KR0138654B1 - 인터루킨-i 저해제 및 이의 제조방법 - Google Patents
인터루킨-i 저해제 및 이의 제조방법Info
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Abstract
내용없음.
Description
[발명의 명칭]
인터루킨-1 저해제 및 이의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 인터루킨(interleukin)-1의 작용을 선택적으로 저해하는 인터루킨 1 저해제(IL-1 INH)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 요(尿)로부터 상기 IL-1 INH를 정제하는 방법과 이 저해제를 암호화하고 있는 DNA서열을 포함하는 제조합 DNA 분자에 의해서 형질전환된 숙주를 사용하여 상기 IL-1 INH를 생성하는 방법 및 상기 IL-1 INH를 특징으로 하는 조성물 및 치료방법에 관한 것이다. 이러한 방법 및 제제는 면역억제 및 항 염증 용도 및 치료법에 유용하다.
[배경 기술]
인터루킨-1(IL-1)은 대식세포(macrophage) /단핵세포(monocyte) 계통의 세포에 의해 주로 생산되는 시토킨(cytokine) 단백질이다. 이것에는 IL-1 폴리펩티드들-IL-1α 및 IL-1β를 암호할 수 있는 두개의 구별되는 IL-1 유전자가 있다[P. Auron외 다수, 인간 단핵세포 인터루킨-1 전구체 cDNA의 누클레오티드 서열(Nucleotide Sequence of Human Monocyte Interleukin-1 Precusor cDNA), Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 81. p.7907(1984) ; C. March외 다수, 2가지 독특한 인간 인터루킨 1 상보적 DNAα 및 β의 클로닝, 서열 결정 및 형질발현(Cloning, Sequences And Expression of Two Distinct Human Interleukin 1 Complementary DNA's α and β), Nature, 315, p.641(1985)]. 제조합 IL-1α 및 β를 이용하여 그것들 각각의 생물학적 작용을 연구한 결과는 IL-1의 두가지 형태가 다수의 생물학적 작용을 공유한다는 것이다.
IL-1은 여러 가지 독특한 생물학적 작용을 가지고 있다. 이러한 작용중의 하나인 임파구 활성 인자(LAF)작용은 IL-1을 면역학적 반응 매개인자로 만들고 IL-1 그 자체가 미성숙 T 및 B 임파구와 같은 여러 가지 세포형태의 성숙, 분화 및 성장을 자극한다[P. Auron외 다수, Proc, Natl, Acad. Sci. USA, 81, 상기 참조]. IL-1의 작용중 다른 하나인 단핵 세포인자(MCF)작용은 다양한 염증 반응의 조절에 중심 역할을 하는 IL-1의 활성으로서[C. Dinarello, An Update of Human Interleukin 1:, J. Clin. Immun., 5, P287(1985)], IL-1 그 자체가 섬유아세포 및 연골세포와 같은 여러 세포들을 자극하여 각각 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 콜라게나제를 생성토록 한다. 이러한 반응들은 류마티스양 관절염과 같은 관절질병이나 조직의 파괴와 관련된 질병의 병인론과 관련이 있다[J. Dayer, 류마티스양 관절염에 있어서의 시토킨 및 다른 매개인자(Cytokines and Other Mediators in Rheumatoid Arthritis) Springer Semin. Immunopaht, 7. p.387(1984)]. 더욱이, IL-1은 T-세포증식과 관련이 있는 IL-2의 생성을 유도[J. W. Lowenthal외 다수, 흉선 종세포에 의한 IL-2 분비 및 IL-2 수용체 발현이 IL-1의 의존적 유도(IL-1 Dependent Induction of Both IL-2 Secretion and IL-2 Receptor Expression By Thymoma Cells), J. Imm., 137, pp. 1226-1231(1986)]하는 것으로 알려져 있다. 마지막으로, IL-1은 또한 내피 세포상의 분자를 자극하여 백혈구를 포획하는 것으로 알려져 있다[J. Oppenheim외 다수, 인터루킨 1은 1종류 이상이다., Immun. Today, 7, p.45(1986)].
그러므로, 항원특이성 T-세포 및 B-세포의 증식을 저해하고 섬유 아세포에 의한 프로스타글란딘 및 콜라게나제 합성을 저해하는 IL-1 저해제를 확인하고 분리하는 것은 흥미로울 것이다. 그러나 화합물은 면역 및 염증반응과 관련된 질환의 치료에 유용할 것이다. 더구나, IL-1 매개의 IL-2 생성을 저해할 수 있는 IL-1 저해제는 분리하는 것이 요망되고 있다. 또한 예를 들어, 인간 피부 섬유 아세포에 의한 PGE2및 콜라게나제 생성[J. Dayer외 다수, 카켁틴(Cachectin)/종양 과시인자는 인간활액세포 및 피부섬유아세포에 의한 콜라게나제 및 프로스타글란딘 E2생성을 자극한다, J. Exp. Med., 162, p.2163(1985)] 또는 섬유 아세포 증식의 유도[P. Seckinger외 다수, 종양 괴사 인자 α에는 영향을 미치지 못하고 인터루킨 1α 및 β에 영향을 미치는 요중의 인터루킨 1작용 저해제 J. Immun. 139, p.1541(1987)]와 같은 IL-1의 여러 가지 생물학적 특성을 공유하는 TNF-α와 같은 종양괴사 인자들과 같은 다른 단백질을 동시에 저해함이 없이 IL-1의 작용을 선택적으로 저해하는 화합물을 동정하는 것도 관심의 대상이다.
현재, 프로스타글란딘과 같이, IL-1에 저해효과를 보이는 것으로 보고된 화합물은 주로 비선택적 저해제처럼 작용한다. 또한 열성(熱性)환자의 요중에는 20 내지 30kD의 IL-1 선택적 저해제를 포함하고 있다는 것이 보고되었다[Z. Liao외 다수, 열성환자의 요중에 있는 특이적인 인터루킨 1 저해제의 동정(Identification of a Specific Interleukin 1 Inhibitor In The Urine of Febrile Patients) J. Exp. Med., 159 p.126(1984)]Liao는 이러한 화합물이 미정제 형태가 아닌 다른 형태이거나 IL-1의 MCF 작용을 저해하거나, 표적세포 수용체에 IL-1의 결합을 저해하거나 또는 IL-1의 존재하에서 섬유 아세포의 증식을 저해한다고는 제시하지 않았다. IL-1 저해효과를 가지는 것으로 보고된 제2의 화합물[W. Arend외 다수, 인간 단핵세포에 의한 인터루킨이나 인터루킨 1 저해제의 생성에 대한 면역복합체의 효과(Effects of Immune Complexes On Production By Human Monocytes of Interleukin or an Interleukin 1 Inhibitor), J. Immun., 134, p.3868(1985)]은 부착성 면역복합체상에서 배양된 인간 단핵세포로부터 생성된다. 그러나, 상기 Arend의 보고에 따르면 상기 화합물이 IL-1의 LAF 및 MCF 작용 둘다를 저해하는지에 대해서는 모호하다(상기 문헌 3874페이지 참조). 어쨋든, 상기 Arend 논문은 상기 화합물이 본질적으로 순수하다거나 또는 표적세포 수용체에 대한 IL-1의 결합을 차단한다거나 또는 IL-1의 존재하에서 섬유아세포 증식을 저해한다는 것을 보고하고 있지 않다. IL-1 저해효과를 가지는 것으로 보고된 제3의 화합물[J-F. Balavoine외 다수, 요중의 인간 인터루킨 1 및 저해제(들)에 의해 조절되는 섬유아세포 및 활액 세포에 의한 프로스타글란딘 E2 및 콜라게나제의 생성, J. Clin. Inevst. 78, p.1120(1986)]은 매우 미정제된 형태인 것으로 제시되고 있고 그것의 작용 방식도 기술되어 있지 않다.
[발명의 개요]
본 발명은 상기 문제점들의 해결책으로서 면역억제 또는 항염증 조성물로 사용하기 위한, IL-1 LAF 및 IL-1 MCF 작용의 선택적 저해성, IL-1 매개의 IL-2 생성 저해성, IL-1 매개의 섬유 아세포 증식 저해성, 및 표적 세포상의 IL-1 수용체에 대한 결합성을 가지고 있는 본질적으로 순수한 IL-1 저해제(IL-1 INH)와 이를 제조하는 방법 및 치료법에 관한 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 상기 IL-1 INHS는 표적 세포내에 TNF α 매개의 PGE2및 콜라게나제 생성을 저해하지는 않는다. 따라서, 본 발명의 IL-1 INH는 면역억제제 및 항 염증제로 사용되는 여러 가지 조성물 및 밥법에 유용하다. 본 발명의 IL-1 INH SDS/PAGE상에서 약 25kD의 분자량 및 크로마토포커싱(chromatofocussing)으로 측정시 4.7의 등전점을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하고 있다.
이러한 IL-1 INH를 생성하기 위한 본 발명의 방법중에 한가지 구체예는 자연계로부터 정제하는 것이다. 그러한 정제방법은 열성환자(febrile patient)의 미정제 요를 농축하는 단계, 상기 요로부터 미정제 IL-1 INH를 침전시키는 단계 및 이러한 침전물 중의 다른 단백질로부터 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과법 및 면역흡착법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 IL-1 INH를 분별하는 단계를 포함한다.
이러한 IL-1 INH를 생성하기 위한 본 발명의 밥법중에 제2의 바람직한 구체예는 그러한 저해제의 재조합 생성법이다. 이러한 방법에 있어서, 본 발명의 IL-1 INH를 암호하는 DNA 서열, 그러한 서열들을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자 및 그러한 DNA 서열 및 분자들로 형질전환된 여러가지 단세포 숙주는 상기 형질전환된 숙주를 발효배양시킴으로써 본 발명의 IL-1 INH(추가의 N-말단 메티오닌을 가진 것이거나 가지지 않은 것임) 또는 그 일부를 생성하는데 이용된다. IL-1 INH 작용을 나타내는 본 발명에 따른 IL- 1 INH 폴리펩티드는 IL-1 INH의 아미노산 서열에 여러 가지 다른 아미노산이 치환, 부가 또는 결실된 것을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 IL-1 INH를 사용하여 IL-1 INH의 활성 부위의 위치와 분자구조를 결정하고 그 정보를 사용하여 본 발명의 면역억제성 또는 항-염증성 조성물 및 본 발명의 방법에 IL-1 INH처럼 사용하기 위한 단편 및 펩티드를 고압하는데 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 원에 설명된 발명을 완전히 이해하기 위해서, 하기 상세한 설명에 기술한다.
본 원에서는 하기 용어들이 사용되고 있다 :
MCF-단핵세포인자. IL-1의 MCF 작용은 섬유 아세포, 활액세포와 같은 많은 표적 세포중에서 프로스타글란딘 E 및 콜라게나제 생성을 자극하는 IL-1의 작용력을 나타낸다.
LAF-임파구-활성인자. IL-1의 LAF 활성은 T 및 B임파구의 증식 및 분화를 자극하는 IL-1의 작용력을 나타낸다.
CTLL-세포독성 T-임파구 세포주. CTLL세포를 EL-4세포와 함께 공동항온 배양하여, EL-4세포로부터 산출되는 IL-2 생성에 대한 IL-1의 자극 효과를 검정하는데 사용하고 ; 그 다음 산출된 IL-2는 측정가능한 CTLL 세포의 증식을 자극한다.
본 발명은 본질적으로 순수한 IL-1 INH에 관한 것이다. 본 발명에 정의된 본질적으로 순수한 IL-1 INH란 주요 오염물, 특히 아포지단백질(apolipo protein) A1 및 레티놀 결합 단백질이 본질적으로 제거된 상태로서 SDS/PAGE상에 단일 밴드로서 이동하는 것을 의미한다.
본 발명의 IL-1 INH등은 IL-1 LAF 및 IL-1 MCF 작용을 선택적으로 저해하고, EL-4세포에 의한 IL-1 매개의 IL-2 생성을 저해하고, IL-1 매개의 섬유아세포 증식을 저해하며 그리고 표적 세포상의 IL-1 수용체에 결합한다. 상기 선택적 저해작용이란 IL-1 매개의 작용을 차단하는 작용력은 갖고 있는 반면, PGE2및 콜라게나제 생성의 매개인자인 사람의 재조합 TNFα(hrTNFα)와 같은 IL-1과 유사한 활성을 일부 가진 다른 화합물을 차단하는 작용력은 결필된 것을 의미한다. 이러한 특이성은 면역계의 다른 매개인자의 필요한 활성을 방해하지 않고 선택적으로 IL-1을 차단하는데 있어 중요한 인자이다. 본 발명자들은 IL-1/MCF 및 섬유아세포 증식분석을 이용하여 IL-1 대 hrTNFα의 활성에 대한 본 발명의 IL-1 INH의 효과를 비교함으로써 본 발명의 IL-1 INH의 특성을 증명하였다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 IL-1 INH는 SDS-PAGE상에서 약 25kD의 분자량 및 크로마토포커싱에 의해 측정되는 바와 같이 4.7의 동전점을 가지고 있다.
본 발명의 IL-1 INH는 LAF 검정, MCF 검정, EL-4/세포독성 T-임파구 검정(EL-4/CTLL) 및 섬유아세포 증식검정에서 IL-1 매개 반응을 저해할 수 있다. IL-1/LAF 검정에서, IL-1α 또는 β에 의한 T-세포 증식의 저해 정도는 본 발명의 IL-1 INH를 여러 가지 희석율로 첨가한 가운데 [H3] 티미딘의 병입양의 감소를 검측함으로써 측정된다. IL-1/MCF 검정에서 IL-1 매개의 PGE2생성의 저해정도는 본 발명의 IL-1 INH를 여러 가지 희석율로 첨가한 가운데 PGE2에 대한 항혈청을 사용하여 이중 항체 방사성면역 검정으로 측정한다. 방사성 면역검정으로 측정한 상기 매질내의 PGE2감소는 IL-1 INH 활성을 나타낸다. EL-4/CTLL 분석에 있어서 IL-1 매개 IL-2 생성의 저해 정도는 본 발명의 IL-1 유도성 섬유아세포에 의한 [H3]-TdR 흡수의 저해정도는 본 발명의 IL-1 INH를 여러 가지 희석율로 첨가한 가운데 측정한다. 저해는 CTLL 세포증식의 척도로서 사용되는 [H3]티미딘[H3]-(TdR)의 흡수양의 감소로서 관찰한다. 증식은 용량 의존 방식으로 IL-2를 유도하는 IL-1의 조재하에서만 일어난다. 섬유아세포 증식 분석에 있어서, IL-1 INH를 여러 가지 희석율로 첨가한 가운데 측정한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 IL-1 INH는 표적 세포상의 IL-1 수용체에 특이적으로 결합한다. 이 결합은 일련의 IL-1 결합 분석법으로 증명되었다. 먼저, 본 발명자들은 표지된 IL-1이 표적 세포상의 수용체에 결합하는데 있어서 IL-1 INH 농도의 증가효과를 측정하였다. 본 발명자들은 고농도의 IL-1 INH가 표지 IL-1의 결합양을 감소시킨다는 것을 관찰하였다. 다음, 본 발명자들은 과량의 비표지형 IL-1 INH를 첨가하고 표적 세포에 결합된 표지 IL-1에 대한 상기 과량물의 효과를 관찰하였다. 이 분석은 과량의 IL-1 INH가 표적 세포의 표면에 결합된 표지 IL-1과 잘 경쟁 반응하여 치환시킨다는 것을 증명하였다. 본 발명자들은 또한 과량의 레티놀 결합 단백질을 추가로 첨가하고, 이것이 IL-1 INH가 상기 표적 세포에 결합하는 것을 방해하지 않는다는 것을 관찰하였다. 이 분석은 본 발명의 IL-1 INH가 표적 세포상의 IL-1 수용체에 결합하는 IL-1과 특이적으로 경쟁한다는 것을 증명하였다.
본 발명은 또한 자연적 출처, 예를 들어 고 열성호나자 또는 기회 감염증에 걸린 AIDS 환자로부터 본 발명의 IL-1 INH를 분리하는 정제 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 여러 단계를 포함한다. 일반적인 개요로서, (1) 요를 농축하는 단계 ; (2) 이 농축된 단계로부터 미정제 IL-1 INH를 첨가시키는 단계 ; 및 (3) 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 및 면역 흡착법 중 한가지 이상의 방법을 사용하여 상기 침전물중의 다른 단백질들로부터 IL-1 INH를 분별하는 단계이다.
이러한 방법의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명자들은 먼저 예를 들어, 한외여과와 같은 표준 방법을 사용하여 열성환자 유래의 미정제 요를 농축하였다. 다음 황산 암모늄을 사용하여 상기 농축된 요의 저장물로부터 IL-1 INH를 포함하는 미정제 분획물을 침전시켰다. 상기 황산 암모늄을 투석으로 제거한 후, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IL-1 INH를 활성을 포함하는 분획물을 다른 단백질들로부터 분리하였다. 특히 가장 바람직한 구체예로서, 두 개의 음이온 교환기인 디에틸-(2-히드록시프로필)아미노에틸-세파로즈 컬럼((QAE)-세파로즈 컬럼) 및 디에틸 아미노에틸-세파로즈 컬럼(DEAE)-세파로즈 컬럼)을 독립적으로 또는 복합적으로 사용하였고, 상기 DEAE 세파로즈 컬럼은 QAE 세파로즈 컬럼 후에 사용하는 것이 바람직하다. 여러 가지 분획물의 활성을 모니터하기 위하여, LAF 및 수용체 결합 분석법을 사용하였다. 이러한 본 발명의 구체예에서 그 다음으로 상기 IL-1 INH 활성분획은 겔 여과법으로, 가장 바람직하게는 AcA54 겔을 사용하여 분자량에 따라 분별하고, 다시 상기와 같이 활성 분획물을 선정한다. 선정된 분획물은 약 25kD의 분자량을 가지고 있으며 90% 이상의 단백질 함량을 나타냄을 특징으로 한다. 주로 오염물은 아포지단백 AI 및 레티놀 결합 단백질이다. 비록 이러한 오염물을 여러 가지 방법으로 제거할 수 있을지라도, 아포지단백 및 레티놀 결합 단백질에 대하여 유발되는 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용하는 면역흡착법이 바람직하다.
상기 IL-1 INH 활성 분획물은 그것의 소수성에 따라 단백질을 분별하는 페닐-세파로즈 컬럼상의 소수성 크로마토그래피로 추가 정제한다. 예를 들어, 아포지 단백질 AI 및 레티놀 결합 단백질은 본 발명의 단백질보다 더욱 소수성이며, 따라서 상기 컬럼에 남아 있게 된다.
상술한 바람직한 방법을 사용하여, 본 발명의 IL-1 INH의 비활성도, 즉, 최대저해율의 1/2 정도의 저해율을 산출하는데 필요한 IL-1 INH의 양은 각 정제 단계 후마다 증가하였다. 제9도를 참조하라. 본 발명자들은 이 비활성도를 측정하기 위해 IL-1 수용체 결합분석법, LAF 분석법, EL-4/CTLL 분석법 및 MCF 분석법을 사용하였다. 그러나, 다른 분석법들도 또한 사용될 수 있다.
상기 방법 또는 바람직한 방법으로 정제된 IL-1 INH는 면역억제성 및 항염증성 조성물과 본 발명의 방법에 직접 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 상기 정제된 단백질을 아미노산 서열의 데이타원으로서 사용하여 본 발명의 IL-1 INH를 암호하는 DNA 서열을 분리하고 선정하는데 사용되는 DNA 프로브를 고안하였다. 그 DNA 서열, 이를 포함하는 재조합 DNA 분자 및 이것으로 형질전환된 단세포 숙주를 이용하여 본 발명의 조성물 및 치료법에 사용되는, 다른 인체 단백질이 본질적으로 제거된 본 발명의 IL-1 INH를 다량으로 생산할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 상기 정제된 IL-1 INH의 여러 영역 및 단편의 아미노산 서열을 결정하였다. 그 다음, 이러한 서열 및 이를 암호하는 것으로 추론되는 DNA 서열을 사용하여 본 발명의 IL-1 INH를 암호하는 DNA 서열에 대한 다양한 DNA 라이브러리를 선별하는데 매우 유용한 일련의 DNA 프로브를 고안하였다. 그러한 라이브러리들은 본 발명의 IL-1 INH를 생성하는 것을 증명된 조직 또는 세포 주로부터 제조된 DNA 또는 cDNA 라이브러리 및 염색체 유전자 뱅크(bank)들을 포함하며 ; 그러한 세포 주로는 본 기술분야에 공지된 단핵구 세포 주들을 포함한다.
cDNA를 제조하고 최종적으로 클로닝하여 IL-1 INH 폴리펩티드를 형질 발현하는 방법으로서, 통상적인 방법[예를 들어, Land외 다수, 높은 효율로 클로닝될 수 있는 진핵성 mRNA의 5'-말단서열, Nucleic Acids Research, 9, pp.2251-66(1981) ; Okayoma 및 Berg, cDNA 총길이의 높은 효율 클로닝 Mol. and Cell. Biol., 2, pp. 161-70(1982) ; 및 Maniatis외 다수, 분자 클로닝(Cold Spring Harbor Labora-tory 편집, Cold Spring Harbor, New York), pp.229-46(1982)에 기술된 방법]을 사용하여 자극된 대식 세포와 같은 IL-1 INH 생성 세포원으로부터, 폴리 A+mRNA를 분리한다. 다음, 상기 분리된 폴리 A+ mRNA로부터, 통상적인 방법[예를 들어, Wickens외 다수, 라이소자임, 오보뮤코이드 및 오발휴먼 mRNA에 상보적인 이중나선 DNA의 합성, J. Biol. Chem., 253, p.2483-95(1978) ; Maniatis외 다수, 분자 클로닝(Cold Spring Harbor Laboratory 편집, Cold Spring Harbor, Yew York) pp.229∼46(1982) ; 및 V. Gubler외 다수, cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법, Gene, 25, pp.263∼69(1983)에 기술된 방법]을 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작한다.
클론들의 라이브러리중에서 특정한 재조합 DNA 분자를 포함하는 것, 즉, IL-1 INH 삽입물을 포함하는 것을 선택하는 여러 가지 접근 방법이 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제된 IL-1 INH의 부분적인 아미노산 서열을 기초로 하여, 본 발명의 IL-1 INH의 선정된 부위를 암호하는 일련의 합성 DNA 단편을 포함하는 DNA 프로브를 삭제할 수 있다. 아미노산 서열을 결정하는 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. IL-1 INH의 다양한 부위의 아미노산 서열을 결정한 후, 하이브리드화에 의해서 관련된 DNA 서열을 선별하기 위하여 여러 가지 DNA 라이브러리를 선택하는데 사용하기 위해 통상적인 포스포아미드 DNA 합성 기술을 사용하여 축퇴형 IL-1 INH 프로브의 저장물을 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 DNA 프로브를 A. M. Maxam 및 W.Gilbert(DNA 서열 결정의 새로운 방법, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp.560∼64(1977))에 의해 기술된 것과 본질적으로 같은32P-ATP 및 T4 폴리누클레오티드 키나제를 사용하여32P로 5'-말단 표지시킨다. 다음 이러한 DNA 프로브는 통상적인 방법을 사용하여 본 발명의 IL-1 INH를 암호하는 DNA 서열에 대하여 단핵구성 백혈병 세포주 U937, THP-1 및 HL60으로부터 유도된 cDNA 라이브러리와 같은 cDNA나 또는 게놈 라이브러리를 선별하는데 사용된다. 다음, 이와 같이 선별된 서열을 사용하여 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 상기 서열로 형질전환된 원핵세포 및 진핵세포 숙주내에서 IL-1 INH를 형질 발현할 수 있도록 조작한다. 이들은 또한 포유동물 IL-1 INH를 암호하는 다른 관련된 DNA 서열을 선별하기 위한 선별 프로브로서 유용하다.
광범위한 숙주/벡터 조합을 사용하여 본 발명의 DNA 서열 및 DNA분자를 형질 발현시킬 수 있다. 벡터는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열의 분절을 포함하는 것이 유용하며, 예를 들어, 다양한 공지된 SV40의 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예를 들어 colE1, pCRI, pBR322, pMB9 및 RP4와 같은 이 콜리.(E.coli)의 플라스미드 : 파지 DNA, 예를 들어 NM989와 같은 다양한 파지 유도체, 및 M13 및 다른 사상균 단일 가닥 DNA 파지와 같은 다른 DNA 파지 ; 2μ 플라스미드와 같은 효모에 유용한 벡터 ; SV-40 아데노비루스 및 레트로비루스 유래의 DNA 서열을 포함하는 것과 같은 동물 세포에 유용한 벡터와 같이, 진핵세포에 유용한 벡터 및 파지 DNA 또는 그것의 다른 유도체를 사용하기 위해 변형시킨 플라스미드와 같이, 플라스미드와 파지 DNA의 복합체로부터 유래된 벡터가 있다.
이러한 형질발현 백터는 또한 상기 백터에 삽입되어 있는 IL-1 INH DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 상기 클로닝된 DNA 서열의 형질 발현을 조절 및 제어하는 하나 이상의 형질발현 조절서열을 지님을 특징으로 한다. 유용한 형질발현 조절서열의 예로는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 λ의 주작동인자부와 프로모토부, fd 외피 단백질의 제어부, 효모의 해당작용성 프로모터(예, 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터(예, Pho 5), 효모 α-교배 인자의 프로모터 및 폴리요마, 아데노비루스, 레트로비루스 및 시미안 비루스 유래의 프로모터(예, SV40의 초기 및 후기 프로모터), 및 원핵 또는 진핵 세포 및 그들의 비루스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 서열 또는 그 복합 서열들이 있다.
상기 유용한 형질 발현 백터중에는 동물 및 사람 세포와 같은 진핵생물 숙주내에서 상기 클로닝돈 IL-1 INH DNA 서열을 형질 발현시킬 수 있는 백터가 있다[예를 들어, P.J.Southern 및 P. Berg. J. Mo1. App1. Genet., 1, pp.327∼41(1982) ; S. Subramani외 다수, Mo1. Cell. Bio1., 1, pp. 854∼64(1981) ; R.J.Kaufman 및 P.A.Sharp. 기본 디히드로폴레이트 리덕타제 상보적인 DNA 유전자로 동시 형질 감염된 서열의 증폭 및 형질 발현, J. Mo1., Bio., 159 ; pp.601∼21(1982) ; R. J. Kaufmann 및 P.A.Sharp, Mo1, Cell, Bio1., 159, pp.601∼64(1982) ; S. I. Scahill외 다수, 중국 햄스터 난소 세포내에 사람 면역 인터페론 DNA 유전자 생성물의 형질발현 및 특성 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, pp. 4654∼59(1983) ; G.Urlaub 및 L.A.Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, pp 4216∼20(1980)].
더욱이, 각각의 특정 형질 발현 벡터내에서 여러 부위를 선정하여 본 발명의 IL-1 INH DNA 서열을 삽입시킬 수 있다. 이 부위는 일반적으로 이것을 절단하는 제한 효소에 의해 표지된다. 그것은 당해 기술분야의 전문가들에게 공지된 사항이다. 본 발명에 유용한 형질 발현 벡터는 상기 선정된 DNA 단편의 삽입을 위해서 제한 효소 부위를 가질 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다. 대신, 대안적인 방법에 의해 상기 벡터를 상기 단편에 결합시킬 수 있다. 상기 형질 발현 벡터, 및 특히 선정된 DNA 단편을 삽입하여 그것을 형질발현 조절 서열에 유효하게 결합시키기 위한 벡터내의 선택 부위는 여러 요인, 예를 들어, 특정 제한 효소에 민감한 영역의 수, 형질 발현될 단백질의 크기, 숙주 세포의 효소에 의한 단백분해성 분해에 대한 상기 목적 단백질의 감수성, 정제시 제거하기 힘든 숙주 세포 단백질에 의해 형질 발현되는 단백질의 결합 또는 오염성 ; 상기 벡터 서열에 상대적인 개시 및 종지 코돈의 위치와 같은 형질 발현 특성, 및 당업자들이 알고 있는 다른 요인들에 의해서 결정된다. 벡터 및 DNA 서열의 삽입 부위의 선택은 모든 선택이 제시된 경우에 동일하게 유효하지는 않지만, 상기 요인들의 균형을 맞추어 결정한다.
유용한 형질 발현 숙주에는 이. 콜리 SG-936, 이. 콜리 HB 101, 이. 콜리 W3110, 이. 콜리 X1776, 이. 콜리 X2282, 이. 콜리 DHI, 및 이. 콜리 MRC1과 같은 이. 콜리 균주, 슈도모나스(Pseudomonas)균주, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 효모 및 다른 곰팡이 균주, COS 세포 및 CHO세포와 같은 동물 세포, 및 조직 배양물중의 사람 세포 및 식물 세포와 같이, 공지된 진핵 및 원핵 숙주를 포함한다.
물론 모든 숙주/형질 발현 벡터 조합체가 본 발명의 DNA 서열을 형질 발현하는데 또는 본 발명의 IL-1 INH-유사 폴리펩티드를 생성하는데 있어서 동일한 효율로 작용하지는 않는다. 그러나, 특정한 숙주/형질 발현 벡터 조합체의 선택은 본 발명의 범위로부터 이탈됨이 없이 본 명세서에서 전술한 원리를 충분히 고려한 후 당업자라면 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택은 많은 요인들이 균형을 이루는 것에 기초해야 한다. 그 예로서 숙주와 벡터의 화합성(compatibility), DNA 서열에 의해 암호된 단백질의 숙주에 대한 독성, 목적 단백질의 회수 용이성, DNA 서열과 그것에 유효하게 연결된 형질 발현 조절 서열의 발현 특성, 생체 안정성, 비용 및 목적 단백질의 폴딩(folding), 형태 또는 형질 발현후 임의의 다른 필요한 변형과 같은 요인들을 포함한다.
본 발명의 DNA 서열로 형질 전환된 원핵 및 진핵 숙주의 발효배양에 의해 생성한 IL-1 INH는 면역억제성 및 항 염증 조성물과 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-1 INH는 또한 IL-1 INH의 활성을 가진 합성 펩티드를 포함하여 단편이나 펩티드를 제조하는 활성 부위를 결정하기 위해 분석할 수 있다. 그러한 활성 부위를 결정하기 위한 공지된 기술중에서는 X-선 결정법, 핵자기 공명, 원형 이색법, UV 분광분석 및 부위 특이적 돌연변이법이 있다. 따라서, 이러한 단편 또는 펩티드들도 또한 본 발명의 부분이며 면역 억제성 또는 항 염증성 표적 및 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-1 INH 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드나 그것의 아미노산 서열을 사용하여 유도되거나 합성된 펩티드, 또는 그것의 염이나 그것의 약학적 허용성 유도체의 투여는 면역 억제 활성 또는 항 염증 활성을 나타내는 제제가 통상적을 투여되는 방식중 어떤 방식을 사용해도 된다. 예컨대 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 병소내 또는 국소투여를 포함한다. 특히, 국소, 병소내 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
이러한 치료제로 사용되는 조성물은 또한 여러 가지 형태일 수 있다. 이러한 것은 예를 들어, 정제, 환약, 산제, 액상 용액 또는 현탁액, 좌약, 주사용 및 주입용 용액과 같은 고상, 반고상 및 액상복용 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 의도적인 투여 및 치료 적용 방식에 따라 달라진다. 상기 조성물은 또한 통상적인 약학적 허용성 담체를 포함하는 것이 바람직하고, 사람 혈청 알부민이나 형장 제제와 같은 다른 약제, 담체, 보조제, 부형제 등을 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 단위복용량 형태이고 보통 하루 한번 또는 수회 이상으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.
본 명세서에 설명된 본 발명을 더욱 충분히 이해할 수 있도록 하기 위하여, 하기 실시예를 예시하였다. 하기 실시예는 단지 설명을 목적으로 한 것이고 본 발명을 본 원에 제시한 구체적인 실시예로 제한하는 것으로서 이해되어서는 안된다.
[실시예]
[실시예 1]
IL-1 INH의 정제
a) 사람 요로부터 단백질의 농축
요 감염증이 없는 고 열성환자(38.5℃)로부터 채취한 100리터의 요 저장물을 4℃에서 아미콘(Amicon) 한회여과 공동 섬유 기구(Ultrafiltration hollow fiber apparatus)로 2리터로 농축하였다. 얻어진 용액은 실시예 2에서 설명되는 IL-1 수용체 분석으로 측정했을 때 12U/mg 단백질, 실시예 3에서 설명되는 LAF 분석으로 측정했을 때 166U/mg 단백질, 실시예 4에서 설명되는 EL-4/CTLL 분석으로 측정했을 때 32U/mg 실시예 5에서 설명되는 MCF 분석으로 측정했을 때 125U/mg 단백질의 비활성도를 가지고 있었다. U 또는 유니트는 각 생물학적 검정법에서 최대저해율은 1/2의 저해율을 생성하는 IL-1 INH(μg)의 양으로서 정의된다. 제9도를 참조하라.
b) 사람의 요로부터 단백질의 침전
먼저, 상기 농축 요 저장물은 4℃에서 일정하게 교반하면서 여기에 고체 황산암모늄을 40%의 황산암모늄 포화도에 도달할 때까지 서서히 첨가함으로써 상기 농축된 요를 포화시켰다. 다음, 상기 용액을 10,000rpm에서 고정각을 유지하는 GSA로터를 사용하여 Sorvall RC-5B(E.I.Du Pont, New Town, Conn)로 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 분리하였다. 그 다음 펠렛을 분리하고, 그 상층액을 황산암모늄 80% 포화도로 조정하고 10,000rpm에서 1시간 동안 원심분리시켰다. 수득한 펠렛을 150mM NaCl이 첨가된 20mM인산나트륨(pH 72) (650ml)중에 재현탁시켰다. 상기 용액을 24시간 동안 10mM 트리스 HCl(pH 8), 2mM EDTA 및 5mM 벤즈아미딘 HCl을 포함하는 45리터 용액에 대하여 투석(2회)시켜 황산암모늄을 제거하였다.
c) 이온 교환 크로마토그래피
두 개의 다른 음이온 교환기에 대한 IL-1 INH의 강한 결합 친화력을 이용하여 다른 단백질들로부터 IL-1 INH 활성을 지닌 여러 분획 혼합물을 분리하였다. 각 음이온 교환기는 독립적으로 또는 복합적으로 사용되며, DEAE 세파로즈 컬럼 전에 QAE 세파로즈 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다.
1) 디에틸-(2-히드록시프로필) 아미노에틸(QAE) 세파로즈 컬럼
많은 음이온 교환 크로마토그래피 시스템이 당해 기술분야의 전문가들에게 공지되어 있지만, 먼저 직경 5㎝×45㎝의 QAE-세파로즈 컬럼(뉴저지주의 피츠카타웨이 소재의 Pharmacia Fine Chemicals 시판품)을 사용했다. 상기 투석된 용액을 상기 컬럼에 부하한 후 결합되지 않은 단백질이 용출될 때까지 상기 컬럼을 세정하였다(280㎚에서의 광학 밀도). 평형화 완충액중에 용해된 0에서 0.8M까지 NaCl염 구배시킨 용액을 4배의 컬럼 부피로 결합된 단백질을 용출시켰다. 컬럼 유속은 120ml/h이었다. LAF 및 수용체 결합 분석을 사용하여 여러 가지 분획물의 활성을 모니터하였다(하기 참조). 제1도를 참조하라. IL-1 INH의 생물학적 활성을 나타내는 분획물들이 약 150mM NaCl로 용출되었다. 상기 합한 활성 분획물은 실시예 2에서 설명되는 IL-1 수용체 결합 분석으로 측정했을 때 33U/㎎ 단백질, 실시예 3에서 설명되는 LAF 분석으로 측정했을 때 63U/㎎ 단백질, 실시예 4에서 설명되는 EL-4/CTLL 분석으로 측정했을 때 27U/㎎ 단백질 및 실시예 5에서 설명하는 MCF 분석을 측정했을 때 200U/㎎ 단백질의 비활성을 가지고 있었다. 제9도를 참조하라.
2) 디에틸아미노에틸(DEAE)세파로즈 컬럼
2.5㎝×30㎝의 DEAE-세파로즈 고속 컬럼(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 Pharmacia Fine Chemicals 시판품)상에 장입된 10mM 트리스 HCl(pH 7)에 대하여 상기 활성 저장물을 투석시켰다. 상기 활성 저장물이 장입된 컬럼을 평형 완충액(10mM 트리스 HCl, ph 7)으로 강학밀도(280nM에서)가 약 0이 될 때까지 세정하였다. 다음 결합된 단백질을 0부터 0.2M까지 NaCl구배된 평형 완충액으로 용출시켰다. 상기 구배량은 상기 컬럼 부피의 10배이다. 그 컬럼의 유속은 78ml/h였다. 다시, 상기와 같이 여러 분획물들의 활성을 모니터하였다. 이러한 용출방법은 90mM NaCl로의 세정 단계 마지막에 IL-1 INH 활성을 가진 분획물이 용출되도록 하였다. 제2도는 상기 DEAE-세파로즈 상에 요의 IL-1 저해제의 활성 프로필을 보여 주며, 여기에서 상기 저해 활성은 (A)IL-1/LAF 분석 및 (B) IL-1/수용체 결합 분석(하기 참조)으로 측정한다.
다음, 상기 활성 저장물을 YM-10 멤브레인을 사용하여 아미콘 한외여과 장치로 6ml로 농축시켰다. 수득한 용액은 IL-1 수용체 결합 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 50U/㎎ 단백질, LAF 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 125U/㎎ 단백질, EL-4/CTLL 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 40U/㎎ 단백질 및 MCF 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 500U/㎎ 단백질의 비활성도를 가지고 있었다. 제9도를 참조하라.
물론, 본 발명의 범위로부터 이탈됨이 없이 다른 음이온 교환컬럼도 또한 선택될 수 있다는 것은 자명한 것이다.
d) 울트로겔 AcA54
상술한 바와 같이 제조된 농축물을, 분자량에 따라서 겔 여과법을 사용하여 2회 분별하였다. 수많은 적절한 겔 여과 시스템이 당해 기술분야의 전문가들에게 공지되어 있지만, 6,000 내지 70,000 달톤의 분별 범위를 가진 AcA54 겔(LKB, 스웨덴)을 선택 사용하였다. 다시, 상기와 같이 분획물들의 활성을 모니터하였다. 제3도를 참조하라. 수득한 활성 분획물은 IL-1 수용체 결합 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 1666U/㎎ 단백질, LAF 분석(하기 참조)으로 측정했을 때 526/㎎ 단백질, EL-4/CTLL 분석(하기 참조)으로 측정했을대 333U/mg 단백질, MCF 분석으로 측정했을 때 1110/㎎ 단백질의 비활성도를 가지고 있었고 (제9도를 참조하라), 약 25kD의 분자량을 가지고 있었다. 또한, 다른 여과 시스템도 사용할 수 있다는 것은 당연한 것이다.
제4도는 하기 설명되는 (A) IL-1/LAF 분석 및 (B) IL-1/수용체 결합 분석에 있어서 여러 요 IL-1 INH 저장물의 용량 응답 반응을 예시한다. 각 정제 단계후, 즉, 농축 요 ; QAE-세파로즈 ; DEAE-세파로즈 ; 및 AcA54(2회)후, 저해작용을 수행하는 데 필요한 IL-1 INH의 농도(㎍/ml)는 감소되었고 이것은 더욱 순수한 단백질임을 나타낸다.
e) 음성-면역흡착법
상기 겔 여과후의 활성물을 사용하여 통상적인 방법인 자동에드만(Edman)분해법으로 아미노산 서열을 결정하였고, 90% 이상의 단백질 함량을 나타내는 두가지 주요 오염물이 아포지단백질AI 및 레티놀 결합 단백질이라는 것을 관찰하였다. 비록, 여러 가지 방법이 이러한 단백질을 제거하는데 유용하지만, 본 발명들은 면역흡착 및 소수성 크로마토그래피를 선택하였다.
다음으로, 본 발명자들은 면역 흡착법을 사용하여 상기 IL-1 INH AcA54 활성물로부터 주요 오염물을 분리하였다. 면역화의 표준방법을 사용하여 레티놀 결합 단백질 및 아포지단백질 AI에 대한 단클론성 및 다클론성 항체를 생성하였다. 다음 40% 포화도의 황산암모늄으로 침전시켜 면역글로불린G(IgG)를 부분정제 하였다. 이 IgG 펠렛을 0.2M 인산나트륨에 재현탁시키고 동일 완충액에 대하여 투석시켰다. 이 IgG액을 제조업자(덴마아크 소재의 Biotechnoiogy Corp.의 KEM-EN-TEC)에 의해 기술된 바와 같이 비닐술폰-활성 아가로즈에 결합시켰다. 상기 면역 흡착제를 인산염 완충 식염수로 평형화한 후, 이 면역흡착제 상으로 IL-1 INH 저장물을 수회 통과시켜 오염물인 임의의 레티놀 결합 단백질 및 아포지단백 AI가 소듐도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 측정시 완전 흡착될 때까지 상기 저장물중의 오염물들을 흡착시켰다. 이로써 수득한 용액은 IL-1 수용체 결합 분석법(하기 참조)으로 측정했을 때, 3334U/㎎ 단백질, LAF 분석법(하기 참조)으로 측정했을 때 2500U/㎎ 단백질, EL-4/CTLL 분석법(하기 참조)으로 측정했을 때 1250U/㎎ 단백질, MCF 분석법(하기 참조)으로 측정했을 때 2160U/㎎ 단백질의 비활성을 나타냈고(제9도 참조), SDA/PAGE상에서 단일 피크를 나타내었다.
f) 페닐 세파로즈
상기 면역 흡착된 IL-1 저해제 저장물을 10mM 트리스 HCl(pH 7)에 용해된 2M NaCl을 1부피량 첨가함으로써 1M NaCl로 조정하였고 페닐-세파로즈(0.5×5㎝, 이 수지는 스웨덴 소재의 Pharmacia fine Chemicals로부터 입수함)에 장입시켰다. 이 수지는 0.2M NaCl(평형화 완충액)을 함유하는 pH7의 10mM 트리스 HCl로 미리 평형화시킨 것이다. 장입후 상기 컬럼을 컬럼의 3배 부피의 평형화 용액으로 세정하여 모든 비-결합 단백질을 용출시키고, 결합 단백질은 10mM트리스 HCl(pH 7)중에 용해된 0.2M에서부터 0M까지의 NaCl 구배로 용출시켰다. 상기 총 구배량은 상기 컬럼 부피의 50배였다. 상기 컬럼 유속은 30ml/h였다. Il-1 저해제 활성은 약 0.160M NaCl에서 용출되었고 여기에서 4.7의 PI를 가진 25Kda 분자량의 단백질이 산출되었다. 수득된 용액을 실시예 2에서 설명되는 Il-1 수용체 결합 분석으로 측정했을 때 38461U/㎎ 단백질, 실시예 3에서 설명되는 LAF 분석으로 측정했을 때 2,500U/㎎ 단백질, 실시예 4에서 설명되는 EL-4/CTLL 분석으로 측정했을 때 35,020U/㎎ 단백질, 실시예 5에서 설명되는 MCF 분석으로 측정했을 때 30,303U/㎎ 단백질의 비활성을 나타냈고 (제9도 참조), SDS/PAGE 상에서 단일 피크를 나타내었다.
[실시예 2]
IL-1 INH의 수용체 결합 능력
본 발명자들은 EL-4-6.1 표적 세포상의 IL-1 수용체에 대한 본 발명의 IL-1 INH의 결합 특성을 측정하기 위하여, 먼저 IL-1 INH가 [125I]-IL-1의 상기 표적 세포에 대한 결합을 방해하는지에 대하여 관찰하였다. 클로라민(Chloramine) T방법[Lowentha]외 다수, T 세포에 대한 결합 및 내재화 J.Exp. Med.,164, p. 1060]으로 IL-1을125I로 표지시키고, 이것을 과량의 IL-1 INH와 함께 동시 항온 처리한 후 오일 구배상에서 세정하였다. 감마 계수기를 사용하여, 상기 세포에 보유된 물질을 측정하였고 IL-1 INH의 농도를 증가시키는 것이 상기 표적세포의 표면에 [125I]-IL-l의 양을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
또한, 표적 세포에 대한 [125I]-IL-l INH의 결합을 비표지된 IL-1과 경쟁하든지 또는 상기 표적세포에 대한 [125I]-IL-1 INH의 결합이 레티놀 결합 단백질 또는 아포지 단백질 AI와 경쟁하든지 간에, IL-1 INH가 상기 표적 세포에 대한 [125I]-IL-1 INH의 결합을 방해하는지의 여부를 시험 관찰하였다. [125I]를 사용하여, Bolton 및 Hunter의 방법에 따라 [Bolton 및 Hunter,125I-함유 아실화제의 결합에 의한 단백질의 높은 특이 방사능으로의 표지, Biochem. J.,133, p.529(1973)] IL-1 INH를 표지화했다. 이 물질을 EL-4-6.1 표적세포와 같이 항온처리한 후 오일구배로 세정하고, SDA/PAGE상에서 분석하여 약 25kD의 종류가 상기 EL-4 세포에 결합하는 것으로 나타났다. 상기[125I]-IL-l INH와 과량의 비표지 IL-1 INH의 동시항온 처리한 결과 표지된 25kD류의 결합을 방해한다는 것을 관찰하였다. 우리는 또한 [125I]-IL-l INH와 50ng의 비표시 IL-1β를 동시항온 처리함으로써, 상기 표지된 25kD류의 결합이 방해된다는 것을 발견하였다. 또한 [125I]-IL-l INH를 1㎍의 면역정제된 레티놀 결합 단백질 및 1㎍의 재조합 아포지단백 AI과 함께 동시항온 처리한 결과, 상기 표지된 25kD류의 결합이 방해되지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서 상기 표지된 [125I]-IL-l 제조물중에 존재하는 상기 25kD류는 본래의 EL-4-6.1 세포의 표면에 결합하며, 그 결합은 비표지형 저해제 및 IL-l과 경쟁적이지만, 레티놀 결합 단백질이나 아포지단백질 AI와는 경쟁적이지 않았다.
[실시예3]
IL-1/LAF 분석
IL-1/LAF 분석에서 IL-1 INH의 저해활성은 C3H/HeJ 마우스내에서 흉선세포(T-세포) 증식으로 측정하는 바와 같이 증명하였다[J. M. Dayer외 다수, 사람의 활액세포에 의해 콜라게나제 및 프로스타글란딘 E2생성을 자극하는 사람의 재조합 IL-1, J. Clin Invest., 77, p.645(1986)]. hrIL-1α[P. Wingfield외 다수, 이. 콜리 내에서 형질 발현되는 사람의 인터루킨-1의 정제 및 특성, Eur.J.Biochem, 165, p. 537(1987)] 또는 IL-1β[P.Wingfield외 다수, 재조합 이. 콜리내에서 형질 발현되는 사람의 이터루킨-1β의 정제 및 특성, Eur. J. Biochem, 160, p. 491(1986)]를 제5도에 나타낸 바와 같이 hrIL-1, 20pg/ml 내지 2,000pg/ml 범위의 여러 최종 농도로서 존재하에 PHA(1㎍/ml)로 흉선 세포를 72시간 동안 공동 자극하였다. 이와 같이 공동자극한 hIL-1α 또는 hIL-1β 흉선세포 증식의 완전 저해는 실시예1(e)로부터 수득한 IL-1 INH 분획물을 상기 세포에 첨가했을 때 나타났다. 저해 활성은 IL-1 INH : 1/20, 1/40 및 1/80의 3가지 회석율하에 모니터했다.
hrIL-1의 부재하에 PHA-자극된 세포에 IL-1 INH를 첨가하면 [H3]-TdR 병입에 영향을 미치지 않으므로 저해작용을 세포독성이나 비-특이적인 효과 때문이 아니라 IL-1 생물학적 활성의 저해 작용 때문인 것으로 측정되었다.
[실시예 4]
EL-4/CTLL 분석
IL-1 INH의 저해활성은 EL-4 세포내에 IL-2의 생성을 유도할 수 있는 IL-1α 또는 IL-1β의 능력이 저해되는지의 여부를 관찰함으로써 측정하였다[참조, 예를 들어, A.J.H.Gearing외 다수, 103U/ml의 IL-2에 대하여 반응하지 않은 IL-1에 대한 간단하고 민감한 생물학적 검정법, J.Immun. Met., 99, p.7(1987)].이것은 주위 배지로부터 티미딘을 취할 수 없는 EL-4 세포의 서브클론(Sub-Clone)을 CTLL-2 세포와 공동배양하고 상기 CTLL-2 세포가 증식하는지의 여부를 관찰함으로써 측정하였다.
EL-4.6.1 c10 세포 및 CTLL-2 세포를 약 1pg/ml의 IL-1α 또는 IL-1β의 존재하에 마이크로타이터웰(96웰 평판)당 각각 104세포의 농도로서 실시예 1(e)의 IL-1 INH와 공동 배양하였다. 18시간 동안 공동 배양한 후 [H3]-TdR 1μCi를 첨가하고 가습대기하에 37℃ 에서 추가로 6시간 동안 항온배양하였다. 세포를 MASH세포 수거기상의 유리섬유 스트립위에 수거하고, 건조한 후 신틸레이션 칵테일로 제조하여 베타 계수기로 계수하였다. 1/20, 1/40 및 1/80의 IL-1 INH 희석물에서 [H3]-TdR의 병입이 완전 저해되었다.
[실시예 5]
IL-1/MCF 분석
유아의 포피(包皮)로부터 얻은 섬유세포상에서 측정되는 바와 같이 IL-1/MCF 분석으로 IL-1 INH의 저해작용을 추가로 증명했다[J.Dayer외 다수, 류마티스양 활액세포에 의한 콜라게나제 및 프로스타글라딘의 방출을 자극하는 인자의 생어에 단핵구-대식세포 및 림프구의 참여, J.Clin. Invest., 64, p.1386(1979) ; J.Dayer외 다수, 류미티스양 활액 세포내에 콜라게나제 및 프로스타글란딘 E2-자극 활성에 의해 측정되는 사람 인터루킨-1 mRAN의 유도, J. Immunol., 14, p.898(1984)]. IL-1/LAF 분석에서와 동일한 농도의 hrIL-1α 또는 hrIL-1β로 섬유아세포를 자극시키고 IL-1/LAF 분석에서와 동일한 최종 희석율의 IL-1 INH로 저해활성을 모니터했다. 72시간 동안 세포 배양후 프로스타글란딘 E2에 대한 항혈청을 이용하여 이중 항체 방사능 면역분석[J.Dayer(1979) 상기 참조]으로 섬유아세포 상층액내의 프로스타글란딘 E2생성을 측정했다. 제6도에 제시된 것처럼, hrIL-1α 또는 hrIL-1β에 의한 100pg/ml 이하의 프로스타글란딘 E2생성의 용량 응답 반응을 관찰했다. 실시예 1(e)의 Il-1 INH 분획물을 첨가함으로써 이러한 생물학적 활성을 억제시킬 수 있었다. IL-1 INH가 hrIL-1α 및 hrIL-1β에 대한 효과적이라는 것을 다시 알게 되었다.
또한, 본 발명자들은 TNFα가 프로스타글란딘 E2및 콜라게나제 생성의 매개 인자이므로 IN-1 INH의 특이성을 측정하기 위해서 hrIL-1 대신 hrTNFα[A.Marmenout외 다수, TNF의 분자 클로닝 및 형질발현과 마우스 TNF와의 비교, Eur. J. Biochem, 152, pp. 515-22(1985)]를 사용하여 상기 분석을 수행했다. 제7도에 도시된 것처럼, hrTNF-유도성 프로스타글란딘 E2생성은 본 발명의 IL-1 INH를 첨가함으로써 큰 영향을 받지 않았으며, 이는 IL-1 INH의 특이성을 나타내는 것이다.
[실시예 6]
섬유아세포 증식 분석
[H3]-TdR의 병입으로 측정되는 섬유아세포 증식 분석을 이용하여, 실시예 1(e)의 IL-1 INH의 존재하에서 IL-1의 작용을 더 자세히 분석했다. 10mM HEPES, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100ug/ml, 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산 및 2% FCS로 보강된 이글스 MEM 배지내에서 사람의 포피 섬유아세포를 배양한 후에, 96-웰 평판에 세포를 접종한 후(2000세포/웰), 37℃의 5% CO2세포 배양기 내에서 24시간 동안 배양했다. 배지를 제거한 후, hrIL-1α 또는 hrIL-1β를 첨가함으로써 섬유아세포를 자극했으며 상기 분석법들에서와 동일한 희석율의 IL-1 INH를 첨가했다. 48시간을 기다린 후 세포에 [H3]-TdR을 첨가한 후 16시간 동안 유지시켰다. 세포로부터 배지를 제거한 후 PBS로 세정하고 37℃에서 추가로 15분동안 트립신처리를 했다. 세포수거기(Skatron, Lier, Norway)로 유리 필터(Skatron, Int., Sterling, Virginia, U.S.A)상에 세포를 모아서 물로 세정하고 공기건조한 후 신틸레이션 계수기로 병입량 cpm을 측정했다. 제8도에 제시된 것처럼, 섬유아세포 증식은 hrIL-1α 및 hrIL-1β에 대해서 용량-의존 적이었다. 250pg/ml의 hrIL-1α 또는 hrIL-1β로 최대 [H3]-TdR 병입량을 얻었다. 또한, AcA54 저해분획물을 첨가함으로써 hrIL-1-유도증식을 완전히 감소시켰다. 또한, IL-1 농도를 증가시키거나 IL-1 INH를 희석시킴으로써 저해반응을 완전 가역시킬 수 있었다.
또한, hrTNFα로 섬유아세포를 자극함으로써 상기 저해 반응의 특이성을 측정했으며, 상기 hrTNFα는 250pg/ml 이하의 농도에서 용량 의존 방식으로 섬유아세포 증식을 유도한다. AcA54 저해분획물을 첨가함으로써 hrTNFα의 생물학적 활성을 저해할 수 없었다. 이것은 IL-1 INH의 특이성을 입증하는 것이다.
[실시예 7]
[등전점의 측정]
25mM 이미다졸(pH 7.5)로 미리 평형화시킨 PBE 94 크로마토포커싱(Pharmacia Fine Chemical, Sweden) 컬럼(2.5×10㎝)위에 실시예 1(e)로부터 용출된 단백질 저장물을 장입했다. 등전점에 따라서, 결합된 단백질을 용출하는 pH 4의 폴리완충액 74HCl을 첨가하였다. 상기 IL-1 INH의 pI는 4.7로 측정되었다.
이상에서 본 발명의 수많은 구체예를 설명하였지만, 기본적인 구성을 변화시켜 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 다른 구체예를 제공할 수 있다는 것이 명백하다.
그러므로, 본 발명의 범위는 실시예에 의해서 제시된 구체예보다 첨부된 청구범위에 의해 규정되어야만 할 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 QAE-세파로즈 단계로부터 수득한 요의 IL-1 INH의 활성 프로파일을 도시한다.
제2도는 DEAE-세파로즈 단계로부터 수득한 요의 IL-1 INH의 활성 프로필을 도시한 것이다.
제3도는 AcA54 여과 분획중에 요의 IL-1 INH의 활성 프로필을 도시한 것이다.
제4도는 각 정제 단계후에 IL-1/LAF 및 IL-1/수용체 결합검정으로 측정된 요의 IL-1 INH 저장물(pool)의 용량-응답 곡선을 도시한 것이다.
제5도는 IL-1/LAF 검정에서 측정된 IL-1 INH 활성을 도시한 것이다.
제6도는 IL-1/MCF 검정에서 측정된 IL-1 INH 활성을 도시한 것이다.
제7도는 IL-1 INH가 hrTNFα-유도성 PGE2생성에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한 것이다.
제8도는 IL-1/ 섬유 아세포 증식 검정에서 측정된 IL-1 INH 활성을 도시한 것이다.
제9도는 각 정제 단계후에 IL-1 수용체 결합 검정, LAF 검정, EL-4/CTLL 검정 및 MCF 검정에서 측정된 IL-1 INH 특이 활성을 도시한 것이다.
Claims (14)
- (a)IL-1의 LAF 활성에 대한 저해 작용 ; (b) IL-1의 MCF 활성에 대한 저해 작용 ; (c)IL-1매개 섬유아세포 증식에 대한 저해 작용 ; (d) TNFα 매개의 PGE2및 콜라게나제의 생성에 대한 비-억제 작용 ; (e) IL-1 수용체에 IL-1 결합의 저해 작용 ; 및 (f) IL-1 매개의 IL-2 생성 분석법에서 1.2×103U/단백질㎎의 비활성을 특징으로 하며, SDS/PAGE상에서 단일 밴드로서 이동하고 아포지단백 A1 및 레티놀 결합 단백질이 실질적으로 제거된, 본질적으로 순수한 IL-1 저해제(INH).
- 제1항에 있어서, SDS PAGE상에서 약 25,000달톤의 분자량을 나타냄을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- 제2항에 있어서, 크로마토포커싱 결과 4.7의 등전점을 가짐을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- 제1항에 있어서, IL-1 수용체 결합 분석에서 3.8×104U/㎎ 이상의 비활성을 나타냄을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- 제1항에 있어서, IL-1/LAF 분석에서 6.2×104U/㎎ 이상의 비활성을 나타냄을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- 제1항에 있어서, EL-4/CTLL 분석에서 3.5×104U/㎎ 이상의 비활성을 나타냄을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- 제1항에 있어서, IL-1/MCF 분석에서 3.0×104U/㎎ 이상의 비활성을 나타냄을 특징으로 하는 IL-1 INH.
- a) 열성환자로부터 얻은 요를 농축시키는 단계 ; b) 상기 농축된 요로부터 미정제 IL-1 INH를 침전 시키는 단계 ; 및 c) 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과법 및 면역흡착법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 상기 IL-1 INH를 다른 오염물로부터 분별하는 단계를 포함하는, 제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 내지 제7항중 어느 한 항의 IL-1 INH를 정제하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 미정제 IL-1 INH는 황산암모늄을 사용하여 상기 농축된 요로부터 침전됨을 특징으로 하는 방법.
- 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과법 및 면역 흡착법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 다른 오염물로부터 IL-1 INH를 분별하는 단계를 포함하는, 제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 내지 제7항중 어느 한 항의 IL-1 INH를 정제하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 QAE 또는 DEAE 세파로즈 컬럼상에서, 각각 또는 복합적으로 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 겔 여과법은 AcA54 겔상에서 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 면역 흡착법은 레티놀 결합 단백질 및 아포지단백질 A1에 대한 단클론 또는 다클론 항체를 사용함으로써 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 QAE 또는 DEAE 세파로즈 컬럼상에서, 각각 또는 복합적으로 실시됨을 특징으로 하는 방법.
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