JPS6152283A - 発現ベクタ− - Google Patents
発現ベクタ−Info
- Publication number
- JPS6152283A JPS6152283A JP59169388A JP16938884A JPS6152283A JP S6152283 A JPS6152283 A JP S6152283A JP 59169388 A JP59169388 A JP 59169388A JP 16938884 A JP16938884 A JP 16938884A JP S6152283 A JPS6152283 A JP S6152283A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vector
- gene
- promoter
- cleavage site
- expression vector
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は動物細胞を宿主として、遺伝子組み換え技術に
より、たんぱく質を産生させることを目的とした新規発
現ベクターに関する。
より、たんぱく質を産生させることを目的とした新規発
現ベクターに関する。
動物細胞を宿主とする遺伝子発現およびそこで用いられ
る発現ベクターについての若干ノ記述は底置例えば Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ Ｎａ、ｒ［１ｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｖｉｒａｌ ＶｅｃｔｏｒｓＪ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 出
版、１９８２年） あるいはＹ、Ｇ］ｕｚｍａｎｓ Ｔｈｏｍａｓ ５ｈｅ
ｎｋ 著ｒＥｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ −ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＪ（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ ｌ、ａｈｏ
ｒａｔｏｒｙ出版、１９８３年）の中に見られる。
る発現ベクターについての若干ノ記述は底置例えば Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ Ｎａ、ｒ［１ｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｖｉｒａｌ ＶｅｃｔｏｒｓＪ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 出
版、１９８２年） あるいはＹ、Ｇ］ｕｚｍａｎｓ Ｔｈｏｍａｓ ５ｈｅ
ｎｋ 著ｒＥｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ −ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＪ（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ ｌ、ａｈｏ
ｒａｔｏｒｙ出版、１９８３年）の中に見られる。
しかしながら現在までのところ、所望のたんぱく質を動
物細胞で効率よく発現するためのベクターの開発はまだ
十分に行われていない。
物細胞で効率よく発現するためのベクターの開発はまだ
十分に行われていない。
本発明は、動物細胞中で効率よくたんぱく質を発現する
ためのベクターを提供することを目的とする。
ためのベクターを提供することを目的とする。
本発明は、特定されない一種のたんぱく質（ペプチドを
含む。以下同じ）を動物細胞中で発現させるためのベク
ターであって、当８亥たんぱく質遺伝子配列の翻訳開始
コドンＡＴＧの直前もしくは直後に、制限酵素による切
断部位が存在し、かつ当該ベクターの他の部分に該制限
酵素による切断部位が多くとも一ケ所しか存在しないベ
クターである。
含む。以下同じ）を動物細胞中で発現させるためのベク
ターであって、当８亥たんぱく質遺伝子配列の翻訳開始
コドンＡＴＧの直前もしくは直後に、制限酵素による切
断部位が存在し、かつ当該ベクターの他の部分に該制限
酵素による切断部位が多くとも一ケ所しか存在しないベ
クターである。
ＡＴＧの直前もしくは直後とは好ましくはＡＴＧのＡを
＋１とすると−１５から＋１０の間の令頁域である。
＋１とすると−１５から＋１０の間の令頁域である。
翻訳開始コドンＡＴＧの周辺を詳しく説明すると次のよ
うになる。
うになる。
上式においてＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表わず。」−の
−１５から＋１０の間の領域に、制限酵素の切断部位を
少なくとも一ケ所有するヌクレオチド配列を持つ物が本
発明のベクターである。
−１５から＋１０の間の領域に、制限酵素の切断部位を
少なくとも一ケ所有するヌクレオチド配列を持つ物が本
発明のベクターである。
本発明の制限酵素は一種または二種以上でも良く、好ま
しくは６塩基配列以上を認識する制限酵素が良い。
しくは６塩基配列以上を認識する制限酵素が良い。
このような制限酵素による切断部位がＡＴＧ直前もしく
は直後に存在することによって本発明のベクターは、こ
の制限酵素によって特異的に切断されることが出来、切
断されたフラグメントは１コ多くとも２コになる。
は直後に存在することによって本発明のベクターは、こ
の制限酵素によって特異的に切断されることが出来、切
断されたフラグメントは１コ多くとも２コになる。
従って本発明のベクターは翻訳開始コドンＡＴＧ付近の
制限酵素の切断部位を含んでその付近の塩基配列を容易
に操作（挿入、欠失、置換など）することが出来る点に
特徴を有するものである。
制限酵素の切断部位を含んでその付近の塩基配列を容易
に操作（挿入、欠失、置換など）することが出来る点に
特徴を有するものである。
翻訳開始コドンＡＴＧ直前の塩基配列がｍＲＮＡからた
んぱく質への翻訳効率に重要な影響を与えることを考え
ると本発明のベクターばこの部分を容易に修飾出来るこ
とから、ベクターの発現効率を容易に改良し得るベクタ
ーとして有利な面をもっている。
んぱく質への翻訳効率に重要な影響を与えることを考え
ると本発明のベクターばこの部分を容易に修飾出来るこ
とから、ベクターの発現効率を容易に改良し得るベクタ
ーとして有利な面をもっている。
翻訳効率に影響を与えると考えられる要素として、転写
開始点から翻訳開始コドンまでの長さ、構造およびプロ
モータの種類等がある。
開始点から翻訳開始コドンまでの長さ、構造およびプロ
モータの種類等がある。
本発明では転写開始点から翻訳開始コドンまでの距離が
６０塩ｗ対以下であることが好ましい。特に強力なプロ
モータとして知られているＳＶ４０初朋プ初子プロモー
タする場合は、転写開始点のすぐ」−流に存在するＢｇ
ｌＴ切断部位から数えて翻訳開始コドンＡＴＧのＡが８
０塩基対以下、さらに好ましくは７５塩基対以下である
ことが好ましい。
６０塩ｗ対以下であることが好ましい。特に強力なプロ
モータとして知られているＳＶ４０初朋プ初子プロモー
タする場合は、転写開始点のすぐ」−流に存在するＢｇ
ｌＴ切断部位から数えて翻訳開始コドンＡＴＧのＡが８
０塩基対以下、さらに好ましくは７５塩基対以下である
ことが好ましい。
→腎ｄｐんばく質遺伝子をｍＲＮＡに転写するためにそ
の遺伝子の」二液に位置する必要がある。
の遺伝子の」二液に位置する必要がある。
本発明のプロモータとは動物ウィルス遺伝子のプロモー
タ、もしくは動物細胞遺伝子のプロモータであって、動
物細胞の中で下流の遺伝子配列をｍＲＮＡへ転写する機
能を有するものであれば何でもよい。
タ、もしくは動物細胞遺伝子のプロモータであって、動
物細胞の中で下流の遺伝子配列をｍＲＮＡへ転写する機
能を有するものであれば何でもよい。
一例として、ＳＶ４０初朋プ初子プロモータ４０後期プ
ロモータ、アデノウィルス遺伝子のプロモータ、ＩＩｎ
ウィルス遺伝子のプロモータ、レトロウィルス遺伝子の
プロモータ等が動物ウィルス遺伝子のプロモータとして
あげられる。
ロモータ、アデノウィルス遺伝子のプロモータ、ＩＩｎ
ウィルス遺伝子のプロモータ、レトロウィルス遺伝子の
プロモータ等が動物ウィルス遺伝子のプロモータとして
あげられる。
また、チミジンキナーゼ遺伝子のプロモータ、メタロチ
オネイン遺伝子のプロモータ、インターフェロン遺伝子
のプロモータ等が動物細胞遺伝子のプロモータとしてあ
げられる。
オネイン遺伝子のプロモータ、インターフェロン遺伝子
のプロモータ等が動物細胞遺伝子のプロモータとしてあ
げられる。
本発明のベクターは、動物細胞でたんぱく質もしくはペ
プチドを発現させることを目的としたものであって、そ
れ故に、その最小構成要素として当該たんぱく質（ペプ
チド）をコードする遺伝子配列、その上流のプロモータ
、および下流のポリＡ付加部位から成る。実際にはこれ
に加えて、スプライシング部位や、プロモータ機能を活
性化するエンハンサ−配列を加えてもよい。
プチドを発現させることを目的としたものであって、そ
れ故に、その最小構成要素として当該たんぱく質（ペプ
チド）をコードする遺伝子配列、その上流のプロモータ
、および下流のポリＡ付加部位から成る。実際にはこれ
に加えて、スプライシング部位や、プロモータ機能を活
性化するエンハンサ−配列を加えてもよい。
特にエンハンザ−配列は転写を促進するために望ましい
ものである。
ものである。
現実的には本発明のベクターは、それぞれの構成要素で
ある遺伝子配列から構築したのちバクテリア特に大腸菌
や、もしくは酵母によってベクターＤＮＡを調製するこ
とが多いので、バクテリアや酵母でのプラスミドオリジ
ンと選択マーカー遺伝子を有していることが望ましい。
ある遺伝子配列から構築したのちバクテリア特に大腸菌
や、もしくは酵母によってベクターＤＮＡを調製するこ
とが多いので、バクテリアや酵母でのプラスミドオリジ
ンと選択マーカー遺伝子を有していることが望ましい。
しかしながらこれらは、動物細胞を本発明のベクターに
よってトランスフェクション（ＤＮＡ感染）させるとき
には不要であるので、切り離してもよく、本発明の内容
に対して本質的に重要なものではない。
よってトランスフェクション（ＤＮＡ感染）させるとき
には不要であるので、切り離してもよく、本発明の内容
に対して本質的に重要なものではない。
本発明で使用される遺伝子配列がコードするたんぱく質
もしくはペプチドは本発明のベクターを使用することに
よって動物細胞で産生される。
もしくはペプチドは本発明のベクターを使用することに
よって動物細胞で産生される。
このたんぱく質もしくはペプチドは特に限定されず通常
有用な生理活性たんぱく質、酵素、ペプチド等を示す。
有用な生理活性たんぱく質、酵素、ペプチド等を示す。
本発明で６才特にインターフェロンの例を示すが、もち
ろん本発明はこれによって限定されるものではない。
ろん本発明はこれによって限定されるものではない。
本発明で使用される動物細胞としては特に限定されない
が例えば、ザルのＣＯ３−１細胞、Ｆｌ、細胞（ヒト羊
膜由来） 、、 ＰＣ−８細胞（ヒト肺癌転移リンパ節
由来） 、ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓由来
）、ｌ、−９２９細胞（マウス結合組織由来）、マウス
のＣ−１２７細胞、Ｃ１１０細胞（チャイニーズ・ハム
スター卵巣由来細胞）等が挙げられる。
が例えば、ザルのＣＯ３−１細胞、Ｆｌ、細胞（ヒト羊
膜由来） 、、 ＰＣ−８細胞（ヒト肺癌転移リンパ節
由来） 、ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓由来
）、ｌ、−９２９細胞（マウス結合組織由来）、マウス
のＣ−１２７細胞、Ｃ１１０細胞（チャイニーズ・ハム
スター卵巣由来細胞）等が挙げられる。
本発明のベクターは動物細胞を宿主としてたんぱく質を
産生させる際の発現効率の高いベクターである。
産生させる際の発現効率の高いベクターである。
また、本発明のベクターば翻訳開始コドン付近に制限酵
素認識部位があるため、塩基配列を容易に操作できると
いう利点がある。
素認識部位があるため、塩基配列を容易に操作できると
いう利点がある。
以下に制限酵素による切断部位として、ｘｂａｌおよび
ＨｉｎｄｌＴＩによる切断部位を使用し、ＳＶ４０初期
プロモータ及び化学合成シグナルペプチド遺伝子を用い
てヒトインターフェロンβ発現用ヘクターを作製した例
を示すが、本発明は熱論これに限定されるものではない
。
ＨｉｎｄｌＴＩによる切断部位を使用し、ＳＶ４０初期
プロモータ及び化学合成シグナルペプチド遺伝子を用い
てヒトインターフェロンβ発現用ヘクターを作製した例
を示すが、本発明は熱論これに限定されるものではない
。
実施例１
インターフェロンβ遺伝子を発現させるベクターｐｓＶ
２１ＦＮβは、シグナルペプチド部分を含むヒトインタ
ーフェロンβ遺伝子をＳＶ４０初期プロモータ及びポリ
アデニル化信号を持つ動物細胞発現ベクター（ｐＳＶ２
シリーズ、Ｐ。
２１ＦＮβは、シグナルペプチド部分を含むヒトインタ
ーフェロンβ遺伝子をＳＶ４０初期プロモータ及びポリ
アデニル化信号を持つ動物細胞発現ベクター（ｐＳＶ２
シリーズ、Ｐ。
５ｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｐ、Ｒｅｒｇ Ｅｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ″ｐ４１〜４
６ ｅｄ ｂｙ Ｙ、ＧＩｕｚｍａｎ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ １．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ＋ １９８２）につないだベクターである。
ｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ″ｐ４１〜４
６ ｅｄ ｂｙ Ｙ、ＧＩｕｚｍａｎ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ １．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ＋ １９８２）につないだベクターである。
ヒトインターフェロンβ構造遺伝子は、大腸９Ａ＾１
菌ヒトインターフェロンβ発現用ベクターｐＫＭ６より
得た。
得た。
ｐＫＭ６はトリプトファンプロモーター支配下にヒトβ
型インターフェロン遺伝子を発現するように組み立てら
れたプラスミドｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配
列を修飾することにより得たプラスミドである。
型インターフェロン遺伝子を発現するように組み立てら
れたプラスミドｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配
列を修飾することにより得たプラスミドである。
５Ｄ−ＡＴＧ間の配列はＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴ
Ｇである。
Ｇである。
ｐＫ７１−９の作製方法および構造はすでに報告されて
いるｐ Ｆ Ｉ Ｆ ｔ ｒ ｐ ６９（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、８． ４０５１〜４０７４（１
９８０）） と同一である。
いるｐ Ｆ Ｉ Ｆ ｔ ｒ ｐ ６９（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、８． ４０５１〜４０７４（１
９８０）） と同一である。
乙
ｐＫＭ６９５μｇを制限酵素ｍ＃ａＴ２００単位及びＢ
ｇｆＴ１２００単位で消化し、アガロースゲル電気泳動
にかけヒトインターフェロンβ構造遺伝子をコードする
５００塩基対のＴ）ＮＡ断片を分離した。
ｇｆＴ１２００単位で消化し、アガロースゲル電気泳動
にかけヒトインターフェロンβ構造遺伝子をコードする
５００塩基対のＴ）ＮＡ断片を分離した。
シグナルペプチド遺伝子はヒ［インターフェロンβのシ
グナルペプチド遺伝子を化学合成した。
グナルペプチド遺伝子を化学合成した。
本合成シグナルペプチド遺伝子は翻訳開始コドンＡＴＧ
の直前に制限酵素Ｘｂａ Ｉの認識配列を持ち、かつ５
゛末端はＨｉｎｄｕ切断配列を、３゛末端はＣβａｌ切
断配列を持つよう設計して合成した。
の直前に制限酵素Ｘｂａ Ｉの認識配列を持ち、かつ５
゛末端はＨｉｎｄｕ切断配列を、３゛末端はＣβａｌ切
断配列を持つよう設計して合成した。
作製方法は、まず上記配列を構成する７５塩基対の二本
ＩＮ Ｄ Ｎ Ａを９から１６オリゴマクレオチシメン ドの一本鎖ＤＮＡｌ０本（ＢＳ−１４ＢＳ−１０）に分
けて同相法により合成し、これらをアニーリング（９５
℃２分→０℃５分→７０℃から徐々に冷却）したあとＴ
４ＤＮＡリガーゼで１１℃１６時間反応させて１０本の
オリゴマーをつなぎ合わせることによアデニル化信号を
持つＤＮＡ断面は既存のベクターｐＳＶ２−Ｒａｂｂｉ
ｔ−β−ｇｌｏｂｉｎ （Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｒ
ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ２７７、１０８１９７９？
。
ＩＮ Ｄ Ｎ Ａを９から１６オリゴマクレオチシメン ドの一本鎖ＤＮＡｌ０本（ＢＳ−１４ＢＳ−１０）に分
けて同相法により合成し、これらをアニーリング（９５
℃２分→０℃５分→７０℃から徐々に冷却）したあとＴ
４ＤＮＡリガーゼで１１℃１６時間反応させて１０本の
オリゴマーをつなぎ合わせることによアデニル化信号を
持つＤＮＡ断面は既存のベクターｐＳＶ２−Ｒａｂｂｉ
ｔ−β−ｇｌｏｂｉｎ （Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｒ
ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ２７７、１０８１９７９？
。
Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｒ ｅｔ ａｌ、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２０９．１４２２．１９８０）より得た。
ｅ ２０９．１４２２．１９８０）より得た。
ずなわち、ｐＳＶ２Ｒａｂｂｉｔ−β−ｇ１ｏｂｉｎ５
０＃ｇを８ｇ７！［１５０単位で消化し引き続いてＨｉ
ｎｄｌＴ１１２５単位で消化した。
０＃ｇを８ｇ７！［１５０単位で消化し引き続いてＨｉ
ｎｄｌＴ１１２５単位で消化した。
反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ、目的とす
る４２３０塩基対のＤＮＡ断片を切り出し、電気泳動法
によりＤＮＡを分離した。
る４２３０塩基対のＤＮＡ断片を切り出し、電気泳動法
によりＤＮＡを分離した。
目的とするベクターｐｓＶ２ＴＦＮβは上記３つのＤＮ
Ａ断片を次のように結合することにより得た。 第１図
にその作製方法を示す。
Ａ断片を次のように結合することにより得た。 第１図
にその作製方法を示す。
ｐＫＭ６ ＣＩ！ａ Ｔ−ＢｇｎｌＴ５００塩基対Ｄ
ＮＡ、０．２μｍｏ／、合成７５塩基対ＤＮＡ１．５
ｐｍ ｏ ｆ！およびｐＳＶ２ Ｒａｂｂｉｔ−β−
ｇｌｏｂｉｎ ＨｉｎｄＴｒ［−Ｂｇｊ！ＴＩ ４２
３０塩基対ＤＮＡ０．１ ｐ ｍ ｏ １を混合し常用
緩衝液濃度全量５０μｌでＴ４ＤＮＡリガーゼ７単位を
加え１２℃−晩反応を行った。
ＮＡ、０．２μｍｏ／、合成７５塩基対ＤＮＡ１．５
ｐｍ ｏ ｆ！およびｐＳＶ２ Ｒａｂｂｉｔ−β−
ｇｌｏｂｉｎ ＨｉｎｄＴｒ［−Ｂｇｊ！ＴＩ ４２
３０塩基対ＤＮＡ０．１ ｐ ｍ ｏ １を混合し常用
緩衝液濃度全量５０μｌでＴ４ＤＮＡリガーゼ７単位を
加え１２℃−晩反応を行った。
反応混合物１０μｌで 大腸菌Ｍ Ｃ１０６１（Ｊ、Ｍ
ｏ１、Ｂｉｏｌ、１３８．１７９ （１９８０））を形
質転換し、２００個のコロニーを得た。
ｏ１、Ｂｉｏｌ、１３８．１７９ （１９８０））を形
質転換し、２００個のコロニーを得た。
これらをｐＫＭ６ Ｃ１！ａＴ−ＢｇｌｌＨ断片及び
合成オリゴマーを用いたコロニーハイブリグイゼーショ
ン（Ｊ、Ｐ、Ｇｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｌ
ｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、７．２１１５．１９７９）によ
り、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子及びシグナルペ
プチド遺伝子の両方を持つクローンを選択した。
合成オリゴマーを用いたコロニーハイブリグイゼーショ
ン（Ｊ、Ｐ、Ｇｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｌ
ｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、７．２１１５．１９７９）によ
り、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子及びシグナルペ
プチド遺伝子の両方を持つクローンを選択した。
得られた１７個のクローンのうち４つを１７！培養しり
、Ｒ，１ｌｅｌｉｎｓｋｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １３＋５４８４．１９７４ ）でプラスミド
ＤＮＡを調製した。
、Ｒ，１ｌｅｌｉｎｓｋｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １３＋５４８４．１９７４ ）でプラスミド
ＤＮＡを調製した。
Ｍａｘａｍ、Ｇ１１ｂｅｒｔ法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ
ａｎｄ Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａ１．５ｃｉｅ、ＵｓＡ、 ７４． ５６０．（１
９７７））により合成シグナルペプチド遺伝子部分の塩
基配列を決定して目的通りのプラチスミドを持つ大腸菌
を得た。
ａｎｄ Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａ１．５ｃｉｅ、ＵｓＡ、 ７４． ５６０．（１
９７７））により合成シグナルペプチド遺伝子部分の塩
基配列を決定して目的通りのプラチスミドを持つ大腸菌
を得た。
実施例２
ｐｓＶ２１ＦＮβの制限酵素による切 ：実施例１で得
られたベクターｐｓＶ２ＩＦＮβにおいて、制限酵素）
（ｉｎｄｌＴｌおよびＸｂａＩ各２単位でそれぞれｐＳ
Ｖ２ Ｉ ＦＮ／３０．５μｇを消化した反応混合物を
アガロースゲル電気泳動にかけ消化物の大きさを調べた
ところ、すべての場合にｐｓＶ２１ＦＮβを１ケ所で切
断する酵素で消化した場合に得られる約４８００塩基対
のＤＮＡ断片が確認できた。
られたベクターｐｓＶ２ＩＦＮβにおいて、制限酵素）
（ｉｎｄｌＴｌおよびＸｂａＩ各２単位でそれぞれｐＳ
Ｖ２ Ｉ ＦＮ／３０．５μｇを消化した反応混合物を
アガロースゲル電気泳動にかけ消化物の大きさを調べた
ところ、すべての場合にｐｓＶ２１ＦＮβを１ケ所で切
断する酵素で消化した場合に得られる約４８００塩基対
のＤＮＡ断片が確認できた。
よって該ベクターは、該ベクターの他の領域にまったく
認識部位を有さない制限酵素ＨｉｎｄｌＴＩおよびＸｂ
ａ Ｉによる切断部位がヒトインターフェロンβ遺伝子
の開始コドンＡＴＧのＡを＋１としたときの−１５から
＋１０の間の領域に存在することが確認された。
認識部位を有さない制限酵素ＨｉｎｄｌＴＩおよびＸｂ
ａ Ｉによる切断部位がヒトインターフェロンβ遺伝子
の開始コドンＡＴＧのＡを＋１としたときの−１５から
＋１０の間の領域に存在することが確認された。
実施例３
ｐｓＶ２１ＦＮβのシグナルペプチド遺伝子の一塩］ｉ
社刀Ａ９負ｐＳＶ２ＩＦＮβの化学合成したシグナルペ
プチド遺伝子であるＨｉｎｄｌｌｌ・Ｃｌａ■断片につ
いて、Ｍａｘａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（４−Ｍｅ ｔ
ｈ 。
社刀Ａ９負ｐＳＶ２ＩＦＮβの化学合成したシグナルペ
プチド遺伝子であるＨｉｎｄｌｌｌ・Ｃｌａ■断片につ
いて、Ｍａｘａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（４−Ｍｅ ｔ
ｈ 。
ｄｓ ｊｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５，４９７（１
９８０））により塩基配列を決定したところ、設計通り
であった。
９８０））により塩基配列を決定したところ、設計通り
であった。
（第２図）
ＨｉｎｄＴＩＩ切断部位は、ＳＶ４０初期プロモータ中
に存在するＢｇｌＩ切断部位から６３塩基対下流に、ま
た、ヒトインターフェロンβ遺伝子の開始コドンＡＴＧ
のＡから１２塩基対上流に位置している。
に存在するＢｇｌＩ切断部位から６３塩基対下流に、ま
た、ヒトインターフェロンβ遺伝子の開始コドンＡＴＧ
のＡから１２塩基対上流に位置している。
またＸｂａ Ｔ切断部位はＡＴＧのＡから４塩基対上流
に位置している。
に位置している。
よってヒトインターフェロンβ遺伝子の開始コドンＡＴ
ＧのＡはＳＶ４０初朋プ初子プロモータ中する８ｇ７！
Ｉ切断部位から下流７５塩基対の位置にある。
ＧのＡはＳＶ４０初朋プ初子プロモータ中する８ｇ７！
Ｉ切断部位から下流７５塩基対の位置にある。
実施例４
ｐｓＶ２１ＦＮ ヘク −に ＣＯ−１１ｉｄ Ｏ
ＪｆＪ買Ｑｆｆ施例１において得られたヒトインターフ
ェロンβ発現用ベクターｐｓＶ２１ＦＮβ０．７ｐｍｏ
ρをリン酸カルシウム法（Ｆ、１．、Ｇｒａｈａｍ、ｅ
ｔ ａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４．５３６．１９７３
）により約たヒトインターフェロンβ活性を測定したと
ころベクター導入後３日後に最高約２０００単位／ｍｐ
のインターフェロン活性が確認できた。
ＪｆＪ買Ｑｆｆ施例１において得られたヒトインターフ
ェロンβ発現用ベクターｐｓＶ２１ＦＮβ０．７ｐｍｏ
ρをリン酸カルシウム法（Ｆ、１．、Ｇｒａｈａｍ、ｅ
ｔ ａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４．５３６．１９７３
）により約たヒトインターフェロンβ活性を測定したと
ころベクター導入後３日後に最高約２０００単位／ｍｐ
のインターフェロン活性が確認できた。
なおインターフェロン活性の定量はＳ、Ｒｕｂｉｎｓｔ
ｅｉｎらの方法（，１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ３７．７
５５．１９８１ ）により、ヒｌ−Ｆ Ｌ細胞νｅｓｉ
ｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｓ Ｖｉｒｕｓを用いたＣ
ＰＥ５０法で行った。標準インターフェロンとしては、
Ｎ ｒ Ｈ標準インターフェロンβとすり合わせを行っ
た培養細胞由来のヒトインターフェロンβ７３０単位／
ｍρを用いた。
ｅｉｎらの方法（，１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ３７．７
５５．１９８１ ）により、ヒｌ−Ｆ Ｌ細胞νｅｓｉ
ｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｓ Ｖｉｒｕｓを用いたＣ
ＰＥ５０法で行った。標準インターフェロンとしては、
Ｎ ｒ Ｈ標準インターフェロンβとすり合わせを行っ
た培養細胞由来のヒトインターフェロンβ７３０単位／
ｍρを用いた。
第１図は実施例１のベクターｐｓＶ２１ＦＮβの作製方
法を示す図であり、第２図は実施例１のシグナルペプチ
ド遺伝子の合成オリゴマーからの作製方法を示す図であ
る。 第３図ばｐＳＶ２ Ｔ ＦＮβにより形質転換されたＣ
Ｏ３−１細胞によるヒトインターフェロンβ産生の経時
的変化を示すグラフである。
法を示す図であり、第２図は実施例１のシグナルペプチ
ド遺伝子の合成オリゴマーからの作製方法を示す図であ
る。 第３図ばｐＳＶ２ Ｔ ＦＮβにより形質転換されたＣ
Ｏ３−１細胞によるヒトインターフェロンβ産生の経時
的変化を示すグラフである。
Claims (4)
- （１）たんぱく質をコードする遺伝子配列を、動物ウィ
ルス遺伝子のプロモータ領域もしくは、動物細胞遺伝子
のプロモータ領域の下流に連結したベクターであって、
翻訳開始コドンの直前または直後に制限酵素による切断
部位が存在し、かつ当該ベクターの他の部位に該制限酵
素による切断部位が多くとも１ケ所しか存在しないこと
を特徴とする発現ベクター。 - （２）翻訳開始コドンの直前または直後がＡＴＧのＡを
＋１としたときの−１５から＋１０の間の領域である特
許請求の範囲第（１）項記載の発現ベクター。 - （３）プロモータがＳＶ４０初期プロモータであり、プ
ロモータ中に存在するＢｇｌ I 切断部位から翻訳開始
コドンまでの距離が８０塩基対以下である特許請求の範
囲第（１）項記載の発現ベクター。 - （４）たんぱく質をコードする遺伝子配列がヒトインタ
ーフェロンβの遺伝子配列である特許請求の範囲第（１
）項記載の発現ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59169388A JPS6152283A (ja) | 1984-08-15 | 1984-08-15 | 発現ベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59169388A JPS6152283A (ja) | 1984-08-15 | 1984-08-15 | 発現ベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152283A true JPS6152283A (ja) | 1986-03-14 |
Family
ID=15885667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59169388A Pending JPS6152283A (ja) | 1984-08-15 | 1984-08-15 | 発現ベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152283A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63141581A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体および糖付加ポリペプチドの生産方法 |
| JPS63141583A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンの生産方法 |
| JPS63141582A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体 |
| JPH01128788A (ja) * | 1987-11-12 | 1989-05-22 | Ichio Yanagi | Ｅｂｎａ関連抗原遺伝子の発現組み換え体ｄｎａおよびそれを移入した細胞 |
-
1984
- 1984-08-15 JP JP59169388A patent/JPS6152283A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63141581A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体および糖付加ポリペプチドの生産方法 |
| JPS63141583A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンの生産方法 |
| JPS63141582A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体 |
| JP2530631B2 (ja) * | 1986-12-05 | 1996-09-04 | 東レ株式会社 | 形質転換体 |
| JP2530632B2 (ja) * | 1986-12-05 | 1996-09-04 | 東レ株式会社 | ヒトインタ―フェロンの生産方法 |
| JPH01128788A (ja) * | 1987-11-12 | 1989-05-22 | Ichio Yanagi | Ｅｂｎａ関連抗原遺伝子の発現組み換え体ｄｎａおよびそれを移入した細胞 |
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