JPS62278994A - ヒトインタ−リユ−キン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、発明の詳細な説明 遺伝子ｍ換え、または遺伝子工学とも呼ばれる組換えＤ
ＮＡ技法の発展により、広く各種生物由来産物の生産が
可能となった。現在の組換えＤＮＡ技術では、特定のＤ
ＮＡ配列を適当なりＮＡ運搬体またはベクターに挿入し
て宿主細胞中で複製可能な組換えＤＮＡ分子を作製する
。グラスミドと呼ばれる環状二重鎖ＤＮＡ分子がベクタ
ーとしてよく使用され、組換えＤＮＡ体の調製にはＤＮ
Ａの特定の塩基配列を切断することの出来る制限エンド
ヌクレアーゼ酵素の使用を伴なう。このような組換えＤ
ＮＡ分子調製のための一般的方法はＣｏｈｅｎら〔米国
特許４．２３７．２２４番〕、Ｃｏ１１ｉｎｓら〔米国
特許４．３０４，８６３番〕およびＭａｎｉａｔｉｓら
（Ｍｏｌｅｃ（１０）ａｒＣｌｏｎｌｎｇ　＋　Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、１９８２年、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　〕にｊｆｉ記載されている。

組換えＤＮＡ分子は挿入した遺伝子配列に工りコードさ
れる産物を、多くの条件を満たした場合にのみ生産する
のに使用される。第一の条件は、組換え分子が宿主細胞
と適合性があ）、従って宿主細胞中で自己増殖が出来る
事である。新しい報告の多くはバクテリアのＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）を宿主生物
として使用しているが、これはＥ、ｃｏｌｉが広い範囲
の組換えプラスミドと適合性を有するからである。組換
えＤＮＡ分子の宿主への導入は、使用するベクター／宿
主細胞系により形質転換、形質導入またはトランスフエ
クシヨンにより行なう。

組換えベクターを宿主細胞に単に導入しただけでは目的
の遺伝子産物が十分量生産されることが保証されない。

そのためＫは、プロモーターと呼ばれるベクター中のシ
グナル領域と適当な関係で異種遺伝子配列が結合されな
ければならない。或いは、宿主が認識する限υ、外来Ｄ
ＮＡがそれ自身のプロモータを保有していてもよい。由
来が何であ几、プロモーターとは発現されるべき外来遺
伝子の「上流」側、言い換えれば５′側のＤＮＡ配列で
ある。この配列がＦＬＮＡポリメラーゼの結合を指示し
、その結果ＤＮＡのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ
）への転写と「プロモート」する。

多量のｍＲＮＡを提供できる強いプロモーション（促進
）があれば、目的遺伝子産物の最終的生産ｆ’ｉ　ｍＲ
ＮＡから蛋白質への翻訳の効率による。これＶｉｍＲＮ
Ａへのりボゾームの結合の効率および宿主細胞中でのｍ
ＲＮＡの安定性に依存する。真核細胞では翻訳効率を支
配する要因はよく理解されていないが、翻訳を開始する
ＡＵＧコドンを囲む核酸配列に好ましいものがあるらし
い（Ｋｏｚａｋ、　Ｃｅ１ｌ　。

４４巻、２８６頁（１９８６年）〕。ｍＲＮＡの安定性
に影響する因子は原核細胞、真核細胞のいずれでもまだ
よくわかっていないが、得られる蛋白質生産量にＭ要な
影響をもつ。

現在までの組換えＤＮＡ分野での仕事はほとんどＥ、　
ｃｏｌｉのようなバクテリアの発現系を使用したものに
焦点があった。しかし、バクテリア細胞の使用には多く
の好ましくない要素がある。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉで
生産されるほとんどの蛋白質およびポリペプチドはべり
プラズム空間に蓄積する。従ってこれらの遺伝子産物の
回収には細胞の破砕が必要で、これは不完全であると共
に目的産物を多くの他のＥ、　ｃｏｌｉ細胞成分から精
製しなければならず、精製で大きい問題となる。また、
バクテリアは、多くの興味ある遺伝子産物の生合成に必
要な糖鎖結合を行なうことができない。さらに、バクテ
リアでは多くの真核細胞蛋白質の適当な構造および生物
活性に必須である特定のＳ−Ｓ結合を形成することが出
来ないと思われる。

バクテリアの発現系での欠点を克服するために遺伝子工
学の注意は組換えＤＮＡ分子の発現に真核宿主細胞を使
用する方向に強まっている。酵母や動物細胞は目的遺伝
子産物を培養液中に分泌でき、しかも必須の糖鎖結合も
行なうことが出来る。しかし、組換えＤＮＡ分子のクロ
ーニングおよび発現に動物細胞を利用するのにも解決し
なければならない技術点短所がある。例えば、バクテリ
ア中で非常に有効であった外来プラスミドは高等真核細
胞では複製できない。七の結果、他のアプローチを採用
しなければならない。

一つのアプローチはＥ、　ｃｏｌｉと同じように簡単に
生育、増殖できる下等真核酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用することであった。

酵母のクローニング系は既にある。そのような系を用い
てヒトインターフェロン遺伝子の酵母中での効率よい発
現も成功している（　Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２９３巻、７１７貞（１９８１
年）〕。

しかしインターフェロン遺伝子はイントロンを含まない
。酵母細胞はイントロンを含む少なくとも一つのへテロ
な唾乳動物遺伝子、既ちウサギβ−グロブリン遺伝子、
を正しく転写しないことがわかっているＣ　Ｂｅｇｇｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２８３巻、８
３５頁（１９８０年）〕ので酵酵母金主として動物遺伝
子の発現を行なう場合には、イントロンが存在するかし
ないかを考慮しなければならない。

他のアプローチとしては、異榎遺伝子全直接取シ込みに
よシ哺乳動物細胞に挿入するものがある。

例工ば、クローン化遺伝子をリン酸カルシウムと共沈澱
することにより行ない、この方法では細胞のお工そ１−
２チが通常ＤＮＡの取シ込みを銹導さｎる。しかし、こ
のよ５に低レベルの取り込みでは目的遺伝子産物の発現
の程度も低い。チミジンキナーゼ遺伝子を欠損する哺乳
動物細胞（ｔｋ−細胞）が得らｎ＼ばｔｋ遺伝子と共−
形質転換と行なった、選択条件下で中背することにより
より良い結果は得られる。ＴＫ−細胞はＨＡＴ　（ヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地中で生育
できない。これらの細胞はｔｋ遺伝子を＠有する外部Ｄ
ＮＡ　（例えばヘルペス・シ／プンノクスウィルスＤＮ
Ａ　）をリン酸カルシウムとの共形質転換により取り込
むと、欠損酵素活性を回復する。ｔｋＤＮＡと共有結合
した他のＤＮＡ分子またはそれと単に混合したものも細
胞に取り込まれて同時発現することも多いＣＳｃａｎｇ
ｏｓら参照、（）ｅｎｅ、１４巷、１頁（１９８１年）
〕。

三つ目のアプローチは異種遺伝子を咽乳動物細胞中に導
入するためにウィルス遺伝子をベクターとして利用する
ものである。シミアンウィルス４０、乳頭腫ウィルスお
よびアデノウィルス遺伝子を基にしたベクターは報告さ
れている［Ｐ、Ｗ、Ｊ。

Ｒｉｇｂｙ、　”　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１
ｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　１ｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃ
ｅ１ｌｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｌ／ａｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ　Ｖｉｒａｌ　Ｒｅｐｌｉ
ｃｏｎｓ　”、　：　Ｃ）ｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｕｅ
ｅｒｉｎｇ。

３巻；　Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　＠集、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　＝ニーヨーク、８３−１４１頁
（１９８２年）の総説参照のこと〕。しかし、これらの
ベクター系は宿主範囲が限られているという欠点がある
。その上、これらの系でのウィルス複製によジ宿主細胞
の死滅が生じる。レトロウィルスＤＮＡの調節要素を使
用することによυこれらウィルスベクター系の短所の多
くを避けることができる。例えば、（）ｏｒｍａｎら（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、　７９巻、６７７７頁（１９８２年）〕はラウ
スデルコマウィルスの長い末端リビー）　（ＬＴＲ）は
強いプロモータであシ、ｃｖ−１サル腎臓細胞、トリ胎
児繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅ
Ｌａ細胞およびマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む各種細
胞にＤＮＡ−仲介トランスフェクションによシ取り込ま
れる。

遺伝子発現の調節が遺伝子のコード配列の直前または直
後の配列である５′および６′側の非コード領域に工り
成されるという事実は癌遺伝子および高等真核細胞のｍ
ＲＮＡの研究から明かとなっている。これらの配列を削
除または改変した時の遺伝子発現への影響が真核細胞で
観察されている。例えは、Ｔｒｅｉｓｍａｎ　［Ｃｅ１
ｌ、４２巻、８８９頁（１９８５年）］はクローン化し
たヒト　ｃ−ｆｏｓ遺伝子（）Ｉ’ＢＪネズミ骨肉腫ウ
ィルスが保有するｃ−ｆｏｓＨと命名した癌遺伝子の細
胞ホモログ）をトランスフェクトしたマウス繊維芽細胞
で、血清誘導の後ｃ−ｆｏｓ　ＲＮＡが蓄積することを
見つけた。

通常、この細胞を血清誘導するとｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡ
の強いが一時的な増加が見られ、それは１０〜１５分で
最大となって急速に減少し、ｍＲＮＡの急速な分解のた
め１〜２時間で誘導前の値に戻る。

しかし、ｃ−ｆｏｓＨの５′末端配列を正常なｃ−ｆｏ
ｓＨ６′側末端配列非存在下で異種遺伝子と融合すると
、得られる遺伝子は血清因子によシ誘導と受けるがその
結果生成するｍＲＮＡは血清誘導の後４時までも持続す
る。雑種転写単位の実験からｃ−ｆｏｓＨ遺伝子の６′
末端および６′の非コード領域を含有する遺伝子のみが
誘導の後典型的な急速なｍＲＮＡ分解を示す。従って、
ｃ−ｆｏｓの６′末端はそれを含むＲＮＡを反安定化す
る作用があるのであろう。これらの配列の削除または修
飾によシ遺伝子発現にプラスの効果があると思われる。

６′の非コード領域の調節の役割はさらにＳｉｍｃｏｘ
ら（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５巻、３６９
７頁（１９８５年）〕のキイロショウゾヨウバエの熱シ
ヨツク蛋白質に関する研究に工）裏づけられた。キイロ
ショウジョウバエを常温から３７°Ｃに生育温度をシフ
トすると、数多くの熱シヨツク蛋白質を急激に生産し、
七の中の主要蛋白質はｈｓｐ　７０と呼ばれる。温度シ
フトはＲＮＡ生成の増加を誘導する。正常の生育温度に
戻った後、ｈｓｐ　７　Ｑ遺伝子の転写は急激に抑制さ
れ、対応するｍＲＮＡレベルも急激に低下し、その結果
ｈｓｐ　７　Ｑ蛋白質の合成も急速に終了する。Ｓ　ｉ
ｍｃｏｘらはしかしながら、熱ショックから解放後のｈ
ｓｐ　７０の蛋白質合成の急激な抑制は３′配列を除去
しておくと遅くなる事を見つけ、６′配列が通常、温度
低下の後のｈｓｐ　７０　ｍＭＡの非安定化に作用する
ことを暗示している。

ｍＲＮＡ制御の役割は５′側の非コード領域にもあるこ
とを示す事実が得られている。Ｂｕｔｎｉｃｋら（Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５巻、６（１１）９頁
（１９８５年）〕はヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子（トリ骨髄球
種症ウィルス癌遺伝子の細胞ホモログ）のおよそ５５０
ヌクレオチドを含む５′非コード配列（ｅｘｏｎ　ｉと
命名）が、開始点欠損シミアンウィルス４０で形質転換
したｃｖ１サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞と命名）中で該遺
伝子を保有するプラスミドの″発現に影響することを見
つけた。ｃ−ｍｙｃ遺伝子の５′非コ一１配列を削除し
たプラスミドからの転写物は完全な遺伝子を保有するプ
ラスミドからの転写物よりも高い定常状態で存在するこ
とがわかシ、これは５′の非コード配列が対応するｍＲ
ＮＡを何らかの方法で非安定化する作用があることを示
している。

別の実験でＲａｂｂｉｔｔｓら（ＥＭＢＯＪ、　４巻、
６７２７負（１９８５年）〕はｃ−ｍｙｃ遺伝子からエ
クソン１を削除すると、Ｃ０Ｌ０３２０　ｍ胞中でｃ−
ｍｙｃｍＲＩＪＡの安定性が増加することを見つけた。

同じようにＥｉｃｋら（ＥＭＢＯＪ、　４巻、６７１７
頁（１９８５年））はバーキットリンパ腫細胞で、Ｃ−
ｍ７ｃ遺伝子のエクソン１に転位が起っていると生成す
るｍＲＮＡがはるかに高い安定性を示すことを明かにし
た。

上述の文献は全て、多くの遺伝子でその５′および６′
の非コード領域がそれらの遺伝子から転写される対応す
るｍＲＮＡの不安定性に何らかの関与をしていることを
示す。それらの非コード領域の削除または変化にようｍ
ＲＮＡの安定性が増加し、従って全体の遺伝子発現レベ
ルが上る。しかしながら、その工５な非コード配列の修
飾や削除の遺伝子発現への効果は確信もって子側するこ
とは出来ない。

例えば、Ｊｏｈａｎｓｅｎら（：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１巻、７６９８頁（１９８４年）〕は
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのがラクトキナーゼ
（ｇａｌＫ　）遺伝子と融合した遺伝子調節要素を含む
組換ベクター糸で、５′側の非コード領域の長さを変え
た。

その結果、非コード領域の長さを変えてもｇａｌＫ発現
には全く影響しなかった。同様にＫａｔｚら（Ｍｏ１．
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　６巻、６７２頁（１９８６年）〕
はトリレトロウィルスｍＲＮＡの５′側の非翻訳リーダ
ーに削除と置換との両方を行なった。全体として、これ
らの削除および置換によ、！ｌ）　ｅｎｖ遺伝子の発現
は実質的に低下した。しかし、これらの発現の低下はｍ
ＲＮＡ分子の数の減少によるものでなかった。それは非
コード領域の変化の結果、翻訳の不完全が起シ、全体の
発現低下となったのである。

インタリューキン−２（ＩＬ−２）はリンパ球の反応性
を調節し、抗体特異性のＴ　＋　＋７ンパ球の長期試験
管内生育を促する可溶性蛋白質である。

過去にはＩＬ−２はマイトジェン誘導動物培養細胞の上
澄液から主に単離された。例えば、Ｍｏｒｇａｎら（５
ｃｉｅｎｃａ　１９３巻、１（１１）７頁（１９７６年
）およびＲｕｓ　ｃ　ｅ　ｔ　ｔ　ｉら（Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、１１９巻、１６１頁（１９７７年）〕は正常
植物性血球凝集素（ＰＨＡ　）誘導ヒトＩＪンパ球の上
澄液を集めてＩＬ−２を回収している。−万、ｇｉｌｌ
ｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ　２６８巻、１５４頁（１９７７
年）〕はコンカナバリンＡで誘導した正常ＤＢＡ　／　
２マウス牌臓細胞を蛋白質源として使用した。最近では
５ｔｅｒｎ　［米国特許４，４９０．２８９　）はＩＬ
−２の原料として誘導ヒト悪性細胞を使用している。

ＩＬ−２生産を組換えＤＮＡ手法を用いて行なう検討も
成されてきた。例えば呑口ら（Ｎａｔｕｒｅ３０２巻、
６０５頁（１９８３年）〕はジュルカソト白血病細胞株
からのメツセンジャーＲＮＡから調製したヒトＩＬ−２
をコードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ　）の配列分析、ク
ローニングおよび発現を報告している。ＩＬ−２の発現
は呑口らによりサルＣＯ８培養細胞で行なわれているが
、著者らによるとｚ、　ｃｏｌｉＯ組換えＤＮＡベクタ
ーを用いたＩＬ−２の発現の研究も進行中で、間もな（
Ｅ。

ｌ　　ｃｏｌｉ系でのＩＬ−２の大量生産が可能となる
だろうと報告している。ＩＬ−２は細胞中で１５６アミ
ノ酸残基のポリペプチド前駆体の形で合成される。細胞
から分泌される際に２０アミノ酸残基の長いシグナルペ
プチド配列が切断される。成熟ＩＬ−２はアミノ酸残基
１６６のポリペプチドとして細胞から分泌される。Ｅ、
　ｃｏｌｉ中での成熟ＩＬ−２の発現にはＩＬ−２をコ
ードする遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列部
分を組換えＤＮＡ法に工す除去する必要がある。それは
Ｌｃｏｌｉでは真核細胞のシグナルペプチド配列を切断
できないからである。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（５ｃｉｅｎｃｅ　２２３巻、１
４１２頁（１９８４年）〕もゾユルカット細胞株から単
離した遺伝子を用いてＥ、ｃｏｌｉ中でＩＬ−２を発現
した。最近、５ｏｕｚａら〔欧州特許出願ＡＩ　１３６
，４８９）は成熟ＩＬ−２のアミン配列および性状を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子より成る化学
合成りＮＡ配列をクローニングし、微生物中で発現した
と報告している。５ＯｕＺａらはまた、天然のＩＬ−２
とアミン配列の異なるＩＬ−２アナログを生産するのに
合成遺伝子を利用することも開示している。５ｏｕｚａ
らの特許出願で示される実施例では宿主としてＥ、　ｃ
ｏｌｉ　ｋ使用している。

Ｂａｒｒら〔国際特許出願８５１０２２（１１）番〕は
化学合成したと）ＩＬ−２遺伝子の酵母でのクローニン
グお工び発現を報告している。

本発明はヒトインタリューキン−２（ＨＩＬ−２）およ
びシグナルペプチド配列をコードし、ＨＩＬ−２および
シグナルペプチド配列をコードして遺伝子の５′側非コ
ード配列を異種の５′非コード配列、例えばラットのイ
ンシュリン遺伝子、好ましくはラットのプロインシュリ
ンＩ遺伝子の配列と置換した遺伝子よυ成るＤＮＡ配列
に関するものである。

さらにシグナルペプチド配°列をコードする頭載である
隣接ヌクレオチドを対応する異種配列、即ち、上述の異
種５′非コード配列に隣接するシグナルペプチド配列を
コードするヌクレオチドで置換することも本発明の範囲
である。シグナルペプチド配列をコードする頭域のヌク
レオチドヲ置換する場合にはＨＩＬ−２遺伝子の読みワ
クが維持さｎるよう注意する必要がある。さらに本発明
は、上記定義のＤＮＡ配列を含む組換えベクターおよび
上記ＤＮＡ配列またはそれを含有する組換えベクターを
保有する動物細胞に関するものである。本発明はさらに
、ヒトインタリューキン−２の製造方法、該製法により
得られるインタリューキン−２それ自体およびヒトイン
タリューキン−２の疾患治療および予防への使用に関す
るものである。さらに、本発明はそのようなインクリュ
ーキン−２を含有する医薬組成物に関するものである。

ＨＩＬ−２の天然のｂ′非コード配列′ｓ？よびシグナ
ルペプチド配列上コードする配列の最初の４ヌクレオチ
ドＡＴＧＴ　會ラットのインシュリン遺伝子、具体的に
はラットのプレプロインシュリン■のシグナルペプチド
配列ｔコードする配列のヌクレオチドＡＴＧＧＣＯＣＴ
ＧＴＧＧＡＴＣＧ　、で置換した新規なりローニングお
よび発現ベクターを使用することにより、ＨＩＬ−２の
凡くべき高い発現が得らｎた。シグナルペプチドは成熟
段階で切断されるため、ＨＩＬ−２シグナルペプチドの
Ｎ宋端の改変は生産細胞から分泌される成熟Ｈ工Ｌ−２
ポリペプチドには全く影響しない。

本発明は以下の図面（一定の尺度で描いてない）を参照
することによりよシ容易に理解される。

第１図はＨＩＬ−２発現ベクター構築のための出発ベク
ターであるプラスミドｐＢ０１２Ｍ工を図示したもので
ある。

第２図はプラスミドｐＢｃ１２　／　ＲＥＶ　／　ＩＬ
−２中の新規シグナルペプチドのＮ宋鴻の構造およびプ
ラスミド構築に使用したインシュリンおよびＨ工り一２
配列を示す。特定の制限および結合部位に下線を引いで
ある。

第３図は最終のＩＬ−２発現ベクター、ｐＢＣ１２／Ｒ
ＳＶ　／工Ｌ−２　／　ｄｈｆｒの図示である。

第４図はｐＢｃ４０ΔＴ構築のため部位考異変真により
プラスミドｐＢｃ４０から削除しｔヌクレオチド配列を
示す。

本発明の方法は順序に従って以下のステップを伴なう。

（１）ＨＩＬ−２お工びシグナルペプチド配列をコード
するＤＮＡ配列の調製、（２＋５’−非コード配列およ
び多分そｎに隣接するシグナルペプチド配列をコードす
る部分配列のヌクレオチドの相当する配列、好ましくは
ラットのプレプロインシュリン■遺伝子の配列とのＨＩ
Ｌ−２コード領域の挽みワクを維持した−ま＼での置換
、（Ｊ）；ｎｒ規ＤＮＡ配列を含有する組換えベクター
の適当な哨乳動物宿王細胞への挿入、（４１新規Ｈ工Ｌ
−２遺伝子の増幅お工び修飾宿主細胞の選択、および（
５）生産したＨＩＬ　−２の同定と精製。

不明ＩＩＩＩ書で使用する「ヒトインタリューキン−２
」或いは「ＨＩＬ−２」という言葉は上述のＤＮＡ配列
またはその改変配列によυ転質転換まｆｃはトランスフ
ェクトてれた哺乳動物細胞により生産される糖鎖のつい
た蛋白５Ｌを言う。ＤＮＡ配列は；（ａ）天然のヒトイ
ンタリューキン−２のアミノ酸配列と少なくとも実質的
に同一のアミノ酸配列を有し、（１））天然ヒトインタ
リューキン−２に共通した生物活性を有する蛋白質全コ
ードする。アミノ酸配列の実質的向−というのは配列が
同一であるか或いは天然ヒトインタリューキン−２と合
成蛋白質との間に悪い機能的差を生じないような一個ま
たはそれ以上のアミノ酸の変化（削除、挿入、または置
換）を意味する。

七のような蛋白質の例は欧州特許出願 インタリューキン−２分子である。こｎらのインタリュ
ーキン−２ポリペプチドはバクテリア系で成熟しに形で
生産される。

ヒトインタリューキン−２およびシグナルペプチド配列
をコードするＤＮＡ配列はこの技術で通常用いられるい
かなる方法ででも調製できる。例えば、ＨＩＬ−２合成
のできるヒト細胞株ｉＨ工Ｌ−２ｍＲＮＡを合成するた
め誘導し、ｍＲＮＡ　’ｆｌ鋳型としてＨＩＬ　−２ｃ
ＤＮＡ　ｆ作成する。、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（５ｃｉ
ｅｎｃｅ　’１２５巻、１４１２頁（１９８４年）］は
同様なｃＤＮＡ　ｋ作成するのにヒト白血病Ｔ−細胞株
および正常ヒト末梢ｍ　ＩＪンパ球を用いた。呑口ら（
Ｎａｔｕｒｅ　３０２巻、３０５Ｅｆ（１９８３年）〕
は同じ目的のためヒト白廂病Ｔ−細胞ケ使用した。

呑口らはヌクレオチド配列？開示したので、ＨＩＬ　−
２およびシダナルジペプチド自己夕１１　’にコードす
るＤＮＡ配列會ホスホトリエステル法或いは他の方法を
用い、好ましくは固相法で化学合成することも出来る。

そのような化学合成はＢＯｕＺａら〔欧州特奸出ＪＢＩ
Ａ１　１３６　４８９）により記載されている。Ｂａｒ
ｒら〔国際時許出ａｗａ８５１０２２（１１）コも、比
較的短いオリゴヌクレオチド全合成し、そ詐らを結合す
ることによりＨ工Ｉ、−２遺伝子を調製した。また他の
方法により、ＨＩＬ−２′に生産できるヒト細胞から遺
伝子ＤＮＡ　？！−早離することもできる。ＨＩＬ　−
２ａ伝子は報告されているＨＩＬ−２遺伝子＾じ列に基
づい′ｆｃ佛識ＤＮＡプローブを用い、標準ハイブリダ
・ｆゼーション法により同定できる。

本発明の例示的具体例では、ＨＩＬ−２の４５９ｂｐの
全コード傾城に３１　’ｂｐの５′仲非翻訳配列お工ひ
３（１５）　ｂｐの６′側非翻訳配列がついたｃＤＮＡ
コｖ−１含むプラスミドル工Ｌ−２−２ｂをヒトインタ
リューキン−２およびシグナルペプチド配列をコードす
るＤＮＡ配列の原料として用いた。このＨ工り一２　Ｃ
ＤＮＡコピーのｐＸＬ−２−’ｌｂプラスミドへのクロ
ーニングはＳｍ１ｔｈら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
Ｃａａ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｅｌ、Ａ、　８２巻、８４０４頁（１９８５年〕〕
により報告されている。ＨＩＬ−２遺伝子葡クローン化
するのに用いた方法のため、ｃＤＮＡにｒ、１ｏ−ｃホ
モｄ〈ＩＪママ−列とそれに続くＢ已ｍＨ工部位が結合
している。

５′の非コーＶ配列および恐らく隣接するＨＩＬ−２の
シグナルペプチド全コードする部分配列のヌクレオチド
の置換および得らｎるＩＪＮＡ配列の適当な発現ベクタ
ーへの挿入は必要な配列およびクローニングベクター全
回じ制限酵素で切断すると容易に得られる。相補的ＤＮ
Ａ末端を有する断片が生成し、それらは相互に容易に結
合するからである。

これが出来ない場合には、切断末端全修飾すること、例
えば−重鎖ＩＪＮＡ才端を消化して平滑末端とすること
、が必侠となる。−不知床端をＤＮＡポリメラーゼへの
フレナラ断片のような適当なりＮＡポリメラーゼによっ
て充填することによっても同様な結果が得られる。平滑
末端は次にＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ等を用いて酵素
結合する。

ベクターへのＨＩＬ−２ｍ仏子の挿入のためにもＤＮＡ
　！端にヌクレオチド配列（リンカ−）を結合すること
により目的のどんな結合部位ケも作ることが出来る。そ
ｎらのリンカ−は制限酵素の認識部位ｋｍむ特定のオリ
ゴヌクレオチド配列より成る。開環したベクターおよび
Ｈ工Ｌ−１１−コードする修飾１）ＮＡ配列もＭｏｒｒ
ｏｗ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｋｎｚｙｍｏ−１０ｇ
７６８巻、６員（１９７９年）〕によシ記載されるホモ
ポリマーティリングにより修飾できる。

本発明の実施では、王Ｌ−２遺伝子の５′非コード配列
は全てラットプレプロインシュリン■遺伝子の対応配列
と置換されてなげｎばならない。

Ｈ’ＩＩＩ　−２遺伝子の隣接するコード配列のいくつ
かのヌクレオチドも削除さｎてい工もよいが、それはこ
れらの配列が最終的にはＨ工Ｌ−２遺伝子が挿入さｎ発
現する宿主？ｌ胞中で成熟の過程で切断されるシグナル
ボリペプチドヤコードしているからである。勿論コー　
ド配列の惟域全削除しすぎるとシグナルポリペプチド機
能を失ない、その結果生成Ｈ工Ｌ−２ｍ胞からの適当な
分あが妨げられる。

本発明の例示的実施態様では、ｐｂｃ１２Ｍ工と命名し
た真核細胞発現ベクター會発現ベクターおＬびラットプ
レプロインシュリン証遺伝子配列の亦料として使用した
。天然５′非コード領域およびコード配列の最初の４つ
のヌクレオチドを削除したＨ工Ｉ、−２遺伝子をベクタ
ーｐＢｃ１２Ｍｌ中にラットプレプロインシュリン］遺
伝子の対応する配列に並べて挿入することによジ５′非
コード頒域の置換ができる。

ベクターｐＢＣ！１２Ｍ工はＢｕｔｎｉｃｋら（Ｍｏ１
．　Ｃｅ１ｌＢｉｌｌ　５巻、６（１１）９頁（１９８
５年）〕により詳細に記載さｎている真核細胞発現ベク
ターｐＢａ１２Ｂｌと類似している。本ベクターはｐＢ
Ｒ３２２由来のプラスミドベクターｐＸｆ３　（Ｈａｎ
ａｈａｎ、　Ｊ−Ｍｏ１．Ｂ１０１１６６巻、５５７頁
（１９Ｂ３年）〕を基本とし、さらに５ｖ４０　ｏｒｉ
　’１Ａ域およびラウス肉腫ウィルスの効率よい長い末
端リビー）　（ＬＴＲ）プＣ１−Ｆ−−タ（Ｇｕｎｌａ
ｎら、Ｎａｔｕｒｅ　５　［１７巻、２４１頁（−１９
８４年）〕およびラットインシュリン猛遺伝子の遺伝子
コピーＱ　Ｌｏｍｅａｉｃｏら、Ｑａｌ１１８巻、５４
５員（１９７９年）〕を含んでいる。

以下に述べる構築に使用したベクターｐＢｃｉ　’２ｊ
Ａ工はｐＢＣｌ　２”工と同一で、但し、含まれるＬ’
Ｉ’Ｒ断片が３′力向にさらに７０　ｂｐ長くなってい
るものでおる（第１図参照）。この差はベクターによシ
コードされる遺伝子の発現レベルには影響しない。

勿論、先ず始めに５′非コード領域および開始コドンが
ラットインシュリン遺伝子の配列と置換した工Ｉ、−２
遺伝子’ｉ　ＤＮＡ組換えまたは直接的化学合成により
調製し、次に適当なベクターに挿入することもできる。

哺乳動物細胞での使用に適し、本発明で用いることので
きるベクターとしては、ｐＢｃｌ　２Ｍ工、ｐＢｏｌ　
２Ｂ工、ｐｓＶ２ａｈｆｒ　、　ｐ９１０２３（Ｂ）、
ｐｃＤＶｉおよびｐＲ８Ｖｃａｔがあるが、これらに限
定さｎるものではない。これらのベクターは転質転換、
転質尋入讐にはトランスフェクションにより適当な哺乳
動物宿主細胞に導入さｎる。

本発明で使用できるクローニングベクターの多くは、例
えばｐＢ０１２Ｂ工および１）ＢＯ１２Ｍ工のアンｔシ
リン耐性およびｐＢＶ２ａｈｆｒのジヒドロ葉酸レダク
ターゼ活性のような、目的の形質転換株？１１−選択す
るのに利用する一つまたはそれ以上のマーカー活性をコ
ードする遺伝子（選択用遺伝子）を含む。

ベクターがないとそのような活性會呈すことのない宿主
で、そのベクターが挿入さｎた宿生全選択することによ
り操作が非常に容易になる。その場合、細胞を、プラス
ミド保有形質転換株のみが生育できるような制限条件下
で生育させる。

本発明の好ましい具体例では、Ｈ工Ｌ　−２生産プラス
ミドは、通常ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を持たない
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−
Ｆ８胞）に対してジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を付加
する。ヒポキサンチンおよびチミジン全欠く培地中で生
育することにより、形質転換株を容易に非転換株から選
択できる。

宿主細胞では欠如している活性がプラスミドに存在する
ことは形質転換株の選択にもう一つ有利な点がある。制
限生育下でｄｈｆｒ遺伝子の多コピー七保有し、発現す
る転換株は一個または数コーーで低レベルのｄｈｆｒ発
現している転換株より早い速度で生育する。従ってその
ような条件で発現するｄｈｆｒ遺伝子のコピー数が増加
または増幅した細胞を選択できる。発現したい目的の遺
伝子がプラスミド中でこの選択用遺伝子の近辺にあれば
、目的の遺伝子も一緒に増幅され、該遺伝子の発現も増
加する。本発明では転換株全プリンの新合成の阻害剤で
あるアミノプテリン全徐々に高濃度に含有しｆｃ培地で
培養することによりジヒドロ葉酸レダクターゼおよびＨ
工Ｌ−２の両方の生産レベルを高めた。不法は［共増＠
（コ・アンプリフイケーション〕」と呼ばれる。

本発明では他の同様な選択用遺伝子系を使用できるが、
必ずしも全の系で共増幅が起るものでもない。例えば、
他の系で共増幅が起らないものとしてＥ、ｃｏｌｉのキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
をコードするｇｐｔ遺伝子がある。　Ｍ（１０）ｌｉｇ
ａｎら［Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩＡａａｄ日ｃｉ　。

Ｔ１．Ｓ、Ａ、、　７８巻、２０７２貞（１９８１年）
〕はｇｐｔ遺伝子を保有するプラスミドでトランスフェ
クションさｎたサルおよびマウス細胞全選択する（７）
Ｋ細胞をミコフェノール酸（グアニル酸の新合成のＩＪ
Ｗ剤）、アデニンおよびキサンチン存在下で培養した。

この系での選択はさらに選択培地にアミノプテリン（ア
ミノプテリンのアナログ）全添加することにより高めら
ｎる。

他の選択系としてはバクテリアのアミノグリコシド６′
−ホスフォトランスフェラーゼ、バクテリアのネオマイ
シンおよびカナマイシン耐性ケ呈する産物、の遺伝子が
用いられる。ｃｏｌｂｓｒｅ　−Ｇａｒａｐｉｎら［Ｊ
、　ＭＯ１’　Ｂｉｏｌ、　１５０巻、１頁（１９８’
１年）〕はヘルペスシンプレックスウィルスのチミジン
キナーゼ（Ｈ８Ｖ　ｔｋ　）遺伝子プロモータの制御下
にあるフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子を保有する
プラスミドでトランスフェクトしだ補乳細胞ｆＡ択する
のに、剛胞ｋＸ核細胞の蛋白合成を阻害する２−デオキ
シストレプタミン抗性物質であるＧ−４１８存在下で生
育させた。Ｅｅｒｇ［８ｃｉｅｎｃｓ２１３巻、２９６
頁（１９８１年）〕はホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子がＳＶ４［］プロモータの制御下にある一連のｐｓＶ
ベクターを用いて同じ結果ケ得ている。

４ｆ：産細胞より分泌したＨ几−２は本技術で仰ら１し
るどんな方法によっても培地中で同定できる。

例えば、増殖に関してＨ工Ｌ　−２依存性の細胞上使用
したバイオアッセイを用いることが出来る。さらに、Ｈ
工Ｌ−２に対する抗体を用いてラジオイムノアッセイ′
または酵素結合免疫アッセイを利用することもできる。

ポリアクリルアミドデル電気泳動ノ後りエスタンプロッ
ト〔・ｒｏｗｂｉｎ　Ｃ）、ＰｒｏｃＨａｔｅ、　Ａｃ
ａ、１−８ｃｉ−Ｕ、Ｓ、Ａ、　７　（５巻、４５５０
頁（１９７９年）］Ｌ９ユ同様な分析方法も使用できる
。また、高速酸体クロマトグラフィー（ＨＰＬＯ）もｑ
ｔｅｒｎ　［米国”４　許４，４９　ｏ、２８９番〕に
より記載さｎているように使用できる。

本発明のＨ工Ｌ−２は硫酸ナトリウムまた硫酸アンモニ
ウムなどの埴による沈澱、限外濾過まｌζはこの分舒に
熟練した名に工く仰られるその他の方法により濃縮さ７
Ｌる。その後の和製はデル濾過、イオン又換クロマ１グ
りフィー、分虚用′４気永動、イソエレクトロフォカス
、低己刊＜ｆＡ　’ｋｊ　Ｗ分画、ＨＰＬＣ、或いは向
流分配などの退席の蛋白和製技術により達成できるが、
こｌＬＩ：）に限定さ九るものではない。Ｇｔｅｒｎ　
Ｃ上述）により２歳て几る方法−イｉド　Ｌ會〕１ト　
入ＩＩ）Ｌ−ｔｂ：乙　−ヤ　Ｉ　、ｌＡ一本発明によ
ると、前述の和製Ｈ工Ｌ−２は例えば免疫低下状態の治
療などの疾患の治療および予防に他の免疫調節化合物と
同じ目的で使用される。

これは医薬的に容虻さｎる経口、注射または局所用組成
物として投与される。投与量および投与頻度は現在臨床
に使用されている既仰の免疫調節化合物と相関し、典型
的には一日およそ１−２（１１）ＸＩＯ’単位である。

不発明のこれらの医薬組成物に該Ｈ工Ｌ　−２，と共に
適合した医薬的１ｆ−１’容相体物質を含も・。通常の
どんな相体物質でも利用できる。

囲体物質は経口、公皮または非経口投与に通した有機ま
たは無機の不活性相体物質などである。適当な相体とし
ては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、でん粉、ステ
アリン酸マグネシウム、メルク、植物性油脂、？リアル
キレングリコール、特にボリエ°チし・ングリコール、
黄色ワセリン等がある。さらに、医薬調製物は他の医薬
もら性Ａｉｌ　’、を含ひことができろ。孔料、保存剤
、安定剤、乳化剤、緩備剤などのｇ：ｊ加物も医３５品
に１製のＷト容実施に沿って添加できる。

医薬調製物は如何なる適当な医薬剤型にも作成でき、例
えばａ）！’剤、カプセル、ピル錠、粉ス、顆粒などの
固型剤、ｂ）溶液、シロップ、けん濁液、エレキシル等
の液剤、Ｃ）滅菌水、滅菌けん濁液または乳化液のよう
な非経口投与剤、およびｄ）溶液、けん濁液、軟膏、ク
リーム、デル、微細粉末、エアロゾール等の局所投与剤
などがある。

医薬調製物は滅菌し、そして／または保存剤、安定剤、
湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塙、および／または緩
衝剤のようなアジュバントに含有できるＯ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　曳非経口剤型は冷浸剤また
は静注或いは筋注用注射剤である。こｎらの剤型もまた
他の医薬活性物質を含むことができる。医薬製剤で許容
される実施に沿って保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤な
どの添加剤ｋｍ加しても構わない。

実施例 以下の実施例は制限することな（Ｈ工Ｌ−２０晴乳動物
細胞中でのクローニングおよび発現を実施する方法を示
す。以下の例によりＨ工Ｌ−２遺伝子の正常な５′非コ
ード碩域をラットインシュリン遺伝子の配列と置換した
事によるｌＪ！云子発子発現強が証明される。

ＤＮＡの調製 定常期の一晩培養物よりプラスミドＤＮＡの小規模単離
はＢｉｒｎｂｏｉｍら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ａｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ７巻、１５１６頁（１９７９年）〕の
方法に促って行なった。本法では分析用の少雪のＤＮＡ
をバクテリア培養物より単離することが出来る。特に記
載しない限り、大量のプラスミｌ−’ＤＮＡはｃ１θｗ
ｅｌｌら（、Ｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１　Ｑ巻、
１１３５＠（１９７２生り〕の記載の通りｖ！４製した
。プラスミドＤＮＡな特定の制限酵素で切断して得られ
る断片は１％の低融解アガロース（５ｅａｐｌａｑｕｅ
　、　ＪＦＭｃ工ＱＣ，、メイン州ロックランド）中の
分離用電気泳動で単離した。

ＤＮＡは先ずトリス−酢酸緩衝液中で９Ｘ５’凛デルで
分離しく　ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃ（１０）ａ
ｒ　（３１ｏｎｉｎｇ：ムＬａｂｏｒａｃｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ　、　１９８’１手、ＯＯ］１１１−５ｐｒｉ
ｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　４５４
貞〕、次に１μｐ／ｍｅ、エチソウムデロミドで栗色し
て検出した。

目的のＤＮＡ断片を言むｒル切片を切り出して６５°Ｃ
１０分間融屏し、２０ｍＭ）リス■塩酸（−７・４）、
０．２　Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ｆｆ１ＤＴＡ　５　ｍ
ｌで希釈した。次にＤＮＡをＫｌｕｔｉｐ−Ｄカラム（
５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎａ　５ｃｈｕｃｌｌ工ｎｃ
、、ニューＩ・ンプシャー州キーン）を用いテ製造元の
指示に従って−一し、酵母ｔＲＮＡ　（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｓａｃｅｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、メ
リーランド州ベセスダ）１０μＩの存在下−２０″Ｃで
エタノール化でんを行なった。

酵素反応 罪１限酵素、ＤＮＡポリメラーゼエ（フレナラ断片）お
工びＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪが一ゼはマサチュセツツ州の
Ｎｅｗ　ｆｆｌｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの製品で
ある。これらの酵素の使用法および吠用粂件は本員的に
は製遺元のものと同じである。

＋ｔｊｌｌ　Ｉｔエンげヌクレアーゼについては、１単
位の活性は全反応液０−０５ａＪで６７°０６０分間行
なった消化で１．Ｏｐ、９のＤＮＡを完全に消化するの
に必要な酵累量と定義する。これらの酵素全てＶＣ［ｉ
用した緩衝液（以後制限酵素緩衝液という）は１（１１
）ｍＭ　　　ＮａＣ１、ｉ　　Ｑ　　ｍＭ　　）　　リ
　ス　−　塩ｔｆｉ　　（Ｐ）（７−５）　　、５　ｍ
Ｍ　’ｊｈｇ、Ｃ１２および１ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールエリ成る。

Ｔ　Ｊ　ＤＮＡ　Ｊ合反応ｄ４−０１６時間、６０ｍＭ
トリス−４戚（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　Ｍｇ０１２
．１Ｑ　ｍＭジチオスライトールおよび０．１　ｍＭ　
ＡＴＰｑ　含有する緩＃ｉ液（以後ライｒ−ンヨン護面
液と呼ぶ）中で行なった。Ｔ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーぜ
ｒ古注の１１１１泣はラムダＤＮＡのＨｌｎａ　ｌ断片
の５’　ＤＮＡ末端一度０．１２７’Ｍ　（３（１１）
μｊＪ　／　ｍｌ　）を反Ｌｒｆ；ｅ２Ｇｐｌ中で１６
’０６０分で５０％の結合を行なうのに必女な菫と定義
する。

ＤＮＡポリメラーゼエのフレナラ断片を用いた一本鎖Ｄ
ＮＡグ〕平滑末端乍成はｉ　ｍＭ　ａＧＴＰ　、　ａＡ
ＴＰ、ａｅＴＰ　’ｊｉ−工びａＴＴＰ馨言むＬｆ）に
調整した制限酵素後備牧牛で行なった。活性０１１−泣
は６７′ＣろＯ分間で１Ｑ　ｎｍｏｌθのデオキシリボ
ヌクレオチドを酸不靜性に変換するＩ！＃累の量と定義
する。

培養培地 イスコープの改良イーグル培地（工ＭＥＭ　）〔工５ｃ
ｏｖｅら、ｙ、ｇｚｐ、Ｍｅ（１，１４７巻、９２６頁
（１９７８ｆ−）］はニューヨーク州グランドアイラン
ドのＧｒａｎｃＬ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、より購入した。

ルリア堵地（Ｌ１２）は１リットル当り５９　ｔＲクト
イーストエキストラクト、１０ｙバクトドリゾトンおよ
び１０１　ｍａａｚを苫み、−は八５に調整する。アン
ぎンリンは６己載がろれば終一度５０μ／ｌ　／　ｒｎ
ｔで添加する。

ｌ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの菌株ｖ１．　Ｐｅ
ａｃｏｃｋら（Ｂｉｏｃｈｉｍ　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ａｃｔａ　６５５巻、２４６頁１９８１年）〕の方法に
従い、本質的に以下の通り形質転換した。ＬＢ培地で生
胃させた細胞を集め、Ｎｏｒｇａｒａら（、Ｔ、　Ｂｉ
ｏｌ、　ａｈｅｍ、　２２５巻、７６６５貞（１９８０
年）〕の方法により°形質転換りため調製した。但し、
Ｏａ、Ｃ１２緩衝液は７０ｍＭのＭｎ０Ｊ２．４　Ｑ　
ｍＭ　Ｎａ０ＡＣお工び３　［１ｍＭ　０ｔｓ０１２を
含有するように改変し、ＰＩ″ｌは５．６とした。

０ａＯＪ２緩４Ｊｉｉ液にけん濁した細胞試料１（１１
）μｌを５０から１．（１１）Ｏｎ、！ｉｌのＤＮＡを
含むシラスミげ試料５０　ｐｇと合わせる。混合物を氷
上に１時間保持した後、３７’Ｃで２分間加温する。細
胞をアンピシリン含有のＬＢＭ天培地上４　”Ｃでまい
てから６７゛Ｃ１６時間インキュベートして形質転換株
を選択する。

以下の逼り、Ｇｒａｈａｍら（ｖｔｒｏｌｏｇｙ　５２
巻、４５６頁（１９７３年）〕の方法によりチャイニー
ズ／・ムスター卵巣細胞をトランスフェクトした。

１リットル当り８１のＮａＣＡｔ　、　０−３７１のＫ
Ｃｌ　。

０．１２５１　ｃＤ　Ｎａ２ｆ（ｐｏ’、・２１（２０
，１１のグルコース、３Ｆのトリスおよび１２５ｍｍの
ＱｈＣ１２の混合液Ｑ、５　＃ｆｔ　Ｋ　ＤＮＡ　ｉｔ
　１０１’ｌ　’＜　２有したものを１１］’Ｍ３ポキ
サンチンお工び１０−６Ｍチミゾンサセの工Ｍｌ！ｉＭ
　４　ｔｔｄ３を含む６αのペトリ皿中の５Ｘ１０５個
の細胞に加える。混合成牛のＤＮＡは担体と［７ての５
μＩの仔牛胸線高分子量ＤＮＡおよびＰｖｕ工で開環し
たｐＢｏ　ｉ　２／ＲＢＶ／　ｆ　Ｌ　−２／、１ｈｆ
ｒＤＮＡ　５　ｉｌＭより取る。

培養を加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、６７℃
で一晩行なった後、培地を除去し、１０−４Ｍヒポキサ
ンチンおよび１０−５Ｍチミゾン（ＨＴ）添加の新しい
培地５　ｒｎｌと置換する。さらに−日インキュベート
の後、細胞をトリプシン−！ＤＴＡ溶液（Ｇよりｅりを
用いてぺｌ−ＩＪ皿エリ剥離し、透析した仔牛脂児皿ｙ
　（Ｆｃｓ）　１０％を言み、ＨＴ非含有のＸＭｌｇｔ
Ａ　２［１ｍｌを含有する２枚の１０ｍペトリ皿にプレ
ートする。さらに６７°Ｃで１０日間インキュベート仮
、標準のクローニングシリンダー法を用いてトランスフ
ェクトしたコロニーを単離した。

アフリカミドリプル腎臓細胞（ＣＯＳ）をＢｕｔｎｉｃ
ｌｃら（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５巻、６
（１１）９　Ａ　（１９８５年月の記載する方法を用い
てトランスフェクトする。

１０／：ｒｒＬｃｒ）組戦培養皿に、１３　％　Ｆｅ２
および５０μＩ／　ｌｎｌ　Ｕ）　ｒ　ンタマイシンを
添加したｉＱｉｇ工１ｃＭ中のａｏｓ細ＩＭ５Ｘ１１Ｊ
’個を嶺イ血し、力ｕＷ　５　％　ＣＯ２インキュベー
ター中で６７′Ｃ−晩インキユベートする。Ｍ２Ｒを３
７−Ｏｆ／）りん酸緩衝塩液（１’Ｂｓ）で−回、そし
て２Ｍの５（１１）　ｐｇ　／　ｍｌ　ＤｚｈＴ−デキ
ストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）含有ＰＢＳで洗滌する
。次にトランスフェクトするＤＮＡを細胞に添加する。

続いてＣＯ８細胞を５分間隔で培養皿７静かに振とうし
ながら６０分間インキュベートする。インギュベーショ
ン後、１０％ＦＣ８，５０１’：ｊ／　ｔｌｌｃＯ’ｙ
’　ンｌ　マイクンおよび８０μＭのクロロキンを含有
する工ＭＥＭを２０ゴ各皿に疹加する。さらに２．５時
間インキュベートした仮、培地を１０％ＦＣ！お工び５
０μｉ　／　ｌｎｌ　）ｙ’ンタマイシン言有の新しい
ＩＭＩ培地でｖＬ懐する。インキュベーションンろ７　
”Ｃで７２時間読けた後、細胞および培地を以下のよう
に分析する。

細胞培養 本明細書では２株のｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｋ
菌株を使用した。ｍ、　ｃｏｌｉ　Ｇ　Ｍ　１ｉ　９休
ｉ　ＭａｒｉｎｕＢら（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１
１４　巷、１１４６頁（１９７％、ｌ）にニリａｊｔｋ
Ｅされており、１ｎｅｒｉｃａｎ　’］”ｙｐｅ　Ｃ（
１０）ｃｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｋ　寄託番号Ａ
Ｔａａ　５３３３９として、１９８５年１１月２６日に
制限なしで寄託されている。Ｅ、ｃｏｌｌＭＯ１０６１
９は０ａｓａａａｂａｎら［Ｊ、＋４０１．　Ｂ１１１
．　ｉ　３　Ｆ３巻、１７９貞（１９８０年）］により
記載されている。本菌株も１９８５手１１月２６日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ！（１０）ｔｕｒｅ　０
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣりにＡＴｃｃ　５３３３８
として制限なしに寄託されている。

６株の哨乳動物細胞株を開用した。一つはゾと一〇葉虚
レダクターゼを欠損したチャイニーズ・・ムスター卵巣
細胞株（ＣｋｉＯ／　ｄｈｆｒ−）である。この細胞株
は元来、［Ｊｒｌａｕｂ　Ｉ；）　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

σ、Ｓ、Ａ、　７７巻、４２１６頁（１９８０年）〕に
より単離された。不利１施株は１９８６年５月７日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｏｕ１℃ｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎにを託番号ＯＲＬ　９（１５）６として寄
託されている。開始点欠損ｓｖ４［１ワイルス道伝子に
エリ形質転換されたアフリカミトリずルの′Ｉｌｆ城細
胞株（ＣＯ８）［Ｇｌｕｚｍａｎ、　　Ｃｅ１ｌ　ｉ　
３巻、１７５頁（１９８１年）］ｒ１．ＡＴＯＣエリａ
ｘＬ−１６５１として人手可能である。

Ｒｏ　ｂｂ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｆｉｕｚｙ＊ｏｌ
ｏｇｙ　１ｉ　６巻、４９３貞（１９８５年）〕にＬり
記載されているネズミｚＬ−２Ｘ存注細＠株（ｃＴＬｈ
）　ＨＡＴＣＣ工りＴより２１４として人手可能である
。

プライマー指示変異 プライマー指示変異処理はｍｏｒｉｎａｇａら［ＢｉＯ
ｔｅｃｈｎＯＩＯｇ７２巻、６６６頁（１９８４年）］
にＬり記載される方法に従って行なった。変異処理を行
なうために防用した合成オリゴヌクンオチドｙ＠　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　Ｉ
　Ｏ３巷、６１８５頁（１９８１年）〕のホスフォアミ
シト固体担体法にエリ調製した。

コロニーハイテリタイゼーション コロニーハイフリタイゼゞ−ンヨンハＭａｎｉａｔｉｓ
ら［Ｍｏ１ｓｃ（１０）ａｒ　（ｊｌｏｎｉｎｇ　；　
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　；Ｊａｎｕａｌ、１９８２
手、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｏｏ
ｒａｔｏｒｙ　。

３１２−３１５頁］にエリ配或される方法ンこより行な
った。！ライマー指示Ｖ異に開用したと同じオリゴヌク
レオチＶをＭａｎｉａｔｉｓら〔上述、６９６貝〕の方
法に従い、ポリヌクＶオチドキナーゼを用いてγ−”Ｐ
　−ＡＴＰで５′末畑を標識してハイブリダイゼーシヨ
ンに用いた。工Ｌ−２およびｄｈｆ　ｒ遺伝子の検出に
用いる大きいＤＮＡ　７′ロープはニックトランスレー
ションキット（Ａｍｅｒθｈａｍ）　ヲ用’Ａて製造元
の指示通りに標識した。

ｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ　７エｈ−２／　ａｈｆｒの構築
本発明の最終発現ベクターは以下の段階を経て調製した
：（１）悌飾したヒトミ工Ｌ−２選云子を押入するベク
ターの調製、（２）Ｈ工し＋−２遺云千の６′非コード
頭域の大部分、５′の非コード碩域の全ておよびシグナ
ルペゾチド配列をコードする配列の最初の４個のヌクレ
オチドの削除による１じ飾、および（３）１φ飾■工Ｌ
−２１を云十のベクターへの一人。

ｐＢ０１２Ｍニブラスミド１）ＮＡ　（第１凶会照）１
μＩを１（１１）μｅの匍ｊＩ波酵素緩衝孜中２Ｕ単位
の８ａ；ｋｉ工で６７“Ｃ５１時間処理する。シラスミ
ドｐ８ｔ３１２Ｍ工を百ＭするＷ、　０ｏｌｉ　ｇ　Ｃ
１０６１床は１９８６年５月７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐａ　（ｊ（１０）ｃｕｒｅ　（３ｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎにｈＴａａ　６７　Ｉ　Ｑ　９番として寄託され
ている。

Ｂａａｕ工で消化したシラスミドを４単位のＤＮＡポリ
メラーゼエクレナウ断片で１５”０，２時間処理した後
、反応液乞６５°０５分間加熱して反応を停止する。反
応液２μｌを２イデーシヨン緩衝液で１コする。

ライｒ−ジョン反応液を直接Ｆ：、ｃｏｌｉ　ａＭｌ　
１９の形質転換に便用する。形質転換株をアンビンリン
富有ＬＢｇ天上で選択する。得られるアンピシリン附注
コロニーからのＤＮＡ　Ｋつき？ｌ１１１限酵素切断で
検索する。単離しｆｃ７″ラス　ｆ　ＤＮＡ　’ｙ（先
ずＢａａｕ（工またはＣｌａ工で消化し、得られるＤＮ
Ａ断片を１％アがロースモル戒気泳動で分離し、１０μ
、！＋７　／ｕｔｌの臭化エチジウムで検出する。Ｂａ
ｍＨ工％　Ｍを欠失し、その代りにＣｌａ■部位を獲得
した一つのシラスミドを同定し、シラスミドｐＢＯｉ２
０Ｉ　と命名し友。

次にシラスミドｐＢｃ！１２０工を０１ｅＴｖｅｌｌら
の界面ｎ５°で１三メ１すｔＭ　法　（Ｊ　、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　　１　１　　［１巻、　　１１６５頁（
１９７２年）〕により火種に調製した。クローニングベ
クターの最後の調製は１μＪのｐＢＯ１２０工を２０単
位の０１ｅｈ工で切断し、消化生成物をＤＮＡポリメラ
ーゼエリ〕クレナウげ「片で平滑末端とする。

ヒトエｒ、−２の４５９　ｂｐの全コード鎖酸に６１ｂ
ｐの５′非翻訳配列および３　Ｌｌ　９　ＤＰの６′非
翻訳配列が結合しｆＣＣＤＮＡ　ニアビー［：　Ｔａｎ
１ｑｕｃｎｉら、Ｎａｔｕｒｌｉ１３０２舎、６０５貞
（１９８３年９〕を言ひシラスミＨｅ　ｐＩＬ−２−２
ｂを工Ｌ−２．１云子の材料として用いた。ＨＩＬ−２
１ｙｉ云子のヌクレオチげ配列はＴａｎｉｇｕｃｈｉら
Ｋより明かにされているので、ＨＩり一２遺伝子な言む
遣云子断片は５ｏｕｚａら〔−ｘ州特許出顕爾Ａ／１３
４４８９）の記載する方法を用いて合成することも出来
る。１０μ、ｙｖ）ｐ工ｈ−２−２ｂをＲｓａ工お工び
Ｂａｍ１（工を谷２０単位で１（１１）μｌの制限酵素
ｄ両液中３７　’０１時間処理する。Ｒｅａ工はＨＩＬ
−２ｃ　ＤＮＡをＨＩＬ−２の開始コドンの１　ｂｐ　
３’側のｍ−１５Ｔで切断する。反応献を次にｆ）ＨＡ
ポリメラーゼのフレナラ断片で処理し、１％融解アがロ
ースデル中で分離用電気泳動を行なう。目的の７６０ｂ
ｐのＲｓａ工／　ＢａｍｄＩ　ＨＩＬ　−２ｃＤ　ｒｉ
ｈ断片を同定し、前述のとおりデルより抽出する。

前に調製したベクターｐＢｃ１２ｃ工１（１１）　ｎＮ
を２単位の７４　ＤＮＡりが−ゼを言む３０　ｐｔｌの
２イデーシヨン緩衝液中でｉ　ｏ　ｏ　ｎＪのＲｅａ工
／　ＢａｍＨ工Ｈ工Ｌ−２Ｍ片と混ぜ合し、４′ｃで一
晩インキユベートする。得られるＤＮＡをｆｉｊ、ｃｏ
ｌｉ　Ｍｅ　１０６１株の形質転換に用い、アンビンリ
ン貧有のＬＢ摩大平板上で形質転換株を選択する。

２（１１）　ｎＪの単離Ｈ工Ｌ−２断片を用いて、Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ　！！ニックトランスレーションキットを
開用して製造元の南示通りに３２ｐ標識デローデをｍｆ
ｉ　Ｌ７ｔ。平板上のコロニーをニトロセルロースフィ
ルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｓｒ　ａｎａ　５ｃｎｕｅｌ
ｌ工ｎｅ、）Ｖこ吊り上げ、標識プローブを用い、Ｍａ
ｎｉａｌｌ、１８ら（Ｍｏ１ｅｃ（１０）ａｒ　Ｏｌｏ
ａｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ
、、１９８２年、（１１）１（Ｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）の方法ＶＣ従って
ｍより一２坤人乞検索した。ハイデリダイゼーンヨン陽
性コロニーを選択し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法ＶＣ工
りＤｄＡミニＡ製を行なった。得られたＤＮＡをＨｌｎ
ａ　ｉお工びＳｔｕ工で切断し、ベクターが正しく構築
されている事を示す特徴的な６９０　ｂｐ断片の存在を
デル電気体動で検索した。正しい構築ベクター乞ｐｄＵ
　１０と砧名する。

１）ＢＣ１０ＤＮＡ　を大１ｔＫＦＡ製Ｌ、そ（ｉ’）
１０μ、９を制限酵素緩衝液中２ｏ単位のＨｉｎｄ　Ｉ
および１６単位のＳｔ、ｕ　工で３７°ｃ、　　１時間
消化する。得られる６　９０　ｂｐのＨＩＬ　−２ＤＮ
Ａ断片を前述と同様に調製用アがロースｒＡＩ電気泳動
により単離する。

プラスミドｐＢ０１２　ＭＩ　ＤＮＡの１４をＢａｍ　
ＨＩで切断し、続いてフレナラＤＮＡポリメラーゼで前
述のように処理する。６５°Ｃでインキュベーション後
、ＤＮＡをＨｉｎｄ　Ｉで切断し、水溶解フェノールー
クロロホルムで抽出後す容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウ
ムおよび２容量のエタノールを添加し一７０°Ｃにイン
キュベートして沈澱する。沈澱したｐＢＣ１２ＭＩ　Ｄ
ＮＡ　ｋ遠心分離で回収後エタノールで洗滌して水にけ
ん濁する。

準備しりｐＢＣ１２ＭＩ　ヘク１−１０　Ｏｎ、９　ｋ
　３０μｇのライデーンヨン緩衝液中で２（１１）　ｎ
ｉの単離したＩＬ　−２のＨｉｎｄ　ｌ　／　Ｓｚｕ　
Ｉ断片と前述のとおりに結合する。反応液をそのまま用
いてＢ、　ｃｏｌｉＭＣｉ　口６１株を形質転換し、形
質転換株をアンビンリン含有ＬＢ寒天地上上で選択する
。各コロニーにつき６９０　ｔ）Ｔ）のＨｉｎｄ　ｌ　
／　Ｂａｔｏ　ＨＩ断片の存在を前述のように検索し、
この基準に合ったもノＴｈｐＢＣ１２／ＲＳＶ／　ＩＬ
　−２と命名した。

このようにして構築したプラスミドｐＢＣ１２／ＦＩＳ
Ｖ／ＩＬ−２は、ＨＩＬ　−２の５′非コード領域とシ
グナルペプチド配列をコードする配列の最初の４ヌクレ
オチドＡＴＧＴおよび６′非コード領域のほとんど全て
がｐＢＣ１２ＭＩベクターに存在するラッテプレプロイ
ンシュリン■遺伝子の対応する配列で［ｔｌｌれたキメ
ラＨＩＬ　−２遺伝子を含有している。部分的には一定
の６′非コード領域を有するものも調製した。しかし、
以下に示すように、ＨＩＬ−２遺伝子の発現レベルを非
常に増加させるのは５′の非コード領域の置換である。

ＨＩＬ　−２ングナルペプチドＮ末端の最終構造を第２
図に示す。

第２図に示すように、ＩＬ　−２の最初の２つのアミノ
酸（Ｍｅｚ−Ｔｙｒ　）がインシュリンシグナルペプチ
ドの最初の５個のアミノ酸（Ｍｅｚ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ　）および、ライプ−ジョン接点で新た
に出来たヌクレオチドでコードされる６番目のアミノ酸
（Ａｓｐ　）を含むキメラシグナルペプチドが形成され
た。この変化によりシグナルペプチドの機能に影響はな
く、通常のとおり成熟中にＩＬ　−２遺伝子から切断さ
れる。

ｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ／　ＩＬ−２１μｇｋ　Ｓｚｕ　
Ｉで切断する。ＤＮＡ　ｉフェノール／クロロホルムで
抽出しエタノール沈澱抜水にけん濁する。１０μｙのｐ
ｓＶ　２　ｄｈｆｒ　ＤＮＡ　Ｃ３ｕＭａｍａｎｉら、
　ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１１巻、８５４頁（１９８
１年）　］　ｋ　Ｐｖｕ　ＩＩおよびＢａｍ　ＨＩで切
断する。プラスミドｐｓＶ　２ｄｈｆｒはＬ　ｃｏｌｉ
　ＭＣ１０６１（ｐｓＶ　２　ｄｈｆｒ　）の形で１９
８６年５月７日にＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣ（１０
）ｚｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ、ｉｏｎに寄託し、ＡＴＣ
Ｃ’　６７１１０として登録されている。プラスミドｐ
ＳＶ　２　ｄｈｆｒからＳＶ　４０　／　ｄｈｆｒ遺伝
子断片を１％の調製用アガロースデルで単離した後、１
（１１）　ｎ、ｒのＩ）ＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ−２ベ
クターを４０μ！　のライプ−ジョン緩ｉｇ中で４０　
Ｏｎ、！ｉ＋の単離ＳＶ　４０　／　ｄｈｆｒ断片と４
℃−晩反応して結合する。反応液を直接用いてＥ、　ｃ
ｏｌｉ　ＭＣ１０６１株を形質転換する。

形質転換株はアンピシリン含有ＬＢ寒天平板上で選択す
る。

形質転換株コロニーをニトロセルロースフィルター上に
吊り上げ、単離ＳＶ　４０　／　ｄｈｆｒ遺伝子断片に
対する３２ｐニツクトランスレージヨー４７Ｌ識−ｆロ
ーブで検索する。プローブはＳＶ　４０　／　ｄｈｆｒ
のＰｖｕ■／　ＢａｍＩ断片２０　Ｏｎ＆を前述のＡｍ
ｅｒｓｈａｍニックトランスレーションキットを用いて
標識して調製した。Ｂｉｒｎｂｏｉｎ　Ｓの方法（上述
）全周いてハイブリダイゼーション陽性コロニーよりプ
ラスミドＤＮＡを単離し、デル電気泳動分析によりＢａ
ｍ　ＨＩ断片を検索した。

Ｂａｍ　ＨＩの存在によりＳＶ　４０　／　ｄｈｆｒの
存在を断片はｓｖ　４０ウイルスの初期領域プロモータ
ー制御下に全ネズミｄｈｆｒ遺伝子を含有する。ＨＩＬ
−２とｄｈｆｒ遺伝子がシラスミド中で同じ方向ａを有
するクローンを選択し、そのクローンＴｈｐＢＲ１２／
　ＲＰＶ　／　ＩＬ　−２／　ｄｈｆｒ　（第３図参照
）と命名した。

ＨＩＬ　−２遺伝子の高発現 ＨＩＬ　−２遺伝子音発現するため、トランスフェクシ
ョンの一日前に５×１０５個のＣＨＯ／　ｄｈｆｒ−細
＠ヲ１０−４Ｍのヒポキサンチンおよびｉｕ−”　Ｍの
チミン７２７Ｉ］　（ＨＴ）　ＩＭＥＭ　４　ａを含む
６（：ＩｒＬの組織培養皿に接種する。加湿５％ＣＯ２
インキュベーター中６７°Ｃ−晩インキュペートの後、
細＠をｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ　／　ＩＬ−２／　ｄｈｆ
ｒでトランスフェクトする。

トランスフェクトしたコロニーを前述の通り選択する。

このようにしてｄ５１−ｄ５６と命名したクローン化コ
ロニーを得、これらをＩＭＥＭ中で生付させて）（ＩＬ
　−２生産につき他のクローンおよびクローン化前の混
合ｄｈｆｒ＋細胞培養物と比較した。

ＨＩＬ　−２生産はネズミＩＬ　−２依存性細胞株ＣＴ
ＬＬに基づく定量バイオアッセイにより測定した。不ア
ッセイはＲｏｂｂ　ＩＩＣよりＢ己載され［Ｍｅｉｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１６巻、４９６頁
（１９８５年）〕、異なるｄｈｆｒ＋細胞クローンから
の培養上澄液の２倍希釈をネズミエＬ−２依存細胞株Ｃ
’ＴＬＬと温合することによる。ＣＴＬＬ株はＩＬ　−
２存在下でのみ生育できるので、この細胞の増殖の程度
を３Ｈ−ｄＴのとり込みで測定することによりｄｈｆｒ
＋クローンにより分泌されるＩＬ　−２の量を正確に測
定することが出来る。別法として、ＨＩＬ　−２生産測
定にヒトＰＨＡ−芽細＠を使用することもできる（　Ｒ
ｏｂｂら。

上述）。ヒトＰＨＡ−芽細胞はヒト末梢血リンパ球を４
８時間ファイトヘマグルチン（ＰＨＡ）で誘導すること
により得られる。クローン化したコロニーの分析結果を
第１表に示す。工Ｌ　−２活性は培地１Ｎ当りの単位数
および細胞１０６個当りの単位数の両方で表わしている
。１単位のＩＬ　−２活性は、上述のＲｏｂｂにより記
載されているＮａｚｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｚ
ｉｚｕｚｅ　（米国国立がン研究所）のＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＲｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ　Ｐｒｏ
ｇｒａｍ　（生物応答調節物ｌＸ７１１０グラム）のＦ
ｒｅｄｅｒｉｃｋ、　ＭＤ　［Ｔｈｕｒｍａ。

Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、３巻、２７６頁（１９
８４年）〕より入入手症なＩＬ　−２標準物質の応答に
調整した１／２最大増殖応答に対応する希釈の逆数と定
義する。

第１表から明かなとおり、ｄ５１およびｄ５３が最も強
い工Ｌ　−２活性を生産した。前述の選択的遺伝子増幅
効果を確認するたぬ、クローンｄ　５−１の細胞を７〜
１４日間アメトプテリン濃度を徐々に上げて生育てせ、
５　Ｘ　１０−’　Ｍ濃度のアメトプテリン耐性株を得
た。第１表に示すように、この細胞株は高レベルのＨＩ
Ｌ　−２を分泌した。予想したとおり、本細胞のすずン
分析（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ラ。

Ｍｏ１ｅｃ（１０）ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　：　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

１９８２年、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｚｏｒｙ３８２−３８９頁〕の結果、細胞
当りおよそ１（１１）コピーのｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ　
／　工Ｌ−２／　ｄｈｆｒプラスミドを含有しているこ
とがわかった。ＨＩＬ　−２ｃＣＮＡコピーにプラスミ
ドｐＩＬ　−２−２ｂへの挿入を容易にするためはじめ
につけたホモポリマーａ−Ｃは工Ｌ　−２遺伝子の発現
に阻害効果がある。

正常な５′非コード領域を有する遺伝子とその領域がラ
ッテインシュリンからのものとのＩＬ　−２発現の割合
を正しく比較するために、阻害的なホモポリマーチイル
を削除したプラスミドヲ調製する。

このプラスミドはｐＢＣ４０ΔＴと命名した。

ＨＩＬ　−２遺伝子をクローン化する切断ベクターを１
μｇのｐＢＣ１２ＭＩを制限酵素緩衝液中で２０単位の
Ｂａｍ　Ｈ工および２０単位のＢｉｎｄ　ｌで３７℃１
時間消化して調製する。得られる断片を次にＤＮＡポリ
メラーゼのフレナラ断片で処理し、フェノール／クロロ
ホルムで抽出後上述のように沈澱する。

ｐｘＬ−２−２ｂ　ＤＮＡ　１０　ｔ４を２０単位のＢ
ａｍＨ工おまひ８単位のＳｒ、ｕ　Ｉで消化してＨＩＬ
　−２ＤＮＡ断片を調製する。１％の調製用アがロース
デルから前述のようにしておよそ５５０　ｂｐのＨＩＬ
　−２断片を単離する。

調製Ｌｆ　ｐＢｏ　１２　ＭＮベクターの１０Ｏｎ、９
ｅ１５０　ｎ、９のＨＩＬ　−２Ｂａｍ　Ｈ工／　Ｓｒ
、ｕ　Ｉ断片と２５μノのライプ−ジョン緩ｗａ中で既
に述べたように結合する。反応液を直接用い”’ＣＥ、
ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株を形質転換し、形質転換株を
アンピシリン含有ＬＢＩＩ！天平板上で選択する。アン
ピシリン耐性コロニーヲ平板からニトロセルロースフィ
ルターに移し、２（１１）　ｎ、！ｉ’の精製Ｂａｍ　
ＭＩ　／　Ｓｔ、ｕ断片に対して調製した３２ｐ−標識
二ックトランスレーションプローブによるコロニーハイ
ブリダイゼーションでＨＩＬ　−２挿入の存在を検索す
る。

ハイブリダイゼーション陽性のコロニーヲ選択し、Ｂｉ
ｒｎｂｏｒｉｎら、の方法（プラスミドＤＮＡの制限酵
素分析）によりおよそ５６０　ｂｐのＢｓｚ　Ｅｌｌ　
／Ｂａｍ　ＨＩ断片の存在を検索する。該断片を含有す
るクローンを同定し、ｐＢＣ４０と命名した。プラスミ
ドｐＢＣ４０はインシュリンの５′非コード領域を欠損
し、代りに天然ＨＩＬ　−２の３１　ｂｐ　５’非コー
ド領域を有する点板外はｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ　／　Ｉ
Ｌ−２と同じである。本プラスミドはまた天然）ＩＩＬ
　−２の開始コドンおよび５′非コード領域に１７ｂｐ
のホモポリマーチイルを保持している。大量のｐＢＣ４
［、Ｉ　ＤＮＡをＣ１ｅｗｅｌｌらの方法［Ｊ、Ｂａｃ
＋ｃｅｒｉｏ１１１０巻、１１３５頁（１９７２年〕〕
により調製する。

ＨＩＬ　−２遺伝子のホモポリマーチイル部分はＭｏｒ
ｉｎａｇａらのプライマー指示変異ＣＢｉｏ　／Ｔｅｃ
ｈａｏｌｓｇｙ　２巻、６６６頁（１９８４年）〕によ
り削除する。これを行なうためりん酸化２４塩基デオキ
シオリゴヌクレオチドプライマーを前述のホスフォラミ
シト固体担体法により調製した。

これは削除しようとするホモポリマー領域のＤＮＡの一
本鎖の各側の塩基と配列が相補的な１２個のデオキシヌ
クレオチドを含んでいる。この２４塩基ゾライマーおよ
び削除するホモポリマー領域の配列を第４図に示す。変
異処理の際ハイブリダイゼ−ションを起す領域を下線で
示す。ホモポリマー領域を削除することにより、新たに
Ｈｉｎｄ　１部位が出来る。

変異処理を行なうには、１μｇのｐＢＣ４０ＤＮＡをＰ
ｖｕ　Ｉで開環し、フェノール／クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱後２０μ召の水にけん濁する。

さらに’ＩＯ４のｐＥ＋ｃ　４０　ｋ　Ｅｃｏ　ＲＩで
消化し、最大のベクター断片″ギャップ保有ベクター′
を１省の調製用アがロースケ９ルで単離する。

開環グラスミドおよびギャッププラスミドの各２０　Ｏ
ｎｌずつを２０倍のモル過剰量のりん酸化オリゴヌクレ
オチドを含む１０μノの水で混合し、２μｌの１（１１
）倍濃縮フレナラ衝液ｒ　１　Ｍ　ＮａＣ！　。

６５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，４）、４５　ｍＭ　Ｍｚ
ＣＪ２および１０　ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕
を添加する。混合物を順？′Ｋｉｏｏ°Ｃ１室温、４°
Ｃおよび氷上にそれぞれ５，３０．３０および５分間イ
ンキュベートした後、反応液に２μｌの１０ｍＭＡＴＰ
。

４　ｄの２．５　ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　ｄＡＴＰ　、　
ａＧＴＰおよびｄＴＴＰ混合液、０．５μｌのクレナウ
ボリメラーセ゛Ｉ（活性２．５単位）および１μｌのＴ
　４　ＤＮＡりが−セ゛（活性０．８単位）全添加して
２０μｌとする。

反応液を１５°Ｃ１，１５時間インキュベートし、直接
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株を形質転換する。形質
転換株はアンピシリン含有ＬＢ寒天平板上で速択シ、平
板上のコロニーをニトロセルロースフィルターにより、
α−”Ｐ　−ＡＴＰで標識した合成オリゴヌクレオチド
をゾローブとして変異処理に使用した２４塩基プライマ
ーに相当する配列の存在を検出する。

陽性コロニーはさらにＢｉｒｎｂｏｉｎらの方法により
予想される５　３０　ｂｐのＨｉｎｄ　ｌ　／　Ｂａｍ
　ＨＩ断片の存在を検索する。この方法で得られたコロ
ニーは混合物であるので（Ｍ＋ｌ：＋ｒｉｎａｇａら、
前述）、陽性ＤＮＡ試料で再度Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣｉ
Ｏ６１を形質転換し、得られるコロニーを再ひ５３０　
ｂｐのＨｉｎｄＩＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩ断片の検索をし
た。このようにして選択した陽性コロニーｋ　ｐＢＣ４
０ΔＴと命名し、これは主に１７ｂｐのホモポリマー〇
−Ｃ配列より成る非翻訳リーダーの２２　ｂｐ部分を欠
損している以外はｐＢｏ　４０と同じである。

上述の三つのプラスミド構築についてヒトＨＩＬ−２の
合成能ｆ　ＢｕｕｎｉＣｋらＣＭｏ１．　Ｃｅ１ｌ。Ｂ
ｉｏｌ。

５巻、６（１１）９頁（１９８５年）〕のトトランスフ
エフしたＣＯ８を用いた定量短期発現アッセイにより比
較した。本床では、比較するＤＮＡの等モル量ｆ　（）
ｌｕＴ、ｚｍａｎ　［Ｃｅ１１２３巻、１７５頁（１９
８１年）〕により記載されるアフリカミトリずル腎臓細
胞株ＣＯ８にトランフエクションにより導入し、それを
開始点欠損ＳＶ　４０ウイルス遺伝子でトランスフオー
ムする。これらの細胞に導入されたｓｖ　４０″ｆＸｌ
製開始点含有のＤＮＡ　（例えば試験するプラスミドの
ように）は高コピー数で複製し、従って細胞内に存在す
るＳＶ　４　Ｑ依存のＤＮＡ複製機構により効率よく発
現される。

トランスフオームしたｃｏｓａｅにより生成するＨＩＬ
　−２の葉はＲｏｂｂ　（前述）の定ｚ　ＣＴＬＬ細胞
株アッセイを用いて測定し、その結果を４つの異なる実
験につぎ第２表に示す。

第２表に示すように、プラスミドｐＢＣ１２／　Ｒ８Ｖ
／　ＩＬ−２はプラスミドｐＢＣ４０お！びｐＢＣ４０
ΔＴよりもかなり高いレベルで合成を行なう。ｐＢｃ４
０で５′非コード領域にホモポリマ一部分が存在するこ
とでｐＢｏ　４０による発現がｐＢＣ４０ΔＴよりも効
率が悪くなってはいるが、これら三つのプラスミド間の
主要な差はｐＢＣ４ＱおよびｐＢＣ４ＱΔＴの５′非翻
訳配列が天然のヒトの配列であるのに対し、プラスミド
ｐＢｃ１２　／　Ｒ３Ｖ　／　ＩＬ　−２ではラッテプ
レプロインシュリン■遺伝子の対応する配列が存在する
点である。

正常ヒト５′非コード領域をラッテインシュリン遺伝子
により置換することにより理由はわからないがＨＩＬ　
−２発現が著しく高められる。この発現増強の機構を理
解することは本発明に必須ではない。ｍＲＮＡの安定性
の増加がこの効果の原因カモ知れない。逆に、天然ＩＬ
　−２のＡＵＧコドンをインシュリンのＡＵＧコドンと
置換した（第２図）ことでインンユリン開始コドンに隣
接するより理想的配列［Ｋｏｚａｋ、　Ｃｅ１ｌ　４４
巻、２８６頁（１９８６年）〕のためより高い翻訳効率
が得られた可能性もある。

本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に多
くの修飾および変化をさせることが出来るのは本技術の
熟練者に明かである。本明細書に記載する特定の具体態
様は例示であり、本発明は特許請求の範囲の条件でのみ
限定されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の出発材料であるプラスミドｐＢＣ１２
ＭＩの模式図である。第２図はイン７ュリンおよびイン
ターリューキン−２遺伝子並びにプラスミドｐＢＣ１２
／　Ｒ８Ｖ　／　ＩＬ　−２中のングナルペプチドＮ末
端配列を示す構造図である。第６図はＩＬ　−２発現ペ
ククーｐＢｃ１２　／　Ｒ８Ｖ　／　ＩＬ−２／　ｄｈ
ｆｒの構造を図示した模式図である。第４図はｐＢＣ４
０ΔＴ構築のためｐＢｃ４０より削除したヌクレオチド
配列を示す構造図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトインターリユーキン−２およびシグナルペプチ
   ド配列をコードし、遺伝子の５′非コード配列が異種５
   ′非コード配列と置き換えられた遺伝子より成るヒトイ
   ンターリユーキン−２およびシグナルペプチド配列をコ
   ードするＤＮＡ配列。 （２）異種５′非コード配列がラットインシュリン遺伝
   子由来である特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配
   列。 （３）さらにシグナルペプチドをコードする部分配列の
   隣接ヌクレオチドも対応する異種配列で置換した特許請
   求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列。 （４）シグナルペプチド配列をコードする部分配列の隣
   接ヌクレオチドＡＴＧＴがラットプレプロインシュリン
   IIのシグナルペプチド配列をコードする部分配列である
   ヌクレオチドＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧで置換
   した特許請求の範囲第（３）項記載のＤＮＡ配列。 （５）ベクターおよび特許請求の範囲第（１）項から（
   ４）項のいずれか記載のＤＮＡ配列とから成り、適合性
   哺乳動物細胞中でＤＮＡ配列の発現を指示できる組換え
   ベクター。 （６）ベクターがＳＶ４０のｏｒｉ領域、ラウス肉腫ウ
   ィルスの長い末端リピートプロモーターおよびラッテイ
   ンシュリンII遺伝子を含む特許請求の範囲第（５）項記
   載の組換えベクター。 （７）ｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ−２およびｐＢＣ１２
   ／ＲＳＶ／ＩＬ−２／ｄｈｆｒのグループより選択され
   る特許請求の範囲第（５）項記載の組換えベクター。 （８）特許請求の範囲第（１）項から（４）項のいずれ
   か記載のＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列でコードされ
   るヒトインターリユーキン−２の発現を行なうことの出
   来る哺乳動物細胞。 （９）特許請求の範囲第（５）項から（７）項のいずれ
   か記載の組換えベクターを含み、該ベクター中に含有さ
   れるＤＮＡ配列によりコードされるヒトインターリユー
   キン−２を発現することの出来る哺乳動物細胞。 （１０）含有する組換えベクターまたはＤＮＡ配列が増
   幅されている特許請求の範囲第（８）項または（９）項
   記載の哺乳動物細胞。 （１１）特許請求の範囲第（５）項から（７）項のいず
   れか記載の組換えベクターを含有する哺乳動物細胞を培
   養し、培養液よりヒトインターリユーキン−２を単離す
   ることより成るヒトインターリユーキン−２の製造方法
   。 （１２）組換えベクターを哺乳動物細胞中にトランスフ
   エクシヨンにより導入した特許請求の範囲第（１１）項
   記載の方法。 （１３）組換えベクターが選択用遺伝子を含み、哺乳動
   物細胞を選択培地中で培養することにより選択用遺伝子
   およびヒトインターリユーキン−２をコードするＤＮＡ
   配列の多重コピーが共増幅により生成する特許請求の範
   囲第（１１）項記載の方法。 （１４）選択用遺伝子がジヒドロ葉酸レダクターゼをコ
   ードし、哺乳動物細胞がそれ自体ではジヒドロ葉酸レダ
   クターゼ活性を欠損し、選択培地がヒポキサンチンおよ
   びチミジンを含有しないでアメトプテリンを含有してい
   る特許請求の範囲第（１３）項記載の方法。 （１５）哺乳動物細胞がＣＨＯ／ｄｈｆｒ＾−細胞であ
   る特許請求の範囲第（１４）項記載の方法。 （１６）特許請求の範囲第（５）から（７）項のいずれ
   か記載の組換えベクターを哺乳動物細胞へ導入すること
   より成る、特許請求の範囲第（８）項から（１０）項の
   いずれかに規定される哺乳動物細胞を調製する方法。 （１７）特許請求の範囲第（１１）項から（１５）項の
   いずれかに記載の方法により得られるヒトインターリユ
   ーキン−２。 （１８）特許請求の範囲第（１１）項から（１５）項の
   いずれか記載の方法により調製したヒトインターリユー
   キン−２。 （１９）本質的に純粋な、特許請求の範囲第（１７）項
   または（１８）項記載のヒトインターリユーキン−２。 （２０）医薬品としての特許請求の範囲第（１７）項か
   ら（１９）項のいずれか記載のヒトインターリユーキン
   −２。 （２１）特許請求の範囲第（１７）項から（１９）項の
   いずれか記載のヒトインターリユーキン−２を含有する
   医薬組成物。 （２２）特許請求の範囲第（１７）項から（１９）項の
   いずれか記載のヒトインターリユーキン−２の疾患治療
   および予防ヘの使用。 （２３）特許請求の範囲第（１７）項から（１９）項の
   いずれか記載のヒトインターリユーキン−２の免疫調節
   化合物としての使用。 （２４）特許請求の範囲第（１７）項から（１９）項の
   いずれか記載のヒトインターリユーキン−２の免疫抑制
   状態の治療のための使用。 （２５）本明細書に記載される発明。