指数 161-168
 1552.     114a 抗原性指数 172-174
 1553.     114a 抗原性指数 181-189
 1554.     114a 抗原性指数 196-203
 1555.     114a 抗原性指数 208-213
 1556.     114a 抗原性指数 220-229
 1557.     114a 抗原性指数 242-248
 1558.     114a 抗原性指数 251-266
 1559.     114a 抗原性指数 268-276
 1560.     114a 抗原性指数 295-307
 1561.     114a 抗原性指数 309-312
 1562.     114a 抗原性指数 318-340
 1563.     114a 抗原性指数 345-352
 1564.     114a 抗原性指数 357-366
 1565.     114a 抗原性指数 371-381
 1566.     114a 抗原性指数 385-392
 1567.     114a 抗原性指数 404-427
 1568.     114a 抗原性指数 429-434
 1569.     114a 抗原性指数 440-456
 1570.     114a 抗原性指数 465-468
 1571.     114a 抗原性指数 473-494
 1572.     114a 抗原性指数 496-510
 1573.     114a 抗原性指数 515-530
 1574.     114a 抗原性指数 535-549
 1575.     114a 抗原性指数 555-560
 1576.     114a 抗原性指数 564-578
 1577.     114a 抗原性指数 588-596
 1578.     114a 抗原性指数 602-615
 1579.     114a 抗原性指数 617-620
 1580.     114a 抗原性指数 622-624
 1581.     114a 抗原性指数 628-632
 1582.     114a 抗原性指数 637-640
 1583.     114a 抗原性指数 647-654
 1584.     114a 抗原性指数 660-666
 1585.     114a 抗原性指数 668-688
 1586.     114a 抗原性指数 697-725
 1587.     114a 抗原性指数 730-733
 1588.     114a 抗原性指数 738-755
 1589.     114a 抗原性指数 760-766
 1590.     114a 抗原性指数 779-783
 1591.     114a 抗原性指数 786-799
 1592.     114a 抗原性指数 806-809
 1593.     114a 抗原性指数 811-819
 1594.     114a 抗原性指数 831-839
 1595.     114a 抗原性指数 845-857
 1596.     114a 抗原性指数 860-862
 1597.     114a 抗原性指数 864-868
 1598.     114a 抗原性指数 872-879
 1599.     114a 抗原性指数 883-891
 1600.     114a 抗原性指数 893-902
 1601.     114a 抗原性指数 908-916
 1602.     114a 抗原性指数 923-936
 1603.     114a 抗原性指数 941-947
 1604.     114a 抗原性指数 950-956
 1605.     114a 抗原性指数 959-976
 1606.     114a 抗原性指数 979-989
 1607.     114a 抗原性指数 993-1000
 1608.     114a 抗原性指数 1007-1022
 1609.     114a 抗原性指数 1041-1053
 1610.     114a 抗原性指数 1062-1068
 1611.     114a 抗原性指数 1075-1108
 1612.     114a 抗原性指数 1115-1121
 1613.     114a 抗原性指数 1126-1145
 1614.     114a 抗原性指数 1148-1152
 1615.     114a 抗原性指数 1157-1176
 1616.     114a 抗原性指数 1195-1206
 1617.     114a 抗原性指数 1208-1212
 1618.     114a 抗原性指数 1224-1243
 1619.     114a 抗原性指数 1247-1263
 1620.     114a 抗原性指数 1271-1282
 1621.     114a 抗原性指数 1284-1288
 1622.     114a 抗原性指数 1292-1295
 1623.     114a 抗原性指数 1299-1307
 1624.     114a 抗原性指数 1318-1328
 1625.     114a 抗原性指数 1330-1340
 1626.     114a 抗原性指数 1344-1359
 1627.     114a 抗原性指数 1367-1384
 1628.     114a 抗原性指数 1396-1399
 1629.     114a 抗原性指数 1405-1417
 1630.     114a 抗原性指数 1434-1436
 1631.     114a 抗原性指数 1449-1451
 1632.     114a 抗原性指数 1468-1487
 1633.     114a 抗原性指数 1498-1503
 1634.     114a 抗原性指数 1509-1515
 1635.     114a 抗原性指数 1525-1532
 1636.     114a 亲水性 4-6
 1637.     114a 亲水性 12-15
 1638.     114a 亲水性 23-34
 1639.     114a 亲水性 43-55
 1640.     114a 亲水性 75-85
 1641.     114a 亲水性 104-110
 1642.     114a 亲水性 118-123
 1643.     114a 亲水性 127-132
 1644.     114a 亲水性 147-154
 1645.     114a 亲水性 163-167
 1646.     114a 亲水性 185-187
 1647.     114a 亲水性 197-203
 1648.     114a 亲水性 208-211
 1649.     114a 亲水性 221-227
 1650.     114a 亲水性 243-245
 1651.     114a 亲水性 253-261
 1652.     114a 亲水性 263-266
 1653.     114a 亲水性 270-272
 1654.     114a 亲水性 295-301
 1655.     114a 亲水性 309-312
 1656.     114a 亲水性 320-328
 1657.     114a 亲水性 332-337
 1658.     114a 亲水性 345-351
 1659.     114a   亲水性 360-366
 1660.     114a   亲水性 371-378
 1661.     114a   亲水性 387-392
 1662.     114a   亲水性 404-417
 1663.     114a   亲水性 421-423
 1664.     114a   亲水性 425-427
 1665.     114a   亲水性 442-456
 1666.     114a   亲水性 473-488
 1667.     114a   亲水性 499-509
 1668.     114a   亲水性 515-520
 1669.     114a   亲水性 536-549
 1670.     114a   亲水性 555-560
 1671.     114a   亲水性 565-568
 1672.     114a   亲水性 570-578
 1673.     114a   亲水性 589-594
 1674.     114a   亲水性 602-604
 1675.     114a   亲水性 609-615
 1676.     114a   亲水性 617-620
 1677.     114a   亲水性 660-665
 1678.     114a   亲水性 668-680
 1679.     114a   亲水性 684-686
 1680.     114a   亲水性 699-708
 1681.     114a   亲水性 715-725
 1682.     114a   亲水性 730-733
 1683.     114a   亲水性 738-744
 1684.     114a   亲水性 746-754
 1685.     114a   亲水性 760-766
 1686.     114a   亲水性 789-793
 1687.     114a   亲水性 816-818
 1688.     114a   亲水性 831-836
 1689.     114a   亲水性 845-857
 1690.     114a   亲水性 860-862
 1691.     114a   亲水性 864-866
 1692.     114a   亲水性 873-879
 1693.     114a   亲水性 883-885
 1694.     114a   亲水性 887-889
 1695.     114a   亲水性 896-899
 1696.     114a   亲水性 908-916
 1697.     114a   亲水性 923-932
 1698.     114a   亲水性 941-947
 1699.     114a   亲水性 961-975
 1700.     114a   亲水性 979-989
 1701.     114a   亲水性 993-1000
 1702.     114a   亲水性 1007-1022
 1703.     114a   亲水性 1041-1043
 1704.     114a   亲水性 1045-1053
 1705.     114a   亲水性 1062-1068
 1706.     114a   亲水性 1075-1078
 1707.     114a   亲水性 1080-1087
 1708.     114a   亲水性 1089-1104
 1709.     114a   亲水性 1115-1121
 1710.     114a   亲水性 1126-1141
 1711.     114a   亲水性 1143-1145
 1712.     114a   亲水性 1148-1151
 1713.     114a   亲水性 1158-1171
 1714.     114a   亲水性 1197-1203
 1715.     114a   亲水性 1224-1243
 1716.     114a   亲水性 1251-1263
 1717.     114a   亲水性 1271-1273
 1718.     114a   亲水性 1275-1277
 1719.     114a   亲水性 1284-1288
 1720.     114a   亲水性 1299-1307
 1721.     114a   亲水性 1318-1326
 1722.     114a   亲水性 1334-1340
 1723.     114a   亲水性 1350-1359
 1724.     114a   亲水性 1367-1384
 1725.     114a   亲水性 1407-1417
 1726.     114a   亲水性 1449-1451
 1727.     114a   亲水性 1469-1482
 1728.     114a   亲水性 1484-1486
 1729.     114a   亲水性 1498-1503
 1730.     114a   亲水性 1510-1512
 1731.     114a   亲水性 1527-1532
 1732.     124-1   两亲性 37-43
 1733.     124-1   两亲性 94-96
 1734.     124-1   两亲性 113-115
 1735.     124-1   抗原性指数 20-26
 1736.     124-1   抗原性指数 38-43
 1737.     124-1   抗原性指数 52-55
 1738.     124-1   抗原性指数 62-70
 1739.     124-1   抗原性指数 88-97
 1740.     124-1   抗原性指数 104-114
 1741.     124-1   抗原性指数 123-135
 1742.     124-1   抗原性指数 146-155
 1743.     124-1   亲水性 20-26
 1744.     124-1   亲水性 41-43
 1745.     124-1   亲水性 52-55
 1746.     124-1   亲水性 63-69
 1747.     124-1   亲水性 91-94
 1748.     124-1   亲水性 104-114
 1749.     124-1 亲水性 123-135
 1750.     124-1 亲水性 146-155
 1751.     124a 两亲性 19-21
 1752.     124a 两亲性 23-29
 1753.     124a 两亲性 37-43
 1754.     124a 两亲性 94-96
 1755.     124a 抗原性指数 38-43
 1756.     124a 抗原性指数 52-55
 1757.     124a 抗原性指数 62-70
 1758.     124a 抗原性指数 77-80
 1759.     124a 抗原性指数 90-96
 1760.     124a 抗原性指数 105-115
 1761.     124a 抗原性指数 120-135
 1762.     124a 抗原性指数 145-153
 1763.     124a 亲水性 41-43
 1764.     124a 亲水性 52-55
 1765.     124a 亲水性 63-69
 1766.     124a 亲水性 91-95
 1767.     124a 亲水性 108-115
 1768.     124a 亲水性 120-135
 1769.     124a 亲水性 146-153
应理解，本发明是仅通过实例如上进行描述的，可以在本发明的范围和精神内进行改动。
表II
本发明在其范围内不包括包含WO99/36544中所公开的45种蛋白质序列中任一序列的蛋白质。如上所述，如果在WO99/36544中所公开的任一特定蛋白质序列的长度是x个氨基酸，那么本发明的抗原性片段具有该蛋白质的至多x-1个氨基酸。对于WO99/36544中给出的45种蛋白质的每一种蛋白，在下表中给出了x的值，以供参考：
SEQ ID NO：  x SEQ ID NO：   x SEQ ID NO：   x SEQ ID NO：   X
    2  245     26  571     50  185     74  150
    4  591     28  710     52  166     76  255
    6  592     30  710     54  326     78  255
    8  164     32  62     56  356     80  172
    10  321     34  86     58  284     82  242
    12  321     36  92     60  1978     84  242
    14  124     38  103     62  1532     86  183
    16  124     40  85     64  593     88  155
    18  173     42  78     66  129     90  153
    20  640     44  78     68  319
    22  761     46  219     70  619
    24  111     48  212     72  595

Claims (13)

1.一种片段，其特征在于，它是WO99/36544中所公开的蛋白质的片段，所述片段含有至少一个抗原决定簇。
2.如权利要求1所述的片段，其特征在于，片段长度为100个氨基酸或更短。
3.如权利要求1或2所述的片段，其特征在于，片段长度为3个氨基酸或更长。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的片段，其特征在于，它是表1中1769种片段之一。
5.一种多肽，其特征在于，它与权利要求1-4中任一权利要求所述的片段有50％或更高的序列相同性。
6.一种蛋白质，其特征在于，它包含权利要求1、2或3所述的一种或多种片段，附加条件是该蛋白质不是WO99/36544中所公开的45种完整蛋白质序列之一。
7.一种抗体，其特征在于，它识别权利要求1-4中任一项所述的片段。
8.一种蛋白质，其特征在于，它包含一肽序列，所述肽序列被权利要求7所述的抗体识别。
9.一种核酸，其特征在于，它编码权利要求1、2、或3所述的片段，权利要求5所述的多肽，或权利要求8所述的蛋白质。
10.一种组合物，其特征在于，它包含权利要求1、2、或3所述的片段，权利要求5所述的多肽，权利要求8所述的蛋白质，权利要求7所述的抗体，和/或权利要求9所述的核酸，其中该组合物是疫苗、诊断试剂或免疫原性组合物。
11.如权利要求10所述的组合物的用途，其特征在于，用作药物。
12.如权利要求1、2、或3所述的片段，权利要求5所述的多肽，权利要求8所述的蛋白质，权利要求7所述的抗体，和/或权利要求9所述的核酸的用途，其特征在于，用于生产下列物质：(i)用于治疗或预防奈瑟球菌属细菌感染的药剂；(ii)用于检测奈瑟球菌属细菌或检测抗奈瑟球菌属细菌抗体是否存在的诊断试剂；和/或(iii)用于产生抗奈瑟球菌属细菌的抗体的试剂。
13.一种治疗患者的方法，其特征在于，包括给予患者治疗有效量的权利要求10所述的组合物。
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