HU205384B

HU205384B - Process for increased expressin of human interleukin-2 in mammal cells

Info

Publication number: HU205384B
Application number: HU872102A
Authority: HU
Inventors: Bryan Richard Cullen
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1986-05-12
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1992-04-28
Also published as: AU7270387A; GB8711072D0; AU603576B2; SE8701934L; ATA263787A; AR241794A1; GB2190382B; FR2598433A1; HUT45558A; NZ220246A; BE1000717A5; GB2190382A; FR2598433B1; PT84849B; AT389892B; FI872096A; ES2012940A6; MC1821A1; DK234087A; SE8701934D0

Description

A rekombináns DNS-eljárások - amelyeket gyakran genetic engineering-nek neveznek - kifejlesztése a biológiai termékek széles körű választékának termelését tette lehetővé. A jelenlegi rekombináns DNS-eljárások során megfelelő DNS-hordozóba vagy vektorba specifikus DNS-szekvenciákat illesztenek be, ily módon a gazdasejtekben replikálódni képes rekombináns DNSmolekulákat képezve. Vektorként gyakran használnak kör alakú kettős szálú DNS-molekulákat és az ilyen rekombináns DNS előállítása során olyan restrikciós endonukleáz enzimeket alkalmaznak, amelyek a DNS-t specifikus bázis szekvencia helyeken hasítják. A fenti rekombináns DNS-molekulák készítését Cohe és tsai (4 237 224 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Collins és tsai (4 304 863 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és Maniatis és tsai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory] írták le.

A rekombináns DNS-molekulák csak számos feltétel teljesülése esetén alkalmazhatók a beillesztett génszekvencia által kódolt termékek készítésére. Első számú követelmény, hogy a rekombináns molekula a gazdasejttel kompatibilis és ezáltal a gazdasejtben autonóm replikációra képes legyen. Az utóbbi időben sok közleményben gazda organizmusként az Escherichia coli (E.coli) baktériumot használják, minthogy ez a baktérium a rekombináns plazmidok széles körével kompatibilis. A rekombináns DNS-molekulát a felhasznált vektor/gazdasejt rendszertől függően transzformáció, transzdukciő vagy transzfekció segítségével viszik be a gazdasejtbe.

A rekombináns vektor beillesztése a gazdasejtbe önmagában még nem biztosítja szignifikáns mennyiségű kívánt genetikus tennék keletkezését. Ennek biztosítása céljából az idegen génszekvenciát a vektor területével megfelelő kapcsolatban fuzionálni kell. Alternatív módon az idegen DNS magával hordozhatja saját promotorát abban az esetben ha azt a gazdasejt felismeri. A promotor - eredetétől függetlenül - olyan DNS-szekvencia, amely a kifejezendő idegen génhez viszonyítva „felfelé” vagy más szóval 5’ irányban helyezkedik el. Ez a szekvencia irányítja az RNS-polimeráz kötődését és ezáltal „elősegíti” a DNS-nek a messenger RNS-sé (mRNS) történő transzkripcióját.

Nagy mennyiségű mRNS-t biztosító erős „elősegítés” esetében a kívánt géntermék termelése attól függ, hogy az mRNS transzlációja a fehérjévé mennyire hatékony. Ez pedig az mRNS-hez való riboszomális kötés hatékonyságától és az mRNS-nek a gazdasejten belüli stabilitásától függ. Eukariőta sejtekben a transzlációs hatékonyságot szabályozó faktorok működése gyengén érthető ugyan, azonban úgy tűnik, hogy a transzlációt iniciálé AUG kodont körülvevő kedvező nukleinsavszekvenciát tartalmaznak [Kozák, Cell 44,283 (1986)]. Az mRNS stabilitását befolyásoló, a prokarióta és eukariőta sejtek által egyaránt gyengén figyelembe vett faktorok szintén döntő jelentőségűek az előállítható fehérje mennyisége szempontjából.

A rekombináns DNS-területen mind ez ideig végzett legtöbb munka bakteriális kifejezőrendszerek (pl. ExoIi) felhasználására irányul. A baktériumsejtek alkalmazása azonban számos nemkívánatos körülménnyel és hátránnyal jár. így pl. az Exoliban tennelt legtöbb fehérje és polipeptid a periplazmikus térben felhalmozódik. E génteimékek kinyeréséhez a sejtek széttörésére van szükség, ez az eljárás azonban nem hatékony és komoly tisztítási nehézségeket okoz, minthogy a kívánt terméket az Exoli számos más sejtkomponensétől meg kell tisztítani. Ezenkívül a baktériumok sok érdekes géntermék szintéziséhez szükséges glikozilezést nem képesek elvégezni. A baktériumok továbbá számos eukariotikus fehérje megfelelő konformációja és biológiai aktivitása szempontjából esszenciális jelentőségű specifikus diszulfidkötések kialakítására nem képesek.

A bakteriális kifejezőrendszerek fenti hiányosságainak kiküszöbölése céljából a genetikai engineering szakembereinek figyelme fokozott mértékben arra irányul, hogy rekombináns DNS-molekulák kifejezésére eukariotikus gazdasejteket alkalmazzanak. Sejtek (pl. élesztő- és emlős sejtek) a kívánt génteimékeket a tenyészközegben kí tudják választani és esszenciális glikozilezési eljárások elvégzésére is képesek. Ennek ellenére azonban emlős sejtek felhasználása klónozásra és rekombináns DNS-molekulák kifejezésére számos leküzdendő műszaki akadályt jelent. így pl. a baktériumokban olyannyira hasznosnak bizonyult endogén plazmidok magasabb eukariőta sejtekben nem replikáidnak. Következésképpen más megközelítésekre van szükség.

Egy ilyen megközelítés szerint alacsonyabb rendű eukariőta élesztőt (Saccharomyces cerevisiae) alkalmaznak, amely ugyanolyan könnyen tenyészthető és manipulálható, mint az Exoli. Élesztő klónozó rendszerek is rendelkezésre állnak. Afenti rendszerek segítségével humán interferon gént hatékonyan kifejeztek élesztőben [Hitzeman és tsai: Natúré (London) 293, 717 (1981)]. Az interferon gének azonban nem tartalmaznak intronokat. Minthogy azt találták, hogy az élesztősejtek legalább egy, intronokat tartalmazó heterológ emlős gént — nevezetesen nyúl β-globin gént [Beck és tsai: Natúré (London) 283, 835 (1980)] - nem írnak helyesen át, élesztőnek emlős gének kifejezésére gazdaként történő felhasználása során az íntronok jelenlétét vagy távollétét figyelembe kell venni.

Másik megközelítés szerint idegen géneket közvetlen felvétellel illesztenek az emlős sejtekbe. Ezt pl. a klónozott gének kalcium-foszfátos együttes kicsapásával végzik el; az eljárás során általában a sejtek kb. 1-2%-a indukálható DNS felvételére. Az ilyen alacsony felvételi szint azonban a kívánt géntermék csupán nagyon alacsony kifejezési szintjét eredményezheti. Timidin-kináz gén deficiens emlős sejtek (tk‘ sejtek) esetében jobb eredmények érhetők el oly módon, hogy a tk-génnel együttes transzformációt alkalmaznak, majd a tenyésztést szelektív körülmények között végzik. Ik‘ sejtek HAT (hipoxantin-aminopterin-piridin) közegben nem növekednek. Ezek a sejtek elvesztett enzimatikus aktivitásukat oly módon képesek visszanyerni, hogy kalcium-foszfátos együttes lecsapással a tk-géneket (pl. herpes simplex virális DNS) tartalmazó

HU 205 384 Β exogén DNS-t vesznek fel. A tk DNS-hez kovalens kötéssel ligáit vagy csupán hozzákevert más DNS-molekulákat a sejt ugyancsak felvesz és gyakran együttesen ki is fejez [lásd: Schangos és tsai., Gene 14, 1 (1981)].

Harmadik megközelítés szerint idegen géneknek emlős sejtekbe történő beiktatására vektorként virális genomokat (génkészlet) alkalmaznak. így leírták a Simian-vírus 40, papilloma-vírus és adeno-vírus genom alapú vektorokat. [Lásd P. W. J. Rigby, „Expression of Cloned Genes in Eukaryotic Cells Using Vector Systems Derived from Viral Replicons”, Genetic Engineering, 3. kötet; R. Williamson, ed., Academic Press, New York, (1982) 83-141, mint összefoglaló mű]. E vektoirendszerek hátránya a korlátozott gazdasejttartomány. Ezenkívül a virális replikáció ezekben a rendszerekben a gazdasejt elhalásához vezet. Retrovírus DNS-kontrollelemek alkalmazása ezen virális vektorrendszerek sok hátrányát csupán elkerüli. Gorman és tsai [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79. 6777 (1982)] kimutatták, hogy pl. A Rous sarcoma vírus hosszú terminális ismétlődése (LTR) erős promotor és DNS által közvetített transzfekciő segítségével különféle sejtekbe (beleértve CV-1 majomvesesejteket, csirkeembrió fibroblasztokat, kínai hörcsög petefészeksejteket, HeLa-sejteketés egér NIH/3T3 sejteket) beépíthető.

Az 5’ és 3’ nem kódoló szekvenciák - azaz a gén kódoló szekvenciája előtt, illetve után közvetlenül elhelyezkedő szekvenciák - által végzett génkifejezés szabályozását bizonyítja az onkogének és magasabb rendű eukariotikus sejtek mRNS-einek tanulmányozása. Megfigyelték, hogy a fenti szekvenciák kiküszöbölése vagy módosítása ezekben a sejtekben a génkifejezésre hatást gyakorol. így pl. Treisman [Cell 42, 889 (1985)] tanulmányozta a klónozott humán c-fos génnel (FBJ rágcsáló osteosarcoma vírus által hordozott onkogén celluláris homológja, amelyet c-fos^H-nak neveznek) transzfektált (átfertőzött) egér fibroblaszt szérummal történő stimulálása után a c-fos RNS akkumulációját. E sejtek szérummal történő stimulálása a c-fos mRNS erős, azonban csupán átmeneti növekedését idézi általában elő, amely maximumát 10-15 perc után éri el, majd gyorsan csökken és a stimulálás előtti szintet az mRNS gyors lebomlása miatt 1-2 órán belül éri el.

Ha a c-fos¹¹ 5’ szegélyező szekvenciákat normál cfos^H 3’ szegélyező szekvenciák távollétében fuzionáljuk heterológ génekhez, a keletkező gének szérumfaktorok által még indukálhatók, azonban az ily módon termelt mRNS a szérummal történő stimulálás után 4 óráig megmarad. Hibrid transzkripciós egységekkel végzett kísérletek azt mutatják, hogy csupán a c-fos^H 3’ végeit és a 3’ nem kódoló tartományt tartalmazó gének mutatják az mRNS tipikus gyors lebomlását stimulálás után. Lehetséges tehát, hogy a c-fos 3’ szekvenciák destabilizálják az azokat tartalmazó RNS-t. E szekvenciák kiküszöbölése vagy módosítása tehát kedvezően befolyásolhatja a génkifejezést.

Simcox és tsai [Mól. Cell. Bioi. 5, 3397 (1985)] a Drosophila melanogaster hő által sokkolt fehérjerendszert vizsgálva további bizonyítékokat találtak a 3 ’ nem kódoló szekvenciák szabályozó szerepére. A növekedési hőmérsékletet szobahőmérsékletről 37 °C-ra növelve a Drosophila melanogaster gyorsan számos „hővel sokkolt” fehérjét termel, amelyek között található a hsp 70 nevű főfehérje. A hőmérséklet eltolódása fokozott RNS-termelést idéz elő. A hőmérsékletet a szokásos növekedési hőmérsékletre visszaállítva a hsp 70 gén transzkripciója gyorsan represszálódik és a megfelelő mRNS-szintje gyorsan csökken és ezáltal a hsp 70 fehérje további termelése gyorsan befejeződik. Simcox és tsai azonban azt találták, hogy a 3’ szekvenciák törlése a hsp 70 fehérjeszintézisnek a hősokk megszüntetés utáni gyors represszióját késlelteti és ez arra utal, hogy a 3’ szekvenciák a hőmérséklet csökkentése után normálisan destabilizálják a hsp 70 mRNS-t.

Bizonyítékokat találtak továbbá arra nézve, hogy az mRNS az 5’ nem kódoló szekvenciák terén is szabályozó szerepet tölt be. Butnick és tsai [Mól. Cell. Bioi. 5, 3009 (1985)] kimutatták, hogy a humán c-myc gén (madár myelocytomatosis vírus onkogén celluláris homológja) kb. 550 nukleotidot tartalmazó 5’ nem kódoló szekvenciája (elnevezés: exon-1) befolyásolja a fenti gént tartalmazó plazmidok kifejezését eredet-defektív Simian-vírus 40-nel transzformált CV1 majomvesesejtekben (ún. COS sejtekben). Olyan plazmidokból származó átiratok, amelyekben a c-myc gén 5’ nem kódoló szekvenciája törölt, magasabb állandó szinten vannak jelen, mint az érintetlen (intakt) gént magukban hordozó plazmidok esetében és ez azt jelzi, hogy az 5’ nem kódoló szekvenciák bizonyos módon destabilizálják a megfelelő mRNS-t.

Másik tanulmányban Rabbitts és tsai [EMBO J. 4, 3727 (1985)] kimutatták, hogy az exon-1 tompítása a c-myc génekből fokozza a c-myc mRNS stabilitását COLO 320 sejtekben. Hasonlóképpen Eick és tsai [EMBO J. 4, 3717 (1985)] igazolták, hogy a Burkittféle lymphoma sejtekben termelt c-myc mRNS-ek sokkal stabilabbak, ha a megfelelő c-myc gén exon-l-ben transzlokációt tartalmaz.

A fenti referátumok arra utalnak, hogy különféle gének 5’ és 3’ nem kódoló tartományai bizonyos úton a fenti génekből átírt megfelelő mRNS instabilitását idézik elő. E nem kódoló tartományok törlése vagy megváltoztatása ezekben az esetekben az mRNS stabilitását növeli és ezáltal a génkifejezés össz-szintjét fokozza.

Ennek ellenére az ilyen nem kódoló szekvenciák módosításának vagy törlésének a génkifejezésre gyakorolt hatása nem jósolható meg bizonyossággal. így pl, Johansen és tsai [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7698 (1984)] megváltoztatta az 5’ nem kódoló vezető (leader) tartomány hosszát egy Escherichia coli galactokináz (galK) génnel fuzionált génkontroll elemeket tartalmazó rekombináns vektorrendszerben. A nem kódoló tartomány hosszának változtatása nem befolyásolja a galK kifejezést. Hasonlóképpen Katz és tsai [Moll. Cell. Bioi. 6, 372 (1986)] madár retrovírus mRNS 5’ nem transzlatált vezetőjében törléseket és helyettesítéseket egyaránt végrehajtottak. Ezek a törlések és helyettesítések általában az env gén kifejezésének lénye3

HU 205 384 Β ges csökkenését idézték elő. A kifejezés fent említett csökkenése azonban nem az mRNS-molekulák száma csökkenésének tudható be. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy a nem kódoló tartományokban bekövetkezett változások transzlációs hiányosságot okoztak és ez a kifejezés általános csökkenéséhez vezetett.

Az iníerIeukin-2 QL-2) oldható fehérje, amely a lymphocyta reaktivitás modulálására és az antigén-specifikus T-Iymphocyták in vitro tenyészeteinek hosszú távú elősegítésére képes. A múltban az IL-2-t elsősorban tenyésztett mitogének által stimulált emlős sejtek felülúszóiból izolálták. így pl. Margan és tsai [Science 193,1007 (1976)] és Ruscetti és tsai [J. Immunoi. 119, 131 (1977)] az IL-2-t normál phytohaemagglutinin (PHA) által stimulált humán lymphocyták összegyűjtött felülúszóiból nyerték ki, míg Gillis és tsai [Natúré 268,154 (1977)] concanavalin A által stimulált normál DBA/2 egérlépsejteket használtak fehérjeforrásként. Ennél frissebb publikációban Stem indukált rosszindulatú humán sejteknek IL-2 forrásként történő alkalmazását írta le (4 490 289 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Erőfeszítések történtek IL-2 előállítására rekombináns DNS-metodika felhasználásával. így pl. Taniguchi és tsai [Natúré 302, 305 (1983)] leírták Jurkat-leukémia sejtvonalból nyert messenger RNS-ből készített és humán IL-2 kódolására alkalmas kiegészítő (komplementer) DNS (cDNS) szekvencia analízisét, klónozását és kifejezését. Az IL-2 kifejezését Taniguchi és tsai tenyésztett majom COS sejtekben végezték el, bár a szerzők kijelentették, hogy az IL-2 kifejezésénél rekombináns DNS-vektor alkalmazása E.coliban folyamatban van és az E.coli rendszerből rövid időn belül lehetőség nyílik IL-2 nagy mennyiségben történő előállítására. Az IL-2 a sejtben 153 aminosavból álló prekurzor polipeptid alakjában szintetizálódik. A sejtből való kiválasztáskor 20 aminosav hosszúságú szignálpeptid-szekvencia hasad le. Az érett IL-2 a sejtekből 133 aminosavból álló polipeptid alakjában válik ki. Az érett IL-2-nek E.coliban való kifejezéséhez az IL-2-t kódoló gén szignálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvenciát rekombináns DNS-metodikával le kell hasítani, mivel az E.coli nem képes az eukariotikus szignálpeptid-szekvenciák lehasítására.

Rosenbeig és tsai [Science 223,1312 (1984)] ugyancsak kifejezték az IL-2-t E.coliban, éspedig a Jurkat-sejtvonalból izolált gén felhasználásával. Újabban Souza és tsai (Al 136 489 sz. európai szabadalmi bejelentés) leírták az érett IL-2 aminosav-szekvenciáját és tulajdonságait tartalmazó polipeptidet kódoló szerkezeti géneket tartalmazó, kémiailag szintetizált DNS-szekvenciák klónozását és kifejezését mikroorganizmusokban. Souza és tsai továbbá leírták szintetikus gének felhasználását olyan IL-2 analógok termelésére, amelyek a természetes IL-2-től az aminosav-szekvenciában különböznek. Souza és tsai szabadalmi bejelentésének példáiban gazdaszervezetként E-colit alkalmaznak.

Barr és tsai [85/02200 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés] nemrégen kémiailag szintetizált humán IL2 gén klónozását és kifejezését írták le, élesztőben.

Találmányunk tárgya humán interleukin-2-t (HIL-2) kódoló DNS-szekvencia és HIL-2-t kódoló gént tartalmazó szignálpeptid-szekvencia és szignálpeptid-szekvencia, amelyben a gén 5’ nem kódoló szekvenciáit heterolőg 5’ nem kódoló szekvenciák (pl. patkány inzulin gén, előnyösen patkány preproinzulin H gén szekvenciák) helyettesítik.

Találmányunk körébe tartozik továbbá a szignálpeptid-szekvenciát kódoló szubszekvencia szomszédos nukleotidjainak megfelelő heterolőg szekvenciákkal való helyettesítése, azaz a fent említett heterolőg 5’ nem kódoló szekvenciákkal szomszédos szignálpeptidszekvenciát kódoló szubszekvencia nukleotidjaival történő helyettesítése. A szignálpeptid-szekvenciát kódoló szubszekvencia nukleotidjainak helyettesítése esetében ügyelni kell a HIL-2 gén olvasókeretének megtartására.

Találmányunk továbbá a fentiekben meghatározott DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorokra és ilyen DNS-szekvenciát vagy azt magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtekre vonatkozik.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás humán interleukin-2 előállítására.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás humán interleukin-2 kifejezésére képes emlős sejtek előállítása.

A HIL-2 gén kifejezése meglepően magas szintjét kapjuk olyan új klónozó és kifejező vektorok felhasználásával, amelyekben a természetes 5’ nem kódoló szekvenciákat és a HIL-2 gén szignálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvencia első négy ATG T nukleotidjét patkány inzulin génből származó heterolőg szekvenciák helyettesítik, éspedig a patkány preproinzulin H szignálpeptid- szekvenciáját kódoló szubszekvencia ATG GCC CTG TGG ÁTC G nukleotidjai. A HIL-2 szignálpeptid N-terminális létrejött módosítások nem befolyásolják a termelősejtek érett HIL-2 polipeptid kiválasztását, minthogy a szignálpeptid az érési folyamat alatt lehasad.

Találmányunk jobb megértése céljából a kísérőábrákra hivatkozunk.

Az 1. ábrán a pBC12MI plazmidoL a HIL-2 kifejező vektor felépítésének kiindulási vektorját sematikusan ábrázoljuk.

A 2. ábrán az új szignálpeptid N-terminális szerkezetét a pBC12/RSV/IL-2 plazmidban és a plazmid felépítésénél felhasznált inzulin és HIL-2 szekvenciák szerkezetét mutatjuk be. A specifikus restrikciókat és ligációs helyeket aláhúztuk.

A 3. ábrán a végső IL-2 kifejező vektort pBC12/RSV/IL-2/dhff - vázlatosan tüntetjük fel.

A 4. ábrán a pBC40 plazmidról hely specifikus mutagenezissel a pBC40AT felépítéséhez eltávolított nukleotid-szekvenciát mutatjuk be. Az aláhúzott szegmensek az új Hindin helyett létrehozó törléshez felhasznált 24 mer prímért ábrázolják.

A találmányunk tárgyát képező eljárás az alábbi lépések logikus szekvenciájából áll:

1. HIL-2-t kódoló DNS-szekvencia és szignálpeptidszekvencia elkészítése.

HU 205 384 Β

2. 5’ nem kódoló szekvenciák és adott esetben a szignálpeptid-szekvenciát kódoló szubszekvencia szomszédos nukleotidjainak helyettesítése megfelelő szekvenciákkal, előnyösen patkány preproinzulin II gén szekvenciákkal, a HIL-2-t kódoló tartomány leolvasókeretének megtartása mellett.

3. Az új DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektor átvitele a megfelelő emlős gazdasejtbe.

4. Új HIL-2 gén amplifikációja és a módosított emlős gazdasejtek szelektálása.

5. A termelt HIL-2 azonosítása és tisztítása.

A leírásban használt „humán interleukin-2” vagy „HIL-2” kifejezésen a fentiekben meghatározott DNSszekvencia vagy valamely módosulata által transzformáit vagy átfertőzött emlős sejt által termelt glikozilált fehérje értendő. A DNS-szekvencia által kódolt fehérje

a) olyan aminosav-szekvenciával rendelkezik, amely a természetben előforduló (natív) humán interleukin-2 aminosav-szekvenciájával legalább lényegében azonos és

b) a természetben előforduló (natív) humán interleukin-2 biológiai aktivitásának megfelelő hatással rendelkezik.

Az aminosav-szekvenciák lényegében véve azonos volta azt jelenti, hogy a szekvenciák vagy azonosak vagy csupán egy vagy két olyan aminosav-változtatásban (törlések, addíciók vagy helyettesítések) különböznek, amelyek a szintetikus fehérje és natív humán interleukin-2 között funkcionális eltérést nem okoznak.

A fenti fehérjék példáiként a 82307036.2 és 83101035.0 sz európai szabadalmi bejelentésekben és a 4 518 584 és 4 569 790 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett interleukin-2 molekulákat említjük meg. Ezeket az interleukin2 polipeptideket bakteriális rendszerek érett formában termelik.

A humán interleukin-2-t kódoló DNS-szekvencia és szignálpeptid-szekvencia a gyakorlatban általánosan használt bármely módszerrel előállítható. így pl. HIL-2 szintetizálására alkalmas humán sejtvonal stimulálható és felhasználásával HIL-2 mRNS készíthető, amely HIL2 cDNS készítéséhez sablonként szolgálhat. Rosenbeig és tsai [Science 223,1412 (1984)] a fenti cDNS készítéséhez humán leukémia T-sejtvonalakat és normál humán perifériális vér lymphocytákat alkalmaztak. Taniguchi és tsai [Natúré 302,305 (1983)] ugyanerre a célra humán leukémiás T-sejteket használtak.

Alternatív módon minthogy Taniguchi és tsai leírták a nukleotid-szekvenciát, a HIL-2-t kódoló DNS-szekvencia és egy szignálpeptid-szekvencia a foszfotriészter felhasználásával vagy más módon - előnyösen szilárd fázisú rendszerben - kémiailag szintetizálható. Egy ilyen kémiai szintézist Souza és tsai is leírták (Al 136 489 sz, európai szabadalmi bejelentés), Bair és tsai [WO 85/02200 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés] viszonylag kis oligonukleotidok szintetizálása, majd ezek összekapcsolása (ligálása) útján szintén előállítottak HIL-2 géneket. További módszer segítségével genomikus DNS a HIL-2 termelésére képes emberi sejtekből izolálható. A HIL-2 gének standard hibridizációs módszerekkel, nyilvánosságra hozott HIL-2 gén szekvencián alapuló jelzett DNS-minta felhasználásával azonosíthatók.

A jelen találmány előnyös foganatosítási módja szerint a humán interleukin-2-t kódoló cDNS-szekvencia és szignálpeptid-szekvencia forrásaként olyan pIL-22b plazmidot alkalmazunk, amely a HIL-2 459 bázispár teljes kódoló tartományában az 5’ nem transzlatált szekvencián 31 bázispárral és a 3’ nem transzlatált szekvencián 309 bázispárral szegélyezett cDNS-kópiát tartalmaz.

A fenti HIL-2 cDNS-másolatnak a pIL-2-2b plazmidba való klónozását Smith és tsai írták le [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8404 (1985)]. A HIL-2 gén klónozásához felhasznált módszer eredményeként a cDNS-t homopolimer G-C szekvenciák szegélyezik, a BamHI helyeket követően.

Az 5’ nem kódoló szekvenciák és adott esetben a HIL2 szignálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvenciák szomszédos nukleotidjainak helyettesítését és a keletkező DNS-szekvenciának a megfelelő kifejező vektorba való beillesztését könnyen végezhetjük el abban az esetben, ha a szükséges DNS-szekvenciák és klónozó vektorok szélvágásához ugyanazt vagy ugyanazokat a restrikciós enzimet vagy enzimeket alkalmazzuk, minthogy ezáltal a kiegészítő DNS-végcsoportokat tartalmazó fragmensek keletkeznek és ezek egymással könnyen ligálhatók. Ha ez nem valósítható meg, szükség lehet a vágási végek módosítására (pl. egyszálas DNS-ek visszaemésztése tompa végek kialakítása céljából). Ugyanez az eredmény oly módon is elérhető, hogy az egyszálas végcsoportot a megfelelő DNS-polimerázzal (pl. a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével) feltöltjük. A tompa végeket ezután enzimatikusan ligálhatjuk, pl. T4 DNS-ligáz felhasználásával.

A HIL-2 génnek a vektorba való beillesztéséhez bármely kívánt kombinált hely is kialakítható a nukleotid-szekvenciáknak (kötőelemek) a DNS-végcsoportokra való ligálása útján. Ezek a kötőelemek a restrikciós helyek felimserő szekvenciáit kódoló specifikus oligonukleotid-szekvenciákat tartalmazhatnak. A hasított vektor és a HIL-2-t kódoló módosított DNS-szekvencia homopolimer farokképzéssel is módosítható [lásd: Morrow: Methods inEnzymology 68, 3 (1979)].

, A találmány megvalósítása során a HIL-2 gén összes 5’ nem kódoló szekvenciáját a patkány preproinzulin II gén megfelelő szekvenciáival kell helyettesíteni. Lehetőség van továbbá arra, hogy a HIL-2 gén szomszédos kódoló szekvenciáinak néhány nukleotidját töröljük, minthogy ezek a szekvenciák kódolják azt a szignálpolipeptidet, amely a HIL-2 gén beillesztésének és kifejezésének helyéül szolgáló gazdasejtben az érés alatt utólag lehasad. Természetesen a kódoló szekvenciák túl nagy méretű tartományának törlése a szignálpolipeptid funkciót megszüntetheti és ezáltal beavatkozna a termelt HIL-2-nek a sejtekből való megfelelő kiválasztásába.

Találmányunk egyik előnyös kiviteli alakja szerint a kifejezés hordozója és a patkány preproinzulin Π génszekvencia forrásának egyaránt a pBC12MI jelzésű

HU 205384 Β eukariőta kifejező vektort alkalmazzuk. Az 5’ nem kódoló tartományok helyettesítése azután következik be, hogy a HIL-2 gént (amelyben a természetes 5’ nem kódoló tartományt és a kódoló szekvencia első négy nukleotídját töröltük) a pBC12MI vektorba a patkány preproinzulin Π gének megfelelő szekvenciáival juxtapozicióban beiktattuk.

A pBC12MI vektor hasonló a Butnick és tsai által részletesen leírt [Mól. Cell. Bioi. 5, 3009 (1985)] pBC12BI eukariotíkus kifejező vektorhoz. Ez a vektor a pBR322-leszármaztatott pXf₃ plazmidvektoron alapul [Hanahan, J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)] és egy SV40 őri tartományt és Rous Sarcoma vírus [Cullen és tsai: Natúré 307, 241 (1984)] hatékony hosszúságú terminális ismétlődő (LTR) promotorát és patkány inzulin H gén [Lomedico és tsai: Cell 18, 545 (1979)] genomikus másolatát is tartalmazza. Az alábbiakban ismertetésre kerülő felépítésben felhasznált pBC12MI vektor azonos a pBC12BI vektorral, azzal az eltéréssel, hogy a benne levő LTR fragmens a 3’ irányban további 70 bázispárral terjed ki (lásd 1. ábra). Ez a különbség azonban nem befolyásolja a vektor által kódolt gének kifejezési szintjét.

Természetesen egy olyan IL-2 gén, amelyben az 5’ nem kódoló tartományt és az iniciáló kodont már korábban a patkány inzulin génből származókkal helyettesítettük, előállítható oly módon is, hogy először DNS-rekombinációt, vagy közvetlen kémiai szintézist alkalmazunk és a második lépésben a megfelelő vektorba beillesztjük.

A jelen találmányunk szerint emlős sejtekben történő felhasználásra például az alábbi kifejező vektorok alkalmazhatók: pBC12MI, pBC12BI, pSV2dhfr, p91023(B), pcDVl és pRSVcat. Ez a felsorolás csupán példa, de nem korlátozó jellegű. A fenti vektorok transzformáció, transzdukció vagy transzfekció útján vihetők be a megfelelő emlős gazdasejtbe.

A jelen találmány szerint felhasználható sok klónozó vektor egy vagy több marker aktivitást kódoló géneket (szelektálható géneket) tartalmaz és ezek kívánt transzformánsok kiválasztására felhasználhatók (pl. ampicillin-rezisztencia pBC12BI-ben és pBC12MI-ben és dihidrofolát reduktáz aktivitás pSV2dhfr-ben). A vektorok beillesztésének helyéül szolgáló gazdasejtek kiválasztása sokkal egyszerűbb, ha a gazdasejt egyébként nem rendelkezik a vektornak tulajdonított aktivitással. Ilyen esetekben a sejt olyan restrikciós körülmények között tenyészthető, amelyekben csak a plazmidot befogadó transzformáns és ezáltal az aktivitás sokszorozódik.

Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint HIL-2 termelő plazmidok segítségével dihidrofolát reduktáz aktivitást alakítunk ki olyan kínai hörcsög petefészeksejtekben, amelyek ezt az aktivitást egyébként nélkülözik (CHO-dhfr sejtek). A transzfoimánsok a nem transzformáit sejtekből hipoxantin- és timidinmentes táptalajon való tenyésztéssel könnyen szelektálhatok.

A transzformánsok szelektálásánál további előny, ha a plazmid rendelkezik a gazdasejtből hiányzó aktivitással. Restrikciós növekedési körülmények között a dhff gén sokszoros másolatait tartalmazó és kifejező transzformáit sejtek gyorsabban növekednek, mint a dhff alacsony szintjeit kifejező, csupán egy vagy néhány másolatot magukban foglaló sejtek.

Ilyen körülmények segítségével kiválaszthatók azok a sejtek, amelyek a kifejezendő dhfr gének kópiáinak számát fokozták vagy amplifíkálták. Ha a kifejezendő gén a plazmidban a szelektálható gén közelében van jelen, a kívánt gén co-amplifikálható és ez az említett gén megnövekedett kifejezéséhez vezethet. Találmányunk szerint transzformánsokat emelkedő ametopterinszint (a de novo purin szintézis egyik inhibitora) jelenlétében tenyésztve, a dihidrofolát reduktáz és HIL-2 termelése növekedik. Ezt az eljárást co-amplifikációnak nevezzük.

A jelen találmányhoz bármely hasonló szelektálható génrendszer felhasználható, bár nem minden rendszer termel génamplifíkációt. A felhasználható, azonban amplifikációt elő nem idéző rendszerek közül pl. a xantin-guanin-foszforibozil-transzferázt kódoló E.coli gpt gén alapú rendszert említjük meg. Mulligan és tsai [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 2072 (1981)] gpt gént hordozó plazmiddal átfertőzött majom és egérsejteket szelektált, a sejteket mikofenolsav (de novo guanilsavszintézis inhibitora), adenin és xantin jelenlétében tenyésztve. A rendszerben a szelekció elősegíthető továbbá oly módon, hogy a szelekciós közeghez aminopterint (az ametopterin analógja) adunk.

Egy másik rendszer a bakteriális aminoglikozid 3’foszfotranszferáz génjét tartalmazza; ennek terméke a baktériumokat neomicinnel és kanamicinnel szemben rezisztenssé teszi. Colbere-Garapin és tsai [J. Mól. Bioi. 150, 1 (1981)] foszfotranszferáz gént tartalmazó plazmidokkal herpes simplex vírus timidin-kináz (HSV tk) gén promotor jelenlétében átfertőzött emlős sejteket szelektál; a sejteket G-418 (az eukariotíkus fehérjeszintézist gátló 2-deoxi-sztreptamin antibiotikum) jelenlétében tenyésztik. Berg [Science 213, 296 (1981)] ugyanezt az eredményt egy sorozat pSV vektor segítségével éri el, amelyekben a foszfotranszferáz gént SV40 promotor ellenőrzi.

A termelősejtek által kiválasztott HIL-2 a tápkőzegben az irodalomból ismert bármely módszerrel azonosítható. így pl. a EQL-2-től függően burjánzó sejtek felhasználásán alapuló biomeghatározás alkalmazható. Ezenkívül radioimmunassay vagy enzimhez kötött immunosorbens assay is alkalmazható, HIL-2 elleni antitestek felhasználásával. Ezenkívül poliakrilamid gélelektroforézis, majd ezt követő „Western biot” [Towbin és tsai Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350 (1979)] vagy hasonló analitikai módszerek is alkalmazhatók. Alternatív módon nagy teljesítőképességű folyadékkromatográfiás (HPLC) is alkalmazható, a Stem által leírt módon (4 490 289 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

A találmány szerinti HIL-2 sókkal (pl. nátrium- vagy ammónium-szulfát) történő lecsapással vagy ultraszűréssel vagy az irodalomból ismert bármely más módszerrel koncentrálható. További tisztítást a fehérjék tisztítására használatos ismert módszerekkel végezhe6

HU 205 384 Β tünk el. Ezek közül példaként, de nem korlátozó jelleggel a gélszűrést, ioncserélő kromatografálást, preparatív gélelektroforézist, izoeléktromos fókuszálást, alacsony hőmérsékleten szerves oldószenei végzett frakcionálást, HPLC-t vagy ellenáramú megoszlást stb. említjük meg. A fentiekben idézett Stem-féle irodalmi helyen leírt módszerek előnyösen alkalmazhatók.

Találmányunk értelmében a fent említett tisztított HIL-2 más ismert immunomodulátor vegyietekhez hasonló módon betegségek kezelésére és megelőzésére (pl. immunoszupresszív állapotok kezelésére) alkalmazható. A találmányunk szerinti tisztított HIL-2-t a gyógyászatban orális, injekciós vagy helyi úton felhasználásra kerülő készítmények hatóanyagaként alkalmazhatjuk. A dózis és az adagolás mértéke az ismert immunomodulátor vegyületek klinikai alkalmazása során kialakult értékeknek felel meg és általában naponta kb. 1-20040⁶ egység. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények hatóanyagként a korábbiakban jellemzett IL-2-t és kompatibilis gyógyászatiig alkalmas hordozóanyagokat tartalmaznak. E célra bármely szokásos inért hordozóanyag felhasználható, éspedig enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas inért, szerves vagy szervetlen inért hordozóanyagok. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények hordozóanyagként pl. vizet, zselatint, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, talkumot, növényi olajokat, polialkilénglikolokat (előnyösen polietilénglikolokat), vazelint stb. tartalmazhatnak. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények továbbá más gyógyászati hatóanyagokat, valamint adalékokat (pl. ízesítő-, tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket vagy a gyógyszeriparban használatos egyéb adalékokat) is tartalmazhatnak.

A találmányunk szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítmények pl. az alábbi csoportokba sorolhatók.

a) Orális adagolásra alkalmas szilárd készítmények, pl. tabletták, kapszulák, pilulák, porok, granulák stb.

b) Orális adagolásra alkalmas folyékony készítmények, pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixírek stb.

c) Parenterális adagolásra alkalmas készítmények, pl. steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók.

d) Helyi úton alkalmazható készítmények, pl. oldatok, • szuszpenziók, kenőcsök, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszolok stb.

A gyógyászati készítmények sterilezhetők és/vagy adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő-, emulgeálószereket, az ozmózisnyomás-változást elősegítő sókat és/vagy puffereket) tartalmazhatnak.

A parenterális adagolási fonnák intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziók vagy injekciós oldatok lehetnek. A készítmények további gyógyászati hatóanyagokat, valamint szokásos adalékokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket stb.) is tartalmazhatnak. A készítmények előállítása a gyógyszergyártás önmagukban ismert gyógyszereivel történik.

Példa

Az alábbi példában nem korlátozó jelleggel mutatjuk be a HIL-2 emlős sejtekben való klónozására és kifejezésére felhasználható módszereket. A példával bizonyítjuk, hogy a HIL-2 normális 5’ nem kódoló tartományának patkány inzulin génnel való helyettesítése igen jelentős mértékben elősegíti a génkifejezést.

DNS előállítása

Plazmid DNS kisléptékű izolálását telített egy éjszakás tenyészetekből Bimbóim és tsai [Nucleic Acids Research 7,1513 (1979)] módszerével végezzük el. Az eljárás segítségével baktériumtenyészetből analitikai célokra kis mennyiségű DNS izolálható. A plazmid DNS nagyobb mennyiségeit Clewell és tsai [J. Bacteriol. 110, 1135 (1972)] módszerével készítjük feltéve, hogy mást nem közlünk. A plazmid DNS hasításával leszármaztatott specifikus restrikciós enzimffagmenseket preparatív elektroforézissel 1%-os alacsony olvadáspontú agarózban izoláljuk (Seaplaque, FMC Inc., Rockland, ME). A DNS-t először 9·5,5 cm-es gélen (50 mA, 1 óra) izoláljuk, trisz-acetát-pufferben [Maniatis és tsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, 454. oldal], majd 1 gg/ml etidium-bromiddal való megfestéssel tesszük láthatóvá. A kívánt DNS-fragmentet tartalmazó gélszekciókat kivágjuk, 65 ’C-on 10 percen át olvasztjuk, majd 5 ml 20 mmólos trisz/HCl-pufferrel (pH 7,4; 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA) hígítjuk. A DNS-t Elutip-D oszlop (Schleicher és Schuell Inc., Keen, NH) felhasználásával betöményítjük, majd a gyártó cég utasításait követjük és -20 ’C-on etanolban 10 gg tRNS jelenlétében élesztőből lecsapjuk (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD).

Enzimes reakció

A restrikciós enzimek, DNS-polimeráz I (Klenowffagmens) és T4 DNS-ligáz a New England Biolabs, MA cég termékei. A fenti enzimeket lényegében a gyártó cég által megadott módszerekkel és körülmények között alkalmazzuk.

A restrikciós endonukleáz aktivitása egységeként az enzim azon mennyisége szolgál, amely 1,0 gg DNS 37 ’C-on, 60 perc alatt, 0,05 ml össz-reakciótérfogatban végzett teljes emésztéséhez szükséges. A fenti enzimekhez felhasznált puffer (a továbbiakban „restrikciós enzimpuffer”) az alábbi komponenseket tartalmazza: 100 mM nátrium-klorid, 10 mM trisz/HCl (pH 7,5), 5 mM magnézium-klorid és 1 mM 2-merkapto-etanol.

A T4 DNS-ligációt 16 órán át 4 ’C-on pufferben végezzük el. Ez a puffer (a továbbiakban „ligációs puffer”) 60 mM trisz/HCl-ot (pH 7,5), 10 mM magnézium-kloridot, 10 mM ditiotreitolt és 0,1 mM ATP-t tartalmaz. A T4 DNS-ligázaktivitás egységeként azt az enzim mennyiséget tekintjük, amely a lambda-DNS HindlII fragmensének 50%-os ligációját előidézi 30 perc alatt, 16 ’C-on, 20 gl inkubációs elegyben és 0,12 μΜ (300 gg/ml) 5’ DNS-koncentráció mellett.

HU 205384 Β

Az egyszálú DNS-végek tompa végződésének kialakítását DNS-polimeráz I Klenow-fragmensének felhasználásával, előzetesen 1 mmól dGTP, dATP, dCTP és dTTP tartalomra beállított restrikciós enzimpufferben végezzük el. Az aktivitás egységeként azt az enimmennyiséget tekintjük, amely 10 nmól dezoxiribonukleotidot 30 perc alatt 37 °C-on savban oldhatatlan formává alakít át.

Tenyésztőközeg

Az Iscove-féle módosított Eagle-táptalajt (IMEM) [Iscove és tsai: J. exp. Med. 147. 147, 923 (1978)] a Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y. Intézettől kaptuk.

A Luria táptalaj (LB) literenként 5 g Bacto-élesztőextraktumot, 10 g Bacto-triptont és 10 g nátrium-kloridot tartalmaz, a pH-t 7,5-re állítjuk be. Ampicillin antibiotikumot adunk hozzá 50 gg/ml végső koncentrációban.

Transzformáció és transzfekció

Az Escherichia coli törzseket Peacock és tsai [Biochim. Biophys. Acta 655, 243 (1981)] módszerével lényegében a következőképpen transzformáljuk. A sejteket LB táptalajból aratjuk le és a transzformáláshoz Norgard és tsai módszerével készítjük elő [J. Bioi. Chem. 255,7665 (1980)] azzal a változtatással, hogy a kalcium-kloridos puffért módosítjuk és 70 mM mangán-kloridot, 40 mM nátrium-acetátot, 30 mM kalcium-kloridot tartalmaz, pH 5,6.

. A sejtek 100 μΐ-es mintáját kalcium-kloridban szuszpendáljuk, majd 50-1000 ng DNS-t tartalmazó plazmidmintával (50 gl) egyesítjük. Az elegyet jégen egy órán át tartjuk, majd 37 ’C-on 2 percen át tenyésztjük. A sejteket 4 °C-on LB agarlemezeken ampicillinnel szélesztjük és a transzformánsok kiválasztása céljából 16 órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Kínai hörcsög petefészeksejteket Graham és tsai módszerével [Virology 52, 456 (1973)] a következőképpen transzfektálunk: 8 g/1 nátrium-kloridot, 0,37 g/1 kálium-kloridot, 0,125 g/1 dinátrium-hidrogén-foszfátdihidrátot, 1 g/1 dextrózt, 3 g/1 triszt és 125 mM kalcium-kloridot és összesen 10 gg DNS-t tartalmazó elegyből 0,5 ml-t 5H0⁵ sejthez adunk 6 cm átmérőjű tenyésztőedényben, amely 4 ml, 10* M hipoxantinnal és 10⁵ M timidinnel (HT) kiegészített IMEM-et tartalmaz. Az elegyben levő DNS 5 gg nagymolekula-tömegű borjútimusz hordozó DNS-ből és 5 gg, Pvul-gyel linearizált pBC12 (RSV/IL-2/dhfr DNS-ből áll. A tenyészetet egy éjjelen át 37 °C-on nedves, 5% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban inkubáljuk, majd a táptalajt eltávolítjuk és 5 ml, 10* M hipoxantinnal és 10'⁵M timidinnel (HT) frissen kiegészített IMEM-re cseréljük le. Egynapos további inkubálás után a sejteket a tenyészedényből tripszin-EDTA-oldat segítségével (GBBCO) leoldjuk és 2 db 10 cm átmérőjű edényben 10% dializált magzati boqúszérumot (FCS) tartalmazó, azonban HT-mentes IMEM-ben szélesztjük. Az átfertőzött telepeket standard klónozó hengeres módszerrel [Methods in Enzymology Vol. 58, 152-164(1979)] ’C-on végzett további 10 napos inkubálás után izoláljuk.

Afrikai zöldmajom vesesejteket (COS) Butnick és tsai módszerével [Mól. Cell. Bioi. 5,3009 (1985)] transzfektálunk. 10 cm átmérőjű szövettenyészet edényeket 10 ml, 10% FCS-vel (fötális borjúszérummal) és 50 gg/ml gentamicinnel kiegészített IMEM-ben 3· 10⁶ COS-sejttel beoltunk és 37 ’C- on 5% szén-dioxidot tartalmazó nedvesített inkubátorban egy éjjelen át inkubálunk. A sejteket 37 °C-os foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldattal (PBS) és 2 ml, 37 ’C-os, 500 gg/ml DEAE-dextránt (Pharmacia) tartalmazó oldattal egyszer mossuk. A transzfektálandó DNS-t ezután a sejtekhez adjuk. A COS sejteket inkubáljuk, majd a tenyészedényeket 5-5 perces időközökben 30 percen át enyhén rázatjuk. Az inkubálás után minden edényhez 10% FCS-t, 50 gg/ml gentamicint és 80 gM klorokint tartalmazó 20 ml IMEM-et adunk. További 2 és 1/2 órás inkubálás után a táptalajt 10% FCS-t és 50 gg/ml gentamicint tartalmazó friss IMEM táptalajjal helyettesítjük. Az inkubálást 37 ’C-on 72 órán át folytatjuk, majd a sejteket és a táptalajt az alábbiakban ismertetésre kerülő módon analizáljuk.

Sejttenyészetek

Az alábbiakban idézett közleményben leírt módon két Escherichia coli törzset alkalmazunk. Az E.coli GM119 törzset Marinus és tsai [J. Bacteriol. 114,1143 (1973)] írta le. A törzset 1985. november 26-án restrikció nélkül az American Type Culture Collection intézménynél ATCC 53339 számon deponálták. Az E.coli MC1061 törzset Casadaban és tsai [J. Mól. Bioi. 138, 179 (1980)] írta le. A törzset ugyancsak 1985. november 26-án deponálták az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél, ATCC 53338 szám alatt.

Három emlős sejtvonalat alkalmazunk. Ezek közül az egyik kínai hörcsög petefészekvonal (CHO/dhfr), amely dihidrofolát reduktázt nem tartalmaz. A sejtvonalat eredetilag Urlaub és tsai izolálták [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216 (1980)]. A sejtvonal tenyészeteit 1986. május 7-én deponálták az American Type Culture Collection Intézetnél CRL 9096 számon. Őrigin minus SV40 virális genom [Gluzman, Cell 23,175 (1981)] által transzformált afrikai zöldmajom vesesejtvonal (COS) az ATCC-nél CRL 1651 számon hozzáférhető. A Robb által leírt [Methods in Enzymology 116, 493 (1985)] rágcsáló IL-2 dependens sejtvonal (CTLL) az ATCC-nél TIB 214 számon hozzáférhető.

Elsődlegesen irányított mutagenezis

Az elsődlegesen irányított helyspecifikus mutagenezist Morinaga és tsai módszerével [Bio/Technologi 2, 636 (1984)] végezzük el. A mutagenezis eljárás elvégzéséhez felhasznált szintetikus oligonukleotidot Matteuccí és tsai [J.Am. Chem. Soc. 103,3185 (1981)] foszforamidit szilárd hordozós módszerével állítjuk elő.

Telephibridizáció

A telephibridizációt Maniatis és tsai módszerével végezzük el [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, 312-315.

HU 205 384 Β oldal]. Az elsődlegesen irányított mutagenezisnél alkalmazottal azonos oligonukleotidot használunk hibridizációs mintaként, az 5’ vég y^P-ATP-vel történő és polinukleotid-kináz felhasználásával végzett jelzése után, Maniatis és tsai eljárása szerint (lásd a fenti irodalmi hely 396. oldal). Az IL-2 és dhfr gének lokalizálására felhasznált nagyobb DNS-mintákat „nick transzlációs kit” (Amersham) segítségével, a gyártó cég utasításai alapján jelöljük.

pBC12IRSVIlL-2ldhfr interleukin-2 kifejező vektor felépítése

A találmányunk szerinti végső kifejező vektort lépésenként készítjük el, a műveletek alábbi sorrendjében:

1. a vektor elkészítése, amelybe a módosított humán

HIL-2 gén beiktatható;

2. a HIL-2 gén módosítása, ennek kapcsán a legtöbb 3’ nem kódoló tartomány, az összes 5’ nem kódoló szekvencia és a szignálpeptid- szekvenciát kódoló szekvencia első négy nukleotidjának törlése; és

3. módosított HIL-2 gén beiktatása az előkészített vektorba.

Klónozó vektor előállítása 1 pg pBC12MI plazmid DNS-t (lásd 1. ábra) 100 pl restrikciós enzimpufferben 1 órán át, 20 egység BamHIgyel 37 ’C-on kezelünk. Az E.coli MC1061-nek a pBC12MI plazmidot tartalmazó mintáját az American Type Culture Collection intézménynél 1986. május 7-én deponáltuk és ATCC 67109 számon tettük hozzáférhetővé. A BamHI-gyel emésztett plazmidot ezután a DNSpolimeráz I Klenow-fragmensének 4 egységével 2 órán át 15 ’C-on kezeljük, majd a reakciót 65 ’C-on 5 percen át történő melegítéssel leállítjuk. Az elegy 2 pl-es mennyiségét ezután ligációs pufferrel 1:10 arányban hígítjuk. Az elegyet jégre öntjük. 1 egység T4 DNS-ligázt adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 16 órán át 4 ’C-on inkubáljuk.

A ligációs reakcióelegyet ezután közvetlenül használjuk fel az E.coli GM119 törzs transzformálására. A transzformánsokat LB agarban ampicillinnel szelektáljuk. Az ily módon nyert ampicillinrezisztens telepekből ily módon kapott DNS-t restrikciós endonukleáz hasítással vizsgáljuk. Az izolált plazmid DNS-t előbb BamHI-gyel vagy Glal-gyel emésztjük, majd a keletkező DNS-fragmenseket 1%-os agarózgélen végzett elektroforézissel elválasztjuk és 10 pg/ml etidium-bromiddal tesszük láthatóvá. Egy plazmidot, amely BamHI helyét elvesztette, azonban ennek helyén Clal helyet szerzett, ezután azonosítjuk és pBC12CI plazmidnak jelöljük.

ApBC12CI plazmidot ezután nagyobb mennyiségben állítjuk elő a Clewell és tsai által leírt [J. Bacteriol. 110,1135 (1972)] detergens lízis eljárás segítségével. A klónozó vektor végső előállítása oly módon történik, hogy 20 egység Clal-gyel 1 pg pBC12CI-et hasítunk és az emésztett terméken Klenow-fragmens DNS polimeráz I segítségével tompa végződést alakítunk ki.

Interleukin-2 génfragmens készítmény

IL-2 gén forrásként az 5’ nem transzlatált szekvenciánál 31 bázispárral és a 3’ nem transzlatált szekvenciánál 309 bázispárral szegélyezett humán IL-2 teljes 459 bázispár kódolt tartományának cDNS-másolatát alkalmazzuk [Taniguchi és tsai: Natúré 302, 305 (1983)]. Minthogy a HIL-2 gén nukleotid-szekvenciája Taniguchi és tsai közleményéből ismert, a HIL-2 gént tartalmazó génfragmens a Souza és tsai által leírt módszerrel is szintetizálható (Al 134 489 sz. európai szabadalmi bejelentés). 10 pg pIL-2-2b-t 20-20 egység Rsal-gyel és BamHI-gyel hasítunk 100 pl restrikciós enzimpufferben 1 órán át, 37 ’C-on. Az Rsal a HIL-2 cDNS inzertet egyetlen helyen hasítja 1 bázispámál 3’ irányban a HIL-2 iniciáló kodon felé. A reakcióelegyet Klenow-fragmens DNS-polimeráz I-gyel kezeljük, majd 1%-os alacsony olvadáspontú agarózgélben preparatív elektroforézisnek vetjük alá. A kívánt 760 bázispár Rsal/BamHI HIL-2 cDNS-fragmenst azonosítjuk és a gélről a fent leírt módon extraháljuk.

100 ng előkészített pBC12CI vektort 2 egység T4 DNS-ligázt tartalmazó 30 pl ligációs pufferben 100 ng Rsal/BamHI HIL-2 fragmenssel összekeverünk és 4 ’Con egy éjen át inkubálunk. Az E.coli MC1061 törzs transzformálásához a ligáit DNS-t használjuk fel és a transzformánsokat LB agarózlemezeken ampicillinnel szelektáljuk.

200 ng izolált HIL-2 fragmenst használunk fel ³²P jelzett „nick transzlatált” minta generálására, Amersham „nick transzlációs” kit felhasználásával, a gyártó cég utasításainak megfelelően. A telepeket a lemezekről nitrocellulóz szűrőkre (Schleicher and Schuell Inc.) helyezzük át, majd HIL-2 inzert jelenlétére vizsgáljuk a jelzett minta felhasználásával és Maniatis és tsai módszere szerint [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory]. A pozitív hibridizációs telepeket kiszúrjuk és Bimbóim és tsai módszerével [lásd fenti irodalmi hely) DNS-minikészítményeket állítunk elő. A kapott DNS-készítményeket HindlII-mal és Stul-gyel hasítjuk és gélelektroforézissel a vektor helyes felépítését bizonyító karakterisztikus 690 bázispár jelenlétére vizsgáljuk. Ezt a felépítést pB 10-nek jelöljük.

Nagyobb mennyiségű pBCIO DNS-t készítünk [lásd fenti irodalmi hely] és ebből 10 pg-ot 20 egység HindlH-mal és 16 egység Stul-gyel restrikciós enzimpufferben, egy órán át, 37 ’C-on hasítunk. A kapott 690 bázispár HIL-2 DNS-fragmenst a korábbiakban leírt preparatív agaróz gélelektroforézissel izoláljuk.

pg pBC12MI DNS-t BamHI-gyel hasítunk, majd a fentiekben leírt módon Klenow DNS-polimerázzal kezelünk. Ezután 65 ’C-on végzett inkubálás után a DNSt HindlII-mal hasítjuk, vizes fenol-kloroform-eleggyel extraháljuk és fele térfogatú 7,5 mólos ammónium-acetát és 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk, végül -70 ’C-on inkubáljuk. A kicsapott pBC12MI DNS-t centrifugálással kinyerjük, etanollal mossuk és vízben újraszuszpendáljuk.

100 ng ily módon készített pBC12MI vektort 30 pl ligációs pufferben a korábbiakban leírt módon 200 ng

HU 205384 Β izolált IL-2 HmdHI/StuI fragmenshez ligáljuk. A ligációs elegyet használjuk fel az E.coli MC1061 törzs transzformálásához és a transzformánsokat LB agarőzlemezeken ampicillinnel szelektáljuk. Az egyes telepeket a korábbiakban lent módon 690 bázispár HindlΠ/BamHI fragmensek jelenlétére vizsgáljuk és e kritériumnak megfelelő felépítést pBC12/RSV/IL-2-nek jelöljük.

Az ily módon felépített pBC12/RSV/IL-2 plazmid olyan kimér HEL-2 gént tartalmaz, amelyben az 5’ nem kódoló terület és a HIL-2 szignálpeptid-szekvenciát kódoló szekvencia első négy ATG T nukleotidja, valamint csaknem a teljes 3 ’ nem kódoló terület a pBC12MI vektorban jelen levő patkány preproinzulin H gén megfelelő szekvenciáival van helyettesítve. Ezt a felépítést részben a meghatározott 3’ nem kódoló terület létrehozása céljából alakítottuk ki. Azonban - mint azt az alábbiakban bemutatjuk - az 5’ nem kódoló terület helyettesítése idézi elő a HIL-2 gén kifejezésének igen jelentős növekedését A HIL-2 szígnálpeptíd N-terminális kialakított szerkezetét a 2. ábrán tüntetjük fel.

A 2. ábrából kitűnik, hogy az új felépítés eredményekéntkimér szígnálpeptíd alakul ki, amelyben az IL-2 első kétaminosavát (Met-Tyr) apatkányinzulin szígnálpeptíd első öt aminosava (Met-AIa-Leu-Trp-He) és a ligációs csatlakozás helyén létrehozott új nukleotid-szekvencia által kódolt hatodik aminosav (Asp) helyettesíti. Ez a változás nem befolyásolja az IL-2 génről érés alatt a szokásos módon lehasított szígnálpeptíd funkcióját

Dihidrofolát reduktáz gén szekvenciák beiktatása pg pBC12/RSV/IL-2-t Stul-gyel hasítunk. A DNS-t fenol-kloroform-eleggyel extraháljuk, etanollal kicsapjuk és vízben újraszuszpendáljuk. 10 pg pSV2dhfr DNS-t [Subramani és tsai: Mól. Cell. Bioi. 1, 854 (1981)] PvuH-vel és BamHI-gyel hasítunk. A pSV2dhfr plazmidot az American Type Culture Collection intézetnél 1986. május 7-én E.coli MC1061 (pSV2dhfr) minta alakjában ATCC 67110 számon deponáltuk. A pSV2dhfr plazmidból a SV40/dhfr génfragmenst 1%-os preparatív agarózgélben izoláljuk, majd 100 ng pBC12/RSV/IL-2 vektort 400 ng izolált SV40/dhfr fragmenshez ligálunk 40 pl ligációs pufferben, 4 °C-on, egy éjjelen át. A ligációs elegyet használjuk fel az E.coli MC1061 törzs közvetlen transzformálására. A transzformánsokat LB agarózlemezeken ampicillinnel szelektáljuk.

A transzformált telepeket nitrocellulőzszűrőkre visszük át és izolált SV40/dhff génfragmenssel szemben előállított ³²P „nick transzlációs” jelzett mintával vizsgáljuk.

A mintát 200 ng izolált PvuH/BamHI SV40/dhfr fragmens jelzésével, Amersham „nick transzlációs” kit felhasználásával, a fentiekben leírt módon készítjük el. A Bimbóim és tsai által kidolgozott eljárás (lásd fent) felhasználásával a hibridizációs pozitív telepekből plazmid DNS-t izolálunk és gélelektroforézis analízissel két BamHI fragmens jelenlétére vizsgáljuk.

A BamHI fragmensek jelenléte igazolja az S V40/dhfr fragmens jelenlétét és meghatározza a fragmens orientációját. A pBC12/RSV/IL-2-be klónolt SV40/dhfr génffagmens az SV40 vírus korai tartomány promotorának ellenőrzése alatt álló teljes rágcsáló dhff gént tartalmaz. Olyan kiónt választunk, amelyben a HIL-2 és a dhff gének a plazmidban azonos orientációban helyezkednek el és ennek a kiónnak a plazmidját pBC12/RSV/IL-2/dhfr-nek jelöljük (lásd 3. ábra).

HIL-2 gén magas kifejezése

A HIL-2 gén kifejezése céljából 540⁵ CHO/dhlr sejteket a transzfekció előtt egy nappal 6 cm átmérőjű szövéttenyésztő tálban 4 ml, ΙΟ^-4 M hipoxantinnal és 10'⁵ M timidinnel (HT) kiegészített IMEM-ben szélesztünk. Az inkubálást 37 °C-on nedves, 5% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban egy éjjelen át végezzük, majd a sejteket pBC12/RSV/IL-2/dhff-rel transzfektáljuk. Az átfertőzött telepeket a fentiek szerint leírt módon izoláljuk.

Minden egyes ily módon kapott, d51-d56 jelzésű klónozott telepet IMEM-ben tenyésztünk és egymással, valamint nem klónozott kevert dhfi* tenyészettel (jelzése d5) szemben tenyésztünk HIL-2 termelése céljából. A HIL-2 termelését rágcsáló IL-2 dependens CTLL sejtvonal alapú kvantitatív biomeghatározás segítségével mérjük. A Robb által leírt meghatározás [Methods in Enzymology 116, 493 (1985)] során különböző dhfrt sejt kiónok felülúszóinak kétszeres hígítássorozatait rágcsáló IL-2 dependens CTLL sejtvonallal keverjük össze. Minthogy a CTLL vonal csak IL-2 jelenlétében növekedik, ezen sejtek burjánzásának mértéke a dhfrf klónok által kiürített IL-2 szint pontos mértékeként szolgál; a sejtburjánzást a ³H-dT beépülésével határozzuk meg. Alternatív módon humán PHAblastok használhatók a HIL-2 termelés mérésére (Robb és tsai, fent idézett közleménye). Humán PHA-blastok oly módon nyerhetők, hogy humán perifériás vér lymphocytákat 48 órán át phytohaemoagglutininnel (PHA) stimulálunk. A kiónozott telepek fenti analízisének eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be, ahol is az adatokat mint IL-2 aktivitást egység/ml táptalaj és egység/10⁶ sejt mértékegységben fejezzük ki. Az IL-2 aktivitás egységének a Biological Response Modifíers Program of the National Cancer Institute, Frederick, MD [Thurman, Lymphokine Rés. 3:276 (1984)1 intézménytől beszerezhető IL-2 standard reagálása által beállított fél-maximális burjánzás! reagálásnak megfelelő hígítás reciprok értékét tekintjük (lásd Robb fent idézett közleménye).

I. táblázat

Izolált klónok IL-2 termelésének összehasonlítása

Klón Ametopterin Interleukin-2 aktivitás koncentráció (egység/ml) (egység/lO⁶ sejt) (moláris)

d5	640	456
d51	1,920	1,370
d52	1,920	N.D.
d53	1,920	1,580

HU 205 384 Β

Klón Ametopterin	Interleukin-2 aktivitás (egység/ml) (egység/10^-6 sejt)
	koncentráció (moláris)
d54	0	820	N.D.
d55	0	550	N.D.
d51	5-10’⁶	51,200	60,160
d51	2·10-⁵	51,200	80,210
d51	8·ισ⁵	76,800	150,400
d51	2·10·⁴	76,800	156,900
dől	5·ισ⁴	153,600	401,000

N.D.=nem határoztuk meg.

Az 1. táblázatból látható, hogy a d51 és d53 klón az IL-2 aktivitás legerősebb termelője. A fent említett szelektálható gén amplifikációs hatás igazolása céljából klón d51 sejteket 7—14 napon át növekvő ametopterinszint mellett addig tenyésztünk, míg 5· 10'⁴ mól inhibitor koncentrációra rezisztens vonalat kapunk. Az 1. táblázatból látható, hogy ez a sejtvonal nagy mennyiségű HIL-2 szintet választ ki. A sejtek Southem-analízise [Maniatis és tsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 382-389] azt mutatja, hogy minden sejt a pBC12/RSV/IL-2/dhfr plazmid kb. 100 kópiáját tartalmazza. A HIL-2 cDNS másolathoz a pIL-2-2b plazmidba való beilleszkedés megkönnyítése céljából eredetileg hozzáadott homopolimer G-C farkak az IL-2 gén kifejezését gátolják. Abból a célból, hogy a normál humán 5’ nem kódoló tartományokat tartalmazó génszekvenciák IL-2 kifejezésének mértékét összehasonlítsuk azon szekvenciák megfelelő értékével, amelyekben ezeket a tartományokat a patkány inzulin génből származókkal helyettesítettük, olyan plazmidot készítünk, amelyben a gátló homopolimer farkakat töröltük. E plazmid jelölése pBC40AT.

A plazmid pBC40ATfelépítése

Egy hasított vektort - amelybe a HIL-2 gén klónozható - oly módon készítünk el, hogy 1 pg pBC12MI-et 20 egység BamHI-gyel és 20 egység HindHI-mal restrikciós enzimpufferben, egy órán át 37 °C-on hasítunk. A keletkező fragmenst ezután DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével kezeljük, fenol-kloroform-eleggyel extraháljuk és a fentiekben leírt módon kicsapjuk.

Egy HIL-2 DNS-fragmenst oly módon készítünk el, hogy 10 pg pIL-2-2b DNS-t 20 egység BamHI-gyel és 8 egység Stul-gyel hasítunk és Klenow DNS-polimeráz segítségével a végét letomp'ítjuk. A fenti módon 1%-os preparatív agarózgélből kb. 550 bázispár HIL-2 fragmenst izolálunk.

100 ng előkészített pBC12MI vektort ezután 150 ng HIL-2 BamHI/StuI fragmenshez ligálunk 25 pl ligációs pufferben, a korábbiakban leírt módon. A ligációs keveréket közvetlenül használjuk fel E.coli MC1061 törzs transzformálására és a transzformánsokat LB agarózlemezeken ampicillinnel szelektáljuk. Az ampicillinrezisztens telepeket a lemezekről nitrocellulózszűrőkre helyezzük át és HIL-2 inszert jelenlétére vizsgáljuk telephibridizáció útján, 200 ng tisztított BamHI/StuI fragmenssel szemben készített ³²P jelzett „nick transzlatált” minta segítségével, Amersham kit felhasználásával.

A pozitív hibridizációs telepeket kiszúrjuk és Bimbóim és tsai módszerével (plazmid DNS restrikciós enzim analízise) a kb. 560 bázispár BstEH/BamHI fragmens jelenlétére vizsgáljuk. A fenti fragmenst tartalmazó szerkezetet azonosítjuk és pBC40-nek jelöljük. A pBC40 plazmid a pBC12/RSV/IL-2-vel azonos azzal a különbséggel, hogy az inzulin 5’ nem kódoló tartomány hiányzik és e helyett természetes 31 bázispár HIL-2 5’ nem transzlatált tartomány van jelen. A plazmid a természetes HIL-2 iniciációs kodont ugyancsak megtartja és 17 bázispár homopolimer farokkal rendelkezik, amely az 5’ nem kódoló tartományban helyezkedik el. Nagyobb mennyiségű pBC40 DNS-t Clewell és tsai módszerével állítunk elő [J. Bacteriol. 110,1135 (1972)].

A HIL-2 gén homopolimer farok szegmenseit Morinaga és tsai [Bio/Technology 2,636 (1984)] elsődlegesen irányított mutagenezis módszerével töröljük. Az eljárás elvégzéséhez a fentiekben ismertetett módon a foszforamidot szilárd hordozós módszerrel foszforilezett 24-mer deoxioligonukleotid prímért állítunk elő, amely 12 deoxinukleotidet tartalmaz, az egyik DNSszálon eltávolítandó homopolimer tartomány egyes oldalain levő bázisokkal komplementer szekvenciában. A fenti 24-mer primer és a kivágandó homopolimer tartományt tartalmazó DNS-nukleotid-szekvenciáját a 4. ábrán tüntetjük fel. A mutagenezis folyamat alatt hibridizációnak alávetett tartományokat aláhúztuk. A homopolimer tartomány törlése a keletkező DNS-ben új HindlII helyet hoz létre.

A mutagenezis eljárás elvégzéséhez 1 pg pBC40 DNS-t Pvul-gyel linearizálunk, fenol-kloroform-elegygyel extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 20 pl vízben felvesszük. 10 pg további pBC4O-et EcoRI-gyel hasítunk és a legnagyobb termelt vektorfragmenst - az ún. „befogott vektort” - 1%-os preparatív agarózgélben izoláljuk.

A linearizált és befogott plazmidok azonos, 200 ngos mennyiségeit a foszforilezett oligonukleotid 20-szoros moláris fölöslegével összekeverjük 10 pl vízben, majd 2 pl lOx Klenow-puffert [1 mólos nátrium-klorid, 65 mmólos trisz/HCl (pH 7,4), 45 mmólos magnéziumklorid és 10 mmólos 2-merkapto-etanol] adunk hozzá. Az elegyet egymás után következő 5 percen át 100 ’C-on, 30 percen át szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül 4 ’C-on és 5 percen át jégen tartjuk, majd a mintát 2 pl 10 mmólos ATP; 4 pl 2,5 mmólos dCTPből, dATP-ből, dGTP-ből és dTTP-ből álló elegy;

0,5 pl Klenow-polimeráz I (2,5 egység aktivitás) és 1 pl T4 DNS-Ugáz (0,8 egység aktivitás) hozzáadásával 20 pl térfogatra töltjük fel.

Az elegyet 16 órán át 15 ’C-on inkubáljuk, majd közvetlenül használjuk fel E.coli MC1061 törzs transzformálására. A transzformánsokat LB agarózlemezeken ampicillinen szelektáljuk, a telepeket a lemezekről

HU 205 384 Β nitrocellulózszűrókre helyezzük és mintaként a-³²PATP-vel jelzett szintetikus oligonukleotid. felhasználásával a mutagenezis eljárásnál felhasznált 24-mer primerrel homológ szekvencia jelenlétére vizsgáljuk.

A pozitív telepeket Bimbóim és tsai módszerével a várt 530 bázispár HindHI/BamHI fragmensének jelenlétére vizsgáljuk. Minthogy az eljárásnál vegyes telepeket kapunk (Morinaga és tsai fent idézett közleménye), az E.coli MC1061 áttranszformálásához pozitív DNS-mintát használunk és a kapott telepeket az 530 HindHI/BamHI fragmensre újravizsgáljuk. A pozitív telepet azonosítjuk; e telep jelzése pBC40AT és a pBC40-nel azonos azzal a különbséggel, hogy az elsősorban 17 bázispár homopolimer G-C szekvenciából álló nem transzlatált vezetőben a 22 bázispár szegmens törölve van.

A pBC12IRSVIIL-2, pBC40 és pBC40AT vektorok funkcionális összehasonlítása

Összehasonlítjuk a fenti három vektornak humán HIL2 szintézisét irányító képességét, a transzfektált COS sejt kvantitatív átmeneti kifejezés meghatározás felhasználásával [Butnick és tsai: Mól. Cell. Bioi. 5, 3009 (1985)]. Az eljárás során az összehasonlítandó DNS-készítmények ekvimoláris mennyiségeit transzfekció útján Gluzman által leírt [Cell. 23, 175 (1981)] afrikai zöldmajom vesesejtvonal COS-ba építünk be, amelyet eredeti minus SV40 virális genom transzformál. A sejtekbe beépített, SV40 replikációs origót (pl. a tssztplazmidct) tartalmazó deoxiribonukleinsavak nagy kőpiaszámban replikálődnak és ily módon a sejtekben levő S V40 dependens DNS replikációs szerkezet által megfelelő hatékonysággal fejeződnek ki. A transzformált COS sejtek által termelt HIL-2 szinteket Robb-féle (irodalmi hely fent) kvantitatív CTLL sejtvonal biomeghatározással mérjük. A 4 különbözőkísérletsorán kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze:

2. táblázat ’ nem kódoló szekvenciák hatása az interleukin-2 kifejezésére

Klón	1	Relatív IL-2 termelés (egység/ml)	Átlag (%)
2	3	4
pBC12/RSV/IL-2 1024	512	1536	6144	100
pBC40	24	8	32	192	2,8
pBC40AT	128	96	128	768	12,1

A 2. táblázatból látható, hogy a pBC12/RSV/IL-2 plazmid az IL-2 szintézisét lényegesen magasabb szinten irányítja, mint a pBC40 és pBC40AT plazmid. Bár a pBC40 az 5’ nem kódoló tartományában jelen levő homopolimer terület miatt kevésbé hatékony mint a pBC40AT, a három plazmid közötti fő különbséget az okozza, hogy míg a pBC40 és pBC40AT esetében az 5’ nem transzlatált szekvenciák zöme természetes humán szekvencia, addig a pBC12/RSV/lL-2 plazmid megfelelő helyein patkány preproinzulin H gén megfelelő szekvenciái vannak jelen.

Mind ez ideig még tisztázatlan, hogy a normál 5’ nem kódoló szekvenciának patkány inzulin génnel történő helyettesítése miért segíti elő igen. nagy mértékben a HIL-2 kifejezését. A HIL-2 fokozott kifejezésével kapcsolatos mechanizmus megértése azonban találmányunk szempontjából nem lényeges. Lehetséges, hogy ezért a hatásért a fokozott mRNS-stabilitás felelős. Elképzelhető azonban, hogy a természetes IL-2 AUG kodonnak inzulin iniciátor AUG kodonnal való helyettesítése (2, ábra) az inzulin iniciátor kodonnal szomszédos kedvezőbb szekvencia következtében magasabb transzlációs hatékonyságot eredményez [Kozák, Cell. 44,283 (1986)].

A szakember számára nyilvánvaló, hogy jelen találmányunk sok módosítása és változtatása végezhető el anélkül, hogy a találmány szellemétől, lényegétől és terjedelmétől eltérnénk. A leírásban ismertetett specifikus kiviteli alakok csupán a találmány lényegének megismertetésére szolgálnak, és a találmányt csak az igénypontokban szereplő kifejezések korlátozzák.

Claims

1. Eljárás humán interleukin-2 termelésére, azzal jellemezve, hogy

a) humán interleukin-2-t és szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó, a DNS-szekvencia kifejezésének irányítására képes rekombináns vektort magában foglaló emlős sejtet tenyésztünk, ahol a vektorban a natív gén 5’ nem kódoló szekvenciáját vagy az 5’ nem kódoló szekvenciát és a natív gén szignálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvencia 5’ nem kódoló szekvenciával szomszédos nukleötidjait valamely emlős preproinzulin génből származó, megfelelő heterológ 5’ nem kódoló és kívánt esetben szignálszakasz egy részét kódoló szekvencia helyettesíti, és

b) a tenyészetből humán interleukin-2-t izolálunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtet tenyésztünk, amelyben a megfelelő heterológ szekvencia patkány preproinzulin génből származik.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban meghatározott olyan DNS-szekvenciát magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtet tenyésztünk, amely DNS-szekvenciában az 5’ nem kódoló szekvenciát és a gén szignálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvencia első négy ATG T núkleotidját patkány preproinzulin Π gén megfelelő 5’ nem kódoló szekvenciája és a patkány preproinzulin H szignálpeptid első öt aminosavját (MetAla-Leu-Trp-He) kódoló ATG GCC CTG TGG ATC nukleotidok és a ligációs helyen létrehozott, új hatodik aminosavat (Asp) kódoló nukleotid-szekvencia helyettesítik.

4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SV40 őri tartományt és Rous sarcoma vírus hosszú terminális ismétlődő promotorját (LTR) magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtet tenyésztünk.

HU 205 384 Β

5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pBC12/RSV/IL-2 vagy PBC12/RSV/IL-2/dhff rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtet tenyésztünk.

6. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan emlős sejtet tenyésztünk, amelybe a rekombináns vektort transzfekció útján építjük be.

7. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektálható gént magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó emlős sejtet szelekciós közegben tenyésztünk, mimellett a szelektálható gén sokszorozható kópiáit és a humán interleukin-2-t kódoló DNS-szekvenciát co-amplifikáció útján termeljük.

8. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihdirofolát reduktázt kódoló szelektálható gént magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó olyan emlős sejtet tenyésztünk, amely dihidrofolát reduktáz aktivitással különben nem rendelkezik, és ezt az emlős sejtet hipoxantin- és timidinmentes, azonban aminopterint tartalmazó közegben tenyésztjük.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős sejtként CHO/dhfr sejtet tenyésztünk.

10. Eljárás humán interleukin-2 kifejezésére képes emlős sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a DNS-szekvencia kifejezésének irányítására képes rekombináns vektort, amely humán interleukin-2-t és szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és ahol a vektorban a natív gén 5 ’ nem kódoló szekvenciáját vagy az 5’ nem kódoló szekvenciát és a natív gén szingálpeptid-szekvenciáját kódoló szubszekvencia 5’ nem kódoló szekvenciával szomszédos nukleotidjait valamely emlős preproinzulin génből származó, megfelelő heteroíóg 5’ nem kódoló és kívánt esetben szignálszakasz egy részét képező szekvencia helyettesíti, emlős sejtbe építünk be.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns vektort transzfekció útján építjük be az emlős sejtbe.