LU86874A1 - Erhoehte expression von human-interleukin-2 in saeugerzellen - Google Patents

Description

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du .8 mai 1987 ......... -, de l'Économie et des Classes Moyennes Tîtrf» délivré . ^3 Service de la Propriété Intellectuelle

1_ 1 ’TT&P LUXEMBOURG

! ί-'οΛζ - 77 Demande de Brevet d’invention y'/- Zii/sv*., -/ ......................................................................—........................................-........................................................................ ( 1) * I. Requête . La société dite.:........F. HOFFMANN-LÄ.....ROCHE & CO. Aktiengesellschaft^, 124-184 G r en z a ch erstrasse, CH -4002 BASEL, Suisse, représentée .. par......Monsieur.....Jacques......de. Muy ser, agissant en qualité de _______ . mandataire.............................................................................................................. ................. ............................... ( 3j dépose!nti ce.............huit mai 19 00 quatre-vingt sept _________________________________ ^ 4) à........15.................heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: ......" Erhöhte.Expr es s i on von Human-In terleukin-2 in Säug erzeilen ^"5 ( 2. la description en langue .......allemande.......... ....................................de l’invention en trois exemplaires; 3...............................4..................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 3. mai 19 87 .

5. la délégation de pouvoir, datée de Basel..................................................................... le .... l?__avril. 1987 .

6. le document d’avant cause (autorisation); déclare(pt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeurs ) est (sont): ( 6) -BrvanRichard CULLEN,70 Beverly......Road,......WEST CALDWELL, N.J.

..................07006.,.......Etats-Unis d'Amérique ___________________________________________________________________________________________________________________________________ rev&ndiquefnt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ( 7) brevet ...........................................................................................déposée(s)?i(8) aux Etats-Unis d'Amérique le (9) 12......mai......19.8.6....................................................................................................................................................................................................

sous le N° (10) 862.0 82......................................................................................................................................................... ................................................................................................

au nom de (11)........1 ' inventeur...............................................:............................................................................................................................................. .............

élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg..........,.............................................

.............35.,........boulevard......Royal.................................................................................................................................................................................... (12) sollicite(nt) la délivrance d’un brevet d'invention pour l'objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, ave&ajoumement de cette délivrance à....................................................................12_________________________________________________________ ________________________mois. (13) "Ledépœant/mandataire: ....... ................................................................................ .................................................................... (14) \ Π. Procès-verbal de Dépôt

La susd te demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes,

Service ie la Propriété IntelIéctçeiï^*Îiixembourg. en date du: 8 mai 1987 ^7 / ‘ .F *·-·%\ ' f / * ’·. v \ Pr. le Ministre de rÉconqoiie et des Classes Moyennes, T r- j c ... -y.· s ·, Tt» / ' à. 4?...................heures! i / V * \ Æ. à./ . .*· \ t.. ... -.y Le chef du servicame L· oiopriété intellectuelle, \7'· h:, AWiKr_________/ y___ EXPLICATIONS RELATIVES Al FORMULAIRE DE DÉPÔT 7 /1 . r'n , -, I.jt Ti.,M4n>iii rii >ΐ' -n. ητ,η',ητί i 1·. .«ni. VitaïH n 'nrinal Twr Al ^ Γ4! irn-Tm. IMnrMI nnflAm mnfeccinn 52.651

i BEANSPRUCHUNG DER PRIORITÄT

der Patent/ESHi. - Anmeldung . 5 ’ ih: den Vereinigten Staaten von Amerika Vom: 12. Mai 1986 (No. 862.082)

PATENTANMELDUNG

in

Luxemburg

Anmelder: F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft CH-4002 BASEL (Schweiz)

Betr. : ''Erhöhte Expression von Human-Interle.ukin-2 in Säugerzellen. " t t

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j I 4 10 Erhöhte Expression von Human-lnterleukin-2 in Sâuqerzellen 15 Die Gen-Technologie hat es ermöglicht, eine grosse

Anzahl biologischer Produkte industriell herzustellen. In den gängigen Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie werden DNA-Sequenzen in geeignete DNA-Trägermoleküle oder Vektoren eingefügt. Die entstehenden rekombinierten DNA-20 -Moleküle können in Wirtszellen replizieren. Oft werden kreisförmige doppelsträngige DNA Moleküle, auch Plasmide genannt, als Vektoren verwendet. Zur Herstellung dieser rekombinierten DNA-Moleküle werden Restriktionsendonukleasen verwendet, d.h. Enzyme, welche DNA an bestimmten Stellen in 25 der Nukleotidsequenz spalten können. Allgemeine Methoden für die Herstellung von rekombinierten DNA-Molekülen wurden von

Cohen et al. [U.S. Patent No. 4,327,224], Collins et al.

[U.S. Patent'No. 4,304,863] and Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manuali 1982, Cold Spring Harbor 30 Laboratory] beschrieben.

Rekombinierte DNA-Moleküle können nur dann zur Herstellung des von der eingefügten Gensequenz codierten Polypeptids verwendet werden, wenn die nachfolgend aufgeführten 35 Bedingungen erfüllt sind. Allererstes Erfordernis ist, dass · Wä/8.4.87 ' * - 2 -

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das rekombinierte DNA Molekül dem Wirtsorganismus angepasst ist und darin selbstständig replizieren kann. Meist wird das Bakterium Escherichia coli (E. coli) verwendet, weil eine grosse Anzahl rekombinierter Plasmide diesem Wirtsorganismus 5 angepasst sind. In Abhängigkeit vom verwendeten Vektor/ Wirtszellsystem, wird das rekombinierte DNA-Molekül durch Transformation, Transduktion oder Transfektion in die Wirtszelle eingeführt.

10 Die Einführung des rekombinierten Vektors in eine Wirts zelle führt noch nicht notwendigerweise dazu, dass signifikante Mengen des gewünschten Genprodukts produziert werden. Damit das geschieht, muss die fremde Gensequenz in richtiger Art und Weise mit einer Signalsequenz, die die Transkription 15 einleitet, auch Promoter genannt, verbunden werden. Andererseits kann die fremde DNA schon einen eigenen Promoter enthalten, vorausgesetzt, dieser Promoter wird von der Wirtszelle erkannt. Der Promoter ist eine DNA Sequenz, die sich oberhalb, d.h. in 5'-Richtung vor dem Gen das zu expri-20 mieren ist, befindet. Er bestimmt die Bindung der RNA-Poly-merase und leitet demzufolge die Transkription der DNA in die Boten-RNA (mRNA) ein.

Wenn auch durch Verwendung eines starken Promoters 25 grosse Mengen von mRNA bereitgestellt werden, so hängt doch letztendlich das Ausmass der Produktion des gewünschten Genproduktes von der Effizienz der Translation der mRNA in Protein ab. Diese ist wiederum abhängig von der Stärke der Bindung der Ribosomen an die mRNA und von der Stabilität der 30 mRNA in der Wirtszelle. Ueber die Faktoren, die die Translations-Effizienz in eukaryotischen Zellen bestimmen, ist noch wenig bekannt. Ein Faktor beruht auf einer bevorzugten Nukleotidsequenz in unmittelbarer Nachbarschaft des AUG--Kodons> das die Translation einleitet [Kozak, Cell 283 35 (1986)]. Faktoren, welche die Stabilität der mRNA beein flussen, sind entscheidend für die Menge Protein die produ-

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- 3 - ziert werden kann.

In vielen Arbeiten auf dem Gebiet der DNA-Rekombina-tionstechnik wurden bis heute bakterielle Expressionssysteme 5 wie E. coli verwendet. Allerdings hat die Verwendung von bakteriellen Zellen in gewissen Fällen eine Anzahl Nachteile. Zum Beispiel häufen sich die meisten der in E. coli produzierten Proteine und Polypeptide im periplasmatischen Raum an. Um Genprodukte daraus zu gewinnen, müssen die 10 Zellen aufgebrochen werden und das gewünschte Produkt muss von den übrigen zellulären Bestandteilen von E. coli abgetrennt werden. Die dabei verwendeten Verfahren sind jedoch nicht leistungsfähig und führen zu einem ernsthaften Problem bei der Reinigung grösserer Mengen an Polypeptid. Ausserdem 15 sind Bakterien nicht fähig, die exprimierten Polypeptide zu glykosylieren. Glykosylierung ist aber oft nötig, um die Synthese vieler interessanter Genprodukte abzuschliessen. Ausserdem ist es möglich, dass Bakterien spezifische Disul-fidbrücken nicht bilden können, die für die richtige Kon-20 formation und die biologische Aktivität vieler eukaryoti-scher Proteine wesentlich sind.

Um diese Unzulänglichkeiten der bakteriellen Expressionssysteme zu überwinden, richtete sich die Aufmerksamkeit 25 des Fachmannes auf die Verwendung von Säugerzellen für die Expression von rekombinierten DNA Molekülen. Hefezellen oder Säugetierzellen können zwar die gewünschten Genprodukte in das Kulturmedium ausscheiden und die erforderlichen Glykosylierungsschritte ausführen, doch stellen sich der Ver-30 Wendung von Säugerzellen zur Klonierung und Expression von rekombinierten DNA Molekülen eine grosse Anzahl technischer Hindernisse entgegen, die es zu überwinden gilt. Zum Beispiel werden endogene Plasmide, die sich in Bakterien als so nützlich erwiesen haben, in Zellen von höheren Eukaryonten 35 nicht repliziert.

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Ein Weg der zur Ueberwindung dieser Hindernisse beschritten wurde, war die Verwendung von niederen Eukaryon-ten, wie z.B. der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die ähn-licht leicht wachsen gelassen und manipuliert werden können 5 wie E. coli. Hefe-Klonierungssysteme sind verfügbar, so wurde durch die Verwendung eines solchen Systems eine leistungsfähige Expression des Human-Interferon-Gens in Hefe erreicht [Hitzeman et al., Nature (London) 293: 717 (1981)]. Interferon-Gene enthalten allerdings keine Introns. Da 10 bekannt ist, dass Hefezellen mindestens ein heterologes Säugergen, das Introns enthält, nämlich das Kaninchen ß-Globingen, nicht richtig transkribieren, muss auf die Anwesenheit oder das Fehlen von Introns geachtet werden.

15 Bei einem anderen Vorgehen wurden fremde Gene durch direkte Aufnahme in das Genom von Säugerzellen eingeführt. Das wurde z.B. erreicht durch Präzipitation der klonierten Gene mit Calciumphosphat. Bei diesem Verfahren können etwa 1 bis 2% der Zellen veranlasst werden die DNA aufzunehmen. Bei 20 einer so geringen Aufnahme wird allerdings nur ein geringes Mass an Expression des gewünschten Genprodukts erreicht. Falls Säugerzellen, bei denen das Thymidinkinase- oder tk-Gen fehlt (sog. tk -Zellen) zugänglich sind, können bessere Resultate erreicht werden, bei Durchführung einer 25 Co-transformation mit dem tk-Gen gefolgt vom Wachstum unter selektiven Bedingungen, tk -Zellen können in HAT-Medium (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium) nicht wachsen. Sie können aber die verlorene enzymatische Aktivität wieder gewinnen, indem sie exogene DNA die das tk-Gen enthält (wie 30 z.B. virale DNA von Herpes Simplex) durch Copräzipitation mit Calciumphosphat aufnehmen. Wenn weitere DNA-Moleküle kovalent an die tk-DNA gebunden sind oder lediglich mit ihr vermischt sind, können diese ebenfalls durch die Zellen aufgenommen und des öfteren auch exprimiert werden. [Vgl.

35 Scancos et al., Gene 14:1 (1981)].

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In einem dritten Verfahren können virale Genome als Vektoren zur Einführung fremder Gene in Säugerzellen verwendet werden. Vektoren, die auf dem Genom von Simian Virus 40, dem Papillomvirus oder dem Adenovirus basieren, sind 5 beschrieben [vgl. den Uebersichtsartikel von P.W.J. Rigby, "Expression of Cloned Genes in Eukaryotic Cells Using Vector Systems Derived from Viral Replicons", in Genetic Engineering, Vol. 3., R. Williamson. Ed.. Academie Press. New York, pp. 83-141 (1982)]. Diese Vektorsysteme haben aber den 10 Nachteil, dass sie nur für eine beschränkte Anzahl Wirtszellen geeignet sind. Zudem führt die Replikation des Virus in diesen Systemen zum Tod der Wirtszelle. Durch die Verwendung von retroviralen DNA Kontrollelementen werden viele Nachteile der viralen Vektorsysteme aufgehoben. Gorman et 15 al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA T9:6777 (1982)] haben gezeigt, dass die LTR-Sequenz (long terminal repeat-Sequenz im Genom des Rous Sarkomvirus) ein starker Promoter ist und mittels DNA-Transfektion in eine Reihe von Zellen eingeführt werden kann, wie z.B. in CV-1 Affennierenzellen, Hühner-20 embryo-Fibroblasten, CHO(chinese hamster ovary)-Zellen. Heia-Zellen und in Maus NIH/3T3~Zellen.

Beweise für die Regulation der Genexpression durch 5'-und 31-nichtcodierende Sequenzen, d.h. Sequenzen unmittelbar 25 vor. respektive nach der codierenden Sequenz eines Gens wurden durch das Studium der Onkogene und der mRNAs höherer Eukaryonten erbracht. Die Auswirkungen der Eliminierung oder der Modifikation dieser Sequenzen auf die Genexpression in diesen Zellen wurde beobachtet. Z.B. studierte Treisman 30 [Cell 42::889 (1985)] die Anhäufung von c-fos RNA nach Serum--Stimulation von Maus-Fibroblasten in welche ein kloniertes menschliches c-fos-Gen (dem zellulären Homologen des

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Onkogens im FBJ Maus-Osteosarkomvirus, das als c-fos bezeichnet wird) transfiziert wurde. Ueblicherweise verur-35 sacht die Serumstimulation solcher Zellen einen starken aber vorübergehenden Anstieg der c-fos mRNA-Produktion. welche innerhalb von 10 bis 15 Minuten ein Maximum erreicht und 5 - 6 - danach rasch abnimmt. Wegen dem raschen Abbau der mRNA erreicht die mRNA Konzentration innerhalb von 1 bis 2 Stunden wieder das Niveau von vor der Stimulation.

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5 Wenn c-fos 5' flankierende Sequenzen in Abwesenheit von 3' flankierenden Sequenzen mit heterologen Genen verbunden werden, sind die resultierenden Gene immer noch durch Serumfaktoren induzierbar, doch die mRNA, die dabei produziert wird, kann bis 4 Stunden nach der Serumstimulation 10 noch nachgewiesen werden. Experimente mit Hybrid-Transkrip-tionseinheiten zeigen, dass nur Gene, welche das 3'-Ende des c-fos -Gens sowie die 31-nichtcodierenden Regionen enthalten, den typischen, raschen Abbau der mRNA nach der Stimulation zeigen. Demzufolge könnte es sein, dass die 3' 15 Sequenzen von c-fos eine sie enthaltende RNA destabilisieren. Die Entfernung oder Modifikation dieser Sequenzen hätte demzufolge einen positiven Effekt auf die Genexpression.

20 Weitere Anzeichen für eine regulierende Funktion der 3' nichtcodierenden Sequenz kommen von Simcox et al. [Mol.

Cell. Biol. 5.: 3397 (1985)] vom Studium des Hitzeschockproteinsystems von Drosophila melanogaster. Beim Wechseln der Temperatur beim Wachstum von Drosophila melanogaster von 25 Raumtemperatur auf 37°C werden eine Reihe von Hitzeschockproteinen, darunter das Hauptprotein hsp 70, produziert. Der Wechsel der Temperatur induziert eine erhöhte Produktion von mRNA. Nach dem Rückgang zur normalen Wachstumstemperatur wird die Transkription des hsp 70-Gens rasch unterdrückt und 30 die Menge der entsprechenden mRNA nimmt rasch ab, wodurch auch die Produktion des hsp 70 Proteins beendet wird. Simcox et al. fanden andererseits, dass die rasche Unterdrückung der hsp 70 Proteinsynthese nach der Erlösung vom Hitzeschock verzögert ist, wenn die 3' Sequenzen entfernt wurden, was 35 darauf hinweist, dass die 3' Sequenzen normalerweise dazu dienen die hsp 70 mRNA nach der Temperaturabsenkung zu destabilisieren. Anzeichen für eine mRNA regulierende - 7 -

Funktion gibt es auch bezüglich der 5' nichtcodierenden Sequenzen. Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5.: 3009 (1985)] zeigten, dass eine 5' nichtcodierende Sequenz von etwa 550 Nukleotiden (als Exon 1 bezeichnet) des humanen c-myc-Gens 5 (dem zellulären Homologen des Vogel-Myelozytomatosevirus--Onkogens) die Expression von Plasmiden die dieses Gen enthalten in COS-Zellen. d.h. in CV1 Affennierenzellen, welche mit einem Simian Virus 40 mit fehlender Replikations-ursprungssequenz transformiert worden sind, beeinflusst.

10 Transkripte von Plasmiden in denen die 5'-nichtcodierenden Sequenzen des c-myc-Gens entfernt worden waren, waren im Gleichgewichtzustand in höherer Menge vorhanden als Trans-kripte von Plasmiden die das intakte Gen enthielten, was darauf hinweist, dass die 5'-nichtcodierenden Sequenzen in 15 irgend einer Art und Weise die entsprechende mRNA destabilisieren.

In einer weiteren Studie zeigten Rabbitts et al. [EMBO

J. 4: 3727 (1985)], dass die Verkürzung des Exon 1 des c-myc 20 Gens eine Erhöhung der Stabilität der c-myc mRNA in COLO 320 Zellen verursacht. Gleicherweise haben Eick et al. [EMBO J. 4: 3717 (1985)] gezeigt, dass c-myc mRNAs in Burkitt Lymphomzellen viel stabiler sind, wenn das entsprechende c-myc-Gen eine Translokation in Exon I aufweist.

25

Alle obigen Feststellungen weisen darauf hin, dass 5'-und 3'-nichtcodierende Regionen einer Anzahl Gene auf irgendeine Art und Weise eine Instabilität der entsprechenden mRNAs, die von diesen Genen transkribiert werden, 30 hervorrufen. Deletionen oder andere Veränderungen in diesen nichtcodierenden Regionen verursachen in diesen Fällen erhöhte mRNA Stabilität und deshalb eine erhöhte Expression dieser Gene. Die Auswirkungen von Modifikationen und Deletionen auf diese nichtcodierenden Sequenzen kann jedoch 35 nicht mit Sicherheit vorausgesagt werden. Z.B. haben

Johansen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 7598 (1984)] die Länge der 5' nichtcodierenden Region, in einem ï « - 8 - rekombinanten Vektorsystem, in welchem Genkontrollelemente verbunden waren mit dem Escherichia coli Galactokinase (galK)-Gen, abgewandelt. Die Veränderung der Länge der nichtcodierenden Region hatte keine Auswirkung auf die galK 5 Expression. Gleicherweise haben Katz et al. [Mol. Cell.

Biol. 6.: 372 (1986)] sowohl Deletionen wie auch Substitutionen in die 5'-nichttranslatierte Leitsequenz der Vogel--retroviralen mRNA eingeführt. Allgemein verursachten diese Deletionen und Substitutionen eine beträchtliche Abnahme der 10 Expression des env-Gens. Diese Abnahme der Expression war aber nicht eine Folge der Verminderung der Anzahl mRNA Moleküle. Es scheint dagegen, dass die Veränderungen in den nichtcodierenden Regionen eine mangelhafte Translation verursachten, die wiederum zu einer allgemein verringerten 15 Expression führten.

Interleukin-2 (IL-2) ist ein lösliches Protein, welches fähig ist, die Lymphozytenreaktivität zu modulieren und die Langzeit-in-vitro-Kultur von Antigen-spezifischen T-Lympho-20 zyten zu unterstützen. In der Vergangenheit wurde IL-2 hauptsächlich aus Ueberständen von kultivierten, Mitogen--stimulierten Säugerzellen isoliert. Z.B. haben Morgan et al. [Science 193: 1007 (1976)] und Ruscetti et al. [J. Immunol. 119: 131 (1977)] IL-2 aus vereinigten Ueberständen 25 von normalen, Phytohämagglutinin (PHA)-stimulierten Lymphozyten gewonnen, während Gillis et al. [Nature 268: 154 (1977)] als Quelle für das Protein normale. Concanavalin A--stimulierte DBA/2 Mauszellen verwendeten. Kürzlich hat Stern [U.S. Patent No. 4.490.289] die Verwendung von indu-30 zierten bösartigen, humanen Zellen als Quelle für IL-2 beschrieben.

Anstrengungen wurden auch unternommen, IL-2 mittels Verwendung der Methode der DNA-Rekombination herzustellen.

35 Z.B. haben Taniguchi et al. [Nature 302: 305 (1983)] die Sequenzanalyse, die Klonierung und die Expression einer komplementären DNA (cDNA), welche für humanes IL-2 codiert 3 - 9 - und aus Boten-RNA der Jurkat Leukämie-Zellinie tiergestellt worden ist. beschrieben. Die Expression von IL-2 wurde durch Taniguchi et al. in kultivierten COS-Affenzeilen durchgeführt, obwohl die Autoren festhielten, dass Arbeiten bezüg-5 lieh der Expression von IL-2 unter Verwendung eines rekombi-nierten DNA Vektors in E. coli im Gange waren und dass es bald möglich sein werde, aus dem E. coli System IL-2 in grossen Mengen zu isolieren. IL-2 wird in der Zelle in Form eines Vorläuferpolypeptids mit 153 Aminosäuren syntheti-10 siert. Bei der Sekretion aus der Zelle wird eine 20 Aminosäuren lange Signalpeptidsequenz abgespalten. Das reife IL-2 wird von der Zelle in Form eines Polypeptids mit 133 Aminosäuren ausgeschieden. Für die Expression von reifem IL-2 in E. coli muss die für die Signalpeptidsequenz codierende 15 Untersequenz des für IL-2 codierenden Gens mit Methoden der DNA-Rekombination entfernt werden, da E. coli eukaryotische Signalpeptidsequenzen nicht abspalten kann.

Rosenberg et al. [Science 223: 1412 (1984)] haben eben-20 falls IL-2 in E. coli, unter Verwendung eines Gens aus der Jurkat Zellinie, exprimiert. Kürzlich haben Souza et al. [Europäische Patentanmeldung, Publ.-Nr. Al 136 489] die Klonierung und Expression von chemisch synthetisierten DNA Sequenzen mit strukturellen Genen, welche für Polypeptide 25 mit der Aminosäuresequenz und den Eigenschaften von IL-2 codieren, beschrieben. Souza et al. offenbarten auch die Verwendung von synthetischen Genen zur Herstellung von IL-2-Analogen, welche sich in der Aminosäuresequenz vom natürlichen IL-2 unterscheiden. In den Beispielen, die in 30 der Patentanmeldung von Souza et al. aufgeführt, werden ist der Wirtsorganismus E. coli.

Barr et al. [PCT-Anmeldung Nr. 85/02200] haben kürzlich die Klonierung und Expression eines chemisch synthetisierten 35 menschlichen IL-2 Gens in Hefe beschrieben.

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Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen die ein Gen, das für HIL-2 und eine Signalpeptidsequenz codiert, sowie eine 51-nichtcodierende Sequenz enthält, wobei die zum Gen gehörende 5'-nichtcodierende Sequenz ersetzt worden ist durch eine entsprechende heterologe 51-nichtcodierende Sequenz, z.B. solchen eines Ratten-Insulingens, vorzugsweise durch diejenigen des Ratten-Präproinsulin-II-Gens. Im Rahmen der Erfindung können zusätzlich die der 51-nichtcodierenden Sequenz benachbarten Nukleotide der Sequenz, die das Signalpeptid codiert, ersetzt werden durch entsprechende heterologe Nukleotide, d.h. durch Nukleotide die der oben erwähnten heterologen 51-nichtcodierenden Sequenz benachbart sind und die für eine Signalpeptidsequenz codieren. Falls Nukleotide die für einen Teil·der Signalpeptidsequenz codieren 15 ersetzt werden, muss darauf geachtet werden, dass der Leseraster des HIL-2-Gens aufrecht erhalten wird. Zudem betrifft die Erfindung rekombinierte Vektoren, die eine DNA-Sequenz, wie sie oben definiert ist, enthalten und Säugerzellen, die eine solche DNA Sequenz oder einen sie enthaltenden rekombi- 20 nierten Vektor enthalten. Die Erfindung betrifft im weiteren Verfahren für die Herstellung von HIL-2, HIL-2 per se, das durch dieses Verfahren erhalten werden kann und die Verwendung des HIL-2 für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten. Im weiteren betrifft die Erfindung pharmazeutische 25

Zusammensetzungen, die ein solches HIL-2 enthalten. Das so erhaltene HIL-2 ist glykosyliert und hat Disulfidbrücken wie das natürliche Produkt.

Eine überraschend hohe Expression des HIL-2 wurde durch 30 die Verwendung von neuen Klonierungs- und Expressionsvektoren erhalten, in welchen natürliche 5'-nichtcodierende Sequenzen und die ersten vier Nukleotide ATG T des HIL-2 Gens die einen Teil der Signalpeptidsequenz codieren, ersetzt worden sind, durch entsprechende heterologe Se-3 5 quenzen eines Ratten-Insulingens, nämlich durch die Nukleotide ATG GCC CTG TGG ATC G der für einen Teil des Signalpeptids codierenden Sequenz des Ratten-Präproinsulin-II- f - 11 - -Gens. Die resultierenden Veränderungen am N-Terminus des HIL-2 Signalpeptids haben keinen Einfluss auf das von den Zellen produzierte und ausgeschiedene reife HIL-2 Polypeptid. da das Signalpeptid während des Reifungsprozesses 5 abgespalten wird.

Die vorliegende Erfindung wird besser verständlich unter Zuhilfenahme der folgenden, nicht masstabgetreuen Figuren, worin 10

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Plasmids pBC12MI, dem Ausgangsvektor für die Konstruktion des IL-2 Expressionsvektors, ist.

15 Fig. 2 zeigt den Aufbau der neuen Signalpeptidsequenz im Plasmid pBC12/RSV/lL-2 und die Insulin- und IL-2--Sequenzen, die zur Konstruktion des Plasmids verwendet wurden. Spezifische Restriktionsendo-nuklease- und Ligierungsstellen sind unterstrichen.

20

Fig. zeigt eine schematische Darstellung des erhaltenen IL-2 Expressionsvektors pBC12/RSV/IL-2/dhfr; und

Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz, die durch stellenspezi- 25 fische Mutagenese aus dem Plasmid pBC40 entfernt wurde. Die unterstrichene Sequenz bezeichnet die 24 Nukleotide lange Sequenz, die verwendet wurde, um die Deletion einzuführen und mit der eine neue Hindlll-Endonukleasestelle generiert worden ist.

30

Das erfinderische Verfahren umfasst die folgenden Schritte in logischer Reihenfolge: (1) Herstellung einer DNA-Sequenz, die für HIL-2 und eine Signalpeptidsequenz codiert* (2) Ersatz der 51-nichtcodierenden Sequenzen und 35 gegebenenfalls der benachbarten Nukleotide der für die Signalpeptidsequenz codierenden Untersequenz durch entsprechende Sequenzen, vorzugsweise durch diejenigen des 9 - 12 -

Ratten-Präproinsulin-II-Gens unter Beibehaltung des richtigen Leserasters der für HIL-2 codierenden Region, (3) Transfer des rekombinierten Vektors mit der neuen DNA-Sequenz in eine geeignete Säugetierwirtszelle, (4) Vervielfachung des 5 neuen HIL-2 Gens und Selektion der veränderten Wirtszelle, und (6) Identifizierung und Reinigung des produzierten HIL-2.

Mit "Human-Interleukin-2" oder "HIL-2" wird in der vorliegenden Erfindung ein glykosyliertes Protein bezeich-10 net, das durch eine Säugetierzelle produziert wird, die mit einer DNA-Sequenz, wie sie oben definiert ist oder einer Modifikation davon, transformiert oder transfiziert worden ist. Das modifizierte HIL-2-Gen codiert für ein Protein das: (a) eine Aminosäuresequenz welche zumindest im wesentlichen 15 identisch ist zur Aminosäuresequenz des nativen HIL-2 und (b) eine dem nativen HIL-2 eigene biologische Aktivität aufweist. Wesentliche Identität der Aminosäuresequenz bedeutet, dass die Sequenzen identisch sind oder eine oder mehrere Aminosäureänderungen (Deletionen, Additionen oder 20 Substitutionen) aufweisen können, solange sie keine gegenteilige funktionelle Ungleichheit zwischen dem synthetischen und dem nativen HIL-2 hervorrufen.

Beispiele für solche Proteine sind die HIL-2 Moleküle, 25 welche in den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 82307036.2 und Nr. 83101035.0 sowie in U.S. Patenten Nr. 4,518,584 und Nr. 4.569,790 beschrieben sind. Diese HIL-2 Polypeptide wurden in bakteriellen Systemen in reifer Form hergestellt.

30 Eine DNA-Sequenz, die für HIL-2 und eine Signalpeptid sequenz codiert, kann auf bekannte Art und Weise hergestellt werden. Z.B. kann eine menschliche Zellinie, die fähig ist, HIL-2 zu produzieren stimuliert werden. HIL-2 mRNA zu synthetisieren. Diese mRNA kann als Vorlage verwendet 35 werden, um komplementäre DNA (cDNA) herzustellen. Rosenberg et al. [Science 223: 1412 (1984)] verwendeten eine menschliche leukämische T-Zellinie und normale Lymphozyten aus , « i - 13 - peripheren Blutgefässen, um solche cDNA herzustellen. Taniguchi et al. [Nature 302: 305 (1983)] verwendeten eine menschliche leukämische T-Zellinie zu diesem Zweck.

5 Andererseits kann, da Taniguchi et al. die Nukleotid sequenz des HlL-2-Gens offenbart haben, die für HIL-2 und eine Signalpeptidsequenz codierende DNA-Sequenz unter Verwendung der Phosphotriester- oder einer anderen Methode, vorzugsweise in einem Festphasensystem, auch chemisch 10 synthetisiert werden. Eine solche Synthese ist von Souza et al. [Europäische Patent Anmeldung Al 136 489] beschrieben worden. Durch die Synthese von relativ kurzen Oligonukleo-tiden die dann miteinander verbunden werden, haben auch Barr et al. [PCT-Anmeldung No. WO 85/02200] ein HIL-2-Gen herge-15 stellt. In einer weiteren Methode kann genomische DNA von einer menschlichen Zellinie, die IL-2 herstellen kann, isoliert werden. Das IL-2-Gen könnte mit üblichen Hybridisierungsmethoden unter Verwendung einer markierten DNA-Sonde die auf der publizierten Sequenz des IL-2 Gens basiert, 20 identifiziert werden.

In einem anschaulichen erfindungsgemässen Beispiel wurde als Quelle für die DNA-Sequenz, die für Human-Interleukin-2 und eine Signalpeptidsequenz codiert, das Plasmid pIL-2-2b 25 verwendet. Dieses Plasmid enthält eine cDNA Kopie der gesamten 459 Basenpaare langen Region des HIL-2-Gens. das flankiert ist von 31 Basenpaaren 51-nichttranslatierter Sequenzen und 309 Basenpaaren 3'-nichttranslatierter Sequenzen. Die Klonierung dieser IL-2 cDNA Kopie in das 30 Plasmid pIL-2-2b ist durch Smith et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82.: 8404 (1985)] beschrieben worden. Durch die Art und Weise wie das IL-2 Gen kloniert worden ist, wird die cDNA von homopolymeren G-C-Sequenzen, gefolgt von BamHl Restriktionsenzymschnittstellen, flankiert.

35

Der Ersatz der 5'-nichtcodierenden Sequenzen und gegebenenfalls der benachbarten Nukleotide der Untersequenz, die » l i - 14 - für die Signalpeptidsequenz des HIL-2 codiert und die Einführung des HIL-2-Gens in einen geeigneten Expressionsvektor können in einfacher Weise ausgeführt werden, wenn die erforderlichen DNA Sequenzen und Klonierungsvektoren mit dem 5 oder den gleichen Restriktionsenzym(en) geschnitten worden sind, da dadurch Fragmente mit komplementären DNA-Enden entstehen, die leicht miteinander verknüpft werden können. Falls das nicht durchgeführt werden kann, kann es nötig sein, die geschnittenen Enden zu modifizieren, z.B. durch 10 Abbau von einzelsträngiger DNA. um stumpfe Enden ("blunt ends") herzustellen. Das gleiche Resultat wird durch Auffüllen der einzelsträngigen Enden mit einer DNA-Polymerase. wie z.B. dem Klenow Fragment der DNA-Polymerase I, erreicht. Die stumpfen Enden können dann enzymatisch verknüpft werden 15 z.B. durch Verwendung der T4 DNA Ligase.

Für die Einfügung des HIL-2-Gens in einen Vektor kann jede beliebige Verknüpfungsstelle durch Anknüpfung von Nukleotidsequenzen (sog. Linker) an die DNA-Enden erzeugt 20 werden. Solche Linker können spezifische Oligonukleotid-sequenzen enthalten, die für Restriktionsendonuklease--Erkennungssequenzen codieren. Der geschnittene Vektor und die modifizierte, für HIL-2 codierende DNA-Sequenz kann auch modifiziert werden, indem ein homopolymerer Schwanz ange-25 hängt wird, wie es von Morrow [Methods in Enzymology 68.: 3 (1979)] beschrieben ist.

Bei der Ausführung der Erfindung müssen alle 5'-nicht-codierenden Sequenzen des HIL-2-Gens durch die entsprechen-30 den Sequenzen, z.B. denjenigen des Ratten-Präproinsulin-II--Gens, ersetzt werden. Es ist auch möglich, ein paar Nukleotide der benachbarten codierenden Sequenzen des IL-2-Gens zu entfernen, da diese Sequenzen für das Signalpeptid codieren, welches letztlich während der Reifung in der Wirtszelle, in 35 welche das HIL-2-Gen eingeführt und exprimiert wird, abgeschnitten wird. Klarerweise könnte die Entfernung einer zu grossen Region der codierenden Sequenz zur Zerstörung der » . ' « - 15 -

Signalpeptidfunktion führen und so die richtige Sekretion des Produktes HIL-2 aus der Zelle verhindern.

In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde 5 ein eukaryotischer Expressionsvektor mit der Bezeichnung PBC12MI zugleich als Expressionsvektor und als Quelle der Ratten-Präproinsulin-II-Gensequenzen verwendet. Ersatz der 5'-nichtcodierenden Regionen erfolgte, indem ein HIL-2-Gen. aus welchem die natürliche 5'-nichtcodierende Region und die 10 ersten vier Nukleotide der codierenden Sequenz entfernt worden waren, in den Vektor pBC12MI in direkter Nachbarschaft zu entsprechenden Sequenzen des Ratten-Preproinsulin--II-Gens eingeführt wurde.

15 Der Vektor pBC12MI ist mit dem eukaryotischen Expres sionsvektor pBC12BI vergleichbar, welcher ausführlich durch Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5.: 3009 (1985)] beschrieben worden ist. Dieser Vektor basiert auf dem von pBR322 hergeleiteten Plasmidvektor pXf3 [Hanahan. J. Mol. Biol. 166 : 20 557 (1983)], der zusätzlich eine SV40 ori Region, den leistungsfähigen LTR-Promoter des Rous Sarkomvirus [Cullen et al.. Nature 307: 241 (1984)] sowie eine genomische Kopie des Ratten-Insulin-II-Gens [Lomedico et al.. Cell 18.: 545 (1979)] enthält. Der Vektor pBC12MI der in den nachfolgend 25 beschriebenen Konstruktionen verwendet worden ist, ist identisch mit dem Vektor pBC12Bl mit der Ausnahme, dass das LTR-Fragment, das darin enthalten ist, um zusätzlich 70 Basenpaare in 3'-Richtung (vgl. Figur 1) verlängert ist. Dieser Unterschied hat keine Auswirkung auf die Expression 30 der vom Vektor codierten Gene.

Es liegt auf der Hand, dass auch zuerst ein IL-2 Gen, in welchem die 5'-nichtcodierenden Regionen und die ersten paar Nukleotide der für die Signalpeptidsequenz codierenden 35 Sequenz schon durch entsprechende Sequenzen des Ratteninsulingens ersetzt worden sind, hergestellt werden kann entweder durch DNA-Rekombination oder durch chemische À

A

- 16 -

Synthese und dieses Gen in einem zweiten Schritt in einen geeigneten Vektor eingefügt werden kann.

Beispiele für Expressionsvektoren, die für die Verwen-5 düng in Säugerzellen geeignet sind und welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind pBC12MI, PBC12BI, pSV2dhfr, p91023(B). pcDVl und pRSVcat. Diese Vektoren können durch Transformation, Transduktion oder Transfektion in geeignete Säuger-Wirtszellen eingeführt 10 werden.

Viele der Klonierungsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, enthalten Gene (selek-tionierbare Gene), welche für einen oder mehrere Markie-15 rungsaktivitäten codieren, so z.B. für Ampicillinresistenz in PBC12BI und pBC12MI oder für Dihydrofolatreduktase in pSV2dhfr. Diese Markierungsaktivitäten können zur Selektion der gewünschten Transformanten verwendet werden. Die Selektion von Wirtszellen, die solche Vektoren aufgenommen haben, 20 wird durch das Vorhandensein der selektionierbaren Gene stark vereinfacht, da in solchen Fällen die Zellen unter selektiven Bedingungen wachsen gelassen werden können, unter denen nur die Transformanten, d.h. die Zellen, die das Plasmid aufgenommen haben und die Aktivität enthalten, sich 25 vermehren können.

In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung lieferte das HIL-2-produzierende Plasmid den Ovarzellen des chinesischen Hamsters, denen die Dihydrofolatreduktase-30 -Aktivität fehlt (sog. CHO-dhfr -Zellen), zusätzlich

Dihydrofolatreduktase-Aktivität. Transformanten können auf einfache Art und Weise, selektioniert werden indem sie in einem Medium ohne Hypoxanthin und Thymidin wachsen gelassen werden.

35

Die Anwesenheit eines selektionierbaren Gens auf einem Plasmid kann noch einen weiteren Vorteil bieten. Unter * - 17 - restriktiven Wachstumsbedingungen wachsen Zellen, die mit einem solchen Plasmid transformiert worden sind, und die viele Kopien des selektionierbaren Gens enthalten und es auch exprimieren, besser als solche mit nur einer oder ein 5 paar Kopien. Solche Bedingungen begünstigen deshalb Zellen, welche eine durch Genamplifikation erhöhte Anzahl Kopien des selektionierbaren Gens enthalten und exprimieren. Wenn ein Gen. das exprimiert werden soll, in der Nähe des selektierbaren Gens liegt, kann auch dieses Gen amplifiziert werden. 10 was wiederum zu erhöhter Expression dieses Gens führen kann. In der vorliegenden Erfindung verursacht die Kultivierung der mit dem dhfr-Gen transformierten Zellen in Anwesenheit zunehmender Mengen an Amethopterin, einem de novo Purinsynthese-Inhibitor, zu einer Genamplifikation. Das gleich-15 zeitig in die Zelle eingeführte HIL-2-Gen wird ebenfalls amplifiziert. Dieser Vorgang wird Co-Amplifikation genannt. Daraus resultiert die Produktion von zugleich erhöhten Mengen an Dihydrofolatreduktase und HIL-2.

20 Jedes vergleichbare, selektionierbare Gensystem kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wenn auch nicht alle Systeme eine Genamplifikation verursachen. Ein weiteres System das verwendet werden kann, das jedoch keine Amplifikation verursacht» basiert z.B. auf dem E. coli gpt-Gen, das 25 für die Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase codiert. Mulligan et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 7.8: 2072 (1981)] selektionierten Affen- und Mauszellen, die mit Plasmiden, die das gpt-Gen enthalten, transfiziert worden waren in Gegenwart von Mycophenolsäure (einem Hemmer der de 30 novo Guanylsäuresynthese). Adenin und Xanthin. Die Selektion wird in diesem System zusätzlich verstärkt durch die Zugabe von Aminopterin (einem Amethopterinanalog) zum Selektionsmedium.

35 Als weiteres Selektions-System kommt ein Gen, das für eine bakterielle Aminoglykosid-31-Phosphotransferase codiert, in Frage. Dieses Gen bzw. das darin codierte Poly- “ * - 18 - peptid macht Bakterien gegenüber Neomycin und Kanamycin resistent. Colbère-Garapin et al. [J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)] haben Säugerzellen, die mit Plasmiden, die das Phosphotransferasegen unter der Kontrolle des Herpes Simplex 5 Virus Thymidinkinase (HSV tk)-Genpromoters enthalten, trans-fiziert worden waren, durch Wachsen lassen der Zellen in Gegenwart von G-418» einem 2-Deoxystreptaminantibiotika das die eukaryotische Proteinsynthese hemmt, selektioniert. Berg [Science 213: 296 (1981)] erzielte ähnliche Resultate mit 10 einer Serie von psV-Vektoren, in denen das Phosphotrans-ferasegen unter der Kontrolle eines SV40-Promoters war.

Das HIL-2, das durch die produzierenden Zellen sezer-niert wird, kann durch bekannte Methoden im Kulturmedium 15 identifiziert werden. Z.B. kann ein biologisches Testsystem verwendet werden, das auf der Verwendung von Zellen, deren Wachstum HIL-2 abhängig ist, basiert. Ausserdem kann ein Radioimmuntestsystem verwendet werden oder ein ELISA-Test unter Verwendung von Antikörpern gegen HIL-2 durchgeführt 20 werden. Auch könnte Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von einem Westernblot [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76: 4350 (1979)] oder einer ähnlichen Analysemethode verwendet werden. Andererseits kann auch eine HPLC-Analyse, wie sie von Stern [U.S. Patent No. 4.490.289] beschrieben 25 ist, durchgeführt werden.

Das erfindungsgemässe HIL-2 kann durch Präzipitation mit Salzen wie z.B. Natrium- oder Ammoniumsulfat, durch Ultrazentrifugation oder durch die Verwendung anderer allgemein 30 bekannter Methoden konzentriert werden. Eine weitere Reinigung kann durch übliche Proteinreinigungsmethoden erfolgen, einschliesslich - aber nicht beschränkt auf - Gelfiltration. Ionenaustauschchromatographie, präparative Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Fraktionie-35 rung in organischen Lösungsmitteln bei tiefen Temperaturen. HPLC oder Gegenstromverteilung. Vorzugsweise wird die von . - t - 19 -

Stern (supra) beschriebene Methode verwendet.

Das gemäss vorliegender Erfindung gereinigte HIL-2 kann in gleicher Weise wie die anderen bekannten Substanzen mit 5 immunmodulierender Aktivität zur Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten verwendet werden, z.B. als Mittel zur

Behandlung von immunsuppressiven Zuständen. Es kann in Form pharmazeutischer Präparate oral, durch Injektion oder lokal verabreicht werden. Dosis und Dosierfrequenz können ent- 10 sprechend der Erfahrung bei der klinischen Applikation von bekannten immunmodulierenden Substanzen, üblicherweise 6 .

1-200 x 10 Einheiten täglich, festgesetzt werden. Die aus dieser Erfindung resultierenden Arzneimittel enthalten besagtes HIL-2 zusammen mit physiologisch verträglichem 15 Trägermaterial. Alle üblichen Trägermaterialien können verwendet werden. Das Trägermaterial kann ein inertes, organisches oder anorganisches Material sein, welches sich zur enteralen, perkutanen oder parenteralen Darreichung eignet. Als Träger eignen sich Wasser, Gelatine, Gummi 20 arabicum, Lactose» Maisstärke. Stearinsäure, Talk, vegetabile Oele, Polyalkylenglykole, insbesondere Polyäthylenglykole, natürliche Vaseline und dergleichen. Des weiteren können die pharmazeutischen Präparate weitere pharmazeutisch aktive Wirkstoffe enthalten. Zusätzliche Additive wie Aroma-25 tisierungsmittel, Ueberzugsmittel, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel, Puffer und dergleichen können mittels üblicher galenischer Verfahren zugefügt werden.

Die pharmazeutischen Präparate können in jeder geeigne-30 ten Darreichungsform hergestellt werden, d.h. a) in fester Form, z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, Pudern, Granulaten und dergleichen zur oralen Verabreichung; b) in flüssiger Form. z.B. in Form von Lösungen, Sirups, Suspensionen, Elixieren und dergleichen zur oralen Verabreichung; 35 c) als Präparate zur parenteralen Verabreichung, z.B. als sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen; und d) als Präparate zur lokalen Anwendung in Form von Lösungen. Sus- - 20 -

Pensionen, Salben, Crèmes. Gelées, mikronisierten Pudern, Aerosolen und dergleichen. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert werden und/oder können Hilfsmittel wie z.B. Ueberzugsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel, 5 Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes und/oder Puffer enthalten.

Als parenterale Verabreichungsformen kommen Infusionsoder Injektionslösungen, die intravenös oder intramuskulär 10 injiziert werden können, in Frage.

Beispiel

Das folgende Beispiel soll in nicht-einschränkender Art 15 und Weise die Methoden erläutern, mit welchen die Klonierung und die Expression des HIL-2 in Säugerzellen durchgeführt wurde. Das Beispiel liefert den Beweis für die beträchtliche Erhöhung der Genexpression durch die Substitution der normalen 51-nichtcodierenden Region des HIL-2-Gens durch 20 diejenigen des Ratten-Insulingens.

Generelle Methoden zur Herstellung von rekombinanten Vektoren

Vorbereitung der DNA 25

Die Isolierung von Plasraid-DNA aus gesättigten Ueber-nachtkulturen wurden in kleinem Massstab gemäss der Methode von Birnboim et al. [Nucleic Acids Res. 7: 1513 (1979)] durchgeführt. Die Methode erlaubt die Isolierung geringer 30 Mengen von DNA aus bakteriellen Kulturen für analytische

Zwecke. Falls nicht anders angegeben, wurden grössere Mengen Plasmid-DNA, wie von Clewell et al. [J. Bacteriol. 110: 1135 (1972)] beschrieben, hergestellt.· Spezifische Restriktionsenzymfragmente die durch schneiden der Plasmid-DNA erhalten 35 wurden, wurden mittels präparativer Gelelektrophorese in l%iger Agarose mit niedriger Schmelztemperatur (Seaplaque. FMC Inc., Rockland, ME) isoliert. Die DNA wurde zuerst auf . i * - 21 - einem 9 x 5.5 cm Gel (50 mA, 1 h), in Tris-Acetat-Puffer [Maniatis et al., Moleculac Cloning: A Laboratory Manual. 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 454] aufgetrennt und nachher durch Färbung mit 1 ug/ml Ethidiumbromid sichtbar 5 gemacht. Gelstücke die das gewünschte DNA-Fragment enthalten wurden ausgeschnitten, bei 65°C während 10 Minuten geschmolzen und dann mit 5 ml 20mM Tris/HCl (pH 7,4). 0,2M NaCl, lmM EDTA verdünnt. Die DNA wurde anschliessend unter Verwendung einer Elutip-D Säule (Schleicher und Schnell Inc., Keen, NH) 10 gemäss den Anleitungen des Herstellers konzentriert und in Gegenwart von 10 ug Hefe tRNA (Bethesda Research Laboratories. Bethesda. MD) bei -20°C in Aethanol gefällt.

Enzymatische Reaktionen 15

Die Restriktionsenzyme, die DNA-Polymerase I (Klenow--Fragment) und die T4 DNA Ligase waren Produkte von New England Biolabs, MA. Die vom Hersteller empfohlenen Methoden und Bedingungen für die Verwendung dieser Enzyme wurden 20 befolgt. Bei Restriktionsenzymen ist eine Aktivitätseinheit definiert als diejenige Menge Enzym die nötig ist 1,0 ug DNA in 60 Minuten in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 0,05 ml bei 37°C vollständig zu verdauen. Für alle Enzyme wurde der gleiche Puffer (im nachfolgenden Restriktions-25 enzympuffer bezeichnet), bestehend aus lOOmM NaCl, lOmM Tris/HCl (pH 7,5), 5mM MgCl . ImM 2~Mercaptoäthanol

A

verwendet.

Die T4 DNA Ligation wurde während 16 Stunden bei 4°C in 30 Ligationspuffer enthaltend 60mM Tris/HCl (pH 7,5), lOmM MgCl , lOmM Dithiothreitol und O.lroM ATP durchgeführt.

Ct

Eine Einheit T4 DNA Ligaseaktivität ist definiert als die Menge die benötigt wird, um 50% der HindiII-Fragmente von Lambda-DNA innerhalb von 30 Minuten bei 16°C in 20 μΐ 35 Inkubationsmischung bei einer 5' DNA-Enden-Konzentration von 0.12 μΜ (300 ug/ml) zu ligieren.

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Die Herstellung von stumpfen Enden bei einzelsträngigen DNA-Enden, unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA Polymerase I, wurde in Restriktionsenzympuffer durchgeführt, der zusätzlich ImM dGTP, dATP, dCTP und dTTP enthält. Eine 5 Aktivitätseinheit ist definiert als diejenige Menge Enzym, welche 10 nMol Desoxyribonukleotide innerhalb von 30 Minuten bei 37°C in säureunlösliche Form überführt.

Kulturmedien 10

Iscove's Modifikation des Eagle's Medium (IMEM) [Iscove et al., J. exp. Med. 147: 923 (1978)] wurde von Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y. bezogen.

15 Luria Broth (LB) enthält 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g

Bacto-Trypton und 10 g NaCl per Liter und wurde auf pH 7,5 eingestellt. Das Antibiotikum Ampicillin wurde, da wo es angegeben ist, in einer Endkonzentration von 50 μς/πιΐ zugefügt.

20

Transformation und Transfektion

Escherichia coli wurde gemäss der Methode von Peacock et al. [Biochim. Biophys. Acta 655.: 243 (1981)] im wesentlichen 25 wie folgt transformiert. Die Zellen wurden aus LB-Medium gewonnen und gemäss der Methode von Norgard et al. [J. Biol.

Chem. 255: 7665 (1980)] für die Transformation vorbereitet, wobei jedoch der CaCl^-Puffer modifiziert wurde und bei einem pH von 5,6 70mM MnCl , 40mM NaOAc sowie 30mM CaCl 2 2 30 enthielt.

Eine 100 μΐ Probe der Zellen im CaCl -Puffer wurde 2 mit 50 μΐ Plasmidlösung, die zwischen 50 und 1000 ng DNA enthielt, vermischt. Die Mischung wurde 1 Stunde in Eis 35 inkubiert und anschliessend während 2 Minuten auf 37°C erhitzt. Die Zellen wurden bei 4°C auf Agarplatten mit Ampicillin platiert und anschliessend bei 37°C inkubiert um î - 23 -

Transformanten zu selektionieren.

CHO-Zellen (d.h. Ovarzellen des chinesischen Hamsters) wurden gemäss der Methode von Graham et al. [Virology 52.: 5 456 (1973)] wie folgt transfiziert. Ein halber Mililiter einer Mischung enthaltend 8 g/1 NaCl, 0,37 g/1 KCl, 0.125 g/1 Na HPO »2H Ο, 1 g/1 Dextrose. 3 g/1 Tris ώ T « und 125mM CaCl mit 10 ug Gesamtmenge DNA wurden zu 5 ^ .

5 x 10 Zellen, m einer 6 cm Kulturschale enthaltend 4 ml 10 IMEM ergänzt mit O.lmM Hypoxanthin und O.OImM Thymidin, (IMEM-HT-Medium). gefügt. Die Gesamtmenge DNA in der Mischung setzte sich zusammen aus 5 ug hochmolekularer Kalbsthymus-Träger-DNA und 5 ug pBC12/RSV/IL-2/dhfr DNA, welche mit Pvul linearisiert worden war. Die Kultur wurde 15 über Nacht bei 37°C in einem Inkubator bei befeuchteter. 5%iger C02~Atmosphäre inkubiert. Am andern Morgen wurde das Medium abgesaugt und durch 5 ml frisches IMEM-HT Medium ersetzt. Nach einer weiteren eintägigen Inkubation der Zellen, wurden die Zellen mittels Trpysin-EDTA-Lösung 20 (Gibco) von der Kulturschale gelöst und in 20 ml IMEM

enthaltend 10% dialysiertes fötales Kälberserum (FCS) auf zwei 10 cm Kulturschalen verteilt. Transfizierte Kolonien wurden mittels eines KlonierZylinders nach einer weiteren, 10-tägigen Inkubation bei 37°C isoliert.

25 COS Zellen wurden unter Verwendung von Methoden wie sie von Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)] beschrieben sind transfiziert. 10 cm Kulturschalen wurden 6 . mit 3 x 10 COS Zellen m 10 ml IMEM mit 10% FCS und 30 50 μg/ml Gentamycin angesetzt und über Nacht bei 37°C, in einem befeuchteten, mit 5% CO belüfteten Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit auf 37°C erwärmter

Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) und anschliessend noch mit 2 ml 37°c-warmem PBS enthaltend 500 ug/ml DEAE-Dextran 35 (Pharmacia) gewaschen. Die zu transfizierende DNA wurde dann zu den Zellen gefügt. Die COS-Zellen wurden dann inkubiert wobei die Kulturschalen während 30 Minuten in 5-minütigen . * - 24 -

Intervallen leicht bewegt wurden. Nach dieser Inkubation wurden 20 ml IMEM mit 10% FCS, 50 ug/ml Gentamycin und 80 μΜ Chloroquin zu jeder Schale zugefügt. Nach weiterer 2 1/2-stündiger Inkubation, wurde das Medium durch frisches 5 IMEM-Medium mit 10% FCS und 50 ug/ml Gentamycin ersetzt.

Die Inkubation wurde während 72 Stunden bei 37°C weitergeführt und die Zellen und Medien wurden wie folgt analysiert.

Zellkulturen 10

Zwei Escherichia coli Stämme wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet. E. coli Stamm GM119 ist von Marinus et al. [J. Bacteriol. 114: 1143 (1973)] beschrieben worden. Der Stamm wurde am 26. November 1985 bei der American Type 15 Culture Collection (ATCC) unter der ATCC Nr. 53339 hinterlegt. Der Stamm MC 1061 ist von Casadaban beschrieben [J. Mol. Biol. 138: 179 (1980)] und wurde ebenfalls am 26. November 1985 bei ATCC hinterlegt und zwar unter der ATCC Nr. 53338.

20

Drei Säugerzeilinien wurden verwendet. Eine Zellinie war eine Ovarzellinie des chinesischen Hamsters, der die Dihy-drofolatreduktase fehlt, die sog. CHO/dhfr Zellinie. Die Zellinie wurde ursprünglich von Urlaub et al. [Proc. Natl.

25 Acad. Sei. U.S.A. 77: 4216 (1980)] isoliert. Kulturen dieser Zellinie wurden am 7. Mai 1986 unter der ATCC Nr. CRL 9096 bei ATCC hinterlegt. Eine Nierenzellinie von grünen Meerkatzen. welche mit einem viralen Genom von SV40. in dem der Replikationsurprung fehlte (sog. origin Mutante), trans-30 fiziert worden war. die sog. COS-Zellinie, wurde von Gluzman [Cell 23.: 175 (1981)] beschrieben und ist unter der ATCC Nr. CRL 1651 frei verfügbar. Eine IL-2 abhängige Mauszellinie die CTLL-Linie wurde von Robb [Methods in Enzymology 116 : 493 (1985)] beschrieben und ist bei ATCC unter der Nr.

35 TIB 214 frei verfügbar.

. i * - 25 -

Stellenspezifische Mutagenese

Die Startersequenz geleitete, stellenspezifische Mutagenese wurde gemäss den Methoden, wie sie von Morinaga et 5 al. [Bio/Technology 2: 636 (1984)] beschrieben sind, durchgeführt. Die syntethischen Oligonukleotide. die zur Ausführung der Mutagenese verwendet wurden, wurden mittels der Phosphoramidit-Festphasen-Methode von Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)] hergestellt.

10

Kolonie-Hybridisierung

Die Kolonie-Hybridisierung wurde unter Verwendung einer von Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 15 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 312-315] beschriebenen Methode durchgeführt. Das gleiche Oligonukleo- tid welches für die Startersequenz geleitete Mutagenese verwendet wurde, wurde, nach der Markierung des 5' Endes 32 mittels γ- P-ATP unter Verwendung der Polynukleotid-20 kinase gemäss dem Verfahren von Maniatis et al. [supra,

Seite 396], auch als Probe für die Hybridisierung verwendet. Längere DNA-Proben die zur Lokalisierung der HIL-2-Gene und der dhfr-Gene verwendet wurden, wurden unter Verwendung eines Einschnitttranslationskits (Nick-Translation-Kit) 25 gemäss den Anweisungen des Herstellers (Amersham) markiert.

Konstruktion des IL-2 Expressionsvektors pBC12/RSV/IL-2/dhfr

Die Herstellung des endgültigen Expressionsvektors der 30 vorliegenden Erfindung erfolgte über mehrere Stufen in folgender Reihenfolge (1) Vorbereitung des Vektors in den ein modifiziertes HIL-2-Gen eingebaut werden kann, (2) Modifizierung des HIL-2-Gens durch Wegschneiden des grössten Teils der 3’-nichtcodierenden Region, der ganzen 5'-nicht-35 codierenden Sequenzen einschliesslich der ersten vier Nukleotide der für die Signalpeptidsequenz codierenden Sequenz, und (3) Einbau des modifizierten HIL-2-Gens in den ♦ * - 26 - vorbereiteten Vektor.

Vorbereitung des Klonierungsvektors 5 Ein μς pBC12MI Plasmid-DNA (vgl. Fig.l) wurde während 1 Stunde bei 37°C mit 20 Einheiten BamHl in 100 μΐ Restriktionsenzympuffer behandelt. Eine Probe von E. coli MC1061 enthaltend das Plasmid pBC12MI wurde am 7. Mai 1986 bei ATCC unter der ATCC Nr. 67109 hinterlegt. Das mit BamHl 10 verdaute Plasmid wurde während 2 Stunden bei 15°C mit 4

Einheiten des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I behandelt und die Reaktion durch 5-minütiges Erhitzen auf 65°C gestoppt. Zwei μΐ der Mischung wurden im Verhältnis 1:10 mit Ligasepuffer verdünnt. Die Mischung wurde auf Eis 15 gekühlt. Eine Einheit T4 DNA Ligase wurde zugefügt und die

Reaktionsmischung wurde während 16 Stunden bei 4°C inkubiert.

Die Ligationsreaktionsmischung wurde direkt zur Transformation des E. coli Stammes GM119 verwendet. Die Trans-20 formanten wurden in LB-Agar mit Ampicillin selektioniert.

Die DNA von Ampicillin-resistenten Kolonien wurde mittels Restriktionsenzymanalyse untersucht. Die isolierte Plasmid--DNA wurde zuerst mit BamHl oder Clal geschnitten und die entstandenen Fragmente wurden auf einem l%igen Agarosegel 25 aufgetrennt und mittels 10 μg/ml Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Ein Plasmid, das eine BamHI-Stelle verloren hat und an seiner Stelle eine Clal-Stelle erworben hat, wurde auf diese Weise identifiziert und als Plasmid pBC12CI bezeichnet.

30 Das Plasmid pBC12CI wurde dann in grösseren Mengen, unter Verwendung der Detergenz-Lyse-Methode von Clewell et al. [J. Bacteriol. 110: 1135 (1972)] hergestellt. Zur abschliessenden Vorbereitung des Klonierungsvektors wurden 1 ug pBC12CI mit 20 Einheiten Clal geschnitten und 35 anschliessend wurden, durch Behandlung mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I, stumpfe Enden hergestellt.

» % « - 27 -

HlL-2-Genfraqment-HerStellung

Das Plasmid pIL-2-2b das eine cDNA-Kopie der gesamten 459 Basepaare langen, für HIL-2 codierenden Region enthält 5 und die flankiert ist von 31 Basenpaaren 51-nichttransla-tierte Sequenz und 309 Basenpaare 31-nichttranslatierte Sequenz [Taniguchi et al., Nature 302: 305 (1983)], wurde als Quelle für das HIL-2 Gen verwendet. Da die Nukleotid--Sequenz des HIL-2-Gens bekannt ist [Taniguchi et al., 10 supra], kann das HIL-2 Genfragment auch synthetisch unter Verwendung der Methode von Souza et al. [Europäische Patentanmeldung Nr. Al 136 489] hergestellt werden. 10 ug pIL-2-2b wurden mit 20 Einheiten Rsal und BamHI in 100 μΐ Restriktionsenzympuffer während 1 Stunde bei 37°C geschnit-15 ten. Rsal schneidet die’HIL-2 cDNA an einer einzigen Stelle und zwar 1 Basenpaar in 3' Richtung bezüglich des Start-codons. Die Reaktionsmischung wurde anschliessend mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I versetzt und danach einer präparativen Elektrophorese in einem l%igen, bei 20 niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel unterworfen.

Das gewünschte 760 Basenpaare lange Rsal/BamHI HIL-2 cDNA Fragment wurde wie oben beschrieben identifiziert und aus dem Gel extrahiert.

25 100 ng des vorbereiteten Vektors pBC12CI wurden mit 100 ng des Rsal/BamHI HIL-2 Fragments in 30 μΐ Ligierungs-puffer mit 2 Einheiten T4 DNA Ligase vermischt und über Nacht bei 4°c inkubiert. Die ligierte DNA wurde dann zur Transformation des E. coli Stamms MC1061 verwendet. Die 30 Transformanten wurden auf LB-Agaroseplatten mit Ampicillin selektioniert.

200 ng des isolierten HIL-2 Fragmentes wurden verwendet, 32 um eine P markierte Einschnitt-translatierte (nick 35 translated) Probe (Nick-Translation-Kit, Amersham) herzustellen. Kolonien wurden von den Platten auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell, Inc.) transferiert und * - 28 - anschliessend auf die Gegenwart des eingefügten HIL-2 Fragments, unter Verwendung der markierten Probe gemäss der Methode von Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory], geprüft. Die 5 Kolonien die bei der Hybridisierung positiv waren, wurden gepflückt und DNA-Minipräparationen wurden gemäss der Methode von Birnboim et al. durchgeführt. Die erhaltenen DNA-Präparate wurden mit Hindill und StuI geschnitten und mittels Gelelektrophorese auf die Anwesenheit eines 10 charakteristischen, 690 Basenpaare langen Fragments, welches die korrekte Konstruktion des Vektors anzeigt, geprüft.

Diese Konstruktion wurde mit pBClO bezeichnet.

Eine grössere Menge pBClO DNA wurde hergestellt. Davon 15 wurden 10 ug mit 20 Einheiten Hindill und 16 Einheiten

StuI in Restriktionsenzympuffer während 1 Stunde bei 37°C gespalten. Anschliessend wurde ein dabei erhaltenes 690 Basenpaare langes HIL-2 DNA-Fragment durch präparative Agarosegelelektrophorese wie oben beschrieben isoliert.

20 1 ixg des Plasmids pBC12MI DNA wurde mit BamHI geschnitten und dann mit Klenow DNA-Polymerase wie oben beschrieben behandelt. Nach Inkubation bei 65°c wurde die DNA mit Hindin geschnitten, mit wässrigem Phenol-Chloroform 25 extrahiert und durch die Zugabe eines halben Volumens 7,5M Ammoniumacetat und von 2 Volumen Aethanol, gefolgt von einer Inkubation bei -70°C gefällt. Die präzipitierte pBC12Ml DNA wurde durch Zentrifugation abgetrennt, mit Aethanol gewaschen und in Wasser resuspendiert.

30 100 ng des vorbereiteten pBC12MI Vektors wurde mit 200 ng des isolierten IL-2 Hindlll/Stul-Fragment in 30 μΐ Ligationspuffer wie oben beschrieben ligiert. Die Ligie-rungsmischung wurde zur Transformation von E. coli Stamm 35 MC1061 verwendet. Die Transformanten wurden auf LB-Agarose- platten mit Ampicillin selektioniert. Einzelne Kolonien wurden wie zuvor auf die Anwesenheit eines 690 Basenpaare

A

« - 29 - langen HindlII/BamHI Fragment geprüft. Eine Konstruktion die dieses Kritierium erfüllte wurde mit pBC12/RSV/IL-2 bezeichnet.

5 Das so konstruierte Plasmid pBC12/RSV/IL-2 enthält ein chimäres HIL-2-Gen in welchem die 51-nichtcodierende Region und die ersten vier Nukleotide ATGT der für die Signalpeptidsequenz codierenden Sequenz des HIL-2-Gens. wie auch fast die ganze 3'-nichtcodierende Region, durch Sequenzen 10 des im Vektor pBC12MI enthaltenen Ratten-Preproinsulin-II--Gens, ersetzt worden sind. Zum Teil wurde diese Konstruktion gemacht, um eine definierte 31-nichtcodierende Region zu erhalten. Es ist jedoch der Ersatz der 5'-nichtcodieren-den Region welche, wie unten dargelegt, eine markante 15 Erhöhung der Expression’des HIL-2-Gens bewirkt. Die so erhaltene N-terminale Struktur des HIL-2-Signalpeptids ist in Figur 2 gezeigt.

Wie in Figur 2 ersichtlich, führt die oben ausgeführte 20 Konstruktion zur Bildung eines Chimären Signalpeptids, in welchem die ersten zwei Aminosäuren des HIL-2 (Met-Tyr) ersetzt worden sind durch die ersten fünf Aminosäuren der Ratteninsulin-Signalpeptidsequenz (Met-Ala-Leu-Trp-Ile) und eine sechste Aminosäure (Asp), welche auf der, an der 25 Ligierungsstelle neu gebildeten, Nukleotidsequenz beruht. Diese Veränderung hat jedoch keine Auswirkung auf die Funktion des Signalpeptids, das bei der Reifung des HIL-2 wie üblich abgespalten wird.

30 Einbau der Dihvdrofolatreductaseqensequenz

Ein iig pBC12/RSV/IL-2 wurde mit StuI geschnitten. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Aethanol gefällt und in Wasser resuspendiert. 10 p.g pSV2dhfr DNA 35 [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981)] wurden mit PvuII und BamHI geschnitten. Das Plasmid psV2dhfr war am 7. Mai 1986 bei ATCC in Form einer Kultur des mit dem - 30 -

Plasmid pSV2dhfr transformierten E. coli Stammes MC1061 unter der Nr. ATCC 67110 hinterlegt worden. Das aus dem Plasmid pSV2dhfr erhaltene SV40/dhfr-Gen-Fragment wurde auf einem 1% Agarosegel isoliert. 100 ng des pBC12/RSV/IL-2 5 Vektors wurden dann mit 400 ng des isolierten SV40/dhfr--Fragments in 40 μΐ Ligierungspuffer über Nacht ligiert.

Die Ligierungsmischung wurde direkt zur Transformation von E. coli Stamm MC1061 verwendet. Die Transformanten wurden auf LB Agaroseplatten mit Ampicillin selektioniert.

10

Transformierte Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter übertragen und unter Verwendung einer durch Einschnitt- 32 -Translation (Nick-Translation) mit P markierten, gegen das isolierte SV40/dhfr-Gen-Fragment gerichteten Probe, 15 überprüft. Die Probe wurde durch Markierung von 200 ng des isolierten PvuII/BamHI SV40/dhfr-Fragments unter Verwendung des Amersham Nick-Translation-Kit wie oben beschrieben zubereitet. Aus den bei der Hybridisierung positiven Kulturen wurde durch Verwendung der von Birnboim et al. (supra) 20 beschriebenen Methode die Plasmid-DNA isoliert und diese mittels Gelelektrophorese auf die Anwesenheit von zwei BamHI Fragmenten überprüft.

Die Anwesenheit der BamHI-Fragmente bestätigte die 25 Anwesenheit des SV40/dhfr-Fragmentes und zeigte die Orientierung des Fragmentes an. Das in das Plasmid pBC12/RSV/IL-2 klonierte SV40/dhfr-Genfragment enthält das vollständige dhfr-Gen der Maus unter der Kontrolle des Promoters der "early" Region von SV40. Ein Klon wurde ausgewählt, in 30 welchem die HIL-2-Gene und die dhfr-Gene im Plasmid in der gleichen Orientierung eingebaut waren. Das daraus erhaltene Plasmid wurde mit pBC12/RSV/IL-2/dhfr (siehe Fig. 3) bezeichnet.

35 Hohe Expression des HIL-2-Gens . . 5

Um das HIL-2-Gen zu expnmieren, wurden 5 x 10 4 - 31 - CHO/dhfr--Zellen auf 6 cm Kulturschalen in 4 ml IMEM-HT ausgesät. Nach über Nacht Inkubation in einem befeuchteten, mit 5% CC>2 belüfteten Inkubator bei 37°C wurden die Zellen mit pBC/RSV/IL-2/dhfr transfiziert. Die transfizierten 5 Kolonien wurden wie oben beschrieben isoliert.

Die so erhaltenen, mit d51 bis d56 bezeichneten klonier-ten Kolonien wurden in IMEM wachsen gelassen und gegeneinander und gegen eine unklonierte gemischte dhfr+-Kultur 10 (mit d5 bezeichnet) auf HIL-2-Produktion geprüft. Die HIL-2--Produktion wurde unter Verwendung eines quantitativen biologischen Testsystems, basierend auf der IL-2 abhängigen Zellinie CTLL, gemessen. Dieses Testsystem ist von Robb (Methods in Enzymology 116:493 [1985]) beschrieben und bein-15 halted die Mischung einer Reihe von 2-fachen Verdünnungen von Kulturüberständen der verschiedenen dhfr -Zellkolonien mit der il-2 abhängigen Zellinie CTLL. Da die CTLL Linie nur in Gegenwart von IL-2 wächst, ist das Wachstum dieser

Zellen, bestimmt durch den Einbau von tritiertem Desoxy-3 20 thymidin ( H-dT), ein genaues Mass für die Menge HIL-2 die von den dhfr+-Zellklonen sezerniert wird. Anstelle von CTLL-Zellen können auch menschliche PHA-Blasten zur Messung der HIL-2 Produktion verwendet werden [Robb et al., supra].

Menschliche PHA-Blasten können durch Stimulation von 25 normalen Lymphozyten aus peripherem Blut des Menschen, während 48 Stunden mit Phytohämagglutinin (PHA), erhalten werden. Die Resultate der Analyse dieser Klone sind in

Tabelle I aufgeführt. Die IL-2-Aktivität ist in Einheiten/ml 6

Medium und in Einheiten pro 10 Zellen angegeben. Eine 30 Einheit IL-2-Aktivität ist definiert als der reziproke Wert des Verdünnungsfaktors der den halbmaximalen Wachstumsschub, normiert auf einen IL-2 Standard der vom Biological Response Modifiers Programm des National Cancer Institutes in Frederick, MD, U.S.A. erhältlich ist [vergl. Thurman, 35 Lymphokine Res. 3,:227 (1984) and Robb et al., supra], ergibt.

*

- 32 -TABELLE I

Vergleich der HIL-2 Produktion durch isolierte Klone 5

Araethopterin

Konzentration HIL-2 Aktivität -6

Klon (Molar) (Einheiten/ml) Einheiten/10 Zellen) d5 0 640 456 10 ä51 0 1,920 1,310 d52 0 1,920 N.D.

d53 0 1,920 1,580 d54 0 820 N.D.

d55 0 550 N.D.

15 d51 5xl0~6 51,200 60.160 d51 2xl0~5 51,200 80.210 d51 8xl0~5 76,800 150,400 -4 d51 2x10 76.800 156.900 20 d51 5xl0~4 153,600 401,000 N.D. = nicht bestimmt 25 Aus Tabelle I ist ersichtlich, dass die Klone d51 und d53 am meisten HIL-2 Aktivität aufweisen. Um den oben erwähnten selektionierbaren Genamplifikationseffekt zu zeigen, wurden die Zellen des Klons d51 während 7 bis 14

Tagen mit einer zunehmend höheren Menge Amethopterin wachsen 30 gelassen, bis eine Linie erhalten wurde, die gegen eine -4 .

5 x 10 M Konzentration dieses Inhibitors resistent war.

Wie in Tabelle I gezeigt, sezerniert diese Zellinie grosse Mengen an HIL-2. Wie erwartet zeigte es sich, mittels Southern-Analyse [Maniatis et al.. Molecular Cloning: A 35 Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory,

Seiten 382-389], dass jede Zelle etwa 100 Kopien des Plasmids pBC12/RSV/IL-2/dhfr enthielt. Die homopolymeren G-C

- 33 -

Sequenzen die ursprünglich an die HIL-2 cDNA Kopie angehängt wurden, um deren Einbau in das Plasmid pIL-2-2b zu erleichtern, wirken sich hemmend auf die Expression des HIL-2-Gens aus. Um die Expressionsrate des HIL-2-Gens mit der normalen 5 menschlichen 5'-nichtcodierenden Region mit derjenigen des HIL-2-Gens mit einer entsprechenden Sequenz des Ratteninsulin-Gens richtig vergleichen zu können, wurde ein Plasmid hergestellt, bei dem die hemmenden homopolymeren Sequenzen herausgeschnitten wurden. Dieses Plasmid wurde mit 10 ρΒ040ΔΤ bezeichnet.

Konstruktion des Plasmids pBC40AT

Durch das Schneiden von 1 ug des Plasmids pBC12MI mit 15 20 Einheiten BamHI und 20 Einheiten Hindin während 1 Stunde bei 37°C in Restriktionsenzympuffer, wurde ein geschnittener Vektor vorbereitet, in dem das HIL-2-Gen eingebaut werden konnte. Das erhaltene Fragment wurde mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I behandelt, mit Phenol/Chloroform extra-20 hiert und wie oben beschrieben gefällt.

Ein HIL-2 DNA-Fragment wurde durch Schneiden von 10 ug pIL-2-2b DNA mit 20 Einheiten BamHI und 8 Einheiten StuI und Herstellen von stumpfen Enden mittels Klenow DNA Polymerase 25 hergestellt. Ein etwa 550 Basenpaare langes HIL-2-Fragment wurde anschliessend wie oben beschrieben aus einem 1%-igen präparativen Agarosegel isoliert.

100 ng des vorbereiteten Vektors pBC12MI wurden mit 30 150 ng des HIL-2 BamHI/Stul-Fragmentes in 25 μΐ Ligase- puffer wie oben beschrieben ligiert. Die Ligierungsmischung wurde direkt zur Transformation des E. coli Stammes MC1061 verwendet und die Transformanten wurden auf LB Agarose- platten mit Ampicillin selektioniert. Ampicillin resistente 35 Kolonien wurden von den Platten auf Nitrocellolosefilter transferiert und mittels Koloniehybridisierung unter Verwen-32 düng einer P-markierten (Nick-Translations-Kit, Λτ -34-

Amersham), gegen das BamHI/StuI-Fragment gerichteten Probe auf die Anwesenheit des HIL-2-Fragmentes geprüft.

Hybridisierungspositive Kolonien wurden gepflückt und 5 auf die Anwesenheit eines etwa 560 Basenpaare langen

BstEII/BamHI-Fragmentes geprüft, wobei die von Birnboim et al. (supra) beschriebene Methode (Restriktionsenzymanalyse von Plasmid DNA) verwendet wurde. Eine Konstruktion, die dieses Fragment enthielt, wurde identifiziert und als 10 Plasmid pBC40 bezeichnet. Plasmid pBC40 ist identish zu PBC12/RSV/IL-2 mit der Ausnahme, dass die Insulin 5'-nicht-codierende Region fehlt und ersetzt ist durch die natürliche 31 Basenpaare lange HIL-2 51-nichtcodierende Region. Das Plasmid enthält auch das natürliche HIL-2 Startcodon und hat 15 die 17 Basenpaare lange homopolymere Sequenz in der 5'-nichtcodierenden Region. Eine grössere Menge pBC40 DNA wurde mittels der Methode von Clewell et al. [J. Bacteriol. 110:1135 (1972)] hergestellt.

20 Die homopolymere Sequenz des HIL-2-Gens wurde mittels der Startersequenz geleitete Mutagenesemethode von Morinaga et al., supra herausgeschnitten. Dazu wurde ein phosphory-liertes, 24 Desoxyribonukleotide langes Starterfragment mittels der Phosphoramidit-Festphasensynthesemethode, wie 25 oben beschrieben, hergestellt. Dieses Starterfragment enthält 12 Deoxyribonukleotide die in der Sequenz zu den Basen auf beiden Seiten der homopolymeren Region, die auf einem der DNA-Stränge entfernt werden sollen, komplementär sind. Die Nukleotidsequenz dieses Starterfragments und diejenige 30 der DNA-Sequenz mit der homopolymeren Region, die herausgeschnitten werden soll, sind in Figur 4 gezeigt. Regionen, welche während dem Mutageneseverfahren hybridisieren, sind unterstrichen. Das Herausschneiden der homopolymeren Region führt zu einer neuen Hindin Restriktionsendonukleasestelle 35 in der DNA.

. 1 4.

- 35 -

Um das Mutageneseverfahren durchzuführen, werden 1 y.g pBC40 DNA mit Pvul linearisiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Aethanol gefällt und in 20 μΐ Wasser gelöst. 10 ug zusätzliche pBC40 DNA wurden mit EcoRI 5 geschnitten und das grösste Vektorfragment, das als gespaltener Vektor bezeichnet wird, wurde aus einem 1%-igen präparativen Agarosegel isoliert.

Gleiche Mengen des linearisierten und des gespaltenen 10 Vektors (je 200 ng) wurden mit einem 20-fachen molaren

Ueberschuss des phosphorylierten Oligonukleotides in 10 μΐ Wasser vermischt und 2 μΐ 10 x Klenowpuffer (IM NaCl, 65 mM Tris/HCl (pH 7,4), 45 mM MgCl^ und 10 mM Mercapto-äthanol) wurden zugefügt. Die Mischung wurde zuerst während 15 5 Minuten auf 100°C erhitzt und nachher während 30 Minuten bei Raumtemperatur, dann während 30 Minuten bei 4°C und anschliessend während 5 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurde das Volumen der Mischung durch Zugabe von 2 μΐ 10 mM ΆΤΡ, 4 μΐ einer Mischung von 2,5mM dCTP. dATP, dGTP und 20 dTTP, 0,5 μΐ Klenow Fragment der DNA Polymerase I (2,5 Aktivitätseinheiten) und 1 μΐ T4 DNA-Ligase (0,8 Aktivitätseinheiten) auf 20 μΐ gebracht.

Die Mischung wurde während 16 Stunden bei 15°C inkubiert 25 und anschliessend direkt zur Transformation des E. coli

Stammes MC1061 verwendet. Transformanten wurd.en auf LB

Agaroseplatten mit Ampicillin selektioniert. Kolonien auf den Platten wurden auf Nitrocellulosefilter transferiert und 32 unter Verwendung des mit α- P-ATP markierten Oligo-30 nukleotids als Probe, auf die Gegenwart einer zum Starterfragment, das beim Mutageneseverfahren verwendet wurde, homologen Sequenz geprüft.

Positive Kolonien wurden auf die Anwesenheit eines 35 erwarteten 530 Basenpaare langen HindiII/BamHI-Fragments mittels der Methode von Birnboim et al. geprüft. Weil gemischte Kolonien bei diesem Verfahren erhalten werden 4 - 36 - (Morinaga et al., supra), wurde eine positive DNA-Probe zur Transformation von E. coli Stamm MC1061 verwendet und die erhaltenen Kolonien wurden nochmals auf die Anwesenheit des 530 Basenpaare langen Hindlll/BamHl Fragments geprüft. Eine 5 auf diese Weise identifizierte Kolonie, welche mit pBC40AT bezeichnet wurde, war identisch zu pBC40 mit Ausnahme des Fehlens eines 22 Basenpaare langen Segmentes in der nicht--translatierten Leitsequenz, welche im wesentlichen aus der 17 Basenpaare langen homopolymeren G-C Sequenz bestand.

10

Funktioneller Vergleich der Vektoren PBC12/RSV/IL-2, pBC40 und pBC40AT

Bei drei oben beschriebenen Vektoren wurden unter-15 einander bezüglich ihrer Fähigkeit im Testsystem von Butnick et al. ["Transfected COS cell quantitative transient expression assay"; Mol. Cell. Biol. 5.:3009 (1985)] HIL-2 zu synthetisierten, verglichen. Bei diesem Testverfahren werden gleicher Mengen, der zu vergleichenden DNA's durch Transfek-20 tion in die COS Zellinie eingeführt. Diese Zellinie ist mit einem ori viralen Genom von SV40 transformiert, d.h. einem SV40 viralen Genom dem die Replikationsursprungsequenz fehlt. Desoxyribonukleinsäuren die eine SV40 Replikationsursprungsequenz enthalten (so wie zum Beispiel das zu 25 testende Plasmid) und die in diese Zellen eingeführt werden, werden in hoher Anzahl repliziert und werden demzufolge durch das in den Zellen vorhandene SV40 abhängige DNA Replikationssystem effizient exprimiert.

30 Die in den transformierten COS-Zellen produzierte Menge HIL-2 wurde durch das von Robb (supra) beschriebene quantitative, biologische Testsystem unter Verwendung der CTLL--Zellinie bestimmt. Die Resultate aus vier verschiedenen Experimenten sind in Tabelle 2 aufgeführt.

35

Effekt der 51-nichtcodierenden Sequenzen auf die HIL-2

Expression 5

- 37 -TABELLE II

Relative IL-2 Produktion (Einheiten/ml)

Klon 1234 Durch- 10 schnitt (¾) PBC12/RSV/IL-2 1,024 512 1.536 6,144 100 pBC40 24 8 32 192 2.8 pBC40AT 128 96 128 768 12,1 15

Wie in Tabelle II gezeigt, werden mit dem Plasmid PBC12/RSV/IL-2 beträchtlich mehr HIL-2 produziert als mit den Plasmiden pBC40 bzw. pBC40AT. Obwohl durch die Anwesenheit der homopolymeren Sequenz in der 5'-nicht-20 codierenden Region des Plasmids pBC40 das darin enthaltende HIL-2-Gen weniger gut exprimiert wird als in pBC40AT, wo diese homopolymere Sequenz fehlt, liegt doch der prinzipielle Unterschied zwischen den drei Plasmiden darin, dass der Grossteil der 5'-nichttranslatierten Sequenzen in pBC40 25 und pBC40AT natürliche humane Sequenzen sind, währenddem im Plasmid pBcl2/RSV/IL-2 die entsprechenden Sequenzen aus dem Ratten-Präproinsulin-II-Gen stammen.

Bei Substitution der normalen 5'-nichtcodierenden 30 Sequenzen durch solche eines Ratteninsulin-Gens erhöht die HIL-2 Expression aus nicht bekannten Gründen beträchtlich.

Das Verständnis für den Mechanismus dieser erhöhten Expression ist für die Erfindung nicht wesentlich. Es ist möglich, dass eine erhöhte Stabilität der mRNA für diesen Effekt 35 verantwortlich ist. Andererseits ist es möglich, dass die Substitution der vier ersten Nukleotide, der für die Signalpeptidsequenz des natürlichen HIL-2 codierenden Sequenz, φ * - 38 - eine Erhöhung der translationeilen Effizienz verursacht, die auf den geeigneteren Sequenzen in unmittelbarer Nachbarschaft des Insulin-Startcodons beruht [Kozak. Cell 44:283 (1986)].

5

Eine Vielzahl von Modifikationen und Variationen sind bezüglich der vorliegenden Erfindung machbar ohne von der allgemeinen Idee auf der sie beruht abzuweichen und sind für den Fachmann klar ersichtlich. Die spezifische Ausführungs-10 form der vorliegenden Erfindung ist nur als ein Beispiel aufzufassen.

15 20 25 30 35

Claims (18)

1. Eine DNA-Sequenz, die ein Gen, das für Human-Inter-leukin-2 und eine Signalpeptidsequenz codiert, sowie eine 5 51-nichtcodierende Sequenz enthält, wobei die zum Gen gehörende 51-nichtcodierende Sequenz ersetzt worden ist durch eine entsprechende heterologe 51-nichtcodierende Sequenz.

2. Eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 1. in der die heterologe 51-nichtcodierende Sequenz von einem Ratten--Insulingen stammt.

3. Eine DNA Sequenz gemäss Anspruch 1, in der zusätzlich 15 die der 51-nichtcodierenden Sequenz benachbarten Nukleotide der Sequenz, die das Signalpeptid codiert, ersetzt worden sind durch entsprechende heterologe Nukleotide.

4. Eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 3, in der die der 20 51-nichtcodierenden Sequenz benachbarten und einen Teil des Signalpeptids codierenden Nukleotide ATG T ersetzt worden sind durch die Nukleotidsequenz ATG GCC CTG TGG ATC G.

5. Ein rekombinierter Vektor, der eine DNA-Sequenz 25 gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält und der fähig ist, Human-lnterleukin-2 in einer geeigneten Zelle zu exprimieren.

6. Ein rekombinierter Vektor gemäss Anspruch 5, wobei 30 der Vektor eine SV40 ori Region und einen LTR-Promoter des Rous Sarkomvirus enthält.

7. Ein rekombinierter Vektor gemäss Anspruch 5 aus der Gruppe PBC12/RSV/IL-2 und pBC12/RSV/IL-2/dhfr. 35

8. Eine Säugerzelle, die eine DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält und die fähig ist, das in der t - 40 - DNA-Sequenz codierte Human-Interleukin-2 zu exprimieren.

9. Eine Säugerzelle, die einen rekombinierten Vektor gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7 enthält und die fähig 5 ist, das von der im rekombinierten Vektor enthaltenen DNA-Sequenz codierte Human-Interleukin-2 zu exprimieren.

10 DNA-Sequenz amplifiziert ist.

10. Eine Säugerzelle gemäss einem der Ansprüche 8 oder 9, worin der darin enthaltene rekombinierte Vektor oder die

11. Ein Verfahren zur Herstellung von Human-Inter-leukin-2 dadurch gekennzeichnet, dass eine Säugerzelle die einen rekombinierten Vektor gemäss einem der Ansprüche 5 bis 15. enthält, kultiviert wird und das Human-Interleukin-2 aus der Kultur isoliert wird.

12. Ein Verfahren gemäss Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinierte Vektor durch Transfektion 20 in die Säugerzelle eingeführt wird.

13. Ein Verfahren gemäss Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinierte Vektor ein selektionier-bares Gen enthält und und die Säugerzelle in einem Selek- 25 tionsmedium kultiviert wird, wobei mehrfache Kopien des selektionierbaren Gens und der DNA-Sequenz. welche für Human-Interleukin-2 codiert, durch Co-Amplifikation eingeführt werden.

14. Ein Verfahren gemäss Anspruch 13. in welchem das selektionierbare Gen für Dihydrofolatreduktase codiert, die Säugerzelle ansonst keine Dihydrofolatreduktaseaktivität aufweist und ein Selektionsmedium ohne Hypoxanthin und Thymidin aber mit Amethopterin verwendet wird. 35 X % - 41 - <

15. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14 in welchem die Säugerzelle eine CHO/dhfr Zelle ist.

16. Ein Verfahren zur Herstellung einer Säugerzelle wie 5 sie in einem der Ansprüche 8 bis 10 definiert ist dadurch gekennzeichnet, dass ein rekombinierter Vektor gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7 in die Säugerzelle eingeführt wird.

17. Verwendung eines Vektors gemäss einem der Ansprüche 10 5-7 zur Herstellung von Human-Interleukin-2.

18. Verwendung einer Säugerzelle gemäss einem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung von Human-Interleukin-2. *** 20 25 30 35