KR20020043448A - 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

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KR20020043448A KR1020010076365A KR20010076365A KR20020043448A KR 20020043448 A KR20020043448 A KR 20020043448A KR 1020010076365 A KR1020010076365 A KR 1020010076365A KR 20010076365 A KR20010076365 A KR 20010076365A KR 20020043448 A KR20020043448 A KR 20020043448A
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Abstract

본 발명은 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 인간 인터루킨-2 (Human interleukin-2) 유전자를 포함하는 pMS/hIL-2 재조합 벡터, pMSG/hIL-2 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포주에 관한 것이다. 본 발명의 인간 인터루킨-2 재조합 단백질은 인터루킨-2 단백질의 생리학적 활성을 유지하여 암질환 뿐만 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 대하여 적용할 수 있다.

Description

인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법{RECOMBINANT PROTEIN HUMAN INTERLEUKIN-2 AND MANUFACTURING METHOD OF SAME}
본 발명은 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인간 인터루킨-2 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환주에 관한 것이다.
인터루킨-2(Interleukin-2 : hIL-2)는 항원에 의하여 자극을 받은 T 세포가 분비하는 림포카인(lymphokine)의 일종으로서, B세포와 T세포를 포함한 여러 면역 세포들의 성장과 활성화를 유도하는 물질이다.(Morganet al., 1976,Science193, 1000-1008) 사람의 인터루킨-2는 당단백질이고, 당쇄화(glycosylation) 정도에 따라 다양한 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다.(Conradtet al., 1985,Eur. J. Biochem. 153, 255-261)
초기에 hIL-2는 특정 T 세포를 장기간에 걸쳐 배양하는 데에 반드시 필요한 림포카인인 것으로 발견되었으며, 이어서 다양한 면역 작용을 조절하는 작용을 가지는 것이 규명되었다. hIL-2는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), NK(natural killer)세포, 활성 B 세포(activated B cell), 림포카인에 의한 활성 살세포(lymphokine activated killer(LAK) cell) 등의 면역 세포의 활성에 중요한 영향을 미치고, 감마-일터페론의 생성을 유도하는 것으로 확인되었으며, 작용기작은 hIL-2가 이들 세포 표면에 존재하는 특정 수용체에 결합하는 것으로 알려졌다.
최근에는 암 질환의 치료에 hIL-2를 적용하고 있는데, 특히, 신장 세포에 대하여 효과적이어서 20 % 가량의 신장암의 경우 종양의 완화를 보이는 것으로 알려져 있다. 이는 종양 세포에 특히 높은 활성을 보이는 LAK 세포로 인한 것으로 추측된다. 따라서, hIL-2는 암 질환 뿐 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가 면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 대하여 적용될 수 있다.
hIL-2 재조합 단백질의 생산은 재조합 단백질 기법이 도입되기 이전에는 사람이나 마우스, 쥐(rat) 등의 림포사이트(lymphocyte)를 활성화시킨 다음, 이로부터 매우 소량의 hIL-2를 분리하는 방법으로 이루어졌다.(Gilliset al., 1977,Nature268, 154-156; Farraret al., 1978,J. Immunol., 121, 1353-1360; Gilliset al., 1978,J. Immunol., 120, 2027-2033)
재조합 단백질의 발현은 크게 미생물을 이용한 방법과 동물세포를 이용한 방법으로 나누어 볼 수 있다. 먼저, 미생물을 이용한 방법으로 인간 인터루킨-2 단백질을 제조하여 다량 분리할 수 있다. 그러나 미생물 발현시스템에서 제조된 인터루킨-2 단백질은 당화되어 있지 않아 인터루킨-2 단백질 고유의 기능을 수행하지 못한다.(Devoset al., 1983,Nucleic Acid Res.11, 4307-4323 ; Lianget al.,1986,J. Biol. Chem. 261, 334-337 ; Wanget al., 1984,Science224, 1431-1433) 상기한 문제점은 미생물의 단백질 발현 및 단백질 변형 기작(당쇄화, 인산화, 아마이드화 등)과 동물세포에서의 기작간의 상당한 차이에 의한 것으로, 고등동물의 단백질이나 당쇄화되는 단백질을 제조하기엔 미생물 발현시스템이 적절하지 못함을 의미하는 것이다.
동물 세포는 동물단백질을 발현시킬 수 있는 가장 이상적인 발현시스템이지만, 높은 생산 단가와 어려운 조작 과정에 비하여 발현효율이 낮다는 점으로 인하여 쉽게 활용되지 못하고 있는 실정이다. 또한 동물 세포발현시스템은 미생물 발현 시스템과 달리 외래유전자를 숙주세포의 염색체로 삽입시켜 외래단백질을 발현하는 시스템이기 때문에 동물 발현시스템에서의 외래유전자 발현은 외래유전자가 삽입된 주변의 염기서열, 삽입된 외래유전자수(copy 수), mRNA 전사기작, mRNA의 안정성 등에 의하여 결정되며, 여러 가지 변수들에 의하여 고효율의 발현시스템으로 확립되기가 매우 어려운 실정이다.
인간 인터루킨-2 재조합 단백질을 COS 세포에서 발현하려는 시도가 있었으며 (Taniguchiet al., 1983,Nature, 302, 305-310), CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현되는 방법도 보고되었으나, 인간 인터루킨-2 재조합 단백질의 생성율이 7,200 - 21,000 U/ml/day에 머무는 수준이었으며,(Onomichiet al., 1987,J. Biochem. 102, 123-131) 동일한 MTX 농도에서 선별된 세포주들 사이에서도 hIL-2 생성율에는 상당한 차이가 나타나 안정된 발현시스템으로 확립되기엔 어려웠다.
따라서, 본 발명은 활성이 우수한 인간 인터루킨-2 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 현탁배양으로 다량의 인터루킨- 2 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 동물세포에서 인간 인터루킨-2 단백질을 다량으로 발현할 수 있는 재조합벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 다량의 인간 인터루킨-2 단백질을 발현하는 동물세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 pMS/hIL-2 벡터 또는 pMSG/hIL-2 벡터에서 발현되는 hIL-2 cDNA 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 pMSG/hIL-2 벡터의 제조모식도를 도시한 것이고,
도 3은 형질전환주의 염색체내 삽입된 hIL-2와 DHFR 유전자를 도시한 것이고,
도 4는 MTX 농도에 따라 선별된 형질전환주에서 발현되는 hIL-2 단백질을 웨스턴블롯으로 확인한 것이고,
도 5는 MTX 농도에 따라 선별된 pMSG/hIL-2 형질전환주에 대하여 hIL-2 유전자존재 유무를 서던블롯으로 확인한 것이고,
도 6은 pMSG/hIL-2 형질전환주에서 발현되는 전체 RNA에 대한 hIL-2 노던블롯을 실시한 것이고,
도 7은 1 uM MTX에서 선별된 다수의 pMSG/hIL-2 형질전환주들의 웨스턴블롯을 수행한 것이고,
도 8은 pMSG/hIL-2 형질전환주의 hIL-2 재조합 단백질 발현율을 ELISA 분석으로 결정한 것이고,
도 9는 hIL-2 재조합 단백질의 생리적 활성을 CTLL-2 세포의 성장을 통해 측정한 것이고,
도 10은 pMSG/hIL-2 형질전환주의 배양액을 2차원 전기영동한 것이고,
도 11은 현탁 배양 조건에서 pMSG/hIL-2 형질전환주의 생장과 hIL-2 발현을 분석한 것이고,
도 12는 hIL-2 재조합 단백질의 분리정제 과정이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인간 인터루킨-2(Human interleukin-2)유전자를 포함하는 pMSG/hIL-2 또는 pMS/hIL-2 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 pMSG/hIL-2 재조합 벡터 또는 pMS/hIL-2 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기에서 제조되는 서열번호 2의 인간 인터루킨-2 재조합 단백질을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 인간 인터루킨-2(Human interleukin-2; 이하 "hIL-2"라 함) 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 동물발현 벡터인 pMSG 또는 pMS에 인간 인터루킨-2 유전자를 삽입한 pMSG/hIL-2 벡터 또는pMS/hIL-2 벡터가 바람직하다. pMS 벡터는 KCTC 10203호로, 베타 글로빈 유전자의 MAR 인자(Nuclear matrix attachment region element) 역방향체를 포함하는 벡터이고, pMSG 벡터는 KCTC 10202호로, 상기 pMS 벡터에 SV40 바이러스의 poly-A와 가스트린(gastrin) 유전자의 전사종결인자 조합체를 더욱 포함하는 벡터이다.
본 발명의 pMSG/hIL-2 벡터 또는 pMS/hIL-2벡터에 삽입된 hIL-2는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.
도 1은 본 발명의 pMSG/hIL-2 벡터 또는 pMS/hIL-2벡터의 hIL-2 서열 및 아미노산 서열을 도시한 것으로, hIL-2 유전자의 전사 시작부분과 종결 부분을 나타내었다.
도 2는 본 발명의 pMSG/hIL-2 벡터 제조모식도를 나타낸 것으로, pMSG의 다수클로닝부위에 존재하는NheI 및BglII 제한효소부위에 hIL-2 cDNA를 삽입하여 pMSG/hIL-2 벡터를 제조하는 과정을 나타내었다. 또한 pMS/hIL-2 벡터의 제조방법도 pMSG/hIL-2 벡터제조방법과 동일하다.
또한 본 발명은 pMSG/hIL-2 벡터 또는 pMS/hIL-2 벡터로 형질전환되어 hIL-2를 발현하는 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 동물세포주가 바람직하다. 본 발명의 동물세포주는 삽입된 외래유전자 수에 비례하여 재조합단백질을 발현하는 안정된 발현양상을 나타낸다.
본 발명은 동물세포주 CHO DG44(KCLRF-BP-00036)를 제공한다. 본 발명의 CHO DG44(KCLRF-BP-00036)는 pMSG/hIL-2 벡터로 형질전환된 세포주로, 염색체내에 다수의 hIL-2 유전자를 포함하고 있으며, hIL-2 유전자를 안정하게 발현하여 10.2- 13.4 ㎍/ 106cell/ day 의 hIL-2를 발현한다. 기존의 보고된 IL-2 단백질 발현량은 2 ㎍/ml/day, 10,000 unit/ml/day 이하이며, 세포주 간의 발현율 차이가 크게 나타나고, 지속적인 발현을 유지하는 안정된 시스템으로 확립되지 못한 문제점이 있었지만 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하였다.
또한 본 발명은 동물세포를 현탁배양하여 hIL-2 재조합 단백질을 제조하는 시스템을 확인하였다. 현탁배양시 동물세포는 재조합 단백질의 발현을 장기간 유지할 뿐 아니라, 재조합 단백질의 대량 생산에 용이하다. 또한 무단백질 배지의 사용으로 인하여 재조합 단백질 산물의 수득, 정제가 용이하고, 동물체에서 유래될 수 있는 각종 감염에 대한 안정성이 높아지며, 이는 인체에 대한 의약품으로 이용될 때 커다란 장점으로 작용한다.
또한 본 발명은 hIL-2 재조합 단백질을 제공한다. 상기 hIL-2 재조합 단백질은 pMSG/hIL-2 벡터 또는 pMS/hIL-2 벡터에서 제조되는 것으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 분자량은 약 17 kDa으로 당쇄화된 단백질이다. 따라서, 본 발명의 hIL-2 재조합 단백질은 인터루킨-2 단백질의 생리학적 활성을 유지하여 암질환 뿐만 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 벡터의 제조
(1) 인간 인터루킨-2 유전자 클로닝
인간 인터루킨(human interleukine; 이하 hIL라 함)-2의 cDNA를 얻기 위하여 이 유전자의 특이적 발현 수준이 높은 것으로 알려진 Jurkat leukemia cell line을 이용하였다 (Taniguchiet al.,1983,Nature302, 305 - 310). 상기 세포주로부터 Tri-ReagentTM(Molecular Research Inc.)로 RNA를 추출하였고 추출한 RNA는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머와 TitanTMOne-Tube RT-PCR Kit(Boehringer Mannheim)을 사용하여, RT-PCR(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)하여 hIL-2 cDNA로 합성하였다. PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 25 ℃에서 1 시간동안 반응시켜 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터에 삽입한 다음 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 형질전환체는 X-gal이 포함된 배지에 평판배양하여 흰색을 띠는 콜로니로 선별한 다음, pGEM-T 이지 벡터에 삽입된 PCR 산물을 분리하고 약 450 bp의 DNA 절편의 염기서열을 확인하였다.
pGEM-T 이지 벡터에 삽입된 hIL-2는 38번째 아미노산인 류신의 코돈 가운데 G(guanine)가 T(thymine)로 치환되어 있었으나, 이는 해당 아미노산에는 아무런 변화를 가져오지 않았다. 재조합 hIL-2 cDNA은 153 아미노산 잔기로 구성되며 N 말단의 신호펩타이드 (아미노산 잔기 1 - 20)가 제거된 후에는 약 15.4 kDa의 분자량을 갖는다. 동물 세포로부터 발현된 단백질은 23 번째 트레오닌(threonine) 잔기에 당쇄가 첨가되며, 분자량이 17 또는 16.5 kDa인 것으로 알려져 있다.(Ferraraet al., 1987,FEBS Letters, 226, 47-52)
(2) 재조합 벡터 제조
상기에서 수득한 hIL-2 cDNA는 발현벡터 pMS(KCCM 10203) 또는 pMSG(KCCM 10202)에 삽입하기 위하여NheI 또는BglII 제한효소의 인식서열을 포함하는 프라이머(서열번호 5; 5'- CTAGCT AGCCAC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT G -3' 밑줄부분은NheI 인식 서열임, 서열번호 6; 5'- GAA GAT CTC AAG TCA GTG TTG AGA T -3' 밑줄친 부위는BglII 인식 서열임)로 PCR하였다. 또한 단백질 합성을 증가시키기 위하여 단백질 합성이 시작되는 첫 번째 코돈의 5' 상위에 Kozac 서열 (GCCACC)이 포함되도록 서열번호 5의 프라이머(5'- CTA GCT AGC CAC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT G -3')를 제조하였다.
발현 벡터 제조시 전사 종결 부위가 외래 유전자의 발현에 비치는 영향을 보기 위하여 두 가지 발현 벡터, pMS 및 pMSG를 사용하였다.
PCR 산물을NheI과BglII 제한효소로 처리하여 삽입체를 제조한 다음, 진 크린 키트(Gene Clean Kit, Bio 101)로 정제하였고, 도 2에 도시한 바와 같이NheI과BglII 제한효소로 처리한 pMSG(KCCM 10202)를 상기 삽입체와 접합하여 pMSG/hIL-2를 제조하였다. 상기와 동일한 방법으로NheI과BglII 제한효소로 처리한 pMS(KCCM 10203)를 상기 삽입체와 접합하여 pMS/hIL-2를 제조하였다.
실시예 2: 형질전환체 제조
(1) CHO 세포에 형질전환
pMSG/hIL-2 또는 pMS/hIL-2 플라스미드를 제한효소ScaI으로 처리한 다음CHROMA SPINTM(Clontech)로 정제하였다. 형질도입 하루 전에 2 x 106개의 CHO DG44 세포를 6 웰 플레이트에 접종하고, 10 % qualified FBS(fetal bovine serum), 리보뉴클레오사이드 및 디옥시리보뉴클레오사이드가 포함된 MEM-α(Minimum Essential Medium Alpha, GIBCO BRL)배지에서 배양하였다. pMSG/hIL-2(2 ug)와 pDCH1P(17 ng)를 100:1 비율로 Dosper(Boehringer Mannheim)와 함께 배지에 혼합하여 상온에서 40분 동안 반응시켰다. 이 때 DNA 1.5 ug 당 4 ug의 Dosper을 사용하였다. 상기 pDCH1P는 인간 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자가 선별표지로 삽입되어 있어 형질전환체를 쉽게 선별할 수 있다. 세포를 세척하고 혈청이 포함되지 않은 MEM- α배지로 교환한 다음 상기 혼합물을 배지에 첨가하여 6시간 반응시켰다. 다시 10 % FBS MEM- α배지로 교환하고, 2일 후 리보뉴클레오사이드 및 디옥시리보뉴클레오사이드가 포함되지 않은 MEM- α배지로 다시 교환하여 DHFR 유전자 발현에 대한 선별을 시작하였다. 약 2주간의 1차 선별을 거친 후 DHFR의 저해제인 MTX(methotrexate)를 10 nM과 50 nM로 배지에 첨가하여 배양하여 점차적으로 MTX 농도를 높이면서 DHFR 발현 수준이 높은 즉, 많은 수의 외래 유전자가 염색체내로 삽입된 동물세포주를 선별하였다. 도 3은 형질전환주의 염색체내 삽입된 hIL-2와 DHFR 유전자를 도시한 것이다.
(2) 형질전환주에서 hIL-2 재조합 단백질 발현확인
각각의 MTX 농도 단계에서 선별한 세포를 1 x 105개씩 48 웰 플레이트에 접종하여 100 ㎕의 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 배지 가운데일정량을 취하여 SDS-PAGE한 다음 니트로셀룰로우즈 막에 젤상의 단백질들을 이동시켰다.
웨스턴 분석을 실시하였다. 일차 항체는 hIL-2에 대한 토끼의 항체(Chemicon International Inc.)를 1:1000 비율로 희석한 것을 사용하였고, 이차 항체는 염소의 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Zymed Laboratories Inc.)항체를 1:5000 비율로 사용하였다. 또한 대장균에서 발현시킨 재조합 hIL-2(Chemicon International Inc.)를 파지티브 대조군으로 사용하여 형질전환주에서의 hIL-2 발현량과 비교하였다. 웨스턴 블롯 결과는 Enhanced ChemiLuminescent Detection System (Amersham Pharmacia Biotech Inc.)으로 분석하였다.
도 4는 MTX 농도에 따라 선별된 형질전환주에서 발현되는 hIL-2를 웨스턴블롯으로 확인한 것으로, 1과 2번 레인은 대조군으로 대장균에서 발현된 hIL-2 재조합 단백질을 각각 10, 50 ng 전기영동한 것이고, 3번 레인에서 9번 레인은 MTX 농도(10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 uM)에 따라 선별된 형질전환주를 48 시간 배양한 다음 7.5 ul의 배지를 전기영동한 것이다. 레인 7에서 9는 형질 도입 후 10, 50, 100 nM에서 각각 배양하고 2주 후 1000 nM로 높여 다시 배양한 것을 나타낸 것이다. MTX의 고농도에서 선별된 형질전환주는 다량의 hIL-2단백질을 발현하였고, 1 uM MTX 조건으로부터 분리된 세포주들은 약 5-10 ug/106cell/day를 발현하였다.
도 4의 상단은 pMSG/hIL-2로 형질전환된 동물세포주에서 발현된 hIL-2 단백질이고, 도 4의 하단은 pMS/hIL-2로 형질전환된 동물세포주에서 발현된 hIL-2 단백질을 나타낸 것으로, 두 가지 발현 벡터 pMSG/hIL-2(도 4, 상단)와 pMS/hIL-2(도 4, 하단)를 비교하였을 때 pMSG/hIL-2가 hIL-2의 발현에 훨씬 효과적임을 확인할 수 있었으며, 이는 pMSG에 포함된 전사 종결부위가 hIL-2 mRNA의 안정성을 높여 주기 때문으로 여겨진다.
또한 본 발명의 hIL-2 재조합 단백질이 대장균에서 발현된 hIL-2단백질에 비해 분자량이 더욱 큰 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 hIL-2 재조합 단백질이 동물세포발현 시스템에서 단백질의 당쇄화가 일어났음을 의미하는 것이고 또한 본 발명의 hIL-2 재조합 단백질의 형태 및 구조가 자연의 hIL-2와 유사한 것으로 예측할 수 있었다. 당쇄화는 hIL-2의 23번째 트레오닌 잔기에 NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuAc(α2-6)]GalAc 또는 NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)GalAc 구조에서 발생되는 것으로 알려져 있다.(Marcheseet al., 1990,J. Chromatography504, 351-358)
(3) 형질전환주 염색체내의 hIL-2 유전자의 확인
선별된 형질전환주는 GenomicPrepTM(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)으로 염색체 DNA를 추출한 다음, 제한효소ClaI과XhoI을 처리하였다. 15 ug의 DNA를 전기영동하여 HybondTM-N (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) 막으로 이동시키고, hIL-2 cDNA를 [α-32P]dATP로 표지한 프로브로 65 ℃에서 하이브리디제이션을 실시하였다.
도 5는 본 발명의 MTX 농도에 따라 선별된 pMSG/hIL-2 형질전환주에 대하여 hIL-2 유전자존재 유무를 서던블롯으로 확인한 것으로, 형질전환주 염색체를ClaI과XhoI으로 자른 후 hIL-2의 위치 및 양을 확인한 결과 450 bp 크기의 hIL-2 cDNA 절편을 확인할 수 있었다. 또한 각 형질전환주의 MTX 농도선별에 따라 형질전환주내의 hIL-2 유전자의 카피(copy)수가 많아졌음을 알 수 있었다. 이를 대조군으로 사용한 플라스미드의 양과 비교해 보면, 1 uM 의 MTX 에 대하여 저항성을 갖는 세포주는 약 200 카피의 hIL-2 유전자를 염색체에 가지고 있음을 알 수 있었다.
(4) 형질전환주의 hIL-2 mRNA 분석
Tri-ReagentTM(Molecular Research Inc.)으로 선별한 형질전환주의 전체 RNA를 추출하였다. 15 ㎍의 RNA를 젤상에 전기영동하였고, 그 외 실험은 서던블롯과 동일하게 수행하였다.
도 6은 본 발명의 pMSG/hIL-2 형질전환주에서 발현되는 전체 RNA에 대한 hIL-2 노던블롯을 실시한 것으로, 상단은 노던블롯 결과를 나타낸 것이고, 하단은 전기영동 후 젤상에 보이는 라이보좀 RNA를 나타내어 각 레인에 일정량의 RNA가 존재함을 확인한 것이다.
도 6에서는 MTX 농도별(10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 uM)로 선별한 형질전환세포에서 발현되는 hIL-2 RNA의 양을 확인할 수 있었으며, MTX의 고농도에서 선별된 형질전환주일수록 더욱 많은 RNA 발현양상을 나타내었다.
따라서, 도 4, 5 및 6은 세포의 염색체로 안정하게 삽입된 hIL-2 유전자의 숫자와 발현된 mRNA 및 단백질의 양 사이에 직접적인 비례 관계가 있음을 입증한다.
실시예 3: hIL-2 고발현 형질전환주 선별
고발현 형질전환주를 선별하기 위하여 1uM MTX에 대해 저항성을 갖는 32 개의 클로니(colony)를 분리하고, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
도 7은 1uM MTX에서 선별된 형질전환주들의 웨스턴 블롯을 수행한 것으로, 1번에서 12번까지의 형질전환주가 모두 hIL-2를 고발현함을 확인할 수 있었다. 이는 삽입된 외래 유전자의 발현 과정에서 주변의 염기서열로 인한 영향이 배제되어 각각 콜로니 사이의 편차가 크지 않은 발현 시스템임을 의미한다. 이 가운데 발현 효율이 높은 것으로 나타난 pMSG/hIL-2 형질전환주(8번)를 취하여 한국세포주 은행에 기탁하였으며, 기탁번호 KCLRF-BP-00036를 받았다.
실시예 4: hIL-2 재조합 단백질의 효율 및 특성 분석
(1) hIL-2 재조합 단백질의 발현양 결정
선별한 pMSG/hIL-2 형질전환주(KCLRF-BP-00036)에 의한 hIL-2 발현율을 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 방법으로 결정하였다.
OptEIATMHuman IL-2 Set (Pharmingen)을 사용하였으며, 이에 포함된 재조합 hIL-2를 대조군으로 하여 hIL-2 단백질량과 450 nm에서의 흡광도 사이의 연관식을 얻은 후, 적정 비율로 희석된 시료 내의 hIL-2 농도를 측정하였다. 플레이트의 각 웰을 먼저 캡쳐 항체(capture antibody)로 하룻밤 처리하고 세척한 다음, 대조군과 시료를 넣고 2시간 반응시켰다. 다시 세척한 후, 검출 항체와 반응시킨 다음 발색 반응의 기질을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 분석 결과는 도8에 나타내었으며, hIL-2 발현율은 10.2 - 13.4 ㎍/ 106cell/ day에 이르는 것으로 측정되었다.
(2) hIL-2 재조합 단백질의 활성 확인
hIL-2 재조합 단백질의 생리적 활성도는 IL-2 요구 세포주인 CTLL-2를 이용하여 측정하였다.
10 % FBS와 재조합 IL-2가 첨가되어 있는 RPMI 1640 배지에서 CTLL-2 세포를 배양한 후, RPMI 1640 배지로 세척하여 1 X 105/ ㎖ 의 농도로 현탁하였다.
형질전환 세포주의 배양 상층액을 희석하여 96 웰 플레이트에 50 ㎕씩 넣고 이어서 현탁한 CTLL-2 세포 50 ㎕ 및 0.5 μCi의 [3H]티미딘을 각 웰에 첨가하여 4시간 배양하였다.
세포내로 흡수되지 않은 티미딘은 세척하고, LSC(liquid scintillation counter)로 CTLL-2 세포의 방사능을 측정하였다. 일반적으로 사이토카인 활성 측정에서 EC50([3H]티미딘 흡수의 측정 최고치의 절반에 해당하는 값)을 나타내는 시료의 희석 배수를 활성의 단위(unit: U)로 정의한다.
도 9는 세포 배양액에 존재하는 hIL-2 재조합 단백질에 의한 CTLL-2 세포의 성장촉진효과를 나타낸 그래프로, 1번은 음성대조군이고, 2는 양성대조군으로 대장균에서 발현, 정제된 hIL-2 단백질이고, 3은 본 발명의 형질전환주의 배양 상층액이다. 도 9에서 배양 상층액내에 존재하는 hIL-2 재조합 단백질이 순수 정제된 대조군(대장균에서 분리한 hIL-2)과 유사한 활성을 가짐을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에서 얻어진 재조합 단백질이 암질환 및 면역질환 치료를 위한 의약적 용도로 쓰일 수 있음을 시사한다.
(3) hIL-2 재조합 단백질의 당쇄화 검증
형질전환주의 배양액을 시료로 하여 2차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis)을 실시하였다. 1차원 전기영동에서 단백질들은 고유의 등전점(isoelectric point) 위치로 이동하며, 다시 2차원 전기영동에서 분자량에 따라 분리된다. 따라서 따라서, 당쇄를 포함하는 단백질은 당쇄의 유형 및 정도에 따라 각각의 스팟으로 분리되어 나타난다.
형질전환주를 PF-CHO 배지(Hyclone) 에서 48시간 배양하여 상층액을 5 mM Tris-Cl(pH 7.5) 용액으로 투석한 후, 센트리콘(Amicon)으로 농축하였다. 농축한 단백질 100 ㎍(35 ㎕)과 리하이드레이션 용액(7 M Urea, 2 M Thiourea, 4 % CHAPS, 1 % DTT, 0.2 % Bio-lyte(40 %), 0.001 % BPB) 150㎕를 잘 섞은 후, IPG 스트립(pH 3-10, BioRad)에 두고, 50 V에서 12시간 동안 리하이드레이션하였다.
2차 전기영동은 프로테안 IEF 셀(PROTEAN IEF Cell, BioRad)과 레디스트립 IPG 스트립(ReadyStrip IPG Strip, BioRad)을 이용하여 수행하였다 (15분, 250V ; 2시간 30분, 250V → 8000V ; 4시간 30분, 8000V). 깨끗한 시험관에 스트립을 옮기고 평형완충액 Ⅰ(6 M urea, 2 % SDS, 0.375 M Tris-Cl(pH 8.8), 20 % glycerol, 130 mM DTT) 용액 10 ㎖을 넣어 30분 동안 처리하고, 새로운 시험관에서 평형완충액 Ⅱ(6 M urea, 2 % SDS, 0.375 M Tris-Cl(pH 8.8), 20 % glycerol, 135 mMiodoacetamide, 0.001 % BPB) 용액 10 ㎖을 다시 30분 처리하였다. 1 % 저융점 아가(low-melting agarose)를 사용해서 스트립을 12.5 % 프리케스트 젤(Criterion precast gel, BioRad) 위에 놓고 80 V로 2시간 30분 전기영동하였다.
도 10은 2차원 전기영동 젤을 은염색(a)한 사진 및 웨스턴 블롯 사진(b)을 나타낸 것으로, hIL-2 재조합 단백질이 당쇄화되어 있으며 이에 따라 여러 형태로 존재함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: hIL-2 재조합 단백질의 정제
(1) hIL-2 발현 세포주의 현탁 배양
T-75 플라스크에 2 × 106개의 세포를 접종하였다. 다음날 PBS 완충 용액으로 두 번 세척한 후, 1 uM MTX와 8 mM L-글루타민이 포함된 CD-CHO 배지(Gibco BRL) 10 ㎖을 첨가하여 배양하였다. 3일마다 CD-CHO 배지를 교환하면서 세포가 8~9×106개로 증가하면 배지를 제거하고 트립신을 처리하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 떼어냈다. 수거한 세포에 CD-CHO 배지 13 ㎖을 다시 첨가한 다음 14일 동안 배지를 추가하면서 배양상태를 유지시켰다.
상기 세포에 트립판 블루로 염색하여 생존 세포를 확인하였다.
상기와 같이 CD-CHO 배지에 적응시킨 세포를 250 ㎖ 스피너 플라스크에 넣고 70 rpm의 속도로 교반기 위에서 배양하였다. 새로운 배지를 추가하면서 현탁 배양 조건에 완전히 적응하도록 하였다.
도 11은 현탁 배양 조건에서 형질전환 세포주의 생장 속도(a)와 hIL-2 발현량(b)을 분석한 것으로, 도 11a의 가로축은 배양시간(일)을 나타내었고, 세로축은 생존세포 수를 나타내었다. 또한 도 11b에서 레인 1은 25 ng의 대조군 hIL-2(대장균에서 발현된 것), 레인 2는 부착배양시 수득한 배양액, 레인 3 내지 레인 9는 현탁배양 1일 내지 7일 동안 수득한 배양액이다. 도 11에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 형질전환주는 현탁배양으로 hIL-2 재조합 단백질을 과량 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라 부착배양 조건에서와 유사한 수준의 양을 계속적으로 발현시킬 수 있었다.
(2) hIL-2 재조합 단백질 정제
스피너 플라스크에 형질전환주를 1 × 106/ ㎖ 농도로 접종하여 48시간 배양하였다. 배양액 450 ㎖을 회수하여 5000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액에 시바크론 블루-아가로즈(Cibacron Blue-Agarose) 젤을 첨가하여 반응시켰다. 젤에 결합한 단백질은 20 mM 트리스 완충액(pH 7.5) 및 1 M NaCl 용액으로 용출시켰다.
용출 단백질을 PD-10 컬럼으로 탈염시키고, Q-세파로즈 HiTrap 컬럼(Amersham Pharmacia)에 주입하여 NaCl 농도구배(0-0.8M)로 단백질들을 용출시켰다. 용출된 각 분획은 SDS-PAGE한 후, 은 염색 또는 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
상기 분획들 중 hIL-2 단백질을 포함하는 분획들은 다시 탈염하고, SP-세파로즈와 블루-세파로즈 컬럼을 수행하여 hIL-2 단백질을 분리하였다.
도 12는 hIL-2 재조합 단백질의 정제과정 중 각 단계에서 수득한 시료를 전기영동 후 은염색으로 확인한 것이다. 레인 1은 사이즈마커이고, 레인 2는 대조군 hIL-2 단백질이고, 레인 3은 배양액이고, 레인 4는 시바크론 블루 아가로즈로 분리한 시료이고, 레인 5는 Q-세파로즈로 분리한 분획이고, 레인 6은 SP-세파로즈로 분리한 분획이고, 레인 7은 블루 세파로즈로 분리한 hIL-2 재조합 단백질이다. 최종 단계(도 12의 레인 7)에서 순수분리된 hIL- 단백질을 확인하였고, 대조군에 비하여 큰 분자량으로 당쇄화된 hIL-2임을 확인하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 pMSG/hIL-2로 형질전환된 동물세포주는 인간 인터루킨-2 재조합 단백질을 11.4 ug/ 106cell/ day의 생성율로 발현한다. 또한 본 발명의 인간 인터루킨-2 재조합 단백질은 인터루킨-2 단백질의 생리학적 활성을 유지하여 암 질환 뿐 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가 면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 인간 인터루킨-2(Human interleukin-2) 유전자를 포함하는 pMSG/hIL-2 벡터.
  2. 인간 인터루킨-2(Human interleukin-2) 유전자를 포함하는 pMS/hIL-2 벡터.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 형질전환체는 동물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 형질전환체는 pMSG/hIL-2 재조합 벡터로 형질전환된 CHO DG44(KCLRF-BP-00036)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  6. 상기 제 3항의 형질전환체로부터 발현되는 서열번호 2의 인간 인터루킨-2 재조합 단백질.
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