FR2598433A1 - Procede de production d'interleukine-2 humaine, interleukine-2 ainsi obtenue, son utilisation a titre de medicament et composition pharmaceutique la contenant - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UNE SEQUENCE ADN CODANT POUR L'INTERLEUKINE-2 HUMAINE ET UNE SEQUENCE PEPTIDE SIGNAL COMPRENANT UN GENE CODANT POUR L'INTERLEUKINE-2 HUMAINE ET UNE SEQUENCE PEPTIDE SIGNAL DANS LAQUELLE LES SEQUENCES 5 NON CODANTES DU GENE ONT ETE REMPLACEES PAR DES SEQUENCES 5 NON CODANTES HETEROLOGUES. DE PLUS L'INVENTION CONCERNE DES VECTEURS RECOMBINANT COMPRENANT UNE TELLE SEQUENCE ADN ET DES CELLULES DE MAMMIFERE CONTENANT UNE TELLE SEQUENCE D'ADN OU UN VECTEUR RECOMBINANT LE CONTENANT. L'INVENTION CONCERNE EN OUTRE UN PROCEDE DE PRODUCTION D'INTERLEUKINE-2 HUMAINE, L'INTERLEUKINE-2 HUMAINE POUVANT ETRE OBTENUE PAR CE PROCEDE ET L'UTILISATION DE L'INTERLEUKINE HUMAINE POUR LE TRAITEMENT ET LA PREVENTION DE MALADIES. EN OUTRE L'INVENTION CONCERNE DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT UNE TELLE INTERLEUKINE-2 HUMAINE.

Description

-1 Le développement des procédures de recombinaison d'ADN, qui sont

souvent appelées manipulations génétiques ou ingénierie génétique ont rendu possible la production d'une grande variété de produits biolo5 giques. Dans les procédures courantes de recombinaison d'ADNdes séquences spécifiques d'ADN sont insérées dans un véhicule ADN approprié, ou vecteur, pour former des molécules d'ADN r-combinantes qui peuvent se reproduire dans des cellules hôtes. Des molécules d'ADN cir10 culaires à double brin appelées plasmides sont souvent utilisées comme vecteurs, et la préparation de telles formes d'ADN recombinant impose l'utilisation d'enzymes endonucléases de restriction qui peuvent couper l'ADN en des sites spécifiques de la séquence de base. Des 15 procédés généraux de préparation de telles molécules d'ADN recombinantes ont été décrits par Cohen et al. (Brevet US n0 4 237 224), Collins et al. (Brevet US n 4 304 863) et Maniatis et al (Clonage Moléculaire: Un

manuel de laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor 20 Laboratory).

Des molécules d'ADN recombinantes peuvent être utilisées pour produire le produit pour le-quel elles sont codées par insertion de la séquence du gène seulement si un certain nombre de conditions sont rem25 plies. Il y a tout d'abord la nécessité que la molécule -2 recombinante soit compatible avec la cellule hôte, et

soit ainsi capable de réplication autonome en elle.

Beaucoup de travaux récents ont utilisé la bactérie Escherichia coli (E. coli) comme organisme hôte parce qu'elle est compatible avec une large gamme de plasmides recombinants. En fonction du système vecteur/cellule hôte utilisé, la molécule d'ADN recombinant est introduite dans l'hôte par transformation, transduction ou transfection. La simple insertion d'un vecteur recombinant dans une cellule hôte n'assurera pas elle-même que des quantités significatives du produit du gène désiré seront produites. Pour que cela se produise, il faut que la séquence de gène étranger soit soudée en relation 15 correcte avec une région de signal du vecteur appelée un promoteur. En alternative, l'ADN étranger peut apporter avec lui son propre promoteur, dans la mesure o il est reconnu par l'hôte. Quelle que soit son origine, le promoteur est une séquence d'ADN qui est "en amont" de, 20 ou en d'autres termes en 5' avant le gène étranger qui doit être exprimé. Cette séquence dirige la fixation de la polymérase ARN et "provoque" ainsi la transcription

de l'ADN en ARN messager (ARNm).

Pour une initiation forte donnée qui peut fournir de grandes quantités d'ARNm, la production ultime du produit de gène souhaité dépendra de l'efficacité du transfert d'ARNm en protéine. Ceci, à son tour dépendra de l'efficacité de la liaison du ribosome à 1'ARNm et de la stabilité de l'ARNm dans la cellule hôte. 30 Dans les cellules eucaryotes on comprend mal les facteurs gouvernant l'efficacité de transfert, mais il semble qu'ils comprennent une séquence favorable d'acide nucléique entourant un codon AUG qui initie le transfert [Kozak, Cell 44: 283 (1986)]. Des facteurs affec35 tant la stabilité de l'ARNm, qui sont mal compris, à la 3 fois dans les cellules procaryotes et eucaryotes, sont aussi critiques du point de vue quantité de protéine

produite qui peut être obtenue.

La plupart des travaux dans le domaine de 5 d'ADN recombinant s'est focalisé jusqu'à présent sur l'utilisation de systèmes d'expression bactériens tels que E. coli. Maintenant, l'utilisation de cellules bactériennes présente un certain nombre d'aspects indésirables. Par exemple, la plupart des protéines 10 et polypeptides produits dans E. coli s'accumulent dans l'espace périplasmique. La récupération de ces produits de gène nécessite ainsi la rupture des cellules, un processus qui est inefficace et conduit à un sérieux problème de purification, puisqu'il faut séparer le pro15 duit souhaité des nombreux autres constituants cellulaires d'E. coli. Ainsi la bactérie ne peut réaliser la glycosylation qui est nécessaire pour compléter la synthèse de nombreux produits génétiques intéressants. De plus les bactéries peuvent être incapables de former les liaisons spécifiques disulfure qui sont essentielles à la conformation correcte et à l'activité biologique de

nombreuses protéines eucaryotes.

Pour surmonter ces défauts dans les systèmes d'expression bactériens, l'attention des ingénieurs gé25 néticiens s'est tournée de plus en plus vers l'utilisation de cellules hôtes eucaryotes pour l'expression de molécules d'ADN recombinantes. Des cellules telles que levure et cellules de mammifère peuvent sécréter les produits génétiques souhaités dans le milieu de culture 30 et peuvent réaliser aussi bien les processus essentiels de glycojylation. Maintenant l'utilisation de cellules de mammifère pour le clonage et l'expression de molécules d'ADN recombinantes pose aussi un grand nombre d'obstacles techniques qu'il faut surmonter. Par exem35 ple, les plasmides endogènes qui se sont révélés si -4 utiles dans les bactéries ne sont pas répliqués par les cellules eucaryotes supérieures. En conséquence,

il faut avoir d'autres approches.

Une approche a été d'utiliser la levure eucaryote inférieure, Saccharomyces cerevisiae, qui peut être cultivée et manipulée avec la même facilité

que E. coli. Des systèmes de clonage de levure existent.

Grâce à l'utilisation de tels systèmes on a obtenu l'expression efficace dans la levure d'un gène de l'interféron humain [Hitzeman et al., Nature, (Londres) 293:717 (1981)]. Cependant les gènes de l'interféron ne possèdent pas d'introns. Puisqu'il a été trouvé que les cellules de levure ne transcrivent pas correctement au moins un gène de mammifère hétérologue qui contient 15 des introns, à savoir le gène de e-globine du lapin [Beggs et al., Nature (Londres) 283:835 (1980)], il faut prendre en considération la présence ou l'absence d'introns quand la levure est utilisée comme hôte pour

l'expression d'un gène de mammifère.

Dans une autre approche, des gènes étrangers ont été incorporés dans des cellules de mammifères au moyen d'une absorption directe. Ceci a été obtenu, par exemple, par coprécipitation par le phosphate de calcium de gènes clones, ce procédé permettant à 1-2 % des 25 cellules d'absorber l'ADN. Un tel faible niveau d'absorption, cependant, produit seulement un très faible

niveau d'expression du produit génétique souhaité.

Lorsqu'on peut trouver des cellules de mammifères avec absence de gène thimidine kinase (cellules tk-), de meilleurs résultats peuvent être obtenus en utilisant une co-transformation avec le gène tk suivie d'une croissance dans des conditions sélectives. Les cellules tk ne peuvent pas se développer dans un milieu HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine). Elles peuvent regagner 35 leur activité enzymatique perdue par absorption d'un -5 ADN exogène contenant le gène tk (tel que l'ADN viral simplex de l'herpès) par co-précipitation de phosphate

de calcium. D'autres molécules d'ADN liées par covalence à l'ADN tk ou simplement mélangées à lui seront aus5 si absorbées par les cellules et seront souvent coexprimées (voir Scangos et al., Gene 14: I (1981)].

Dans une troisième approche, des génomes viraux ont été utilisés comme vecteurs de l'introduction de gènes étrangers dans des cellules de mammifère. Des 10 vecteurs basés sur les génomes de virus Simien 40, de papilloma-virus et d'adénovirus ont été décrits [voir P.W.J. Rigby, "Expression de Gènes Clonés dans les Cellules Eucaryotes Utilisant des Systèmes Vecteurs Dérivés de Répicons Viraux" in Genetic Engineering, 15 Vol. 3, R. Williamson, ed. Academic Press, New York,

pp. 83-141 (1982) pour une synthèse]. Ces systèmes de vecteurs cependant, souffrent de l'inconvénient d'un dimaine limité de cellules hôtes. De plus la réplication virale dans ces systèmes conduit à la mort de la 20 cellule hôte. Seule l'utilisation d'éléments de contrôle d'ADN rétroviral évite de nombreux inconvénients de ces systèmes de vecteur viral. Gorman et al. [Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777 (1982)] ont montré, par exemple, que la longue terminaison répétitive (LTR) du virus du sarcome de Rous est un promoteur efficace et qu'il peut être introduit dans une grande variété de cellules, y compris les cellules CV-1 de rein de singe, les fibroblastes d'embryon de poulet, les cellules d'ovaire de hamster chinois, les cellules HeLa et les cel50 lules NIH,53T3 de souris par transfection au moyen d'un ADN. L'évidence de la régulation de l'expression de gène par les séquences non codantes 5' et 3', ce qui

signifie les séquences directement avant, respective35 ment après la séquence codante d'un gène vient de l'é-

-6 tude d'encogènes et d'ARNm de cellules eucaryotes supérieures. Les effets de l'élimination ou de la modification de ces séquences sur l'expression de gène dans ces cellules ont été observés. Par exemple, Treisman [Cell 42: 889 (1985)] a étudié l'accumulation ARN c-fos après la stimulation par du sérum de fibroblastes de souris dans lesquels un gène humain cloné c-fos (l'homologue cellulaire de l'oncogène porté par le virus de l'ostéosarcome murin FBJ désigne par c-fos) a été transfecté. 10 D'ordinaire, la stimulation par du sérum de telles cellules provoque une augmentation forte mais transitoire d'ARNm c-fos qui atteint un maximum pendant 10 à 15 minutes et décroît rapidement après, atteignant les

niveaux d'avant la stimulation en 1 à 2 heures à cause 15 de la dégradation rapide de l'ARNm.

Quand les séquences 5' contiguës de c-fosH sont liées aux gènes hétérologues en l'absence des

1 H

séquences contigu8s normales 3' de c-fos, cependant, les gènes résultant sont encore induits par des fac20 teurs du sérum mais l'ARNm ainsi produit persiste encore pendant 4 heures après la stimulation par le sérum. Des expériences avec des unités de transcription hybrides montrent que seulement les gènes contenant l'extrémité 3' du gène c-fos et les régions non co25 dantes 3' présentent la dégradation rapide typique d'ARNm qui suit la stimulation. Il se peut en sorte

que les séquences c-fos 3' agissent pour déstabiliser un ARN qui les contient. L'élimination ou la modification de ces séquences peut avoir un effet positif sur 30 l'expression du gène.

Une autre évidence du rôle régulateur des séquences non codantes 3' vient des études de Simcox et al. [Mol. Cell. Biol. 5: 3397 (1985)] sur le système de protéine choc thermique de Drosophila melano35 gaster. Quand on déplace Drosophila melanogaster de -7 son lieu de croissance à température ambiante à 37 0C, elle produit rapidement un certain nombre de protéines "choc thermique", parmi lesquelles il y a une protéine majeure appelée hsp 70. L'augmentation de température 5 induit une production accrue d'ARNs. Après un retour aux températures normales de croissance, la transcription du gène hsp 70 est rapidement freinée et le niveau d'ARNm correspondant décline rapidement, arr9tant ainsi rapidement toute autre production de la protéine hsp 70. 10 Simcox et al. trouvent cependant que le freinage rapide de la synthèse de la protéine hsp 70 après suppression du choc thermique est retardé quand les séquences 3' ont été supprimées, ce qui suggère que les séquences 3' agissent normalement pour déstabiliser l'ARNm de hsp 70 15 après la chute de température À L'évidence d'un rôle de régulation d'ARNm a été aussi déterminée pour des séquences 5' non codantes. Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)] ont montré qu'une séquence non codante 5' contenant en20 viron 550 nucleotides (désignée par exon 1) du gène humain c-myc (l'homologue cellulaire du virus oncogène aviaire de myelocytomatose) affecte l'expression de plasmides portant ce gène dans des cellules CV1 de rein de singe transformées avec un virus Simien 40 défec25 tueux d'origine (désignées par cellules COS). Des transcriptions à partir de plasmides dans lesquels les séquences 5' non codantes du gène c-myc ont été supprimées ont été trouvées présentes à un niveau d'équilibre plus élevé que les transcriptions à partir de plasmides 30 portant le gène intact, ce qui suggère que les séquences non codantes 5' d'une certaine manière agissent en

déstabilisant 1'ARNm correspondant.

Dans une autre étude, Rabbitts etal. [EMBO J. 4: 3727 (1985)] ont montré que l'amputation de l'exon I du gène c-myc provoque une augmentation de la -8

stabilité de l'ARN c-myc dans les cellules COLO 320.

De manière similaire, Eick et al. [EMBO J. 4: 3717 (1985)] ont démontré que les ARNm c-myc produits dans les cellules de lymphome de Burkitt sont beaucoup plus stables quand le gène c-myc correspondant contient

une translocation dans l'exon 1.

Les références ci-dessus suggèrent toutes que les régions non-codantes 5' et 3' d'une grande variété de gène peuvent d'une certaine mesure produire 10 de l'instabilité dans les ARNm transcrits à partir de

ces gènes. La suppression ou l'altération de ces régions non-codantes produisent une stabilité augmentée de l'ARNm, et donc, un niveau général accru d'expression de gène.

Actuellement l'effet de la modification ou

de la suppression de telles séquences non codantes sur l'expression du gène ne peut être prévue avec sécurité.

Par exemple, Johansen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 81: 7698 (1984) ] ont fait varier la 20 longueur de la région de tête non codante dans un système vecteur recombinant contenant les éléments de contrôle du gène lié au gène galactokinase (gaiK)

d'Escherichia coli. La variation en longueur de la région non codante n'a pas d'effet sur l'expression de 25 galK. De manière similaire, Katz et al. [Mol. Cell.

Biol. 6: 372 (1986)] on introduit à la fois des suppressions et des substitutions dans le leader 5' non décalé des ARNm rétroviraux aviaires. En général, ces suppressions et substitutions ont causé une diminution 30 sensible dans l'expression du gène env. Ces diminutions dans l'expression, cependant, n'ont pas été dues à des réductions dans le nombre de molécules d'ARNm. Il apparaît, par contre que les changements dans les régions non codantes oi causé une déficience en transfert

qui a conduit à la réduction globale de l'expression.

-9 J'interleukine-2 (IL-2) est une protéine soluble qui est capable de moduler la réactivité de lymphocyte et de promouvoir la culture in-vitro à long terme de lymphocytes T antigènes spécifiques. Dans le 5 passé, IL- 2 a tout d'abord été isolée du liquide surnageant de cultures de cellules de mammifères stimulées par mitogène. Par exemple, Morgan et al. [Science 193: 1007 (1976)] et Ruscetti et al. [J. Immunol. 119: 131 (1977)] ont isolé l'IL-2 de liquides surnageants 10 réunis sur des lymphocytes humains normaux stimulés par la phytohémagglutinine (PHA), tandis que Gillis et al. [Nature 268: 154 (1977)] ont utilisé des cellules de rate normales de souris DBA/2 stimulées avec de la concanavaline A comme source de protéine. Plus 15 récemment, Stern [Brevet des Etats-Unis n0 4 490 289] a décrit l'utilisation de cellules malignes stimulées

comme source de IL-2.

On s'est aussi efforcé de produire de

l'IL-2 à l'aide de la méthoologie d'ADN recombinant.

Par exemple, Taniguchi et al. [Nature, 302: 305 (1983)] ont décrit l'analyse de la séquence, le clonage et l'expression d'un ADN complémentaire (C-ADN) codant pour l'IL-2 humaine préparé à partir de l'APdE messager de la lignée de cellules leucémiques de Jurkat. L'ex25 pression d'IL-2 a été réalisée par Taniguchi et al. dans des cellules COS de singe cultivées bien que les auteurs affirment que le travail sur l'expression d'IL-2 utilisant un vecteur ADN recombinant dans E. coli était en cours, et qu'à partir du système E. coli 30 il serait bientôt possible de produire IL-2 en grandes quantités. IL-2 est synthétisée dans la cellule sous

forme d'un précurseur polypeptide avec 153 amino-acides.

Lors de la sécrétion par la cellule,une séquence de peptide signal longue de 20 amino-acides est amputée. 35 L'IL-2 mature est sécrétée par la cellule sous forme -10 d'un polypeptide avec 133 aminoacides. Pour l'expression de l'IL-2 mature dans E. coli,la sous-séquence codant la séquence peptide signal du gène codant pour l'IL-2 doit être éliminée par la méthodologie d'ADN recombinant, puisque E. coli n'est pas capable d'amputer des séquences peptide si&nal eucaryote. Rosenberg et al. (Science 223:1412 (1984.) ont aussi exprimé l'IL-2 chez E. coli, enr utilisant un

gène isolé à partir de la lignée de cellule Jurkat.

Plus récemment, Souza et al (Demande de Brevet Européen n A1 136 489) ont décrit le clonage et l'expression dans des microorganismes de séquences ADN synthétisées chimiquement comprenant des gènes structuraux codant pour un polypeptide ayant la séquence d'amino-acides et les propriétés de l'IL-2 mature. Souza et al décrivent aussi l'utilisation de gènes synthétiques pour produire des analogues d'IL-2 qui diffèrent dans la séquence des amino-acides de l'IL-2 naturelle. Dans

les exemples fournis dans la demande de brevet de Souza 20 et al., E. coli est l'organisme hôte.

Barr et al [Demande de Brevet International

n 85/02200] ont décrit récemment le clonage et l'expression d'un gène humain synthétisé chimiquement d'IL2 dans la levure.

La présente invention concerne une séquence d'ADN codant pour l'interleukine-2 humaine HIL-2) et une séquence peptide signal comprenant un gène codant pour HIL-2 et une séquence peptide signal dans lesquels les séquences 5' non codantes du gène ont été rempla30 cées par des séquences 5' non-codantes hétérologues,

par exemple par celles d'un gène d'insuline de rat, de préférence par celles du gène de rat preproinsuline II.

C'est dans le cadre de l'invention de remplacer en plus les nucléotides adjacents de la sous-séquence codant

pour la séquence peptide signal par des séquences hété-

-11 rologues correspondantes, c'est-à-dire par les nucléotides de la sousséquence codant pour la séquence peptide signal adjacente aux séquences 5' non-codantes hétérologues mentionnées ci-dessus. Dans le cas o des nucléotides de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal sont remplacés il faut faire attention, à ce que le cadre de lecture du gène HIL-2 soit maintenu.De plus l'invention concerne des vecteurs recombinants comprenant une séquence ADN comme définie ci10 dessus et une cellule de mammifère contenant une telle

séquence d'ADN ou un vecteur recombinant la contenant.

L'invention concerne en plus un procédé de production d'interleukine-2 humaine, une interleukine-2 humaine en soi obtenue par ce procédé et l'utilisation de l'interleukine-2 humaine pour le traitement et la prévention de maladies. De plus l'invention concerne des

compositions pharmaceutiques contenant une telle interleukine-2 humaine.

De manière surprenante des niveaux élevés d'expression du gène HIL-2 sont obtenus grâce à l'utilisation de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans lesquels les séquences 5' non codantes naturelles et les quatre premiers nucléotides ATG T de la sousséquence codant pour la séquence peptide signal du gène 25 HIL-2 ont été remplacées par des séquences hétérologues correspondantes du gène insuline de rat, à savoir par les nucléotides ATG GCCCTGTGGATCG de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal de préproinsuline II de rat. Les modifications résultantes à la terminai30 son N du peptide signal HIL-2 n'a pas d'effet sur le polypeptide HIL-2 mature sécrété par les cellules de production puisque le peptide signal est coupé pendant

le processus de maturation.

La présente invention peut être plus facile35 ment comprise en faisant référence aux figures suivantes -12 (non dessinées à l'échelle) dans lesquelles FIG 1 est une représentation schématique du plasmide pBC12MI, le vecteur de départ pour la construction du vecteur d'expression de la HIL-2; FIG 2 représente la structure de la terminaison N du nouveau peptide signal dans le plasmide pBCI2/RSV/IL-2 et les séquences insuline et HIL-2 utilisées pour constnire le plasmide. Les sites spécifiques de restriction et de ligation sont soulignées; 10 FIG 3 est une représentation schématique du vecteur final d'expression de IL-2, pBC12/RSV/IL-2/ dhfr; et FIG 4 représente la séquence de nucléotide enlevée du plasmide pBC40 par mutagénèse spécifique de site pour la construction de pBC40LT. Les segments soulignés délimitent le primer à 24mères utilisé pour réaliser la suppression, qui crée un nouveau site HindIII. Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes en séquence logique: (1) préparation d'une séquence d'ADN codant pour HIL-2 et d'une séquence peptide signal, (2) remplacement de séquences 5' non codantes et si possible des nucléotides adjacents de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal par des séquences correspondantes, de préférence par celles du gène de rat préproinsuline II,

de telle manière que le cadre de lecture de la région codant pour HIL-2 soit maintenu (3) transfert du vecteur recombinant comprenant la nouvelle séquence d'ADN 30 dans une cellule hôte de mammifère appropriée, (4) reproduction du nouveau gène HIL-2 et sélection des cellules hôte de mammifère modifiées, et (5) identification et purification de la HIL-2 produite.

Comme il est utilisé ici, le terme "inter35 leukine-2 humaine" ou "HIL-2" représente une protéine -13

glycosylée qui est produite par une cellule de mammifère qui a été transformée ou transfectée avec une séquence ADN ci-dessus ou par une de ses modifications.

La séquence ADN code une protéine ayant: (a) une sé5 quence amino-acide qui est au moins sensiblement identique à la séquence amino-acide d'une interleukine-2 humaine naturelle et (b) a une activité biologique qui est celle de l'interleukine-2 humaine naturelle. Une identité sensible des séquences amino-acide signifie que les séquences sont identiques ou diffèrent par une ou plusieurs altérations d'amino-acide (suppressions,

additions ou substitutions) qui ne causent aucune différence fonctionnelle contraire entre la protéine synthétique et l'interleukine-2 humaine.

Des exemples de telles protéines sont les molécules d'interleukine-2 décrites dans les Demandes de Brevet Européen n 82 50 7036.2 et 83 101035.0 et les Brevets US 4 518 584 et 4 569 790. Ces polypeptides

interleukine-2 sont produits dans des systèmes bacté20 riens sous forme mature.

Une séquence ADN codant pour l'interleukine2 humaine et une séquence peptide signal peut être préparée par l'un quelconque des procédés utilisés habituellement dans la technique. Par exemple, une lignée 25 de cellule humaine capable de synthétiser HIL-2 peut être stimulée pour faire HIL-2 ARNm qui peut servir de gabarit pour faire HIL-2 ADNc. Rosenberg et al. (Science 223:1412 (1984)] ont utilisés une lignée de cellule-T leucémique et de lymphocytes de sang périphérique pour 50 préparer un tel ADNc. Taniguchi et al. [Nature 502:

505 (1983)] ont utilisé 'me cellule-T leucémique humaine dans ce but.

En alternative,puisque Taniguchi et al. ont décrit la séquence de nucléotides, la séquence ADN co55 dant pour HIL-2 et une séquence de peptide signal -14 peuvent être synthétisées chimiquement en utilisant la méthode au phosphotriester ou une autre, de préférence dans un système à phase solide. Une telle synthèse chimique a été décrite par Souza et al. [Demande de Brevet Européen N AI 136 489]. En synthétisant des nucléotides relativement petits et en les liant ensemble, Barr et al. [ Demande de Brevet International N W0 85/02200] ont aussi préparé un gène HIL-2. Par un autre procédé, un ADN de génome pourrait être isolé 10 à partir d'une cellule humaine capable de produire HIL-2. Le gène HIL-2 pourrait être identifié par des procédés standard d'hybridation en utilisant une sonde ADN marquée basée sur la séquence publiée du gène

HIL-2.

Dans un mode de réalisation de l'invention le plasmide pIL-2-2b, qui contient une copie ADNc de toute la région codante 459bp de HIL-2 contiguë à 31 bp de la séquence 5' non décalée et à 309 bp de la séquence 3' non décalée, a été utilisé comme source de la séquence ADN codant pour l'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal. Le clonage de cette copie de HIL-2

ADNc dans le plasmide pIL-2-2b a été décrit par Smith et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8404 (1985)].

A cause du procédé utilisé pour cloner le gène HIL--2, 25 l'ADNc est encadré par des séquences homopolymères G-C

suivies de sites BamHI.

Le remplacement de séquences 5' non codantes et si possible des nucléotides adjacents de la sousséquence codant pour la séquence peptide signal de HIL-2 et l'insertion de la séquence ADN résultante dans un vecteur d'exp.ession approprié sont facilement réalisés quand les séquences requises d'ADN et le vecteur cloné ont été coupés avec la (ou les) même(s) enzymeS) de restriction, puisqu'on obtient ainsi des fragments avec des groupes terminaux complémentairesde l'ADN, qui -15 peuvent être facilement liés l'un à l'autre. Si cela ne peut pas être réalisé, il peut être nécessaire de modifier les extrémités coupées, par exemple en faisant digérer à nouveau l'ADN monobrin pour produire des ex5 trémités rognées. Le même résultat peut être obtenu en complétant les groupes terminaux monobrins avec une ADN polymérase appropriée tel que le fragment Klenow de l'ADN polymérase I. Les extrémités rognées peuvent

alors être liées enzymatiquement, par exemple en utili10 sant la ligase enzyme ADN T4.

Pour l'insertion du gène HIL-2 dans un vecteur, un quelconque site de combinaison souhaité pourrait aussi être produit en liant des séquences de nucléotide (liens) sur les groupes terminaux d'ADN. De 15 tels liens peuvent comprendre des séquences d'oligonucléotides spécifiques qui codent des séquences de reconnaissance de site de restriction. Le vecteur coupé et la séquence ADN modifiée codant IIIL-2 peut aussi

être modifiée par addition d'homopolymère, comme décrit 20 par Morrow [Methods in Enzymology 68:3 (1979)].

En pratique pour l'invention, il faut remplacer toutes les séquences 5' non codantes avec les séquences correspondantes du gène préproinsuline II de rat. Il peut aussi être possible de supprimer quelques 25 nucléotides des séquences codantes adjacentes au gène HIL-2, puisque ces séquences codent le polypeptide signal qui est coupé à la fin pendant la maturation à l'intérieur de la cellule hôte dans laquelle le gène HIL-2 sera inséré et exprimé. Evidemment, la suppres30 sion d'une région trop large des séquences codantes pourrait abolir la fonction polypeptide signal, interférant ainsi avec la sécrétion correcte du produit

HIL-2 par les cellules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, 35 un vecteur d'expression eucaryote désigné par pBC12MI -16 a été utilisé à la fois comme véhicule d'expression et comme source des séquences de gène préproinsuline II de rat. La substitution des régions 5' non codantes a eu ainsi lieu après qu'un gène HIL-2, dans lequel la ré.5 gion 5' non codante naturelle et les quatre premiers nucléotides de la séquence codante aient été supprimés, ait été inséré dans le vecteur pBC12MI en juxtaposition

avec des séquences correspondantes du gène préproinsuline II de rat.

Le vecteur pBC12MI est similaire au vecteur pBC12BI d'expressioneucaryote, qui a été décrit en détail par Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)]. Ce vecteur est basé sur le vecteur pXf3 dérivé du plasmide p-BR322 [Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557 15 (1983)] et contient aussi une région SV40 ori et la longue terminaison répétitive (LTR) efficace promoteur du virus du sarcome de Rous [Cullen et al., Nature 307, 241 (1984)] et une copie génomique du gène insuline II du rat [Lomedico et al., Cell 18: 545 (1979)]. Le vec20 teur pBC12MI utilisé dans les constructions décrites ci-dessous est identique au pBCI2BI sauf que le fragment LTR contenu ici prolonge un 70 bp additionnel dans la direction 3' (voir Fig. 1). Cette différence n'a pas

d'effet sur le niveau de l'expression des gènes codés 25 par le vecteur.

Evidemment un gène IL-2 dans lequel les régions 5' non codantes et le codon d'initiation ont déjà été remplacés par ceux d'un gène d'insuline de rat

pourraient être produits d'abord, soit par recombinaison 30 d'ADN, soit par synthèse chimique directe et être introduit dans une deuxième étape dans un vecteur approprié.

Des vecteurs d'expression convenables pour être utilisés dans des cellules de mammifère et qui pourraient être utilisés dans cette invention compren35 nent mais ne sont pas limités à pBC12MiI, pBC12BI, - 17 pSV2dhfr, p91023(B), pcDVl et pRSVcat. Ces vecteurs peuvent être introduits dans des cellules hôte de mammifère appropriées par transformation,transduction ou transfection. De nombreux vecteurs de clonage qui peuvent être utilisés dans cette invention contiennent des gènes (gènes sélectionnables) qui codent une ou plusieurs activités marqueur qui peuvent être utilisées pour choisir des mutants tels que la résistance à 10 l'ampicilline dans pBC12B1 et pBC12MI et l'activité dihydrofolate reductase dans pSV2dhfr. La sélection des cellules hôte dans lesquelles de tels vecteurs ont été insérés est grandement simplifiée quand les cellules hôtes sont privées par ailleurs de l'activité 15 apportée par le vecteur. Dans de tels cas les cellules peuvent être cultivées dans des conditions restrictives dans lesquelles seules les mutants abritant le plasmide,

et ainsi l'activité, peuvent être multipliés.

Dans un mode de réalisation préféré, le plas20 mide produisant la HIL-2 fournit l'activité dihydrofolate reductase aux cellules d'ovaire de hamster chinois auxquelles manque par ailleurs une telle activité (cellules CHO-dhfr-). Des mutants sont facilement sélectionnés à partir de cellules non transformées en les culti25 vant dans un milieu manquant d'hypoxanthine et de thymidine.

La présence dans un plasmide,d'une activité qui est manquante dans les cellules hôte peuvent fournir un autre avantage pour la sélection des mutants. Dans 30 des conditions de croissance restrictive>les cellules transformées qui contiennent et forment des copies multiples du gène dhfr croîtront plus vite que des cellules avec une ou peu de copies sécrétant de faibles quantités de dhfr. De telles conditions sélectionneront donc les 35 cellules qui ont augmenté ou "amplifié" le nombre de -18 copies des gènes dhfr qu'elles expriment. Lorsqu'un gène qui doit être exprimé est présent dans le plasmide près du gène sélectionné, le gène souhaité peut être co-amplifié ce qui à son tour peut conduire à une 5 expression accrue de ce gène. Dans la présente invention, la culture de mutants en présence de niveaux accrus d'améthoptérine, Un inhibiteur de la synthèse de purine de novo, a provoqué la production de niveaux

accrus à la fois de dihydrofolate reductase et de 10 HIL-2. Ce processus est appelé "co-amplification".

Tout système de gène sélectionnable similaire pourrait être utilisé dans la présente invention, bien que tous les systèmes ne produiront pas d'amplification de gène. Un autre système qui pourrait être uti15 lisé mais qui ne produira pas d'amplification, par

exemple, est basé sur le gène gpt d'E.coli, qui code pour la xanthineguanine phosphoribosyl transférase.

Mulligan et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2072 (1981)] ont sélectionné des cellules de singe et 20 de souris transfectées avec des plasmides portant le gène gpt en cultivant les cellules en présence d'acide mycophénolique (un inhibiteur de la synthèse de l'acide guanylique de novo), adénine et xanthine. La sélection dans ce système est encore accrue par l'addi25 tion d'aminoptérine (un analogue de l'améthoptérine)

au milieu de sélection.

Un autre système implique le gène d'aminoglycoside 3'-phosphotransférase bactérienne, dont le

produit rend la bactérie résistante à la néomycine et 30 la kanamycine. Colbere-Garapin et al. [J. Mol. Biol.

: I (1981)] ont sélectionné des cellules de mammifère transfectées avec des plasmides portant le gène de phosphotransférase sous le contr8le du promoteur de gène thymidine kinase (HSV tk) du virus simplex de 35 l'Herpès en cultivant les cellules en présence de -19 G-418, un antibiotique 2-désoxystreptamine qui inhibe la synthèse de protéine eucaryote. Berg (Science 213: 296 (1981)] a obtenu le même résultat avec toute une

série de vecteurs pSV dans lesquels le gène de phospho5 transférase a été sous le contrôle d'un promoteur SV40.

La HIL-2 sécrétée par les cellules productrices peut être identifiée dans le milieu de culture par l'une quelconque des méthodes connues dans la technique. Par exemple un essai biologique basé sur l'uti10 lisation de cellule qui dépendent de la HIL-2 pour leur prolifération. De plus un essai radio-immunologique ou un essai d'immunoadsorbant lié à un enzyme pourrait

être réalisé en utilisant des anticorps contre la HIL-2.

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide suivie d'un 15 Westerm Blot [Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)] ou une méthode similaire pourrait aussi être utilisée. En alternative, une analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

pourrait aussi être réalisée comme décrit par Stern 20 [brevet des Etats Unis nO 4 490 289].

La HIL-2 de l'invention peut être concentrée par précipitation avec des sels tels que le sulfate de sodium ou d'annnmonium, par ultrafiltration ou par l'utilisation d'autres procédés bien connus des hommes de 25 la technique. Une purification supplémentaire peut être obtenue par les techniques conventionnelles de purification de protéine, y compris mais non limité à la filtration sur gel, la chromatographie d'échange ionique, l'électrophorèse préparative sur gel, la fo30 calisation isoélectrique, le fractionnement à passe température dans un solvant organique, HPLC ou répartition à contre-courant. Les procédés. décrits plus haut par

Stern sont utilisés de préférence.

La HIL-2 purifiée comme mentionné ci-dessus 35 selon cette invention peut être utiliséepourdesobjec-

--O tifs similaires à ceux des autres composés immunomodulateurs connus pour le traitement et la prévention de maladies, par exemple comme moyen de traiter des conditions immunosuppressives. Elle peut être administrée à l'aide de moyens et compositions pharmaceutiquement acceptables/oraux, injectables ou topiques. Le dosage et la posologie peuvent être parallèles à ceux d'usage courant dans les applications cliniques de composés immunomodulateurs connus, typiquement environ 1-200 x O106 unités par jour. Ces compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent cette HIL-2 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible. Tout véhicule classique peut être utilisé. Le véhicule peut être un véhicule inerte orga15 nique ou minéral convenant à une administration parentérale, percutanée ou entérale. Des véhicules adaptés comprennent l'eau, la gélatine, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles comestibles, les polyalkylène-glycols, spé20 cialement les polyéthylène-glycols, vaseline et analogue. De plus, les préparations pharmaceutiques peuvent contenir d'autres agents pharmaceutiquement actifs. Des additifs supplémentaires tels qu'agents aromatiques, conservateurs, stabilisants, émulsifiants, tampons et

analogues peuvent être ajoutés selon la pratique acceptée en composition pharmaceutique.

Les préparations pharmaceutiques peuvent être réalisées sous toute forme de dosage pharmaceutique adaptée comprenant: a) une forme solide pour l'administration orale telle que comprimés, capsules, pilules, poudres, granulés et analogue; b) une forme liquide pour l'administration orale telle que solutions,

sirops, suspensions, élixir et analogue; c) préparations pour l'administration parentérale telles que so55 lutions stériles, suspensions ou émulsions; et d) prépa-

-21 rations pour administrations topiques telles que solutions, suspensions, onguents, crèmes, gels, poudres micronisées, aérosol et analogue. Les préparations pharmaceutiques peuvent être stérilisées et/ou peuvent contenir des adjuvants tels que des conservateurs, stabilisants, agents mouillants, émulsifiants, sels pour

modifier la pression osmotique et/ou tampon.

Les formes de dosage parentéral peuvent être des perfusions ou des solutions injectables qui peuvent 10 être injectées par voie intraveineuse ou intramusculaire. Les préparations peuvent aussi contenir d'autres

substances pharmaceutiquement actives. D'autres additifs tels que des conservateurs, stabilisants, agents émulsifiants, tampons et analogues peuvent être ajoutés selon 15 la pratique acceptée de la formulation pharmaceutique.

EXEMPLE

L'exemple suivant doit illustrer d'une manière non limitative les procédés par lesquels le clonage et l'expression de HIL-2 dans des cellules de mammi20 fère a été réalisée. Il apporte la preuve de l'amélioration substantielle dans l'expression de gène qui peut être attribuée au remplacement des régions 5' normales non codantes du gène de la HIL-2 par celles du gène de

l'insuline de rat.

PREPARATION D'ADN

L'isolation à petite échelle d'ADN plasmide à partir de cultures saturées pendant la nuit a été réalisée selon la procédure de Birnboim et al. LNucleic Acids Research 7: 1513 (1979)]. Cette procédure permet 30 l'isolation d'une petite quantité d'ADN à partir d'une culture bactérienne dans des buts analytiques. Sauf autres indications, de plus grandes quantités d'ADN plasmide ont été préparées comme décrit par Clewell et al.. LJ. Bacteriol. 110: 1135 (1972)]. Des fragments 35 d'enzyme de restriction spécifique dérivés par coupure -22 de l'ADN plasmide ont été isolés par électrophorèse préparative sur plaque à 1 % d'agarose à bas point de fusion (Seaplaque, FMC Inc., Rockland, ?E). L'ADN a d'abord été séparé sur un gel de 9 x 5 1/2 cm (50 mA, 5 I heure) dans un tampon Tris-Acétate [Maniatis et al. Clonage Moléculaire, un manuel de laboratoire, 1982, Cold Srping Harbor Laboratory p. 454] et ensuite visualisé par coloration avec I g/l de bromure d'éthidium. Des sections de gels contenant le fragment ADN 10 souhaité ont été découpées et fondues à 65 C pendant minutes et ensuite diluées avec 5 ml de 20 mM Tris/ HCl (pH 7,4), 0,2 MNaCl, I mM EDTA. L'ADN a été ensuite concentré en utilisant une colonne Elutip-D (Schleicher et Schuell Inc., Keen, NH' ensuivant les instructions 15 du fabricant et précipité à -20 C avec de l'éthanol en présence de 10 ig de ARNt de levure (Bethesda Research

Laboratories, Bethesda, MID).

REACTIONS ENZYIAT IQUES

Les enzymes de restriction, ADN polymerase 20 I (fragment Klenow) et ligase ADN T4 étaient des produits de New England Biolabs, MA. Les méthodes et conditions d'utilisation de ces enzymes ont été essentiellement celles préconisées par le fabricant.

Pour les endonucléases de restriction, une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une digestion complète de

1,0/ug d'ADN en 60 minutes dans un volume total de réaction de 0,05 ml, avec une digestion réalisée à 37 C.

Le tampon utilisé pour toutes ces enzymes (appelé ci30 après tampon d'enzyme de restriction) est constitué de mM de NaCl, 10 mM de Tris/HCl (pH 7,5), 5 mN de

MgC12 et I mM de 2-mercaptophénol.

La ligation par ADN T4 a été réalisée pendant 16 heures à 4 C (appelé cidessous tampon de li35 gation) contenant 60 mM de Tris/HCl (pH 7,5), 10 mM de -23 MgC12, 10 mMl de dithiothréitol et 0,1 mi d'ATP. Une unité d'activité de ligase ADN T4 est définie comme la quantité nécessaire pour donner 50 % de liaison de fragments de HindIII d'ADN lambda en 30 minutes à 16 C dans 20,/ul de mélange d'incubation et une concentration de groupes terminaux 5' d'ADN de O,12uM (300/ug/ml). Le rognage d'extrémités d'ADN monobrin en utilisant le fragment Klenow d'ADN polymérase I a été 10 réalisé dans le tampon d'enzyme de restriction qui a été ajusté pour contenir I mM de dGTP, dATP, dCTP et

dTTP. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme transformant 10 nmoles de désoxyribonucléotides en une forme acide insoluble en 30 minutes à 15 37 0C.

MILIEUX DE CULTURE

Le Milieu d'Eagle Modifié Iscove (IMEM) [Iscove et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)] a été

obtenu chez Grand Island Biological Co., Grand Island, 20 N.Y.

Le Bouillon Luria (LB) a contenu 5 g d'extrait de bactolevure, 10 g de bacto-tryptone et 10 g de NaCl par litre, ajusté à un pH de 7,5. L'ampicilline

antibiotique a été ajoutée à une concentration finale 25 de 50 kg/ml là o c'est indiqué.

TRANSFORMATION ET TRMNSFECTION

Des souches d'Escherichia coli ont été

transformées par le procédé de Peacock et al. [Biochim.

Biophys. Acta 655: 243 (1981)] essentiellement comme 50 suit. Les cellules ont été récoltées sur le milieu LB et préparées à la transformation par le p2océdé de Norgard et al. [J. Biol. Chem. 255: 7665 (1980)] sauf que le tampon CaC12 a été modifié et a contenu 70 mM

de MnCl2, 40 mM de NaOAc et 30 mM de CaC12, pH 5,6.

Un échantillon de 100 1l de cellules mises en suspension dans le tampon CaCl2 a été combiné avec 50Oyl d'échantillon de plasmide contenant entre 50 et 1000 ng d'ADN. Le mélange a été conservé sur de la glace pendant I heure et ensuite chauffé à 37 C pendant 2 minutes. Les cellules ont été déposées sur des plaques d'Agar LB à 4 C avec de l'ampicilline et incubées pendant 16 heures à 37 pour sélectionner les mutants. Des cellules d'ovaire de hamster chinois ont été transfectées par le procédé de Graham et al. 10 [Virology 52: 456 (1973)] comme suit. Cinq dixièmes de ml d'un mélange contenant 8 g/l de NaCl, 0,37 g/l de KCl, 0,125 g/l de Na2HPO4.2H20, I g/l de dextrose, 3 g/l de Tris et 125 mM de CaCl2 avec 10/ug de quantité totale d'ADN ont été ajoutés à 5 x 105 cellules dans 15 une boite de culture de 6 cm contenant 4 ml d'IMEM additionné de 10-4 M d'hypoxanthine et 10-5 N de thymidine (HT). L'ADN dans le mélange a consisté en 5/1ug de véhicule ADN de thymus de veau de haut poids moléculaire et 5/ug de pBC12/RSV/IL-2/dhfr ADN qui avait été 20 linéarisé avec PvuI. La culture a été incubée pendant une nuit à 37 C dans un incubateur à 5 % de C002 humidifié, après quoi le milieu a été enlevé et remplacé avec ml d'IMEM frais additionné de 10-4 M d'hypoxanthine et 10-5 M de thymidine (HT). Après un jour d'incubation 25 supplémentaire les cellules ont été détachées de la boîte en utilisant une solution de trypsine-EDTA (GIBCO) et placées dans deux boîtes de 10 cm dans 20 ml d'IMEM avec 10 % de sérum foetal de veau dialysé (FCS) mais sans HT. Des colonies transfectées ont été isolées en

utilisant une technique standard de clonage à la micropipette après 10 jours d'incubation supplémentaire.

Des cellules de rein de singe vert d'Afrique (COS) ont été transfectées en utilisant les procédés décrits par Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 35 (1985)]. Des boîtes de culture de tissus de 10 cm ont -25 été ensemencées avec 3 x 106 cellules COS dans 10 ml d'IMEM additionné de 10 % de FCS et 50/ug/ml de gentamycine et incubés pendant une nuit dans un incubateur à 37 , humidifié et avec 5 % de C02. Les cellules ont alors été lavées une fois avec une solution saline tampon de phosphate à 37 C (PBS) et 2 ml de PBS à 37 C

contenant 5001g/ml de DEAE-dextrane (Pharmacia).

L'ADN à transfecter a alors été ajouté aux cellules.

Les cellules COS ont alors été incubées tandis que les 10 boites de culture ont été agitées doucement à intervalles de 5 minutes pendant une période de 30 minutes.

Après cette incubation, 20 ml d'IIEM contenant 10 % de FCS, 50/ug/ml de gentamycine et 80/uM de chloroquine ont été ajoutés à chaque boîte. Après 2,5 heures d'incubation supplémentaire, le milieu a été remplacé par du milieu IMEM frais avec 10 % de FCS et 50/ug/ml de gentamycine. L'incubation a été poursuivie à 37 C pendant 72 heures, et les cellules et les milieux ont alors été analysés comme décrit ci-dessous. 20 CULTURES DE CELLULES Deux souches d'Escherichia coli ont été utilisées dans le travail décrit ici..E. coli souche GM 119, qui a été décrite par Iarinus et al. LJ. Bacteriol. 114: 1143 (1973)]. Cette souche a été déposée 25 le 26 Novembre 1985 sans restriction à l'"'merican Type Culture Collection" sous le n matricule ATCC 53339. E. coli souche MC 1061 a été décrite par

Casadaban et al. [J. Mol. Biol. 138: 179 (1980)].

Cette souche a été déposée aussi le 26 Novembre 1985 sans restriction à l'"'American Type Culture Collection"

(ATCC).son numéro matricule étant AiTCC N 53338.

On a utilisé trois lignées de cellule de mammifère. Une lignée de cellule a été la lignée d'ovaire de hamster chinois (CHO/dhfr-) qui manque de di35 hydrofolate réductase. La lignée de cellule a été -26 isolée au départ par Urlaub et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216 (1980)]. Des cultures de cette lignée de cellule ont été déposées le 7 mai 1986 à l'"American Type Culture Collection" avec attribution du numéro matricule n CRL 9096. Une lignée de cellule de rein de singe vert d'Afrique (COS) qui a été transformée par un génome viral SV40 moins original [Gluzman, Cell 23: 175 (1981)] est disponible à l'ATCC sous le numéro matricule CRL 1651. Une lignée de cellules mu10 rine IL-2 dépendante (CTLL) qui a été décrite par

Robb [Méthodes en enzymologie 116: 493 (1985) peut être obtenue à l'ATCC sous le no matricule TIB 214.

MUTAGENESE DIRIGEE PAR LE "PRIIIER" (ou amorce) La mutagénèse sur site spécifique dirigée 15 par le "primer" a été réalisée suivant les procédés décrits par Morinaga et al. [Bio/Technology 2: 636 (1984)]. L'oligonucléide synthétique utilisé pour réaliser la procédure de mutagénèse a été préparé par le

procédé à support solide de phosphoramidite J. Am. 20 Chem. Soc. 103: 3185 (1981)].

HYBRIDATION DE COLONIE

L'hybridation de colonie a été réalisée en utilisant un procédé décrit par Maniatis et al. [Clonage moléculaire: Un manuel de laboratoire, 1982, 25 Cold Spring Harbor Laboratory, pp 312-315]. Le même oligonucléotide utilisé pour la mutagénèse dirigée sur le primer a été utilisé comme sonde pour les hybridations après l'extrémité 5' en marquant avec Y-3 2- ATP et en utilisant la polynuclétide kinase selon le pro30 cédé de Maniatis et al. [Supra, p 396]. Des sondes ADN

plus grandes pour localiser les gènes d'IL-2 et dhfr ont été marqués en utilisant un kit de transfert par insertion (Amersham) selon les instructions du fabricant.

-27 CONSTRUC2ION DU VECTEUR pBC12/RSV/IL-2/dhfr D 'EXPRESSION DE L'INTERLEUKINE-2 La préparation du vecteur final d'expression de l'invention a été réalisée en plusieurs étapes, comprenant successivement (1) la préparation d'un vecteur dans lequel un gène humain modifié HIL-2 pourrait être inséré, (2) modification du gène HIL-2 pour supprimer la plupart de la région 3' non-codante, toutes les séquences 5' non codantes et les quatre premiers 10 nucléotides de la séquence codant pour la séquence peptide signal, et (3) l'insertion du gène modifié

HIL-2 dans le vecteur prépare.

PREPARATION DU VECTEUR DE CIONAGE

Unug d'ADN plasmide pBC12MII (voir Fig. 1) 15 a été traité avec 20 unités de BamHI dans 100uil de

tampon d'enzyme de restriction pendant I heure à 37 C.

Un échantillon de E-coli MC 1061 contenant le plasmide pBCI2MI a été déposé le 7 Mai 1986 à l'"American Type Culture Collection" avec le numéro matricule n LTCC 67109. Le plasmide digéré par BamHI a été ensuite traité avec 4 unités de fragment Klenow de l'ADN polymérase I pendant 2 heures à 15 C, après quoi la réaction a été arrêtée en chauffant à 65 C pendant 5 minutes. Deux1l

du mélange ont été dilués ensuite à 1:10 avec du tampon 25 de ligation. Le mélange a été refroidi sur de la glace.

On a ajouté une unité de ligase ADN T4, et le mélange

réactionnel a été incubé pendant 16 heures à 4 C.

Le mélange de réaction de ligation a été utilisé ensuite directement pour transformer la souche 30 E.coli GM 119. Les mutants ont été sélectionnés sur agar LB avec de l'ampicilline. L'ADN de colonies résistantes à l'ampicilline ainsi obtenu a été séparé par coupure par l'endonucléase de restriction. L'ADN plasmide isolé a d'abord été digéré avec BamHI ou ClaI et 35 les fragments d'ADN résultants ont été séparés par -28 électrophorèse sur un gel à 1 % d'agarose et visualisés par 10/ug/ml de bromure d'éthidium. Un plasmide qui a perdu le site BamHI mais acquis un site ClaI à sa place

a ainsi été identifié et appelé plasmide pBC12CI.

Le plasmide pBC12CI a été ensuite préparé en plus grande quantité par le procédé de lyse détergente

de Clewell et al. [J. Bacteriol. 110: 1135 (1972)].

La préparation finale du vecteur de clonage a été réalisée en coupant 1 g de pBC12CI avec 20 unités de ClaI et par rognage des terminaisons du produit de digestion avec le fragment Klenow de l'ADIN polymérase I.

PREPARATI0N DU FRAGIIENT DE GENE INTERLEUXIINE-2

Le plasmide pIL-2-2b, conternant une copie d'ADNc de toute la région codante 459 bp de IL-2 hu15 maine flanquée de 31 bp de la séquence 5' non transférée et de 309 bp de la séquence 3' non transférée [Taniguchi et al. , Nature 302: 305 (1983)] a été utilisé comme source du gène IL-2. Puisque la séquence des nucléotides du gène HIL-2 a été déterminée par 20 Taniguchi et al., le fragment de gène contenant le gène HIL-2 peut être aussi synthétisé en utilisant le procédé décrit par Souza et al. [Demande de Brevet Européen n Al 134 489]. Dix/ug de pIL-2-2b ont été coupés avec 20 unités de RsaI et de 20 unités de BamHI dans 100 l de tampon d'enzyme de restriction

pendant I heure à 37 C. RsaI coupe l'insert ADNc HIL-2 au site unique I bp 3' du codon d'initiation de HIL-2.

Le mélange réactionnel a été traité ensuite avec le fragment Klenow d'ADN polymérase I et est soumis à l'électrophorèse préparative dans un gel à 1 % d'agarose à faible point de fusion. Le fragment souhaité 760 bp RsaI, BamHI HIL-2 ADNc a été identifié et extrait du gel

comme décrit ci-dessus.

Cent ng du vecteur pBC12CI préparé ont été 35 mélangés avec 100 ng de fragment RsaI/BamHI HIL-2 dans -29 ul de tampon de ligation contenant 2 unités de ligase ADN T4 et incubés une nuit à 4 C. L'ADN soudé a alors été utilisé pour transformer la souche E. coli MC 1061 et des mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec de l'ampicilline. Deux cents ng du fragment HIL-2 isolé ont été utilisés pour former une sonde transférée par insertion marquée au 32p en utilisant le kit de transfert par insertion selon les instructions du fabricant. 10 Les colonies des plaques ont été récupérées sur des filtres de nitrocellulose (Schleicher et Schuell Inc.) et ensuite sélectionnées selon la présence de l'insert HIL-2 en utilisant la sonde marquée et en suivant les procédures de laniatis et al. [Clonage moléculaire: 15 Un manuel de laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. Les colonies positives d'hybridation ont été prélevées et des minipréparations d'ADN ont été faites selon le procédé de Birnboim et al. Les préparations d'ADN résultantes ont été coupées avec HindIII 20 et StuI et analysées par électrophorèse sur gel pour trouver la présence d'un fragment caractéristique 690 bp qui indique que le vecteur a été correctement construit. Cette construction a été désignée par pBC10. Une plus grande quantité i'ADN pBC10 a été préparée et 10/ug ont été coupés avec 20 unités de

HindIII et 16 unités de StuI dans le tamnpon de l'enzyme de restriction pendant I heuze à 37 C. Le fragment résultant 690 bp d'ADN HIL-2 a été isolé par électropho30 rèse préparative sur gel d'agarose comme décrit antérieurement.

Un/g de plasmide pBC12MI a été coupé avec BamHI et ensuite traité avec l'ADN polymérase Klenow comme décrit ci-dessus. Après incubation à 65 C, l'ADN 35 a été coupé avec HindIII, extrait avec une solution -30 aqueuse de phénol et de chloroforme et précipité par

l'addition d'un demi-volume d'acétate d'ammonium 7,5.

et 2 volumes d'éthanol, suivie par une incubation à -70 C. L'ADN pBC12MI précipité a été recueilli par centrifugation, lavé avec de l'éthanol et remis en suspension dans l'eau. Cent ng du vecteur pBCi2?= préparé ont été soudés à 200 ng du fragment isolé iL-2 HindIII/StuI dans 50/uil du tampon de ligation comme décrit ci10 dessus. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche E. coli MClO61, et les mutants ont été sélectionnés sur plaque d'agarose LB avec de l'ampicilline. Les colonies individuelles ont été sélectionnées comme ci-dessus selon la présence d'un

fragment 690 bp HindIII/'BamHI et un assemblage correspondant à ce critère a été appelé pBCI2/RSV/IL-2.

Ainsi construit, le plasmide pBC12/RbV/IL-2 contient un gène chimère HIL2 dans lequel la région 5' non codante et les quatre premiers nucléotides ATG T 20 de la séquence codant pour la séquence peptide signal de HIL-2 aussi bien que presque toute la région 3' non codante ont été remplacés par des s&quences correspondantes du gène préproinsuline II de rat présent dans

le vecteur pBC12III. En partie cette construction a été 25 faite pour produire une région 3' non codante définie.

Mais c'est la substitution de la région 5' non codante qui, comme on va le montrer ci-dessous, qui produit une augmentation marquée dans le niveau d'expression du gène HIL. La structure résultant de la terminaison N

du peptide signal de HIL-2 est présentée sur la Fig. 2.

Comme c'est montré sur la Fig. 2 cette construction a pour résultat la formation d'un peptide signal chimère dans lequel les deux premiers aminoacides de IL-2 (Met-Tyr) sont remplacés par les cinq premiers 35 aminoacides du peptide signal de l'insuline de rat -31 Met-Ala-Leu-Trpile), et un sixième aminoacide (Asp) qui est codé par la nouvelle séquence de nucléotide créée au point de ligation. Ce changement n'a pas d'effet sur la fonction du peptide signal, qui est coupé du gène IL-2 pendant la maturation comme d'habitude.

INSERTIOI DES SEQUECES DU GENE DIHYDROFOLATE REDUCTASE

Un/ug de pBC12/RSV/IL-2 a été coupé avec StuI. L'IADN a été extrait par le mélange phénol/chloro10 forme, prêcipité avec de l'éthanol et remis en suspension dans l'eau. Dix/ug d'ADN pSV2dhfr LISubramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854 (1981)] ont été coupés avec PvuiI et BamHI. Le plasmide pSV2dhfr a été déposé le 7 Mai1986 sous forme d'un échantillon de E. coliMC 1061 (pSV2dhfr) à l'"American Type Culture Collection" avec le numéro matricule N ATCC 67110. Le fragment de gène SV40/dhfr du plasmide pSV2dhfr a été isolé dans un gel de préparation à 1 % d'agarose, après quoi 100 ng du vecteur pBC12/RSV/IL-2 ont été soudés à 400 ng du fragment SV40/dhfr isolé, dans 40 1 de tampon de ligation pendant une nuit à 4 C. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer directement la souche E. coli MC 1061. Les mutants ont été sélectionnés sur

des plaques d'agarose LB avec ampicilline.

Les colonies transformées ont été reprises sur filtres de nitrocellulose et sélectionnées en utilisant une sonde de transfert par insertion marquée au 52p préparée contre le fragment de gène SV40/dhfr isolé. La sonde a été préparée par marquage de 200 ng 50 du fragment PvuII/BamIlI SV40/dhfr isolé en utilisant le kit de transfert par insertion d'Amersham décrit ci-dessus. En utilisant la procédure de Birnboim et al (supra) l'ADN plasmide a été isolé à partir des

colonies positives d'hybridation et on a recherché la 35 présence de deux fragments BamHI par analyse par élec-

-32 trophorèse sur gel. La présence des fragments de BamHI confirme la présence du fragment de SV40/dhfr et établit l'orientation du fragment. Le fragment de gène bV40/dhfr cloné dans pBC12/RSV/IL-2 contient un gène dhfr murin entier sous le contrôle de la région promoteur précoce du virus SV40. Un clone a été choisi dans lequel les gènes HIL-2 et dhfr dans le plasmide ont été positionnés dans la même orientation, et le

plasmide de ce clone a été appelé pBC12/RSV/IL-2/dhfr 10 (voir Fig. 3).

EXPRESSIONI FORTE DU GENE HIL-2

Pour exprimer le gène HIL-2, un jour avant la transfection,ona placé 5 x 105 cellules CHO/dhfr dans une boîte de culture à tissu,de6cmldans4ml d'ME 15 additionné de 10-4 M d'hypoxanthine et de 10-5 Y de thymidine (HT) . Après incubation une nuit dans un incubateur à 37 C humidifié et avec 5 % de C02, les cellules ont été transfectées avec pBC12/RSV/IL-2/dhfr. Les

colonies transfectées ont été isolées comme décrit ci20 dessus.

Les colonies clonées désignées par d51-d56 ont ainsi été obtenues, chacune d'entre elles étant cultivée dans l'IúEM et séparée des autres et des cultures dhfr+ non clonées mélangées (désignées par d5) 25 pour la production de HIL-2. La production de HIL-2 a été mesurée en utilisant un essai biologique quantitatif basé sur la lignée CTLL de cellules IL-2 murine dépendantes. Cet essai qui a été décrit par Robb [Methods in Enzymology 116: 493 (1985)] comprend de 30 mélanger une série de dilution de moitié des milieux surnageants de différents clones de cellules dhfr+

avec la lignée CTLL de cellules IL-2 murine dépendantes.

Puisque la lignée CTLL ne se développera qu'en présence d'IL-2, le degré de prolifération de ces cellules, dé35 terminé par le taux d'incorporation de 3H-dT, est une -33 mesure précise du niveau de IL-2 sécrété par les clones dhfr+. En alternative, des blastes humains? PHIA peuvent être utilises pour mesurer la production de HIL-2 (Robb et al., supra'. Des blastes-PHA humains peuvent être obtenus par stimulation de lymphocyte de sang périphérique humain pendant 48 heures par de la phytohémagglutinine (PHA). Les résultats de cette analyse des colonies clonées sont présentés dans le Tableau I, dans lequel les données sont exprimées en activité 10 d'IL-2 en terme à la fois d'unités par ml de milieu et unités/106 cellules. Une unité d'activité IL-2 est définie comme l'inverse de la dilution correspondant à la moitié de la réponse de prolifération maximale étalonnée par la réponse de standard d'IL-2 fourni par le 15 "Biological Response Modifiers Programme" de l'Institut National du Cancer, Frederick, IMD [Thurman, Lymphokine

Res. 3:276 (1984)] comme décrit par Robb, supra.

TABLEAU 1

Comparaison de la Production d'IL-2 par des Clones 20 isolés Concentration Activité d'interleukine-2 d 'améthoptérine 6 Clone (Molaire) unités/ml unités/106cellules d5 0 640 456 d51 0 1.920 1.-370

d52 O 1.920 N.D.

d53 0 1.920 1.580

d54 0 820 N.D.

d55 0 550 N.D.

d51 5 x 10-6 51.200 60.160 d51 2 x 10- 51.200 80.210 d51 8 x 10- 76.800 150.400 d51 2 x 0-4 76.800 156.900 d51 5 x 10- 155.600 401.000

N.D. = non déterminé.

-34 Dans le Tableau I on peut voir que les clones d51 et d53 ont été les plus forts producteurs d'activité IL-2. Pour démontrer l'effet d'amplification de gène sélectionnable mentionné ci-dessus des 5 cellules de clone d51 ont été cultivées pendant des périodes de 7 à 14 jours en présence de taux croissant d'améthoptérine jusqu'à ce qu'on obtienne une lignée résistante à une concentration de 5 x 10-4 M d'inhibiteur. Comme c'est montré dans le tableau 1, cette li10 gnée de cellule a sécrété des quantités élevées de HIL-2. Comme attendu, l'analyse des cellules par Southern analysis [Maniatis et al., Clonage Noleculaire: Un Manuel de Laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory pp 382-389] a montré que chacune contenait environ 100 copies du plasmide. Les queues homopolymères G-C ajoutées à l'origine à la copie HIL-2 ADNc pour faciliter son insertion dans le plasmide pIL-2-2b ont un effet inhibiteur sur l'expression du gène IL-2. Pour pouvoir comparer correctement les taux d'expression de 20 IL-2 entre les séquences de gène ayant les régions 5' non codantes humaines normales et les séquences dans lesquelles ces régions ont été remplacées par celles du

gène d'insuline de rat un plasmide a ainsi été préparé dans lequel les queues homopolymères inhibitrices ont 25 été supprimées. Ce plasmide a été appelé pBC40iT.

CONSTRUCIOI DU PLASMIIDE pBC40LT Un vecteur coupé dans lequel le gène HIL2 pourrait être cloné a été préparé en coupant 1/ig de pBC12M1 avec 20 unités de BamHI et 20 unités de HindII 30 dans le tampon d'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37 C. Le fragment résultant a ensuite été traité avec le fragment Klenow de l'ADN polymerase I, extrait avec du mélange phénol/chloroforme et précipité comme

décrit ci-dessus.

Un fragment d'ADN HIL-2 a été préparé en -35 coupant 10/ug d'ADN pIL-2-2b avec 20 unités de 3amHI et 8 unités de Stul e; rogné les terminaisons avec l'ADN polymerase de Klenow. Un fragment approximativement 550 bp HIL- 2 a alors été isolé à partir du gel de préparation à 1 % d'agarose comme décrit ci-dessus. Cent ng du vecteur pBC121II préparé ont alors été soudés à 150 ng du fragment HIIIL-2 BamHI/StuI dans

/ul de tampon de ligation comme décrit ci-dessus.

Le mélange de ligation a été utilisé directement pour 10 transformer la souche E. coli MC 1061 et les mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec ampicilline. Les colonies résistantes à l'ampicilline ont été enlevées des plaques et placées sur filtre de nitrocellulose et sélectionnées selon la présence de l'insert HIL-2 par hybridation de colonies avec des sondes transférées par insertion et marquées au 32p préparé en présence de 200 ng de fragment BamHI/StuI

purifié, avec le kit d'Amersham.

Les colonies positives d'hybridation ont été 20 prélevées et sélectionnées selon la présence d'un fragment d'approximativement 560 bp BstEII/BamHI selon le procédé de Birnboim et al (analyse par enzyme de restriction d'ADN plasmide). Une construction contenant ce fragment a été identifiée et appellée pBC40. Le plasmide pBC40 est identique à pBCI2/RSV/IL-2 sauf qu'il lui manque la région 5' non codante de l'insuline et qu'à la place il a la région naturelle 32 bp HIL-2 5' non transférée. Le plasmide conserve aussi le codon

d'initiation naturel de HIL-2 et a la queue 17 bp homo30 polymère qui est située dans la région 5' non codante.

Une plus grande quantité d'ADN pBC40 a été préparée par le procédé de Clewell et al. [J. Bacteriol. 110: 1135

(1972)].

* Le segment de queue homopolymère du gène

HIL-2 a été supprimé par le procédé de mutagénèse diri-

-56 gée sur le primer de Morinaga et al [Bio. Technology 2: 6561 (1984)]. Pour réaliser ce procédé un primer désoxy-oligonucléotide à 24-mères phosphorylé a été préparé par le procédé du support solide phosphorami5 dite comme décrit ci-dessus qui a contenu 12 désoxynucléotides qui sont en séquence complémentaire des bases de chaque côté de la région homopolymère à éliminer sur l'un des brins de l'ADN. La séquence nucléotide de ce primer à 24-mères et celle de l'ADN conte10 nant la région homopolymère à exciser sont représentés sur la Fig. 4. Les régions qui subissent l'hybridation

pendant le processus de mutagénèse sont soulignées.

La suppression de la région homopolymère crée un nouveau site HindIII dans l'ADN résultant.

Pour réaliser la procédure de mutagénèse, 1/ug d'ADN pBC40 a été linéarisé avec PvuI, extrait avec du mélange phénol/chloroforme, précipité dans l'éthanol et repris dans 20/ul d'eau. Dix/ug de pBC40 supplémentaires ont été coupés avec EcoRI, et le plus grand 20 fragment de vecteur produit, appelé le "vecteur à lacune" a été isolé dans un gel de préparation à 1 % d'agarose. Des quantités égales à 200 ng des plasmides linéarisé et à lacune ont alors été mélangés avec un excès 20 fois molaire de l'oligonucléotide phosphorylé 25 dans 10/ul d'eau, et 2pl de 10 x tampon Klenow [1 M NaCl, 65 mM Tris/HCl (pH 7,4), 45 ml MYgCl2 et 10 ml 2-mercaptoéthanol]ont été ajoutés. Le mélange a été traité pour des durées successives de 5, 30, 50 et 5 minutes à 1000C, température ambiante, 4 C et sur la 50 glace, respectivement, après quoi l'échantillon a été porté à un volume de 20/ul par addition de 2/ul de

mM ATP, 4/1l d'un mélange de 2,5 mM de dCTP, dA2P, dGTP et dTTP, 0,5/ul de Klenow polymerase I (2,5 unités d'activité) et 1/ul de ligase ADIN T4 (0,8 unité d'ac35 tivité).

-37 Le mélange a été incubé pendant 16 heures à C et utilisé alors directemenr pour transformer la souche E. co li MC 1061. Les mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec ampicilline, et les colonies des plaques ont été recueillies sur filtre de nitrocellulose et triées selon la présence d'une séquence homologue du primer à 24-mères utilisé dans le procédé de mutagénèse en utilisant l'oligonucléotide

synthétique marqué avec l'l 32P-ATP comme sonde.

Les colonies positives ont encore été triées selon le procédé de Birnboim et al. selon la présence d'un fragment attendu 530 bp HindIII/BamHI. Puisque les colonies obtenues selon ce procédé sont mélangées (Morinaga et al. supra), un échantillon positif d'ADN 15 a été utilisé pour retransformer E. co li MC 1061, et les colonies résultantes ont été retriées pour le fragment 530 bp HindIII/BamHI. Une colonie positive ainsi identifiée, qui a été appelée pBC40AT, était identique à pBC40 sauf la suppression d'un segment 22 bp dans la séquence de tête non transférée constitué

principalement de la séquence 17 bp homopolymère G-C.

COMPARAISON FONCTIONNELLE DES VECTEURS pBCI2/RSV-IL-2, pBC40 et pBC4i0T Les trois constructions décrites ci-dessus 25 ont été comparées du point de vue de leur capacité à diriger la synthèse de l'HIL-2 humaine en utilisant le test d'expression rapide quantitatif avec des cellules COS transfectées, de Butnick et al. [Mlol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)]. Dans ce procédé des quantités équimolaires 30 des préparations d'ADN à comparer sont introduites par transfection dans des cellules de rein de singe vert Africain de lignée COS décrites par Gluzman [Cell 23: (1981)] qui est transformée par un génome viral SV40 moins d'origine. Les acides désoxyribonucléiques 35 contenant une origine de réplication SV40 (telle que -38 le test des plasmides) et qui sont introduits dans ces cellules sont répliqués pour donner un grand nombre de copies et sont ainsi efficacement exprimés par la machine de réplication 1DN dépendant de SV40 présente dans les cellules. Les quantités de HIL-2 produites par les cellules COS transformées ont été déterminées en utilisant l'essai biologique quantitatif de Robb (supra) avec la lignée de cellules CTLL, avec les résultats 10 présentés dans le Tableau 2 pour quatre expériences différentes. 20

TABLEAU 2

Influence des séquences 5' non codantes sur l'expression d'interleukine-2 Production relative d'IL-2 (unités/ml) Clone 1 2 5 4 Moyenne pBC12/RSV/IL2 1.024 512 1.536 6.144 100 pBC40 24 8 32 192 2,8 pBC4OAT 128 96 128 768 12,1 Comme le montre le Tableau 2, le plasmide pBCI2/RSV/IL-2 induit la synthèse de quantités de IL-2 25 considérablement plus grandes que ce que font les plasmides pBC40 et pBC40LT. Bien que la présence d'une région homopolymère dans la région 5' non codante de pBC40 le rende moins efficace que pBC4CAT, la principale différence entre les trois plasmides repose sur le fait 30 que l'ensemble des séquences 5' non transférées de pBC40 et de pBC40ZT sont des séquences humaines naturelles, tandis que dans le plasmide pBC12/R-V/IL-2

existent les séquences correspondantes du gène préproinsuline II de rat.

Le remplacement des séquences 5' non codantes -39 humaines naturelles par celle du gène d'insuline de rat augmente nettement l'expression de HIL-2 pour des raisons qui ne sont pas claires. Une compréhension du mécanisme de cette expression accrue n'est pas indis5 pensable à l'invention. Il se peut que la stabilité accrue de l'ARum soit responsable de cet effetInversement, il est possible que le remplacement par le codon AUG initiateur d'insuline du codon naturel IL-2 AUG (Fig. 2) confère une efficacité de transfert supé10 rieure à cause de la présence de la séquence la plus idéale adjacente au codon initiateur d'insuline [Kozak,

Cell 44: 283 (1986)].

De nombreuses modifications et variations de cette invention peuvent être faites sans s'écarter 15 de son esprit et étendue, comme cela est évident aux hommes de la technique. Les modes de réalisation spécifiques décrits ici sont présentés comme exemple seulement, et l'invention n'est limitée que par les termes

des revendications en annexe.

-40 - REVEiîIGAl0:i.L I - Séquence d'ADN codant pour l'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal comprenant un gène codant pour l'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal dans laquelle des séquences ' non codantes du gène ont été remplacées par des séquences 5' hétérologues non codantes. 2 - Séquence d'ADN selon la revendication 1

dans laquelle les séquences 5' non codantes hétérologues 10 proviennent du gène d'insuline de rat.

3 - Séquence d'ADN selon la revendication I dans laquelle en plus les nucléotides adjacents aux

sous-séquences codant pour la séquence peptide signal ont été remplacés par des séquences hétérologues cor15 respondantes.

4 - Séquence d'ADNi selon la revendication 3, dans laquelle les nucléotides adjacents ATG T de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal

ont été remplacés par les nucléotides ATG GCC CTG TGG 20 ATC G de la sousséquence codant pour la séquence peptide signal de préproinsuline II de rat.

- Vecteur recombinant comprenant un vecteur et une séquence d'ADN conforme à l'une

quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce 25 que le vecteur recombinant est capable de diriger l'expression de leéquence d'ADN dans une cellule de mammifère compatible.

6 - Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que le vecteur comprend une région 50 SV40 ori, un promoteur à longue terminaison répétitive du virus du sarcome de Rous et un gène d'insuline II

de rat.

7 - Vecteur recombinant selon la revendication 5 sélectionné dans le groupe de pBC12/RSV/IL-2 55 et pBC12/RSV/IL-2/dhfr.

-41

8 - Cellule de mammifère contenant une séquence d'ADNI selon l'une quelconque des revendications

1 à 4, caractérisée en ce qua la cellule de mammifère est capable d'exprimer l'interleukine-2 humaine codée par cette séquence d'ADN.

9 - Cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 capable d'exprimer l'interleukine-2

humaine codée par la séquence d'DNT comprise dans ledit 10 vecteur.

- Cellule de mammifère selon la revendication 8 ou 9 dans laquelle le vecteur recombinant

ou la séquence d'ADN qui y sont inclus est amplifiée.

11 - Procédé de production d'interleukine-2 15 humaine, caractérisé en ce qu'il conprend la culture d'une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et

l'isolation de l'interleukine-2 humaine à partir de la culture. 12 Procédé selon la revendication 11 caractériséen ce que levecteurrecombinantestintroduit dans la

cellule de mammifère par transfection.

- Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que ledit vecteur recombinant contient 25 ungènesélectionnableet ladite cellule de mrammifère est cultivée sur un milieu de sélection, o des copies multiples du gène sélectionnable et de la séquence ADN codant

pour l'interleukine-2 humaine sont produites par coamplification.

14 - Procédé selon la revendication 15

caractérisé encequeleditgènesélectionnablecodepourladihydrofolate réductase, la cellule de mammifère manquant sinon d'activité dihydrofolate réductase et le milieu de sélection manque d'hypoxanthine et thymidine et contient 55 de l'améthoptérine.

- Procédé selon la revendication 14 dans

lequel la cellule de mammifère est une cellule CHO/dhfr-.

16 - Procédé de préparation d'une cellule de mammifère définie dans l'une quelconque des revendica5 tions 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'un vecteur recombinant selon l'une quelconque des

revendications 5 à 7 dans une cellule de mammifère.

17 - Interleukine-2 humaine préparée par un

procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15. 10 18 Interleukine-2 humaine selon la revendication 17 sous forme essentiellement pure.

19 - Interleukine-2 humaine selon l'une

des revendications 17 à 18 en tant que produit pharmaceutique.

20 - Compositions pharmaceutiques contenant

une interleukine-2 humaine selon l'une des revendications

17 et 18.

21 - Utilisation d'une interleukine-2 humaine

selon l'une des revendications 17 et 18 pour le traitement 20 et la prévention de maladies.

22 - Utilisation d'une- interleukine-2 humaine

selon l'une des revendications 17 et 18 en tant que

composé immunomodulateur.

23 - Utilisation d'une interleukine-2 humaine

selon l'une des revendications 17 et 18 pour le traitement

de conditions -immunosuppressives.