<Desc/Clms Page number 1>
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Klonierung und Expression von menschlichem Transforming Growth Faktor-Beta2 (TGF-ss2). Gegenstand der Erfindung ist eine für einen TGFss2-Prekursor kodierende Nukleotidsequenz sowie der TGF-ss2-Prekursor selbst.
EMI1.1
: 685-698),Drosophila (padgett et al., 1987, Nature 325 : 81-84).
Der Transforming Growth Faktor-Beta (TGF-ss) besteht aus zwei identischen Disulfid-verbrückten Untereinheiten mit einem jeweiligen Molekulargewicht von 13 000 (Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 7155-
EMI1.2
; FrolikTGF-ss ist ausserdem in der Lage, fetale Rattenmuskel-Mesenchym-Zellen zu differenzieren und zur Produktion knorpelspezifischer Makromoleküle zu veranlassen (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem.
261 : 5693-5695).
Im Gegensatz zu seiner Wirkung auf die Zellproliferation kann der aus menschlichen Thrombozyten isolierte TGF-ss ebenso wie ein funktionell verwandtes Protein aus BSC-1-Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze das Wachstum bestimmter Zellen In Kultur inhibieren (Tucker et al., 1984, Science 226 : 705-707).
EMI1.3
wurden bereits isoliert. DNA-Sequenzanalysen dieser Klone welsen darauf hin, dass TGF-ss In Form eines grossen Prekursor-Polypeptids synthetisiert wird, wobei dessen carboxy-terminales Ende unter Bildung des matunerten TGF-ss-Monomers abgespalten wird. Eine ausgeprägte Sequenzhomologie Im gesamten Bereich des Prekursor-Proteins wurde in sämtlichen TGF-ss-Faktoren mit oben genannter Abstammung gefunden.
Erst kürzlich wurde aus demineralisierten Rinderknochen ein mit TGF-ss verwandtes Protein isoliert
EMI1.4
bozyten (Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415), einer menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie, PC-3 (Ikeda et al, 1987, Biochemistry 26'2406-2410) sowie aus einer menschlichen Glioblastomzellinie (Wrann et al., 1987, EMBO 6 : 1633-1636) isoliert. Eine partielle Aminosäuresequenzanalyse dieses Proteins wies auf eine Homologie zu TGF-ss hin, weshalb dieses Protein als TGF-ss2 bezeichnet wurde. Die früher
EMI1.5
(Derynck261 : 4377-4379) und Simian- (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244) TGF-ss-Faktoren wurden als TGF-ss1 bezeichnet.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung soll die Herstellung grosser Mengen von TGF-ss2 durch eukaryonttsche W ! rtszeiten, weiche mit rekombinanten DNA-Vektoren transfiziert sind, die TGF-ss2 kodierende Sequenzen enthalten, ermöglicht werden. Diese Sequenzen werden durch expressionsregulierende Elemente kontrolliert. Man erhält für den Human-TGF- ; S2-Prekursor kodierende cDNA-Klone aus einer cDNA-Genbank, hergestellt aus einer Tamoxifen-behandelten menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3.
Aus der cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt sich, dass TGF-ss2 in Form eines Polypeptld-Prekursors mit 442 Aminosäuren synthetisiert wird, aus dem die reife (maturierte) TGF-ss2-Untereinhelt mit 112 Ammosäu- ren durch proteolytische Spaltung erzeugt wird. Dieser TGF-ss2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-442 zeigt eine 41% ige Homologie zum Prekursor von TGF-ss1. Ausserdem erhält man cDNA-Kione, welche für den Slmlan- TGF-ss2-Prekursor kodieren, aus einer cDNA-Genbank einer Nierenzellinie BCS-40 aus Afnkanlsche Grüne Meerkatze.
Die cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt, dass TGF-ss2 ebenso als PrekursorPolypeptid mit 414 Aminosäuren synthetisiert wird, woraus die matunerte TGF-ss2-Untereinhelt mit 112 Aminosäuren durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird Dieser TGF-ss2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-414 mit einer Aminosäuresequenz von 414 Aminosäuren stimmt mit der Aminosäurensequenz von
<Desc/Clms Page number 2>
TGF-ss2-442 überein, wobei allerdings ein einzelner Asparaginrest anstelle der 29 Aminosäuren langen Teilsequenz vom Rest Nummer 116 bis zum Rest Nummer 144 der Human-TGF-ss2-442-Sequenz enthalten ist.
Ausserdem wurden in einer BSC-40 cDNA-Genbank für einen Simian-TGF-ss2-442-Prekursor kodierende Klone sowie in einer Human-PC-3 cDNA-Genbank für einen Human-TGF-ss2-414-Prekursor Kodierende Klone nachgewiesen. Die Human- und Simian-TGF-ss2-442-Prekursoren scheinen auf der Aminosäureebene ebenso wie die Human- und Simian-TGF-ss2-414-Prekursoren absolut homolog zu sein.
EMI2.1
welchess2-Faktor In Phase mit der Signal- und Prekursorsequenz von TGF-ss1 enthalten und zur Transfektion von Ovanalzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) verwendet. Die dabei gebildeten Transfektanten produzieren und sezernieren maturierten, biologisch aktiven TGF-ss2.
DEFINITIONEN
Die hierin verwendeten Abkürzungen besitzen folgende Bedeutung : TGF-ss2 : Ein Transforming Growth Faktor-Beta2 aus Menschen oder Affen, welcher im wesentlichen die Aminosäuresequenz etwa vom Aml- nosäurerest Nummer 331 bis etwa zum Aminosäurerest Nummer
442 gemäss Fig. 1a umfasst.
TGF-ss2-Prekursor : Eine Gruppe von Transforming Growth Faktor-Beta2-Molekülen aus Menschen oder Affen, welche eine Aminosäuresequenz ge- mäss Fig. 1a etwa vom Aminosäurerest Nummer 1 bis etwa zum
Aminosäurerest 442, oder etwa vom Aminosäurerest Nummer 1 bis etwa zum Aminosäurerest 442, wobei die Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 116 bis zum Aminosäurerest 144 deletiert und durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt ist, umfassen. Dieser Ausdruck steht für einen TGF-beta2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-442 oder TGF-ss2-414, welche vom
Menschen oder vom Affen abgeleitet sind.
TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor : Ein neues Transforming Growth Faktor-Beta-Prekursor-Molekül, weiches Im wesentlichen eine Aminosäuresequenz etwa vom Aml-
EMI2.2
Fig. 1 b umfasst.
TGF-ss1-Prekursor : Simlan- TransformlOg Growth Faktor-Betal-Prekursor und Signalse- quenzen, welche im wesentlichen etwa die Aminosäurereste Num- mer 1 bis etwa 278 gemäss Fig. 1 b umfassen.
FIGURENBESCHREIBUNG
Fig. 1 a : Nukleotidsequenz von Human- TGF-ss2-442 cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz. Das
2597 bp Insert von pPC-21 wurde 10 pEMBL subkloniert (Dante et al., 1983, Nuclelc Acids
EMI2.3
1645-1654)angegeben. Die Sequenz des maturierten TGF-ss2 ist eingerahmt und das Signalpeptid mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Potentielle Glycosyllerungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet. Die mutmassliche Signalsequenz-Schnittstelle ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Die Nukleotidsequenz von Simian- TGF-ss2-414 cONA Ist mit der Human-TGF-ss2- 442 cDNA-Sequenz identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 (geschwärzt) deletiert und durch die Sequenz AAT ersetzt sind Ausserdem sind an verschiedenen Stellen der Sequenz stumme Vertauschungen von Nukleotiden gezeigt (angegeben durch einzelne Buchstaben direkt unter dem ausgetauschen Nukleotid). Die für den Simian- TGF-ss2-414-Prekursor abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit der Aminosäuresequenz des Human- TGF-ss2-442-Prekursors überein, mit der Ausnahme, dass Asparagin die Aminosäurereste 116 bis 144 In der Human-TGF-ss2-442-Strukturersetzt.
Die Nukleotidsequenz von Human-TGF-ss2-414 cDNA wurde in dem durch gestnchelte Linien gekennzeichneten Bereich sequenzlert, wobei vollkommene Homologie zur Human-TGF-ss2-442 cDNA-Sequenz festge-
<Desc/Clms Page number 3>
stellt wurde, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 deletiert und durch die
Sequenz AAT ersetzt sind.
Fig. 1 b : Nukleotidsequenz der Hybrid-TGF-ss1/TGF-ss2-Prekursor-DNA und die abgeleitete Aminosäu- resequenz. Es ist sowohl die kodierende Sequenz als auch unmittelbar darüber die abgeleite- te Aminosäuresequenz gezeigt. Die Sequenz des maturierten TGF-ss2 ist eingerahmt und das
Prekursor-Signalpeptid mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Glycosylierungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet. Die mutmassliche Slgnalsequenz-Schmttstelle ist mit einem
Pfeil gekennzeichnet. Die kodierende Sequenz entspricht maturiertem Human-TGF-ss2. Die kodierende Sequenz von Simian-TGF-ss2 ist mit der Humansequenz fast identisch : Lediglich drei stumme Basenaustausche wurden gefunden und sind mit einzelnen Buchstaben direkt unter dem ausgetauschten Nukleotid gekennzeichnet.
Einzelheiten zur cDNA-Klonierung von TGF-ss2 und zur Konstruktion des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybridgens folgen im Text.
Fig. 1 c : Schematisches Diagramm des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens.
Fig. 1 d : Restriktionsendonukleasekarten von pPC-14 (2. 2 kb) und pPC-21 (2. 3 kb). Die umrahmten
Bereiche stehen für die kodierenden Sequenzen des TGF-ss2-Monomers. ATG bezeichnet das Methionin-Startcodon. Der Abstand zwischen ATG und der Kpnl-Schnittstelle in pPC-21 (2. 3 kb) beträgt ca. 420 bp. Der geschwärzte Bereich zeigt die Position des 84-bp-Inserts in pPC-21 (2. 3 kb).
Fig. 1 e : Partielle DNA-Sequenzanalyse von pPC-14 (2. 2 kb). Ein synthetisches Oligonukleotid 5'-
AGGAGCGACGAAGAGTACTA-3', welches ca. 140 bp oberhalb (upstream) der Kpnl-Schnitt- stelle innerhalb des Inserts In pPC-21 (2. 3 kb) hybridisiert, wurde als Pnmer zur DNA-
Sequenzierung verwendet. In diesen Bereich Ist die Sequenz von pPC-14 (22 kb) (obere
Zelle) bis zu den Nukleotiden, welche für Asn-116 kodieren, identisch mit pPC-21 (2. 3 kb).
Das 84-bp-lnsert In das Asn-116-codon von pPC-14 (2. 2 kb), das in pPC-21 (2. 3 kb) gefunden wurde, Ist ausserdem gezeigt. Die Kpnl-Schnittstelle innerhalb des Inserts ist angegeben.
Fig. 2 : Homologien von Human-TGF-ss1-und TGF-ss2-442-Prekursorsequenzen. a) Pnmäre Sequenzhomologie : Identische Reste sind eingerahmt. Potentielle Glycosylie- rungsste ! ! en ! n TGF-/32 sind mit Sternchen gekennzeichnet, die potentielle Signalsequenz- schnittstelle und die Schnittstelle des maturierten Polypeptids sind gekennzeichnet. b) Punktmatrixvergleich mit Hilfe der Gene Pro-Software. Durch jeden Punkt wird ein
Bereich angegeben, worin 5 von 10 Aminosäuren Identisch sind. Diagonale Linien weisen auf homologe Bereiche hin.
Flg. 3 : Northern Blot-Analyse von BSC-40 und PC-3 polyadenylierter RNA. Polyadenyherte RNA wird aus BSC-40 und PC-3 Zellen Isoliert, auf einem Agarose-Formatdehydge ! frakttontert. auf Hybond-N-Filter übertragen und mit einem [32P]-markiertem TGF-ss2 spezifischen Marker, pPC-21 (Teil A) oder einem Gemisch von [32P]-markiertem TGF-ss2-und TGF-ss1-(Sharples et al., 1987) spezifischen Markern (Teil B) wie in Materials und Methoden beschrieben, hybridisiert. Spur 1, BSC-40 polyadenylierte RNA (5 Mikrogramm), Spur 2, PC-3 polyaden- ylierte RNA (5 Mikrogramm).
Fig. 4 : Northern Blot-Analyse von polyadenylierter RNA unterschiedlicher Herkunft. Polyadenylierte
RNA wurde aus MCF-7 (Human-Mammakarzinom), SK-MEL 28 (Human-Melanom), KB (Na- sopharyngealkarzinom) und HBL-100 (Human-Mammaepithel) Zellen isoliert und durch Nor- thern Blot-Hybridisierung mit einem TGF-ss2-spezifischen Marker (pPC-21) gemäss der Be- schreibung m Material und Methoden analysiert. Jede Spur enthält 5 Mikrogramm polyaden- ylierter RNA aus SK-MEL 28 (Spur 1), MCF-7 (Spur 2), HBL-100 (Spur 3) oder KB (Spur 4)
Zellen.
Fig. 5 : Bioaktivitätstest mit Rekombinantem TGF-ss2 1ss9. 12.5, Klon 36-Zellen werden bis zur
Konfluenz In 100 mm Gewebskulturschalen gezüchtet. Die Zellen werden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und 24 h 10 serumfreiem Medium inkublert. Die Medien werden gesammelt, gegen O, 2M Essigsäure dialysiert und auf Inhibition der DNA-Synthese 10
CCL64-Zellen wie beschrieben (Gentry et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7.3418) getestet. In diesem Test ergeben 33 pg eines gereinigten natürlichen TGF-ss1-Standards 50%ige inhibt- tion ; für die spez) f ! sche Aktivität von gereinigtem natürlichen TGF-ss2 wurde etwa der halbe
Wert von TGF-ss1 bestimmt.
Fig. 6 : Western Blot-Analyse rekombinanter Proteine sezerniert von 1ss9, 12.5, Klon 36 Säuredialy- Sterte serumfreie konditionierte Medien von 1ss9. 12,5, Klon 36 Zellen werden durch SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und durch Western-Blotting mit einem Antise-
<Desc/Clms Page number 4>
rum gegen das synthetische NH2-YNTINPEASASPC-COOH wie beschrieben analysiert (Gen- try et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Herstellung einer biologisch aktiven, maturierten Form von TGF-ss2 aus der kodierenden Sequenz eines TGF-ss-Prekursor-Genes und dessen Produkt.
Das maturierte biologisch aktive TGF-ss2 kann durch Klonierung und Expression der kodierenden Nukleotidequenz des TGF-ss2-Prekursors in voller Länge oder eines seiner funktionalen Äquivalente in einer Wirtszelle produziert werden, weiche den Prekursor nchtig prozessiert, so dass maturierter TGF-ss2 mit einer biologischen Aktivität erzeugt wird, die sich von der Aktivität eines authentischen natürlichen TGF-ss2 nicht unterscheidet. Funktionale Äquivalente der kodierenden Gesamtnukleotidsequenz des TGF-ss2-Prekursors beinhalten jegliche DNA-Sequenz, die bei Expression in einer geeigneten Wirtszelle die Synthese, Prozes-
EMI4.1
werden.
Gegenstand der Erfindung ist eine für einen TGF-ss2-Prekursor kodierende Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie im wesentlichen die kodierende Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer 1 bis zum Nukleotidrest Nummer 1326 gemäss Fig. la umfasst
Ebenso ist Gegenstand der Erfindung der TGF-ss2-Prekursor der Im wesentlichen die Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 1 bis zum Aminosäurerest Nummer 442 gemäss Fig. 1 umfasst.
Zur Verdeutlichung des Herstellungsverfahrens kann dieses In folgende Stufen aufgeteilt werden : (a) Isolierung oder Generierung der kodierenden Sequenz für einen TGF-ss2-Prekursor : (b) Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher die Expression einer kodierenden Sequenz für TGF- ss2 steuert ; (c) Transfektion einer geeigneten Wirtszelle, welche das Gen repliziert und exprimiert und das Genpro- dukt zur Produktion der maturierten, biologisch aktiven Form von TGF-ss2 prozessiert ; und (d) Identifizierung und Reinigung des maturierten biologisch aktiven TGF-ss2.
Nach Identifizierung des Transfektanten, welcher eine hohe Expressionsrate für bioaktives maturiertes TGF-ss2 aufweist, wird dieser Klon vermehrt und das exprimierte Genprodukt daraus isoliert.
Das Verfahren wird anhand von Beispielen beschrieben. Hierin werden cDNAs der kodierenden TGF- ss2-Prekursorregion hergestellt, kloniert, sequenziert und zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet, weicher eine hohe Expressionsrate von TGF-ss2 in CHO-Zellen steuert. In einer speziellen Ausführungsform wird die gesamte Aminosäuresequenz der maturierten Form von Human-TGF-ss2 bestimmt, welche insgesamt eine Homologie von 71% mit TGF-ss1 aufweist. Unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden wurden Klone einer PC-3 cDNA-Genbank identifiziert, welche für TGF-ss2 kodieren.
Die DNASequenzanalyse eines dieser Klone ergab, dass TGF-ss2 ebenso wie TGF-ss1 in Form eines grösseren Prekursorproteins synthetisiert wird, woraus unter Abspaltung des carboxyterminalen Endes das maturierte
EMI4.2
der restlichen Prekursorsequenz. Funktionale Unterschiede der aminoterminalen Bereiche von TGF-ss1 und TGF-ss2 können daraus geschlossen werden.
In einer speziellen Ausführungsform wird die Herstellung grosser Mengen von biologisch aktivem TGF- ss2 durch Expression eines neuartigen TGF-ss1/TGF-ss2-Hybridgens in CHO-Zellen erreicht.
Die verschiedenen Aspekte dieses Verfahrens werden Im folgenden sowie In den Beispielen näher beschneben.
Isolierung und Erzeugung der TGF-ss2-kodlerten Region
EMI4.3
benen Verfahrens können die dann dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmente oder funktionale Äquivalente davon zur Erzeugung des rekombinanten Moleküls verwendet werden, welches die Expression des TGF-ss2-Produktes in einer geeigneten Wirtszelle steuert. Gemäss einer speziellen Ausführungsform wird ein TGF-ss1/TGF-ss2-Hybndgen (Flg. 1b) hergestellt und zur Transfektion von CHO-Zellen verwendet. Transfektanten mit einer Produktionsrate von 500 J. Lg matunertem biologisch aktivem TGF-ss2 pro ml Kulturmedium wurden isoliert.
Aufgrund der Degeneration der kodierenden Nukieotidsequenz können andere DNA-Sequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, die den Sequenzen gemäss Fig 1 a und 1 b im wesentlichen gleichen, zur Klonierung und Expression von TGF-ss2 verwendet werden. Derartige Veränderungen beinhalten Deletionen, Additionen oder Substitutionen unterschiedlicher Nukleotidreste, welche zu einer Sequenz
<Desc/Clms Page number 5>
führen, die für ein identisches oder funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz aufweisen, welche zu stummen Veränderungen führen und wodurch ein bioaktives Produkt erzeugt wird.
Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydro- phobizität, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der betreffenen Reste erfolgen. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin ; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder unpolaren Kopfgruppen mit vergleichbarer Hydrophilie beinhalten : Leucin, Isoleucin, Valin ; Glycin, Alanin ; Asparagin, Glutamin ; Serin, Threonin ; Phenylalanin, Tyrosin.
Die kodierende Nukleotidsequenz für TGF-ss2 kann man aus Zellen erhalten, welche eine TGF-ss2 ähnliche Aktivität aufweisen. Die kodierende Sequenz kann man durch cDNA-Klonierung von RNA erhalten, welche aus derartigen Zellen durch genomische Klonierung isoliert und gereinigt wurde. Man kann entweder cDNA- oder genomische Genbanken von Klonen herstellen, welche mit Hilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, z. B. unter Verwendung von Restriktionsenzymen aus DNA-Fragmenten erzeugt wurden. Die Genfragmente, welche für TGF-ss2 kodieren, können durch Screening solcher Genbanken mit einer Nukleotidsonde nachgewiesen werden, welche zu einem beliebigen Tell der in Fig. 1 a dargestellten Sequenz im wesentlichen komplementär ist.
Klone mit der Gesamtsequenz, d. h. Klone, welche den gesamten kodierenden Bereich des TGF-ss2-Prekursors enthalten, können selektiert und expnmlert werden.
Gemäss einer anderen Ausführungsform kann die kodierende Sequenz in Fig. 1 a als ganzes oder teilweise unter Verwendung von bekannten chemischen Methoden synthetisiert werden (s. z. B. Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215-223 ; Crea und Horn, 1980, Nuc. Acids. Res. 9 (10) 2331 ; Matteuccl und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21 : 719 und Chow und Kempe, 1981, Nuc. Acids Res.
9 (12) : 2807-2817). Andererseits könnte das Protein dadurch hergestellt werden, dass man mit Hilfe von chemischen Methoden die Aminosäuresequenz in Fig. 1a als Ganzes oder teilweise synthetisiert. Beispielsweise können Peptide mit Hilfe der Festphasensynthese auf einem Beckman 990-Gerät hergestellt werden,
EMI5.1
and A. Lawton, 1986, Virology 152 : 421-431) abgespalten werden. Zur Reinigung kann man präparative hochauflösende Flüssigchromatographie verwenden. Die Peptidzusammensetzung kann durch Aminosäure- analyse bestimmt werden.
Gemäss einer speziellen Ausführungsform in den hierin beschnebenen Beispielen erhält man die TGF- ss2-kodierende Sequenz durch Klonierung der cDNA der kodierenden Sequenz des Human-TGF-ss2Prekursors, abgeleitet von polyadenylierter RNA. Diese wurde aus einer Tamoxlfen-behandelten menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3 isoliert, deren TGF-ss2-Produktion bereits nachgewiesen war. Der gesame kodierende Bereich eines cDNA-Klons wurde sequenziert und mit der veröffentlichten Sequenz für Human-TGF-ssi verglichen (s. Fig. 2).
Die DNA-Sequenzanalyse von TGF-ss2-cDNA-Klonen zeigt. dass TGF-ss2 ebenso wie TGF-ss1 als grosses Prekursorprotem synthetisiert wird, dessen carboxyterminales Ende unter Bildung des matunerten 112 Aminosäuren langen TGF-ss2-Monomers abgespalten wird.
Für TGF-ss2 wurde ein Molekulargewicht von 24 000 nachgewiesen, wobei das Molekül aus zwei disulfidverbrückten 13 000 Dalton grossen Untereinheiten
EMI5.2
Produktion von maturiertem TGF-ss2 ist daher sowohl eine entsprechende proteolytische Spaltung als auch die Bildung intra-und intermolekularer Disulfidbrücken erforderlich Eine aminoterminale hydrophobe Leadersequenz (Reste 3-19) ist im Prekursor nachweisbar und kann für das Ausschleusen des Proteins aus der Zelle verantwortlich sein. Maturierter TGF-ss2 kann während dieses Vorgangs mit dem restlichen Tell des Prekursors noch verbunden sein.
TGF-ss2 zeigt gegenüber TGF-ss1 im maturierten Bereich des Prekursors eine 71% Ige Homologie, die
EMI5.3
hinweist.Prekursorberelchen von TGF-ss1 und TGF-ss2 zu beobachten. Nach Abspaltung des wahrscheinlichen Signalpeptids würde der TGF-ss2-Prekursor eine grössere Anzahl von Aminosäuren als der TGF-ss1Prekursor besitzen. Die primären Strukturunterschiede Innerhalb des aminotermmaien Bereichs des TGF- ss1-und TGF- 32-Prekursorprote ! ns können auf funktionalen Unterschieden beruhen. Es werden jedoch
EMI5.4
<Desc/Clms Page number 6>
vierung wichtiger funktionaler Domänen auch innerhalb der N-terminalen Prekursorregion andeuten.
Northern Blot-Analysen ergaben grössenmässig zwei Hauptklassen von TGF-ss2-spezifischer mRNA mit 4. 1 und 6. 5 kb in BSC-4Q-Zellen. Tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen enthalten drei TGF-ss2-Transcriptionen mit 4. 1 kb, 5. 1 kb und 6. 5 kb. Diese unterschiedlichen Grössen können durch differentielles RNA-Spleissen und/oder Polyadenylierung, wie bereits für andere Gene beschrieben (Helfman et al., 1986, Mol. Cell.
Biol.
EMI6.1
: 3582-3595 ;Analysen eines weiteren TGF-ss2-cDNA-Klons ergaben am 3'-Ende einen nicht-translatierten Bereich, welcher annähernd 1 kb grösser ist als der entsprechende Bereich in pPC-21 und pPC-14 und der ausserdem eine unterschiedliche Polyadenylierungsstelle aufweist. Daraus kann geschlossen werden, dass eine alternative Polyadenylierung eine Ursache ist, die zur Erzeugung multipler TGF-2-mRNAs (wie) n
Northern Blots beobachtet) führt.
BSC-40-Zellen enthalten vergleichbare Mengen von TGF-ss1- und TGF-ss2-spezifischen Transcriptionen; Tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen enthalten mehr TGF-ss1-mRNA als TGF-ss2-mRNA (Fig. 3b). Letzteres
Ergebnis ist nicht zu erwarten, da diese Zellen mehr TGF-ss2-Protein als TGF-ss1 produzieren (Ikeda et al,
1987, Biochemistry 26 : 2406-2410). Daraus kann auf eine posttranscriptionale Regulation der Synthese dieser Wachstumsmodulatoren geschlossen werden. Versuche zum besseren Verstehen der transcriptiona- len und translationalen Kontrollmechanismen. die zur Produktion von TGF-ss1 und TGF-ss2 führen, werden durchgeführt.
Die Herstellung adequater Mengen von TGF-ss2 mit Hilfe der DNA-Rekombination, wie bereits für TGF-ss1 durchgeführt. sollte der Durchfuhrung weiterer Experimente zur Erforschung der verschiedenen Effekte dieses Proteins dienen.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform wurde die TGF-ss2-kodierende Sequenz durch cDNA-Klonie- rung der kodierenden Sequenz des Simian- TGF-ss2-Prekursors hergestellt. letzterer wurde von polyadenylierter RNA abgeleitet, die aus der BSC-40-Zellinie afrikanischer grüner Meerkatzen isoliert wurde. Die gesamte kodierende Region eines cDNA-Klons wurde sequenziert. Daraus ergaben sich identische Aminosäuresequenzen des Human-und Simian-TGF-ss2-Prekursors und eine annähernde Identität ihrer Nukleotid- sequenzen.
Konstruktion eines Expressionsvektors mit der TGF-ss2 kodierenden Sequenz
Zur Expression von biologisch aktivem, maturiertem TGF-ss2 sollte ein Expresstonsvektor/Wirtssystem gewählt werden, welches nicht nur hohe Transcriptions- und Translationsraten, sondern auch die richtige Prozessierung des Genproduktes bewirkt. Dies ist insbesondere wichtig bel Verwendung der gesamten kodierenden Sequenz eines TGF-ss2-Prekursors im Expressionssystem, da die maturierte Form von TGF-ss2 wahrscheinlich über zelluläre Prozessierungsvorgänge vom Prekursorprodukt abgeleitet wird. Zusätzlich kann ein ExpressionslWirtszelten-System ausgewählt werden, welches das Genprodukt sezerniert.
Anscheinend wird der matunerte TGF-ss2, ein disulfidverbrücktes Homodimeres mit 112 Aminosäuren pro Untereinheit, durch zelluläre Prozessierung gebildet. Hierbei erfolgt eine proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg-Ala des Prekursors (Reste 330 und 331 in Fig. 1a).
Zusätzlich enthält der TGF-ss2-Prekursor drei potentielle N-Glycosylierungsstellen. welche in der maturierten Form nicht zu beobachten sind : eine richtige Glycosylierung des Prekursors kann für die zelluläre Synthese und Freisetzung oder Sekretion des maturierten Moleküls entscheidend sein. Der maturierte TGF-ss2 umfasst ein disulfidverbrücktes Dimer mit neun Cysteinresten je Untereinheit. Einige dieser Reste sind an intermole- kularen Disulfidbrücken, andere an Intramolekularen Disulfidbrücken beteiligt, wodurch die Tertiärstruktur und die Konfiguration des maturierten Moleküls und als Folge davon dessen biologische Aktivität beeinflusst wird.
Die Fähigkeit der im Expressionssystem verwendeten Wirtszelle zur korrekten Expression und Prozessierung des TGF-ss2-Genproduktes ist daher für die Produktion eines biologisch aktiven maturierten TGF-ss2 von Bedeutung.
Eine Vietzahl von Tierzellen/Expressionsvektorsystemen (d.h. Vektoren, welche die zur Steuerung der Replikation, Transcnption und Translation der TGF-ss2-kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle enthalten) können vom Fachmann in gleicher Weise verwendet werden. Beispiele hierfür sind Systeme mit viralem Expressionsvektor und Säugerwirtszelle (z. B. Cytomegaiovirus. Vaccinavirus, Adenovirus u. dgf.) :
EMI6.2
(z. B. Baculovirus) ;virale Promotor-Expressionssysteme als dem Genom von Säugerzellen (z. B. Mäuse-Metaiiothionein-Promo- ter).
Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit des verwendeten WlrtsNektorsystems können beliebige Transcriptlons- und Translationselemente aus einer Vielzahl von geeigneten Elementen verwendet werden. Wenn z. B. in einem Säugetierzellsystem kloniert
EMI6.3
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<Desc/Clms Page number 8>
quenzen verwendet werden. Diese weisen Homologien zur kodierenden Sequenz von TGF-ss2 (im wesentlichen gemäss Fig. 1 a) oder zu Teilen oder Derivaten davon auf.
In einem zweiten Versuch kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem durch Abwesenheit oder Anwesenheit bestimmter"Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Antibiotikaresistenz, Methotrexatresistenz, Transformationsphenotyp, Occlusionskörperbildung im Baculovirus, usw. ) identifiziert und selektioniert werden. Wenn z. B. die TGF-ss2-kodierende Sequenz in eine Marker-Gensequenz eines Vektors insertiert wird, können diejenigen Rekombinanten durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden, welche die TGF-ss2-kodierende Sequenz enthalten. Andererseits kann eine MarkerGensequenz zusammen mit der TGF-ss2-Sequenz unter Kontrolle desselben oder eines weiteren Promotors zur Kontrolle der TGF-ss2-kodierenden Sequenz gestellt werden.
Die Expression des Markers nach Induktion oder Selektion weist auf die Expression der TGF-ss2-kodierenden Sequenz hin.
In einem dritten Versuch kann die Transcr ! ptionsakt ! vität für die TGF-ss2-kodierende Region mit Hilfe von Hybridisierungsversuchen bestimmt werden. Beispielsweise kann polyadenylierte RNA isoliert und durch Northern Blotting analysiert werden. Hierzu wird eine zur gesamten oder teilweisen TGF-ss2- kodierenden Sequenz homologe Sonde verwendet. Ausserdem können alle Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und durch Hybridisierung mit den oben genannten Sonden verwendet werden.
In einem vierten Versuch kann die Expression des maturierten Proteinproduktes Immunologisch z. B. durch Western Blots, Immunoassays, wie der Radioimmuno-Präzipitation, enzymgebundene Immunoassays u. dgl. bestimmt werden. Der letzte Test zur Beurteilung des Expressionssystems beinhaltet die Detektion von biologisch aktiven TGF-ss2-Genprodukt. Wird das Genprodukt durch die Wirtszelle sezerniert, kann das zellfreie Medium der kultivierten transfizierten Wirtszelle auf TGF-ss2-Aktlvität getestet werden. Wird das Genprodukt nicht sezerniert, können Zell-Lysate auf die gesuchte Aktivität hin getestet werden.
In beiden Fällen können biologische Tests, wie der hierin beschriebene Wachstumsinhibitionstest oder die Stimulie-
EMI8.1
Biochem. 28 : 289-297 ; Delarco und Todaro, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75 : 4001-4005) oder ähnliche Tests verwendet werden.
Nach einmaliger Identifizierung eines Klons, welcher grosse Mengen von biologisch aktiven matunertem TGF-ss2 produziert, kann dieser Klon vermehrt und TGF-ss2 unter Verwendung bekannter Techniken gereinigt werden. Solche Verfahren sind die Immunoaffinitätsreinigung, chromatographische Methoden einschliesslich der hochauflösenden Flüssigchromatographie und andere.
BEISPIEL 1 : Klonlerung des TGF-ss2-Prekursors aus PC-3-Zellen
Die folgenden Beispiele beschreiben die cDNA-Klonierung der TGF-ss2-Prekursor kodierenden Sequenzen aus der menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3, aus der TGF-ss2 bereits früher isoliert wurde.
1. MATERIAL UND METHODEN
Die folgenden Verfahren wurden zur Klonierung von cDNAs verwendet, welche für den Human-TGF-ss2Prekursor kodieren.
1. 1. Züchtung der Zellen und Extraktion der RNA
Die menschliche prostatische Adenokarzinomzellinie PC-3 wurde in einem Tamoxifen-haltigen Medium
EMI8.2
2406-2410)Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium mit einem Gehalt von 10% fetalen Kälberserum und 6 Einhei- ten/mi Insulin gezüchtet. Alle anderen Zellinie wurden In dem gleichen insulinfreien Medium gezüchtet.
Polyadenylierte RNA wurde durch Oligo [dT]-Cellulosechromatographie Isoliert (Purchio und Fareed, 1979, J.
Vlrol. 29 : 763-769).
1. 2. Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening Doppelsträngige CDNA wurde, ausgehend von polyadenylierter RNA synthetisiert, welche aus PC-3Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Tamoxifen isoliert wurde (Maniatis et al., 1982, In Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Press, Cold Spnng Harbor, New York). cDNA-Faktionen mit mehr als 1000 Basenpaaren wurden in Lambda gt10 wie beschneben kloniert (Webb et al., 1987, DNA 6. 71-79) Die Genbank wurde zuerst mit einer [32P[-marklerten 24fach degenenerten Sonde zweifach
<Desc/Clms Page number 9>
gescreent.
Die verwendete Sonde ist komplementär zu der für die Aminosäuresequenz WKWIHEP kodierenden DNA (Sonde 1), welche in TGF-ss1 und TGF-ss2 konserviert ist :
EMI9.1
Positive Klone wurden anschliessend mit einer zweiten 128-fach degenerierten Sonde gescreent, welche zu der für die Aminosäuresequenz CFRNVQD kodierenden DNA (Sonde 2) komplementär ist ; fünf dieser sieben Aminosäuren sind spezifisch für TGF-ss2 :
EMI9.2
EMI9.3
denaturierter Kalbsthymus-DNA, 100 ug/ml Hefe tRNA und 1 mM EDTA (Maniatis et al., 1982, in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spnng Harbor, New York). Die Filter wurden bei 42 C in 2XSSC, 0, 1% NaDodSO4, viermal 30 min gewaschen.
Mehrere cDNA-Klone wurden Isoliert, welche mit beiden Sonden hybridisierten und wurden in pEMBL (Dante et al., 1983, Nuclelc Acids Res. 11 : 1645-1654) subkloniert. Ein Klon (pPC-21) mit einem 2. 6 kb Insert wurde beidstranging mit Hilfe der Dldeoxykettenabbruchmethode sequenziert, wobei verschiedene Restnktionsfragmente und Exonuklease 111- Deletionsfragmente zusammen mit spezifischen Oligonukleotidpnmern (Hemkoff, 1984, Gene 28 : 351-359) verwendet wurden. Ein weiterer Klon (pPC-14) mit einem 2. 2 kb Insert wurde teilweise sequenziert. Eine Dot-Matrixanalyse wurde auf einem IBM AT-PC unter Verwendung der Gene Pro-Software von Riverside Scientific Enterpnses (Seattle. WA) durchgeführt.
1 3. Northern Blot Analyse
EMI9.4
stry 16 : 4743-4751) fraktioniert, auf eine Nylonmembran übertragen (Hybond, Amersham) und mit einer [32P]-markierten Sonde hybridisiert. Die Hybndlslerung wurde bei 42. C In 50% Formamid mit 0, 9 M NaCI, 50 mM Natriumphosphat (pH 7, 0), 5 mM EDTA, 0, 1% NaDodS04, 4X Denhardt's Lösung, 0, 4 mg/mi HefetRNA und 0,25 mg/ml denatunerter Kalbsthymus-DNA durchgeführt. Die Filter wurden bel 65. C In O, 25X SSC, 0, 1% NaDodS04 gewaschen, getrocknet und auf einen Cronex-4-Röntgenfilm (DuPont) unter Verwendung eines Lightening Plus-Verstärkerschirms (DuPont) aufgelegt.
2 ERGEBNISSE
Eine cDNA-Genbank wurde unter Verwendung von polyadenylierter, aus Tamoxlfen behandelten PC-3Zellen isolierter RNA aufgestellt. Frühere Beobachtungen wiesen darauf hin, dass eine Tamoxifen-Behandlung zu einer 2- bis 5-fachen Zunahme der Sekretion von TGF-ss2-führt (ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410). Die Genbank wurde mit den Sonden 1 und 2 wie oben beschneben gescreent. Man erhielt fünf Klone, weiche mit beiden Sonden hybndisierten : Ein Klon (pPC-21) mit einem Insert von 2. 6 kb wurde für die Sequenzierung ausgewählt. Ein weiterer Klon (pPC-14) mit einem Insert von 22 kb wurde teilweise sequenziert.
Die DNA- und die davon abgeleiteten Ammosäuresequenzen sind In Fig 1 gezeigt. pPC-21 enthält einen einzigen offenen Leserahmen, welcher für ein abgeleitetes Polypeptid mit 442 Aminosäuren kodiert ; die 112 carboxyterminalen Aminosäuren umfassen das matunerte TGF-ss2-Monomer (in Fig la eingerahmt) Auf das erste durch den offenen Leserahmen kodierte Methionin folgt unmittelbar eine Reihe hydrophober und ungeladener Aminosäuren, charakteristisch für ein Einzelpeptid (in Flg. la durch eine Linie über der Sequenz gekennzeichnet). Weder die Nukleotidsequenz für dieses Methionin noch die Nukleotldsequenzen für die nächsten zwei Methionine Im offenen Leserahmen stehen in Übereinstimmung mit der Consensus-Sequenz für die Methionin-Startsequenz (Kozak, 1986, Cell 44283-292).
Da die Translation gewöhnlich am ersten Methionin In einem offenen Leserahmen beginnt und da zu TGF-ss1 homologe Bereiche (wie hienn diskutiert) oberhalb (in 5'-Rlchtung) des zweiten Methionins zu beobachten
<Desc/Clms Page number 10>
sind, wurde das erste Methionin versuchsweise als Startsignal für die Translation festgesetzt. Daraus ergibt sich, dass TGF-ss2 ebenso wie TGF-ss1 als Teil eines sehr viel grösseren sezernierten Prekursors exprimiert wird.
Der pPC-21-Klon enthält 467 bp oberhalb (in 5'-Richtung) des mutmasslichen Methionin-Startsignals und eine 3'-untranslatierte Region von etwa 800 bp einschliesslich einer Poly (A)-Folge. Fünfzehn Basen oberhalb davon (upstream ; in 5'-Richtung) befindet sich eine Polyadenylierungs-Signalsequenz (Proudfoot and Brownlee, 1976, Nature 263 : 211-214).
Die Nukleotidsequenz-Homologie innerhalb der kodierenden Regionen von TGF-ss1 und TGF-ss2 pPC- 21 cDNA Klonen beträgt 53%. Die für das matunerte Protein kodierenden Bereiche weisen eine 57%ige Homologie auf, während die Upstream-Prekursor-Region eine 48%ige Homologie zeigt. Nach optimaler Anordnung der beiden Sequenzen waren mehrere Nukleotidinsertionen in der TGF-ss2-Prekursor-Region, eine davon mit 75 Nukleotiden, zu beobachten. Inwiefern diese Insertionen durch Anwesenheit zusätzlicher Exons in TGF-ss2 verursacht werden, ist nicht bekannt.
Eine signifikante Homologie zwischen den DNASequenzen in den nicht-kodierenden Bereichen der beiden Klone war nicht zu zu beobachten. TGF-ss1 weist ausgedehnte G-C-reiche nicht-kodierende Bereiche auf, während TGF-ss2 ausgedehnte A-T-reiche nicht-kodierende Bereiche zeigt. Belde cDNA-Klone enthalten wiederkehrende Strukturmuster Im 3'-nichtkodierenden Bereich mit Wiederholungen in TGF-ss1, bestehend aus (Purin) CCCC (Sharpies et al., 1987, DNA 6 : 239-244) und in TGF-ss2, bestehend aus ATG oder A (Pyrimidin) (Punn).
Restriktionsanalysen vieler Klone führten zu dem Ergebnis, dass einem Klon (pPC-14) eine Kpnl- Schnittstelle im aminoterminalen Teil der für TGF-ss2 kodierenden Sequenz fehlt. Restriktionsanalysen für pPC-14 und pPC-21 sind in Fig. 1d angegeben. pPC-14 wurde mit Hilfe eines zu den Nukleotiden 277 bis 296 in Fig. 1a komplementären Primer-Oligonukleotids (20 Nukleotide) in einem Bereich von etwa 100 Nukleotiden im betreffenden aminoterminalen Ende sequenziert.
Die Ergebnisse zeigten, dass der Klon pPC- 14 eine Deletion von 87 Nukleotiden (Nukleotidpositionen 346 bis 432 in Fig. 1 a ; s. auch Fig. 1 e) enthält, welche für die fehlende Kpnl-Schnlttstelle verantwortlich ! St und durch die Sequenz AAT, dem Codon für Asparagin, ersetzt ist. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Klon pPC-14 für einen kürzeren TGF-ss2- Prekursor mit 414 Aminosäuren kodiert, welcher sich von der durch pPC-21 kodierten Sequenz lediglich durch eine Deletion der Aminosäurereste 116 bis 144 unterscheidet, die durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt sind.
Obwohl die gesamte kodierende Region von pPC-14 nicht bestimmt wurde, liegt wahrscheinlich eine vollständige Übereinstimmung mit der kodierenden Sequenz aus pPC-21 vor, da sich mit Ausnahme der Kpnl-Schnittstelle die Restriktionsmuster beider Klone decken (Fig. ld). Ausserdem wurde ein Simian-Klon kodierend für einen 414 Aminosäure grossen TGF-, 8-Prekursor mit der gleichen 29 Aminosäure grossen Deletion und Substitution nachgewiesen (s. Beispiel im Abschnitt 7, unten). Dieser Simian-Klon weist eine kodierende Sequenz auf, welche zu der des Human-pPC-21-Klons Im 5'- und 3'-Berelch der Deletion nahezu identisch ist.
Fig. 2A zeigt die abgeleitete Proteinsequenz für Human-TGF-ssl (Derynck et al., 1985, Nature 316 701- 705) im Vergleich zu der Sequenz von Human-TGF-2-442. Es wurde eine 71% ige Homologie von TGF-ss2 mit Human- TGF-ss1 im maturierten Bereich des Moleküls bestimmt (Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem., Im Druck). Der aminoterminale Teil des Prekursors oberhalb (upstream) des maturierten Moleküls zeigt eine 31% ige Homologie zwischen TGF-ssl und TGF-ss2-442. Der Dot-Matnx-Homologlevergleich in Fig. 2B ergibt eine signifikante Homologie in mehrerer spezifischen Bereichen der Proteine.
Ein Vergleich der Nterminalen Aminosäuresequenzen Im mutmasslichen Signalpeptidbereich ergibt keinerlei signiftkante Homologie.
In TGF-ss2 wird eine Slgnalsequenz-Schnittstelle nach Aminosäure 20 (Senn) und in TGF-ss1 nach Aminosäure 29 (Glycin) (Von Hetjne, 1983, Eur. J. Blochem. 133 : 17-21) vorgeschlagen. Dieser Schnittstelle folgt direkt der erste homologe Block (zwischen TGF-ss1 und TGF-ss2), der sich 34 Aminosäuren 10 3'Richtung (downstream) erstreckt. Nach Abspaltung der Signalsequenzen würden die TGF-ss1- und TGF-ss2-
EMI10.1
Position 4). Vierzehn Aminosäuren downstream von diesen mutmasslichen N-Terminus sind 19 der folgenden 21 Aminosäuren In TGF-ss1 und TGF-ss2 konserviert.
Dieser Homologiebereich ist grösser als irgendein anderer Homologiebereich 10 der C-terminalen Region, die das maturierte TGF-ss-Protein enthält. Wie aus den Flg. 2A und 2B zu entnehmen ist, zeigen sich noch mehrere Bereiche mit auffallender Homologie Im Upstream-Berelch des maturierten Proteins. Diese Domänen sind jeweils durch eine Vielzahl nichthomologer Aminosäuren voneinander getrennt.
Der TGF-ss2-Prekursor weist dre@ potentielle N-Glycosylierungsstellen an den Resten 72,168 und 269 (s Fig. la) auf. Lediglich die erste Stelle ISt In TGF-ss1 konserviert und liegt innerhalb eines grösseren Blocks konservierter Reste, woraus man entnehmen kann, dass diese Glycosylierungsstelle wichtige strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaften besitzt
<Desc/Clms Page number 11>
Nach Abspaltung der Signalsequenz würde der TGF-ss2-Prekursor 31 bzw. 59 Aminosäuren mehr als TGF-ss1 aufweisen. Ein zusätzlicher Cysteinrest in TGF-ss2 befindet sich unmittelbar upstream einer grossen nicht-homologen Aminosäuresequenz vor der Sequenz des maturierten Proteins.
Ebenso wie in TGF-ss1 findet man in TGF-ss2 die Schnittstelle für das maturierte Protein unmittelbar nach einem Bereich von 4-5 basischen Aminosäuren (s. Fig. 2A). Der maturierte Bereich enthält 9 Cysteine. Eine Konservierung von 7 der 9 Cysteine ist ein wesentliches Merkmal der verschiedenen Mitglieder der TGF-ss-Familie. Eine Bestimmung der hydropathischen Indizes für TGF-ss1 und TGF-ss2 ergab sowohl für den Prekursor als auch für die maturierte Form ähnliche Muster, wobei beide Proteine generell hydrophiler Natur sind (keine Daten angegeben).
Fig. 3A zeigt eine Korthern Blot-Analyse unter Verwendung von pPC-21 als Sonde zur Detektion von polyadenylierter RNA aus BSC-40 (einer Afrikanische-Grüne-Meerkatze-Zellinie) und tamoxifen-behandelten PC-3-Zellen. PC-3-Zellen enthalten drei Hauptgruppen von TGF-ss2-spezifischen mRNAs mit einer Grösse
EMI11.1
Transcripte und geringere Mengen der 5. 1 kb RNA (Fig. 3A, Spur 1). Es Ist zu erwähnen, dass die pPC-21Sonde unter diesen Hybridisierungsbedingungen den in diesen Zellen vorliegenden TGF-ss1-spezifischen 2. 5 kb-mRNA-Typ nicht detektiert.
Diese Ergebnisse und frühere Beobachtungen (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244) weisen darauf hin, dass BSC-40-Zellen sowohl TGF-ssl-als auch TGF-ss2-spezifische mRNAs enthalten Um dies deutlicher zu demonstrieren, wurden Northern Blots mit einem Gemisch aus gleichen Teilen TGF-ss1- und TGF-ss2-Sonden hybridisiert, welche mit gleicher spezifischer Aktivität radiomarkiert waren. Spur 1 in Fig. 3B zeigt, dass BSC-40-Zellen sowohl das TGF-ss1-spezlfische 2 5 kb-mRNAFragment als auch d ! e TGF- 2-mRNA-Typen mit 4. 1 und 6. 5 kb enthalten ; Spur 2 in Fig. 3B zeigt. dass tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen ausserdem die TGF-ss1-spezifische 2. 5 kb-mRNA enthalten.
Fig. 3B zeigt ausserdem, dass tamoxlfen-behandelte PC-3-Zellen mehr TGF-ss1-als TGF-ss2-spezifische mRNA enthalten.
Der Nachweis von TGF-ss2-spezifischen cDNA-Klonen ermöglichte ein Screening verschiedener Zelligen auf TGF-ss2-mRNA. Der Northern Blot in Fig. 4 zeigt, dass TGF-ss2-spezifische Transcripte in HBL100 (einer normalen Epithelzelllinie aus menschlicher Milch, von Dr. Greg Schutz), in MCF-7 (einer menschlichen Mammakarzinomzellinie) in SK-MEL 28 (einer Melanomzellinie) nachgewiesen werden können und KB-Zellen (eine Nasopharyngeal-Karzinomzellinie) geringe Mengen von TGF-ss2-mRNA enthalten.
BEISPIEL 2 : Klonlerung der cDNA des TGF-ss2-Prekursors aus BSC-40-Zellen
Die folgenden Beispiele beschreiben die cDNA-Klonierung der TGF-ss2-kodierenden Sequenzen aus der MSC-40-Zelllinie der Niere Afrikanischer Grüner Meerkatzen, welche TGF-ss2-spezifische mRNAs enthalten (Abschnitt 6, oben). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Simian- TGF-ss2 ähnlich wie Human-TGF-ss2 in Form eines von mindestens zwei längeren Prekursormolekülen synthetisiert wird, woraus das matunerte TGF-ss2-Molekül durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird.
1. MATERIAL UND METHODEN
Die folgenden Verfahren wurden zur Konierung der für den Simian-TGF-ss2-Prekursor kodierenden cDNAs verwendet.
1. 1. Züchtung der Zellen und RNA-Extraktion BSC-40-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. Polyadenylierte RNA wurde mit Hilfe von Oligo [dT]-Cellulosechromatographle wie beschrieben (Purchio und Fareed, 1979, J. Vlrol, 29 : 763-769) isoliert.
1 2. Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening
Doppelstrangige cDNA wurde mit polyadenylierter RNA aus BSC-40-Zellen wie beschneben hergestellt (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372) und nach Behandlung mit EcoRI-Methylase mit Oligonukleotidlinkern ligiert, welche
EMI11.2
daut und durch Chromatographie über Sephacryl S-1000 fraktioniert. cDNA-Fraktionen grösser als 750 Basenpaare wurden vereinigt und mit Lambda-gt10 ligiert, welcher zuvor mit EcoRI geschnitten wurde (Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics ;
Cold spring Harbor
EMI11.3
<Desc/Clms Page number 12>
: 227-237)rK-mK+hfl plattiert. Die Genbank wurde durch Plaque-Hybridisierung (Bentonet et al., 1977, Science 196 : 180-182) mit [32P]-markierten pPC-21- und pPC-14-Sonden gescreent. Der mit pPC-21 hybridisierende Klon pBSC-40-16 und der mit pPC-14 hybridisierende Klon pBSC-40-1 wurde isoliert und in pEMBL subkloniert. Die TGF-ss2-kodierende Sequenz aus pBSC-40-1 wurde durch Sequenzierung beider Stränge mit Hilfe der
EMI12.1
1977,pBSC-40-16 wurde teilweise sequenziert.
2. ERGEBNISSE
Man erhielt zwei Klone aus der BSC-40 cDNA-Genbank, die jeweils mit Sonden hybridisierten, welche für die kodierenden Sequenzen für den Human-TGF-ss2-442- und TGF-ss2-414-Prekursor konstruiert wurden.
Klon pBSC-40-16, welcher mit der TGF-ss2-442-Sonde hybridisierte, wurde über einen Bereich von 150 Nukleotide (Nukleotide 300 bis 450 In Fig. 1 a) sequenziert, von dem man vermutete, dass er die kodierende Sequenz des 29 Aminosäuren grossen Segmentes aus den Positionen 346 bis 432 in Fig. 1 a enthält. Die Ergebnisse zeigten, dass pBSC-40-16 in diesem Bereich für eine Aminosäureasequenz kodiert, die der korrespondierenden Sequenz im Human-TGF-ss2-442 cDNA-Klon. pPC-21, identisch ist und zeigt, dass pBSC-40-16 für einen 442 Aminosäure grossen TGF-ss2-Prekursor kodiert.
Klon pBSC-40-1, welcher mit der TGF-ss2-414-Sonde hybndislert, wurde Im gesamten kodierenden Bereich sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, daS dieser Klon für einen 414 Aminosäure grossen TGF-ss2- Prekursor kodiert, welcher mit dem Human- TGF-ss2-442-Prekursor identisch ist, mit der Ausnahme, dass die Reste 116 bis 144 von Human-TGF-2-442 deiettert und durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt sind.
EMI12.2
Die Nukleotide 346 bis 432 in Fig. 1a sind detet ! ert und durch das Asparagin-Codon AAT ersetzt Mit Ausnahme von 13 stummen Basenaustauschen sind die beiden Strukturen Im restlichen Bereich der kodierenden Sequenz absolut homolog.
BEISPIEL 3 : Expression von TGF-ss2
Die folgenden Beispiele beschreiben die Expression von maturiertem, biologisch aktivem TGF-ss2 in Chinesischer Hamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen), welche mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert wurden, das unter der regulatorischen Kontrolle der SV40-Promotorsequenz die kodierende Sequenz für maturierten Human-TGF-ss2 enthält, die downstream und Im nchtigen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz für den Simian-TGF-ss1-Prekursor ligiert ist. Die Konstruktion steuert Synthese und Sekretion von matunertem, biologisch aktivem TGF-ss2 bei einer Ausbeute von etwa 0,5 mg/l.
1. MATERIAL UND METHODEN 1. 1. Zellkultur
Chinesischer-Hamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen) mit fehlender Dihydrofolatreductase (Urlaub und Cha-
EMI12.3
S. A., 77 : 4216)mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 150 ug/ml L-Prolin vermehrt. Ausserdem waren 100 U/ml Penicillin und 100 Jlg/ml Streptomycin enthalten. Die CHO-Transfektanten wurden in Dulbecco's modifiziertem EagleMedium mit den oben beschriebenen Zugaben vermehrt. CHO-Zellen und deren Derivate wurden routine- mässig durch Trypsinisierung bei einem Teilungsverhältnis von 1 : 5 überführt.
Methotrexat (Sigma, MO) wurde mit einer Stammkonzentration von 10 mg/mi In Wasser hergestellt.
Verdünnte NaOH (0, 2 M) wurde zur Solubilisierung des Wirkstoffs hinzugegeben (pH-Endwert von 6). Die Stammlösung wurde filterstenlrslert und bei -20 C aufbewahrt. Die Stammlösungen von Methotrexat Im Medium (100 u. M) wurden bel 4 C nicht länger als 1 Monat aufbewahrt 1. 2.DNA-ManipulationenundPlasmidkonstruktionen Restnktlonsenzyme, T4 DNA-Lgase, Phosphatase aus Kälberdarm, das Klenow-Fragment der DNAPolymerase I und andere DNA-Reagentlen wurden von Bethesda Research Laboratories, MD. bezogen.
Standard-DNA-Manipulationen wurden nach T. Maniatis, et al., 1982. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, New York, durchgeführt.
Das Plasmid pSV2-(ss1-TGF-dhfr). welches die Simian-TGF-ss1-cDNA und das Maus-dhfr-Gen In Tandemposition und ebenso die SV40-Zwischensequenz enthält, wurde wie beschrieben hergestellt (Gentry et
<Desc/Clms Page number 13>
al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418).
Das Plasmid pSV2/ss1-ss2/dhfr wurde gemäss Absatz 8. 2. hergestellt.
1. 3. DNA- Transfektionen
Etwa 24 h nach Aufbnngen von 106 dhfr-negativen CHO-Zellen auf 100 mm-Platten, wurden die Kulturen mit 20 ug Ndel-linearisiertem-pSV2-(ss1-TGF-dhfr)-Plasmid in Form eines Calciumphosphatpräzipi-
EMI13.1
der linearisierten DNA zu 1 ml einer sterilen CaCl2-Lösung (250 mM) hinzugefügt. 1 ml einer 2X HEPESLösung (280 mM NaCl. 50 mM HEPES, 1, 5 mM Natriumphosphat, pH 7, 1) wurde anschliessend tropfenwetse hinzugefügt und das Gemisch 30 min in Eis aufbewahrt. Das Präzipitat wurde anschliessend tropfenweise in 10 ml eines die Zellen enthaltenden F12-Mediums dispergiert. Nach 4-stündiger Inkubation bel 37. C wurde das Medium entfernt und durch 10 ml F12-Medium mit 25% Glycenn 90 s lang bei Raumtemperatur ersetzt.
Die Zellen wurden einmal mit 20 ml F12-Medium gespült und weitere 48 h in nicht-selektivem F12Medium (20 ml) inkubiert. Die Selektion der dhfr-exprimierenden Transfektanten erfolgte durch Substitution des Mediums mit einem DMEM-Supplement mit 10% dialysiertem FBS (Gibco, N. Y.) und 150 u. g/ml LProlin. Kolonien wurden nach 10- bis 14-tägiger Kultivierung der Zellen im Selektionsmedium erhalten. Zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Pasteurpipette aufgesaugt und vermehrt.
1. 4 Selektion von Methotrexat-resistenten Zellen
EMI13.2
anschliessend bel 5facher Methotrexat-Konzentration auf 100 mm-Platten aufgebracht. Platten, die sichtbare Kolonien enthielten, wurden erneut trypsmisiert und auf das Methotrexathaltige Medium eingestellt. Zellen wurden in verschiedenen Stadien der Amplifikation in einem Medium mit 40% FBS, 10% Dimethylsulfoxid und 50% DMEM eingefroren. Methotrexat war 10 den Gefriermedien nicht enthalten.
1. 5. Wachstumsmh) bit ! onstest Mink-Lungenepithelzellefl, Mv 1 Lu (Hinterlegungsnummer CCL-64, American Type Culture Collection) mit hoher Sensitivität für TGF-ss1 wurden im Wachstumsinhibitionstest verwendet. Zur Bestimmung der
EMI13.3
Zum Nachweis der Sekretion von aktivem TGF-ss2 aus transfizlerten Zellen wurde serumfreier Überstand konfluenter Zellkulturen Innerhalb von 24 h abgetrennt und ausgiebig gegen 0, 2 M Essigsäure dialysiert. Essigsäure wurde durch Lyophilisierung abgetrennt und die Proben in sterilem vollständigem Kulturmedium zur Verwendung Im Test gelöst.
2. Konstruktion des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens zur TGF-ss2-Expression
Ein Hybrid TGF-Beta-Prekursor-Gen, bestehend aus der Slmian- TGF-ss1-kodierenden Prekursorsequenz und der 5'-untranslatierten Sequenz und der im nchtigen Leserahmen daran gebundenen kodierenden Sequenz für maturierten Human-TGF-ss2 und der 3'-untranslatierten Sequenz wurde gemäss der Darstellung 10 Fig 1c konstruiert. pPC-21 wurde zuerst m ! t EcoRt verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, das 2. 3 kb-Fragment mit Hincll-verdautem pEMBL ligiert und zur Transformation von E.coli verwendet.
Zwei Klone. pPC-21/Hincll+ und pPC-21 Hincll-mit den Inserts in jeweils entgegengesetzter Orientierung wurden zur Erzeugung überlappender Exolll-Fragmente durch jeweiligen Verdau mit Sstl und BamHI. gefolgt von Exolll-Verdau, Klenow-Behandlung, erneuter Ligierung der DNA und Transformation von E. coll verwendet Zwei Klone, Exo 5. 9 und Exo 25C wurden mit unterschiedlich langen 5'- bzw. 3'-Sequenzen gefunden und 10 pEMBL zur Erzeugung von pEMBL 5. 9 und pEMBL 25C subkloniert. pEMBL 5. 9 wurde mit Hindlll verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt, mit Kpnl verdaut und daraus das 0. 6 kb-Fragment (Fragment 1) isoliert.
Exo 25C wurde mit
<Desc/Clms Page number 14>
EcoRI und Kpnl verdaut und daraus das 1. 1 kb-Fragment (Fragment 2) isoliert. pGS62 wurde mit BamHI verdaut, mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit EcoRI verdaut und mit den Fragmenten 1 und 2 ligiert (pGS62 wurde aus pGS20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49 : 857) durch Deletion einer einzelnen EcoRIschnittstelle erzeugt). Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli verwendet, woraus pGS62/CIFB isoliert wurde. pGS62/CIFB wurde mit Pstl und EcoRI verdaut, daraus das 1600 bp-Fragment isoliert und nochmals mit Xholl verdaut. Das daraus resultierende 400 bp grosse Fragment Xholl-EcoRI wurde isoliert (Fragment 3). pSV2-beta-TGF (Gentry et al, 1987, Mol. Cell.
Biol. 7 : 3418) wurde mit Apal und EcoRI verdaut und daraus das 300 bp grosse Fragment isoliert (Fragment 4).
Zwei komplementäre DNA-Stränge mit den unten angegebenen Sequenzen wurden synthetisiert, phosphoryliert, anneliert und mit den oben beschnebenen Fragmenten 3 und 4 ligiert.
'5CAACATCTCCAAACCTCCCGGCACCGCCGAGCTTTG
GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT
TGC TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG 3'
5'GATC CCT CTT GAA ATC AAT GTA AAG TGG ACG TAG GCA
GCA ATT ATC CTG CAC ATT TCT AAA GCA ATA GGC CGC
EMI14.1
Das Plasmid pss1Iss2 wurde mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt, mit Hindlil geschnitten und daraus das 1600 bp-Fragment isoliert; pSV2,ss1/ss2 wurde durch Insertion dieses Fragmentes in pSV2, neo, welches zur Entfernung des neo-Gens zuvor mit Hindi und Hpal verdaut wurde. pSV2, ss1/ss2 wurde mit Pvul und EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit Ndel verdaut und daraus das 2. 6 kb (circa) Ndel-EcoRI-Fragment isoliert und mit psV2, dhfr ligiert, welches zuvor mit
EMI14.2
ss2/dhfr isoliert.
3. Expression von TGF-ss2 in CHO-Zellen pSV2/ss1-ss2/dhfr wurde zur Transfektion von dhfr-negativen CHO-Zellen verwendet und dhfr-ampliflzier- te Zellen wurden aus den primären Transfektanten, wie in Material und Methoden beschrieben, hergestellt
Positive Klone wurden mit Hilfe des Bioassays (Inhibition der Mink-Lungenepithelzellen (CCL-64)) wie beschrieben nachgewiesen (Gentry et al.. 1987. Mol. Cell. Biol. 7:3418). Rekombinante Proteine wurden mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung eines Antipeptid-Antiserums gegen die Sequenz NH2- YNTINPEASASPC-COOH (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418), die in matunertem TGF-ss2 zu finden ist, nachgewiesen.
Eine ine Zellinie 1ss9. 12.5. ergab eine Sekretion von 240 ng/ml TGF-ss2 (Fig. 5). Diese Zellinie wurde anschliessend durch verdünnung 10 Mikrotiterplatten (96 wells) klontert Der Klon 1ss9, 12.5, cl 36, produzierte annähernd 500 ng/ml des Faktors (Flg. 5).
Eine Analyse des von diesem Klon sezernierten Proteins mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung des Antipeptid-Antiserums ist in Fig. 6 gezeigt. Daraus Ist zu entnehmen, dass sowohl das maturierte 24kd TGF-ss2-Dimer als auch die grössere (annähernd 90kd) Prekursorform nachgewiesen werden konnte HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Die folgenden Mikroorganismen wurden bel der Agncultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)
hinterlegt und mit folgenden Hinterlegungsnummern bezeichnet
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb>
<tb> Mikroorganismen <SEP> Plasmid <SEP> Hinterlegungs-Nummer
<tb> Escherichia <SEP> co <SEP> li <SEP> HB101 <SEP> pPC-21 <SEP> B-18256
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pPC-14 <SEP> B-18333
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-1 <SEP> B-18335
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-16 <SEP> B-18334
<tb> Chinese <SEP> Hamster <SEP> Ovary <SEP> pSV/ss1-ss2/dhfr
<tb>
EMI15.2