JPH06261770A - 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 - Google Patents

導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法

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JPH06261770A
JPH06261770A JP3035353A JP3535391A JPH06261770A JP H06261770 A JPH06261770 A JP H06261770A JP 3035353 A JP3035353 A JP 3035353A JP 3535391 A JP3535391 A JP 3535391A JP H06261770 A JPH06261770 A JP H06261770A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 プラスミドに、目的とする遺伝子を発現する
ためのプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、目的とする
遺伝子産物をコードする遺伝子、ターミネータ及びカイ
コのBMC−ファミリー遺伝子を組込んでなる導入発現
ベクター。このベクターをカイコの培養細胞ゲノムDN
Aに導入してなる遺伝子産物産生性細胞及びこれを用い
る遺伝子産物の生産方法。 【効果】 カイコのBMC−ファミリー遺伝子を組込む
ことにより、このベクターをカイコ培養細胞ゲノムDN
A中に効率よく導入することができる。得られる細胞
は、遺伝子産物を収率よく産生することが期待できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、生理活性があったりあ
るいは産業上利用できるペプチド、蛋白質、例えば組織
プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、インシュ
リンブリ生長ホルモン等を発現することのできるプロモ
ーター、さらにこれらを組込んだ導入ベクター細胞及び
この細胞を用いてこれらのペプチド、蛋白質等を発現す
る方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、組織プラスミノーゲンアクチベー
ター(tPA)、インシュリン、エリスロポエチン(E
PO)等の生理活性を持つペプチド、蛋白質、あるいは
ブリ成長ホルモン等産業上利用できるペプチド、蛋白質
等を遺伝子工学的手法によって生産することは知られて
いる。これらの方法の多くは、これらのペプチド、蛋白
質等の遺伝子を組込んだプラスミドを大腸菌あるいは哺
乳動物の細胞に組み込み、この細胞を細胞培養すること
によって生産する方法で、文献的に多数の方法が知られ
ており実用化されている方法もある。しかし、カイコの
ように非常に効率の良い単一蛋白質(フィブロイン及び
セリン)産生動物は他に類をみない。この系を利用する
ためにまずゲノムへの組込み方法を考えねばならない。
そこで導入ベクターを使用した培養細胞への組込みにつ
いて実施した。
【0003】ところが、カイコの細胞は従来からその遺
伝子についてよく研究されてはいるが、いまだ外来遺伝
子を細胞の中に導入し、これで外来遺伝子産物を発現さ
せようとする試みは殆どなされていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】相同組換えによって挿
入されたと考えられる反復配列LIはヒトではゲノム全
体の5%程度を占め、約104 回反復、分散して存在し
ており配列の3′末端にポリ(A)の多い部分を持ち、
もう一方の端は途中で欠失していることが多く、完全長
のものは約6kbの大きさを持つと予想される。また、
L1は、マウスやラット並びにショウジョウバエにも見
出され、真核生物界に広く分布することが明かとなっ
た。
【0005】カイコで見出されたL1様配列は、BMC
ファミリーと名付けられた。BMCファミリーはゲノム
の約3%、3×103 コピー/haploidgenome 以上の存
在が確認されており、その構造はL1と同様に最大長5
kbで5′末端は欠失している物が多く、3′末端のポ
リ(A)の存在がわかっている。しかし完全なORFが
とれないので遺伝子としての機能は失われていると考え
られている。
【0006】そこで導入法の一つとしてこのような分散
型反復配列を使って組換えによるゲノムへの遺伝子導入
を試みた。すなわち、このBMC−familyをプラスミド
に組込み培養細胞でゲノムとの組換えが起こるかどうか
を検討し、効率よく組換えが生ずることを見出した。本
発明は、このような知見に基づいてなされたものであ
る。本発明は、このようなBMCファミリーを用い、目
的とする遺伝子を組込んだベクターを調製し、これをカ
イコ培養細胞中に効率よく組込み、発現させようとする
ものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、目
的とする遺伝子を発現するためのプロモーター、抗生物
質耐性遺伝子、目的とする遺伝子産物をコードする遺伝
子、ターミネータ及びカイコのBMC−family遺伝子を
プラスミドに組込んでなる導入発現ベクター、このベク
ターをカイコの培養細胞に組込んでなる遺伝子産物産生
性細胞及びこの細胞を培養し、遺伝子産物を産生せし
め、これを採取することよりなる遺伝子産物生産方法に
関する。
【0008】本発明におけるプロモーター、抗生物質耐
性遺伝子、ターミネーター、プラスミド等としては従来
遺伝子工学において知られているものを使用することが
できる。しかし、プロモーターとしては、カイコで効率
よく機能することが確認されているショウジョウバエの
熱ショック蛋白質遺伝子を用い、またターミネーターと
してはSV40ウイルスポリA付加領域を用いることが
望ましい。これにBMCベクターを附加したものは効率
良くゲノムに組込まれることができ、また遺伝子産物を
収率よく産生することができる。
【0009】また、プラスミドとしてはpBR322 を用
い、抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺
伝子(Ampr )を用いることができる。また、目的と
する遺伝子としては、t−PA、インシュリン、CAT
(抗生物質耐性遺伝子)等の生理活性物質の遺伝子ある
いはブリ生長ホルモンの遺伝子等がある。cotransfecti
on用としてネオマイシン−アナログ(G418)を挙げ
ることができる。
【0010】これらの遺伝子によるプラスミドの構築
は、従来知られているプラスミドの構築法により行なう
ことができ、得られるプラスミドは、カイコの培養細胞
に導入される。導入用細胞としては、カイコの培養細胞
SES−Bm−l 30株から効率のよい遺伝子導入用
に選択されたSES−Bm−l 30Tからさらに選択
したBm−l 30T及びそのクローンを用いることが
望ましい。形質導入は、リン酸カルシウム法により容易
に行なうことができる。
【0011】このようにして得られたカイコ培養細胞を
培養するとカイコ培養細胞中で異種遺伝子産物を発現す
ることができる。また、本発明で用いるプラスミドは、
目的とする遺伝子産物を産生させる遺伝子の上流に分泌
シグナルを有していないので、遺伝子産物をカイコ培養
細胞内に蓄積し、これから遺伝子産物を容易に採取する
ことができる。
【0012】この遺伝子産物を発現したかどうかの確認
は、カイコ培養細胞から遺伝子産物を抽出単離精製し、
これを各種の理化学的試験法や生理学的試験法によって
容易に行なうことができる。
【0013】次に、実施例を示して本願発明を具体的に
説明する。
【実施例1】プラスミドpBR322に、E.coli由来の
クロラムフェニコールアセチル化酵素(CAT)遺伝
子、hspプロモーター、SV40ターミネーターを挿
入した公知のプラスミドphspcat(特開平2−2
61385号公報参照)にBMCフラグメントを挿入
し、BMCフラグメントをもつプラスミドpBmhsc
atを構築した。
【0014】(1) BMCフラグメントの切り出し 第1図に示す手順にしたがって、プラスミドpBmT1
001の制限酵素EcoRIとPstIの開裂部位の間
に挿入されているカイコ分散型反復配列BMCフラグメ
ントをプラスミド1μgを20μlのH緩衝液中に制限
酵素EcoRI10ユニット及びPst10ユニットを
加え37℃の温度下に1時間消化を行った。 この消化
したものにBPBグリセリン溶液を加え電気泳動を行っ
た。この際、緩衝液としてTEB(0.1Mトリス0.
1Mホウ酸、2mM EDTA2Na)を使用し、低融
点アガロースゲル(TEBに溶かし1%濃度にしたも
の)で100mAに調整して1〜1.5時間泳動を行っ
た。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、長波長のU
Vランプを照射して目的のBMCフラグメント9.5k
bpのバンドを切り出し、約5倍量のTE緩衝液(10
mMトリス−HCl、pH7.5、0.5M EDT
A)を加え、フェノール処理を行った後、アガロースと
分離し、乾燥沈澱として20μlのT4DNAポリメラ
ーゼ緩衝液(67mMトリス−HCl、pH8.8、
6.7mM MgCl2 、16.6mM(NH4 2
4 、10mM2−メルカブトエタノール、6.7μl
EDTA、0.0167%ウシ血清アルブミン、0.
5mM NTP)に溶かした。
【0015】(2) ベクターの調製:第1図に示す手順に
したがって、プラスミドpBR322をベクターとする
hspプロモーター、CAT(クロラムフェニールアセ
チル化酵素)遺伝子、及びSV40ターミネーターを含
むプラスミドphspCAT2μgを、10ユニットの
SmaIを用い10μlのA緩衝液(33mMトリス−
酢酸、pH7.9、10mM 酢酸マグネシウム、66
mMKCl、0.5mMジチオスレイトール)中で消化
を行った。これをフェノール処理後乾燥沈澱とした。次
に、30ユニットのClP(Calf Intestine Alkaline
Phosphatase)でリン酸基を消化(dephosphorylation)し
てベクターとした。CIP緩衝液は、1Mジエタノール
アミン、pH9.8 、1mM MgCl2 、及び11mM
−ニトロフェニルホスフェートから成り、10μlを反
応液として用いた。
【0016】(3) プラスミドpBmhscatの調製:10μl
のライゲーション用緩衝液に前記の(1) 及び(2) のフラ
グメントを入れ、リガーゼで結合(16℃で30分間)
した後、大腸菌K12株由来のJM109のコンピテン
ト細胞に上記DNA溶液5μlを入れ氷上に1時間放置
し、37℃で2分間処理した後37℃で1時間培養し
た。これの約1/5を、アンピシリンナトリウム0.1
%含むLBプレート(2% Bacto tryptone 、1%酵母
エキス、1%NaCl及び1.5%Bacto agar) に撒き、3
7℃で一夜培養を行った。この培養により出現したコロ
ニーを楊枝で一つづつ釣り上げ、1mlのLA(LB+
アンピシリン)培地において37℃で一夜増殖させ、ア
ルカリ法か熱処理法によりプラスミドDNAを単離し、
15.1KbpのプラスミドpBmhscatであるこ
とを制限酵素EcoRIにより切断して確認した。図2
にプラスミドpBmhscat15.1kbの構造を示
す。
【0017】(4) カイコの培養細胞への組込み 次いで、上記プラスミドを、IPL−41培地(表1参
照)中で25℃の温度で培養しされたカイコ培養細胞B
m−l 30Tにフアルマシア社製のセルフェクトキッ
トを加えて12時間培養した後、培地を交換し、更に4
8時間培養を行って、このプラスミドをl30T細胞に
cotransfectionした。
【表1】
【0018】この培養細胞を集めてCATの活性を確認
した。
【0019】(5) カイコ培養細胞への組込みの確認 以上のとおり、カイコの分散型反復配列であるBMC−
familyを利用して、培養細胞での相同組換えによるゲノ
ムへの遺伝子導入を試みた。すなわちレポーター遺伝子
としてCAT、プロモーターとしてheat shock protein
のプロモーターを持つプラスミドにBMC−familyの2
ユニットを組込んだプラスミドpBmhscat(図
2)を構築し、このプラスミドをneo遺伝子を持つプ
ラスミドと共にカイコ培養細胞BM−l30Tにcotran
sfectionを行った後に、ネオマイシンアナログG−41
8による選択をかけた。この選択で生存する細胞は、同
時に導入したDNA(この場合pBmhsCAT)をも
つ場合が多い。約1月間の選択の後、全DNAを抽出し
てCATをプローブとして、サザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ってみるとCATとBMC−familyの配列(以
下BMC−sequenceという。)が両方が含まれるような
切りかたをした場合に、広い範囲でバンドの位置のシフ
トが確認され、このバンドのシフトは組換えによるもの
だと考えられる。トータルDNAをXbaI切断した後
にCharomid(9-36)とライゲーションを行い、CATをプ
ローブをしてクローニングを行った。
【0020】その結果、得られたポジティブクローン8
個のうち少くとも4個のクローンは明らかに、クローン
の大きさと制限酵素部位に変化を起こしていた。これら
のクローンは、pUC19にサブクローンしてそれぞれ
をpUC4,pUC24,pUC58,pUC97とし
た(図3)。これらのことより得られたクローンについ
ては、かなり多様な組換えが起こっていると考えられた
のでさらにpUC58とpUC24の解析を進めた。
【0021】まず、pUC58については、pBR32
2のどのあたりで組換えが起こっているのかを解析し
た。予備的実験でpBR322の4290近辺のAat
IIについては、その存在が確認されたのでその付近のプ
ライマーを合成し、塩基配列を決定した。その結果、p
BR322のEcoRI直前の4355番目でオリジナ
ルとは、全く違う配列に変っていることが確認された。
【0022】また、pUC24については、BMC−se
quence内の制限酵素地図を作成した。その結果、pUC
24はBMC−sequence内のHindIII 近辺のPvu
II,SacI,SacIIが消失していることが確認され
た。さらにpUC24のHind III−XbaI 断片を
DraI 消化の後、オリジナルのpBmhscatをプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うと約
300bpの断片には、ハイブリダイズしなかった。そ
の故この部分は、オリジナルのプラスミドには存在しな
い領域と考えられたので、まず塩基配列を決定して両端
の部分のプライマーを合成してPCRによる増幅をオリ
ジナル及びゲノムDNAに対して行った。導入したオリ
ジナルのpBmhscatでは、300bpの位置に増
幅されたDNAは認められなかったが、培養細胞l30
TのDNAでは増幅されたDNAが認められた。この培
養細胞が由来するカイコの系統l30の後部絹糸腺DN
Aでも同じ位置に増幅されたDNAが認められた。しか
し別の遺伝的系統のカイコP22では増幅されたDNA
は認められなかった。
【0023】組換えを起こしたポジティブクローンは、
得られたクローンのうちの少くとも半分であり、BMC
−familyの配列を利用することによってかなり効率よく
組換えを起こすことができると考えられる。さらにポジ
ティブクローンのうち3クローンではほとんどBMC−
sequenceの部分でのみ組換えが起こっている。BMC領
域同志の特異的組換えの可能性について興味が持たれ
る。この組換えについては、得られたクローンの一部を
プローブとして導入に使用した最初のプラスミドに対
し、サザンハイブリダイゼーションを行ってもハイブリ
ダイズしないので、プラスミド同志の組換えの可能性は
低く、ゲノム内のBMC領域と組換えを起こした可能性
が大きいと判断される。さらにpUC24は、PCRに
よる増幅の結果で明らかにゲノムとの組換えであると考
えられる。
【0024】本発明ではCAT遺伝子に代えてt−P
A、ヒトインシュリンあるいはブリ成長ホルモン等の遺
伝子を用いることによって効率よくカイコ培養細胞のゲ
ノムDNAにこれらの遺伝子をもつプラスミドを導入す
ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の発現プラスミドpBmhsCATの構
築の概要
【図2】本発明の発現プラスミドpBmhsCATの制
限酵素地図
【図3】遺伝子導入によるゲノムとの組換え確認のため
にクローニングの制限酵素地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12P 21/02 C12R 1:91) (72)発明者 菊地 美明 神奈川県横浜市中区南通4−43 協同飼料 株式会社研究所内 (72)発明者 前川 秀彰 東京都港区白金台5−19−3−401

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 プラスミドにプロモーター、抗生物質耐
    性遺伝子、目的とする遺伝子産物をコードする遺伝子、
    ターミネータ及びカイコのBMC−family遺伝子を組込
    んでなる導入ベクター。
  2. 【請求項2】 プラスミドpBR322にショウジョウ
    バエの熱ショック蛋白質遺伝子であるプロモーター、目
    的とする遺伝子産物をコードする遺伝子、SV40ウイ
    ルスポリA付加領域であるターミネータ及びカイコのB
    MC−family遺伝子を組込んでなる導入ベクター及びco
    transfection用ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミ
    ド 。
  3. 【請求項3】 請求項1または2に記載される導入ベク
    ターをカイコの培養細胞に組込んでなる遺伝子産物産生
    性細胞。
  4. 【請求項4】 培養細胞がBm−l 30T及びそのク
    ローンである請求項3記載の細胞。
  5. 【請求項5】 請求項3または4に記載される細胞をI
    PL41培地で培養し、遺伝子産物を産生せしめ、これ
    を採取することを特徴とする遺伝子産物の生産方法。
JP03035353A 1991-02-05 1991-02-05 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 Expired - Fee Related JP3143933B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003079365A (ja) * 2001-09-07 2003-03-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 環境有害化学物質の高感度検出法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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