JPH06261770A - 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 - Google Patents
導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法Info
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- JPH06261770A JPH06261770A JP3035353A JP3535391A JPH06261770A JP H06261770 A JPH06261770 A JP H06261770A JP 3035353 A JP3035353 A JP 3035353A JP 3535391 A JP3535391 A JP 3535391A JP H06261770 A JPH06261770 A JP H06261770A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 プラスミドに、目的とする遺伝子を発現する
ためのプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、目的とする
遺伝子産物をコードする遺伝子、ターミネータ及びカイ
コのＢＭＣ−ファミリー遺伝子を組込んでなる導入発現
ベクター。このベクターをカイコの培養細胞ゲノムＤＮ
Ａに導入してなる遺伝子産物産生性細胞及びこれを用い
る遺伝子産物の生産方法。 【効果】 カイコのＢＭＣ−ファミリー遺伝子を組込む
ことにより、このベクターをカイコ培養細胞ゲノムＤＮ
Ａ中に効率よく導入することができる。得られる細胞
は、遺伝子産物を収率よく産生することが期待できる。
ためのプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、目的とする
遺伝子産物をコードする遺伝子、ターミネータ及びカイ
コのＢＭＣ−ファミリー遺伝子を組込んでなる導入発現
ベクター。このベクターをカイコの培養細胞ゲノムＤＮ
Ａに導入してなる遺伝子産物産生性細胞及びこれを用い
る遺伝子産物の生産方法。 【効果】 カイコのＢＭＣ−ファミリー遺伝子を組込む
ことにより、このベクターをカイコ培養細胞ゲノムＤＮ
Ａ中に効率よく導入することができる。得られる細胞
は、遺伝子産物を収率よく産生することが期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生理活性があったりあ
るいは産業上利用できるペプチド、蛋白質、例えば組織
プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インシュ
リンブリ生長ホルモン等を発現することのできるプロモ
ーター、さらにこれらを組込んだ導入ベクター細胞及び
この細胞を用いてこれらのペプチド、蛋白質等を発現す
る方法に関する。
るいは産業上利用できるペプチド、蛋白質、例えば組織
プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インシュ
リンブリ生長ホルモン等を発現することのできるプロモ
ーター、さらにこれらを組込んだ導入ベクター細胞及び
この細胞を用いてこれらのペプチド、蛋白質等を発現す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（ｔＰＡ）、インシュリン、エリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）等の生理活性を持つペプチド、蛋白質、あるいは
ブリ成長ホルモン等産業上利用できるペプチド、蛋白質
等を遺伝子工学的手法によって生産することは知られて
いる。これらの方法の多くは、これらのペプチド、蛋白
質等の遺伝子を組込んだプラスミドを大腸菌あるいは哺
乳動物の細胞に組み込み、この細胞を細胞培養すること
によって生産する方法で、文献的に多数の方法が知られ
ており実用化されている方法もある。しかし、カイコの
ように非常に効率の良い単一蛋白質（フィブロイン及び
セリン）産生動物は他に類をみない。この系を利用する
ためにまずゲノムへの組込み方法を考えねばならない。
そこで導入ベクターを使用した培養細胞への組込みにつ
いて実施した。
ター（ｔＰＡ）、インシュリン、エリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）等の生理活性を持つペプチド、蛋白質、あるいは
ブリ成長ホルモン等産業上利用できるペプチド、蛋白質
等を遺伝子工学的手法によって生産することは知られて
いる。これらの方法の多くは、これらのペプチド、蛋白
質等の遺伝子を組込んだプラスミドを大腸菌あるいは哺
乳動物の細胞に組み込み、この細胞を細胞培養すること
によって生産する方法で、文献的に多数の方法が知られ
ており実用化されている方法もある。しかし、カイコの
ように非常に効率の良い単一蛋白質（フィブロイン及び
セリン）産生動物は他に類をみない。この系を利用する
ためにまずゲノムへの組込み方法を考えねばならない。
そこで導入ベクターを使用した培養細胞への組込みにつ
いて実施した。
【０００３】ところが、カイコの細胞は従来からその遺
伝子についてよく研究されてはいるが、いまだ外来遺伝
子を細胞の中に導入し、これで外来遺伝子産物を発現さ
せようとする試みは殆どなされていない。
伝子についてよく研究されてはいるが、いまだ外来遺伝
子を細胞の中に導入し、これで外来遺伝子産物を発現さ
せようとする試みは殆どなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】相同組換えによって挿
入されたと考えられる反復配列ＬＩはヒトではゲノム全
体の５％程度を占め、約１０4 回反復、分散して存在し
ており配列の３′末端にポリ（Ａ）の多い部分を持ち、
もう一方の端は途中で欠失していることが多く、完全長
のものは約６ｋｂの大きさを持つと予想される。また、
Ｌ１は、マウスやラット並びにショウジョウバエにも見
出され、真核生物界に広く分布することが明かとなっ
た。
入されたと考えられる反復配列ＬＩはヒトではゲノム全
体の５％程度を占め、約１０4 回反復、分散して存在し
ており配列の３′末端にポリ（Ａ）の多い部分を持ち、
もう一方の端は途中で欠失していることが多く、完全長
のものは約６ｋｂの大きさを持つと予想される。また、
Ｌ１は、マウスやラット並びにショウジョウバエにも見
出され、真核生物界に広く分布することが明かとなっ
た。
【０００５】カイコで見出されたＬ１様配列は、ＢＭＣ
ファミリーと名付けられた。ＢＭＣファミリーはゲノム
の約３％、３×１０3 コピー／haploidgenome 以上の存
在が確認されており、その構造はＬ１と同様に最大長５
ｋｂで５′末端は欠失している物が多く、３′末端のポ
リ（Ａ）の存在がわかっている。しかし完全なＯＲＦが
とれないので遺伝子としての機能は失われていると考え
られている。
ファミリーと名付けられた。ＢＭＣファミリーはゲノム
の約３％、３×１０3 コピー／haploidgenome 以上の存
在が確認されており、その構造はＬ１と同様に最大長５
ｋｂで５′末端は欠失している物が多く、３′末端のポ
リ（Ａ）の存在がわかっている。しかし完全なＯＲＦが
とれないので遺伝子としての機能は失われていると考え
られている。
【０００６】そこで導入法の一つとしてこのような分散
型反復配列を使って組換えによるゲノムへの遺伝子導入
を試みた。すなわち、このＢＭＣ−familyをプラスミド
に組込み培養細胞でゲノムとの組換えが起こるかどうか
を検討し、効率よく組換えが生ずることを見出した。本
発明は、このような知見に基づいてなされたものであ
る。本発明は、このようなＢＭＣファミリーを用い、目
的とする遺伝子を組込んだベクターを調製し、これをカ
イコ培養細胞中に効率よく組込み、発現させようとする
ものである。
型反復配列を使って組換えによるゲノムへの遺伝子導入
を試みた。すなわち、このＢＭＣ−familyをプラスミド
に組込み培養細胞でゲノムとの組換えが起こるかどうか
を検討し、効率よく組換えが生ずることを見出した。本
発明は、このような知見に基づいてなされたものであ
る。本発明は、このようなＢＭＣファミリーを用い、目
的とする遺伝子を組込んだベクターを調製し、これをカ
イコ培養細胞中に効率よく組込み、発現させようとする
ものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、目
的とする遺伝子を発現するためのプロモーター、抗生物
質耐性遺伝子、目的とする遺伝子産物をコードする遺伝
子、ターミネータ及びカイコのＢＭＣ−family遺伝子を
プラスミドに組込んでなる導入発現ベクター、このベク
ターをカイコの培養細胞に組込んでなる遺伝子産物産生
性細胞及びこの細胞を培養し、遺伝子産物を産生せし
め、これを採取することよりなる遺伝子産物生産方法に
関する。
的とする遺伝子を発現するためのプロモーター、抗生物
質耐性遺伝子、目的とする遺伝子産物をコードする遺伝
子、ターミネータ及びカイコのＢＭＣ−family遺伝子を
プラスミドに組込んでなる導入発現ベクター、このベク
ターをカイコの培養細胞に組込んでなる遺伝子産物産生
性細胞及びこの細胞を培養し、遺伝子産物を産生せし
め、これを採取することよりなる遺伝子産物生産方法に
関する。
【０００８】本発明におけるプロモーター、抗生物質耐
性遺伝子、ターミネーター、プラスミド等としては従来
遺伝子工学において知られているものを使用することが
できる。しかし、プロモーターとしては、カイコで効率
よく機能することが確認されているショウジョウバエの
熱ショック蛋白質遺伝子を用い、またターミネーターと
してはＳＶ４０ウイルスポリＡ付加領域を用いることが
望ましい。これにＢＭＣベクターを附加したものは効率
良くゲノムに組込まれることができ、また遺伝子産物を
収率よく産生することができる。
性遺伝子、ターミネーター、プラスミド等としては従来
遺伝子工学において知られているものを使用することが
できる。しかし、プロモーターとしては、カイコで効率
よく機能することが確認されているショウジョウバエの
熱ショック蛋白質遺伝子を用い、またターミネーターと
してはＳＶ４０ウイルスポリＡ付加領域を用いることが
望ましい。これにＢＭＣベクターを附加したものは効率
良くゲノムに組込まれることができ、また遺伝子産物を
収率よく産生することができる。
【０００９】また、プラスミドとしてはｐＢＲ322 を用
い、抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺
伝子（Ａｍｐr ）を用いることができる。また、目的と
する遺伝子としては、ｔ−ＰＡ、インシュリン、ＣＡＴ
（抗生物質耐性遺伝子）等の生理活性物質の遺伝子ある
いはブリ生長ホルモンの遺伝子等がある。cotransfecti
on用としてネオマイシン−アナログ（Ｇ４１８）を挙げ
ることができる。
い、抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺
伝子（Ａｍｐr ）を用いることができる。また、目的と
する遺伝子としては、ｔ−ＰＡ、インシュリン、ＣＡＴ
（抗生物質耐性遺伝子）等の生理活性物質の遺伝子ある
いはブリ生長ホルモンの遺伝子等がある。cotransfecti
on用としてネオマイシン−アナログ（Ｇ４１８）を挙げ
ることができる。
【００１０】これらの遺伝子によるプラスミドの構築
は、従来知られているプラスミドの構築法により行なう
ことができ、得られるプラスミドは、カイコの培養細胞
に導入される。導入用細胞としては、カイコの培養細胞
ＳＥＳ−Ｂｍ−ｌ ３０株から効率のよい遺伝子導入用
に選択されたＳＥＳ−Ｂｍ−ｌ ３０Ｔからさらに選択
したＢｍ−ｌ ３０Ｔ及びそのクローンを用いることが
望ましい。形質導入は、リン酸カルシウム法により容易
に行なうことができる。
は、従来知られているプラスミドの構築法により行なう
ことができ、得られるプラスミドは、カイコの培養細胞
に導入される。導入用細胞としては、カイコの培養細胞
ＳＥＳ−Ｂｍ−ｌ ３０株から効率のよい遺伝子導入用
に選択されたＳＥＳ−Ｂｍ−ｌ ３０Ｔからさらに選択
したＢｍ−ｌ ３０Ｔ及びそのクローンを用いることが
望ましい。形質導入は、リン酸カルシウム法により容易
に行なうことができる。
【００１１】このようにして得られたカイコ培養細胞を
培養するとカイコ培養細胞中で異種遺伝子産物を発現す
ることができる。また、本発明で用いるプラスミドは、
目的とする遺伝子産物を産生させる遺伝子の上流に分泌
シグナルを有していないので、遺伝子産物をカイコ培養
細胞内に蓄積し、これから遺伝子産物を容易に採取する
ことができる。
培養するとカイコ培養細胞中で異種遺伝子産物を発現す
ることができる。また、本発明で用いるプラスミドは、
目的とする遺伝子産物を産生させる遺伝子の上流に分泌
シグナルを有していないので、遺伝子産物をカイコ培養
細胞内に蓄積し、これから遺伝子産物を容易に採取する
ことができる。
【００１２】この遺伝子産物を発現したかどうかの確認
は、カイコ培養細胞から遺伝子産物を抽出単離精製し、
これを各種の理化学的試験法や生理学的試験法によって
容易に行なうことができる。
は、カイコ培養細胞から遺伝子産物を抽出単離精製し、
これを各種の理化学的試験法や生理学的試験法によって
容易に行なうことができる。
【００１３】次に、実施例を示して本願発明を具体的に
説明する。
説明する。
【実施例１】プラスミドｐＢＲ３２２に、E.coli由来の
クロラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）遺伝
子、ｈｓｐプロモーター、ＳＶ４０ターミネーターを挿
入した公知のプラスミドｐｈｓｐｃａｔ（特開平２−２
６１３８５号公報参照）にＢＭＣフラグメントを挿入
し、ＢＭＣフラグメントをもつプラスミドｐＢｍｈｓｃ
ａｔを構築した。
クロラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）遺伝
子、ｈｓｐプロモーター、ＳＶ４０ターミネーターを挿
入した公知のプラスミドｐｈｓｐｃａｔ（特開平２−２
６１３８５号公報参照）にＢＭＣフラグメントを挿入
し、ＢＭＣフラグメントをもつプラスミドｐＢｍｈｓｃ
ａｔを構築した。
【００１４】(1) ＢＭＣフラグメントの切り出し 第１図に示す手順にしたがって、プラスミドｐＢｍＴ１
００１の制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの開裂部位の間
に挿入されているカイコ分散型反復配列ＢＭＣフラグメ
ントをプラスミド１μｇを２０μｌのＨ緩衝液中に制限
酵素ＥｃｏＲＩ１０ユニット及びＰｓｔ１０ユニットを
加え３７℃の温度下に１時間消化を行った。 この消化
したものにＢＰＢグリセリン溶液を加え電気泳動を行っ
た。この際、緩衝液としてＴＥＢ（０．１Ｍトリス０．
１Ｍホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ）を使用し、低融
点アガロースゲル（ＴＥＢに溶かし１％濃度にしたも
の）で１００ｍＡに調整して１〜１．５時間泳動を行っ
た。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、長波長のＵ
Ｖランプを照射して目的のＢＭＣフラグメント９．５ｋ
ｂｐのバンドを切り出し、約５倍量のＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ）を加え、フェノール処理を行った後、アガロースと
分離し、乾燥沈澱として２０μｌのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（６７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、
６．７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１６．６ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 、１０ｍＭ２−メルカブトエタノール、６．７μｌ
ＥＤＴＡ、０．０１６７％ウシ血清アルブミン、０．
５ｍＭ ＮＴＰ）に溶かした。
００１の制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの開裂部位の間
に挿入されているカイコ分散型反復配列ＢＭＣフラグメ
ントをプラスミド１μｇを２０μｌのＨ緩衝液中に制限
酵素ＥｃｏＲＩ１０ユニット及びＰｓｔ１０ユニットを
加え３７℃の温度下に１時間消化を行った。 この消化
したものにＢＰＢグリセリン溶液を加え電気泳動を行っ
た。この際、緩衝液としてＴＥＢ（０．１Ｍトリス０．
１Ｍホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ）を使用し、低融
点アガロースゲル（ＴＥＢに溶かし１％濃度にしたも
の）で１００ｍＡに調整して１〜１．５時間泳動を行っ
た。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、長波長のＵ
Ｖランプを照射して目的のＢＭＣフラグメント９．５ｋ
ｂｐのバンドを切り出し、約５倍量のＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ）を加え、フェノール処理を行った後、アガロースと
分離し、乾燥沈澱として２０μｌのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（６７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、
６．７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１６．６ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 、１０ｍＭ２−メルカブトエタノール、６．７μｌ
ＥＤＴＡ、０．０１６７％ウシ血清アルブミン、０．
５ｍＭ ＮＴＰ）に溶かした。
【００１５】(2) ベクターの調製：第１図に示す手順に
したがって、プラスミドｐＢＲ３２２をベクターとする
ｈｓｐプロモーター、ＣＡＴ（クロラムフェニールアセ
チル化酵素）遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含
むプラスミドｐｈｓｐＣＡＴ２μｇを、１０ユニットの
ＳｍａＩを用い１０μｌのＡ緩衝液（３３ｍＭトリス−
酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、６６
ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭジチオスレイトール）中で消化
を行った。これをフェノール処理後乾燥沈澱とした。次
に、３０ユニットのＣｌＰ（Calf Intestine Alkaline
Phosphatase)でリン酸基を消化（dephosphorylation)し
てベクターとした。ＣＩＰ緩衝液は、１Ｍジエタノール
アミン、ｐＨ9.8 、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、及び１１ｍＭ
−ニトロフェニルホスフェートから成り、１０μｌを反
応液として用いた。
したがって、プラスミドｐＢＲ３２２をベクターとする
ｈｓｐプロモーター、ＣＡＴ（クロラムフェニールアセ
チル化酵素）遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含
むプラスミドｐｈｓｐＣＡＴ２μｇを、１０ユニットの
ＳｍａＩを用い１０μｌのＡ緩衝液（３３ｍＭトリス−
酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、６６
ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭジチオスレイトール）中で消化
を行った。これをフェノール処理後乾燥沈澱とした。次
に、３０ユニットのＣｌＰ（Calf Intestine Alkaline
Phosphatase)でリン酸基を消化（dephosphorylation)し
てベクターとした。ＣＩＰ緩衝液は、１Ｍジエタノール
アミン、ｐＨ9.8 、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、及び１１ｍＭ
−ニトロフェニルホスフェートから成り、１０μｌを反
応液として用いた。
【００１６】(3) プラスミドpBmhscatの調製：１０μｌ
のライゲーション用緩衝液に前記の(1) 及び(2) のフラ
グメントを入れ、リガーゼで結合（１６℃で３０分間）
した後、大腸菌Ｋ１２株由来のＪＭ１０９のコンピテン
ト細胞に上記ＤＮＡ溶液５μｌを入れ氷上に１時間放置
し、３７℃で２分間処理した後３７℃で１時間培養し
た。これの約１／５を、アンピシリンナトリウム０．１
％含むＬＢプレート（２％ Bacto tryptone 、１％酵母
エキス、１％NaCl及び１．５％Bacto agar) に撒き、３
７℃で一夜培養を行った。この培養により出現したコロ
ニーを楊枝で一つづつ釣り上げ、１ｍｌのＬＡ（ＬＢ＋
アンピシリン）培地において３７℃で一夜増殖させ、ア
ルカリ法か熱処理法によりプラスミドＤＮＡを単離し、
１５．１ＫｂｐのプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔであるこ
とを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断して確認した。図２
にプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔ１５．１ｋｂの構造を示
す。
のライゲーション用緩衝液に前記の(1) 及び(2) のフラ
グメントを入れ、リガーゼで結合（１６℃で３０分間）
した後、大腸菌Ｋ１２株由来のＪＭ１０９のコンピテン
ト細胞に上記ＤＮＡ溶液５μｌを入れ氷上に１時間放置
し、３７℃で２分間処理した後３７℃で１時間培養し
た。これの約１／５を、アンピシリンナトリウム０．１
％含むＬＢプレート（２％ Bacto tryptone 、１％酵母
エキス、１％NaCl及び１．５％Bacto agar) に撒き、３
７℃で一夜培養を行った。この培養により出現したコロ
ニーを楊枝で一つづつ釣り上げ、１ｍｌのＬＡ（ＬＢ＋
アンピシリン）培地において３７℃で一夜増殖させ、ア
ルカリ法か熱処理法によりプラスミドＤＮＡを単離し、
１５．１ＫｂｐのプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔであるこ
とを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断して確認した。図２
にプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔ１５．１ｋｂの構造を示
す。
【００１７】(4) カイコの培養細胞への組込み 次いで、上記プラスミドを、ＩＰＬ−４１培地（表１参
照）中で２５℃の温度で培養しされたカイコ培養細胞Ｂ
ｍ−ｌ ３０Ｔにフアルマシア社製のセルフェクトキッ
トを加えて１２時間培養した後、培地を交換し、更に４
８時間培養を行って、このプラスミドをｌ３０Ｔ細胞に
cotransfectionした。
照）中で２５℃の温度で培養しされたカイコ培養細胞Ｂ
ｍ−ｌ ３０Ｔにフアルマシア社製のセルフェクトキッ
トを加えて１２時間培養した後、培地を交換し、更に４
８時間培養を行って、このプラスミドをｌ３０Ｔ細胞に
cotransfectionした。
【表１】
【００１８】この培養細胞を集めてＣＡＴの活性を確認
した。
した。
【００１９】(5) カイコ培養細胞への組込みの確認 以上のとおり、カイコの分散型反復配列であるＢＭＣ−
familyを利用して、培養細胞での相同組換えによるゲノ
ムへの遺伝子導入を試みた。すなわちレポーター遺伝子
としてＣＡＴ、プロモーターとしてheat shock protein
のプロモーターを持つプラスミドにＢＭＣ−familyの２
ユニットを組込んだプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔ（図
２）を構築し、このプラスミドをｎｅｏ遺伝子を持つプ
ラスミドと共にカイコ培養細胞ＢＭ−ｌ３０Ｔにcotran
sfectionを行った後に、ネオマイシンアナログＧ−４１
８による選択をかけた。この選択で生存する細胞は、同
時に導入したＤＮＡ（この場合ｐＢｍｈｓＣＡＴ）をも
つ場合が多い。約１月間の選択の後、全ＤＮＡを抽出し
てＣＡＴをプローブとして、サザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ってみるとＣＡＴとＢＭＣ−familyの配列（以
下ＢＭＣ−sequenceという。）が両方が含まれるような
切りかたをした場合に、広い範囲でバンドの位置のシフ
トが確認され、このバンドのシフトは組換えによるもの
だと考えられる。トータルＤＮＡをＸｂａＩ切断した後
にCharomid(9-36)とライゲーションを行い、ＣＡＴをプ
ローブをしてクローニングを行った。
familyを利用して、培養細胞での相同組換えによるゲノ
ムへの遺伝子導入を試みた。すなわちレポーター遺伝子
としてＣＡＴ、プロモーターとしてheat shock protein
のプロモーターを持つプラスミドにＢＭＣ−familyの２
ユニットを組込んだプラスミドｐＢｍｈｓｃａｔ（図
２）を構築し、このプラスミドをｎｅｏ遺伝子を持つプ
ラスミドと共にカイコ培養細胞ＢＭ−ｌ３０Ｔにcotran
sfectionを行った後に、ネオマイシンアナログＧ−４１
８による選択をかけた。この選択で生存する細胞は、同
時に導入したＤＮＡ（この場合ｐＢｍｈｓＣＡＴ）をも
つ場合が多い。約１月間の選択の後、全ＤＮＡを抽出し
てＣＡＴをプローブとして、サザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ってみるとＣＡＴとＢＭＣ−familyの配列（以
下ＢＭＣ−sequenceという。）が両方が含まれるような
切りかたをした場合に、広い範囲でバンドの位置のシフ
トが確認され、このバンドのシフトは組換えによるもの
だと考えられる。トータルＤＮＡをＸｂａＩ切断した後
にCharomid(9-36)とライゲーションを行い、ＣＡＴをプ
ローブをしてクローニングを行った。
【００２０】その結果、得られたポジティブクローン８
個のうち少くとも４個のクローンは明らかに、クローン
の大きさと制限酵素部位に変化を起こしていた。これら
のクローンは、ｐＵＣ１９にサブクローンしてそれぞれ
をｐＵＣ４，ｐＵＣ２４，ｐＵＣ５８，ｐＵＣ９７とし
た（図３）。これらのことより得られたクローンについ
ては、かなり多様な組換えが起こっていると考えられた
のでさらにｐＵＣ５８とｐＵＣ２４の解析を進めた。
個のうち少くとも４個のクローンは明らかに、クローン
の大きさと制限酵素部位に変化を起こしていた。これら
のクローンは、ｐＵＣ１９にサブクローンしてそれぞれ
をｐＵＣ４，ｐＵＣ２４，ｐＵＣ５８，ｐＵＣ９７とし
た（図３）。これらのことより得られたクローンについ
ては、かなり多様な組換えが起こっていると考えられた
のでさらにｐＵＣ５８とｐＵＣ２４の解析を進めた。
【００２１】まず、ｐＵＣ５８については、ｐＢＲ３２
２のどのあたりで組換えが起こっているのかを解析し
た。予備的実験でｐＢＲ３２２の４２９０近辺のＡａｔ
IIについては、その存在が確認されたのでその付近のプ
ライマーを合成し、塩基配列を決定した。その結果、ｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ直前の４３５５番目でオリジナ
ルとは、全く違う配列に変っていることが確認された。
２のどのあたりで組換えが起こっているのかを解析し
た。予備的実験でｐＢＲ３２２の４２９０近辺のＡａｔ
IIについては、その存在が確認されたのでその付近のプ
ライマーを合成し、塩基配列を決定した。その結果、ｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ直前の４３５５番目でオリジナ
ルとは、全く違う配列に変っていることが確認された。
【００２２】また、ｐＵＣ２４については、ＢＭＣ−se
quence内の制限酵素地図を作成した。その結果、ｐＵＣ
２４はＢＭＣ−sequence内のＨｉｎｄIII 近辺のＰｖｕ
II,ＳａｃＩ，ＳａｃIIが消失していることが確認され
た。さらにｐＵＣ２４のＨｉｎｄ III−ＸｂａI 断片を
ＤｒａI 消化の後、オリジナルのｐＢｍｈｓｃａｔをプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うと約
３００ｂｐの断片には、ハイブリダイズしなかった。そ
の故この部分は、オリジナルのプラスミドには存在しな
い領域と考えられたので、まず塩基配列を決定して両端
の部分のプライマーを合成してＰＣＲによる増幅をオリ
ジナル及びゲノムＤＮＡに対して行った。導入したオリ
ジナルのｐＢｍｈｓｃａｔでは、３００ｂｐの位置に増
幅されたＤＮＡは認められなかったが、培養細胞ｌ３０
ＴのＤＮＡでは増幅されたＤＮＡが認められた。この培
養細胞が由来するカイコの系統ｌ３０の後部絹糸腺ＤＮ
Ａでも同じ位置に増幅されたＤＮＡが認められた。しか
し別の遺伝的系統のカイコＰ２２では増幅されたＤＮＡ
は認められなかった。
quence内の制限酵素地図を作成した。その結果、ｐＵＣ
２４はＢＭＣ−sequence内のＨｉｎｄIII 近辺のＰｖｕ
II,ＳａｃＩ，ＳａｃIIが消失していることが確認され
た。さらにｐＵＣ２４のＨｉｎｄ III−ＸｂａI 断片を
ＤｒａI 消化の後、オリジナルのｐＢｍｈｓｃａｔをプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うと約
３００ｂｐの断片には、ハイブリダイズしなかった。そ
の故この部分は、オリジナルのプラスミドには存在しな
い領域と考えられたので、まず塩基配列を決定して両端
の部分のプライマーを合成してＰＣＲによる増幅をオリ
ジナル及びゲノムＤＮＡに対して行った。導入したオリ
ジナルのｐＢｍｈｓｃａｔでは、３００ｂｐの位置に増
幅されたＤＮＡは認められなかったが、培養細胞ｌ３０
ＴのＤＮＡでは増幅されたＤＮＡが認められた。この培
養細胞が由来するカイコの系統ｌ３０の後部絹糸腺ＤＮ
Ａでも同じ位置に増幅されたＤＮＡが認められた。しか
し別の遺伝的系統のカイコＰ２２では増幅されたＤＮＡ
は認められなかった。
【００２３】組換えを起こしたポジティブクローンは、
得られたクローンのうちの少くとも半分であり、ＢＭＣ
−familyの配列を利用することによってかなり効率よく
組換えを起こすことができると考えられる。さらにポジ
ティブクローンのうち３クローンではほとんどＢＭＣ−
sequenceの部分でのみ組換えが起こっている。ＢＭＣ領
域同志の特異的組換えの可能性について興味が持たれ
る。この組換えについては、得られたクローンの一部を
プローブとして導入に使用した最初のプラスミドに対
し、サザンハイブリダイゼーションを行ってもハイブリ
ダイズしないので、プラスミド同志の組換えの可能性は
低く、ゲノム内のＢＭＣ領域と組換えを起こした可能性
が大きいと判断される。さらにｐＵＣ２４は、ＰＣＲに
よる増幅の結果で明らかにゲノムとの組換えであると考
えられる。
得られたクローンのうちの少くとも半分であり、ＢＭＣ
−familyの配列を利用することによってかなり効率よく
組換えを起こすことができると考えられる。さらにポジ
ティブクローンのうち３クローンではほとんどＢＭＣ−
sequenceの部分でのみ組換えが起こっている。ＢＭＣ領
域同志の特異的組換えの可能性について興味が持たれ
る。この組換えについては、得られたクローンの一部を
プローブとして導入に使用した最初のプラスミドに対
し、サザンハイブリダイゼーションを行ってもハイブリ
ダイズしないので、プラスミド同志の組換えの可能性は
低く、ゲノム内のＢＭＣ領域と組換えを起こした可能性
が大きいと判断される。さらにｐＵＣ２４は、ＰＣＲに
よる増幅の結果で明らかにゲノムとの組換えであると考
えられる。
【００２４】本発明ではＣＡＴ遺伝子に代えてｔ−Ｐ
Ａ、ヒトインシュリンあるいはブリ成長ホルモン等の遺
伝子を用いることによって効率よくカイコ培養細胞のゲ
ノムＤＮＡにこれらの遺伝子をもつプラスミドを導入す
ることができる。
Ａ、ヒトインシュリンあるいはブリ成長ホルモン等の遺
伝子を用いることによって効率よくカイコ培養細胞のゲ
ノムＤＮＡにこれらの遺伝子をもつプラスミドを導入す
ることができる。
【図１】本発明の発現プラスミドｐＢｍｈｓＣＡＴの構
築の概要
築の概要
【図２】本発明の発現プラスミドｐＢｍｈｓＣＡＴの制
限酵素地図
限酵素地図
【図３】遺伝子導入によるゲノムとの組換え確認のため
にクローニングの制限酵素地図
にクローニングの制限酵素地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 菊地 美明 神奈川県横浜市中区南通４−43 協同飼料 株式会社研究所内 (72)発明者 前川 秀彰 東京都港区白金台５−19−３−401
Claims (5)
- 【請求項１】 プラスミドにプロモーター、抗生物質耐
性遺伝子、目的とする遺伝子産物をコードする遺伝子、
ターミネータ及びカイコのＢＭＣ−family遺伝子を組込
んでなる導入ベクター。 - 【請求項２】 プラスミドｐＢＲ３２２にショウジョウ
バエの熱ショック蛋白質遺伝子であるプロモーター、目
的とする遺伝子産物をコードする遺伝子、ＳＶ４０ウイ
ルスポリＡ付加領域であるターミネータ及びカイコのＢ
ＭＣ−family遺伝子を組込んでなる導入ベクター及びco
transfection用ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミ
ド 。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載される導入ベク
ターをカイコの培養細胞に組込んでなる遺伝子産物産生
性細胞。 - 【請求項４】 培養細胞がＢｍ−ｌ ３０Ｔ及びそのク
ローンである請求項３記載の細胞。 - 【請求項５】 請求項３または４に記載される細胞をＩ
ＰＬ４１培地で培養し、遺伝子産物を産生せしめ、これ
を採取することを特徴とする遺伝子産物の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03035353A JP3143933B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03035353A JP3143933B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261770A true JPH06261770A (ja) | 1994-09-20 |
| JP3143933B2 JP3143933B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=12439507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03035353A Expired - Fee Related JP3143933B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 導入ベクター、これを組込んだ細胞を用いて遺伝子産物を生産する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3143933B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003079365A (ja) * | 2001-09-07 | 2003-03-18 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 環境有害化学物質の高感度検出法 |
-
1991
- 1991-02-05 JP JP03035353A patent/JP3143933B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003079365A (ja) * | 2001-09-07 | 2003-03-18 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 環境有害化学物質の高感度検出法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3143933B2 (ja) | 2001-03-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |